RS65211B1

RS65211B1 - Bispecifična antitela protiv ceacam5 i cd47

Info

Publication number: RS65211B1
Application number: RS20240190A
Authority: RS
Inventors: Vanessa Buatois; Anja Seckinger; Dirk Hose
Original assignee: Lamkap Bio Beta Ag
Priority date: 2020-12-18
Filing date: 2021-12-17
Publication date: 2024-03-29
Also published as: AU2021400227A1; HUE065728T2; WO2022130348A1; CA3193210A1; EP4055055A1; US20240101705A1; KR20230121772A; AU2021400227A9; CL2023001797A1; IL301701A; JP2024501809A; CO2023009100A2; HRP20240213T1; EP4055055B1; PE20231386A1; MX2023007220A; ES2967381T3; US11753481B2; EP4055055C0; PL4055055T3

Description

Opis

REFERENCA NA LISTING SEKVENCI

[0001] Uz prijavu je priložen i sadržaj elektronski dostavljenog listinga sekvenci.

OBLAST PRONALASKA

[0002] Ovaj pronalazak se odnosi na bispecifična antitela koja se vezuju za humani karcinoembrionalni antigen CEACAM5 (CEA) i za humani CD47 (CEAxCD47 bispecifična antitela). Pored toga, ovaj pronalazak se odnosi na polinukleotide koji kodiraju takva bispecifična antitela i vektore i ćelije domaćina koje sadrže takve polinukleotide. Pronalazak se dalje odnosi na postupke za selekciju i proizvodnju takvih antitela i na postupke upotrebe takvih antitela u lečenju bolesti. Pronalazak se takođe odnosi na terapeutsku upotrebu CEAxCD47 bispecifičnih antitela u monoterapiji.

STANJE TEHNIKE

[0003] CEA pripada porodici molekula ćelijske adhezije povezanih sa CEA (CEACAM) koja sadrži 12 blisko povezanih proteina kod ljudi kodiranih sa 22 gena podeljenih između CEACAM i podgrupa glikoproteina specifičnih za trudnoću (PSG) na hromozomu 19q13 (Beauchemin N & Arabzadeh A, Cancer Metastasis Rev. 2013). CEACAM su uključeni u različite fiziološke procese kao što je prepoznavanje ćelija-ćelija i modulacija ćelijskih procesa u rasponu od oblikovanja arhitekture tkiva i neovaskularizacije do regulacije homeostaze insulina i proliferacije T-ćelija; CEACAM su takođe identifikovani kao receptori za viruse i bakterije specifične za domaćina (Kuespert K et al., Curr Opin Cell Biol. 2006). CEA (CEACAM5 ili CD66e; UniProtKB - P06731) je prisutan rano u embrionalnom i fetalnom razvoju i održava svoju ekspresiju u normalnim tkivima odraslih. Njegovo glavno mesto ekspresije je u stubastim epitelnim i peharastim ćelijama debelog creva, posebno u gornjoj trećini kripte i na slobodnoj luminalnoj površini.

[0004] CEA je (preterano) eksprimiran u tumorima epitelnog porekla, uključujući, ali ne ograničavajući se na kolorektalni karcinom, karcinome želuca, pluća i pankreasa (prikaz u Beauchemin N & Arabzadeh A, Cancer Metastasis Rev. 2013), gde gubi svoju apikalnu ekspresiju što rezultira distribucijom po celoj površini ćelije (Hammarström, Semin Cancer Biol 1999).

[0005] Postupak za lečenje kancera koji eksprimira CEA kombinacijom antagonista humane PD-1 ose i T-ćelija koje preusmerava i aktivira anti-CEA/anti-CD3 bispecifično antitelo pominje se u US20140242079 i WO2017118657 i klinički rezultati su predstavljeni na ASCO godišnjem sastanku 2017. (Tabernero et al., J Clin Oncol 35, 2017 (suppl; abstr 3002)).

[0006] Postupak lečenja tumora primenom antagonista imunih kontrolnih tačaka koji vezuju dva ili više različitih ciljnih mesta na putu imunološke kontrolne tačke, i sredstva za preusmeravanje T-ćelija koji se vezuje za CEA i površinskog antigena T-ćelija pominje se u WO2015112534. Pominje se antitelo klase I koje se vezuje za CEACAM5 i granulocite US20110064653.

[0007] Humani CD47 (UniProtKB - Q08722 (CD47_HUMAN; IAP)) je transmembranski protein koji vezuje ligande trombospondin-1 (TSP-1) i protein-regulator signala alfa (SIRPα; CD172a; UniProtKB P78324) i može da deluje kao signal "nemoj da me pojedeš" za imunološki sistem, posebno za makrofage koji eksprimiraju SIRPα. Snažna inhibicija (nizak IC50) vezivanja SIRPα za CD47 na površini tumorskih ćelija je mera za povećanje fagocitoze tumorskih ćelija pomoću makrofaga. CD47 je uključen u niz ćelijskih procesa, uključujući apoptozu, proliferaciju, adheziju i migraciju. Pored toga, igra ključnu ulogu u imunološkim i angiogenim odgovorima. CD47 je prekomerno eksprimiran u tumorskim ćelijama pacijenata sa hematološkim i solidnim tumorima. Antitela protiv CD47 su opisana u stanju tehnike i pokazala su obećavajuću pretkliničku i ranu kliničku aktivnost u različitim tumorskim entitetima, uključujući hematološke maligne bolesti kao što su limfom i solidni tumori, na primer kancer želuca (Weiskopf K., European Journal of Cancer 76 (2017) 100-109; Huang Y et al., J Thorac Dis 2017;9(2):E168-E174; Kaur et al., Antibody Therapeutics, 3 (2020) 179-192). Antitela podklase IgG1 koja vezuju CD47 mogu dovesti do iscrpljivanja trombocita i smanjenja crvenih krvnih zrnaca (RBC) i hemoglobina na način zavisan od Fc (videti npr. US20140140989). Da bi se izbegao ovaj neželjeni efekat, u WO2017196793 opisan je mutantni oblik IgG4 podklase anti-CD47 antitela (IgG4PE, sa mutacijom S228P kao i mutacijom L235E za smanjenje vezivanja FcyR). Takvo anti-CD47 antitelo sa ozbiljno smanjenim vezivanjem FcyR i efektorskom funkcijom ne dovodi do takvog smanjenja trombocita. Jednodomensko bispecifično antitelo protiv CD47 i CD20 je opisano od von Bommel PE et al. (Oncoimmunol.

7 (2018) e386361) i Piccione EC et al. (mAbs 7 (2015) 946-956). Dheilly E. et al. (Mol. Thera.

25 (2017) 523-533); takođe videti WO2014087248) opisuju bispecifično antitelo protiv CD19 i CD47.

[0008] Bispecifična antitela protiv CEACAM5 i CD47 koja sadrže uobičajeni težak lanac prema SEQ ID NO:5 (VH-CH1) i CD47-interagujući varijavilni region VL lakog lanca prema SEQ ID NO:10 opisani su u WO2019234576, EP19213002 i US62943726. Bispecifično antitelo protiv CD19 i CD47 koje sadrži uobičajeni težak lanac prema SEQ ID NO:5 i CD47-interagujući varijabilni region VL lakog lanca prema SEQ ID NO:10 je opisano u WO2014087248, koje istovremeno ciljno deluje na CD47 i CEACAM5. EP3623388 se odnosi na bispecifične vezujuće molekule koji sadrže granu koja ciljno deluje na tumor i fuzioni protein sa niskim afinitetom za blokiranje interakcije između CD47 i SIRPα. WO 2018/057955 se odnosi na bispecifična antitela koja vezuju i CD47 i mezotelin i koja sadrže uobičajeni teški lanac. WO2019016411 odnosi se na molekule bispecifičnih antitela koja ciljno deluju na CD47 i tumorski antigen.

[0009] Ostvaren je značajan napredak u lečenju hematoloških maligniteta. To je u suprotnosti sa napretkom u lečenju nekoliko tipova uznapredovalih solidnih tumora. Uprkos određenom napretku u lečenju lokalno uznapredovalih ili posebno metastatskih solidnih tipova kancera, preživljavanje bez progresije (PFS) i ukupno preživljavanje (OS) pacijenata koji pate od uznapredovalog kancera poput kolorektalnog kancera, kancera pankreasa, kancera pluća itd. je i dalje prilično ograničen i obično nema leka. Mnogo nade je položeno u imunoterapiju kancera i postoje izvesni, ali ograničeni uspesi. Tumori razvijaju mere za zaštitu svojih ćelija od uništenja T-efektorskih ćelija i drugih imunih ćelija poput makrofaga. Strategije zasnovane na imunoterapiji kancera u poslednjoj deceniji imale su određeni uspeh u suzbijanju ovih zaštitnih mera tumora i preusmeravanju T ćelija protiv ćelija kancera. Najistaknutiji primeri takvih strategija su inhibitori/aktivatori određenih imunoloških kontrolnih tačaka. Na primer, inhibitori kontrolnih tačaka kao što su antagonisti ose PD-1 pokazali su da ponovo aktiviraju T-efektorske ćelije za borbu protiv određenih solidnih kancera. Ali ne reaguju svi tipovi solidnih tumora na antagoniste PD-1 osovine, i, čak i kod tih tipova koji reaguju, često mnogo manje od 50% pacijenata ima relevantnu korist od npr. tretmana sa anti-PD-1 ili PD-L1 antitelom. Na primer, manje od 10% pacijenata sa uznapredovalim kolorektalnim kancerom ispunjava uslove za terapiju inhibitorima PD-1 ose (naročito približno 4% pacijenata sa uznapredovalim kolorektalnim kancerom koji pokazuju mikrosatelitsku nestabilnost MSI u svom kanceru imaju neku korist).

[0010] Adoptivna T-ćelijska terapija sa T-ćelijama himernih antigenskih receptora (CAR) i terapija T-ćelijskim bispecifičnim antitelima dale su obećavajuće kliničke rezultate kod hematoloških maligniteta. Ali kliničke studije sa usvojenim terapijama T-ćelija, npr. CAR T-ćelija, u različitim solidnim tumorima, uglavnom nisu pokazivale nikakve ili samo male stope odgovora (npr. Xu et al., Expert Review of Anticancer Therapy 2017, 17, 1099-1106; Greenbaum et al., Biol Blood Marrow Transplant 2020 Oct;26(10):1759-1769).

[0011] US20140242079, WO2017055389, US20140242080 i Bacac et al. (Clin. Cancer Res., 22(13), 3286-97 (2016)) opisuju CEAxCD3 T-ćelijska bispecifična antitela. T-ćelijska bispecifična antitela iz WO2017055389 pokazuju snažno povećanu potenciju/efikasnost aktiviranja T-ćelija u poređenju sa cibisatamabom u pretkliničkim studijama, jedno od ovih bispecifičnih antitela CEAxCD3 T-ćelija veće potencije je bilo u kliničkom razvoju (RO7172508 u NCT03539484). Kako se ovde koristi, "TCB2014" se odnosi na bispecifično antitelo koje se vezuje za CEA i CD3 u formatu 2+1 kao što je opisano u US20140242080, koji kao CDR regione sadrži CDR regione kao što su prikazani u SEQ ID NO: 270-276 i 290-296 iz US20140242080 (videti takođe CDR regione SEQ ID NO: 4-10 i 24-30 iz US20140242079, prezentacija od Tabanero et al. na godišnjem sastanku ASCO 2017 (J Clin Oncol 35, 2017 (suppl;abstr 3002)) obuhvata kliničke podatke faze 1 kod pacijenata sa uznapredovalim/metastatskim kolorektalnim kancerom, sa CEAxCD3 bispecifičnim antitelom RO 6958688 (cibisatamab) u monoterapiji i u kombinaciji sa anti-PD-L1 antitelom atezolizumabom. Stabilna bolest i delimični odgovori su nađeni u monoterapiji cibisatamabom, kao i u kombinaciji sa inhibitorom PD-L1 atezolizumabom. Od 2017. nisu objavljeni novi klinički podaci za Cibisatamab CEAxCD3. Jedno ispitivanje korišćenjem Q3W 100 mg cibisatamaba plus inhibitora PD-L1 atezolizumaba i prethodnog tretmana sa anti-CD20 antitelom koji ubija B-ćelije Obinutuzumab (da bi se izbeglo stvaranje antitela protiv lekova ADA kao što je prijavljeno za cibisatamab) objavljeno je u martu 2019. (ClinicalTrials. Gov. Identifier NCT038666339). Do danas nisu objavljeni podaci. Nedavno je objavljeno novo kliničko ispitivanje sa Q3W 100 mg Cibisatamaba plus atezolizumab plus RO712290 (april 2021., NCT04826003) kod pacijenata sa uznapredovalim kolorektalnim kancerom koje pokazuje mikrosatelitsku stabilnost. RO712290 je bispecifični fuzioni protein koji se vezuje za protein koji aktivira fibroblast (FAP) i za kostimulatorni faktor T-ćelija 4-1BB, izazivajući dodatnu aktivaciju T-ćelija što dovodi do povećane efikasnosti/ubijanja tumorskih ćelija ako se kombinuje sa CEAxCD3, ali takođe povećane toksičnosti, npr. povećanog oslobađanja citokina. MEDI-565 (AMG211), dalje bispecifično CEAxCD3 antitelo, jednolančano antitelo, je u kliničkom razvoju, a rezultati kliničkih ispitivanja sa tim antitelom su objavljeni (npr.

indukcija stabilne bolesti, videti npr. M. Pishvaian et al., Clin Colorectal Cancer. 2016 DEC; 15(4) 345-351).

[0012] Povećana efikasnost je prijavljena kada je CEAxCD3 bispecifično antitelo kombinovano sa antitelom koje inhibira PD-L1. Ovi podaci pokazuju da se efikasnost može postići sa CEAxCD3 bispecifičnim antitelom u uznapredovalim solidnim tumorima. Ali sveukupno u monoterapiji, kao i u kombinaciji sa inhibitorom PD-L1, većina pacijenata u kliničkoj studiji je i dalje napredovanje bolesti i oni koji su reagovali su pokazali u najboljem slučaju delimične odgovore i stabilnu bolest, ali potpuni odgovori nisu postignuti.

[0013] Jedan pristup za postizanje povećane efikasnosti sa T-ćelijskim bispecifičnim antitelom kao što je CEAxCD3 cibisatamb je kombinacija sa drugim lekom koji izaziva dodatnu aktivaciju T-ćelija preko agonističkog efekta na kostimulatorne T-ćelijske receptore kao što su 4-1BB ili CD28 i drugi. Dobro poznati neželjeni efekat T-ćelijskih bispecifičnih antitela je indukcija CRS sindroma oslobađanja citokina koji može biti višeg stepena, npr. stadijum 3 ili čak 5 (smrt). Dodavanje bispecifičnih antitela koja ciljno deluju na koštane receptore T-ćelija bispecifičnim antitelima T-ćelija može izazvati značajno povećanje oslobađanja citokina i stoga povećan rizik od CRS višeg stadijuma.

[0014] Drugi pristup za postizanje boljih rezultata mogao bi biti, na primer, dodavanje bispecifičnim antitelima T-ćelija ne samo inhibitora ose kontrolne tačke PD-1, već i dodavanje dodatnih inhibitora ili agonista kontrolne tačke. Ali do sada, nema dostupnih kliničkih podataka koji obećavaju za takav kombinovani pristup u uznapredovalom solidnom kanceru kao što je kolorektalni kancer itd. Ograničena dostupnost T-ćelija u uznapredovalim solidnim tumorima je svakako važan mehanizam koji ograničava efikasnost koja se može postići sa T-ćelijskim bispecifičnim antitelima plus inhibitorima PD-1 ose i/ili drugim inhibitorima kontrolnih tačaka ili plus bispecifičnim agonistima na koštanim receptorima T-ćelija.

[0015] T-ćelijska bispecifična antitela TAAxCD3 (TAA=Tumorski povezan antigen kao što je CEA i mnogi drugi) su visoko efikasna kod pacijenata sa hematološkim malignitetima kao što je multipli mijelom, malignitetima B-ćelija kao npr. difuzni veliki B-ćelijski limfom, folikularni limfom itd. Klinički rezultati sa Cibisatamabom CEAxCD3 pokazuju da postoji efikasnost TAAxCD3 i kod uznapredovalih solidnih tumora (videti tekst iznad), ali mnogo manje nego što se postiže kod hematoloških maligniteta. Dodavanje inhibitora osovine PD-1 može povećati efikasnost, ali ako je uopšte ograničeno. Dodavanje bispecifičnog antitela ili agonista fuzionog proteina na koštani receptor T-ćelija kao što je CD28 ili 4-1BB povećava efikasnost u pretkliničkim testovima, ali i toksičnost, npr. povećano oslobađanje citokina. Umesto da se teži dodatnoj aktivaciji T-ćelija, moglo bi biti uspešnije dodati terapeutsko sredstvo koje preusmerava tumorske ćelije na druge imune ćelije, posebno na makrofage. Ovaj pronalazak se bavi bispecifičnim antitelima CEAxCD47 koja preusmeravaju i aktiviraju makrofage protiv solidnih tumora koji eksprimiraju CEACAM5 u 1. monoterapiji i/ili 2. kao kombinovanoj terapiji, posebno sa CEAxCD3 T-ćelijskim bispecifičnim antitelima za povećanje efekta ubijanja tumorskih ćelija od strane CEAxCD3 bispecifičnih antitela. i da se izbegne, za razliku od kombinacije sa bispecifičnim agonistima kostimulativnih receptora T-ćelija, povećan rizik od CRS.

[0016] Bispecifična antitela protiv CEACAM5 i CD47 su opisana u WO2019234576. Jedan primer bispecifičnog antitela opisan u WO2019234576 je K2AC22 (SEQ ID NO:65 iz WO2019234576 prikazuje laki lanac CEACAM5 vezujućeg dela K2AC22, SEQ ID NO:6 iz WO2019234576 prikazuje uobičajeni teški lanac K2AC22 i SEQ ID NO:10 prikazuje laki lanac CD47 vezujućeg dela K2AC22). Međutim, još uvek postoji potreba za poboljšanim bispecifičnim antitelima protiv CEACAM5 i CD47, na primer za poboljšana antitela koja kombinuju visoku efikasnost sa niskom toksičnošću, niskom imunogenošću i povoljnim farmakokinetičkim svojstvima. Stoga je cilj ovog pronalaska da obezbedi nova bispecifična antitela protiv CEACAM5 i CD47 koja imaju prednost u odnosu na bispecifična antitela protiv CEACAM5 i CD47 iz prethodnog stanja tehnike. WO2018098384 odnosi se na bispecifično CEACAM5xCD47 Fab antitelo bez efektorske funkcije. WO2018057955. WO2018057955 se odnosi na bispecifično mezotelin x CD47 antitelo. WO2019016411 odnosi se na smeše multispecifičnih antitela.

SUŠTINA PRONALASKA

[0017] Ovaj pronalazak obezbeđuje nova bispecifična antitela sa prvim vezujućim delom sposobnim da se veže za humani CEACAM5 i drugim vezujućim delom sposobnim da se veže za humani CD47. Bispecifična antitela prema pronalasku indukuju visoku fagocitnu aktivnost protiv tumorskih ćelija, kako protiv tumorskih ćelija koje eksprimiraju CEACAM5 u velikim količinama, tako i protiv tumorskih ćelija koje eksprimiraju CEACAM5 u malim količinama. U jednom primeru izvođenja, bispecifična antitela indukuju svoje efekte na antitumorske ćelije uglavnom preko optimizovane fagocitoze/ćelijske fagocitoze zavisne od antitela (ADCP) usled uključivanja imunih ćelija, posebno makrofaga. U jednom primeru izvođenja, bispecifična antitela prema pronalasku pokazuju smanjeni odnos afiniteta vezivanja CEACAM3 prema CEACAM5, odnosno povećan odnos KD u odnosu na CEACAM5-CD47 antitelo K2AC22. U jednom primeru izvođenja, bispecifična antitela prema pronalasku inhibiraju vezivanje SIRPα za CD47 eksprimiran na tumorskim ćelijama i povećavaju fagocitozu tumorskih ćelija. Otkrivena bispecifična antitela koja se specifično vezuju za humani CEACAM5 i humani CD47 su takođe pogodna za upotrebu u lečenju tumora, posebno u lečenju solidnih tumora.

[0018] U jednom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje bispecifično antitelo (dalje nazvano i kao "CEAxCD47 bispecifično antitelo", ili "bispecifično antitelo prema pronalasku") koje sadrži prvi vezujući deo koji se specifično vezuje za humani CEACAM5 (dalje nazvan i kao "CEA") i drugi vezujući deo koji se specifično vezuje za humani CD47 (dalje nazvan i kao "CD47") koji se karakteriše po tome što:

a) prvi vezujući deo kao varijabilni region teškog lanca sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži CDRH1 prema SEQ ID NO: 1, CDRH2 prema SEQ ID NO: 2 i CDRH3 prema SEQ ID NO: 3,

b) prvi vezujući deo sadrži kao varijabilni region lakog lanca varijabilni region lakog lanca koji sadrži CDRL set izabran iz grupe koja se sastoji od CDRL1 prema SEQ ID NO: 17, CDRL2 prema SEQ ID NO: 18 i CDRL3 prema SEQ ID NO : 19, ili CDRL1 prema SEQ ID NO:23, CDRL2 prema SEQ ID NO:24 i CDRL3 prema SEQ ID NO:25, i

c) drugi deo za vezivanje sadrži kao varijabilni region teškog lanca varijabilni region teškog lanca koji sadrži CDRH1 prema SEQ ID NO:1, CDRH2 prema SEQ ID NO:2 i CDRH3 prema SEQ ID NO:3,

i kao varijabilni region lakog lanca varijabilni region lakog lanca koji sadrži CDRL1 prema SEQ ID NO:7, CDRL2 prema SEQ ID NO:8 i CDRL3 prema SEQ ID NO:9.

[0019] Pronalazak sadrži dalje primere izvođenja ovog aspekta:

Primer za razumevanje pronalaska je bispecifično antitelo, koje sadrži prvi vezujući deo koji se specifično vezuje za humani CEACAM5 i drugi vezujući deo koji se specifično vezuje za humani CD47 naznačen time što

a) prvi i drugi vezujući deo sadrže svaki kao varijabilni region teškog lanca, varijabilni region teškog lanca koji sadrži CDRH1 prema SEQ ID NO: 1, CDRH2 prema SEQ ID NO: 2 i CDRH3 prema SEQ ID NO: 3,

b) prvi vezujući deo sadrži kao varijabilni region lakog lanca varijabilni region lakog lanca koji sadrži CDRL1 prema SEQ ID NO: 14, CDRL2 prema SEQ ID NO: 15 i CDRL3 prema SEQ ID NO: 16, i

c) drugi vezujući deo sadrži kao varijabilni region lakog lanca varijabilni region lakog lanca koji sadrži CDRL1 prema SEQ ID NO:7, CDRL2 prema SEQ ID NO:8 i CDRL3 prema SEQ ID NO:9.

[0020] U jednom primeru izvođenja, pronalazak se odnosi na bispecifično antitelo, koje sadrži prvi vezujući deo koji se specifično vezuje za humani CEACAM5 i drugi vezujući deo koji se specifično vezuje za humani CD47 naznačen time što

b) prvi vezujući deo sadrži kao varijabilni region lakog lanca varijabilni region lakog lanca koji sadrži CDRL1 prema SEQ ID NO: 17, CDRL2 prema SEQ ID NO: 18 i CDRL3 prema SEQ ID NO: 19, i

[0021] Primer za razumevanje pronalaska je bispecifično antitelo, koje sadrži prvi vezujući deo koji se specifično vezuje za humani CEACAM5 i drugi vezujući deo koji se specifično vezuje za humani CD47 naznačen time što

a) prvi i drugi vezujući deo sadrže svaki kao varijabilni region teškog lanca, varijabilni region teškog lanca koji sadrži CDRH1 prema SEQ ID NO:1, CDRH2 prema SEQ ID NO:2 i CDRH3 prema SEQ ID NO:3,

b) prvi vezujući deo kao varijabilni region lakog lanca sadrži varijabilni region lakog lanca koji sadrži CDRL1 prema SEQ ID NO:20, CDRL2 prema SEQ ID NO:21 i CDRL3 prema SEQ ID NO:22, i

[0022] U jednom primeru izvođenja, pronalazak se odnosi na bispecifično antitelo, koje sadrži prvi vezujući deo koji se specifično vezuje za humani CEACAM5 i drugi vezujući deo koji se specifično vezuje za humani CD47 naznačen time što

b) prvi vezujući deo kao varijabilni region lakog lanca sadrži varijabilni region lakog lanca koji sadrži CDRL1 prema SEQ ID NO:23, CDRL2 prema SEQ ID NO:24 i CDRL3 prema SEQ ID NO:25, i

[0023] Primer za razumevanje pronalaska je bispecifično antitelo, koje sadrži prvi vezujući deo koji se specifično vezuje za humani CEACAM5 i drugi vezujući deo koji se specifično vezuje za humani CD47 naznačen time što

b) prvi vezujući deo sadrži kao varijabilni region lakog lanca varijabilni region lakog lanca koji sadrži CDRL1 prema SEQ ID NO:26, CDRL2 prema SEQ ID NO:27 i CDRL3 prema SEQ ID NO:28, i

[0024] U jednom primeru izvođenja, pronalazak se odnosi na bispecifično antitelo prema pronalasku, koje se karakteriše time što u prvom vezujućem delu kao varijabilni region teškog lanca sadrži varijabilni region teškog lanca SEQ ID NON i kao varijabilni region lakog lanca sadrži izabrani varijabilni region lakog lanca iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35 i SEQ ID NO: 36 i koja u drugom vezujućem delu kao varijabilni region teškog lanca sadrži teški lanac region varijabilnog lanca SEQ ID NO: 4 i kao varijabilni region lakog lanca sadrži region varijabilnog lakog lanca SEQ ID NO: 10.

[0025] U jednom primeru izvođenja, pronalazak se odnosi na bispecifično antitelo prema pronalasku, koje je naznačeno time što u prvom vezujućem delu kao varijabilni region teškog

1

lanca sadrži varijabilni region teškog lanca SEQ ID NON i kao varijabilni region lakog lanca sadrži varijabilni region lakog lanca prema SEQ ID NO: 32 i u drugom vezujućem delu kao varijabilni region teškog lanca sadrži region varijabilnog lanca SEQ ID NON i kao varijabilni region lakog lanca sadrži varijabilni region lakog lanca koji ima SEQ ID NO: 10.

[0026] U jednom primeru izvođenja, pronalazak se odnosi na bispecifično antitelo prema pronalasku, koje je naznačeno time što u prvom vezujućem delu kao varijabilni region teškog lanca sadrži varijabilni region teškog lanca SEQ ID NON i kao varijabilni region lakog lanca sadrži varijabilni region lakog lanca prema SEQ ID NO: 33 i u drugom vezujućem delu kao varijabilni region teškog lanca sadrži region varijabilnog lanca SEQ ID NON i kao varijabilni region lakog lanca sadrži varijabilni region lakog lanca koji ima SEQ ID NO: 10.

[0027] U jednom primeru izvođenja, pronalazak se odnosi na bispecifično antitelo prema pronalasku, koje je naznačeno time što u prvom vezujućem delu kao varijabilni region teškog lanca sadrži varijabilni region teškog lanca SEQ ID NON i kao varijabilni region lakog lanca sadrži varijabilni region lakog lanca prema SEQ ID NO: 34 i koji u drugom vezujućem delu kao varijabilni region teškog lanca sadrži region varijabilnog lanca SEQ ID NON i kao varijabilni region lakog lanca sadrži varijabilni region lakog lanca koji ima SEQ ID NO: 10.

[0028] U jednom primeru izvođenja, pronalazak se odnosi na bispecifično antitelo prema pronalasku, koje je naznačeno time što u prvom vezujućem delu kao varijabilni region teškog lanca sadrži varijabilni region teškog lanca SEQ ID NON i kao varijabilni region lakog lanca sadrži varijabilni region lakog lanca prema SEQ ID NO: 35 i u drugom vezujućem delu kao varijabilni region teškog lanca sadrži region varijabilnog lanca SEQ ID NON i kao varijabilni region lakog lanca sadrži varijabilni region lakog lanca koji ima SEQ ID NO: 10.

[0029] U jednom primeru izvođenja, pronalazak se odnosi na bispecifično antitelo prema pronalasku, koje je naznačeno time što u prvom vezujućem delu kao varijabilni region teškog lanca sadrži varijabilni region teškog lanca SEQ ID NON i kao varijabilni region lakog lanca sadrži varijabilni region lakog lanca prema SEQ ID NO:36 i koji u drugom vezujućem delu kao varijabilni region teškog lanca sadrži region varijabilnog lanca SEQ ID NON i kao varijabilni region lakog lanca sadrži varijabilni region lakog lanca koji ima SEQ ID NO:10.

[0030] U jednom primeru izvođenja, pronalazak se odnosi na bispecifično antitelo prema pronalasku, koje je naznačeno time što u prvom vezujućem delu sadrži teški lanac SEQ ID NO:5 i laki lanac izabran iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO:37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40 i SEQ ID NO: 41 i koje u drugom vezujućem delu sadrži teški lanac SEQ ID NO: 5 i laki lanac koji ima SEQ ID NO: 11.

[0031] U jednom primeru izvođenja, pronalazak se odnosi na bispecifično antitelo prema pronalasku, naznačeno time što u prvom vezujućem delu sadrži teški lanac SEQ ID NO:5 i laki lanac SEQ ID NO:37 i u drugom vezujućem delu sadrži teški lanac SEQ ID NO:5 i laki lanac koji ima SEQ ID NO:11.

[0032] U jednom primeru izvođenja, pronalazak se odnosi na bispecifično antitelo prema pronalasku, naznačeno što u prvom vezujućem delu sadrži teški lanac SEQ ID NO:5 i laki lanac SEQ ID NO:38 i u drugom vezujućem delu sadrži teški lanac SEQ ID NO:5 i laki lanac koji ima SEQ ID NO:11.

[0033] U jednom primeru izvođenja, pronalazak se odnosi na bispecifično antitelo prema pronalasku, naznačeno time što u prvom vezujućem delu sadrži teški lanac SEQ ID NO:5 i laki lanac SEQ ID NO:39 i u drugom vezujućem delu sadrži teški lanac SEQ ID NO:5 i laki lanac koji ima SEQ ID NO:11.

[0034] U jednom primeru izvođenja, pronalazak se odnosi na bispecifično antitelo prema pronalasku, naznačeno time što u prvom vezujućem delu sadrži teški lanac SEQ ID NO:5 i laki lanac SEQ ID NO:40 i u drugom vezujućem delu sadrži teški lanac SEQ ID NO:5 i laki lanac koji ima SEQ ID NO:11.

[0035] U jednom primeru izvođenja, pronalazak se odnosi na bispecifično antitelo prema pronalasku, naznačeno time što u prvom vezujućem delu sadrži teški lanac SEQ ID NO:5 i laki lanac SEQ ID NO:41 i u drugom vezujućem delu sadrži teški lanac SEQ ID NO:5 i laki lanac koji ima SEQ ID NO:11.

[0036] U jednom primeru izvođenja, pronalazak se odnosi na bispecifično antitelo koje sadrži CEACAM5 vezujuće delove koji su isti kao oni u K2AC82, K2AC84, K2AC91, K2AC100 ili K2AC117 bispecifičnom antitelu. U takvom primeru izvođenja, bispecifično antitelo sadrži:

● CDR regione lakog lanca prema SEQ ID NO:14-16, VL prema SEQ ID NO:32, i/ili VLCL prema SEQ ID NO:37 (K2AC82),

● CDR regione SEQ ID NO:17-19, VL prema SEQ ID NO:33, i/ili VLCL prema SEQ ID NO:38 (K2AC84),

● CDR regione prema SEQ ID NO:20-22, VL prema SEQ ID NO:34, i/ili VLCL prema SEQ ID NO:39 (K2AC91),

● CDR regione prema SEQ ID NO:23-25, VL prema SEQ ID NO:35, i/ili VLCL prema SEQ ID NO:40 (K2AC100),

● CDR regione prema SEQ ID NO:26-28, VL prema SEQ ID NO:36, i/ili VLCL prema SEQ ID NO:41 (K2AC117), ili

● derivate koji sadrže CDR regione i/ili lake i teške lance navedenih antitela kao što je gore opisano.

[0037] U jednom primeru izvođenja, sekvence konstantnog i varijabilnog okvirnog regiona su humane.

[0038] U jednom primeru izvođenja, bispecifično antitelo prema pronalasku je naznačeno time što svaki od prvog i drugog vezujućeg dela sadrži teški lanac imunoglobulina i laki lanac imunoglobulina. U jednom primeru izvođenja, bispecifično antitelo prema pronalasku je antitelo pune dužine. U jednom primeru izvođenja, bispecifično antitelo prema pronalasku je naznačeno time što je humanog IgG1 tipa.

[0039] U jednom primeru izvođenja, bispecifično antitelo prema pronalasku naznačeno je time što sadrži prvi vezujući deo specifičan za CEA, koji sadrži varijabilni domen lambda lakog lanca (VL) i konstantni domen lambda lakog lanca (CL) i drugi vezujući deo specifičan za CD47, koji sadrži varijabilni domen kapa lakog lanca (VK) i konstantni domen kapa lakog lanca (CK) (κλ bispecifično antitelo, κλ telo). U jednom takvom primeru izvođenja, drugi vezujući deo sadrži kao laki lanac LC (CD47 VKCK) laki lanac SEQ ID NO:11. Kapa laki lanac SEQ ID NO: 11 sadrži kao varijabilni domen lakog lanca varijabilni domen lakog lanca SEQ ID NO: 10 (Mab CD47 VK) i kao konstantni domen lakog lanca domen konstantnog lakog lanca SEQ ID NO: 13 ( CD47 CK).

[0040] U jednom primeru izvođenja, bispecifično antitelo prema pronalasku je potpuno humani bispecifični IgG (posebno IgG1) format i pored toga κλ bispecifično antitelo.

[0041] U jednom primeru izvođenja, bispecifično antitelo prema pronalasku karakteriše se kao κλ bispecifično antitelo i sadrži uobičajeni teški lanac (cHC). U jednom primeru izvođenja, zajednički teški lanac sadrži kao varijabilni domen teškog lanca VH varijabilni domen teškog lanca SEQ ID NO:4. U jednom primeru izvođenja, bispecifično antitelo prema pronalasku je naznačeno time što sadrži uobičajeni teški lanac VH-CH1 SEQ ID NO:5. U jednom primeru izvođenja, bispecifično antitelo prema pronalasku karakteriše se time što sadrži uobičajeni teški lanac (VH-CH1-CH2-CH3) SEQ ID NO:6.

[0042] U jednom primeru izvođenja, bispecifično antitelo prema pronalasku je naznačeno time što je monovalentno za prvi vezujući deo i monovalentno za drugi vezujući deo.

[0043] U jednom primeru izvođenja, bispecifično antitelo prema pronalasku je naznačeno time što je u kompeticiji za vezivanje za CEACAM5 sa anti-CEACAM5 antitelom SM3E, koje sadrži VK i VH domene VK i VH sekvenci SEQ ID NO:43 i 44. U jednom primeru izvođenja, bispecifično antitelo prema pronalasku naznačeno je time što nije u kompeticiji za vezivanje za

1

CEACAM5 sa cibisatamabom i/ili sa MEDI-565 (AMG211; (MD Oberst et al., mAbs 6 (2014) 1571-1584)). U jednom primeru izvođenja, bispecifična CEAxCD47 antitela prema pronalasku mogu se primenjivati paralelno sa CEAxCD3 bispecifičnim antitelima cibisatamabom i/ili MEDI-565.

[0044] U sledećem primeru izvođenja, bispecifično antitelo prema pronalasku je naznačeno time što je konstruisano tako da ima Fc region sa modifikovanim oligosaharidima. U sledećem primeru izvođenja, bispecifično antitelo prema pronalasku je naznačeno time što sadrži Fc region koji je konstruisan da ima smanjen broj ostataka fukoze u poređenju sa istim bispecifičnim antitelom koje nije konstruisano glikoinženjeringom.

[0045] U jednom primeru izvođenja, bispecifično antitelo prema pronalasku sadrži smanjenu količinu fukoze u oligosaharidnom lancu(lancima).

[0046] U jednom primeru izvođenja, bispecifično antitelo prema pronalasku je naznačeno time što je 50% do 100% N-vezanih oligosaharida u Fc regionu nefukozilovano.

[0047] U jednom primeru izvođenja, bispecifično antitelo prema pronalasku naznačeno je time što je količina fukoze u oligosaharidnom lancu(lancima) bispecifičnog antitela prema pronalasku smanjena za 80% do 100% u poređenju sa sadržajem fukoze u odgovarajućem antitelu, ako se ne primenjuje postupak afukozilacije.

[0048] U jednom primeru izvođenja, bispecifično antitelo je naznačeno time da je 80% do 100% N-vezanih oligosaharida u Fc regionu podeljeno na pola i nefukozilovano. Afukozilovana bispecifična antitela koja se vezuju za CEACAM5 i CD47 uopšte i njihova proizvodnja i prečišćavanje opisani su u WO2019234576, US 62/943,726 i EP19213002.

[0049] U jednom primeru izvođenja, bispecifično antitelo prema pronalasku je naznačeno time što sadrži jednu, dve ili tri aminokiselinske supstitucije u Fc regionu izabrane iz grupe koja se sastoji od mono-supstitucija S239D, I332E, G236A, bi-supstitucija I332E i G236A, S239D i I332E, S239D i G236A, i trostrukih supstitucija S329D i I332E i G236A; i Fc region koji je konstruisan da ima smanjen broj ostataka fukoze u poređenju sa istim ali ne-glikoinženjeringom bispecifičnim antitelom.

[0050] U jednom primeru izvođenja, bispecifična antitela prema pronalasku su naznačena odnosom KD vrednosti za vezivanje za rekombinantni CEACAM3 i rekombinantni CEACAM5 faktora od 100 ili više (Primer 3, Tabela 2).

[0051] U jednom primeru izvođenja, bispecifična antitela prema pronalasku su naznačena odnosom KD vrednosti za vezivanje za rekombinantni CEACAM3 i rekombinantni CEACAM5 faktora između 100 i 200.

[0052] U jednom primeru izvođenja, bispecifična antitela ovog pronalaska imaju relativno razdvajanje vezivanja za CEACAM5 i CEACAM3 (diskriminativno vezivanje). Uprkos, u poređenju sa bispecifičnim CEAxCD47 antitelom K2AC22, povećanom vezivanju za rekombinantni humani CEACAM5 protein pune dužine, vezivanje za rekombinantni humani CEACAM3 pune dužine se ne povećava proporcionalno. Količnik/odnos KD za vezivanje za CEACAM3 pune dužine u odnosu na CEACAM5 pokazuje povećanje sa 83 (K2AC22) na 137 (K2AC84) na 146 (K2AC100). Ovo je jednako povećanju diskriminativnog vezivanja od 65% - 76% (Primer 3, Tabela 2).

[0053] U jednom primeru izvođenja, bispecifična antitela prema pronalasku su naznačena fagocitozom zavisnom od koncentracije (ADCP od CEACAM5 koji eksprimira tumorske ćelijske linije pomoću humanih makrofaga). ADCP se meri prema pronalasku kao indeks fagocitoze (EC50 i/ili maksimum) imadžingom, obično sa E:T odnosom od 1:3 (humani makrofagi:ciljne ćelije (tumorske ćelije); videti npr. sliku 2 i tabele 6 do 9 za EC50 vrednosti i za maksimalni indeks fagocitoze Emax). Rezultati na slici 2 su dobijeni sa E:T od 1:3. Detalji testa su opisani u Primeru 7; test imadžinga zasnovan na CellInsight CX5. Ako nije drugačije navedeno, vrednosti indeksa fagocitoze se mere takvim postupkom imadžinga.

[0054] U jednom primeru izvođenja, bispecifična antitela prema pronalasku su naznačena povećanjem od najmanje 8% maksimalnog indeksa fagocitoze (Emax) LoVo tumorskih ćelija u poređenju sa indeksom fagocitoze K2AC22. U jednom primeru izvođenja, povećanje je između 8% i 20% za LoVo tumorske ćelije u poređenju sa indeksom fagocitoze K2AC22. U jednom primeru izvođenja, bispecifično antitelo prema pronalasku je naznačeno povećanjem od najmanje 8% maksimalnog indeksa fagocitoze tumorskih ćelija Ls174T u poređenju sa indeksom fagocitoze K2AC22. U jednom primeru izvođenja, povećanje je između 8% i 25% za ćelije tumora Ls174T u poređenju sa indeksom fagocitoze K2AC22. (Primer 7, Tabela 5). LoVo i LS174T su tumorske ćelije sa prilično niskom ekspresijom CEACAM5 (videti tabelu 3 u primeru 5).

[0055] U jednom primeru izvođenja, bispecifična antitela prema pronalasku inhibiraju interakciju između humanog CD47 i humanog SIRPα. U jednom primeru izvođenja, bispecifična antitela prema pronalasku inhibiraju interakciju između CD47 i SIRPα na MKN-45 ćelijama sa IC50 koji je faktor 10 ili više niži od IC50 izmerenog za K2AC22 pod istim eksperimentalnim uslovima. U jednom primeru izvođenja, navedeni faktor je između 10 i 30. U jednom primeru izvođenja, bispecifična antitela prema pronalasku inhibiraju interakciju između CD47 i SIRPα na MKN-45 ćelijama sa IC50 od 0.1 nM ili niže. U jednom primeru

1

izvođenja, bispecifična antitela prema pronalasku inhibiraju interakciju između CD47 i SIRPα na MKN-45 ćelijama sa IC50 od 0.1 nM do 0.04 nM (videti Primer 10 i Tabelu 12).

[0056] U jednom primeru izvođenja, bispecifična antitela prema pronalasku su naznačena time što poseduju dva ili više od sledećih svojstava: da imaju odnos KD vrednosti za vezivanje za rekombinantni CEACAM3 i rekombinantni CEACAM5 faktor od 100 ili više, imaju relativno razdvajanje vezivanja za CEACAM5 i CEACAM3, koji ima ADCP zavisno od koncentracije, ima najmanje 8% povećanja maksimalnog indeksa fagocitoze (Emax) LoVo tumorskih ćelija u poređenju sa indeksom fagocitoze K2AC22 i imaju sposobnost da inhibiraju interakciju između humanog CD47 i humanog SIRPα na više od 10 puta niže IC50 u poređenju sa K2AC22

[0057] Bispecifično antitelo K2AC22 je bispecifično antitelo koje se vezuje za humani CEACAM5 i humani CD47 i opisano u WO2019234576. K2AC22 sadrži uobičajeni teški lanac SEQ ID NO:6, u delu koji se vezuje za CEACAM5 laki lanac SEQ ID NO:42 i u delu koji se vezuje za CD47 laki lanac SEQ ID NO:11; CDR regioni K2AC22 su prikazani u SEQ ID NO: 1-3, 7-9 i 29-31 (Tabela 1).

[0058] U jednom primeru izvođenja, bispecifično antitelo prema pronalasku je naznačeno vezivanjem za rekombinantni humani CD47 sa afinitetom vezivanja (KD) od 100 nM do 600 nM i u jednom primeru izvođenja sa afinitetom vezivanja od 100 nM do 500 nM (mereno interferometrijom biosloja).

[0059] U jednom primeru izvođenja, bispecifično antitelo prema pronalasku je naznačeno vezivanjem za rekombinantni humani CEACAM5 sa KD između 2 nM i 10 nM (Primer 3, Tabela 2). U jednom primeru izvođenja, bispecifična antitela pronalaska imaju 10 do 50 puta veći afinitet vezivanja (niži KD) i u jednom primeru izvođenja 20 do 50 puta, u poređenju sa najsavremenijim bispecifičnim antitelom K2AC22 (Primer 3, Tabela 2).

[0060] U jednom primeru izvođenja, bispecifična antitela prema pronalasku su korisna za kombinovani tretman sa bispecifičnim antitelima CEAkCD3 T-ćelija kao što je cibisatamab.

[0061] U jednom primeru izvođenja, bispecifično antitelo prema pronalasku je naznačeno specifičnim vezivanjem za CEACAM5, ali nije u kompeticiji sa TCB2014 i cibisatamabom za vezivanje za CEACAM5 na tumorskim ćelijama, npr. MKN-45 i LS174T (Primer 8).

[0062] U jednom primeru izvođenja, bispecifično antitelo prema pronalasku je naznačeno time da bispecifično antitelo TCB2014, koje se vezuje za humani CEACAM5 i CD3ε (gore), u koncentraciji od 300 nM, ne pomera EC50 krive vezivanja bispecifičnog antitela prema prema pronalasku na ćelije MKN-45 ili u drugom primeru izvođenja na ćelije LS174T za više od faktora 3, u jednom primeru izvođenja prema višim koncentracijama (Primer 8 i Slika 5). U tom slučaju bispecifično antitelo prema pronalasku i TCB2014 su definisani kao

1

"nekompetitivni" i smatraju se sposobnim da se vežu istovremeno za CEA bez značajnog mešanja u vezivanje za pomenuti CEA. U tom slučaju bispecifično antitelo prema pronalasku i TCB2014 su definisani kao „nekompetitivni“ i smatraju se sposobnim da se vežu istovremeno za CEA bez značajnog mešanja u njihovo vezivanje za pomenutu CEA i stoga mogu razviti svoj efekat na fagocitozu (CEAxCD47) neometano i takođe njegov efekat na aktivaciju T-ćelija (TCB2014 i cibisatamab) neometano, čak i ako su terapeutski nivoi oba leka istovremeno prisutni u krvi i/ili tumorskom tkivu. Ovo olakšava kombinovani tretman TCB2014 ili cibisatamaba sa CEAxCD47 bispecifičnim antitelima pronalaska.

[0063] U jednom primeru izvođenja, CEAxCD47 bispecifična antitela pronalaska kombinovana sa CEAxCD3 bispecifičnim antitelom TCB2014 pokazuju najmanje aditivni ili čak sinergistički % ubijanja tumorskih ćelija u testu koji sadrži npr. LoVo ili LS174T tumorske ćelije i humane makrofage i T-ćelije izvedene od istog dobrovoljnog humanog donora.

[0064] U jednom primeru izvođenja, CEAxCD47 bispecifična antitela pronalaska, kombinovana sa CEAxCD3 bispecifičnim antitelom TCB2014 pokazuju najmanje aditivno ili čak sinergističko ubijanje tumorskih ćelija u testu koji sadrži npr. LoVo ili LS174T tumorske ćelije i humane makrofage i T-ćelije izvedene od istog dobrovoljnog humanog donora.

[0065] Ovaj pronalazak dalje obezbeđuje ekspresioni vektor koji sadrži jedan ili više polinukleotida koji kodiraju bispecifično antitelo prema pronalasku.

[0066] Ovaj pronalazak dalje obezbeđuje ćeliju domaćina koja sadrži ekspresioni vektor preema pronalasku.

[0067] Ovaj pronalazak dalje obezbeđuje postupak za proizvodnju bispecifičnog antitela prema pronalasku, naznačen time što sadrži:

a) kultivisanje ćelije domaćina koja sadrži ekspresioni vektor koji kodira pomenuto bispecifično antitelo pod uslovima koji dozvoljavaju proizvodnju pomenutog antitela prema pronalasku, i

b) izolovanje pomenutog antitela pri čemu je navedeno antitelo sposobno da se specifično veže za CEACAM5 i CD47.

[0068] Drugi polipeptid koji kodira antitelo prema pronalasku može biti jedan polipeptid koji kodira sva odgovarajuća dva različita laka lanca i uobičajeni teški lanac ili odvojene polipeptide, koji posebno kodiraju odgovarajuće lake i teške lance. Takođe, ekspresioni vektor može biti jedan, dva ili tri vektora koji eksprimiraju odgovarajuća dva različita laka lanca i kom

1

[0069] Ovaj pronalazak dalje obezbeđuje antitelo prema pronalasku za upotrebu u postupku indukovanja ćelijske lize tumorske ćelije, koji sadrži dovođenje u kontakt tumorske ćelije sa navedenim antitelom. Tumorska ćelija je humana tumorska ćelija, poželjno u pacijentu. U jednom primeru izvođenja indukovana je ćelijska liza tumorske ćelije, tumorska ćelija je ćelija kolorektalnog kancera, NSCLC (nesitnoćelijski kancer pluća), ćelija kancera želuca, ćelija kancera pankreasa, ćelija kancera dojke ili druga tumorska ćelija koja eksprimira CEACAM5. Ovaj pronalazak dalje obezbeđuje antitelo prema pronalasku za upotrebu u postupku lečenja subjekta koji ima kancer koji eksprimira CEACAM5, postupak sadrži primenu na subjekta terapeutski efikasne količine pomenutog antitela.

[0070] Predmetni pronalazak dalje obezbeđuje antitelo prema pronalasku za upotrebu u postupku povećanja vremena preživljavanja kod subjekta koji ima kancer koji eksprimira CEACAM5, pri čemu pomenuti postupak sadrži primenu na pomenutog subjekta terapeutski efikasne količine pomenutog antitela. U sledećem primeru izvođenja pronalaska je takav postupak, kancer je kolorektalni kancer, nesitnoćelijski kancer pluća (NSCLC), kancer želuca, kancer pankreasa ili dojke. Ovaj pronalazak dalje obezbeđuje antitelo prema pronalasku za upotrebu u postupku lečenja subjekta koji ima kancer koji eksprimira CEACAM5, postupak koji sadrži primenu na subjekta terapeutski efikasne količine pomenutog antitela. U sledećem primeru izvođenja pronalaska, bispecifično antitelo prema pronalasku se primenjuje u kombinaciji sa hemoterapijom ili terapijom zračenjem na humanog subjekta.

[0071] Svaka referenca u opisu na postupke lečenja ili in vivo dijagnoze odnosi se na jedinjenja, farmaceutske kompozicije i lekove ovog pronalaska za upotrebu u postupku lečenja ljudskog ili životinjskog tela terapijom ili za in vivo dijagnozu.

[0072] Ovaj pronalazak dalje obezbeđuje bispecifično antitelo prema pronalasku, za upotrebu u istovremenoj, odvojenoj ili uzastopnoj kombinaciji sa drugim bispecifičnim antitelom koje sadrži treći vezujući deo koji se specifično vezuje za humani CEACAM5, i četvrti vezujući deo koji se specifično vezuje za humani CD3ε u lečenju subjekta koji ima kancer koji eksprimira CEACAM5. Dodatni primer izvođenja pronalaska je bispecifično antitelo prema pronalasku, za upotrebu u istovremenoj, odvojenoj ili uzastopnoj kombinaciji sa TCB2014 ili cibisatamabom u lečenju subjekta koji ima kancer koji eksprimira CEACAM5.

[0073] Dodatni primer izvođenja pronalaska je bispecifično antitelo prema pronalasku, za upotrebu u istovremenoj, odvojenoj ili uzastopnoj kombinaciji sa navedenim drugim bispecifičnim antitelom u lečenju subjekta koji ima kancer koji eksprimira CEACAM5.

[0074] Dodatni primer izvođenja pronalaska je bispecifično antitelo prema pronalasku, za upotrebu prema pronalasku, naznačeno time što se bispecifično antitelo prema pronalasku i

1

drugo bispecifično antitelo primenjuju na pomenutog subjekta naizmenično u intervalima od 6 do 15 dana.

[0075] Dodatni primer izvođenja pronalaska je bispecifično antitelo prema pronalasku, za upotrebu prema pronalasku, naznačeno time što se bispecifično antitelo prema pronalasku i drugo bispecifično antitelo primenjuju na pomenutog subjekta istovremeno u intervalima od 6 do 15 dana.

[0076] Dodatni primer izvođenja pronalaska je prvo bispecifično antitelo prema pronalasku, koje sadrži prvi vezujući deo, koji se specifično vezuje za humani CEACAM5 i drugi vezujući deo, koji se specifično vezuje za humani CD47 prema pronalasku, za upotrebu prema pronalasku, naznačen time što pomenuti kancer je kolorektalni kancer, nesitnoćelijski kancer pluća (NSCLC), kancer želuca, kancer pankreasa i kancer dojke.

[0077] Takođe je otkriveno antitelo prema pronalasku za upotrebu u postupku za lečenje humanog pacijenta sa dijagnostikovanim tumorom (kancerom), posebno solidnim tumorom, posebno solidnim kancerom koji eksprimira CEACAM5, posebno kolorektalnim kancerom, nesitnoćelijskim kancerom pluća (NSCLC), kancerom želuca, kancerom pankreasa i kancerom dojke, koji sadrži primenu efikasne količine bispecifičnog antitela prema pronalasku i drugog bispecifičnog antitela kao što su gore opisani, protiv CEA i CD3 (u jednom primeru izvođenja TCB2014, u jednom primeru izvođenja cibisatamab), na humanog pacijenta, postupak koji sadrži naknadnu primenu na pacijenta doze od 0.1 do 10 mg/kg, u sledećem primeru izvođenja od 0.5 do 10 mg/kg, u sledećem primeru izvođenja od 1 do 2 mg/kg pomenutog drugog anti CEAxCD3 antitela, npr. nedeljno tokom 4 do 12 nedelja ili q2w (jednom svake dve nedelje), tokom 4 do 12 nedelja i primenu nakon ovih 4 do 12 nedelja i nakon čekanja na dodatna 2 ili 3 ili 4 poluvremena eliminacije pomenutog anti CEAxCD3 antitela na pacijenta u dozi od 0.1 do 20 mg/kg antitela prema pronalasku, primenu na pacijenta pomenutog antitela prema pronalasku jednom nedeljno (q1), jednom u dve nedelje (q2w), jednom u tri nedelje (q3w) ili izborno jednom u četiri nedelje (q4w) tokom npr. još 12 nedelja, čekajući 2 ili 3 ili 4 poluživota eliminacije pomenutog antitela prema pronalasku i zatim izborno ponavljajući navedeni ciklus primene CEA × CD3 bispecifičnog antitela, nakon čega sledi primena bispecifičnog antitela prema pronalasku i izborno ponoviti taj ciklus itd.

[0078] Kako pomenuto CEA × CD3 bispecifično antitelo i CEA × CD47 bispecifično antitelo prema pronalasku nisu kompetitivni, dva bispecifična antitela se takođe mogu primeniti na način („istovremeni način“) da pacijent doživljava terapeutski efikasne koncentracije u plazmi i tkivu oba bispecifična antitela paralelno, npr. primenom na pacijenta u približno isto vreme doze od 0.1 do 10 mg/kg, u sledećem primeru izvođenja od 0.5 do 10 mg/kg, u sledećem

1

primeru izvođenja od 1 do 2 mg/kg bispecifičnog antitela CEA × CD3 i doze od 3 do 30 mg/kg u sledećem primeru izvođenja od 1 do 10 mg/kg bispecifičnog antitela CEA × CD47 prema pronalasku, nakon čega sledi jedna ili više ovih kombinovanih primena sa učestalošću od jednom u nedelju dana (q1w) ili jednom u dve nedelje (q2w) ili jednom u tri nedelje (q3w) ili izborno jednom u četiri nedelje (q4w). Termin "q1w" označava primenu jednom nedeljno; q2w označava primenu svake dve nedelje itd.

[0079] Iz bezbednosnih razloga može biti potrebno u jednom primeru izvođenja da se započne terapija sa navedenim drugim antitelom CEAxCD3 bez dodavanja bsAb pronalaska i da se počne istovremeno primena dva bsAb tek pošto je sindrom oslobađanja citokina (CRS) tipičan za CEAxCD3 gotov (obično nakon 2 ili 3 doze TAAxCD3 antitela).

[0080] Ovaj pronalazak dalje obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži antitelo prema pronalasku i farmaceutski prihvatljiv ekscipijens ili nosač.

[0081] Ovaj pronalazak dalje obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži antitelo prema pronalasku za upotrebu kao lek. U jednom takvom primeru izvođenja, ovaj pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži antitelo prema pronalasku za upotrebu kao lek u lečenju poremećaja solidnog tumora. U jednom primeru izvođenja, farmaceutska kompozicija sadrži antitelo prema pronalasku za upotrebu kao lek u lečenju kolorektalnog kancera, NSCLC (nestinoćelijskog kancera pluća), kancera želuca, kancera pankreasa ili kancera dojke.

[0082] Ovaj pronalazak dalje obezbeđuje kompoziciju koja sadrži bispecifično antitelo prema pronalasku, za upotrebu u istovremenoj, odvojenoj ili uzastopnoj kombinaciji u lečenju subjekta koji ima kancer koji eksprimira CEACAM5, sa TCB2014 ili cibisatamabom kao što je gore definisano, pri čemu pomenuto drugo bispecifično antitelo u koncentraciji od 300 nM ne pomera EC50 krive vezivanja za MKN-45 i/ili LS174T ćelije bispecifičnog antitela prema pronalasku za više od faktora 3, u jednom primeru izvođenja ka višim koncentracijama. Sledeći primer izvođenja pronalaska je takva kompozicija prema pronalasku, koja je naznačena time što je kancer kolorektalni kancer, nesitnoćelijski kancer pluća (NSCLC), kancer želuca, kancer pankreasa ili kancer dojke.

[0083] Ovaj pronalazak dalje obezbeđuje antitelo prema pronalasku za upotrebu u proizvodnji leka u lečenju solidnih tumorskih poremećaja. Sledeći primer izvođenja pronalaska je antitelo prema pronalasku za upotrebu u lečenju kolorektalnog kancera, NSCLC (nesitnoćelijskog kancera pluća), kancera želuca, kancera pankreasa ili kancera dojke. Sledeći aspekt pronalaska obezbeđuje antitelo prema pronalasku za upotrebu u postupku indukovanja ćelijske lize tumorske ćelije koji sadrži dovođenje u kontakt tumorske ćelije sa bispecifičnim antitelom bilo

2

kog od gore opisanih primera izvođenja. U nekim primerima izvođenja, tumorska ćelija je ćelija kolorektalnog kancera, NSCLC (nesitnoćelijskog kancera pluća), ćelija kancera želuca, ćelija kancera pankreasa ili ćelija kancera dojke. U jednom primeru izvođenja, ćelijska liza je indukovana ćelijskom fagocitozom zavisnom od antitela i/ili ćelijski posredovanom citotoksičnošću bispecifičnog antitela prema pronalasku. Sledeći aspekt pronalaska obezbeđuje antitelo prema pronalasku

[0084] za upotrebu u postupku lečenja subjekta koji ima kancer koji abnormalno eksprimira CEACAM5, postupak koji sadrži primenu na subjekta terapeutski efikasne količine bispecifičnog antitela bilo kog od gore opisanih primera izvođenja.

[0085] Sledeći aspekt pronalaska obezbeđuje postupak lečenja subjekta koji ima kancer koji abnormalno eksprimira CEACAM5, postupak koji sadrži primenu na subjekta terapeutski efikasne količine bispecifičnog antitela bilo kog od gore opisanih primera izvođenja u kombinaciji sa bispecifičnim antitelom koji se vezuje za humani CEA i humani CD3. Kako CEAxCD3 bispecifična antitela i CEAxCD47 bispecifična antitela prema pronalasku nisu ili su samo minimalno u kompeticiji, mogu se primenjivati ne samo uzastopno već i paralelno (istovremeno) što može biti prednost jer ubijanje tumorskih ćelija angažovanjem T-ćelija bispecifičnim antitelom CEAxCD3 i istovremeno zauzimanjem makrofaga sa bispecifičnim antitelom CEAxCD47 prema pronalasku može biti aditivno ili čak sinergističko, što znači da se efikasnost povećava ako se oba leka daju paralelno.

[0086] Sledeći aspekt pronalaska obezbeđuje postupak povećanja preživljavanja bez progresije i/ili ukupnog vremena preživljavanja kod subjekta koji ima kancer koji abnormalno eksprimira CEACAM5, pri čemu pomenuti postupak sadrži primenu na navedenog subjekta terapeutski efikasne količine bispecifičnog antitela bilo kog od gore opisanih primera izvođenja. U jednom primeru izvođenja, kancer je kolorektalni kancer, nesitnoćelijski kancer pluća (NSCLC), kancer želuca, kancer pankreasa ili kancer dojke ili drugi kancer koji eksprimira CEACAM5.

[0087] U određenim primerima izvođenja ovih postupaka, bispecifično antitelo prema pronalasku se primenjuje u kombinaciji sa hemoterapijom ili terapijom zračenjem. U jednom primeru izvođenja, subjekat je pacijent koji boluje od kolorektalnog kancera ili kancera pluća ili kancera želuca ili kancera pankreasa ili kancera dojke ili drugog kancera koji eksprimira CEACAM5.

[0088] Sledeći aspekt pronalaska obezbeđuje antitelo prema pronalasku za upotrebu u postupku lečenja subjekta koji ima kancer koji abnormalno eksprimira CEACAM5, pri čemu postupak sadrži primenu na subjekta terapeutski efikasne količine bispecifičnog antitela bilo kog od gore opisanih primera izvođenja u kombinaciji sa bispecifičnim antitelom protiv humanog CEA i humanog CD3epsilon.

[0089] Sledeći aspekt pronalaska obezbeđuje antitelo prema pronalasku za upotrebu u postupku povećanja vremena preživljavanja bez progresije i/ili ukupnog vremena preživljavanja kod subjekta koji ima kancer koji abnormalno eksprimira CEACAM5, pri čemu pomenuti postupak sadrži primenu na navedenog subjekta terapeutski efikasne količine bispecifičnog antitela bilo kog od gore opisanih primera izvođenja. U jednom primeru izvođenja, kancer je kolorektalni kancer, nesitnoćelijski kancer pluća (NSCLC), kancer želuca, kancer pankreasa ili kancer dojke.

[0090] U određenim primerima izvođenja ovih postupaka, bispecifično antitelo prema pronalasku se primenjuje u kombinaciji sa hemoterapijom ili terapijom zračenjem. U jednom primeru izvođenja, subjekat je pacijent sa kancerom sa kolorektalnim kancerom ili kancerom pluća ili kancerom želuca ili kancerom pankreasa ili kancerom dojke ili drugim kancerom koji eksprimira CEACAM5.

[0091] Sledeći primer izvođenja pronalaska obezbeđuje antitelo prema pronalasku za upotrebu u bilo kom od gore opisanih postupaka lečenja. U jednom primeru izvođenja, kancer je izabran iz grupe koja se sastoji od kolorektalnog kancera, nesitnoćelijskog kancera pluća (NSCLC), kancera želuca, kancera pankreasa i kancera dojke.

KRATAK OPIS SLIKA

[0092]

Slike 1A-1F. Vezivanje pet CD47xCEACAM5 bispecifičnih antitela prema pronalasku (K2AC82, K2AC84, K2AC91, K2AC100 i K2AC117) zavisno od koncentracije, u poređenju sa najsavremenijim bispecifičnim CEAxCD47 antitelom K2AC22. Ove slike takođe pokazuju vezivanje odgovarajućeg anti-CD47 monovalentnog antitela, irelevantne hIgG 1 kontrole (hIgG 1, linija ispod linije za monovalentni CD47) i bivalentnog anti-CD47 mAb (hB6H12, tačkasta linija) na šest ćelijskih linija kancera koje eksprimiraju CEACAM5: (Sl.1A) SK-CO-1 ćelije, (Sl. 1B) MKN-45 ćelije, (Sl. 1C) HPAF-II ćelije, (Sl. 1D) SNU-C1 ćelije, (Sl. 1E) Ls174T ćelije i (Sl. 1F) LoVo ćelije. EC50 bispecifičnih antitela prema pronalasku je niži od EC50 K2AC22 i maksimalno vezivanje (MFI) bispecifičnih antitela prema pronalasku je veće od maksimalnog vezivanja K2AC22.

Slike 2A-2F. Fagocitoza zavisna od koncentracije LoVo ćelija kancera indukovana sa dva CEACAM5xCD47 bispecifična antitela prema pronalasku (K2AC84 i K2AC100) u poređenju sa najsavremenijim CEACAM5xCD47 bispecifičnim antitelom K2AC22. Ove slike takođe pokazuju fagocitozu izazvanu odgovarajućim anti-CD47 monovalentnim antitelom i kontrolnim izotipom hIgG 1. Slike 2A-2F prikazuju podatke dobijene sa makrofagima dobijenim iz PBMC (mononuklearne ćelije periferne krvi) šest različitih humanih donora ((Sl.

2A) donor 862; (Sl.2B) donor 872; (Sl.2C) donor 873; (Sl.2D) donor 863; (Sl.2E) donor 874 i (Sl. 2F) donor 866). Kod većine donora, fagocitoza indukovana sa dva antitela prema pronalasku je bolja od K2AC22.

Slike 3A-3B. Fagocitoza zavisna od koncentracije ćelija kancera koje eksprimiraju CEACAM5 indukovana sa četiri do pet afukozilovanih CEACAM5xCD47 bispecifičnih antitela prema pronalasku (K2AC82 afuko, K2AC84 afuko, K2AC91 afuko, K2AC100 afukoi K2AC100 afuko) u poređenju sa stanjem afukozilovanog CEACAM5xCD47 bispecifičnog antitela K2AC22 iz stanja tehnike. Ove slike takođe pokazuju fagocitozu indukovanu odgovarajućim anti-CD47 monovalentnim antitelom i kontrolom izotipa hIgG1 (hIgG1). Slika 3A prikazuje podatke dobijene sa MKN-45 kao ciljnim ćelijama i sa makrofagima dobijenim iz PBMC (mononuklearne ćelije periferne krvi) dva humana donora (donor (D) 830; donor (D) 831), a slika 3B prikazuje podatke dobijene sa SNU-C1 kao ciljnim ćelijama i sa makrofagima dobijenim od dva humana donora (donor (D) 831; donor (D) 833). Kod donora, fagocitoza indukovana antitelima prema pronalasku je bolja od K2AC22.

Slika 4. CD47/SIRPα aktivnost blokiranja pet CEACAM5xCD47 bispecifičnih antitela prema pronalasku (K2AC82, K2AC84, K2AC91, K2AC100 i K2AC177) u poređenju sa najsavremenijim CEACAM5xCD47 bispecifičnim antitelom K2AC22. Ova slika takođe pokazuje aktivnost blokiranja CD47/SIRPa od strane odgovarajućeg anti-CD47 monovalentnog antitela. Dve negativne kontrole su dodate za poređenje, sa dodatkom hIgG 1 izotip kontrole (hIgG1) ili bez ikakvog Ab. Dvovalentno mAb hB6H12 je dodato kao pozitivna kontrola. Svih pet CEACAM5xCD47 bispecifičnih antitela prema pronalasku (K2AC82, K2AC84, K2AC91, K2AC100 i K2AC177) pokazala su poboljšanu aktivnost blokiranja u poređenju sa najsavremenijim CEACAM5xCD47 bispecifičnim antitelom K2AC22.

Slika 5. Vezivanje CD47xCEACAMS bispecifičnog antitela K2AC100 zavisno od koncentracije u prisustvu anti-CEACAM5 mAbs, TCB2014 i TCB 2017, na površini ćelije ćelija koje eksprimiraju CEACAMS, MKN-45. K2AC100 je direktno obeležen fluorohromom da bi se pratilo njegovo vezivanje samo na ćelijama MKN-45 (tamna linija, tamni krugovi), u prisustvu 300 nM TCB2014 (tamna linija, tamni trouglovi) ili 30 nM TCB2017 (tamna linija, tamni rombovi). Korišćene su negativne kontrole (Ctrl) (IgG1 u prisustvu TCB2014 ili TCB2017).

2

DETALJAN OPIS PRONALASKA

[0093] Termini se ovde koriste kao što se generalno koriste u tehnici, osim ako nisu drugačije definisani na sledeći način.

[0094] Antitela prema pronalasku imaju jedno ili više korisnih svojstava od sledećih svojstava:

● odnos vrednosti KD za vezivanje za CEACAM3 naspram CEACAM5,

● maksimum indeksa fagocitoze (Emax) kod tumorskih ćelija sa niskim nivoom ekspresije CEA, i/ili

● inhibicija (nizak IC50) vezivanja SIRPα za CD47 na površini tumorskih ćelija.

[0095] Antitela prema pronalasku pokazuju iznenađujuće povoljan odnos vezivanja za CEACAM3 naspram CEACAM5 kao što je prikazano u Primeru 3 i Tabeli 2. Na primer, K2AC100 pokazuje 25 puta veći afinitet vezivanja (niži KD) za CEACAM5, ali iznenađujuće samo 14 - puta veći afinitet vezivanja (niži KD) za CEACAM3, u poređenju sa afinitetima vezivanja (KD) K2AC22. Slično, K2AC84 pokazuje 46 puta veći afinitet vezivanja (KD) za CEACAM5, ali iznenađujuće samo 28 puta veći afinitet vezivanja (KD) za CEACAM3, u poređenju sa afinitetima vezivanja (KD) K2AC22. Dakle, odnos KD vrednosti za vezivanje za CEACAM3 i KD vrednosti za vezivanje za CEACAM5 je 83 za K2AC22, ali je 146 za K2AC100 i 137 za K2AC84.

[0096] Dok se nekoliko članova porodice kao što su CEACAM5 ili CEACAM6 eksprimiraju epitelnim ćelijama, drugi članovi porodice, kao što je CEACAM3 (CGM1 ili CD66d; UniProtKB - P40198), eksprimiraju se isključivo na humanim granulocitima, tip ćelije npr. učestvuje u uklanjanju bakterijske infekcije (Kuespert K et al., Curr Opin Cell Biol.2006; Pils S et al., Int J Med Microbiol.2008). Uprkos visokoj homologiji sekvenci između CEACAM5 i CEACAM3, CEACAM3 ne podržava adheziju ćelija za razliku od drugih članova porodice CEACAM, već posreduje u opsonin/nezavisnom prepoznavanju i eliminaciji ograničenog skupa gram-negativnih bakterija, uključujući Neisseria gonorrhoeae, Hemophilus influenzae i Moraxella catarrhalis (Kuroki et al., J. Biol. Chem. 1991; Pils S et al., Int J Med Microbiol.

2008). CEACAM3 se razmatra kao fagocitni receptor urođenog imunog sistema (Schmitter et al., J Exp Med.2004). Prema saznanjima pronalazača, bispecifično antitelo protiv CEACAM5 i CD47, ako se u velikoj meri vezuje i za CEACAM3, imalo bi neželjeni efekat na neutrofilne granulocite i moglo bi da smanji broj neutrofila, odnosno da izazove neutropeniju povećanom fagocitozom. Ovo može povećati rizik od razvoja bakterijskih infekcija koje mogu, bez hitne medicinske intervencije, postati opasne po život. Visok afinitet vezivanja karakteriše nizak KD. Distribucija CEA ciljanog bispecifičnog antitela između CEACAM 5 i CEACAM3 je određena odnosom afiniteta vezivanja za ova dva člana porodice CEACAM. Visok odnos KD za vezivanje za CEACAM3 u odnosu na KD za vezivanje za CEACAM5 znači manje vezivanje bispecifičnog antitela za CEACAM3 u poređenju sa vezivanjem za CEACAM5, što bi bilo korisno.

[0097] Antitela prema pronalasku pokazuju iznenađujuće korisnu maksimalnu vrednost indeksa fagocitoze (Emax), u jednom primeru izvođenja u ćelijama tumora sa malom ekspresijom CEA (kao što je ćelijska linija LoVo) u poređenju sa indeksom fagocitoze K2AC22 u odgovarajućoj ćelijskoj liniji. Prema Tabeli 5, bispecifična antitela ovog pronalaska pokazuju 8.5 do 17% veći maksimum krive indeksa fagocitoze LoVo ćelija (4000 CEACAM5 na površini ćelije) u poređenju sa bispecifičnim antitelom K2AC22 u stanju tehnike. Za ćelije LS174T (26000 CEACAM5 na površini ćelije) maksimum indeksa fagocitoze je između 8.7 do 20.6% veći za antitela pronalaska u poređenju sa K2AC22 (Tabela 5). U ćelijama koje više eksprimiraju CEACAM5 kao što su SNU-C1 ili MKN-45 povećanje Emax je niže.

[0098] Stoga bi veći procenat pacijenata mogao biti uspešno lečen bispecifičnim antitelima prema pronalasku.

[0099] Kao što je otkriveno u Primerima 5 i 11, ekspresija CEA u malignim ćelijama može značajno da varira u smislu RNK-ekspresije ili nabrajanja CEA molekula na površini ćelije. Ćelijske linije kancera koje eksprimiraju CEA korišćene za proučavanje aktivnosti fagocitoze bispecifičnih antitela ovog pronalaska eksprimiraju u proseku 108000 CEA ciljnih mesta na površini ćelije (Primer 5, Tabela 3). Organoidi izvedeni iz svežeg tumorskog tkiva pacijenata obolelih od kancera (kolorektalnog i plućnog) su ispitivani postupcima opisanim u Primeru 11. Prosečna ekspresija CEACAM5 ovih primarnih organoida je utvrđena kao 28000 CEACAM5 ciljnih mesta po ćeliji, tj. faktor od približno 4 niži od prosečne ekspresije na ćelijskim linijama kao što je prikazano u Tabeli 3. Bispecifična antitela koja se poboljšavaju za fagocitozu malignih ćelija sa nižom ekspresijom CEACAM5 mogu stoga biti povoljna za upotrebu u terapiji tumora. S obzirom na heterogenu i/ili prilično nisku ekspresiju npr. kod adenokarcinoma pluća, kod kolorektalnog karcinoma i drugih tumora koji eksprimiraju CEACAM5, takvi pacijenti se stoga mogu uspešno lečiti sa CEAxCD47 bispecifičnim antitelima iz ovog pronalaska.

[0100] Antitela prema pronalasku pokazuju iznenađujuće korisnu inhibiciju (nizak IC50) vezivanja SIRPα za CD47 na površini tumorskih ćelija u poređenju sa antitelom K2AC22, kao

2

što je prikazano u Primeru 10 i Slici 4. Interakcija SIRPα na makrofagima sa CD47 na tumorskim ćelijama inhibira fagocitozu tumorskih ćelija, što znači da efikasna inhibicija ove interakcije povećava fagocitozu.

[0101] Kako se ovde koristi termin "Emax" opisuje maksimalnu aktivnost jedinjenja. Na primer, u testu ubijanja ćelija, Emax opisuje eliminaciju/ubijanje ćelija kancera (npr. obeleženih kalceinom AM, videti Primer 7) od strane makrofaga u datom vremenskom okviru. Ovo je od velikog kliničkog značaja jer je ukupan broj makrofaga koji infiltriraju tumor ograničen: ako se, na primer, eliminiše dupli broj tumorskih ćelija u vremenskom intervalu, to je jednako polovini broja makrofaga koji treba da budu prisutni da bi se eliminisao isti broj tumorskih ćelija po vremenu.

[0102] Kako se ovde koristi, termin "EC50" opisuje koncentraciju jedinjenja pri kojoj se postiže polovina maksimalne aktivnosti (Emax/2). Nizak EC50 je koristan da bi trebalo da se unese manja količina jedinjenja i stoga da se postignu npr. niži troškovi proizvodnje u poređenju sa višim EC50 i/ili potencijalno niža stopa neželjenih efekata. Emax i EC50 stoga opisuju različite aspekte aktivnosti jedinjenja. Za dva jedinjenja uporedivog Emax, EC50 postaje važan jer se isti terapeutski efekat može postići pri nižoj koncentraciji, a samim tim i manjoj količini leka za davanje i potencijalno nižoj stopi neželjenih efekata koje treba postići.

[0103] Kako se ovde koristi, termini "deo koji se vezuje za antigen" i "vezujući deo" odnose se u svom najširem smislu na deo antitela koji specifično vezuje antigensku determinantu kao što su CEA, CD47 i CD3.

[0104] Tačnije, kako se ovde koristi, vezujući deo koji se vezuje za membranski vezan humani karcinoembrionalni antigen (CEA, isto kao CEACAM5) ili za CD47 specifično se vezuje za CEA ili CD47, tačnije za ćelijsku površinu ili za membranu vezan CEA ili CD47. Prema tome, svaki vezujući deo se vezuje ili za CEA ili CD47. Pod "specifično vezivanje, specifično za, vezivanje za" podrazumeva se da je vezivanje selektivno za antigen i da se može razlikovati od neželjenih ili nespecifičnih interakcija. U nekim primerima izvođenja, stepen vezivanja anticiljanog antitela za nepovezani, neciljani protein je oko 10 puta, poželjno >100 puta manji od vezivanja antitela za pomenuto ciljno mesto kao što je mereno, npr. interferometrijom biosloja npr. Octet<®>, površinska plazmonska rezonanca (SPR) npr. Biacore<®>, enzimski imunosorbent (ELISA) ili protočna citometrija (FACS). Ciljna mesta su proteini koji su ovde razmatrani - npr. CEA, CD47 i CD3ε.

[0105] Izrazi specifično vezujući za CEA i CD47, vezujući za CEA i CD47 i specifičan za CEA i CD47 odnose se u jednom aspektu na antitelo, npr., bispecifično antitelo, koje je sposobno da se veže za ciljne CEA i CD47 sa dovoljnim afinitetom tako da antitelo je korisno kao

2

terapeutsko sredstvo u ciljnom delovanju na tumorske ćelije koje eksprimiraju CEACAM5 i CD47. Pozivanje na vezivanje za MKN-45, SNU-C1, LS174T, SK-CO-1, HPAF-II i/ili LoVo ćelije sa određenom vrednošću EC50 odnosi se na vrednost EC50 merenu protočnom citometrijom (videti Primer 6).

[0106] Kako se ovde koristi, termin "antitelo" se odnosi na antitelo koje sadrži dva teška lanca i dva laka lanca. U jednom primeru izvođenja, antitelo je antitelo pune dužine. Kako se ovde koristi, termin "teški lanac antitela" se odnosi na teški lanac antitela, koji se sastoji od varijabilnog regiona i konstantnog regiona kao što je definisano za antitelo pune dužine. Kako se ovde koristi, termin "laki lanac antitela" se odnosi na laki lanac antitela, koji se sastoji od varijabilnog regiona i konstantnog regiona kao što je definisano za antitelo pune dužine.

[0107] Termin "antitelo pune dužine" označava antitelo koje se sastoji od dva "teška lanca antitela pune dužine" i dva "laka lanca antitela pune dužine". „Teški lanac antitela pune dužine“ je polipeptid koji se sastoji u pravcu od N-terminusa do C-terminusa od varijabilnog domena teškog lanca antitela (VH), konstantnog domena teškog lanca antitela 1 (CH1), zglobnog regiona antitela (HR), konstantnog domena teškog lanca antitela 2 (CH2) i konstantnog domena teškog lanca antitela 3 (CH3), skraćeno kao VH-CH1-HR-CH2-CH3. "Laki lanac antitela pune dužine" je polipeptid koji se sastoji u pravcu od N-terminusa do C-terminusa od varijabilnog domena lakog lanca antitela (VL) i konstantnog domena lakog lanca antitela (CL), skraćeno kao VL-CL. Konstantni domen lakog lanca antitela (CL) može biti κ (kapa) ili λ (lambda). Dva domena antitela pune dužine povezana su zajedno preko inter-polipeptidnih disulfidnih veza između CL domena i CH1 domena i između zglobnih regiona teških lanaca antitela pune dužine. Primeri tipičnih antitela pune dužine su prirodna antitela kao što su IgG (npr. IgG 1 i IgG2), IgM, IgA, IgD i IgE. Antitelo pune dužine prema pronalasku je u jednoj varijanti humanog tipa IgG1, u jednom dodatnom primeru izvođenja koje sadrži jednu ili više aminokiselinskih supstitucija u delu Fc kao što je definisano u nastavku i/ili je konstruisano u glikoinženjeringu na polisaharidnom lancu vezan za Asn297. Antitelo pune dužine prema pronalasku sadrži dva vezujuća dela, od kojih je svaki formiran parom VH i VL, jedan se vezuje za CEA, a drugi za CD47.

[0108] Kao što je ovde korišćeno i pomenuto gore, "region(i) koji određuju komplementarnost" (CDR(regioni)) opisuju nekontinuirana mesta za kombinovanje antigena (takođe poznata kao regioni vezivanja antigena) koja se nalaze unutar varijabilnog regiona i teškog i lakog lanca polipeptida. CDR regioni se takođe nazivaju "hipervarijabilni regioni" (HVR), i taj termin se ovde koristi naizmenično sa terminom "CDR" u odnosu na delove varijabilnog regiona koji formiraju regione za vezivanje antigena. Ovaj konkretan region je opisao Kabat et al.,

2

Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991). Odgovarajući aminokiselinski ostaci sa CDR regionima kako ih je definisao Kabat navedeni su ispod u tabeli liste sekvenci. Tačni brojevi ostataka koji obuhvataju određeni CDR će varirati u zavisnosti od redosleda i veličine CDR regiona. Stručnjaci u ovoj oblasti mogu rutinski odrediti koji ostaci sadrže određeni CDR s obzirom na sekvencu aminokiselina varijabilnog regiona antitela. Kako se ovde koristi termin "koji sadrži CDRL1 prema SEQ ID NO:x" odnosi se na to da je CDRL1 region navedenog varijabilnog lakog lanca SEQ ID NO:x (koji kao CDRL1 sadrži CDRL1 prema SEQ ID NO:x). Ovo važi i za druge CDR regione. Osim ako nije drugačije naznačeno, HVR ostaci su ovde numerisani prema Kabat et al., supra i imenovani kao "CDR regioni" i reference na numerisanje pozicija drugih specifičnih aminokiselinskih ostataka u bispecifičnim antitelima prema pronalasku su takođe u skladu sa sistemom Kabat numeracije.

[0109] Kako se ovde koriste, termini "Fc region" i "Fc domen" odnose se na C-terminalni region teškog lanca IgG; u slučaju IgG1 antitela, C-terminalni region sadrži -CH2-CH3 (videti gore). Iako granice Fc regiona IgG teškog lanca mogu neznatno da variraju, Fc region teškog lanca humanog IgG se obično definiše tako da se proteže od aminokiselinskog ostatka na poziciji Cys226 do karboksil-terminusa. Konstantni regioni su dobro poznati u stanju tehnike i npr. opisani od strane Kabat, E.A., (videti npr. Johnson, G., and Wu, T.T., Nucleic Acids Res.28 (2000) 214-218; Kabat, E.A., et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72 (1975) 2785- 2788).

[0110] IgG molekul nosi dva N-vezana oligosaharida u svom Fc regionu, po jedan na svakom teškom lancu. Kao i svaki glikoprotein, antitelo se proizvodi kao populacija glikoformi koje dele istu polipeptidnu kičmu, ali imaju različite oligosaharide vezane za mesta glikozilacije. Antitela sa smanjenim sadržajem fukoze u glikanskim delovima pokazuju veću aktivnost ćelijske citotoksičnosti zavisne od antitela (ADCC) u poređenju sa normalno fukozilovanim antitelom (Niwa R et al., Cancer Res, 64, 2127-33, 2004). Ćelijska linija sa nokautom oba alela za gen odgovoran za dodavanje fukoze (α1,6-fukoziltransferaza; FUT8) je opisana u US6946292, US7425446, US8067232. Korišćenjem takve ćelijske linije, bispecifična antitela prema pronalasku mogu da se proizvedu sa glikanskim delovima koji imaju smanjen sadržaj fukoze i povećan ADCC i ćelijsku fagocitozu zavisnu od antitela (ADCP). Druga tehnologija koja se može koristiti za proizvodnju antitela sa smanjenim sadržajem fukoze je opisana u US8642292 (uključeno ovde kao referenca). Ova tehnologija je dizajnirana da konfiguriše stabilnu integraciju heterolognog bakterijskog enzima u ćelijsku liniju proizvođača antitela kao što je ćelijska linija CHO ili druge. Ovom merom blokira se de novo sinteza fukoze iz D-manoze. Ako se pored toga proizvodne ćelije kultivišu u medijumu bez fukoze, kao rezultat se

2

proizvode antitela sa stabilnim nivoom afukozilacije. Primer postupka za proizvodnju i prečišćavanje afukozilovanih bispecifičnih antitela ovog pronalaska je opisan u Primeru 9 (1. i 2.).

[0111] Mutacije unutar Fc domena takođe mogu promeniti svojstva vezivanja Fc domena za različite Fc receptore (WO2004063351, WO2004099249; WO2005018669, WO2005063815, WO2005110474, WO2005056759, WO2005092925, WO2005018572, WO2006019447, WO2006116260, WO2006023420, WO2006047350, WO2006085967, WO2006105338, WO2007021841, WO2007008943, WO2007024249, WO2007041635, WO2007048077, WO2007044616, WO2007106707, WO2008022152, WO2008140603, WO2008036688, WO2008091798, WO2008091954, WO2008092117, WO2008098115, WO2008121160, WO2008150494, WO2010033736, WO2014113510.

[0112] Termin "epitop" uključuje bilo koju polipeptidnu determinantu sposobnu da se specifično veže za antitelo. U određenim primerima izvođenja, "epitop" uključuje hemijski aktivne površinske grupe molekula kao što su aminokiseline, bočni lanci šećera, fosforil ili sulfonil, i, u određenim primerima izvođenja, može imati specifične trodimenzionalne strukturne karakteristike i/ili specifične karakteristike naelektrisanja. Epitop je region ciljnog mesta koji je vezan antitelom. U jednom primeru izvođenja, bispecifično antitelo pronalaska se vezuje za N-terminalni domen CEACAM5 (domen V-tipa aminokiselina 35 – 144 sličan Ig, UniProtKB - P06731). Lokacija vezivanja CEAxCD47 bispecifičnih antitela za CEACAM5 se postiže vezivanjem epitopa. U vezivanju epitopa, antitela se testiraju na kombinatorni način u paru, a antitela koja su u kompeticiji za isti region vezivanja grupišu se zajedno u binove. Testiranje konkurencije se ovde izvodi sa anti-CEA antitelima u skladu sa stanjem tehnike i kako je ovde opisano. U jednom primeru izvođenja, bispecifično antitelo pronalaska je u kompeticiji za vezivanje za CEACAM5 sa referentnim antitelom SM3E. Kompeticija se meri analizom u kojoj je biotinilovani humani CEACAM5 u koncentraciji od 0.5 µg/ml imobilisan i inkubiran sa serijskim razblaženjem (od 67 nM do 0.09 nM) referentne vrednosti. CEAxCD47 bispecifična antitela iz ovog pronalaska se dodaju u količini od 0.1 µg/ml tokom 1 sata na sobnoj temperaturi. Ploča je isprana i otkrivena su vezana CEAxCD47 bispecifična antitela.

[0113] Kako se ovde koristi, termin "uobičajeni teški lanac" (cHC) odnosi se na polipeptid koji se sastoji u smeru od N-terminusa do C-terminusa od varijabilnog domena teškog lanca antitela (VH), konstantnog domena teškog lanca antitela 1 (CH1), zglobnog regiona antitela (HR), konstantnog domena teškog lanca antitela 2 (CH2) i konstantnog domena teškog lanca antitela 3 (CH3), skraćeno kao VH-CH-HR-CH2-CH3. Uobičajeni teški lanci pogodni za bispecifična antitela prema pronalasku su teški lanci anti-CD47 antitela kao što su opisana u

2

WO2012023053, WO2013088259, WO2014087248, i WO2016156537. U jednom primeru izvođenja uobičajeni teški lanac bispecifičnog antitela prema pronalasku sadrži kao CDR regione teškog lanca CDRH1 prema SEQ ID NO: 1, CDRH2 prema SEQ ID NO:2 i CDRH3 prema SEQ ID NO:3. U jednom primeru izvođenja, cHC bispecifičnog antitela prema pronalasku kao varijabilni region teškog lanca VH sadrži VH region SEQ ID NO:4. U jednom primeru izvođenja, Fab deo uobičajenog teškog lanca cHC bispecifičnog antitela prema pronalasku je SEQ ID NO: 5 (VH-CH1). U jednom primeru izvođenja, uobičajeni cHC teški lanac bispecifičnog antitela prema pronalasku je SEQ ID NO: 6 (VH-CH1-CH2-CH3). SEQ ID NO:6, je teški lanac koji dodatno sadrži IgG1 Fc deo. U jednom primeru izvođenja, antitelo prema pronalasku je κλ bispecifično antitelo koje sadrži cHC (κλ telo).

[0114] Format κλ tela omogućava afinitetno prečišćavanje bispecifičnih antitela koja se ne razlikuju od standardnog IgG molekula i sa karakteristikama koje se ne razlikuju od standardnih monoklonskih antitela (videti npr. WO2013088259, WO2012023053), obećavajući nikakav ili nizak potencijal imunogenosti kod pacijenata.

[0115] Bispecifična antitela prema pronalasku, koja sadrže uobičajeni teški lanac, mogu se napraviti na primer prema WO2012023053. Postupci opisani u WO2012023053 stvaraju bispecifična antitela koja su po strukturi identična humanom imunoglobulinu. Ovaj tip molekula je sastavljen od dve kopije jedinstvenog polipeptida teškog lanca, prvog varijabilnog regiona lakog lanca fuzionisanog sa konstantnim Kapa domenom i drugog varijabilnog regiona lakog lanca fuzionisanog sa konstantnim Lambda domenom. Jedno mesto vezivanja pokazuje specifičnost za CEA, a drugo mesto pokazuje specifičnost za CD47, pri čemu svakom doprinose teški i odgovarajući laki lanci. Varijabilni regioni lakog lanca mogu biti iz porodice Lambda ili Kapa i poželjno su fuzionisani za Lambda i Kapa konstantne domene, respektivno. Ovo je poželjno da bi se izbeglo stvaranje ne-prirodnih polipeptidnih spojeva. Međutim, takođe je moguće dobiti bispecifična antitela prema pronalasku fuzijom varijabilnog domena Kapa lakog lanca sa konstantnim Lambda domenom za prvu specifičnost ili fuzijom varijabilnog domena Lambda lakog lanca sa konstantnim Kapa domenom za drugu specifičnost. Drugi laki lanac je tada uvek potpuno kapa (VL i CL) ili potpuno lambda (takozvani hibridni formati kapa lambda bispecifičnih antitela). Bispecifična antitela opisana u WO 2012023053 su „κλ tela“. Ovaj format κλ-tela omogućava afinitetno prečišćavanje bispecifičnog antitela koje se ne razlikuje od standardnog IgG molekula sa karakteristikama koje se ne razlikuju od standardnog monoklonskog antitela i, stoga, povoljnije u poređenju sa prethodnim formatima uključujući npr. aminokiselinske mostove ili druge neprirodne elemente.

[0116] Kako se ovde koriste, termini "CEA" i "CEACAM5" odnose se na humani karcinoembrionalni antigen (CEA, CEACAM-5 ili CD66e; UniProtKB - P06731) koji je glikoprotein ćelijske površine i antigen povezan sa tumorom (Gold and Freedman, J Exp. Med., 121:439-462, 1965; Berinstein NL, J Clin Oncol., 20:2197-2207, 2002). Kako se ovde koristi, termin "CEACAM3" se odnosi na humani CEACAM3 (UniProtKB - P40198 (CEAM3_HUMAN) koji je takođe član porodice molekula adhezije ćelija povezanih sa karcinoembrionalnim antigenom (CEACAM). Dodatne informacije i informacije o drugim članovima porodice CEA može se naći na http://www.uniprot.org.

[0117] U jednom primeru izvođenja, bispecifično antitelo prema pronalasku nije kompetitivno sa TCB2014. Bispecifično anti-CEACAM5 × anti-CD3ε antitelo cibisatamab je opisano u Bacac et al. (Clin. Cancer Res., 22(13), 3286-97 (2016)). Lanci antitela TCB2014 su opisani u US20140242079 (SEQ ID NO: 1, 2, 21, 22, 23 i 27 iz US20140242079. Dalje bispecifično CEAxCD3 Mab (TCB2017) je opisano u WO2017055389 kao molekul B "2+1 IgG CrossFab, invertovan" sa modifikacijama naelektrisanja (VH/VL razmena u CD3 vezivnom, modifikacija naelektrisanja u CEA vezivu, humanizovano CEA vezivo) (videti SEQ ID NOs 34, 36-38 iz WO2017055389). Kako se ovde koristi u jednom primeru izvođenja, "bispecifično CEA × CD3 antitelo" se odnosi na antitelo TCB2014, cibisatamab ili antitelo TCB2017.

[0118] Cibisatamab, TCB2014 i TCB2017 vezuju se za epitope CEACAM5 koji se nalaze proksimalno od ćelijske membrane. Nasuprot tome, bispecifična antitela CEAxCD47 iz ovog pronalaska vezuju se za epitop distalno od ćelijske membrane blizu N-terminusa CEACAM5 i nisu u kompeticiji sa cibisatamabom, TCB2014 i TCB2017 u vezivanju za CEACAM5.

[0119] Kako se ovde koristi, termini "specifično vezivanje za CD47", "vezivanje za CD47" i "CD47 vezujući deo" odnose se u kontekstu bispecifičnih antitela prema pronalasku na specifičnost za humani CD47. Humani CD47 je višeprolazni membranski protein i sadrži tri ekstracelularna domena (aminokiseline 19-141, 198-207 i 257-268; videti UniProtKB -K08722). Kako se ovde koristi, "afinitet vezivanja za CD47" se meri kvantitativno (KD) interferometrijom biosloja (Octet Technology) i/ili površinskom plazmonskom rezonancom (Biacore tehnologija). U jednom primeru izvođenja, vezivanje bispecifičnog antitela prema pronalasku za CD47 se dešava preko jednog ili više navedenih ekstracelularnih domena.

[0120] U jednom primeru izvođenja, drugi vezujući deo antitela prema pronalasku (specifično vezivanje za humani CD47) karakteriše laki lanac koji kao CDR lakog lanca sadrži CDRL1 prema SEQ ID NO:7, CDRL2 prema SEQ ID NO:8 i CDRL3 prema SEQ ID NO:9, i teški lanac koji sadrži kao CDR regione teškog lanca CDRL1 prema SEQ ID NO:1, CDRL2 prema SEQ ID NO:2 i CDRL3 prema SEQ ID NO:3. U jednom primeru izvođenja, drugi vezujući deo

1

antitela prema pronalasku (specifično vezivanje za humani CD47) je naznačen varijabilnim regionom kapa lakog lanca SEQ ID NO:10. U jednom primeru izvođenja, drugi vezujući deo antitela prema pronalasku (specifično vezivanje za humani CD47) je naznačen kapa lakim lancem SEQ ID NO:11. U jednom primeru izvođenja, drugi vezujući deo antitela prema pronalasku (specifično vezivanje za humani CD47) je naznačen varijabilnim regionom teškog lanca SEQ ID NO:4. U jednom primeru izvođenja, drugi vezujući deo antitela prema pronalasku (specifično vezivanje za humani CD47) je naznačen teškim lancem SEQ ID NO:5. U jednom primeru izvođenja, drugi vezujući deo antitela prema pronalasku (specifično vezivanje za humani CD47) je naznačen teškim lancem SEQ ID NO:6.

[0121] Kako se ovde koristi, termin "naznačen teškim lancem SEQ ID NO:S" odnosi se, kao što je prikazano u tabeli 1, na VH-CH1 deo teškog lanca koji je Fab deo antitela prema pronalasku. Takav teški lanac može dodatno sadržati, a prema opštepoznatim znanjima, dodatne delove kao što je zglobni region, CH2, CH3, i može biti u bilo kom formatu antitela, kao što je F(ab')2format. Poželjni format je uobičajeni format teškog lanca kao što je gore opisan

[0122] Kako se ovde koriste, termini "specifično vezivanje za CEA", "vezivanje za CEA" i "CEA vezujući deo" odnose se na vezivanje bispecifičnog antitela prema pronalasku za rekombinantni humani CEACAM5, gde se pomenuto antitelo vezuje za rekombinantni humani CEACAM3 sa vrednošću KD od 100 puta ili više u poređenju sa KD vrednošću vezivanja za rekombinantni humani CEACAM5. Termin "KD", kako se ovde koristi, odnosi se na ravnotežnu konstantu disocijacije između bispecifičnog antitela prema pronalasku i njegovog antigena CEACAM5 ili CEACAM3 i specificiran je u nM i može biti npr. meren površinskom plazmonskom rezonancom i/ili interferometrijom biosloja (Primer 3).

[0123] Vezivanje za CEA (CEACAMS) na ćelijama se meri korišćenjem različitih tumorskih ćelijskih linija kao što su LoVo, LS174T, MKN-45, SNU-C1, SK-CO-1, HPAF-II. Koncentracija antitela prema pronalasku varira u odgovarajućem opsegu u pogledu rezultujuće vrednosti EC50 i Emax vrednosti za vezivanje za ćelije kao što je gore definisano. Krive vezivanja bispecifičnih antitela pronalaska su prikazane na slikama 1A-1F, EC50 i Emax su navedeni u tabeli 4.

[0124] Kako se ovde koristi, termin "humani CEA vezan za membranu" odnosi se na humani karcinoembrionalni antigen (CEA) koji je vezan za deo ćelije ili za površinu ćelije, posebno, za površinu tumorske ćelije.

[0125] Kako se ovde koriste, termini "bispecifično antitelo koje se vezuje za humani CEA i humani CD3" i "CEAxCD3 Mab" označavaju bispecifično antitelo koje se vezuje za humani

2

CEACAM5 i CD3ε. Takva antitela su na primer cibisatamab, "TCB2014" i "TCB2017". Kako se ovde koristi, "TCB2014" se odnosi na bispecifično vezivanje antitela za CEA i CD3 kao što je opisano u US20140242079 kao SEQ ID NO: 1, 2, 21 i 22. Kako se ovde koristi "TCB2017" se odnosi na molekul B u "2+1 IgG CrossFab, invertovanom" formatu sa modifikacijama naelektrisanja (VH/VL razmena u CD3 vezivu, modifikacija naelektrisanja u CEA vezivu, humanizovanom CEA vezivu); SEQ ID NOs 34, 36-38 iz WO2017055389 (uključeno referencom u celini)). Dalje CEAxCD3 Mabs opisana su u WO2007071426, WO2013012414, WO2015112534, WO2017118675, US20140242079 i WO2017055389. Dalje CEAxCD3 Mab je cibisatamab (bivši RO6958688) (videti npr. Bacac et al., Clin. Cancer Res., 22(13), 3286-97 (2016)). U jednom primeru izvođenja, pomenuto CEAxCD47 Mab prema pronalasku nije kompetitivno i/ili se ne vezuje za isti epitop humanog CEACAM5 kao TCB2014 ili TCB2017.

[0126] Kako se ovde koristi, „CD3ε“ i „CD3“ se odnose na humani CD3ε (UniProtKB - P07766 (CD3E_HUMAN). Termini „antitelo protiv CD3ε (CD3)“ i „antitelo protiv CD3ε (CD3)“ odnose se na antitelo koje se specifično vezuje za CD3ε). U jednom primeru izvođenja, antitelo protiv CD3ε se specifično vezuje za isti epitop kao anti-CD3 antitelo SP34 (BD Biosciences kataloški br.565983).

[0127] U jednom aspektu, bispecifično antitelo pronalaska nije u kompeticiji sa TCB2014 i/ili TCB2017 za vezivanje za CEA kao što je predstavljeno na MKN-45 i/ili LS174T ćelijama. Stoga, TCB2014 u koncentraciji od 300 nM (TCB2014) ili 30 nM (TCB2017) ne pomera EC50 krive indeksa fagocitoze navedenog bispecifičnog antitela pronalaska za MKN-45 i/ili LS174T ćelije za više od faktora od 3, u jednom primeru izvođenja prema višim koncentracijama.

[0128] Koncentracija od 300 nM TCB2014 je izabrana zato što su koncentracije ove veličine izmerene u plazmi pacijenata lečenih terapeutski efikasnim dozama cibisatamaba poput 100 mg iv (za PK podatke za cibisatamab videti Melero et al., ASCO 2017, 49 Abstract and Poster No.41, Abstract in Journal of Clinical Oncology 35, no.15_suppl (May 20, 2017) 2549-2549), za odgovarajuće kliničke rezultate videti Tabernero et al., J. Clin. Oncol.35, 2017 (suppl. Abstr.

3002)). U trenutno aktivnoj studiji cibisatamaba u kombinaciji sa inhibitorom PD-L1 primenjeno je 100 mg cibisatamaba (ClinicalTrials.gov Identifier: NCT03866239). TCB2017 je u pretkliničkim ispitivanjima pribl.10 do 100 puta snažniji od TCB2014 (mereno afinitetom vezivanja ili lizom tumorskih ćelija u TDCC testu ćelijske citotoksičnosti zavisne od T ćelija; videti WO2017055389). Prema tome, pomeranje EC50 krive fagocitoze bispecifičnih antitela pronalaska od strane TCB2017 je testirano na 30 nM TCB2017.

[0129] Kompeticija u vezivanju se može odrediti merenjem krive vezivanja za MKN-45 ćelije zasnovanim na protočnoj citometriji i određivanjem EC50 ove krive vezivanja. Nekompeticija znači da je EC50 pomeren za manje od faktora 3, u jednom aspektu ka višim koncentracijama, ako se 300 nM TCB2014 doda testu. 300 nM su koncentracije u opsegu terapeutski aktivnih doza/koncentracija u plazmi CEA × CD3 bispecifičnog antitela (TCB2014) (Tabernero et al., J. Clin. Oncol. 35, 2017 (suppl. Abstr. 3002)). Nekompeticija od strane TCB2017 znači da se EC50 pomera za manje od faktora 3 ako se 30 nM TCB2017 doda u test.

[0130] Kako se ovde koristi, termin „nekompetitivno“ znači da drugo antitelo (bispecifično antitelo protiv CEAxCD3ε, kao što je TCB2014 ili TCB2017) u koncentraciji od 300 nM (TCB2014) ili 30 nM (TCB2017) ne pomera EC50 krivu bispecifičnog antitela pronalaska na ćelije MKN-45 za više od faktora 3, u jednom aspektu prema višim koncentracijama.

[0131] Kako se ovde koristi, termin "ADCP" se odnosi na ćelijsku fagocitozu zavisnu od antitela. Kako se ovde koristi fagocitoza, EC50 vrednost fagocitoze, maksimum fagocitoze i indeks fagocitoze prema pronalasku se odnose na fagocitozu merenu sa tumorskim ćelijskim linijama kao što je npr. LoVo, LS174T, SNU-C1 i/ili MKN-45 „imidžing“. Odgovarajući postupak imidžinga, sa inkubacijom na efektoru (makrofagi): odnos ciljne (tumorske) ćelije od npr. 1:1 ili 1:3 i sa "indeksom fagocitoze" kao očitavanjem (ADCP određen imidžingom") je opisan u Primeru 7. Kako se ovde koristi "fagocitoza pomenutog bispecifičnog antitela" označava fagocitozu izazvanu/indukovanu navedenim antitelom.

[0132] Termini "humani IgG" i "hIgG" odnose se na izotip humanog antitela. Kao što se koriste u eksperimentalnim postavkama, ovi termini se odnose na komercijalno dostupan homogeni preparat kliničkog kvaliteta humanog imunoglobulina IgG (dostupan npr. od Bio-Rad) koji se ne vezuje specifično za CD47 i CEACAM5.

Terapeutske primene i postupci upotrebe anti-CEA antigen vezujućih molekula

[0133] CEACAM × CD47 bispecifična antitela prema pronalasku su optimizovana za lečenje solidnih tumora uglavnom fagocitozom tumorskih ćelija posredovanom makrofagima, ali i ADCC, bilo u monoterapiji ili u kombinovanoj terapiji zajedno sa CEAxCD3 T-ćelijskim bispecifičnim antitelima kao što je cibisatamab, TCB2014 ili TCB2017 i/ili antagonist ose PD-1. Antitelo prema pronalasku i bispecifično antitelo CEAxCD3 T-ćelija mogu se primenjivati kao što je opisano u nastavku.

[0134] U posebnom primeru izvođenja, bolest odn. solidni tumor je kancer koji eksprimira ili čak prekomerno eksprimira CEACAM5, uključujući, ali ne ograničavajući se na grupu kolorektalnih tumora, nesitnoćelijskih tumora pluća, tumora želuca, tumora pankreasa i tumora dojke. U posebnom primeru izvođenja, tumor je kolorektalni tumor. U posebnom primeru

4

izvođenja tumor je tumor želuca ili tumor gastroezofagealnog spoja. U posebnom izvođenju tumor je tumor želuca/tumor gastroezofagealnog spoja koji eksprimira CEACAM5 i HER-2. U posebnom primeru izvođenja tumor je tumor pluća. Sve terapijske primene, postupci upotrebe, upotrebe, kombinacije, itd. koje su ovde opisane su posebno primeri izvođenja za upotrebu antitela prema pronalasku za lečenje ovih tumora/bolesti.

[0135] Pronalazači prepoznaju da antitela prema pronalasku pokazuju nizak ili nikakav potencijal za formiranje antitela na lek (ADA), odnosno gubitak izloženosti leku usled neutralisanja ADA, odnosno gubitak efikasnosti.

[0136] U jednom primeru izvođenja, pronalazak obezbeđuje antitelo prema pronalasku za upotrebu u postupku lečenja karcinoma (kancera, tumora, na primer, humanih karcinoma), posebno tumora koji eksprimiraju CEACAM5, in vivo. Ovaj postupak sadrži primenu na subjekta farmaceutski efikasne količine kompozicije koja sadrži bispecifično antitelo pronalaska. Pod "subjekat" se podrazumeva humani subjekat, u jednom primeru izvođenja pacijent koji pati od kancera/tumora/karcinoma.

[0137] Ekspresija CEACAM5 se može naći u različitim tumorskim entitetima, posebno kod kolorektalnog karcinoma, adenokarcinoma pankreasa, kancera želuca, nesitnoćelijskog kancera pluća, kancera dojke između ostalog. U zdravom, normalnom epitelu žlezde u gastrointestinalnom traktu, CEACAM5 se uglavnom eksprimira u polarizovanom uzorku na apikalnoj površini ćelija. Ovaj polarizovan obrazac ekspresije ograničava dostupnost anti-CEA mono ili bispecifičnih antitela koja se primenjuju sistemski i stoga ograničava potencijalnu toksičnost na zdrava tkiva. Zajedno sa niskim afinitetom CD47 vezivanja antitela prema pronalasku, ovo dovodi do odsustva ili ograničene fagocitoze takvih normalnih ćelija od strane antitela pronalaska. Ovaj polarizovani obrazac ekspresije se gubi u ćelijama gastrointestinalnih i drugih malignih tumora. CEACAM5 se podjednako eksprimira na celoj ćelijskoj površini ćelija kancera, što znači da su ćelije kancera mnogo bolje dostupne antitelu prema pronalasku od normalnih, zdravih ćelija i da se mogu selektivno ubiti pomoću CEAxCD47 bispecifičnih antitela pronalaska, odnosno pomenutim kombinacijama iznad. Ekspresija CEACAM5 u ćelijama kancera je uglavnom veća od ekspresije u nemalignim ćelijama.

[0138] U jednom primeru izvođenja, bispecifična antitela ovog pronalaska mogu da se koriste u monoterapiji za lečenje uznapredovalih solidnih tumora, u jednom primeru izvođenja tumora koji eksprimiraju CEACAM5. U jednom primeru izvođenja, bispecifično antitelo prema pronalasku se koristi u kombinaciji sa CEAxCD3 Mab u istovremenoj, odvojenoj ili uzastopnoj kombinaciji. U jednom primeru izvođenja, bispecifično antitelo prema pronalasku se koristi u kombinaciji sa CEAxCD3 Mab i/ili antagonistom PD-1 ose u istovremenoj, odvojenoj ili uzastopnoj kombinaciji. U jednom primeru izvođenja, bispecifično antitelo prema pronalasku se koristi u kombinaciji sa antagonistom PD-1 ose u istovremenoj, odvojenoj ili uzastopnoj kombinaciji. Takvi antagonisti PD-1 ose su opisani npr. u WO2017118675. Takve kombinacije napadaju solidni kancer pomoću makrofaga i T-ćelija. Jedno CEAxCD3 mab je u kliničkom razvoju (cibisatamab; videti ClinicalTrials.gov Identifier: NCT03866239). MEDI-565 je bio u kliničkom razvoju, ali nije bilo aktivnog kliničkog ispitivanja u clinicaltrials.gov. U jednom primeru izvođenja, kao bispecifično antitelo protiv CEA i CD3, korišćeno je antitelo TCB2014 ili cibisatamab.

[0139] Vezujuće sredstvo za CEA korišćeno u TCB2014 i cibisatamabu je izvedeno iz anti-CEA antitela PR1A3 (videti npr. EP2681244B1). Ovo antitelo se vezuje za takozvani B3 domen CEA koji se nalazi proksimalno od ćelijske membrane. TCB2014 ima nizak afinitet vezivanja nM za CEA i pokazuje efikasnost u visokim dozama (između 40 i 600 mg po dozi i pacijentu; (videti npr. Tabernero et al., J. Clin. Oncol.35, 2017 (suppl. Abstr.3002)). Pri najvećim dozama skoro sva CEA ciljna mesta na površini ćelija su zauzeta sa TCB2014. Prema znanju pronalazača, kombinacija cibisatamaba, TCB2014 ili TCB2017 sa CEAxCD47 može istovremeno generisati terapeutske nivoe oba leka u plazmi i postići najbolje rezultate (aditivne ili čak sinergističke), ako oba leka nisu kompetitivna za CEA antigen, odnosno vezivanje za različite epitope koji se ne preklapaju.

[0140] Kako se ovde koriste, termini „kombinacija, istovremena, odvojena ili uzastopna kombinacija“ antitela prema pronalasku i drugog bispecifičnog antitela, vezivanje za humani CEA i humani CD3ε odnose se na bilo koju primenu dva antitela (ili tri antitela u slučaju kombinacije antitela prema pronalasku, CEAxCD3 Mab i antagonista PD-1 ose), bilo odvojeno ili zajedno, gde se dva ili tri antitela primenjuju kao deo odgovarajućeg doznog režima osmišljenog tako da se dobije korist od kombinovane terapije, na primer u odvojenoj, uzastopnoj, simultanoj, istovremenoj, hronološki raspoređenoj ili naizmeničnoj primeni. Dakle, dva ili tri antitela se mogu primeniti ili kao deo iste farmaceutske kompozicije ili u odvojenim farmaceutskim kompozicijama. Antitelo prema pronalasku se može primeniti pre, u isto vreme ili posle primene drugog bispecifičnog antitela, ili u nekoj njihovoj kombinaciji. Kada se antitelo prema pronalasku primenjuje na pacijenta u ponovljenim intervalima, drugo bispecifično antitelo se može primeniti pre, u isto vreme ili posle svake primene antitela prema pronalasku ili neke njihove kombinacije, ili u različitim intervalima u odnosu na tretman antitelom pronalaska, ili u jednoj dozi pre, u bilo kom trenutku tokom ili posle toka tretmana antitelom pronalaska. U jednom primeru izvođenja, antitelo prema pronalasku i drugo bispecifično antitelo se primenjuju naizmeničnom primenom, u jednom primeru izvođenja, u intervalima od 6 do 15 dana između primene antitela pronalaska i drugog antitela. U takvoj naizmeničnoj primeni prva doza može biti antitelo pronalaska ili drugo antitelo.

[0141] Termin "antagonist PD-1 ose" se odnosi na anti-PD-1 antitelo ili anti-PD-Ll antitelo. Anti-PD-1 antitela su npr. pembrolizumab (Keytruda<®>, MK-3475), nivolumab, pidilizumab, lambrolizumab, MEDI-0680, PDR001 i REGN2810. Anti-PD-1 antitela su opisana npr. u 5 WO200815671, WO2013173223, WO2015026634, US7521051, US8008449, US8354509, WO20091 14335, WO2015026634, WO2008156712, WO2015026634, WO2003099196, WO2009101611, WO2010/027423, WO2010/027827, WO2010/027828, WO2008/156712 i WO2008/156712.

[0142] Anti-PD-Ll antitela su npr. atezolizumab, MDX-1105, durvalumab i avelumab. Anti-PD-Ll antitela su npr. opisana u WO2015026634, WO2013/019906, WO2010077634, US8383796, WO2010077634, WO2007005874 i WO2016007235.

[0143] Što se tiče kombinovane primene antitela prema pronalasku i drugog bispecifičnog antitela, oba jedinjenja mogu biti prisutna u jednom pojedinačnom obliku doze ili u odvojenim oblicima doze, na primer u dva različita ili identična oblika doze.

[0144] Ako antitelo prema pronalasku i drugo antitelo nisu u kompeticiji u odnosu na CEACAM5, u jednom primeru izvođenja oba antitela, po želji lekara, mogu da se primenjuju istovremeno. Ako su antitelo pronalaska i drugo antitelo u kompeticiji u pogledu CEACAM5, u jednom primeru izvođenja oba antitela se primenjuju naizmenično.

[0145] Antitelo pronalaska će se tipično primenjivati na pacijenta u režimu doze koji obezbeđuje najefikasniji tretman kancera (i iz perspektive efikasnosti i iz perspektive bezbednosti) za koji se pacijent leči, kao što je poznato u tehnici. Poželjno je da tumorske ćelije istovremeno napadnu T-ćelije i makrofagi, da bi se postigao pun terapeutski potencijal ovog pristupa, bispecifična antitela CEAxCD3 i CEAxCD47 prema pronalasku moraju biti nekompetitivna u pogledu vezivanja za CEA na površini ćelije.

[0146] Kao što je gore objašnjeno, količina primenjenog antitela i vreme primene antitela prema pronalasku mogu zavisiti od tipa (npr. pol, starost, težina) i stanja pacijenta koji se leči, težine bolesti ili stanja koji se leče i puta primene. Na primer, antitelo pronalaska i drugo antitelo se mogu primenjivati na pacijenta u dozama u rasponu od 0.1 do 100 mg/kg telesne težine dnevno ili nedeljno u pojedinačnim ili podeljenim dozama, ili kontinuiranom infuzijom. U jednom primeru izvođenja, svako od antitela pronalaska i drugo antitelo se primenjuju na pacijenta u dozama u rasponu od 0.1 do 30 mg/kg. U nekim slučajevima, nivoi doze ispod donje granice gore pomenutog opsega mogu biti adekvatni, dok u drugim slučajevima mogu se primeniti još veće doze bez izazivanja bilo kakvog štetnog neželjenog efekta.

[0147] Kako se ovde koristi, termin "polu-život antitela" se odnosi na poluvreme eliminacije pomenutog antitela mereno uobičajenim farmakokinetičkim testom. Antitelo prema pronalasku i drugo bispecifično antitelo protiv CEA i CD3 imaju poluvreme eliminacije od 3-14 dana.

[0148] U sledećem aspektu, pronalazak je takođe usmeren na bispecifično antitelo prema pronalasku za upotrebu u lečenju bolesti, posebno poremećaja ćelijske proliferacije gde je CEACAM5 eksprimiran, posebno gde je CEACAM5 abnormalno eksprimiran (npr. prekomerno eksprimiran ili eksprimiran u različitom obrascu na površini ćelije) u poređenju sa normalnim tkivom istog tipa ćelije. Takvi poremećaji uključuju, ali nisu ograničeni na kolorektalni kancer, NSCLC (nesitnoćelijski kancer pluća), kancer želuca, gastroezofagealni kancer, kancer pankreasa i kancer dojke. Nivoi ekspresije CEACAM5 mogu se odrediti različitim poznatim postupcima iz stanja tehnike (npr. putem imunohistohemijskog testa, imunofluorescentnog testa, imunoenzimskog testa, ELISA, protočne citometrije, radioimuno testa itd.).

[0149] U jednom aspektu, bispecifična antitela pronalaska mogu da se koriste za ciljno delovanje na ćelije in vivo ili in vitro koje eksprimiraju CEACAM5. Bispecifična antitela pronalaska su posebno korisna u prevenciji formiranja tumora, iskorenjivanju tumora i inhibiciji rasta tumora ili metastaza putem indukcije ADCP i ADCC tumorskih ćelija. Bispecifična antitela pronalaska mogu da se koriste za lečenje bilo kog tumora koji eksprimira CEACAM5. Određeni maligniteti koji se mogu lečiti bispecifičnim antitelima prema pronalasku uključuju, ali nisu ograničeni na, kolorektalni kancer, nesitnoćelijski kancer pluća, kancer želuca, kancer gastroezofagealnog spoja, kancer pankreasa i kancer dojke.

[0150] Bispecifična antitela prema pronalasku primenjuju se na sisara, poželjno čoveka, u farmaceutski prihvatljivom obliku doze kao što su oni o kojima se govori u nastavku, uključujući one koje se mogu primenjivati na čoveka intravenski kao bolus ili kontinuiranom infuzijom tokom određenog vremenskog perioda, intramuskularnim, intraperitonealnim, intracerebrospinalnim, subkutanim, intraartikularnim, intrasinovijalnim, intratekalnim, oralnim, lokalnim ili inhalacionim putevima. Bispecifična antitela prema pronalasku se takođe prikladno primenjuju intratumoralnim, peritumoralnim, intralezijskim ili perilezijskim putevima, da bi se ispoljili lokalni kao i sistemski terapeutski efekti.

[0151] Za lečenje bolesti, odgovarajuća doza bispecifičnih antitela prema pronalasku će zavisiti od vrste bolesti koja se leči, težine i toka bolesti, prethodne terapije, kliničke istorije pacijenta i odgovora na antitelo, i diskrecionog prava nadležnog lekara. Bispecifično antitelo pronalaska se prikladno primenjuje na pacijenta u jednom trenutku ili tokom serije tretmana. Ovaj pronalazak obezbeđuje postupak za selektivno ubijanje tumorskih ćelija (takođe nazvanih ovde kao ćelije kancera) koje eksprimiraju CEACAM5.

[0152] Ovaj postupak sadrži interakciju bispecifičnih antitela pronalaska sa navedenim tumorskim ćelijama. Ove tumorske ćelije mogu biti iz humanog karcinoma, uključujući kolorektalni karcinom, nesitnoćelijski karcinom pluća (NSCLC), karcinom želuca, kancer gastroezofagealnog spoja, karcinom pankreasa i karcinom dojke.

[0153] U sledećem aspektu, pronalazak je usmeren na bispecifična antitela pronalaska za upotrebu u proizvodnji leka za lečenje bolesti povezane sa abnormalnom ekspresijom CEACAM5. U posebnom primeru izvođenja, bolest je kancer koji eksprimira ili čak prekomerno eksprimira CEACAM5, uključujući, ali ne ograničavajući se na, kolorektalne tumore, nesitnoćelijske tumore pluća, tumore želuca, tumore gastroezofagealnog spoja, tumore pankreasa i tumore dojke. U posebnom primeru izvođenja, tumori su kolorektalni tumori.

Kompozicije, formulacije, doze i putevi primene

[0154] U jednom aspektu, ovaj pronalazak je usmeren na farmaceutske kompozicije koje sadrže bispecifična antitela iz ovog pronalaska i farmaceutski prihvatljiv nosač. Ovaj pronalazak je dalje usmeren na antitelo prema pronalasku za upotrebu u farmaceutskim kompozicijama u postupku lečenja bolesti, kao što je kancer, ili u proizvodnji leka za lečenje bolesti, kao što je kancer. Specifično, ovaj pronalazak je usmeren na antitelo u skladu sa pronalaskom za upotrebu u lečenju bolesti, a tačnije, za lečenje kancera, postupak koji sadrži primenu terapeutski efikasne količine farmaceutske kompozicije pronalaska.

[0155] U jednom aspektu, ovaj pronalazak obuhvata farmaceutske kompozicije, kombinacije i postupke za upotrebu u lečenju humanih karcinoma, tumora, kao što je gore definisano. Na primer, pronalazak obuhvata farmaceutske kompozicije za upotrebu u lečenju humanih karcinoma koje sadrže farmaceutski efikasnu količinu antitela iz ovog pronalaska i farmaceutski prihvatljiv nosač.

[0156] Kompozicije bispecifičnih antitela prema pronalasku mogu se primenjivati upotrebom konvencionalnih načina primene uključujući, ali bez ograničenja, intravensku, intraperitonealnu, oralnu, intralimfatičnu ili direktnu intratumoralnu primenu. Poželjna je intravenska ili subkutana primena.

[0157] U jednom aspektu pronalaska, terapeutske formulacije koje sadrže bispecifična antitela pronalaska se pripremaju za skladištenje mešanjem antitela željenog stepena čistoće sa izbornim farmaceutski prihvatljivim nosačima, ekscipijensima ili stabilizatorima (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)), u obliku liofilizovanih formulacija ili tečnih formulacija. Prihvatljivi nosači, ekscipijensi ili stabilizatori su netoksični za primaoce u korišćenim dozama i koncentracijama. Formulacije koje se koriste za primenu in vivo moraju biti sterilne. Ovo se lako postiže filtriranjem kroz sterilne filtracione membrane. Najefikasniji način primene i režim doziranja za farmaceutske kompozicije ovog pronalaska zavise od težine i toka bolesti, stanja pacijenta i odgovora na lečenje i od procene lekara koji leči. Shodno tome, doze kompozicija mogu biti ravne doze ili mogu biti prilagođene individualnom pacijentu, npr. telesnoj težini. Ipak, efikasna doza kompozicija ovog pronalaska će generalno biti u opsegu od 0.1 do 30 mg/kg.

[0158] Bispecifična antitela ovog pronalaska imaju molekulsku težinu u veličini od 150 kDa po molu. Oni nose u jednom primeru izvođenja Fc deo. Poluvreme eliminacije kod pacijenata je u rasponu od 3 do 14 dana. Ovaj poluživot dozvoljava, ali nije ograničen na primenu jednom dnevno, jednom nedeljno ili jednom u dve nedelje ili čak 4 nedelje.

[0159] Bispecifična antitela ovog pronalaska i njihove odgovarajuće kompozicije mogu biti u različitim oblicima doze koji uključuju, ali nisu ograničeni na, tečne rastvore ili suspenzije, tablete, pilule, prahove, supozitorije, polimerne mikrokapsule ili mikrovezikule, lipozome i injektabilne ili infuzibilne rastvore. Poželjni oblik zavisi od načina primene i terapeutske primene.

[0160] Kompozicija koja sadrži bispecifično antitelo ovog pronalaska biće formulisana, dozirana i primenjena na način koji je u skladu sa dobrom medicinskom praksom. Faktori za razmatranje u ovom kontekstu uključuju određenu bolest ili poremećaj koji se leči, određenog sisara koji se leči, kliničko stanje pojedinačnog pacijenta, uzrok bolesti ili poremećaja, mesto isporuke sredstva, postupak primene, režim primene i druge faktore poznate lekarima.

Proizvodni artikli

[0161] U sledećem aspektu pronalaska, obezbeđen je proizvod koji sadrži materijale korisne za lečenje, prevenciju i/ili dijagnozu gore opisanih poremećaja. Proizvodni artikal sadrži kontejner i etiketu ili uložak pakovanja na ili u vezi sa kontejnerom. Pogodni kontejneri uključuju, na primer, boce, bočice, špriceve, kese za IV rastvor, itd. Kontejneri mogu biti formirani od različitih materijala kao što su staklo ili plastika. Kontejner sadrži kompoziciju koja je sama po sebi ili u kombinaciji sa drugom kompozicijom efikasna za lečenje, prevenciju i/ili dijagnostikovanje stanja i može imati sterilni pristupni otvor (na primer, kontejner može biti vrećica za intravenski rastvor ili bočica koja ima čep koji se može probiti iglom za

4

hipodermičku injekciju). Najmanje jedno aktivno sredstvo u kompoziciji je bispecifično antitelo pronalaska. Etiketa ili umetak pakovanja označava da se kompozicija koristi za lečenje stanja po izboru. Pored toga, proizvod može da sadrži (a) prvi kontejner sa kompozicijom koja se u njemu nalazi, pri čemu kompozicija sadrži bispecifično antitelo pronalaska; i (b) drugi kontejner sa kompozicijom koja se nalazi u njoj, pri čemu kompozicija sadrži još jedno citotoksično ili na drugi način terapeutsko sredstvo. Proizvodni artikal u ovom primeru izvođenja pronalaska može dalje da sadrži umetak pakovanja koji ukazuje da se kompozicije mogu koristiti za lečenje određenog stanja. Alternativno, ili dodatno, proizvodni artikal može dalje da sadrži drugi (ili treći) kontejner koji sadrži farmaceutski prihvatljiv pufer, kao što je bakteriostatska voda za injekcije (BWFI), fiziološki rastvor puferovan fosfatom, Ringerov rastvor i rastvor dekstroze. Dalje može uključivati druge materijale poželjne sa komercijalnog i korisničkog stanovišta, uključujući druge pufere, razblaživače, filtere, igle i špriceve.

Tabela 1: Lista sekvenci

4

PRIMERI

Primer 1: Kloniranje, ekspresija i prečišćavanje humanog CEACAM5; izvor huCEACAM3 i huCD47.

[0162] Sekvenca koja odgovara kompletnom ekstracelularnom domenu (ECD) CEACAM5 je subklonirana u pEAK8 vektor ekspresije sisara (Edge Biosystems, Gaithersburg, Md.). Vektori su modifikovani da bi se uveo Avitag<™>(Avidity, Denver Colo.) i heksa-histidin obeleživač, humani Fc region ili Fc region miša na C-kraju. Konstrukti su verifikovani sekvenciranjem DNK. Prečišćavanje rekombinantnog rastvorljivog proteina je sprovedeno pomoću IMAC (hromatografija imobilizovanih metalnih jona), FcXL ili CaptureSelect<™>IgG-Fc (ms) matrica afiniteta; Humani CEACAM3 i biotinilovani CEACAM3 su dostupni iz ACROBiosystems, Newark USA (Thermo Ffisher Scientific). Humani CD47 i biotinilovani CD47 se mogu proizvesti kako je opisano u WO2019234576 ili su dostupni od ACROBiosystems, Newark USA.

Primer 2: Ekspresija i prečišćavanje bispecifičnih antitela koja nose lambda i kapa laki lanac.

[0163] Istovremena ekspresija se može postići na različite načine, kao što je transfekcija više vektora, od kojih svaki eksprimira jedan od lanaca koji se ko-eksprimiraju, ili upotrebom vektora koji pokreću ekspresiju više gena. Vektor pNovi κHλ je prethodno generisan da bi se omogućila koekspresija jednog teškog lanca, jednog lakog lanca Kapa i jednog Lambda lakog lanca kao što je opisano u US 2012/0184716 i WO 2012/023053. Ekspresiju tri gena pokreću promotori humanog citomegalovirusa (hCMV), a vektor takođe sadrži gen glutamin sintetaze (GS) koji omogućava selekciju i uspostavljanje stabilnih ćelijskih linija. VL geni antihCEACAM5 IgGλ ili anti-hCD47 IgGκ su klonirani u vektor pNovi κHλ, za prolaznu ekspresiju u ćelijama sisara. Peak ćelije ili CHO ćelije se uzgajaju u odgovarajućoj posudi sa odgovarajućim brojem ćelija i zapreminom medijuma za kulturu (koji sadrži fetalni goveđi serum). Plazmidna DNK se transfektuje u ćelije korišćenjem Lipofectamine 2000) prema uputstvima proizvođača. Koncentracija antitela u supernatantu transfektovanih ćelija se meri tokom proizvodnje pomoću OctetRED96. Prema koncentraciji antitela, supernatanti se sakupljaju 5 do 7 dana nakon transfekcije i bistre se centrifugiranjem na 1300 g tokom 10 minuta. Postupak prečišćavanja se sastoji od tri afinitetna koraka. Prvo, FcXL afinitetna matrica (Thermo Fisher Scientific) se ispere sa PBS i zatim se doda u razbistreni supernatant. Posle inkubacije preko noći na 4°C, supernatanti su centrifugirani na 2000 g tokom 10 min, protok se čuva i smola se dva puta ispere sa PBS. Zatim se smola prenosi na Amicon Pro kolone i rastvor koji sadrži 50 mM glicina na pH 3.0 se koristi za eluiranje. Nekoliko elucionih frakcija se generiše, objedinjuje i odsoljava u odnosu na PBS koristeći 50 kDa Amicon<™>Ultra

4

centrifugalne filterske jedinice (Merck KGaA, Darmstadt, Nemačka). Eluirani proizvod, koji sadrži ukupne humane IgG iz supernatanta, je kvantitativno određen korišćenjem Nanodrop spektrofotometra (NanoDrop Technologies, Wilmington, Del.) i inkubiran 15 minuta na sobnoj temperaturi i 20 rpm sa odgovarajućom zapreminom Kappa select affinity matriksa (GE Health). Koraci inkubacije, obnavljanja smole, eluiranja i odsoljavanja se izvode kao što je prethodno opisano. Poslednji korak afinitetnog prečišćavanja se izvodi korišćenjem matrice afiniteta lambda Fab select (GE Healthcare) primenom istog postupka kao i za prethodna dva prečišćavanja. Konačni proizvod je kvantitativno određen korišćenjem Nanodrop. Prečišćena bispecifična antitela se analiziraju elektroforezom u uslovima denaturacije i redukcije. Bioanalizator Agilent 2100 se koristi sa kompletom Protein 80 kako je opisano od strane proizvođača (Agilent Technologies, Santa Clara, Kalifornija, SAD).4 µL prečišćenih uzoraka se pomeša sa puferom za uzorke sa dodatkom ditiotreitola (DTT; Sigma Aldrich, St. Louis, Mo.). Uzorci se zagrevaju na 95°C tokom 5 minuta, a zatim se stavljaju na čip. Svi uzorci su testirani na kontaminaciju endotoksinom pomoću testa Limulus Amebocyte Lysate (LAL; Charles River Laboratories, Wilmington, Mass.).

Primer 3: Merenje KD.

a) Eksperimentalni postupak za merenje KD Ab na rekombinantni humani CEACAM5 (oktet)

[0164] Afinitet anti-humane CEACAM5 grane CD47xCEACAM5 bispecifičnih antitela pronalaska prema rekombinantnom rastvorljivom humanom CEACAM5 određen je korišćenjem tehnologije bio-slojne interferometrije (BLI). Korišćeni su OctetRED96 instrument i protein A biosenzori (Sartorius). Merenje je obavljeno na 30°C. Posle hidratacije, prethodnog kondicioniranja i osnovnog koraka u Kinetičkom puferu (PBS, 0.002% Tween 20, 0.01% BSA, Kathon; Sartorius), biosenzori su napunjeni 5 minuta sa κλ telom na 0.5 µg/mL u Kinetičkom puferu. Zatim su biosenzori potopljeni u serijsko razblaženje rekombinantnog humanog CEACAM5 ekstraćelijskog domena (ECD) rastvorljivog proteina (proizveden „in house“), počevši od 50 nM sa 2x faktorom razblaženja. Faze asocijacije i disocijacije su praćene po 600 sekundi. Biosenzori su regenerisani korišćenjem 10 mM glicina pH 1.7. Primenjena je standardna brzina akvizicije (5.0 Hz, u proseku 20). Krive su obrađene uz oduzimanje referentnog bunarčića, Y poravnanje na početnoj liniji, bez korekcije između koraka. Afinitet je meren primenom globalnog modela uklapanja 1:1 na korake pune asocijacije i disocijacije.

4

Afinitet vezivanja (KD) bispecifičnih antitela pronalaska za rekombinantni humani CD47 određen je istim eksperimentalnim postupkom. KD primera bispecifičnih antitela pronalaska na CEACAM5, kao što je određeno ovim postupkom, prikazani su u Tabeli 2 ispod.

b) Eksperimentalni postupak za merenje KD Ab na rekombinantni humani CEACAM3 (oktet)

[0165] Afinitet anti-humanih CEACAM5 grana CD47xCEACAM5 bispecifičnih antitela pronalaska prema rekombinantnom rastvorljivom humanom CEACAM3 određen je korišćenjem tehnologije bio-slojne interferometrije (BLI) i instrumenta OctetRED96. HIS1K biosenzori (Sartorius), napunjeni anti-His tag antitelom, korišćeni su za hvatanje hisobeleženog rekombinantnog huCEACAM3 (R&D Systems, # 9868-CM). Merenje je obavljeno na 30°C. Posle hidratacije, prethodnog kondicioniranja i osnovnog koraka u Kinetičkom puferu (PBS, 0.002% Tween 20, 0.01% BSA, Kathon; Sartorius), biosenzori su napunjeni 5 minuta sa rekombinantnim huCEACAM3 na 5 µg/mL u Kinetičkom puferu. Zatim su biosenzori uronjeni u serijsko razblaženje κλ tela, počevši od 667 nM sa 2x faktorom razblaženja. Faze asocijacije i disocijacije su praćene 60 sekundi, odnosno 120 sekundi. Biosenzori su regenerisani korišćenjem 10 mM glicina pH 1.7. Primenjena je standardna brzina akvizicije (5.0 Hz, u proseku 20). Krive su obrađene dvostrukim referentnim oduzimanjem, Y poravnanjem na početnoj liniji i korekcijom između koraka. Afinitet je meren primenom globalnog modela uklapanja 1:1 na korak pune asocijacije i prvih 5 sekundi koraka disocijacije. KD primera bispecifičnih antitela pronalaska na CEACAM3, kao što je određeno ovim postupkom, prikazani su u tabeli 2 ispod.

Tabela 2. Afiniteti vezivanja (KD; nM) anti-CEACAM5 grane za 3 (tri) CD47xCEACAM5 bispecifična antitela, K2AC84, K2AC100 i K2AC22 (poređenje) mereno pomoću Octet.

4

Primer 4: Vezivanje epitopa CD47xCEACAM5 bispecifičnih antitela kompeticijom sa referentnim antitelom SM3E.

[0166] Vezivanje epitopa je kompetitivni imunološki test koji se koristi za karakterizaciju vezivanja antitela prema pronalasku ili npr. alternativno vezivanje srodnih bivalentnih anti-CEA (ciljni protein) antitela za prvi vezujući deo bispecifičnih antitela pronalaska. Kompetitivni blokirajući profil novog antitela koji se vezuje za ciljni protein stvara se protiv antitela koja se takođe vezuju za ovaj ciljni protein i za koja je epitop vezivanja već utvrđen/objavljen. Kompeticija sa ovim referentnim antitelom ukazuje na to da antitelo ima isti ili blisko lociran epitop i da su "vezani" zajedno. Sposobnost CD47xCEACAM5 bispecifičnih antitela iz ovog pronalaska da su u kompeticiji sa CEACAM5 referentnim antitelima je testirana pomoću ELISA na rekombinantnom humanom CEACAM5 sa referentnim antitelom izvedenim iz SM3E (US20050147614) koji nosi Fc region miša (mAb proizveden korišćenjem standardnih postupaka). SM3E se više vezuje za N-terminalni, distalni deo ćelijske membrane CEA.

[0167] Biotinilovani humani CEACAM5 je obložen sa 0.5 µg/ml u ploči sa 96 bunarčića obloženom streptavidinom i inkubiran sa serijskim razblaženjima referentnog mAb (od 0.09 nM do 67 nM) ili nepovezanog mAb koji nosi Fc region miša tokom 1 sata. CD47xCEACAM5 bispecifična antitela iz ovog pronalaska se dodaju u količini od 0.1 µg/ml tokom 1 sata na sobnoj temperaturi. Ploča je isprana i vezana CD47xCEACAM5 bispecifična antitela su otkrivena anti-humanim IgG(Fc)-HRP (Jackson ImmunoResearch). Nakon pranja, ploča se otkriva sa Amplex Red reagensom. Signal fluorescencije se meri na Sinergy HT čitaču ploča (Biotek).

[0168] Eksperimenti kompeticije su izvedeni sa CD47 × CEACAM5 bispecifičnim antitelima iz ovog pronalaska. Vezivanje K2AC82, K2AC84, K2AC91, K2AC100 i K2AC117 smanjeno je odgovarajućim kompetitivnim (tj. alatom) antitelom za 80% ili više. Bispecifično antitelo CD47xCEACAM5 je ovde identifikovano kao kompetitivno sa SM3E antitelom kada je vezivanje bispecifičnog antitela smanjeno za 80% ili više sa najvišom koncentracijom referentnog antitela. Bispecifično antitelo CD47xCEACAM5 je identifikovano kao nekompetitivno sa antitelom alata u slučaju da je vezivanje za CEACAM5 smanjeno za manje od 20% ako se uporede rezultati sa i bez dodavanja antitela alata.

4

Primer 5: Kvantitativno određivanje ciljne gustine (tj. broja) CEACAM5 i CD47 na površini ćelije 6 različitih ćelijskih linija kancera.

[0169] Izmerena je ciljna gustina (tj. broj) CEACAM5 i CD47 na površini ćelija 6 različitih ćelijskih linija kancera. Testirane ćelijske linije su bile ćelije humanog adenokarcinoma želuca (MKN-45, DSMZ ACC 409), ćelije humanog kolorektalnog kancera (SK-CO-1 (ATCC; HTB-39); SNU-C1 (ATCC; CRL-5972); Ls174T (ATCC; CL-188) i LoVo (ATCC; CCL-229)), ili ćelije adenokarcinoma pankreasa (HPAF-II, ATCC, CRL-1997).

[0170] QIFIKIT<®>(Agilent Dako) je korišćen za kvantitativno određivanje površinskih antigena ćelije protočnom citometrijom korišćenjem indirektnog imunofluorescentnog testa. QIFIKIT<®>sastoji se od serije od 6 populacija kuglica obloženih različitim, ali dobro definisanim količinama mišjeg monoklonskog antitela (Mab). Kuglice imitiraju ćelije obeležene specifičnim primarnim mišjim monoklonskim antitelom. Različiti uzorci ćelija mogu biti obeleženi različitim primarnim antitelima, a zatim kvantitativno određeni korišćenjem istog seta kalibracionih kuglica.

[0171] Ćelije su kultivisane u svom prilagođenom medijumu, odvojene sa tripsin-EDTA (Sigma Aldrich), centrifugirane (3 min, 350 g) i resuspendovane u hladnom FACS puferu (PBS, 2% BSA - od Sigma Aldrich), filtrirane kroz 0.22 µm (Stericup, Millipore)) da se dobije 3.106 ćelija/mL. 3.10<5>ćelija svakog uzorka su postavljene u ploču sa V-donom. 1 µL FcγR blokirajućeg reagensa je dodat u svaki bunarčić i ploča je inkubirana na 4°C tokom 10 min.10 µL primarnog antitela protiv humanog CEACAM5 (#sc-23928; mIgG1 (Santa Cruz)) i humanog CD47 (interna proizvodnja; B6H12; kičma miša), u konačnoj koncentraciji 20 µg/mL, dodato je ćelijama i inkubirano 30 min na 4°C. Ćelije su dva puta isprane sa 200 µL PBS BSA 2% i centrifugirane na 400 g tokom 3 min.100 µL kuglica (podešavanje ili kalibracija iz QIFIKIT<®>) je oprano zajedno sa ćelijama i tretirano identično.100 µL sekundarnog antitela iz kompleta (1/50 u PBS BSA 2 %) je dodato u svaki bunarčić i inkubirano 30 do 45 minuta na 4°C. Ćelije su centrifugirane (3 min, 400 g na 4°C) da bi se odbacio supernatant i dva puta isprane. Posle poslednjeg centrifugiranja, ćelije su resuspendovane u 130 µL CellFix i dobijene na CytoFlex citometru (Beckman Coulter). Analiza je urađena korišćenjem softvera FlowJo i geometrijskih sredstava eksportovanih u Excel datoteku. Linearna regresija je izvedena korišćenjem MFI vrednosti iz kalibracionih kuglica. Kapacitet vezivanja antitela (ABC) ćelija je ekstrapoliran iz ove regresivne linije. Specifični kapacitet vezivanja antitela (sABC) je dobijen oduzimanjem ABC od kontrole izotipa u onaj za specifično bojenje. Podaci iz ove analize prikazani su u tabeli 3 ispod.

4

Tabela 3. Ciljna gustina CEACAM5 i CD47 na površini ćelija 6 ćelijskih linija kancera.

Primer 6: Merenje vezivanja CEAxCD47 bispecifičnih antitela za CEACAM5 eksprimirajuće ćelijske linije kancera (EC50 i maksimalno vezivanje Emax).

[0172] Vezivanje CD47xCEACAMS bispecifičnih antitela je testirano na ćelijama humanog adenokarcinoma želuca koje eksprimiraju CEACAM5 (npr. MKN-45), na ćelijama humanog kolorektalnog kancera koje eksprimiraju CEACAMS (SK-CO-1, SNU-C1, Ls174T i LoVo), i na ćelije adenokarcinoma pankreasa koje eksprimiraju CEACAMS (HPAF-II).

[0173] Ćelije su sakupljene, prebrojane, proverene na održivost i resuspendovane na 3×10<6>ćelija/ml u FACS puferu (PBS 2% BSA, 0.1% NaN3).100 µl ćelijske suspenzije je raspoređeno u ploče sa 96 bunarčića sa V-dnom (3×10<5>ćelija/bunarčiću). Supernatant je uklonjen centrifugiranjem 3 minuta na 4°C, 1300 rpm. Povećane koncentracije antitela prema pronalasku se zatim dodaju u bunarčiće i inkubiraju 15 minuta na 4°C. Ćelije su dva puta isprane hladnim FACS puferom i ponovo inkubirane još 15 minuta na 4°C sa PE (R-fikoeritrin)-konjugovanim mišjim anti-humanim IgG Fc sekundarnim antitelom (SouthernBiotech, prethodno razblaženo 1:100 u FACS puferu). Ćelije su dva puta isprane hladnim FACS puferom i resuspendovane u 300 µl FACS pufera sa 1:15000 razblaženim SytoxBlue (Life Technologies). Fluorescencija, posebno srednja aktivnost fluorescencije (MFI), određena je korišćenjem Cytoflex (Millipore) protočnog citometra. Krive vezivanja i vrednosti EC50 i Emax su dobijene i izračunate korišćenjem softvera GraphPad Prism7. Podaci iz ove analize prikazani su u tabeli 4 u nastavku.

Tabela 4. EC50 (nM) i Emax(MFI) vezivanje 6 CD47xCEACAM5 bispecifičnih antitela na humane ćelijske linije kancera koje eksprimiraju CEACAM5 i CD47 (poređenje

K2AC22).

N/A - Nije primenljivo - nema dostupnih podataka za ovo Ab na ovoj ćelijskoj liniji

[0174] Podaci u tabeli 4 pokazuju da sva bispecifična antitela prema pronalasku pokazuju znatno niži EC50 i veći Emax u poređenju sa K2AC22.

1

[0175] Kao što je prikazano u tabeli 4, bispecifična antitela prema pronalasku vezuju se za SK-CO1 ćelije sa EC50 vrednošću od 10 do 30 nM, za MKN-45 ćelije sa EC50 vrednošću od 5 do 15 nM, za ćelije HPAF-II sa EC50 vrednošću od 5 do 15 nM, za SNU-C1 ćelije sa EC50 vrednošću od 1 do 10, za LS174T ćelije sa EC50 vrednošću od 3 do 15 nM i/ili za LoVo ćelije sa EC50 vrednošću od 15 do 25 nM.

[0176] Takođe, kao što je prikazano u tabeli 4, bispecifična antitela prema pronalasku se vezuju za SK-CO1 ćelije sa Emax vrednošću od 0.5 do 1.5 (MFI × 10<6>), za ćelije MKN-45 sa Emax vrednošću od 1 do 2 (MFI×10<6>), za HPAF-II ćelije sa Emax vrednošću od 0.5 do 1.5 (MFI × 10<6>), za SNU-C1 ćelije sa Emax vrednošću od 0.2 do 0.6 (MFI × 10<6>), za ćelije LS174T sa Emax vrednošću od 0.05 do 0.2 (MFI × 10<6>), i/ili za LoVo ćelije sa Emax vrednošću od 0.2 do 0.5 (MFI × 10<6>).

Primer 7: Merenje fagocitoze (indeks fagocitoze) odnosno ćelijske fagocitoze zavisne od antitela (ADCP).

[0177] Fagocitna in vitro aktivnost CEACAM5xCD47 bispecifičnih antitela pronalaska je procenjena korišćenjem 6 ćelijskih linija kancera koje eksprimiraju CEACAMS (MKN-45, SK-CO-1, SNU-C1, Ls174T, LoVo i HPAF-II). K2AC22 je procenjen za poređenje korišćenjem istih ćelijskih linija i eksperimentalnih postupaka.

[0178] Test se oslanja na postupak zasnovan na imidžingu, koji koristi CellInsight CX5 High Content Screening Platform. Procenjeno očitavanje je indeks fagocitoze, definisan kao prosečan broj ciljnih ćelija obuhvaćenih sa 100 makrofaga.

1. Priprema makrofaga:

[0179] Mononuklearne ćelije humane periferne krvi (PBMC) izolovane su iz „buffy coat“-a, od različitih zdravih donora (od 5 do 7 različitih donora, u zavisnosti od ćelijske linije), Ficoll gradijentom. Makrofagi su generisani kultivisanjem PBMC tokom 7 do 9 dana u kompletnom medijumu (RPMI 1640, 10% toplotno inaktivirani fetalni teleći serum [Invitrogen]), 2 mM L-glutamina, 1 mM natrijum piruvata, 10 mM HEPES pufera, 25 mg/mL gentamicina (sve od Sigma-Aldrich) i 50 mM 2-merkaptoetanola (Thermo Fisher Scientific)) u prisustvu 20 ng/mL faktora stimulacije kolonija humanih makrofaga (M-CSF) (PeproTech). Neadherentne ćelije su naknadno eliminisane u fazi diferencijacije (dan+1) razmenom medijuma za ćelijsku kulturu, a adherentne ćelije koje predstavljaju makrofage su odvojene korišćenjem pufera za disocijaciju

2

ćelija (Sigma-Aldrich) i isprane u kompletnom medijumu na dan upotrebe (dan 7, dan 8 ili dan 9) za ADCP eksperiment zasnovan na citometriji. Za ADCP zasnovan na imidžingu ćelija, makrofagi su odvojeni 6. dana korišćenjem pufera za disocijaciju ćelija i zasejani u količini od 30 000 po bunarčiću u 96 optičku ploču (Costar).

2. Procena aktivnosti fagocitoze (testovi zasnovani na CellInsight<™>)

[0180] Makrofagi (obojeni kalcein crveno narandžastom) koji su se prilepili za bunarčiće mikroploče su ko-inkubirani sa ciljnim tumorskim ćelijama obeleženim kalceinom AM u odnosu efektorske: ciljne ćelije od 1:3 tokom 30 minuta (MKN45 i SNU-C1) ili 2.5 sata (LoVo i Ls174T) na 37 stepeni C u prisustvu različitih koncentracija ispitivanih antitela. Na kraju perioda inkubacije, supernatanti su zamenjeni kompletnim medijumom za kulturu, a mikroploče su snimljene pomoću CellInsight<™>CX5 platforme za skrining visokog sadržaja. Prikupljeno je i analizirano 1500 makrofaga po bunarčiću. Fagocitoza je dokazana kao dvostruko pozitivni događaji (makrofag ciljna tumorska ćelija), a indeksi fagocitoze su izračunati pomoću CellInsight<™>softvera proizvođača.

[0181] Svi rezultati prikazani na slici 2 i tabelama 5, 6, 7, 8, 9 su dobijeni sa 4 ćelijske linije kancera koje eksprimiraju CEACAMS (MKN-45, SNU-C1, Ls174T, LoVo); sa odnosom efektorske ćelije prema ciljnoj i tumorskoj ćeliji od 1:3.

Tabela 5. Procenat povećanja maksimalnog indeksa fagocitoze procenjenog za 5 CEACAM5xCD47 bispecifičnih antitela u poređenju sa bispecifičnim Ab K2AC22.

[0182] Svih pet bispecifičnih antitela prema pronalasku pokazalo je bolje vezivanje u poređenju sa K2AC22 (niži EC50 i veći Emax, videti Primer 6, Tabela 4). Iznenađujuće, procenat povećanja maksimalno postignutog indeksa fagocitoze Emax ADCP antitela pronalaska u poređenju sa K2AC22 bio je najjači u ćelijskim linijama LoVo i Ls174T sa niskom ekspresijom CEACAM5.

[0183] Ovi rezultati su dobijeni u eksperimentima korišćenjem makrofaga dobijenih od različitih humanih donora. Podaci dobijeni iz ovakvih eksperimenata prikazani su u tabeli 6 (za ćelije MKN-45), tabeli 7 (za ćelije SNU-C1), u tabeli 8 (za ćelije Ls174T) i tabeli 9 (za ćelije LoVo).

Tabela 6. In vitro procena EC50 (µg/mL) i Emaxiz aktivnosti fagocitoze 6

CEACAM5xCD47 bispecifičnih antitela (K2AC82, K2AC84, K2AC91, K2AC100,

K2AC117 i K2AC22 (poređenje)) koristeći MKN-45 humanu ćelijsku liniju kancera kao ciljnog mesta sa 7 različitih donora (D) makrofaga.

4

Tabela 7. In vitro procena EC50 i Emax na osnovu aktivnosti fagocitoze 6 CEACAM5xCD47 bispecifičnih antitela (K2AC82, K2AC84, K2AC91, K2AC100 & K2AC117, i K2AC22) korišćenjem SNU-C1 humane ćelijske linije kancera kao ciljnog mesta sa 5 različitih donora (D) makrofaga.

Tabela 8. EC50 i Emaxaktivnosti fagocitoze 6 bispecifičnih antitela CD47xCEACAM5 na Ls174T humanoj ćelijskoj liniji kancera sa 5 različitih donora makrofaga.

Tabela 9. EC50 i Emaxaktivnosti fagocitoze 6 CD47xCEACAM5 bispecifičnih antitela na LoVo humanoj ćelijskoj liniji kancera sa 6 različitih donora makrofaga.

Primer 8: Merenje kompeticije za vezivanje za CEACAM5 između bispecifičnih antitela pronalaska i drugih terapeutskih antitela koja se vezuju za CEACAM5.

[0184] Test vezivanja za ćelije koje eksprimiraju CEACAM5 je izveden kao što je opisano u Primeru 6. Ovaj test se može koristiti za merenje pomeranja krive vezivanja bispecifičnih antitela prema pronalasku na ćelijske linije kancera MKN-45 i LS174T ako se CEAxCD3 bispecifična antitela kao što je cibisatamab ili TCB2014 dodaju u test vezivanja. Antitelo se smatralo kompetitivnim ako 300 nM antitela pomera krivu vezivanja bispecifičnog antitela prema pronalasku za manje od faktora 3.

[0185] U ovom eksperimentu, vezivanje CD47xCEACAM5 bispecifičnog antitela K2AC100 je mereno u prisustvu anti-CEACAM5 mAbs, bilo TCB2014 ili TCB 2017. Ovo vezivanje je mereno na površini MKN-45 ćelija koje eksprimiraju CEACAMS. K2AC100 je direktno obeležen fluorohromom da bi se pratilo njegovo vezivanje samo na ćelijama MKN-45 (tamna linija, tamni krugovi), u prisustvu 300 nM TCB2014 (tamna linija, tamni trouglovi) ili 30 nM TCB2017 (tamna linija, crni rombovi). Korišćene su negativne kontrole (Ctrl) (IgG1 u prisustvu TCB2014 ili TCB2017). Rezultati ovog eksperimenta su prikazani na Slici 5. Ovi podaci pokazuju da nije bilo ili da je bilo minimalno pomeranje krive vezivanja CEAxCD47 bispecifičnog antitela K2AC100 ovog pronalaska za MKN-45 tumorske ćelije ako se doda 300 nM TCB2014. Prema tome, antitelo K2AC100 nije kompetitivno sa antitelima TCB2014 i TCB2017 u pogledu vezivanja za CEACAM5.

[0186] Primer 9: Proizvodnja afukozilovanih bispecifičnih antitela prema pronalasku.

Tabele 10 i 11 prikazuju rezultate za fagocitozu dve ćelijske linije (MKN-45 i SNU-C1) pomoću afukozilovanih verzija bispecifičnih antitela pronalaska (EC50 i Emax). Afukozilovane verzije bispecifičnih antitela pronalaska su proizvedene i prečišćene sledećim postupcima:

1. Proizvodnja

[0187] CHO skup transfektovan plazmidom za odgovarajuće bispecifično antitelo pronalaska (za vektore, odnosno plazmide videti Primer 2) je inokulisan u koncentraciji vijabilnih ćelija od 0.3 × 10<6>ćelija/mL u Thomson erlen uređaju sa radnom zapreminom od 700 mL ili 100 mL za proizvodnju fukozilovanih i afukozilovanih antitela, respektivno. Svi skupovi su funkcionisali u režimu punjenja u trajanju od 15 dana koristeći CDACF medijum CDCHO i prilagođen režim punjenja. Za proizvodnju afukozilovanih antitela, dodat je bolus 200 µM inhibitora fukoze (1,3,4-Tri-O-acetil-2-deoksi-2-fluoro-L-fukoza) na dan 0, 5, 8 i 11 tokom šaržnog postupka punjenja zasnovanog na strategiji afukozilacije koju opisuju Rillahan et al. Nature Chem. Biol.

2012 Jul;8(7):661-8 i na osnovu EP2282773. Sakupljanje bispecifičnih antitela prema pronalasku skupova supernatanta koji sadrže fukozilovana ili afukozilovana antitela je obavljeno posle 15 dana kulture šaržnog punjenja. Sakupljeni CHO pulovi supernatanata su razbistreni upotrebom Sartoclear Dynamics<®>Lab V Cell Harvesting Sartorius sistema (videti uputstva dobavljača).

2. Prečišćavanje

[0188] Prečišćavanje fukozilovanih i afukozilovanih bispecifičnih antitela pronalaska je postignuto postupkom afinitetnog prečišćavanja u tri koraka. Pre početka prečišćavanja, merena je koncentracija antitela u supernatantu skupova bispecifičnih antitela korišćenjem OctetRED96 da bi se koristile kolone sa odgovarajućom zapreminom afinitetne matrice. Svaki prečišćeni supernatant CHO skupa koji sadrži fukozilovana ili afukozilovana bispecifična antitela sipan je na kolonu MabSelect SuRe (MSS) (GE Healthcare) bez prethodnog podešavanja, da bi se uklonio veći deo kontaminanata ćelijske kulture. MSS eluat je zatim tretiran zadržavanjem niskog pH da bi se inaktivirali virusi, i neutralizovan na pH 6 sa Tris 1M pH9. MSS eluat je zatim stavljen na kolonu LambdaFabSelect (LFS) (GE Healthcare) da bi se uklonio monospecifični κ (mono κ). LFS eluat je zatim podešen na pH 6. LFS je napunjen na Capto L (CL) kolonu (GE Healthcare) da bi se uklonio monospecifični λ (mono λ). CL eluatu je podešen pH pre skladištenja. Finalni materijal je zatim koncentrovan i dijafiltriran u pufer za finalnu formulaciju, pri čemu je njegova koncentracija podešena korišćenjem Nanodrop. Fukozilovana i afukozilovana bispecifična antitela su podeljena na alikvote i čuvana na -80°C do isporuke. Prečišćena bispecifična antitela su analizirana za određivanje veličine pomoću elektroforeze u uslovima denaturacije i redukcije sa Agilent 2100 bioanalizatorom korišćenjem kompleta Protein 80 kako je opisano od strane proizvođača (Agilent Technologies, Santa Clara, Kalifornija, SAD). Nivo agregacije je procenjen ekskluzionom hromatografijom (SEC-UPLC) korišćenjem ACQUITY UPLC H-klase Bio System (Waters). Analiza varijante punjenja prečišćenih bispecifičnih antitela je postignuta tehnikom izoelektričnog fokusiranja (IEF) korišćenjem sistema za elektroforezu Multiphor II (GE Healthcare). Relativna raspodela N-vezanih složenih biantenarnih glikoformi fukozilovanih i afukozilovanih K2AC5 i K2AC22 antitela određivani su korišćenjem propusnog mikročip-CE postupka na LabChip GXII Touch (Perkin Elmer). Sva antitela su testirana na kontaminaciju endotoksinom korišćenjem testa Limulus Amebocyte Lysate (LAL; Charles River Laboratories, Wilmington, Mass). Afuc bispecifična antitela pronalaska su pokazala afukozilaciju od > 70%.

[0189] Ova afukozilovana CEAxCD47 bispecifična antitela su korišćena da bi se dobili rezultati prikazani u tabelama 10 i 11 i na slikama 3A i 3B.

3. Drugi postupci za proizvodnju afukozilovanih bispecifičnih antitela prema pronalasku

3.1 Upotrebom FUT 8 negativne proizvodne ćelijske linije

[0190] Alternativno, i prema znanju pronalazača, afukozilovana bispecifična antitela prema pronalasku mogu se proizvesti i prema postupku kako sledi:

Materijal i postupci su prema Naoko Yamane-Ohnuki et al., Biotech. Bioeng.; 87 (2004) 614-622.

1

Izolacija cDNK kineskog hrčka FUT8

[0191] Prema znanju pronalazača, ukupna RNK je izolovana iz CHO/DG44 ćelija pomoću RNeasy<®>Mini kompleta (Qiagen, Hilden, Nemačka) i reverzno transkribovan sa oligo-dT korišćenjem sistema za sintezu prvog lanca Superscript za lančanu reakciju reverznog transkripta-polimeraze (RT-PCR) (Invitrogen, Carlsbad, CA). FUT8 cDNK kineskog hrčka je amplificiran iz jednolančanih cDNK ćelija CHO/DG44 pomoću PCR pomoću prajmera 5V-GTCTGAAGCATTATGTGTTGAAGC-3V (SEQ ID NO:45) i

5V-GTGAGTACATTCATTGTACTGTG-3V (SEQ ID NO:46), dizajniran od mišje FUT8 cDNK (Hayashi, 2000; DNA Seq 11:91-96).

Ciljni konstrukt FUT8 lokusa

[0192] Prema znanjima pronalazača, ciljano uništavanje gena FUT8 u ćelijama CHO/DG44 se vrši korišćenjem dva vektora zamene, pKOFUT8Neo i pKOFUT8Puro. Fragment od 9.0 kb gena FUT8 uključujući prvi kodirajući egzon je izolovan skriningom CHO-K1 ćelijske E-genomske biblioteke (Stratagene, La Jolla, CA) sa cDNK kineskog hrčka FUT8 kao probom za uspostavljanje ciljanih konstrukata. Segment od 234 bp koji sadrži mesto inicijacije translacije zamenjen je kasetom gena otpornosti na neomicin (Neor) ili kasetom gena rezistencije na puromicin (Puror) iz plazmida pKOSelectNeo ili pKOSelectPuro (Lekicon, TX), respektivno, okruženom loxP mestima. Kaseta gena za toksin difterije (DT) iz plazmida pKOSelectDT (Leksikon) je umetnuta u homologni region 5V. Dobijeni ciljni konstrukti, pKOFUT8Neo i pKOFUT8Puro, uključivali su homolognu sekvencu od 1.5 kb 5V i homolognu sekvencu od 5.3 kb 3V. Pre transfekcije, ciljani konstrukti se linearizuju na jedinstvenom mestu SaII.

Transfekcija i skrining za homologne rekombinante

[0193] Prema znanjima pronalazača, subkonfluentne ćelije CHO/DG44 (1.6 106) su elektroporisane sa 4 Ag linearizovanog pKOFUT8Neo na 350 V i 250 AF koristeći Bio-Rad GenePulser<®>II. Nakon elektroporacije, transfektanti se selektuju sa 600 Ag/mL G418 (Nacalai Tesque, Kyoto, Japan). Genomski PCR se izvodi u pločama sa 96 bunarčića modifikovanim postupkom mikroekstrakcije koji je ranije objavljen (Ramirez-Solis et al., 1992; Anal Biochem 201:331-335) koristeći sledeće prajmere:

5V-TTGTGTGACTCTTAACTCTCAGAG-3V (SEQ ID NO:47) i

5V-GAGGCCACTTGTGTAGCGCCAAGTG-3V (SEQ ID NO:48).

2

[0194] Homologni rekombinanti se identifikuju fragmentom od 1.7 kb dobijenim korišćenjem genomskog PCR i potvrđeni Southern blot analizom koristeći fragment od 221 bp amplifikovan sledećim prajmerima:

5V-GTGAGTCCATGGCTGTCACTG-3V (SEQ ID NO:49) i

5V-CCTGACTTGGCTATTCTCAG-3V (SEQ ID NO:50).

[0195] Hemizigotni klon je podložan drugoj rundi homologne rekombinacije korišćenjem linearizovanog pKOFUT8Puro i selekcije leka sa 15 Ag/mL puromicina (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) kao što je ranije opisano. Identifikovani homozigotni disruptanti su elektroporisani sa Cre-rekombinaznim ekspresionim vektorom pBS185 (Invitrogen) da bi se uklonile kasete gena otpornosti na lekove sa oba alela FUT8.

Proizvodnja monoklonskih antitela pomoću FUT8(-) ćelija

[0196] Prema znanjima pronalazača, FUT8(-) ćelijske linije su elektroporisane ekspresionim vektorom koji kodira bispecifično antitelo prema pronalasku i selekcionisano u medijumu bez hipoksantina i timidina. Konfluentni transfektanti su kultivisani u Ex-Cell<®>301 medijumu (JRH Biosciences, Lenexa, KS) u trajanju od 1 nedelje. Antitelo je prečišćeno iz supernatanata kulture korišćenjem MabSelect<™>(Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). Dalji koraci prečišćavanja mogu biti hromatografija izmene anjona/katjona, hromatografija isključivanja veličine i posebno prečišćavanje korišćenjem kapa, odnosno lambda selektivnih smola kao što je gore opisano.

3.2. Uzimanjem ekstracelularne fukoze iz produkcionog ćelijskog medijuma plus enzimska intervencija sa intracelularnom biosintezom fukoze

[0197] Poželjno, i prema znanjima pronalazača, afukozilovana bispecifična antitela pronalaska mogu da se proizvedu i prema postupku/tehnologiji kako sledi i opisana u, US8642292. Ova tehnologija je dizajnirana da konfiguriše stabilnu integraciju heterolognog bakterijskog enzima u ćelijsku liniju proizvođača antitela kao što je ćelijska linija CHO ili druge. Ovim se blokira de novo sinteza fukoze iz D-manoze. Ako se pored toga proizvodne ćelije kultivišu u medijumu bez fukoze, kao rezultat se proizvode antitela sa stabilnim nivoom afukozilacije.

[0198] U eukariotskim ćelijama fukoza se stvara preko dva puta,

a) iz ekstracelularnog prostora ili lizozoma kroz spasonosni put i

b) de novo sintezom fukoze iz D-manoze u de novo putu sinteze fukoze.

[0199] Put spasavanja može biti potpuno blokiran izostavljanjem fukoze iz medijuma za kulturu. De novo put biosinteze može biti blokiran pretvaranjem intermedijera GDP-4-keto-6-deoksi-D-manoze ovog puta u GDP-D-ramnozu umesto GDP-4-keto-6-deoksi-D-galaktoze. Ovo se postiže unošenjem bakterijskog enzima GDP-6-deoksi-D-likso-4-heksuloze reduktaze (RMD) u proizvodnu ćelijsku liniju, odnosno stabilnom integracijom gena koji kodira RMD u proizvodnu ćelijsku liniju. Čak i prilično male količine RMD eksprimirane u proizvodnoj ćelijskoj liniji u potpunosti blokiraju de novo put sinteze proizvodne ćelije.

[0200] Ova tehnologija će se koristiti za konstruisanje proizvodnih ćelijskih linija, npr. ćelijske linije zasnovane na CHO, dizajnirane za proizvodnju afukozilovanih antitela prema pronalasku, kao i za postojeće proizvodne ćelijske linije koje već proizvode antitela pronalaska i konstruisane su da proizvode antitela sa smanjenim sadržajem fukoze za 80% do 100%.

[0201] Svi rezultati prikazani na slikama 3A i 3B i tabelama 10 i 11 su dobijeni sa 2 ćelijske linije kancera koje eksprimiraju CEACAM5 (MKN-45 i SNU-C1); sa odnosom efektorske ćelije prema ciljnoj i tumorskoj ćeliji od 1:3. Ovi rezultati su dobijeni u eksperimentima korišćenjem makrofaga dobijenih od tri različita humana donora. Podaci dobijeni iz ovakvih eksperimenata prikazani su u tabeli 10 (za ćelije MKN-45) i tabeli 11 (za ćelije SNU-C1).

Tabela 10. In vitro procena EC50 (µg/mL) i Emax(maksimalni indeks fagocitoze) od aktivnosti fagocitoze 6 afukozilovanih CEACAM5xCD47 bispecifičnih antitela (K2AC82 afuko, K2AC84 afuko, K2AC91 afuko, K2AC100 afuko, K2AC117 afuko i K2AC22 (poređenje)) upotrebom MKN45 humane ćelijske linije kancera kao ciljnog mesta sa 2 različita donora (D) makrofaga.

4

Tabela 11. In vitro procena EC50 (µg/mL) i Emaxiz aktivnosti fagocitoze 6 afukozilovanih CEACAM5xCD47 bispecifičnih antitela (K2AC82 afuko, K2AC84 afuko, K2AC91 afuko, K2AC100 afuko, K2AC117 afuko i K2AC22 afuko (poređenje)) upotrebom SNU-C1 humane ćelijske linije kancera kao ciljnog mesta sa 2 različita donora (D) makrofaga.

Primer 10

Blokiranje interakcije SIRPα sa CD47 na tumorskim ćelijama.

[0202] Eksperimentalna postavka za merenje SIRPα inhibitorne potencije (IC50) bispecifičnih antitela ovog pronalaska:

[0203] Ispitivanje zasnovano na ćelijama koje prati interakciju rastvorljivog SIRPα sa humanim CD47 eksprimiranim na površini MKN-45 ćelija, kao što je opisano u nastavku, korišćen je za detekciju aktivnosti blokiranja. Eksperimenti koncentracije-odgovora sa bispecifičnim antitelima prema pronalasku omogućili su određivanje krive inhibicije (videti sliku 4) i vrednosti IC50 (videti tabelu 12).

[0204] Ćelije kancera MKN-45, koje eksprimiraju i CD47 i CEACAM5, obojene su CFSE ljubičastom da bi se omogućilo sistemu za imidžing (CX5) da detektuje ćelije. Ukratko, 3'000 obojenih MKN-45 ćelija po bunarčiću je zasejano u ploču sa 384 optička bunarčića (Costar) i inkubirano 50 minuta sa povećanom koncentracijom bispecifičnih antitela pronalaska (1.9 pM do 333 nM, u četiri puta). Zatim je dodata fiksna koncentracija SIRPα-mišjeg Fc prethodno pomešanog sa anti-mišjim IgG-Fc AF647 spojenim antitelom (Jackson Immunoresearch razblaženo 1:2000) u konačnoj količini od 50 ng/mL. Posle inkubacije od 3 sata i 30 minuta, slike fluorescentnih signala koje emituje detektovani vezani SIRPα na pločama su dobijene pomoću sistema za imidžing (CKS5, Thermo Fisher). Signali fluorescencije (srednji intenzitet fluorescencije MFI) su ucrtani na grafikon prema opsegu testiranih doza i IC50 je izračunat pomoću softvera (Prism, GraphPad). Rezultati su prikazani u tabeli 12:

Tabela 12. IC50 (nM) izmeren testom blokiranja CD47/SIRPα za 5 CEACAM5xCD47 bispecifičnih antitela iz ovog pronalaska (K2AC82, K2AC84, K2AC91, K2AC100 i K2AC117) u poređenju sa najsavremenijim bispecifičnim CEAxCD47 antitelom K2AC22 (upotrebom MKN-45 kao ćelija koje eksprimiraju hCD47).

Primer 11: Organoidni postupak za a. dobijanje ekspresije CEACAM5 u ćelijama kancera iz svežih uzoraka pacijenata obolelih od kancera (Qifikit podaci) i b. za dobijanje podataka o fagocitozi

[0205] Organoidi dobijeni iz primarnih uzoraka pacijenata pripremljeni su kao jednoćelijska suspenzija standardnim postupcima (enzimska digestija i/ili mehanička disocijacija). 10 µL anti-humanog CEACAM5 primarnog antitela ((#sc-23928; mIgG1 (Santa Cruz); konačna koncentracija 20 µg/mL) je dodato u ćelije i inkubirano 30 minuta na 4°C. Ćelije su isprane i centrifugirane. 100 µL kuglica (podešavanje ili kalibracija iz QIFIKIT<®>) je oprano zajedno sa ćelijama i tretirano identično.100 µL sekundarnog antitela iz kompleta (1/50 u PBS BSA 2 %) je dodato u svaki bunarčić i inkubirano 30 do 45 minuta na 4°C. Ćelije su centrifugirane da bi se odbacio supernatant i dva puta isprane. Posle poslednjeg centrifugiranja, ćelije su resuspendovane dobijene na citometru. Analiza je urađena korišćenjem specifičnog softvera i geometrijskih sredstava eksportovanih u Excel datoteku. Linearna regresija je izvedena korišćenjem MFI vrednosti iz kalibracionih kuglica. Kapacitet vezivanja antitela (ABC) ćelija je ekstrapoliran iz ove regresivne linije. Specifični kapacitet vezivanja antitela (sABC) je dobijen oduzimanjem ABC od kontrole izotipa od onog sa specifičnim bojenjem.

[0206] Utvrđeno je da je prosečna ekspresija CEACAM5 ovih primarnih organoida 28 000 CEACAM5 ciljnih mesta po ćeliji, odnosno faktor približno 4 puta niži od prosečne ekspresije na ćelijskim linijama u Tabeli 5.

[0207] Organoidi dobijeni iz primarnih uzoraka pacijenata obolelih od kancera mogu se takođe koristiti za proučavanje indeksa fagocitoze/fagocitoze zavisne od koncentracije ako se dodaju bispecifična antitela pronalaska i makrofagi od humanih donora (videti Primer 7). Korišćenjem istih postupaka, prema znanjima pronalazača, mogu se proučavati i kombinacije bispecifičnih antitela pronalaska sa CEAxCD3 bispecifičnim antitelima ako se dodaju i T-ćelije humanih donora.

Primer 12: Anti-tumorska aktivnost: kulture isečaka tkiva.

[0208] Prema znanju pronalazača, antitumorska aktivnost bispecifičnog antitela prema pronalasku može se proceniti kao pojedinačno sredstvo, kao i u kombinovanom tretmanu, respektivno, u kulturama isečaka tumorskog tkiva (videti Sönnichsen et al., Clinical Colorectal Cancer 2018) od pacijenata sa dijagnozom tumora koji eksprimiraju CEA.

1. Kultura isečaka tkiva i tretman

[0209] Sveži uzorci tumorskog tkiva se seku i njima se rukuje kako je prethodno objavljeno (Sönnichsen et al., Clinical Colorectal Cancer 2018). Ukratko, odmah nakon hirurške resekcije i prve makroskopske patološke procene, uzorci tumora se seku na isečke od 350 µm pomoću seckalice tkiva. Prečnik preseka tkiva se zatim standardizuje korišćenjem alata za jezgrovanje od 3 mm. Tri isečka tkiva su nasumično skupljena, postavljena na membranske umetke i kultivisane u pločama sa 6 bunarčića. Isečci se inkubiraju pod standardizovanim uslovima od 37°C i 5% CO2. Posle pre-kultivacije u standardnom medijumu za ćelijsku kulturu, tripleti isečaka su izloženi bispecifičnim antitelima prema pronalasku pojedinačno ili u kombinaciji (npr. sa inhibitorima PD-L1), respektivno, do 120 sati. Nakon izlaganja jedinjenju, isečci tumora su fiksirani preko noći korišćenjem 4% paraformaldehida.

2. Bojenje

[0210] Paraformaldehidnom fiksirani isečci se kalupe u parafin i obrađuju u isečke od 5 µm. Bojenje hematoksilinom i eozinom (HE) se vrši da bi se procenili histopatološki aspekti i proporcija tumorskih ćelija. Ukupan broj ćelija, broj tumorskih ćelija i proliferacija se analiziraju imunofluorescentnim bojenjem. Ukratko, parafinski delovi su deparafinizovani. Posle uzimanja antigena, isečci su isprani sa 0.3% PBS/TritonX i blokirani sa 5% normalnog

kozjeg seruma tokom 30 minuta. Primarna antitela protiv citokeratina (AE1 3), Ki67 i odcepljenog-PARP, respektivno, razblaženi su u 0.5% albuminu goveđeg seruma i inkubirani na 4°C preko noći. Isečci su isprani sa 0.3% fosfatnim puferisanim fiziološkim rastvorom/TritonX i obeležene sekundarnim antitelima. Jedra su obojena sa Hoechst 33342. Dodatna bojenja (npr. za CEA ekspresiju) mogu biti uključena.

3. Analiza podataka

[0211] Pet slika (20x) po isečku tkiva je uslikano sa fluorescentno obojenih isečaka pomoću fluorescentnog mikroskopa. Pozitivan broj piksela je određen za mrlje Hoechst 33342, citokeratin, Ki67 i odcepljenog PARP pomoću algoritama segmentacije specifičnih za mrlje. Proliferirajuća/apoptotička površina tumora se izračunava analizom piksela jedara pozitivnih na Ki67/odcepljeni PARP okruženih pikselima pozitivnim na citokeratin. Za svaku sliku izračunava se ukupan broj ćelija (Hoechst-pozitivnih), broj tumorskih ćelija (Hoechst- i citokeratin-pozitivnih) i broj proliferirajućih tumorskih ćelija (Hoechst-, citokeratin- i Ki67-pozitivnih/ocepljeni-PARP). Broj tumorskih ćelija se normalizuje na ukupan broj ćelija, a broj proliferirajućih tumorskih ćelija se normalizuje na broj tumorskih ćelija da bi se razmotrile različite frakcije tumorskih ćelija po slici. Srednje vrednosti isečaka se zatim izračunavaju iz vrednosti pojedinačne slike. Srednje vrednosti za uslove se izračunavaju korišćenjem srednjih vrednosti preseka.

Primer 13: In vivo antitumorska aktivnost.

[0212] Prema znanju pronalazača, antitumorska aktivnost bispecifičnog antitela prema pronalasku može se proceniti kao pojedinačno sredstvo, kao i u kombinovanom tretmanu, respektivno, kod transgenih miševa.

1. Generisanje ćelijskih linija i testiranje rasta

[0213] Biće generisana ćelijska linija hCEACAMS(Tg)hCD47(Tg)mCD47(ko), npr. na osnovu mišjih ćelijskih linija kancera debelog creva CT26 ili MC38. Nokaut (KO) endogenog mišjeg CD47 gena se izvodi korišćenjem CRISPR/Cas9 uz naknadnu izolaciju KO klonova sortiranjem ćelija. Transfekcija KO klonova sa kasetom koja pokreće ekspresiju i hCD47 i hCEACAM5 korišćenjem unutrašnjeg mesta ulaska u ribozom (IRES) je izvedena praćena izolacijom konstruisanih klonova na osnovu npr. ukupnih nivoa ekspresije i odnosa. Tri validirana klona će biti selekcionisana da bi se naknadno testiralo njihovo presađivanje/tumorigenost in vivo za selekciju konačnog klona.

2. In vivo antitumorska aktivnost

[0214] Sojevi miševa BALB/cJGpt osnove koji eksprimiraju humani CD3e (T001550 heterozigotni BALB/c-hCD3ET/Wt miševi) i humani CD47/humani SIRPα (T037264 homozigotni BALB/c-hCD47/hSIRPα miševi) dostupni su u GemPharmatech. Alternativno, sojevi miševa sa osnovom C57BL/6/Bcgen koji eksprimiraju humani CD3e (homozigotni B-hCD3E miševi) i humani CD47/humani SIRPα (homozigotni B-hSIRPα/hCD47 miševi) dostupni su u Biocytogen. Ova dva soja miševa će biti ukrštena da bi se dobili trostruki humanizovani hCD3e/hSIRPa/hCD47 miševi, a potomci korišćeni za naredne eksperimente za testiranje bispecifičnog antitela prema pronalasku bilo kao pojedinačno sredstvo ili u kombinovanom tretmanu.

[0215] Trostruki humanizovani hCD3e/hSIRPa/hCD47 miševi su inokulisani ili sa ćelijskom linijom CT26-hCEACAM5(Tg)hCD47(Tg)mCD47(ko) (BALB/c osnova) ili MC38-hCEACAM5(Tg)hCD47(Tg)mCD47(ko) linija (C57BL/6 pozadina) na dan 0. Kada srednja veličina tumora u kohorti dostigne npr. 200 mm<3>, tretman sa bispecifičnim antitelom prema pronalasku kao pojedinačnim sredstvom, kao i u kombinaciji, započinje kao i.v. bolus u intervalu od npr.2 tretmana nedeljno dok jedan miš ne pokaže zapreminu tumora od npr. preko 3000 mm<3>ili se desi bilo koja ili više od unapred specificiranih krajnjih tačaka zaštite i nege životinja. Zapremina tumora i telesna težina se mere tri puta nedeljno. Zapremina tumora je data u mm<3>koristeći sledeću formulu: TV = 0.5 a × b2, gde su a i b dugi i kratki prečnik tumora, respektivno.

Claims

Patentni zahtevi

1. Bispecifično antitelo koje sadrži prvi vezujući deo koji se specifično vezuje za humani CEACAM5 i drugi vezujući deo koji se specifično vezuje za humani CD47 naznačen time što:

a) prvi vezujući deo kao varijabilni region teškog lanca sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži CDRH1 prema SEQ ID NO:1, CDRH2 prema SEQ ID NO:2 i CDRH3 prema SEQ ID NO:3,

b) prvi vezujući deo kao varijabilni region lakog lanca sadrži varijabilni region lakog lanca koji sadrži CDRL set izabran iz grupe koja se sastoji od

CDRL1 prema SEQ ID NO:17, CDRL2 prema SEQ ID NO:18 i CDRL3 prema SEQ ID NO:19, ili

CDRL1 prema SEQ ID NO:23, CDRL2 prema SEQ ID NO:24 i CDRL3 prema SEQ ID NO:25, i

c) drugi vezujući deo kao varijabilni region teškog lanca sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži CDRH1 prema SEQ ID NO:1, CDRH2 prema SEQ ID NO:2 i CDRH3 prema SEQ ID NO:3, i kao varijabilni region lakog lanca sadrži varijabilni region lakog lanca koji sadrži CDRL1 prema SEQ ID NO:7, CDRL2 prema SEQ ID NO:8 i CDRL3 prema SEQ ID NO:9.

2. Bispecifično antitelo prema patentnom zahtevu 1, naznačeno time što sadrži prvi vezujući deo koji se specifično vezuje za humani CEACAM5 i drugi vezujući deo koji se specifično vezuje za humani CD47, naznačen time što u prvom vezujućem delu kao varijabilni region teškog lanca sadrži varijabilni region teškog lanca SEQ ID NO: 4 i kao varijabilni region lakog lanca sadrži varijabilni region lakog lanca SEQ ID NO: 33 ili SEQ ID NO: 35 i koji u drugom vezujućem delu kao varijabilni region teškog lanca sadrži varijabilni region teškog lanca SEQ ID NO:4 i kao varijabilni region lakog lanca sadrži varijabilni region lakog lanca koji ima SEQ ID NO:10.

3. Bispecifično antitelo koje sadrži prvi vezujući deo koji se specifično vezuje za humani CEACAM5 i drugi vezujući deo koji se specifično vezuje za humani CD47, naznačen time što u prvom vezujućem delu kao varijabilni region teškog lanca sadrži varijabilni region teškog lanca SEQ ID NO:4 i kao varijabilni region lakog lanca sadrži varijabilni region lakog lanca izabran iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:34 i SEQ ID NO:36 i u drugom vezujućem delu kao varijabilni region teškog lanca sadrži varijabilni region teškog lanca SEQ ID NO:4 i kao varijabilni region lakog lanca sadrži varijabilni region lakog lanca koji ima SEQ ID NO:10.

4. Bispecifično antitelo prema patentnom zahtevu 2, naznačeno time što u prvom vezujućem delu sadrži teški lanac koji sadrži SEQ ID NO: 5 i laki lanac izabran iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 38 ili SEQ ID NO: 40 i u drugom vezujućem delu sadrži region teškog lanca SEQ ID NO:5 i laki lanac koji ima SEQ ID NO:11.

5. Bispecifično antitelo prema patentnom zahtevu 3, naznačeno time što u prvom vezujućem delu sadrži teški lanac koji sadrži SEQ ID NO: 5 i laki lanac izabran iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39 i SEQ ID NO: 41 i u drugom vezujućem delu sadrži region teškog lanca SEQ ID NO:5 i laki lanac koji ima SEQ ID NO:11.

6. Bispecifično antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 5, naznačeno time što je pomenuto antitelo monovalentno za prvi vezujući deo i monovalentno za drugi vezujući deo.

7. Bispecifično antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 6, naznačeno time što pomenuto antitelo sadrži Fc region koji je konstruisan glikoinženjeringom tako da ima smanjen broj ostataka fukoze u poređenju sa istim bispecifičnim antitelom koje nije konstruisano glikoinženjeringom.

8. Bispecifično antitelo prema patentnom zahtevu 1, naznačeno odnosom KD vrednosti za vezivanje za rekombinantni CEACAM3 i rekombinantni CEACAM5 faktora od 100 ili više.

9. Bispecifično antitelo prema patentnom zahtevu 1, naznačeno povećanjem od najmanje 8% maksimalnog indeksa fagocitoze LoVo tumorskih ćelija u poređenju sa indeksom fagocitoze bispecifičnog antitela K2AC22, koje sadrži uobičajeni teški lanac SEQ ID NO:6, vezujući deo lakog lanca koji se vezuje za CD47 SEQ ID NO: 42, i laki lanac koji se vezuje za CEACAM5 prema SEQ ID NO:11.

10. Bispecifično antitelo prema patentnom zahtevu 9, naznačeno povećanjem maksimalnog indeksa fagocitoze između 8% i 20% za LoVo tumorske ćelije.

11. Bispecifično antitelo prema patentnom zahtevu 1, naznačeno inhibiranjem interakcije između CD47 i SIRPα na MKN-45 ćelijama sa IC50 od 0.1 nM ili niže.

12. Bispecifično antitelo prema patentnom zahtevu 11, naznačeno inhibiranjem interakcije između CD47 i SIRPα na MKN-45 ćelijama sa IC50 od 0.1 nM do 0.04 nM.

13. Bispecifično antitelo prema patentnom zahtevu 1, pri čemu je navedeno bispecifično antitelo naznačeno time što cibisatamab u koncentraciji od 300 nM, ne pomera EC50 krive vezivanja pomenutog bispecifičnog antitela za ćelije MKN-45 ili za LS174T ćelije za više od faktora 3 ka višim koncentracijama.

14. Izolovani polinukleotid ili set polinukleotida koji kodira bispecifično antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 13.

15. Ekspresioni vektor koji sadrži polinukleotid ili polinukleotide prema patentnom zahtevu 14.

16. Ćelija domaćin koja sadrži ekspresioni vektor prema patentnom zahtevu 15.

17. Postupak za proizvodnju bispecifičnog antitela prema bilo kom od patentnih zahteva 1-13, koji sadrži a) kultivisanje ćelije domaćina prema patentnom zahtevu 16 pod uslovima koji dozvoljavaju proizvodnju pomenutog bispecifičnog antitela, i b) izolovanje pomenutog antitela.

18. Bispecifično antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1-13, za upotrebu u terapiji humanog kancera.

19. Bispecifično antitelo za upotrebu prema patentnom zahtevu 18, naznačeno time što kancer je solidni kancer.

20. Bispecifično antitelo za upotrebu prema patentnom zahtevu 19, naznačeno time što kancer je kolorektalni kancer, NSCLC (nesitnoćelijski kancer pluća), kancer želuca, kancer pankreasa, kancer dojke ili drugi kancer koji eksprimira CEACAM5.

21. Bispecifično antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1-13 za upotrebu u istovremenoj, odvojenoj ili uzastopnoj kombinaciji sa drugim bispecifičnim antitelom koje sadrži treći vezujući deo koji se specifično vezuje za humani CEACAM5, i četvrti vezujući deo koji se specifično vezuje za humani CD3ε u lečenju subjekta koji ima kancer koji eksprimira CEACAM5.

22. Bispecifično antitelo prema patentnom zahtevu 21, naznačeno time što drugo bispecifično antitelo je cibisatamab.

23. Bispecifično antitelo za upotrebu prema patentnom zahtevu 21 ili 22 naznačeno time što bispecifično antitelo prema pronalasku i drugo bispecifično antitelo se primenjuju na navedenog subjekta istovremeno u intervalima od 6 do 15 dana.

24. Farmaceutska kompozicija koja sadrži bispecifično antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 13 i farmaceutski prihvatljiv ekscipijens ili nosač.

25. Farmaceutska kompozicija prema patentnom zahtevu 24, za upotrebu kao lek.

26. Farmaceutska kompozicija prema zahtevu 24, za upotrebu kao lek u lečenju solidnog kancera.

27. Farmaceutska kompozicija prema patentnom zahtevu 24, za upotrebu kao lek u lečenju kolorektalnog kancera, NSCLC (nesitnoćelijskog kancera pluća), kancera želuca, kancera pankreasa ili kancera dojke.