CN116670173A

CN116670173A - 抗ceacam5和cd47的双特异性抗体

Info

Publication number: CN116670173A
Application number: CN202180085112.XA
Authority: CN
Inventors: V·布阿托伊斯; A·塞金格; D·豪赛
Original assignee: Ramcap Bioassay Co ltd
Current assignee: Ramcap Bioassay Co ltd
Priority date: 2020-12-18
Filing date: 2021-12-17
Publication date: 2023-08-29

Abstract

本发明涉及结合人癌胚抗原CEACAM5和人CD47的双特异性抗体。此外，本发明涉及编码这种双特异性抗体的多核苷酸以及包含这种多核苷酸的载体和宿主细胞。本发明进一步涉及选择和产生这种抗体的方法，以及使用这种抗体治疗疾病的方法。本发明还涉及双特异性抗体在单一疗法和组合疗法中的治疗用途。

Description

抗CEACAM5和CD47的双特异性抗体

对序列表的引用

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技术领域

本发明涉及结合人癌胚抗原CEACAM5(CEA)和人CD47的双特异性抗体(CEAxCD47双特异性抗体)。此外，本发明涉及编码这种双特异性抗体的多核苷酸以及包含这种多核苷酸的载体和宿主细胞。本发明进一步涉及选择和产生这种抗体的方法，以及使用这种抗体治疗疾病的方法。本发明还涉及CEAxCD47双特异性抗体在单一疗法和组合疗法中的治疗用途，特别是与CEAxCD3 T细胞双特异性抗体(TCB)和/或PD-1或PD-L1抑制剂的组合疗法的治疗用途。

背景技术

CEA属于CEA相关的细胞黏附分子(CEACAM)家族，该家族包含人类12种密切相关的蛋白质，由分散在染色体19q13上CEACAM和妊娠特异性糖蛋白(PSG)亚群之间的22个基因编码(Beauchemin N&Arabzadeh A,Cancer Metastasis Rev.2013)。CEACAM参与多种生理过程，例如细胞-细胞识别和从组织结构和新生血管的形成到胰岛素稳态和T细胞增殖的调节的调控细胞过程；CEACAM也被鉴定为宿主特异性病毒和细菌的受体(Kuespert K等，CurrOpin Cell Biol.2006)。CEA(CEACAM5或CD66e；UniProtKB-P06731)存在于胚胎和胎儿发育的早期，并在正常成人组织中维持其表达。它的主要表达部位是结肠的柱状上皮细胞和杯状细胞，特别是在隐窝的上三分之一和游离腔表面。

CEA在上皮起源肿瘤中(过)表达，包括但不限于结直肠癌、胃癌、肺癌和胰腺癌(综述于Beauchemin N&Arabzadeh A,Cancer Metastasis Rev.2013)，其中CEA失去其顶端表达，导致分布在整个细胞表面(Semin Cancer Biol 1999)。

US20140242079和WO2017118657(各自通过引用整体并入)中提到了一种通过人PD-1轴拮抗剂和重定向和活化T细胞的抗CEA/抗CD3双特异性抗体的组合治疗表达CEA的癌症的方法，临床结果已在2017年ASCO年会上发表(Tabernero等，J Clin Oncol 35，2017(suppl；abstr 3002))。

WO2015112534中提到了一种通过施用结合免疫检查点途径的两个或更多个不同靶标的免疫检查点拮抗剂和结合CEA和T细胞表面抗原的T细胞重定向剂来治疗肿瘤的方法。US20110064653中提到了与CEACAM5和粒细胞结合的I类抗体。

人CD47(UniProtKB-Q08722(CD47_人类；IAP))是与配体血小板反应蛋白-1(TSP-1)和信号调节蛋白α(SIRPα；CD172a；UniProtKB P78324)结合的跨膜蛋白，可以作为对免疫系统(尤其是对表达SIRPα的巨噬细胞)的“不要吞噬我”信号。对SIRPα与肿瘤细胞表面CD47结合的有效抑制(低IC50)是增加巨噬细胞对肿瘤细胞吞噬作用的一种措施。CD47参与一系列细胞过程，包括细胞凋亡、增殖、黏附和迁移。此外，它在免疫和血管生成反应中发挥关键作用。CD47在患有血液和实体肿瘤的患者的肿瘤细胞中过表达。抗CD47的抗体在现有技术中进行了描述，并在不同肿瘤实体中显示出良好的临床前和早期临床活性，所述肿瘤实体包括血液恶性肿瘤(例如淋巴瘤)和实体肿瘤(例如胃癌(Weiskopf K.,European Journalof Cancer 76(2017)100-109；Huang Y等,J Thorac Dis 2017；9(2):E168-E174；Kaur等,Antibody Therapeutics,3(2020)179–192))。结合CD47的IgG1亚类抗体可以以Fc依赖的方式导致血小板的耗竭和红细胞(RBC)和血红蛋白的减少(参见例如US20140140989)。为了避免这种不利影响，在WO2017196793中描述了抗CD47抗体的IgG4亚类的突变形式(IgG4PE，具有S228P突变和L235E突变以减少FcγR结合)。这种具有严重降低的FcγR结合和效应子功能的抗CD47抗体不会导致这种血小板耗竭。von Bommel PE等人(Oncoimmunol.7(2018)e386361)和Piccione EC等人(mAbs 7(2015)946-956)描述了一种抗CD47和CD20的单结构域双特异性抗体。Dheilly E.等人(Mol.Thera.25(2017)523-533；也参见WO2014087248)描述了一种抗CD19和CD47的双特异性抗体。

WO2019234576、EP19213002和US62943726(通过引用整体并入)中描述了抗CEACAM5和CD47的双特异性抗体，所述抗体包含SEQ ID NO:5的共同重链(VH-CH1)和SEQ IDNO:10的与CD47相互作用的可变轻链区VL。WO2014087248(通过引用整体并入)中描述了抗CD19和CD47的双特异性抗体，其包含SEQ ID NO:5的共同重链和SEQ ID NO:10的与CD47相互作用的可变轻链区VL。WO2018098384涉及共靶向CD47和CEACAM5的双特异性抗体。EP3623388涉及包含肿瘤靶向臂和用于阻断CD47和SIRPα之间相互作用的低亲和性的融合蛋白的双特异性结合分子。WO2018/057955涉及同时结合CD47和间皮素并包含共同重链的双特异性抗体。WO2019016411涉及靶向CD47和肿瘤抗原的双特异性抗体分子。

在血液恶性肿瘤的治疗方面已经取得了相当大的进展。这与在治疗几种类型的晚期实体肿瘤方面取得的进展截然不同。尽管在局部晚期或特别是转移性实体癌类型的治疗中取得了一定进展，但患有晚期癌症(例如结直肠癌、胰腺癌、肺癌等)的患者的无进展生存期(PFS)和总生存期(OS)仍相当有限，并且通常无法治愈。人们对癌症免疫治疗寄予了很大希望，并且取得了一定的但有限的成功。肿瘤会采取措施保护其细胞免受效应T细胞和其他免疫细胞(例如巨噬细胞)的破坏。过去十年来，基于癌症免疫治疗的策略在对抗这些肿瘤保护措施和重定向T细胞对抗癌细胞方面取得了一些成功。这种策略最突出的例子是某些免疫检查点的抑制剂/激活剂。例如，检查点抑制剂(如PD-1轴拮抗剂)已经显示出可以重新激活效应T细胞来对抗某些实体癌。但不是所有的实体肿瘤类型都对PD-1轴拮抗剂有反应，并且即使在那些有反应的类型中，通常也只有不到50％的患者从例如抗PD-1或PD-L1抗体的治疗中获得相关益处。例如，不到10％的晚期结直肠癌患者有资格使用PD-1轴抑制剂进行治疗(尤其是约4％在其癌症中显示微卫星不稳定性(MSI)的晚期结直肠癌患者得到一定益处)。

嵌合抗原受体(CAR)T细胞过继性T细胞治疗和T细胞双特异性抗体治疗在血液恶性肿瘤中取得了有希望的临床结果。但在各种实体肿瘤中采用过继性T细胞治疗(如CAR T细胞)的临床研究大多显示没有或只有较小的反应率(例如Xu等,Expert Review ofAnticancer Therapy 2017,17,1099-1106；Greenbaum等,Biol Blood Marrow Transplant2020Oct；26(10):1759-1769)。

US20140242079、WO2017055389、US2014024280和Bacac等人(Clin.Cancer Res.,22(13),3286-97(2016))(各自通过引用整体并入)描述了CEAxCD3 T细胞双特异性抗体。在临床前研究中，WO2017055389中的T细胞双特异性抗体显示，与赛必妥单抗(cibisatamab)相比，T细胞激活效力/功效显著增强，其中一种效力更高的CEAxCD3 T细胞双特异性抗体正在临床开发中(RO7172508，在NCT03539484中)。如本文所使用的，“TCB2014”是指如US20140242080中所述的以2+1形式存在的结合CEA和CD3的双特异性抗体，包含US20140402080的SEQ ID NO:270-276和290-296中所示的CDR作为CDR(也参见US20140242079的SEQ ID NO：4-10和24-30的CDR，该专利申请通过引用整体并入)。Tabernero等人在2017年ASCO年会上的发言(J Clin Oncol 35,2017(suppl；abstr 3002))包括晚期/转移性结直肠癌患者的1期临床数据，单一疗法中使用CEAxCD3双特异性抗体RO6958688(赛必妥单抗)，组合使用抗PD-L1抗体阿替丽珠单抗(atezolizumab)。在赛必妥单抗单一疗法以及在与PD-L1抑制剂阿替丽珠单抗组合中已经发现稳定的疾病和部分反应。自2017年以来，尚未公布赛必妥单抗CEAxCD3的新临床数据。2019年3月，已经公布了一项使用Q3W 100mg赛必妥单抗加上PD-L1抑制剂阿替丽珠单抗和用B细胞杀伤性抗CD20抗体奥宾尤妥珠单抗(Obinutuzumab)(以避免形成据报道的赛必妥单抗的抗药物抗体ADA)预处理的试验(ClinicalTrials gov.Identifier NCT038666339)。迄今为止，尚未公布任何数据。最近，一项新的使用Q3W 100mg赛必妥单抗加阿替丽珠单抗加RO712290的临床试验(April2021，NCT04826003)公布在显示微卫星稳定性的晚期结直肠癌患者中进行。RO712290是一种双特异性融合蛋白，与成纤维细胞激活蛋白(FAP)和T细胞共刺激因子4-1BB结合，导致T细胞的额外活化，如果与CEAxCD3组合，则会导致增加的肿瘤细胞的功效/杀伤，但也会增加毒性，例如增加细胞因子释放。MEDI-565(AMG211)是另一种双特异性CEAxCD3抗体，是单链抗体，已在临床开发中，并且已经公布了该抗体的临床试验结果(例如，稳定疾病的诱导，参见例如M.Pishvaian等,Clin Colorectal Cancer.2016DEC；15(4)345-351)。

据报道，当CEAxCD3双特异性抗体与PD-L1抑制抗体结合时，效力增加。这些数据表明，在晚期实体肿瘤中CEAxCD3双特异性抗体可以实现效力。但总的来说，在单一疗法和与PD-L1抑制剂的组合中，临床研究中的大多数患者仍在进展，那些有反应的患者至多展现局部反应和稳定的疾病，但尚未实现完全反应。

一种提高T细胞双特异性抗体(例如CEAxCD3赛必妥单抗)效力的方法是与第二药物组合，通过对共刺激T细胞受体(例如4-1BB或CD28等)的激动作用导致额外的T细胞活化。T细胞双特异性抗体的一个众所周知的副作用是诱导细胞因子释放综合征(CRS)，其可以是更高级别的，例如3级或甚至5级(死亡)。将靶向T细胞共刺激受体的双特异性抗体添加到T细胞双特异性抗体中可以导致细胞因子释放的显著增加，并因此增加更高级别CRS的风险。

获得更好结果的另一种方法可以是，例如，不仅向T细胞双特异性抗体中添加PD-1检查点轴抑制剂，还添加进一步的检查点抑制剂或激动剂。但到目前为止，对于晚期实体癌如结直肠癌等的这种组合方法，尚无有希望的临床数据。晚期实体肿瘤中T细胞的有限可用性无疑是限制T细胞双特异性抗体加PD-1轴抑制剂和/或其他检查点抑制剂或加T细胞共刺激受体双特异性激动剂可达到的效力的重要机制。

T细胞双特异性抗体TAAxCD3(TAA＝肿瘤相关抗原，如CEA和许多其他抗原)在血液恶性肿瘤(如多发性骨髓瘤)、B细胞恶性肿瘤(如弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡型淋巴瘤等)患者中高效。赛必妥单抗CEAxCD3的临床结果表明，TAAxCD3在晚期实体肿瘤中也有效力(见上文)，但远低于在血液恶性肿瘤中达到的效力。添加PD-1轴抑制剂可能会增加效力，但只是有限的。在临床前测试中，添加对共刺激T细胞受体(如CD28或4-1BB)激动的双特异性抗体或融合蛋白增加了效力，但也增加了毒性，例如增加的细胞因子的释放。代替旨在额外激活T细胞，添加使其他免疫细胞(尤其是巨噬细胞)重定向到肿瘤细胞的治疗剂可能会更成功。本发明涉及双特异性抗体CEAxCD47，其重新定向和激活巨噬细胞以在以下疗法中对抗表达CEACAM5的实体肿瘤：1.单一疗法和/或2.作为组合疗法，特别是与CEAxCD3 T细胞双特异性抗体组合，以增加CEAxCD3双特异性抗体的肿瘤细胞杀伤作用，并且，与T细胞共刺激受体的双特异性激动剂组合相比，避免CRS的风险增加。

WO2019234576中描述了抗CEACAM5和CD47的双特异性抗体。WO2019234576中描述的一种示例性双特异性抗体是K2AC22(WO2019234576的SEQ ID NO:65显示了K2AC22的CEACAM5结合部分的轻链，WO2019234576的SEQ ID NO:6显示了K2AC22的共同重链，SEQ IDNO:10显示了K2AC22的CD47结合部分的轻链)。然而，仍然需要改进的抗CEACAM5和CD47的双特异性抗体，例如结合高效性与低毒性、低免疫原性与有利的药代动力学特性的改进的抗体。因此，本发明的目的是提供优于现有技术的抗CEACAM5和CD47的双特异性抗体新的抗CEACAM5和CD47的双特异性抗体。

发明内容

本发明提供了新的双特异性抗体，其具有能够与人CEACAM5结合的第一结合部分和能够与人CD47结合的第二结合部分。根据本发明的双特异性抗体诱导针对肿瘤细胞的高吞噬活性，既针对高量表达CEACAM5的肿瘤细胞，也针对低量表达CECACAM5的肿瘤细胞。在一个实施方案中，由于免疫细胞，特别是巨噬细胞的参与，双特异性抗体主要通过优化的吞噬作用/抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)诱导其抗肿瘤细胞效应。在一个实施方案中，根据本发明的双特异性抗体相对于CEACAM5-CD47抗体K2AC22分别显示与CEACAM3和与CEACAM5结合亲和力的比率降低，KD的比率增加。在一个实施方案中，根据本发明的双特异性抗体抑制SIRPα与肿瘤细胞上表达的CD47的结合，并增加肿瘤细胞的吞噬作用。所公开的特异性结合人CEACAM5和人CD47的双特异性抗体也适合用于肿瘤的治疗，特别是用于实体肿瘤的治疗。

在一个方面，本发明提供了一种双特异性抗体(进一步也命名为“CEAxCD47双特异性抗体”或“根据本发明的双特异性抗体”)，其包含特异性结合人CEACAM5的第一结合部分(进一步也命名为“CEA”)和特异性结合人CD47的第二结合部分(进一步也命名为“CD47”)，其特征在于：

a)所述第一结合部分包含含有SEQ ID NO:1的CDRH1、SEQ ID NO:2的CDRH2和SEQID NO:3的CDRH3的重链可变区作为重链可变区，

b)所述第一结合部分包含含有选自由以下组成的组的CDRL集合的轻链可变区作为轻链可变区：

b1)SEQ ID NO:14的CDRL1、SEQ ID NO:15的CDRL2和SEQ ID NO:16的CDRL3，或

b2)SEQ ID NO:17的CDRL1、SEQ ID NO:18的CDRL2和SEQ ID NO:19的CDRL3，

b3)SEQ ID NO:20的CDRL1、SEQ ID NO:21的CDRL2和SEQ ID NO:22的CDRL3，

b4)SEQ ID NO:23的CDRL1、SEQ ID NO:24的CDRL2和SEQ ID NO:25的CDRL3，和

b5)SEQ ID NO:26的CDRL1、SEQ ID NO:27的CDRL2和SEQ ID NO:28的CDRL3，

c)所述第二结合部分包含含有SEQ ID NO:1的CDRH1、SEQ ID NO:2的CDRH2和SEQID NO:3的CDRH3的重链可变区作为重链可变区，

以及含有SEQ ID NO:7的CDRL1、SEQ ID NO:8的CDRL2和SEQ ID NO:9的CDRL3的轻链可变区作为轻链可变区。

本发明包括该方面的进一步实施方案：

在一个实施方案中，本发明涉及双特异性抗体，其包含特异性结合人CEACAM5的第一结合部分和特异性结合人CD47的第二结合部分，其特征在于：

a)第一和第二结合部分各自包含含有SEQ ID NO:1的CDRH1、SEQ ID NO:2的CDRH2和SEQ ID NO:3的CDRH3的重链可变区作为重链可变区，

b)所述第一结合部分包含含有SEQ ID NO:14的CDRL1、SEQ ID NO:15的CDRL2和SEQ ID NO:16的CDRL3的轻链可变区作为轻链可变区，以及

c)所述第二结合部分包含含有SEQ ID NO:7的CDRL1、SEQ ID NO:8的CDRL2和SEQID NO:9的CDRL3的轻链可变区作为轻链可变区。

b)所述第一结合部分包含含有SEQ ID NO:17的CDRL1、SEQ ID NO:18的CDRL2和SEQ ID NO:19的CDRL3的轻链可变区作为轻链可变区，以及

b)所述第一结合部分包含含有SEQ ID NO:20的CDRL1、SEQ ID NO:21的CDRL2和SEQ ID NO:22的CDRL3的轻链可变区作为轻链可变区，以及

b)所述第一结合部分包含含有SEQ ID NO:23的CDRL1、SEQ ID NO:24的CDRL2和SEQ ID NO:25的CDRL3的轻链可变区作为轻链可变区，以及

b)所述第一结合部分包含含有SEQ ID NO:26的CDRL1、SEQ ID NO:27的CDRL2和SEQ ID NO:28的CDRL3的轻链可变区作为轻链可变区，以及

在一个实施方案中，本发明涉及根据本发明的双特异性抗体，其特征在于：在第一结合部分中包含SEQ ID NO:4的可变重链区作为可变重链区和选自SEQ ID NO:32、SEQ IDNO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36的可变轻链区作为可变轻链区，并且在第二结合部分中包含SEQ ID NO:4的重链可变区作为可变重链区和SEQ ID NO:10的可变轻链区作为可变轻链区。

在一个实施方案中，本发明涉及根据本发明的双特异性抗体，其特征在于：在第一结合部分中包含SEQ ID NO:4的可变重链区作为可变重链区和SEQ ID NO:32的可变轻链区作为可变轻链区，并且在第二结合部分中包含SEQ ID NO:4的可变链区作为可变重链区和具有SEQ ID NO:10的可变轻链区作为可变轻链区。

在一个实施方案中，本发明涉及根据本发明的双特异性抗体，其特征在于：在第一结合部分中包含SEQ ID NO:4的可变重链区作为可变重链区和SEQ ID NO:33的可变轻链区作为可变轻链区，并且在第二结合部分中包含SEQ ID NO:4的可变链区作为可变重链区和具有SEQ ID NO:10的可变轻链区作为可变轻链区。

在一个实施方案中，本发明涉及根据本发明的双特异性抗体，其特征在于：在第一结合部分中包含SEQ ID NO:4的可变重链区作为可变重链区和SEQ ID NO:34的可变轻链区作为可变轻链区，并且在第二结合部分中包含SEQ ID NO:4的可变链区作为可变重链区和具有SEQ ID NO:10的可变轻链区作为可变轻链区。

在一个实施方案中，本发明涉及根据本发明的双特异性抗体，其特征在于：在第一结合部分中包含SEQ ID NO:4的可变重链区作为可变重链区和SEQ ID NO:35的可变轻链区作为可变轻链区，并且在第二结合部分中包含SEQ ID NO:4的可变链区作为可变重链区和具有SEQ ID NO:10的可变轻链区作为可变轻链区。

在一个实施方案中，本发明涉及根据本发明的双特异性抗体，其特征在于：在第一结合部分中包含SEQ ID NO:4的可变重链区作为可变重链区和SEQ ID NO:36的可变轻链区作为可变轻链区，并且在第二结合部分中包含SEQ ID NO:4的可变链区作为可变重链区和具有SEQ ID NO:10的可变轻链区作为可变轻链区。

在一个实施方案中，本发明涉及根据本发明的双特异性抗体，其特征在于：在第一结合部分中包含SEQ ID NO:5的重链和选自SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40和SEQ ID NO:41的轻链，并且在第二结合部分中包含SEQ ID NO:5的重链和具有SEQ ID NO:11的轻链。

在一个实施方案中，本发明涉及根据本发明的双特异性抗体，其特征在于：在第一结合部分中包含SEQ ID NO:5的重链和SEQ ID NO:37的轻链，并且在第二结合部分中包含SEQ ID NO:5的重链和具有SEQ ID NO:11的轻链。

在一个实施方案中，本发明涉及根据本发明的双特异性抗体，其特征在于：在第一结合部分中包含SEQ ID NO:5的重链和SEQ ID NO:38的轻链，并且在第二结合部分中包含SEQ ID NO:5的重链和具有SEQ ID NO:11的轻链。

在一个实施方案中，本发明涉及根据本发明的双特异性抗体，其特征在于：在第一结合部分中包含SEQ ID NO:5的重链和SEQ ID NO:39的轻链，并且在第二结合部分中包含SEQ ID NO:5的重链和具有SEQ ID NO:11的轻链。

在一个实施方案中，本发明涉及根据本发明的双特异性抗体，其特征在于：在第一结合部分中包含SEQ ID NO:5的重链和SEQ ID NO:40的轻链，并且在第二结合部分中包含SEQ ID NO:5的重链和具有SEQ ID NO:11的轻链。

在一个实施方案中，本发明涉及根据本发明的双特异性抗体，其特征在于：在第一结合部分中包含SEQ ID NO:5的重链和SEQ ID NO:41的轻链，并且在第二结合部分中包含SEQ ID NO:5的重链和具有SEQ ID NO:11的轻链。

在一个实施方案中，本发明涉及双特异性抗体，其包含与K2AC82、K2AC84、K2AC91、K2AC100或K2AC117双特异性抗体中相同的CEACAM5结合部分。在该实施方案中，所述双特异性抗体包含：

SEQ ID NO:14-16的轻链CDR、SEQ ID NO:32的VL、和/或SEQ ID NO:30的VLCL(K2AC82)，

SEQ ID NO:17-19的CDR、SEQ ID NO:33的VL、和/或SEQ ID NO:38的VLCL(K2AC84)，

SEQ ID NO:20-22的CDR、SEQ ID NO:34的VL、和/或SEQ ID NO:39的VLCL(K2AC91)，

SEQ ID NO:23-25的CDR、SEQ ID NO:35的VL、和/或SEQ ID NO:40的VLCL(K2AC100)，

SEQ ID NO:26-28的CDR、SEQ ID NO:36的VL、和/或SEQ ID NO:41的VLCL(K2AC117)，或

包含如上所述的所述抗体的CDR区和/或轻链和重链的衍生物。

在一个实施方案中，恒定和可变框架区序列是人类的。

在一个实施方案中，根据本发明的双特异性抗体的特征在于第一和第二结合部分中的每一个都包括免疫球蛋白重链和免疫球蛋白轻链。在一个实施方案中，根据本发明的双特异性抗体是全长抗体。在一个实施方案中，根据本发明的双特异性抗体的特征在于是人IgG1型。

在一个实施方案中，根据本发明的双特异性抗体的特征在于包含对CEA特异的第一结合部分和对CD47特异的第二结合部分，所述第一结合部分包含λ轻链可变结构域(VL)和λ轻链恒定结构域(CL)，所述第二结合部分包含κ轻链可变结构域(VK)和κ轻链恒定结构域(CK)(κλ双特异性抗体，κλ抗体)。在一个这样的实施方案中，第二结合部分包含SEQ IDNO:11的轻链作为轻链LC(CD47 VKCK)。SEQ ID NO:11的κ轻链包含SEQ ID NO:10的可变轻链结构域作为可变轻链结构域(Mab CD47 VK)，以及SEQ ID NO:13的恒定轻链结构域作为恒定轻链结构域(CD47 CK)。

在一个实施方案中，根据本发明的双特异性抗体是全人双特异性IgG(特别是IgG1)形式，此外是κλ双特异性抗体。

在一个实施方案中，根据本发明的双特异性抗体的特征在于是κλ双特异性抗体并且包含共同重链(cHC)。在一个实施方案中，共同重链包含SEQ ID NO:4的可变重链结构域作为可变重链结构域(VH)。在一个实施方案中，根据本发明的双特异性抗体的特征在于包含SEQ ID NO:5的共同重链(VH-CH1)。在一个实施方案中，根据本发明的双特异性抗体的特征在于包含SEQ ID NO:6的共同重链(VH-CH1-CH2-CH3)。

在一个实施方案中，根据本发明的双特异性抗体的特征在于对于第一结合部分是单价的，并且对于第二结合部分是单价的。

在一个实施方案中，根据本发明的双特异性抗体的特征在于与抗CEACAM5抗体SM3E竞争与CEACAM5的结合，所述抗体SM3E包含序列SEQ ID NO:43和44的VK和VH作为VK和VH结构域。在一个实施方案中，根据本发明的双特异性抗体的特征在于不与赛必妥单抗和/或MEDI-565(AMG211；(MD Oberst等，mAbs 6(2014)1571—1584))竞争结合CEACAM5。在一个实施方案中，根据本发明的双特异性CEAxCD47抗体可以与CEAxCD3双特异性抗体赛必妥单抗和/或MEDI-565同时施用。

在另一个实施方案中，根据本发明的双特异性抗体的特征在于被糖工程化以具有带有修饰寡糖的Fc区。在另一个实施方案中，根据本发明的双特异性抗体的特征在于包含Fc区，所述Fc区已被糖工程化以与未被糖工程化的相同的双特性抗体相比具有减少数量的岩藻糖残基。

在一个实施方案中，根据本发明的双特异性抗体在寡糖链中包含减少量的岩藻糖。

在一个实施方案中，根据本发明的双特异性抗体的特征在于Fc区中50％至100％的N-连接寡糖是非岩藻糖基化的。

在一个实施方案中，根据本发明的双特异性抗体的特征在于，如果不应用岩藻糖基化方法，则与相应抗体的岩藻糖含量相比，根据本发明的双特异性抗体的寡糖链中的岩藻糖量减少80％至100％。

在一个实施方案中，双特异性抗体的特征在于Fc区中80％至100％的N-连接寡糖是二等分型和非岩藻糖基化的。WO2019234576、US62/943,726和EP19213002中描述了通常与CEACAM5和CD47结合的非岩藻糖基化双特异性抗体及其产生和纯化。

在一个实施方案中，根据本发明的双特异性抗体的特征在于在Fc区中包含一个、两个或三个氨基酸置换，所述氨基酸置换选自单置换S239D、I332E、G236A，双置换I332E和G236A、S239D和I332E、S239D和G236B，以及三置换S329D和I332E和G236A；和已被糖工程化的Fc区，以与相同但非糖工程化的双特异性抗体相比具有减少的岩藻糖残基数量。

在一个实施方案中，根据本发明的双特异性抗体的特征在于与重组CEACAM3和重组CEACAM5结合的KD值的比率为100或更大(实施例3，表2)。

在一个实施方案中，根据本发明的双特异性抗体的特征在于与重组CEACAM3和重组CEACAM5结合的KD值的比率为100至200。

在一个实施方案中，本发明的双特异性抗体具有与CEACAM5和CEACAM3结合的相对解偶联(差异结合)。尽管与双特异性CEAxCD47抗体K2AC22相比，与全长重组人CEACAM5蛋白的结合增加，但与全长重组人CEACAM3的结合没有按比例增加。与全长CEACAM3结合的KD和与CEACAM5结合的KD的商/比率显示从83(K2AC22)增加到137(K2AC84)增加到146(K2AC100)。这相当于差异结合65％-76％的增加(实施例3，表2)。

在一个实施方案中，根据本发明的双特异性抗体的特征在于浓度依赖性吞噬作用(人巨噬细胞对表达CEACAM5的肿瘤细胞系的ADCP)。根据本发明，ADCP通过成像测量为吞噬指数(EC50和/或最大值)，通常具有1:3的E:T比率(人巨噬细胞：靶细胞(肿瘤细胞)；EC50值和吞噬指数最大值(Emax)参见例如图2和表6-9)。图2中的结果是在E:T为1:3的情况下获得的。实施例7中描述了测定的细节；成像测定基于CellInsight CX5。如果没有另外说明，则通过这种成像方法测量吞噬指数值。

在一个实施方案中，根据本发明的双特异性抗体的特征在于与K2AC22的吞噬指数相比，LoVo肿瘤细胞的吞噬指数最大值(Emax)增加至少8％。在一个实施方案中，LoVo肿瘤细胞的增加为8％至20％。在一个实施方案中，根据本发明的双特异性抗体的特征在于与K2AC22的吞噬指数相比，Ls174T肿瘤细胞的最大吞噬指数增加至少8％。在一个实施方案中，Ls174T肿瘤细胞的增加为8％至25％(实施例7，表5)。LoVo和LS174T是具有相当低的CEACAM5表达的肿瘤细胞(参见实施例5的表3)。

在一个实施方案中，根据本发明的双特异性抗体抑制人CD47和人SIRPα之间的相互作用。在一个实施方案中，本发明的双特异性抗体以比在相同实验条件下对K2AC22测量的IC50低10倍或更多的IC50抑制MKN-45细胞上CD47和SIRPα之间的相互作用。在一个实施方案中，所述因子为10至30。在一个实施方案中，根据本发明的双特异性抗体以0.1nM或更低的IC50抑制MKN-45细胞上CD47和SIRPα之间的相互作用。在一个实施方案中，根据本发明的双特异性抗体以0.1nM至0.04nM的IC50抑制MKN-45细胞上CD47和SIRPα之间的相互作用(参见实施例10和表12)。

在一个实施方案中，根据本发明的双特异性抗体的特征在于具有以下两种或更多种性质：具有与重组CEACAM3和重组CEACAM5结合的KD值之比为100或更大，具有与CEACAM5和CEACAM3结合的相对解偶联，具有浓度依赖性ADCP，与K2AC22的吞噬指数相比，LoVo肿瘤细胞的吞噬指数最大值(Emax)增加了至少8％，以及具有以比K2AC22低10倍以上的IC50抑制人CD47和人SIRPα之间的相互作用的能力。

双特异性抗体K2AC22是与人CEACAM5和人CD47结合的双特异性抗体，并在WO2019234576中描述。K2AC22包含SEQ ID NO:6的共同重链，在CEACAM5结合部分中包含SEQID NO:42的轻链，并且在CD47结合部分中包含SEQ ID NO:11的轻链；K2AC22的CDR如SEQ IDNO:1-3、7-9和29-31所示(表1)。

在一个实施方案中，根据本发明的双特异性抗体的特征在于以100nM至600nM的结合亲和力(KD)结合重组人CD47，并且在一个实施方案中具有100nM至500nM的结合亲和力(通过生物层干涉测量)。

在一个实施方案中，根据本发明的双特异性抗体的特征在于以2nM至10nM的KD结合重组人CEACAM5(实施例3，表2)。在一个实施方案中，与现有技术的双特异性抗体K2AC22的情况相比，本发明的双特性抗体具有高10倍至50倍的结合亲和力(较低的KD)，并且在一个具体实施方案中具有高20倍至50倍的结合亲和力(实施例3，表2)。

在一个实施方案中，根据本发明的双特异性抗体可用于与CEAxCD3 T细胞双特异性抗体(如赛必妥单抗)组合治疗。

在一个实施方案中，根据本发明的双特异性抗体的特征在于特异性结合CEACAM5，但不与TCB2014和赛必妥单抗竞争结合肿瘤细胞(例如MKN-45和LS174T)上的CEACAM5(实施例8)。

在一个实，施方案中，根据本发明的双特异性抗体的特征在于，结合人CEACAM5和CD3ε(同上)的双特性抗体TCB2014，在300nM的浓度下，不使根据本发明双特异性抗体对MKN-45细胞或在另一个实施方案中对LS174T细胞的结合曲线的EC50偏移超过3倍，在一个实施方案中趋向更高浓度(实施例8和图5)。在这种情况下，根据本发明的双特异性抗体和TCB2014被定义为“非竞争性”，并且被认为能够同时与CEA结合，而不会显著干扰与所述CEA的结合。在这种情况下，根据本发明的双特异性抗体和TCB2014被定义为“非竞争性”，并且被认为能够同时与CEA结合而不显著干扰它们与所述CEA的结合，并且因此可以在不受干扰的情况下发展其对吞噬作用(CEAxCD47)的作用以及在不受干扰的情况下对T细胞活化(TCB2014和赛必妥单抗)的作用，即使治疗水平的两种药物同时存在于血液和/或肿瘤组织中。这促进了TCB2014或赛必妥单抗与本发明的CEAxCD47双特异性抗体的组合治疗。

在一个实施方案中，在含有例如LoVo或LS174T肿瘤细胞以及来源于同一志愿者人类供体的人巨噬细胞和T细胞的测定中，本发明的CEAxCD47双特异性抗体与CEAxCD3双特异性抗体TCB2014组合显示对肿瘤细胞的至少加成性或甚至协同性％杀伤。

在一个实施方案中，在含有例如LoVo或LS174T肿瘤细胞以及来源于同一志愿者人类供体的人巨噬细胞和T细胞的测定中，本发明的CEAxCD47双特异性抗体与CEAxCD3双特异性抗体TCB2014组合显示对肿瘤细胞的至少加成性或甚至协同性杀伤。

本发明进一步提供了包含一种或多种编码根据本发明的双特异性抗体的多核苷酸的表达载体。

本发明进一步提供了包含根据本发明的表达载体的宿主细胞。

本发明进一步提供了产生根据本发明的双特异性抗体的方法，其特征在于：所述方法包括：

a)在允许产生本发明所述抗体的条件下培养包含编码所述双特异性抗体的表达载体的宿主细胞，以及

b)分离所述抗体，其中所述抗体能够特异性结合CEACAM5和CD47。

编码本发明抗体的第二多肽可以是编码所有各自的两个不同轻链和共同重链的一种多肽，或者是单独编码各自的轻链和重链的单独多肽。此外，表达载体可以是一个、两个或三个分别表达两个不同轻链和共同重链的载体。

本发明进一步提供了诱导肿瘤细胞的细胞裂解的方法，其包括使肿瘤细胞与根据本发明的双特异性抗体接触。所述肿瘤细胞是人肿瘤细胞，优选在患者体内。在诱导肿瘤细胞的细胞裂解的方法的一个实施方案中，所述肿瘤细胞是结直肠癌细胞、NSCLC(非小细胞肺癌)细胞、胃癌细胞、胰腺癌细胞、乳腺癌细胞或表达CEACAM5的另一肿瘤细胞。

本发明进一步提供了治疗患有表达CEACAM5的癌症的受试者的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的根据本发明的双特异性抗体。

本发明进一步提供了增加患有表达CEACAM5的癌症的受试者的生存时间的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的根据本发明的双特异性抗体。本发明的一个进一步的实施方案是这样一种根据本发明的方法，其特征在于：所述癌症是结直肠癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、胃癌、胰腺癌或乳腺癌。

本发明进一步提供了治疗患有表达CEACAM5的癌症的受试者的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的根据本发明的双特异性抗体。本发明的一个进一步的实施方案是这样一种根据本发明的方法，其特征在于：将根据本发明的双特异性抗体与化学疗法或放射疗法组合施用于人类受试者。

本发明进一步提供了根据本发明的双特异性抗体，用于制备用于治疗患有表达CEACAM5的癌症的受试者的药物。本发明的一个进一步的实施方案是根据本发明的双特异性抗体，用于根据本发明的药物的此类制备，其特征在于：所述癌症选自结直肠癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、胃癌、胰腺癌和乳腺癌。

本发明进一步提供了根据本发明的双特异性抗体，用于与第二双特异性抗体同时、单独或顺序组合治疗患有表达CEACAM5的癌症的受试者，所述第二双特异性抗体包含与人CEACAM5特异性结合的第三结合部分和与人CD3ε特异性结合的第四结合部分。本发明的一个进一步的实施方案是根据本发明的双特异性抗体，用于与TCB2014或赛必妥单抗同时、单独或顺序组合治疗患有表达CEACAM5的癌症的受试者。

本发明的一个进一步的实施方案是根据本发明的双特异性抗体，用于与所述第二双特异性抗体同时、单独或顺序组合治疗患有表达CEACAM5的癌症的受试者。

本发明的一个进一步的实施方案是根据本发明使用的根据本发明的双特异性抗体，其特征在于：以6至15天的间隔交替向所述受试者施用根据本发明的双特性抗体和第二双特异性抗体。

本发明的一个进一步的实施方案是根据本发明使用的根据本发明的双特异性抗体，其特征在于：以6至15天的间隔同时向所述受试者施用根据本发明的双特性抗体和第二双特异性抗体。

本发明的一个进一步的实施方案是根据本发明的第一双特异性抗体，其包含特异性结合人CEACAM5的第一结合部分和特异性结合人CD47的第二结合部分，根据本发明使用所述抗体，其特征在于：所述癌症是结直肠癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、胃癌、胰腺癌和乳腺癌。

本发明的一个进一步的实施方案是用于治疗被诊断患有肿瘤(癌症)(特别是实体肿瘤，特别是表达CEACAM5的实体癌，特别是结直肠癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、胃癌、胰腺癌和乳腺癌)的人类患者的方法，所述方法包括向人类患者施用有效量的根据本发明的双特异性抗体和如上所述的抗CEA和CD3的第二双特性抗体(在一个实施方案中为TCB2014，在一个实施方案中为赛必妥单抗)，所述方法之后包括：

向患者施用0.1至10mg/kg的剂量，在一个进一步的实施方案中为0.5至10mg/kg，在一个进一步的实施例中为1至2mg/kg的所述第二抗CEAxCD3抗体，例如每周一次，持续4至12周，或每两周一次(q2w)，持续4至12周，并且在这4至12周后并且在等待所述抗CEAxCD3抗体的额外2或3或4个消除半衰期后向患者施用0.1至20mg/kg剂量的根据本发明的抗体，

向患者q1w、q2w、q3w或任选地q4w施用所述根据本发明的抗体，持续例如12周以上，等待2或3或4个根据本发明的所述抗体的消除半衰期，然后任选地重复所述CEA x CD3双特异性抗体施用的周期，随后施用根据本发明的双特异性抗体，并任选地再次重复该周期等。

由于所述CEA x CD3双特异性抗体和根据本发明的CEA x CD47双特异性抗体不是竞争性的，因此也可以以患者并行经历治疗有效的血浆和组织浓度的两种双特异性抗体的方式(“同时方式”)施用这两种双特异性抗体，例如通过在大约相同的时间向患者施用0.1至10mg/kg的剂量，在一个进一步的实施方案中为0.5至10mg/kg，在一个进一步的实施方案中为1至2mg/kg的CEA x CD3双特异性抗体和3至30mg/kg的剂量，以及在一个进一步的实施方案中为1至10mg/kg的根据本发明的CEA x CD47双特异性抗体，随后以q1w或q2w或q3w或任选地q4w的频率进行一次或多次组合施用。术语“q1w”是指每周施用一次；“q2w”表示每两周施用一次，等等。

出于安全原因，在一个实施方案中可能需要用所述第二抗体CEAxCD3在不添加本发明的bsAb的情况下开始治疗，并且仅在CEAxCD3常有的细胞因子释放综合征(CRS)结束之后(通常在2或3剂量的TAAxCD3抗体之后)才开始同时施用两种bsAb。

本发明进一步提供了药物组合物，其包含根据本发明的抗体和药学上可接受的赋形剂或载剂。

本发明进一步提供了药物组合物，其包含用作药物的根据本发明的抗体。在一个这样的实施方案中，本发明提供了包含根据本发明的抗体的药物组合物，其用作治疗实体肿瘤病症的药物。在一个实施方案中，所述药物组合物包含根据本发明的抗体，用作治疗结直肠癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、胃癌、胰腺癌或乳腺癌的药物。

本发明进一步提供了包含根据本发明的双特异性抗体的组合物，用于与如上定义的TCB2014或赛必妥单抗同时、单独或顺序组合治疗患有表达CEACAM5的癌症的受试者，其中浓度为300nM的所述第二双特异性抗体不会使本发明的双特异性抗体对MKN-45和/或LS174T细胞的结合曲线的EC50偏移超过3倍，在一个实施方案中趋向更高浓度。本发明的一个进一步的实施方案是根据本发明的这种组合物，其特征在于：所述癌症是结直肠癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、胃癌、胰腺癌或乳腺癌。

本发明进一步提供了根据本发明的抗体在制备药物组合物中的用途。

本发明进一步提供了根据本发明的抗体和药学上可接受的赋形剂或载剂在制备药物组合物中的用途。

本发明进一步提供了根据本发明的抗体在制备治疗实体肿瘤病症的药物中的用途。本发明的一个进一步的实施方案是根据本发明的抗体在治疗结直肠癌症、非小细胞肺癌(NSCLC)、胃癌、胰腺癌或乳腺癌中的这种用途。

本发明的另一个方面提供了诱导肿瘤细胞的细胞裂解的方法，其包括使肿瘤细胞与上述实施方案中任一个双特异性抗体接触。在一些实施方案中，所述肿瘤细胞是结直肠癌细胞、NSCLC(非小细胞肺癌)、胃癌细胞、胰腺癌细胞或乳腺癌细胞。在一个实施方案中，通过根据本发明的双特异性抗体的抗体依赖性细胞吞噬作用和/或抗体依赖性的细胞介导的细胞毒性来诱导细胞裂解。

本发明的另一个方面提供了治疗患有异常表达CEACAM5的癌症的受试者的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的任何上述实施方案的双特异性抗体。

本发明的另一个方面提供了治疗患有异常表达CEACAM5的癌症的受试者的方法，所述方法包括向受试者组合施用治疗有效量的任何上述实施方案的双特异性抗体和结合人CEA和人CD3的双特性抗体。由于CEAxCD3双特异性抗体和根据本发明的CEAxCD47双特异性抗体不是竞争性的或仅最低限度地竞争，它们不仅可以顺序给予，而且可以并行(同时)给予，这很可能是一个优点，因为通过CEAxCD3双特异性抗体接合的T细胞以及同时通过根据本发明的CEAxCD47双特异性抗体接合的巨噬细胞对肿瘤细胞的杀伤可以是加成的或甚至是协同的，这意味着如果两种药物并行给予，则效力会增加。

本发明的另一方面提供了在患有异常表达CEACAM5的癌症的受试者中增加无进展生存和/或总生存时间的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的任何上述实施方案的双特异性抗体。在一个实施方案中，所述癌症是结直肠癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、胃癌、胰腺癌或乳腺癌或表达CEACAM5的另一种癌症。

在这些方法的某些实施方案中，根据本发明的双特异性抗体与化学疗法或放射疗法组合施用。在一个实施方案中，所述受试者是患有结直肠癌或肺癌或胃癌或胰腺癌或乳腺癌或表达CEACAM5的另一种癌症的患者。

本发明的另一方面提供了治疗患有异常表达CEACAM5的癌症的受试者的方法，所述方法包括向受试者组合施用治疗有效量的任何上述实施方案的双特异性抗体和抗人CEA和人CD3ε的双特性抗体。

本发明的另一方面提供了在患有异常表达CEACAM5的癌症的受试者中增加无进展生存和/或总生存时间的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的任何上述实施方案的双特异性抗体。在一个实施方案中，所述癌症是结直肠癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、胃癌、胰腺癌或乳腺癌。

本发明的另一个实施方案提供了根据本发明的双特异性抗体用于任何上述治疗方法的用途。在一个实施方案中，所述癌症选自结直肠癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、胃癌、胰腺癌和乳腺癌。

附图说明

图1A-1F.与现有技术的双特异性CEAxCD47抗体K2AC22相比，根据本发明的五种CD47xCEACAM5双特异性抗体(K2AC82、K2AC84、K2AC91、K2AC100和K2AC117)的浓度依赖性结合。这些图还显示了相应的抗CD47单价抗体、无关hIgG1对照(hIgG1，在CD47单价的线下方的线)和二价抗CD47单克隆抗体(hB6H12，虚线)在六种表达CEACAM5的癌细胞系上的结合：(图1A)SK-CO-1细胞、(图1B)MKN-45细胞、(图1C)HPAF-II细胞、(图1D)SNU-C1细胞、(图1E)Ls174T细胞和(图1F)LoVo细胞上。根据本发明的双特异性抗体的EC50低于K2AC22的EC50，并且根据本发明的双特异性抗体的最大结合(MFI)高于K2AC22的最大结合。

图2A-2F.与现有技术的CEACAM5 x CD47双特异性抗体K2AC22相比，根据本发明的两种CEACAM5xCD47双特异性抗体(K2AC84和K2AC100)诱导的LoVo癌细胞的浓度依赖性吞噬作用。这些图还显示了由相应的抗CD47单价抗体和同种型对照hIgG1诱导的吞噬作用。图2A-2F显示了用来源于六种不同人类供体的PBMC(外周血单核细胞)的巨噬细胞获得的数据((图2A)供体862；(图2B)供体872；(图2C)供体873；(图2D)供体863；(图2E)供体874和(图2F)供体866)。对于大多数供体，由根据本发明的两种抗体诱导的吞噬作用优于K2AC22。

图3A-3B.与现有技术的非岩藻糖基化CEACAM5xCD47双特异性抗体K2AC22相比，由四到五种根据本发明的非岩藻糖基化的CEACA5xCD47双特异性抗体(K2AC82非岩藻糖基化的(afuco)、K2AC84非岩藻糖基化的、K2AC91非岩藻糖基化的、K2AC100非岩藻糖基化的和K2AC177非岩藻糖基化的)诱导的表达CEACAM5的癌细胞的浓度依赖性吞噬作用。这些图还显示了由相应的抗CD47单价抗体和hIgG1同种型对照(hIgG1)诱导的吞噬作用。图3A显示了用MKN-45作为靶细胞和用来源于两个人类供体(供体(D)830；供体(D)831)的PBMC(外周血单核细胞)的巨噬细胞获得的数据，图3B显示了用SNU-C1作为靶细胞和用来源于两个人类供体(供体(D)831；供体(D)833)的巨噬细胞获得的数据。对于供体，由根据本发明的抗体诱导的吞噬作用优于K2AC22。

图4.与现有技术的CEACAM5xCD47双特异性抗体K2AC22相比，根据本发明的五种CEACAM5xCD47双特异性抗体(K2AC82、K2AC84、K2AC91、K2AC100和K2AC177)的CD47/SIRPα阻断活性。该图还显示了相应的抗CD47单价抗体对CD47/SIRPα的阻断活性。添加两个阴性对照进行比较：添加hIgG1同种型对照(hIgG1)或不添加任何抗体。添加二价单克隆抗体(mAb)hB6H12作为阳性对照。本发明的所有五种CEACAM5xCD47双特异性抗体(K2AC82、K2AC84、K2AC91、K2AC100和K2AC177)与现有技术的CEACAM5xCD47双特异性抗体K2AC22相比显示出改进的阻断活性。

图5.在抗CEACAM5单克隆抗体TCB2014和TCB2017的存在下，CD47xCEACAM5双特异性抗体K2AC100在表达CEACAM5的细胞MKN-45的细胞表面的浓度依赖性结合。用荧光染料直接标记K2AC100，以追踪其与单独的MKN-45细胞(深色线、深色圆圈)、在300nM的TCB2014(深色线、深色三角形)或30nM的TCB2017(深色线、黑色菱形)存在下的结合。使用阴性对照(Ctrl)(在TCB2014或TCB2017存在下的IgG1)

具体实施方式

除非另有如下定义，否则本文中使用的术语与本领域中通常使用的术语相同。

根据本发明的抗体具有以下性质中的一种或多种有益性质：

-与CEACAM3结合和与CEACAM5结合的KD值比率，

-低CEA表达肿瘤细胞中吞噬指数最大值(Emax)，和/或

-抑制(低IC50)SIRPα与肿瘤细胞表面CD47的结合。

如实施例3和表2中所示，根据本发明的抗体出人意料地显示出与CEACAM3结合相对与CEACAM5结合的有益比率。例如，与K2AC22的结合亲和力(KD)相比，K2AC100对CEACAM5的结合亲和力高25倍(较低的KD)，但令人惊讶的是，对CEACAM3的结合亲和力仅高14倍(较低的KD)。类似地，与K2AC22的结合亲和力(KD)相比，K2AC84显示出对CEACAM5的结合亲和力(KD)高46倍，但令人惊讶的是，对CEACAM3的结合亲和力(KD)仅高28倍。因此，对于K2AC22，与CEACAM3结合的KD值和与CEACAM5结合的KD值的比率为83，但对于K2AC100该比率为146，对于K2AC84该比率为137。

尽管几个家族成员(如CEACAM5或CEACAM6)由上皮细胞表达，但其他家族成员(例如CEACAM3(CGM1或CD66d；UniProtKB-P40198))仅在人粒细胞上表达，粒细胞是一种细胞类型，例如参与细菌感染的清除(Kuespert K等，Curr Opin cell Biol.2006；Pils S等，IntJ Med Microbiol.2008)。尽管CEACAM5和CEACAM3之间具有高序列同源性，但与CEACAM家族的其他成员相反，CEACAM3不支持细胞-细胞黏附，而是介导对一组限制性革兰氏阴性细菌的调理素非依赖性识别和消除，所述细菌包括淋病奈瑟氏菌(Neisseria gonorrhoeae)、流感嗜血杆菌(Hemophilus influenzae)和卡他莫拉菌(Moraxella catarrhalis)(Kuroki等,J.Biol.Chem.1991；Pils S等,Int J Med Microbiol.2008)。CEACAM3被讨论为先天免疫系统的吞噬受体(Schmitter等，J Exp Med.2004)。根据本发明人的知识，抗CEACAM5和CD47的双特异性抗体，如果也与CEACAM3显著结合，将对中性粒细胞产生不利影响，并可减少中性粒细胞的数量，即通过增加吞噬作用诱导中性粒细胞减少。这可能会增加发展细菌感染的风险，如果没有立即的医疗干预，将危及生命。高结合亲和力的特征在于低KD。靶向CEA的双特异性抗体在CEACAM5和CEACAM3之间的分布由与这两个CEACAM家族成员的结合亲和力的比率决定。结合CEACAM3的KD与结合CEACAM5的KD的高比率意味着与结合CEACAM5相比，双特异性抗体与CEACAM3结合较少，这将是有益的。

在一个实施方案中，与各自细胞系中K2AC22的吞噬指数相比，根据本发明的抗体在低CEA表达的肿瘤细胞(如LoVo细胞系)中出人意料地显示出有益的吞噬指数最大值(Emax)。根据表5，与现有技术的双特异性抗体K2AC22相比，本发明的双特性抗体显示出LoVo细胞(细胞表面上4000个CEACAM5)吞噬指数曲线的最大值高8.5％至17％。对于LS174T细胞(细胞表面上26000个CEACAM5)，与K2AC22相比，本发明抗体的吞噬指数最大值高8.7％至20.6％(表5)。在较高表达CEACAM5的细胞(如SNU-C1或MKN-45)中，Emax的增加较低。

因此，较高百分比的患者可以用根据本发明的双特异性抗体成功治疗。

如实施例5和11中所公开的，恶性细胞中的CEA表达可以在RNA表达或细胞表面CEA分子计数方面显著变化。用于研究本发明双特异性抗体吞噬活性的CEA表达癌细胞系在细胞表面表达平均108000个CEA靶标(实施例5，表3)。已通过实施例11中所述的方法对来自癌症患者新鲜肿瘤组织(结直肠和肺)的类器官进行了研究。已发现这些初级类器官的CEACAM5的平均表达为每个细胞28000个CEACAM5靶标，即比细胞系上的平均表达低约4倍，如表3所示。双特异性抗体对具有较低CEACAM5表达的恶性细胞的吞噬作用得到改善，因此可能有利于在肿瘤治疗中使用。鉴于例如在肺腺癌、结直肠癌和其他表达CEACAM5的肿瘤中异源和/或相当低的表达，因此可以用本发明的CEAxCD47双特异性抗体成功治疗这些患者。

如实施例10和图4所示，与抗体K2AC22相比，根据本发明的抗体对SIRPα与肿瘤细胞表面CD47的结合显示出令人惊讶的有益抑制(低IC50)。巨噬细胞上的SIRPα与肿瘤细胞上的CD47的相互作用抑制了肿瘤细胞的吞噬作用，这意味着对这种相互作用的有效抑制增加了吞噬作用。

如本文所用，术语“Emax”描述了化合物的最大活性。例如，在细胞杀伤测定中，Emax描述了巨噬细胞在给定时间段内消除/杀伤癌细胞(例如，用钙黄绿素AM标记，参见实施例7)。这被认为具有很高的临床重要性，因为肿瘤浸润巨噬细胞的总数是有限的：例如，如果每个时间间隔消除的肿瘤细胞数量是两倍，这等于每次消除相同数量的肿瘤细胞需要存在一半数量的巨噬细胞即可。

如本文所用，术语“EC50”描述了达到最大活性的一半(Emax/2)时的化合物浓度。低EC50是有用的，以需要输注较低量的化合物，并因此实现例如与较高EC50相比更低的生产成本和/或潜在的还有更低的副作用率。因此，Emax和EC50描述了化合物活性的不同方面。对于两种Emax相当的化合物，EC50变得很重要，因为在较低的浓度下可以获得相同的治疗效果，并且因此给药量较少，副作用发生率可能较低。

如本文所用，术语“抗原结合部分”和“结合部分”在其最广泛的意义上是指特异性结合抗原决定簇(如CEA、CD47和CD3)的抗体部分。

更具体地，如本文所用，结合膜结合的人癌胚抗原(CEA，与CEACAM5相同)或CD47的结合部分特异性结合CEA或CD47，更具体地结合细胞表面或膜结合的CEA或CD47。因此，每个结合部分与CEA结合，或与CD47结合。“特异性结合、特异性针对、结合至”是指结合对抗原具有选择性，可以区别于不需要的或非特异性的相互作用。在一些实施方案中，抗靶标抗体与无关的非靶标蛋白的结合程度比抗体与所述靶标的结合程度低约10倍，优选地低>100倍，例如通过生物层干涉法(例如)、表面等离子体共振(SPR)(例如/>)、酶联免疫吸附法(ELISA)或流式细胞术(FACS)测量。靶标是本文讨论的蛋白质，例如CEA、CD47和CD3ε。

在一个实施方案中，特异性结合CEA和CD47、结合CEA和CD47以及对CEA和CD47特异性的短语是指抗体，例如双特异性抗体，其能够以足够的亲和力结合靶标CEA和CD47，使得该抗体可用作靶向表达CEACAM5和CD47的肿瘤细胞的治疗剂。提及以特定EC50值与MKN-45、SNU-C1、LS174T、SK-CO-1、HPAF-II和/或LoVo细胞结合是指通过流式细胞术测量的EC50值(参见实施例6)。

如本文所用，术语“抗体”是指包含两条重链和两条轻链的抗体。在一个实施方案中，抗体是全长抗体。如本文所用，术语“抗体重链”是指抗体重链，由全长抗体定义的可变区和恒定区组成。如本文所用，术语“抗体轻链”是指抗体轻链，由全长抗体定义的可变区和恒定区组成。

术语“全长抗体”表示由两个“全长抗体重链”和两个“全长抗体轻链”组成的抗体。“全长抗体重链”是按N端至C端方向由抗体重链可变结构域(VH)、抗体恒定重链结构域1(CH1)、抗体铰链区(HR)、抗体重链恒定结构域2(CH2)和抗体重链恒定结构域3(CH3)组成的多肽，缩写为VH-CH1-HR-CH2-CH3。“全长抗体轻链”是按N端至C端方向由抗体轻链可变结构域(VL)和抗体轻链恒定结构域(CL)组成的多肽，缩写为VL-CL。抗体轻链恒定结构域(CL)可以是κ(kappa)或λ(lambda)。两个全长抗体结构域通过CL结构域和CH1结构域之间以及全长抗体重链的铰链区之间的多肽间二硫键连接在一起。典型的全长抗体的例子是天然抗体，如IgG(例如IgG1和IgG2)、IgM、IgA、IgD和IgE。根据本发明的全长抗体在一个实施方案中是人IgG1型，在一个进一步的实施方案中包含如下定义的Fc部分中的一个或多个氨基酸置换和/或在连接到Asn297的多糖链上被糖工程化。根据本发明的全长抗体包含两个结合部分，每个结合部分由一对VH和VL形成，一个结合CEA，另一个结合CD47。

如本文和上文所述，“互补性决定区”(CDR)描述了在重链多肽和轻链多肽的可变区内发现的非连续抗原结合位点(也称为抗原结合区)。CDR也被称为“高变区”(HVR)，并且在提及形成抗原结合区的可变区的部分时，该术语在本文中与术语“CDR”互换使用。Kabat等,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版.Public HealthService,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)描述了这一特定区域；该文献通过引用并入本文。包含由Kabat定义的CDR的合适的氨基酸残基在下面的序列列表表格中列出。包含特定CDR的确切残基数将根据CDR的序列和大小而变化。给定抗体的可变区氨基酸序列，本领域技术人员可以常规确定哪些残基包含特定CDR。如本文所用，术语“包含SEQ ID NO:x的CDRL1”是指所述可变轻链的CDRL1区是SEQ ID NO.x(包含SEQ ID NO：x的CDRL1作为CDRL1)。其他CDR也是如此。除非另有说明，HVR残基在本文中根据Kabat等人(同上)进行编号，并命名为“CDR”，并且对根据本发明的双特异性抗体中的其他特定氨基酸残基位置的编号的引用也根据Kabat编号系统。

如本文所用，术语“Fc区”和“Fc结构域”是指IgG重链的C末端区；对于IgG1抗体，C末端区包含-CH2-CH3(见上文)。尽管IgG重链的Fc区的边界可能略有变化，但人IgG重链Fc区通常被定义为从Cys226位置的氨基酸残基延伸到羧基末端。恒定区在现有技术中是众所周知的，例如由Kabat,E.A.描述(参见例如Johnson,G.和Wu,T.T.,Nucleic Acids Res.28(2000)214-218；Kabat,E.A.等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 72(1975)2785-2788)。

IgG分子在其Fc区携带两个N-连接的寡糖，每个重链上有一个。与任何糖蛋白一样，抗体是以糖型群体的形式产生的，这些糖型群体共享相同的多肽骨架，但在糖基化位点上连接着不同的寡糖。与正常岩藻糖基化抗体相比，聚糖部分岩藻糖含量降低的抗体表现出更高的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)活性(Niwa R等，Cancer Res,64,2127-33,2004)。US6946292、US7425446、US8067232(各自通过引用整体并入)中描述了一种具有敲除负责岩藻糖添加的基因(α1,6-岩藻糖基转移酶；FUT8)的两个等位基因的细胞系。使用这样的细胞系，根据本发明的双特异性抗体可以用具有降低的岩藻糖含量和增加的ADCC和抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)的聚糖部分产生。另一种可用于产生岩藻糖含量降低的抗体的技术描述于US8642292(通过引用并入本文)中。该技术旨在将异源细菌酶稳定整合到抗体产生细胞系中，如CHO细胞系或其他细胞系。通过这种措施，阻断了从D-甘露糖从头合成岩藻糖。此外，如果在不含岩藻糖的培养基中培养生产细胞，则产生具有稳定水平的非岩藻糖基化的抗体。在实施例9(1和2)中描述了制备和纯化本发明的非岩藻糖基化双特异性抗体的示例性方法。

Fc结构域内的突变也可以改变Fc结构域与不同Fc受体的结合特性(WO2004063351、WO2004099249；WO2005018669、WO2005063815、WO2005110474、WO2005056759、WO2005092925、WO2005018572、WO2006019447、WO2006116260、WO2006023420、WO2006047350、WO2006085967、WO2006105338、WO2007021841、WO2007008943、WO2007024249、WO2007041635、WO2007048077、WO2007044616、WO2007106707、WO2008022152、WO2008140603、WO2008036688、WO2008091798、WO2008091954、WO2008092117、WO2008098115、WO2008121160、WO2008150494、WO2010033736、WO2014113510(各自通过引用整体并入))。

术语“表位”包括能够特异性结合抗体的任何多肽决定簇。在某些实施方案中，“表位”包括分子的化学活性表面分组，例如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基，并且在某些实施方案中，可以具有特定的三维结构特征和/或特定的电荷特征。表位是靶标被抗体结合的区域。在一个实施方案中，本发明的双特异性抗体结合CEACAM5的N末端结构域(氨基酸35-144的Ig样V型结构域，UniProtKB-P06731)。CEAxCD47双特异性抗体与CEACAM5的结合位置是通过表位分析实现的。在表位分析中，抗体以成对组合的方式进行测试，竞争同一结合区的抗体被一起分组到bin内。根据现有技术并如本文所述，本文用抗CEA抗体进行竞争测试。在一个实施方案中，本发明的双特异性抗体与参考抗体SM3E竞争与CEACAM5的结合。通过一种测定法测量竞争，其中固定浓度为0.5μg/ml的生物素化人CEACAM5，并与参考品的连续稀释液(从67nM到0.09nM)一起孵育。本发明的CEAxCD47双特异性抗体以0.1μg/ml添加在室温持续1小时。洗涤板并检测结合的CEAxCD47双特异性抗体。

如本文所用，术语“共同重链”(cHC)是指按N端至C端方向由抗体重链可变结构域(VH)、抗体恒定重链结构域1(CH1)、抗体铰链区(HR)、抗体重链恒定结构域2(CH2)和抗体重链恒定结构域3(CH3)组成的多肽，缩写为VH-CH-HR-CH2-CH3。适用于根据本发明的双特异性抗体的共同重链是如WO2012023053、WO2013088259、WO2014087248和WO2016156537(各自通过引用整体并入)中所述的抗CD47抗体的重链。在一个实施方案中，根据本发明的双特异性抗体的共同重链包含SEQ ID NO:1的CDRH1、SEQ ID NO:2的CDRH2和SEQ ID NO:3的CDRH3作为重链CDR。在一个实施方案中，根据本发明的双特异性抗体的cHC包含SEQ ID NO:4的VH区作为重链可变区(VH)。在一个实施方案中，根据本发明的双特异性抗体的共同重链cHC的Fab部分为SEQ ID NO:5(VH-CH1)。在一个实施方案中，根据本发明的双特异性抗体的共同重链cHC为SEQ ID NO:6(VH-CH1-CH2-CH3)。SEQ ID NO:6是另外包含IgG1 Fc部分的重链。在一个实施方案中，根据本发明的抗体是包含cHC的κλ双特异性抗体(κλ抗体)。

κλ抗体形式允许亲和纯化双特异性抗体，这些抗体与标准IgG分子不可区分，并且具有与标准单克隆抗体不可区分的特征(参见例如WO2013088259，WO2012023053)，预示在患者中没有免疫原性潜力或有低免疫原性潜力。

包含共同重链的本发明的双特异性抗体可以例如根据WO2012023053(通过引用整体并入)制备。WO2012023053中描述的方法产生在结构上与人免疫球蛋白相同的双特异性抗体。这种类型的分子由两个拷贝的独特重链多肽组成，第一轻链可变区与恒定κ结构域融合，第二轻链可变区与恒定λ结构域融合。一个结合位点显示对CEA的特异性，另一个位点显示对CD47的特异性，其中重链和各自的轻链对每一个都有贡献。轻链可变区可以是λ或κ家族的，并且优选各自与λ和κ恒定结构域融合。为了避免非天然多肽连接的产生，这是优选的。然而，也可以通过将κ轻链可变结构域与恒定λ结构域融合用于第一特异性或将λ轻链可变结构域与恒定κ结构域融合以用于第二特异性来获得本发明的双特异性抗体。另一条轻链则总是完全κ(VL和CL)或完全λ(所谓的κλ双特异性抗体的杂交形式)。WO2012023053中描述的双特异性抗体是“κλ抗体”。这种κλ-抗体形式允许亲和纯化双特异性抗体，所述抗体与标准IgG分子不可区分，具有与标准单克隆抗体不可区分的特征，因此，与以前的形式(包括例如氨基酸桥或其他非天然元素)相比是有利的。

如本文所用，术语“CEA”和“CEACAM5”是指人癌胚抗原(CEA、CEACAM-5或CD66e；UniProtKB-P06731)，其是一种细胞表面糖蛋白和肿瘤相关抗原(Gold和Freedman,JExp.Med.,121:439-462,1965；Berinstein NL,JClin Oncol.,20:2197-2207,2002)。如本文所用，术语“CEACAM3”是指人CEACAM3(UniProtKB-P40198(CEAM3_人类))，也是癌胚抗原相关细胞黏附分子(CEACAM)家族的成员。更多信息和有关CEA家族其他成员的信息可获自http://www.uniprot.org。

在一个实施方案中，根据本发明的双特异性抗体不与TCB2014竞争。双特异性抗CEACAM5 x抗CD3ε抗体赛必妥单抗在Bacac等人(Clin.Cancer Res.,22(13),3286-97(2016))中进行了描述。TCB2014的抗体链描述于US20140242079(US20140242079的SEQ IDNO:1、2、21、22、23和27)(通过引用整体并入)。另一种双特异性CEAxCD3单克隆抗体(TCB2017)在WO2017055389中被描述为具有电荷修饰(CD3结合剂中的VH/VL交换、CEA结合剂中的电荷修饰、人源化CEA结合剂)的分子B“2+1IgG CrossFab，倒置的”(参见WO2017055389(通过引用整体并入)的SEQ ID NO 34、36-38)。如本文在一个实施方案中所使用的，“双特异性CEA x CD3抗体”是指抗体TCB2014、赛必妥单抗或抗体TCB2017。

赛必妥单抗、TCB2014和TCB2017与位于细胞膜附近的CEACAM5的表位结合。与此相反，本发明的CEAxCD47双特异性抗体与细胞膜远端靠近CEACAM5的N末端的表位结合，并且不与赛必妥单抗、TCB2014和TCB2017竞争与CEACAM5的结合。

如本文所用，术语“特异性结合CD47”、“结合CD47，”和“CD47结合部分”在根据本发明的双特异性抗体的上下文中是指对人CD47的特异性。人CD47是一种多通道膜蛋白，包括三个细胞外结构域(氨基酸19-141、198-207和257-268；参见UniProtKB-Q08722)。如本文所用，通过生物层干涉法(Octet技术)和/或表面等离子体共振(Biacore技术)定量测量“与CD47的结合亲和力”(KD)。在一个实施方案中，根据本发明的双特异性抗体与CD47的结合通过一个或多个所述细胞外结构域发生。

在一个实施方案中，根据本发明的抗体的第二结合部分(特异性结合人CD47)的特征在于轻链和重链，所述轻链包含SEQ ID NO:7的CDRL1、SEQ ID NO:8的CDRL2和SEQ IDNO:9的CDRL3作为轻链CDR，所述重链包含SEQ ID NO:1的CDRL1，SEQ ID NO:2的CDRL2以及SEQ ID NO:3的CDRL3作为重链CDR。在一个实施方案中，根据本发明的抗体的第二结合部分(特异性结合人CD47)的特征在于SEQ ID NO:10的κ轻链可变区。在一个实施方案中，根据本发明的抗体的第二结合部分(特异性结合人CD47)的特征在于SEQ ID NO:11的κ轻链。在一个实施方案中，根据本发明的抗体的第二结合部分(特异性结合人CD47)的特征在于SEQ IDNO:4的重链可变区。在一个实施方案中，根据本发明的抗体的第二结合部分(特异性结合人CD47)的特征在于SEQ ID NO:5的重链。在一个实施方案中，根据本发明的抗体的第二结合部分(特异性结合人CD47)的特征在于SEQ ID NO:6的重链。

如本文所用，如表1所示，术语“特征在于SEQ ID NO:5的重链”是指重链的VH-CH1部分，其为本发明抗体的Fab部分。这种重链可以另外包含，并且根据公知常识，其他部分如铰链区、CH2、CH3，并且可以是任何抗体形式，如F(ab’)₂形式。优选格式是如上所述的共同重链格式。

如本文所用，术语“特异性结合CEA”、“结合CEA”和“CEA结合部分”是指根据本发明的双特异性抗体与重组人CEACAM5的结合，其中所述抗体以与重组人CEACAM5结合的KD值相比100倍或更高的KD值结合重组人CEACAM3。如本文所用，术语“KD”是指根据本发明的双特异性抗体与其抗原CEACAM5或CEACAM3之间的平衡解离常数，并且以nM为单位，并且可以例如通过表面等离子体共振和/或生物层干涉法来测量(实施例3)。

通过使用不同的肿瘤细胞系(如LoVo、LS174T、MKN-45、SNU-C1、SK-CO-1、HPAF-II)来测量与细胞上CEA(CEACAM5)的结合。根据本发明的抗体的浓度在与如上所定义的细胞结合的所得EC50值和Emax值相关的适当范围内变化。本发明双特异性抗体的结合曲线如图1A-1F所示，EC50和Emax列于表4。

如本文所用，术语“膜结合的人CEA”是指结合到细胞的膜部分或细胞表面，特别是肿瘤细胞表面的人癌胚抗原(CEA)。

如本文所用，术语“与人CEA和人CD3结合的双特异性抗体”和“CEAxCD3Mab”是指与人CEACAM5和CD3ε结合的双特异性抗体。这些抗体是例如赛必妥单抗、“TCB2014”和“TCB2017”。如本文所用，“TCB2014”是指与CEA和CD3结合的双特异性抗体，如US20140242079(通过引用整体并入)中记载为SEQ ID NO:1、2、21和22。如本文所用，“TCB2017”是指具有电荷修饰(CD3结合剂中的VH/VL交换、CEA结合剂中的电荷修饰、人源化CEA结合剂)的“2+1IgG CrossFab，倒置的”形式的分子B；WO2017055389(通过引用整体并入)中的SEQ ID NO 34、36-38。在WO2007071426、WO2013012414、WO2015112534、WO2017118675、US20140242079和WO2017055389(各自通过引用整体并入)中描述了另外的CEAxCD3单克隆抗体。另一种CEAxCD3单克隆抗体是赛必妥单抗(之前的RO6958688)(参见例如Bacac等,Clin.Cancer Res.,22(13),3286-97(2016))。在一个实施方案中，根据本发明的所述CEAxCD47单克隆抗体不与TCB2014或TCB2017竞争和/或不与TCB2014或TCB2017结合人CEACAM5的相同表位。

如本文所用，“CD3ε”和“CD3”是指人CD3ε(UniProtKB-P07766(CD3E_人类))。术语“针对CD3ε(CD3)的抗体”和“抗CD3ε(CD3)抗体”是指特异性结合CD3的抗体。在一个实施方案中，抗CD3ε的抗体特异性与抗CD3抗体SP34(BD Biosciences，目录号565983)结合相同的表位。

在一个实施方案中，本发明的双特异性抗体不与TCB2014和/或TCB2017竞争与MKN-45和/或LS174T细胞上存在的CEA的结合。因此，300nM浓度的TCB2014(TCB2014)或30nM浓度(TCB2017)不会使所述本发明双特异性抗体对MKN-45和/或LS174T细胞的吞噬指数曲线的EC50偏移超过3倍，在一个实施方案中趋向更高浓度。

选择300nM TCB2014的浓度，因为已经在用治疗有效剂量的赛必妥单抗(如100mgiv)治疗的患者的血浆中测量到了这种程度的浓度(关于赛必妥单抗的PK数据，参见Melero等，ASCO 2017,Abstract 2549和Poster No.41,Abstract in Journal of ClinicalOncology 35,no.15_suppl(May 20,2017)2549-2549，关于各自的临床结果，参见Tabernero等，J.Clin.Oncol.35,2017(suppl.Abstr.3002))。在目前一项关于赛必妥单抗与PD-L1抑制剂组合的积极招募研究中，施用100mg赛必妥单抗(ClinicalTrials.govIdentifier:NCT03866239)。TCB2017在临床前研究中比TCB2014有效约10至100倍(通过T细胞依赖性细胞毒性TDCC测定中的结合亲和力或肿瘤细胞裂解来测量；参见WO2017055389)。因此，已经在30nM的TCB2017下测试了TCB2017对本发明双特异性抗体的吞噬曲线的EC50的偏移。

结合中的竞争可以通过基于流式细胞术的MKN-45细胞结合曲线的测量和该结合曲线的EC50的测定来确定。非竞争意味着，在一个实施方案中，如果将300nM的TCB2014添加到测定中，则EC50向更高浓度偏移小于3倍。300nM是CEA x CD3双特异性抗体(TCB2014)的治疗活性剂量/血浆浓度范围内的浓度(Tabernero等，J.Clin.Oncol.35,2017(suppl.Abstr.3002))。TCB2017的非竞争意味着，如果将30nM的TCB2017添加到测定中，则EC50偏移小于3倍。

如本文所用，术语“非竞争性”是指浓度为300nM(TCB2014)或30nM(TC B2017)的第二抗体(抗CEAxCD3ε的双特异性抗体，如TCB2014或TCB2017)不会使本发明的双特异性抗体与MKN-45细胞的结合曲线的EC50偏移超过3倍，在一个实施方案中趋向更高浓度。

如本文所用，术语“ADCP”是指抗体依赖性细胞吞噬作用。如本文所用，根据本发明，吞噬作用的EC50值、吞噬作用的最大值和吞噬作用指数是指通过“成像”用肿瘤细胞系(如LoVo、LS174T、SNU-C1和/或MKN-45)测量的吞噬作用。实施例7中描述了合适的成像方法，在例如1:1或1:3的效应细胞(巨噬细胞)：靶细胞(肿瘤)比例下孵育，并以“吞噬指数”作为读数(成像确定的ADCP)。如本文所用，“所述双特异性抗体的吞噬作用”是指由所述抗体引起/诱导的吞噬作用。

术语“人IgG”和“hIgG”是指人抗体同种型。如在实验设置中所使用的，这些术语是指商购可得的人免疫球蛋白IgG的临床级均质制剂(可从例如Bio-Rad获得)，其不与CD47和CEACAM5特异性结合。

使用抗CEA抗原结合分子的治疗应用和方法

根据本发明的CEACAM x CD47双特异性抗体主要通过巨噬细胞介导的肿瘤细胞吞噬作用，但也通过ADCC，在单一疗法或与CEAxCD3 T细胞双特异性抗体(如赛必妥单抗、TCB2014或TCB2017)和/或PD-1轴拮抗剂组合治疗中，被优化用于治疗实体肿瘤。根据本发明的抗体和CEAxCD3 T细胞双特异性抗体可以如下所述施用。

在一个特定的实施方案，实体肿瘤疾病是表达或甚至过表达CEACAM5的癌症，包括但不限于结直肠肿瘤、非小细胞肺肿瘤、胃肿瘤、胰腺肿瘤和乳腺肿瘤。在一个特定的实施方案中，所述肿瘤是结直肠肿瘤。在一个特定的实施方案中，所述肿瘤是胃肿瘤或胃食道接合处肿瘤。在一个特定的实施方案中，所述肿瘤是表达CEACAM5和HER-2的胃肿瘤/胃食道接合处肿瘤。在一个特定的实施方案中，所述肿瘤是肺肿瘤。本文所述的使用方法、用途、组合等的所有治疗应用是尤其用于治疗这些肿瘤/疾病的实施方案。

本发明人认识到，根据本发明的抗体各自显示出低或无抗药物抗体(ADA)形成潜力，低或无药物暴露丧失，低或无由于中和ADA各自导致的效力丧失。

在一个实施方案中，本发明提供了在体内治疗癌症(癌症、肿瘤，例如人类癌症)，尤其是表达CEACAM5的肿瘤的方法。该方法包括给受试者施用药学有效量的含有本发明双特异性抗体的组合物。“受试者”是指人类受试者，在一个实施方案中是指患有癌症/肿瘤/癌的患者。

CEACAM5表达可以在各种肿瘤实体中发现，尤其在结直肠癌、胰腺癌、胃癌、非小细胞肺癌、癌症等肿瘤中。在胃肠道中健康、正常的腺上皮细胞中，CEACAM5主要以极化模式在细胞顶表面表达。这种极化表达模式限制了系统施用的抗CEA单特异性或双特异性抗体的可及性，并因此限制了对健康组织的潜在毒性。与本发明抗体的低亲和力CD47结合一起，这导致本发明的抗体对这种正常细胞的吞噬作用不存在或有限。这种极化表达模式在胃肠道和其他恶性肿瘤的细胞中丢失。CEACAM5在癌细胞的整个细胞表面上均匀表达，这意味着与正常、健康的细胞相比，癌细胞更容易接触到本发明的抗体，并且可以通过上述组合分别被本发明的CEAxCD47双特异性抗体选择性杀死。CEACAM5在癌细胞中的表达大多高于非恶性细胞中的表达。

在一个实施方案中，本发明的双特异性抗体可用于治疗晚期实体肿瘤(在一个实施方案中为表达CEACAM5的肿瘤)的单一疗法。在一个实施方案中，根据本发明的双特异性抗体与CEAxCD3单克隆抗体以同时、单独或顺序组合的方式组合使用。在一个实施方案中，根据本发明的双特异性抗体与CEAxCD3单克隆抗体和/或PD-1轴拮抗剂同时、单独或顺序组合使用。在一个实施方案中，根据本发明的双特异性抗体与PD-1轴拮抗剂同时、单独或顺序组合使用。例如在WO2017118675中描述了这样的PD-1轴拮抗剂。这种组合通过巨噬细胞和T细胞攻击实体癌。一种CEAxCD3单克隆抗体正在临床开发中(赛必妥单抗；参见ClinicalTrials.gov Identifier:NCT03866239)。MEDI-565正在临床开发中，但没有在clinicaltrials.gov中确定的积极临床试验。在一个实施方案中，使用抗体TCB2014或赛必妥单抗作为抗CEA和CD3的双特异性抗体。

以TCB2014和赛必妥单抗使用的CEA结合剂来源于抗CEA抗体PR1A3(参见例如EP2681244B1)。这种抗体与位于细胞膜附近的CEA的所谓B3结构域结合。TCB2014对CEA具有低nM的结合亲和力，并且在高剂量(每剂量和患者为40至600mg；参见例如Tabernero等，J.Clin.Oncol.35,2017(suppl.Abstr.3002))下显示效力。在最高剂量下，细胞表面上几乎所有的CEA靶标都被TCB2014占据。根据本发明人所知，如果两种药物分别结合到不重叠的不同表位而对CEA抗原没有竞争性，则赛必妥单抗、TCB2014或TCB2017与CEAxCD47的组合可以同时产生两种药物的治疗性血浆水平，并实现最佳结果(加成或甚至协同)。

如本文所用，术语根据本发明的抗体和结合人CEA和人CD3ε的第二双特异性抗体的“组合、同时、单独或顺序组合”是指两种抗体(或在本发明抗体、CEAxCD3单克隆抗体和PD-1轴拮抗剂组合的情况下为三种抗体)的任何施用，即单独或一起施用，其中所述两种或三种抗体作为合适剂量方案的一部分施用，所述方案旨在获得组合治疗的益处，例如以单独、顺序、同时、并行、按时间交错或交替施用的方式施用。因此，所述两种或三种抗体可以作为同一药物组合物的一部分或在单独的药物组合物中施用。根据本发明的抗体可以在施用第二双特异性抗体之前、同时或之后施用，或者以它们的一些组合施用。在根据本发明的抗体以重复间隔施用于患者的情况下，第二双特异性抗体可以在每次施用本发明抗体或其一些组合之前、同时或之后施用，或以与用本发明抗体治疗有关的不同间隔施用，或在本发明抗体治疗过程之前、期间或之后的任何时间以单剂量施用。在一个实施方案中，本发明的抗体和第二双特异性抗体以交替施用的方式施用，在一个实施方案中，在施用本发明抗体和第二抗体之间的间隔为6-15天。在这种交替施用中，第一剂量可以是本发明的抗体或第二抗体。

术语“PD-1轴拮抗剂”是指抗PD-1抗体或抗PD-Ll抗体。抗PD-1抗体是例如帕博丽珠单抗(pembrolizumab，MK-3475)、纳武单抗(nivolumab)、匹地利珠单抗(pidilizumab)、帕姆单抗(lambrolizumab)、MEDI-0680、PDR001和REGN2810。在例如WO200815671、WO2013173223、WO2015026634、US7521051、US8008449、US8354509、WO2009114335、WO2015026634、WO2008156712、WO2015026634、WO2003099196、WO2009101611、WO2010/027423、WO2010/027827、WO2010/027828、WO2008/156712和WO2008/156712(各自通过引用整体并入)中描述了抗PD-1抗体。

抗PD-L1抗体是例如阿替丽珠单抗(atezolizumab)、MDX-1 105、度伐利尤单抗(durvalumab)和阿维单抗(avelumab)。在例如WO2015026634、WO2013/019906、WO2010077634、US8383796、WO2010077634、WO2007005874和WO2016007235(各自通过引用整体并入)中描述了抗PD-L1抗体。

关于根据本发明的抗体和第二双特异性抗体的组合施用，这两种化合物可以以一种单一剂型或以单独的剂型存在，例如以两种不同或相同的剂型存在。

如果本发明的抗体和第二抗体在CEACAM5方面不竞争，在一个实施方案中，如果医生需要，两种抗体可以同时施用。如果本发明的抗体和第二抗体在CEACAM5方面竞争，则在一个实施方案中，两种抗体以交替施用的方式施用。

如本领域所知，本发明的抗体通常将以提供对患者正在治疗的癌症的最有效治疗(从效力和安全性方面来看)的剂量方案施用于患者。优选地，肿瘤细胞同时被T细胞和巨噬细胞攻击，以实现此方法的全部治疗潜力，根据本发明的CEAxCD3和CEAxCD47双特异性抗体在与细胞表面上的CEA结合方面必须是非竞争性的。

如上所述，本发明抗体的施用量和施用时间可以取决于被治疗患者的类型(例如性别、年龄、体重)和状况、被治疗疾病或状况的严重程度以及施用途径。例如，本发明的抗体和第二抗体可以以每天或每周0.1至100mg/kg(体重)的剂量单次或分次施用，或通过连续输注施用于患者。在一个实施方案中，本发明的抗体和第二抗体中的每一种以0.1至30mg/kg的剂量施用于患者。在某些情况下，低于上述范围下限的剂量水平可能是足够的，而在其他情况下，可以使用更大的剂量，而不会引起任何有害的副作用。

如本文所用，术语“抗体的半衰期”是指在通常的药代动力学测定中测量的所述抗体的消除半衰期。根据本发明的抗体和抗CEA和CD3的第二双特异性抗体具有3-14天的消除半衰期。

在另一个方面，本发明还涉及根据本发明的双特异性抗体在治疗疾病中的用途，特别是其中表达CEACAM5的细胞增殖病症，特别是与相同细胞类型的正常组织相比CEACAM5异常表达(例如，在细胞表面过表达或以不同模式表达)的细胞增殖病症。此类病症包括但不限于结直肠癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、胃癌、胃食道癌、胰腺癌和乳腺癌。CEACAM5的表达水平可以通过不同的现有技术已知方法来测定(例如，通过免疫组织化学测定、免疫荧光测定、免疫酶测定、ELISA、流式细胞术、放射免疫测定等)。

在一个方面，本发明的双特异性抗体可用于体内或体外靶向表达CEACAM5的细胞。本发明的双特异性抗体尤其适用于通过诱导肿瘤细胞的ADCP和ADCC来预防肿瘤形成、根除肿瘤和抑制肿瘤生长或转移。本发明的双特异性抗体可用于治疗任何表达CEACAM5的肿瘤。可使用本发明双特异性抗体治疗的特定恶性肿瘤包括但不限于结直肠癌、非小细胞肺癌、胃癌、胃食道接合处癌症、胰腺癌和乳腺癌。

本发明的双特异性抗体以药学上可接受的剂型(如下文所述)施用于哺乳动物，优选为人类，包括那些可以以团剂静脉内或通过一段时间内的连续输注，通过肌内、腹膜内、脑脊髓内、皮下、关节内、滑膜内、鞘内、口服、局部或吸入途径施用于人类。本发明的双特异性抗体也可通过肿瘤内、肿瘤周围、病灶内或病灶周围途径适当施用，以发挥局部和全身治疗作用。

对于疾病的治疗，本发明双特异性抗体的适当剂量将取决于待治疗的疾病类型、疾病的严重程度和病程、先前的治疗、患者的临床病史和对抗体的反应以及主治医生的判断。本发明的双特异性抗体在一次或一系列治疗中适当地施用于患者。本发明提供了选择性杀伤表达CEACAM5的肿瘤细胞(本文中也称为癌细胞)的方法。

该方法包括本发明的双特异性抗体与所述肿瘤细胞的相互作用。这些肿瘤细胞可能来自人类癌症，包括结直肠癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、胃癌、胃食道接合处癌症、胰腺癌和乳腺癌。

在另一个方面，本发明涉及本发明的双特异性抗体在制备用于治疗与异常CEACAM5表达相关的疾病的药物中的用途。在一个特定的实施方案中，所述疾病是表达或甚至过表达CEACAM5的癌症，包括但不限于结直肠肿瘤、非小细胞肺肿瘤、胃肿瘤、胃食道接合处肿瘤、胰腺肿瘤和乳腺肿瘤。在一个特定的实施方案中，所述肿瘤是结直肠肿瘤。

组合物、制剂、剂量和施用途径

在一个方面，本发明涉及包含本发明的双特异性抗体和药学上可接受的载剂的药物组合物。本发明进一步涉及该药物组合物在治疗疾病(例如癌症)的方法中的用途，或在制备治疗疾病(例如癌症)的药物中的用途。具体而言，本发明涉及用于治疗疾病的方法，更具体地，用于治疗癌症，所述方法包括施用治疗有效量的本发明的药物组合物。

在一个方面，本发明包括如上所定义的用于治疗人类癌症、肿瘤的药物组合物、组合和方法。例如，本发明包括用于治疗人类癌症的药物组合物，其包含药学上有效量的本发明的抗体和药学上可接受的载剂。

本发明的双特异性抗体组合物可以使用常规施用方式施用，包括但不限于静脉内、腹膜内、口服、淋巴管内或直接肿瘤内施用。优选为静脉内施用或皮下施用。

在本发明的一个方面，通过将具有所需纯度的抗体与任选的药学上可接受的载剂、赋形剂或稳定剂(Remington's Pharmaceutical Sciences第16版,Osol,A.编(1980))混合来制备含有本发明双特异性抗体的治疗制剂以备以冻干制剂或液体制剂的形式储存。可接受的载剂、赋形剂或稳定剂在所用的剂量和浓度下对受体无毒。用于体内施用的制剂必须是无菌的。这很容易通过无菌过滤膜进行过滤来实现。本发明药物组合物最有效的施用方式和剂量方案取决于疾病的严重程度和病程、患者的情况和对治疗的反应以及治疗医生的判断。因此，组合物的剂量可以是固定剂量，或者可以适合于个体患者，例如体重。然而，本发明组合物的有效剂量通常在0.1和30mg/kg的范围内。

本发明的双特异性抗体的分子量为每摩尔150kDa。在一个实施方案中，它们携带Fc部分。在患者中的消除半衰期在3至14天的范围内。这种半衰期允许但不限于每天一次、每周一次、或每两周一次、甚至4周一次施用。

本发明的双特异性抗体及其各自的组合物可以是多种剂型，包括但不限于液体溶液或悬浮液、片剂、药丸、粉末、栓剂、聚合物微胶囊或微泡、脂质体和可注射或不可输注的溶液。优选的形式取决于施用方式和治疗应用。

包含本发明双特异性抗体的组合物将以符合良好医疗实践的方式配制、给药和施用。在本文中考虑的因素包括正在治疗的特定疾病或病症、正在治疗的特定哺乳动物、个体患者的临床状况、疾病或病症的原因、药剂的递送部位、施用方法、施用时间安排以及医生已知的其他因素。

制品

在本发明的另一个方面，提供了含有用于治疗、预防和/或诊断上述病症的材料的制品。所述制品包含容器和在容器上或与容器相关联的标签或包装插页。合适的容器包括，例如，瓶子、小瓶、注射器、IV溶液袋等。所述容器可以由各种材料(例如玻璃或塑料)制作。所述容器容纳组合物，所述组合物本身或与另一种有效治疗、预防和/或诊断该疾病的组合物组合，并且所述容器可以具有无菌入口(例如，所述容器可以是静脉内溶液袋或具有可被皮下注射针刺穿的塞子的小瓶)。所述组合物中的至少一种活性剂是本发明的双特异性抗体。标签或包装插页表明所述组合物用于治疗所选择的疾病。此外，所述制品可以包含(a)其中含有组合物的第一容器，其中所述组合物包含本发明的双特异性抗体；和(b)其中含有组合物的第二容器，其中所述组合物包含另外的细胞毒性剂或其他治疗剂。在本发明的这个实施方案中，制品可以进一步包含包装插页，其表明组合物可以用于治疗特定的疾病。备选地或另外地，所述制品可以进一步包含第二(或第三)容器，所述第二(或第三)容器包含药学上可接受的缓冲液，例如抑菌注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲液、林格氏液和葡萄糖溶液。它可以进一步包括从商业和用户的角度来看所需的其他材料，包括其他缓冲液、稀释剂、过滤器、针头和注射器。

本发明的进一步实施方案

1.一种双特异性抗体，其包含特异性结合人CEACAM5的第一结合部分和特异性结合人CD47的第二结合部分，其特征在于：

b1)SEQ ID NO:14的CDRL1、SEQ ID NO:15的CDRL2和SEQ ID NO:16的CDRL3，或

b2)SEQ ID NO:17的CDRL1、SEQ ID NO:18的CDRL2和SEQ ID NO:19的CDRL3，

b3)SEQ ID NO:20的CDRL1、SEQ ID NO:21的CDRL2和SEQ ID NO:22的CDRL3，

b4)SEQ ID NO:23的CDRL1、SEQ ID NO:24的CDRL2和SEQ ID NO:25的CDRL3，和

b5)SEQ ID NO:26的CDRL1、SEQ ID NO:27的CDRL2和SEQ ID NO:28的CDRL3，

2.根据实施方案1所述的双特异性抗体，其特征在于：在所述第一结合部分中包含SEQ ID NO:4的可变重链区作为可变重链区和选自SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ IDNO:34、SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36的可变轻链区作为可变轻链区，并且在所述第二结合部分中包含SEQ ID NO:4的可变重链区作为可变重链区和具有SEQ ID NO:10的可变轻链区作为可变轻链区。

3.根据实施方案1所述的双特异性抗体，其特征在于：在第一结合部分中包含含有SEQ ID NO:5的重链和选自SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40和SEQ ID NO:41的轻链，并且在第二结合部分中包含SEQ ID NO:5的重链和具有SEQ ID NO:11的轻链。

4.根据前述实施方案中任一项所述的双特异性抗体，其特征在于：包含SEQ IDNO:6的共同重链作为重链。

5.根据前述实施方案中任一项所述的双特异性抗体，其中所述抗体对所述第一结合部分为单价，并且对所述第二结合部分为单价。

6.根据前述实施方案中任一项所述的双特异性抗体，其中所述恒定和可变框架区序列是人类的。

7.根据前述实施方案中任一项所述的双特异性抗体，其中所述第一结合部分的轻链是λ轻链(VLCL)，并且所述第二结合部分的轻链是κ轻链(VKCK)。

8.根据前述实施方案中任一项所述的双特异性抗体，其中所述抗体是人IgG1型。

9.根据前述实施方案中任一项所述的双特异性抗体，其中所述抗体包含Fc区，所述Fc区已被糖工程化，以与未被糖工程化的相同的双特性抗体相比具有减少数量的岩藻糖残基。

10.根据前述实施方案中任一项所述的双特异性抗体，其特征在于：所述双特异性抗体与抗CEACAM5抗体SM3E竞争结合CEACAM5，所述SM3E包含SEQ ID NO:43和44的可变轻链区和可变重链区。

11.根据前述实施方案中任一项所述的双特异性抗体，其特征在于：以2至10nM的结合亲和力(KD)结合重组人CEACAM5。

12.根据前述实施方案中任一项所述的双特异性抗体，其特征在于：以100nM至600nM的结合亲和力结合人重组CD47。

13.根据前述实施方案中任一项所述的双特异性抗体，其特征在于：与重组CEACAM3结合的KD值和与重组CEACAM5结合的KD值的比率为100或更大。

14.根据实施方案13所述的双特异性抗体，其特征在于：与重组CEACAM3结合的KD值和与重组CEACAM5结合的KD值的比率为100至200。

15.根据前述实施方案中任一项所述的双特异性抗体，其特征在于：LoVo肿瘤细胞的吞噬指数最大值与双特异性抗体K2AC22的吞噬指数相比增加至少8％。

16.根据实施方案15所述的双特异性抗体，其特征在于：LoVo肿瘤细胞的吞噬指数最大值增加8％至20％。

17.根据前述实施方案中任一项所述的双特异性抗体，其特征在于：Ls174T肿瘤细胞的吞噬指数最大值与双特异性抗体K2AC22的吞噬指数相比增加至少8％。

18.根据实施方案17所述的双特异性抗体，其特征在于：Ls174T肿瘤细胞的吞噬指数最大值增加8％至25％。

19.根据前述实施方案中任一项所述的双特异性抗体，其特征在于：抑制MKN-45细胞上CD47和SIRPα之间的相互作用的IC50比在相同实验条件下对K2AC22测量的IC50低10倍或更多。

20.根据实施方案19所述的双特异性抗体，其特征在于：以低10至30倍的IC50抑制MKN-45细胞上CD47和SIRPα之间的相互作用。

21.根据前述实施方案中任一项所述的双特异性抗体，其特征在于：以0.1nM或更低的IC50抑制MKN-45细胞上CD47和SIRPα之间的相互作用。

22.根据实施方案21所述的双特异性抗体，其特征在于：以0.1nM至0.04nM的IC50抑制MKN-45细胞上CD47和SIRPα之间的相互作用。

23.根据前述实施方案中任一项所述的双特异性抗体，其特征在于：不与赛必妥单抗竞争结合CEACAM5。

24.根据前述实施方案中任一项所述的双特异性抗体，其中所述第一双特异性抗体的特征在于，与人CEACAM5和CD3ε结合的第二双特异性抗体在300nM的浓度不会使第一双特异性抗体与MKN-45细胞或LS174T细胞的结合曲线的EC50向更高浓度偏移超过3倍。

25.根据实施方案24所述的双特异性抗体，其中所述第二双特异性抗体是TCB2014或赛必妥单抗。

26.一种分离的多核苷酸或一组多核苷酸，所述多核苷酸编码根据前述实施方案中任一项所述的双特异性抗体。

27.一种包含实施方案26所述的一种或多种多核苷酸的表达载体。

28.一种包含实施方案27所述的表达载体的宿主细胞。

29.产生根据实施方案1-25中任一项所述的双特异性抗体的方法，其包括：a)在允许产生所述双特异性抗体的条件下培养实施方案28所述的宿主细胞，和b)分离所述抗体。

30.根据实施方案1-25中任一项所述的双特异性抗体，其用于治疗人类癌症。

31.根据实施方案30所使用的双特异性抗体，其特征在于：所述癌症是实体癌。

32.根据实施方案30所使用的双特异性抗体，其特征在于：所述癌症是结直肠癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、胃癌、胰腺癌、乳腺癌或表达CEACAM5的另一种癌症。

33.根据实施方案1-25中任一项所述的双特异性抗体，其用于制备用于治疗患有表达CEACAM5的癌症的受试者的药物。

34.根据实施方案1-25中任一项所述的双特异性抗体，其与第二双特异性抗体同时、单独或顺序组合用于治疗患有表达CEACAM5的癌症的受试者，所述第二双特异性抗体包含与人CEACAM5特异性结合的第三结合部分和与人CD3ε特异性结合的第四结合部分。

35.根据实施方案1-25中任一项所述的双特异性抗体，其与第二双特异性抗体同时、分离或顺序组合使用，其中所述第二双特异性抗体是TCB2014或赛必妥单抗。

36.根据实施方案34或35所述的双特异性抗体，其特征在于：以6至15天的间隔将根据本发明的双特性抗体和第二双特异性抗体同时施用于所述受试者。

37.一种药物组合物，其包含实施方案1-25中任一项所述的双特异性抗体和药学上可接受的赋形剂或载剂。

38.根据实施方案37所述的药物组合物，其用作药物。

39.根据实施方案37或实施方案38所述的药物组合物，其用作治疗实体癌的药物。

40.根据实施方案37-39中任一项所述的药物组合物，其用作治疗结直肠癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、胃癌、胰腺癌或乳腺癌的药物。

41.一种治疗患有表达CEACAM5的癌症的受试者的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的实施方案1-25中任一项所述的双特异性抗体或实施方案37-40中任一项所述的药物组合物。

42.根据实施方案41所述的方法，其中所述癌症是人类癌症。

43.根据实施方案41或42所述的方法，其中所述受试者是患者。

44.根据实施方案41-43中任一项所述的方法，其特征在于：所述癌症是结直肠癌细胞、非小细胞肺癌(NSCLC)细胞、胃癌细胞、胰腺癌细胞、乳腺癌细胞或表达CEACAM5的另一肿瘤细胞。

45.根据实施方案41-44中任一项所述的方法，其中所述双特异性抗体与化学疗法或放射疗法组合施用。

46.一种治疗患有肿瘤的人类患者的方法，其包括施用有效量的实施方案1-25中任一项所述的CEACAM5 x CD47双特异性抗体和抗CEACAM5和CD3的第二双特异性抗体。

47.根据实施方案46所述的方法，其中所述CEACAM5 x CD47双特异性抗体与CEACAM5和CD3抗体不是竞争性的。

48.根据实施方案46或47所述的方法，其中所述抗体是同时施用的。

49.根据实施方案41-48中任一项所述的方法，其中向所述患者施用一个或多个剂量的0.01至10mg/kg的实施方案1-25中任一项所述的双特异性抗体。

50.根据实施方案46-48中任一项所述的方法，其中向所述患者施用一个或多个剂量的0.01至10mg/kg的CEACAM5 x CD3双特异性抗体和一个或多个剂量的1至20mg/kg的CEACAM5 x CD47双特异性抗体。

51.根据实施方案46-50中任一项所述的方法，其中所述第二抗体是TCB2014或赛必妥单抗。

52.一种增加患有表达CEACAM5的癌症的受试者生存时间的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的实施方案1-25中任一项所述的双特异性抗体。

53.根据实施方案52所述的方法，其特征在于：所述癌症是结直肠癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、胃癌、胰腺癌或乳腺癌。

54.根据实施方案52或53所述的方法，其中所述双特异性抗体与化学疗法和/或放射疗法组合施用。

55.根据实施方案52-54中任一项所述的方法，其中向所述患者施用一个或多个剂量的0.01至10mg/kg的实施方案1-25中任一项所述的双特异性抗体。

表1：序列列表

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实施例

实施例1：人CEACAM5的克隆、表达和纯化；huCEACAM3和huCD47的来源

将与完整细胞外结构域(ECD)CEACAM5相对应的序列亚克隆到pEAK8哺乳动物表达载体(Edge Biosystems,Gaithersburg,Md.)中。修饰所述载体以在C末端引入Avitag^TM(Avidity,Denver Colo.)和六组氨酸标签、人Fc区或小鼠Fc区。通过DNA测序验证构建体。重组可溶性蛋白的纯化通过IMAC(固定化金属离子亲和色谱法)、FcXL或CaptureSelect^TMIgG-Fc(ms)亲和基质进行；人CEACAM3和生物素化的CEACAM3可从ACROBiosystems，Newark USA(Thermo Ffisher Scientific)获得。人CD47和生物素化的CD47可以如WO2019234576中所述生产，或者可获自ACROBiosystems，Newark USA。

实施例2：携带λ和κ轻链的双特异性抗体的表达和纯化

可以通过不同的方式实现同时表达，例如，通过转染多个载体，每个载体表达要共表达的链中的一个，或者通过使用驱动多个基因表达的载体。如US2012/0184716和WO2012/023053(各自通过引用整体并入本文)中所述，提前生成载体pNoviκHλ以允许一个重链、一个κ轻链和一个λ轻链的共表达。这三个基因的表达是由人巨细胞病毒启动子(hCMV)驱动的，所述载体还含有谷氨酰胺合成酶基因(GS)，该基因能够选择和建立稳定的细胞系。抗hCEACAM5 IgGλ或抗hCD47 IgGκ的VL基因被克隆到载体pNoviκHλ中，用于哺乳动物细胞中的瞬时表达。将peak细胞或CHO细胞在具有适当细胞数和培养基体积(含有胎牛血清)的适当烧瓶中培养。根据制造商的说明书使用Lipofectamine 2000将质粒DNA转染到细胞中。在生产过程中使用OctetRED96测量转染细胞上清液中的抗体浓度。根据抗体浓度，在转染后5至7天，通过以1300g离心10分钟澄清来收获上清液。纯化过程由三个亲和步骤组成。首先，用PBS洗涤FcXL亲和基质(Thermo Fisher Scientific)，然后加入澄清的上清液中。在+4℃下孵育过夜后，将上清液以2000g离心10分钟，储存流过液，并用PBS洗涤树脂两次。然后，将树脂转移到Amicon Pro柱上，并使用pH 3.0的含有50mM甘氨酸的溶液进行洗脱。使用50kDaAmicon^TM超离心过滤装置(Merck KGaA,Darmstadt,Germany)产生几个洗脱级分，合并以及针对PBS脱盐。使用Nanodrop分光光度计(NanoDrop Technologies,Wilmington,Del.)对洗脱的产物进行定量，所述洗脱产物含有来自上清液的总人IgG，并在室温和20rpm下与适当体积的κ选择亲和基质(GE Healthcare)孵育15分钟。孵育、树脂回收、洗脱和脱盐步骤如前所述进行。最后的亲和纯化步骤是使用λFab选择亲和基质(GE Healthcare)进行的，应用与之前两次纯化相同的方法。使用Nanodrop对最终产物进行定量。纯化的双特异性抗体在变性和还原条件下通过电泳进行分析。Agilent 2100生物分析仪与制造商(AgilentTechnologies,Santa Clara,Calif.,USA)描述的蛋白质80试剂盒一起使用。将4μL纯化样品与补充有二硫苏糖醇(DTT；Sigma Aldrich,St.Louis,Mo.)的样品缓冲液混合。将样品在95℃下加热5分钟，然后上样到芯片上。使用鲎变形细胞溶解物试验(LAL；Charles RiverLaboratories,Wilmington,Mass.)对所有样品进行内毒素污染测试。

实施例3：KD测量

a)测量抗体对重组人CEACAM5的KD的实验步骤(Octet)

使用生物层干涉(BLI)技术测定本发明的CD47xCEACAM5双特异性抗体的抗人CEACAM5臂对重组可溶性人CEACAM5的亲和力。使用OctetRED96仪器和蛋白A生物传感器(Sartorius)。测量在30℃下进行。在动力学缓冲液(PBS,0.002％ Tween 20,0.01％ BSA,Kathon；Sartorius)中水合、预处理和基线步骤后，将κλ抗体以在动力学缓冲液中0.5μg/mL上样到生物传感器上持续5分钟。然后，将生物传感器浸入重组人CEACAM5细胞外结构域(ECD)可溶性蛋白(内部生产)的连续稀释液中，连续稀释从50nM开始，稀释因子为2倍。对缔合和解离阶段分别进行600秒的监测。使用pH为1.7的10mM甘氨酸再生生物传感器。采用标准采集速率(5.0Hz，平均20)。曲线采用参考孔减去处理，在基线上进行Y对齐，无需步骤间校正。在完全缔合和解离步骤上应用1:1全局拟合模型来测量亲和力。通过相同的实验步骤测定本发明的双特异性抗体对重组人CD47的结合亲和力(KD)。通过该步骤测定的本发明示例性双特异性抗体对CEACAM5的KD显示在下表2中。

b)测量抗体对重组人CEACAM3的KD的实验步骤(Octet)

使用生物层干涉(BLI)技术和OctetRED96仪器测定本发明的CD47xCEACAM5双特异性抗体的抗人CEACAM5臂对重组可溶性人CEACAM3的亲和力。装载有抗His标记抗体的HIS1K生物传感器(Sartorius)用于捕获his标记的重组huCEACAM3(R&D Systems,#9868-CM)。测量在30℃下进行。在动力学缓冲液(PBS,0.002％ Tween 20,0.01％ BSA,Kathon；Sartorius)中水合、预处理和基线步骤后，将重组huCEACAM3以在动力学缓冲溶液中5μg/mL上样到生物传感器上持续5分钟。然后，将生物传感器浸入κλ抗体的连续稀释液中，连续稀释从667nM开始，稀释因子为2倍。缔合和解离阶段分别被监测60秒和120秒。使用pH为1.7的10mM甘氨酸再生生物传感器。采用标准采集速率(5.0Hz，平均20)。通过双参考减法、基线上的Y对齐和步骤间校正来处理曲线。在完全缔合步骤和解离步骤的前5秒应用1:1全局拟合模型来测量亲和力。通过该步骤测定的本发明示例性双特异性抗体对CEACAM3的KD显示在下表2中。

表2.通过Octet测量的3(三)种CD47xCEACAM5双特异性抗体K2AC84、K2AC100和K2AC22(比较)的抗CEACAM5臂的结合亲和力(KD；nM)

实施例4：通过与参考抗体SM3E竞争的CD47xCEACAM5双特异性抗体的表位分析

表位分析(epitope binning)是一种竞争性免疫测定法，用于表征根据本发明的抗体的结合，或者例如本发明双特异性抗体的第一结合部分的相关二价抗CEA(靶蛋白)抗体的结合。针对也结合该靶蛋白并且其结合表位已经建立/公布的抗体，产生与靶蛋白结合的新抗体的竞争性阻断图谱。与该参考抗体的竞争表明该抗体具有相同或位置相近的表位，并且它们被“分析”在一起。本发明的CD47xCEACAM5双特异性抗体与CEACAM5参考抗体竞争的能力通过ELISA在重组人CEACAM5上测试，其中参考抗体衍生自携带小鼠Fc区的SM3E(US20050147614)(使用标准方法产生的单克隆抗体)。SM3E更多地与CEA的N末端、细胞膜远端部分结合。

将生物素化的人CEACAM5以0.5μg/ml包被在链霉亲和素包被的96孔板中，并与连续稀释的参考单克隆抗体(0.09nM至67nM)或携带小鼠Fc区的无关单克隆抗体孵育1小时。本发明的CD47xCEACAM5双特异性抗体在室温下以0.1μg/ml加入1小时。洗涤板，并用抗人IgG(Fc)-HRP(Jackson ImmunoResearch)检测结合的CD47xCEACAM5双特异性抗体。洗涤后，用Amplex Red试剂处理板。荧光信号是在Synergy HT读板仪(Biotek)上测量的。

用本发明的CD47 x CEACAM5双特异性抗体进行竞争实验。K2AC82、K2AC84、K2AC91、K2AC100和K2AC117的结合被各自的竞争性(即，工具)抗体减少80％或更多。当用最高浓度的参考工具抗体使双特异性抗体的结合减少80％或更多时，CD47xCEACAM5双特异性抗体在本文中被鉴定为与SM3E抗体竞争。如果将添加和不添加工具抗体的结果进行比较，当与CEACAM5的结合减少小于20％时，则CD47xCEACAM5双特异性抗体被鉴定为与工具抗体没有竞争性。

实施例5：定量6个不同癌细胞系细胞表面CEACAM5和CD47的靶密度(即数量)

测量6个不同癌细胞系细胞表面CEACAM5和CD47的靶密度(即数量)。这些细胞系是人胃腺癌细胞(MKN-45，DSMZ ACC 409)，人结直肠癌细胞(SK-CO-1(ATCC；HTB-39)；SNU-C1(ATCC；CRL-5972)；Ls174T(ATCC；CL-188)和LoVo(ATCC；CCL-229))，或胰腺癌细胞(HPAF-II、ATCC，CRL-1997)。

(Agilent Dako)用于通过流式细胞术使用间接免疫荧光测定法定量测定细胞表面抗原。/>由一系列6个珠群组成，所述珠群包被有不同但数量明确的小鼠单克隆抗体(Mab)。这些珠子模仿用特定的一级小鼠单克隆抗体标记的细胞。不同的细胞样本可以用不同的一级抗体标记，然后使用同一组校准珠进行定量。

将细胞在其适应的培养基中培养，用胰蛋白酶-EDTA(Sigma Aldrich)解离，离心(3分钟，350g)，并重悬于冷的FACS缓冲液(PBS，2％BSA—来自Sigma Aldrich)中，通过0.22μm(Stericup，Millipore)过滤，获得3×10⁶个细胞/mL。将每个样品的3×10⁵个细胞接种在V底板中。将1μL FcγR阻断试剂添加到每个孔中，并将平板在4℃下孵育10分钟。将10μL最终浓度为20μg/mL的抗人CEACAM5(#sc-23928；mIgG1(Santa Cruz))和抗人CD47(内部生产；B6H12；小鼠骨架)的一级抗体添加到细胞中，并在4℃下孵育30分钟。用200μL PBS 2％ BSA洗涤细胞两次，并以400g离心3分钟。100μL珠子(来自的设置或校准)与细胞一起洗涤，并进行相同处理。将试剂盒中的100μL二级抗体(1/50，PBS BSA 2％)加入每个孔中，并在4℃下孵育30至45分钟。将细胞离心(3分钟，400g，4℃)以丢弃上清液，并洗涤两次。最后一次离心后，将细胞重悬于130μL CellFix中，并在CytoFlex细胞计数器(BeckmanCoulter)上采集。使用FlowJo软件进行分析，并将几何平均值导出到Excel文件中。使用来自校准珠的MFI值进行线性回归。从该回归线推断出细胞的抗体结合能力(ABC)。特异性抗体结合能力(sABC)是通过将同种型对照的ABC减去特异性染色的ABC而获得的。该分析的数据如下表3所示。

表3.CEACAM5和CD47在6个癌细胞系细胞表面的靶密度

	起源	CEACAM5(x10³)	CD47(x10³)
				SK-CO-1	结直肠	257	105
MKN-45	胃	155	135
				HPAF-II	胰腺	120	114
SNU-C1	结直肠	85	68
				Ls174T	结直肠	26	57
LoVo	结直肠	4	25

实施例6：CEAxCD4双特异性抗体与表达CEACAM5的癌细胞系的结合测量(EC50和最大结合Emax)

CD47xCEACAM5双特异性抗体的结合可在表达CEACAM5的人胃腺癌细胞(例如MKN-45)、表达CEACAM 5的人结直肠癌细胞(SK-CO-1、SNU-C1、Ls174T和LoVo)和表达CEACAME5的胰腺癌细胞(HPAF-II)上进行测试。

收获细胞，计数，检查细胞活力，并以3×10⁶个细胞/ml重悬于FACS缓冲液(PBS2％BSA，0.1％NaN3)中。100μl的细胞悬浮液分布在V底96孔板中(3×10⁵个细胞/孔)。通过在4℃、1300rpm下离心3分钟来去除上清液。然后将浓度增加的根据本发明的抗体加入孔中，并在4℃下孵育15分钟。用冷的FACS缓冲液洗涤细胞两次，并在4℃下与PE(R-藻红蛋白)-缀合的小鼠抗人IgG Fc二级抗体(SouthernBiotech，在FACS缓冲液中以1:100预稀释)进一步孵育15分钟。用冷的FACS缓冲液洗涤细胞两次，并重悬于具有1:15000稀释的SytoxBlue(Life Technologies)的300μl FACS缓冲液中。使用Cytoflex(Millipore)流式细胞仪测定荧光，具体是平均荧光活性(MFI)。使用GraphPad Prism7软件获得并计算结合曲线以及EC50和Emax值。来自该分析的数据如下表4所示。

表4.在表达CEACAM5和CD47的人类癌细胞系上，6种CD47xCEACAM4双特异性抗体的结合的EC50(nM)和Emax(MFI)(与K2AC22比较)

*MFI–平均荧光强度

N/A–不适用–该细胞系上没有该抗体的可用数据

表4中的数据显示与K2AC22相比，根据本发明的所有双特异性抗体显示出相当低的EC50和更高的Emax。

如表4所示，根据本发明的双特异性抗体以10至30nM的EC50值结合SK-CO1细胞、以5至15nM的EC50值结合MKN-45细胞、以5至15nM的EC50值结合HPAF-II细胞、以1至10的EC50值结合SNU-C1细胞、以3至15nM的EC50值结合LS174T细胞和/或以15至25nM的EC50值结合LoVo细胞。

如表4所示，根据本发明的双特异性抗体以0.5至1.5的Emax值(MFI x10⁶)结合SK-CO1细胞、以1至2的Emax值(MFI x 10⁶)结合MKN-45细胞、以0.5-1.5的Emax值(MFI x 10⁶)结合HPAF-II细胞、以0.2至0.6的Emax值(MFI x 10⁶)结合SNU-C1细胞、以0.05至0.2的Emax值(MFI x 10⁶)结合LS174T细胞和/或以0.2-0.5的Emax值(MFI x 10⁶)结合LoVo细胞。

实施例7：抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)的各自吞噬作用(吞噬指数)的测量

使用6个表达CEACAM5的癌细胞系(MKN-45、SK-CO-1、SNU-C1、Ls174T、LoVo和HPAF-II)评估本发明的CEACAM5xCD47双特异性抗体的体外吞噬活性。使用相同的细胞系和实验程步骤评估K2AC22以进行比较。

所述测定依赖于基于成像的方法，该方法利用CellInsight CX5高含量筛选平台。评估的读数是吞噬指数，定义为被100个巨噬细胞吞噬的靶细胞的平均数量。

1.巨噬细胞的制备：

通过Ficoll梯度从来自不同健康供体(根据细胞系，来自5到7个不同的供体)的血沉棕黄层中分离人外周血单核细胞(PBMC)。巨噬细胞通过在完全培养基(RPMI 1640，10％热灭活胎牛血清[Invitrogen]、2mM L-谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠、10mM HEPES缓冲液、25mg/mL庆大霉素(均来自Sigma-Aldrich)和50mM 2-巯基乙醇(Thermo Fisher Scientific))在20ng/mL人巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)(PeproTech)存在下培养7至9天而产生。随后在分化阶段(第+1天)通过交换细胞培养基来消除非贴壁细胞，并且使用细胞解离缓冲液(Sigma-Aldrich)分离代表巨噬细胞的贴壁细胞，并在使用当天(第7天、第8天或第9天)在完全培养基中洗涤，用于基于细胞计数的ADCP实验。对于基于细胞成像的ADCP，在第6天使用细胞解离缓冲液分离巨噬细胞，并在96光学板(Costar)中以每孔30000个细胞接种。

2.吞噬活性评估(基于CellInsight^TM测定)

粘附在微孔板孔上的巨噬细胞(用钙黄绿素红橙色染色)与钙黄绿素AM标记的靶肿瘤细胞在37℃下，在不同浓度的测试抗体存在下，按效应细胞：靶细胞的比例为1:3共同孵育30分钟(MKN45和SNU-C1)或2.5小时(LoVo和Ls174T)。在孵育期结束时，用完全培养基代替上清液，并用CellInsight^TMCX5高含量筛选平台对微孔板进行成像。每个孔采集并分析1500个巨噬细胞。吞噬作用被证明是双阳性事件(巨噬细胞+靶肿瘤细胞)，吞噬指数由CellInsight^TM制造商的软件计算。

图2和表5、6、7、8、9中所示的所有结果均来自4个表达CEACAM5的癌细胞系(MKN-45、SNU-C1、Ls174T、LoVo)；其中效应细胞与靶细胞/肿瘤细胞的比例为1:3。

表5.与双特异性抗体K2AC22相比，5种CEACAM5xCD47双特异性抗体评估的吞噬指数最大值增加的百分比

	CEACAM5水平	K2AC82	K2AC84	K2AC91	K2AC100	K2AC117
							MKN-45	155’000	6.1	1.8	4.6	1.8	0
SNU-C1	85’000	0	0	0	0	0
							Ls174T	26’000	8.7	14.4	20.6	14.4	11.2
LoVo	4’000	13.2	17	9.3	18.6	8.5

与K2AC22相比，根据本发明的所有五种双特异性抗体都显示出更好的结合(更低的EC50和更高的Emax，参见实施例6，表4)。令人惊讶的是，与K2AC22相比，本发明抗体的最大实现吞噬指数Emax ADCP的％增加在低表达CEACAM5的细胞系LoVo和Ls174T中最强。

这些结果是在使用从不同人类供体获得的巨噬细胞的实验中获得的。从这些实验中获得的数据如表6(针对MKN-45细胞)、表7(针对SNU-C1细胞)、图8(针对Ls174T细胞)和表9(针对LoVo细胞)所示。

表6.使用MKN-45人癌细胞系为靶标和7个不同供体(D)的巨噬细胞，体外评估6种CEACAM5xCD47双特异性抗体(K2AC82、K2AC84、K2AC61、K2AC100、K2AC217和K2AC22(比较))的吞噬活性的EC50(μg/mL)和E_max

表7.使用SNU-C1人癌细胞系为靶标和5个不同供体(D)的巨噬细胞，体外评估6种CEACAM5xCD47双特异性抗体(K2AC82、K2AC84、K2AC61、K2AC100、K2AC217和K2AC22)的吞噬活性的EC50和E_max

表8.使用来自5个不同供体的巨噬细胞，6种CD47xCEACAM5双特异性抗体对Ls174T人癌细胞系的吞噬活性的EC50和E_max

表9.使用来自6个不同供体的巨噬细胞，6种CD47xCEACAM5双特异性抗体对LoVo人癌细胞系的吞噬活性的EC50和E_max

/>

实施例8：本发明的双特异性抗体和结合CEACAM5的其他治疗性抗体之间对结合CEACAM5的竞争性测量

在实施例6中描述了对表达CEACAM5的细胞的结合测定。如果将CEAxCD3双特异性抗体(如赛必妥单抗或TCB2014)添加到结合测定中，则该测定可用于测量本发明的双特异性抗体与MKN-45和LS174T癌细胞系的结合曲线的偏移。如果300nM的抗体使本发明的双特异性抗体的结合曲线偏移小于3倍，则该抗体被认为是非竞争性的。

在本实验中，CD47xCEACAM5双特异性抗体K2AC100的浓度依赖性结合是在抗CEACAM5单克隆抗体TCB2014或TCB2017存在的情况下测量的。在表达CEACAM5的MKN-45细胞的细胞表面测量这种结合。用荧光染料直接标记K2AC100，以追踪其与单独的MKN-45细胞(深色线、深色圆圈)、在300nM的TCB2014(深色线、深色三角形)或30nM的TCB2017(深色线、黑色菱形)存在下的结合。使用阴性对照(Ctrl)(在TCB2014或TCB2017存在下的IgG1)。该实验的结果如图5所示。这些数据表明，如果添加300nM的TCB2014，则本发明的CEAxCD47双特异性抗体K2AC100与MKN-45肿瘤细胞的结合曲线没有或只有极小的偏移。因此，K2AC100抗体在CEACAM5结合方面与TCB2014和TCB2017抗体没有竞争性。

实施例9：本发明的非岩藻糖基化的双特异性抗体的产生

表10和11显示了本发明的双特异性抗体的非岩藻糖基化版本对两种细胞系(MKN-45和SNU-C1)的吞噬作用的结果(EC50和Emax)。本发明的双特异性抗体的非岩藻糖基化版本已经通过以下方法产生和纯化：

1.产生

用本发明各自的双特异性抗体的质粒转染的CHO池(对于各自的载体和质粒，参见实施例2)以0.3×10⁶个细胞/mL的活细胞浓度接种在工作体积为700mL或100mL的Thomsonerlen装置中，用于分别产生岩藻糖基化和非岩藻糖基化的抗体。使用CDACF培养基CDCHO和适应的饲养方法，所有池在15天持续时间的分批饲养模式下操作。为了产生非岩藻糖基化的抗体，在分批饲养过程中，根据Rillahan等人(Nature Chem.Biol.2012Jul；8(7):661-8)描述的非岩藻糖基化策略和基于EP2282773，在第0、5、8和11天添加200μM岩藻糖抑制剂(1,3,4-三-O-乙酰基-2-脱氧-2-氟-L-岩藻糖)的团剂。分批饲养培养15天后，进行本发明的双特异性抗体的汇合上清液的收获，该上清液含有岩藻糖基化或非岩藻糖基化的抗体。CHO汇合上清液的收获使用SartoclearLab V细胞收获Sartorius系统进行澄清(参见供应商说明)。

2.纯化

本发明岩藻糖基化和非岩藻糖基化的双特异性抗体的纯化是通过三步亲和纯化方法实现。在开始纯化之前，使用OctetRED96测量双特异性抗体汇合上清液中的抗体浓度，以便使用具有适当体积的亲和基质的柱。将每个含有岩藻糖基化或非岩藻糖基化双特异性抗体的澄清CHO汇合上清液上样到MabSelect SuRe(MSS)柱(GE Healthcare)上，无需事先调整，以去除大部分细胞培养污染物。然后通过低pH保持处理MSS洗脱液以灭活病毒，并在pH 6下用Tris 1M(pH9)中和。然后将MSS洗脱液上样到LambdaFabSelect(LFS)柱(GEHealthcare)上，以去除单特异性κ(monoκ)。然后将LFS洗脱液的pH调节至pH 6。将LFS上样到Capto L(CL)柱(GE Healthcare)上，以去除单特异性λ(monoλ)。CL洗脱液在储存前进行pH调节。然后将最终材料浓缩并渗滤到最终制剂缓冲液中，使用Nanodrop调节其浓度。等分岩藻糖基化和非岩藻糖基化的双特异性抗体，并在-80℃下储存，直至递送。使用制造商(Agilent Technologies,Santa Clara,Calif.,USA)描述的Protein 80试剂盒，用Agilent2100生物分析仪在变性和还原条件下通过电泳分析纯化的双特异性抗体的大小。使用ACQUITY UPLC H-Class生物系统(Waters)通过尺寸排阻色谱法(SEC-UPLC)评估聚集水平。纯化的双特异性抗体的电荷变体分析是通过使用Multiphor II电泳系统(GE Healthcare)的等电聚焦技术(IEF)实现的。使用LabChip GXII Touch(Perkin Elmer)上的通量微芯片CE方法测定岩藻糖基化和非岩藻糖基化K2AC5和K2AC22抗体的N-连接复合物双线糖型(biantennary glycoforms)的相对分布。使用鲎变形细胞溶解物试验(LAL；Charles RiverLaboratories,Wilmington,Mass.)对所有抗体进行内毒素污染测试。本发明的非岩藻糖基化(afuc)双特异性抗体显示出>70％的非岩藻糖基化。

这些非岩藻糖基化的CEAxCD47双特异性抗体已用于获得表10和11以及图3A和3B所示的结果。

3.产生本发明的非岩藻糖基化双特异性抗体的其他方法

3.1通过使用FUT8阴性生产细胞系

备选地，根据本发明人所知，根据本发明的非岩藻糖基化双特异性抗体也可以根据如下方法产生：

材料和方法根据Naoko Yamane-Ohnuki等,Biotech.Bioeng.；87(2004)614-622所述。

中国仓鼠FUT8cDNA的分离

根据本发明人所知，使用Mini试剂盒(Qiagen，Hilden，Germany)从CHO/DG44细胞中分离总RNA，并使用用于逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)的Superscript第一链合成系统(Invitrogen，Carlsbad，CA)用寡聚dT逆转录。利用以下引物，通过PCR从单链CHO/DG44细胞cDNA中扩增出中国仓鼠FUT8 cDNA：

5V-GTCTGAAGCATTATGTGTTGAAGC-3V(SEQ ID NO:45)和

5V-GTGAGTACATTCATTGTACTGTG-3V(SEQ ID NO:46)，该引物由鼠FUT8 cDNA设计(Hayashi,2000；DNA Seq 11:91–96)。

FUT8基因座的靶向构建

根据本发明人所知，CHO/DG44细胞中FUT8基因的靶向破坏是使用两种替代载体pKOFUT8Neo和pKOFUT8Puro进行的。通过用中国仓鼠FUT8 cDNA作为探针筛选CHO-K1细胞E基因组文库(Stratagene，La Jolla，CA)来分离包括第一个编码外显子的FUT8基因的9.0-kb片段，以建立靶向构建体。含有翻译起点的234-bp片段分别被来自质粒pKOSelectNeo或pKOSelectPuro(Lexicon，TX)的新霉素抗性基因(Neor)盒或嘌呤霉素抗性基因(Puror)盒取代，两侧为loxP位点。将来自质粒pKOSelectDT(Lexicon)的白喉毒素基因(DT)盒插入5V同源区。得到的靶向构建体pKOFUT8Neo和pKOFUT7Puro包括1.5-kb的5V同源序列和5.3-kb的3V同源序列。在转染之前，将靶向构建体在独特的SalI位点线性化。

同源重组体的转染和筛选

根据本发明人所知，使用Bio-RadII在350V和250AF下用4Ag的线性化pKOFUT8Neo电穿孔亚汇合CHO/DG44细胞(1.6 106)。电穿孔后，用600Ag/mL G418(Nacalai Tesque，Kyoto，Japan)选择转染子。基因组PCR通过先前报道的改进的微提取方法在96孔板中进行(Ramirez-Solis等，1992；Anal Biochem 201:331-335.)，使用以下引物：

5V-TTGTGTGACTCTTAACTCTCAGAG-3V(SEQ ID NO:47)和

5V-GAGGCCACTTGTGTAGCGCCAAGTG-3V(SEQ ID NO:48)。

同源重组体通过使用基因组PCR获得的1.7-kb片段进行鉴定，并通过使用以下引物扩增的221-bp片段的Southern印迹分析进行确认：

5V-GTGAGTCCATGGCTGTCACTG-3V(SEQ ID NO:49)和

5V-CCTGACTTGGCTATTCTCAG-3V(SEQ ID NO:50)。

如前所述，使用线性化的pKOFUT8Puro和用15Ag/mL嘌呤霉素(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)的药物选择对半合子克隆进行第二轮同源重组。用Cre重组酶表达载体pBS185(Invitrogen)对鉴定的纯合干扰物进行电穿孔，以从两个FUT8等位基因中去除耐药基因盒。

由FUT8(-)细胞产生单克隆抗体

根据本发明人所知，用编码根据本发明的双特异性抗体的表达载体电穿孔FUT8(-)细胞系，并在缺乏次黄嘌呤和胸腺嘧啶的培养基中选择。将汇合的转染子在301培养基(JRH Biosciences，Lenexa，KS)中培养1周。使用MabSelect^TM(AmershamBiosciences,Piscataway,NJ)从培养上清液中纯化抗体。进一步的纯化步骤可以是阴离子/阳离子交换色谱、尺寸排阻色谱，尤其是使用如上所述的κλ选择性树脂分别进行纯化。

3.2通过从生产细胞培养基中回收细胞外岩藻糖加上酶促干预细胞内岩藻糖生物合成

优选地，根据本发明人所知，本发明的非岩藻糖基化双特异性抗体也可以根据如下和US8642292中所述的方法/技术产生。该技术旨在将异源细菌酶稳定整合到抗体生产细胞系中，如CHO细胞系或其他细胞系。由此，从D-甘露糖从头合成岩藻糖被阻断。此外，如果在不含岩藻糖的培养基中培养生产细胞，则产生具有稳定水平的非岩藻糖基化的抗体。

在真核细胞中，岩藻糖通过两种途径产生，

a)通过补救途径从细胞外空间或溶酶体产生，和

b)通过在岩藻糖的从头合成途径中从D-甘露糖从头合成岩藻糖。

通过从培养基中去除岩藻糖，可以完全阻断补救途径。可以通过将该途径的中间体GDP-4-酮基-6-脱氧-D-甘露糖转化为GDP-D-鼠李糖而不是GDP-4-酮基-6-脱氧-D半乳糖来阻断从头生物合成途径。这是分别通过将细菌酶GDP-6-脱氧-D-lyxo-4-己酮糖还原酶(RMD)引入生产细胞系、通过将编码RMD的基因稳定整合到生产细胞系中来实现的。即使在生产细胞系中表达的相当低量的RMD也完全阻断了生产细胞的从头合成途径。

该技术将用于构建生产细胞系，例如基于CHO的细胞系，其被设计用于产生本发明的非岩藻糖基化抗体，以及用于已经产生本发明抗体并被改造用于产生岩藻糖含量降低80％至100％的抗体的现有生产细胞系。

图3A和3B以及表10和11中所示的所有结果都是用两个表达CEACAM5的癌细胞系(MKN-45和SNU-C1)获得的；其中效应细胞与靶细胞/肿瘤细胞的比例为1:3。这些结果是在使用从三个不同的人类供体获得的巨噬细胞的实验中获得的。从该实验获得的数据显示在表10(对于MKN-45细胞)和表11(对于SNU-C1细胞)中。

表10.使用MKN45人癌细胞系为靶标和2个不同供体(D)的巨噬细胞，体外评估6种非岩藻糖基化CEACAM5xCD47双特异性抗体(K2AC82非岩藻糖基化、K2AC84非岩藻糖基化、K2AC61非岩藻糖基化的、K2AC100非岩藻糖基化的、K2AC217非岩藻糖基化的和K2AC22非岩藻糖基化的(比较))的吞噬活性的EC50(μg/mL)和E_max(最大吞噬指数)

/>

表11.使用SNU-C1人癌细胞系为靶标和2个不同供体(D)的巨噬细胞，体外评估6种非岩藻糖基化CEACAM5xCD47双特异性抗体(K2AC82非岩藻糖基化的、K2AC84非岩藻糖基化的、K2AC61非岩藻糖基化的、K2AC100非岩藻糖基化的、K2AC217非岩藻糖基化的和K2AC22非岩藻糖基化的(比较))的吞噬活性的EC50(μg/mL)和E_max

实施例10：阻断SIRPα与肿瘤细胞上CD47的相互作用

用于测量本发明双特异性抗体的SIRPα抑制效力(IC50)的实验设置：

如下所述，监测可溶性SIRPα与在MKN-45细胞表面表达的人CD47的相互作用的基于细胞的测定用于检测阻断活性。根据本发明的双特异性抗体的浓度反应实验允许测定抑制曲线(见图4)和IC50值(见表12)。

表达CD47和CEACAM5二者的MKN-45癌症细胞用CFSE紫染色，以允许成像系统(CX5)检测所述细胞。简言之，将每个孔3000个染色的MKN-45细胞接种在384光学孔板(Costar)中，并与浓度增加的本发明双特异性抗体(1.9pM至333nM，一式四份)一起孵育50分钟。然后，加入固定浓度的与抗小鼠IgG-Fc AF647偶联抗体(Jackson Immunoresearch，1:2000稀释)预混合的SIRPα-小鼠Fc，最终浓度为50ng/mL。孵育3小时30分钟后，用成像系统(CX5，Thermo Fisher)采集由平板上检测到的结合SIRPα发出的荧光信号图像。根据测试的剂量范围绘制荧光信号(平均荧光强度MFI)，并通过软件(Prism，GraphPad)计算IC50。结果如表12所示。

表12.与现有技术的双特异性CEAxCD47抗体K2AC22(使用MKN-45作为hCD47表达细胞)相比，用CD47/SIRPα阻断测定测得本发明的5种CEACAM5xCD47双特异性抗体(K2AC82、K2AC84、K2AC91、K2AC100和K2AC117)的IC50(nM)

抗体名称	SIRPα抑制效力(nM)^#
		K2AC22	1.2
K2AC82	0.07
		K2AC84	0.04
K2AC91	0.05
		K2AC100	0.09
K2AC117	0.08

实施例11：通过类器官步骤a.从来自癌症患者的新鲜样本中获得癌细胞中CEACAM5的表达(Qifikit数据)和b.获得吞噬作用数据

通过标准方法(酶消化和/或机械解离)将源自患者原始样品的类器官制备为单细胞悬浮液。10μL抗人CEACAM5一级抗体(#sc-23928；mIgG1(Santa Cruz)；最终浓度20μg/mL)加入细胞中，并在4℃下孵育30分钟。对细胞进行洗涤和离心。将100μL珠子(来自的设置或校准)与细胞一起洗涤，并进行相同处理。将试剂盒中的100μL二级抗体(1/50，PBS BSA 2％)加入每个孔中，并在4℃下孵育30至45分钟。将细胞离心以丢弃上清液，并洗涤两次。最后一次离心后，将细胞重悬并在细胞计数器上捕获。使用特定软件进行分析，将几何平均值导出到Excel文件中。使用来自校准珠的MFI值进行线性回归。从该回归线推断出细胞的抗体结合能力(ABC)。特异性抗体结合能力(sABC)是通过将同种型对照的ABC减去特异性染色的ABC而获得的。

已发现这些初级类器官的CEACAM5的平均表达为每个细胞28000个CEACAM5靶标，即比表5中细胞系上的平均表达低约4倍。

如果添加本发明的双特异性抗体和来自人类供体的巨噬细胞，则来自癌症患者原始样品的类器官也可用于研究浓度依赖性吞噬作用/吞噬指数(参见实施例7)。根据本发明人所知，通过使用相同的方法，如果还加入来自人类供体的T细胞，也可以研究本发明的双特异性抗体与CEAxCD3双特异性抗体的组合。

实施例12：抗肿瘤活性：组织切片培养

根据本发明人所知，根据本发明的双特异性抗体的抗肿瘤活性可分别在来自诊断患有表达CEA的肿瘤的患者的肿瘤组织切片培养物(参见等,ClinicalColorectal Cancer 2018)中作为单剂和组合治疗进行评估。

1.组织切片培养和处理

新鲜肿瘤组织样本按照之前公开的方法进行切割和处理(等,Clinical Colorectal Cancer 2018)。简言之，在手术切除和第一次宏观病理评估后，立即使用组织切割器将肿瘤样品切成350μm的切片。然后使用3毫米取芯工具对组织切片直径进行标准化。将三个组织切片随机合并，放置在膜插入物上，并在6孔板中培养。切片在37℃和5％CO2的标准条件下孵育。在标准细胞培养基中预培养后，将切片三元组分别暴露于单独或组合(例如与PD-L1抑制剂)的本发明的双特异性抗体长达120小时。在化合物暴露后，使用4％多聚甲醛将肿瘤切片固定过夜。

2.染色

将多聚甲醛固定切片包埋在石蜡中，并加工成5-μm的切片。苏木精和曙红(HE)染色用于评估组织病理学方面和肿瘤细胞比例。通过免疫荧光染色分析总细胞计数、肿瘤细胞计数和增殖。简言之，将石蜡切片脱蜡。抗原回收后，用0.3％PBS/TritonX洗涤切片，并用5％正常山羊血清封闭30分钟。分别在0.5％胎牛血清白蛋白中稀释针对细胞角蛋白Ki67和裂解的PARP的一级抗体，并在4℃下孵育过夜。切片用0.3％磷酸盐缓冲盐水/TritonX冲洗，并用二级抗体标记。细胞核用Hoechst 33342染色。可以包括额外的染色(例如用于CEA表达)。

3.数据分析

使用荧光显微镜从荧光染色的切片中拍摄每个组织切片的五张照片(20x)。使用染色特异性分割算法确定Hoechst 33342、细胞角蛋白、Ki67和裂解的PARP染色的正像素计数。通过分析被细胞角蛋白正像素包围的Ki67/裂解的PARP阳性细胞核的像素来计算增殖/凋亡肿瘤面积。对于每张照片，计算总细胞计数(Hoechst阳性)、肿瘤细胞计数(Hoechst和细胞角蛋白阳性)和增殖肿瘤细胞数(Hoechst、细胞角蛋白和Ki67阳性/裂解的PARP)。将肿瘤细胞计数针对总细胞计数标准化，并将增殖肿瘤细胞计数针对肿瘤细胞计数标准化，以考虑每张照片的不同肿瘤细胞级分。然后根据单个图像值计算平均切片值。使用平均切片值计算条件的平均值。

实施例13：体内抗肿瘤活性

根据本发明人所知，根据本发明的双特异性抗体的抗肿瘤活性可以在转基因小鼠中分别作为单剂和组合治疗来评估。

1.细胞系生成和生长测试

产生例如基于鼠结肠癌细胞系CT26或MC38的hCEACAM5(Tg)hCD47(Tg)mCD47(ko)细胞系。内源性小鼠CD47基因的敲除(KO)通过使用CRISPR/Cas9进行，随后通过细胞分选分离KO克隆。使用内部核糖体进入位点(IRES)用驱动hCD47和hCEACAM5表达的盒转染KO克隆，然后基于例如总表达水平和比率分离工程化克隆。将选择三个经过验证的克隆，随后在体内测试其植入性/致瘤性，以选择最终的克隆。

2.体内抗肿瘤活性

表达人CD3e的BALB/cJGpt背景的小鼠品系(T001550杂合BALB/c-hCD3ET/Wt小鼠)和表达人CD47/人SIRPα的BALB/cJGpt背景的小鼠品系(T037264纯合BALB/c-hCD47/hSIRPα小鼠)可在GemPharmacech获得。备选地，表达人CD3e的C57BL/6/Bcgen背景的小鼠品系(纯合B-hCD3E小鼠)和表达人CD47/人SIRPα的C57BL/6/Bcgen背景的小鼠品系(纯合B-hSIRPα/hCD47小鼠)可在Biocytogen获得。将这两种小鼠品系杂交以获得三重人源化hCD3e/hSIRPa/hCD47小鼠，以及用于后续实验的后代，以测试作为单一试剂或组合治疗的根据本发明的双特异性抗体。

三重人源化hCD3e/hSIRPa/hCD47小鼠在第0天用CT26-hCEACAM5(Tg)hCD47(Tg)mCD47(ko)细胞系(BALB/c背景)或MC38-hCEACAM5(Tg)hCD47(Tg)mCD47(ko)细胞系(C57BL/6背景)接种。一旦群体中的平均肿瘤大小达到例如200mm³，开始治疗：使用根据本发明的双特异性抗体作为单剂以及组合，以例如2次治疗/周的间隔以静脉内推注的方式，直到一只小鼠显示出例如超过3000mm³的肿瘤体积或发生任何一个或多个预先指定的动物保护和护理终点。肿瘤体积和体重每周测量三次。肿瘤体积以mm³为单位，使用以下公式：TV＝0.5a×b2，其中a和b分别是肿瘤的长直径和短直径。

序列表

<110> 拉姆卡普生物测试有限公司

BUATOIS, VANESSA

HOSE, DIRK

SECKINGER, ANJA

<120> 抗CEACAM5和CD47的双特异性抗体

<130> 4130.005PC03

<150> US 63/135,996

<151> 2021-01-11

<150> EP 20215766

<151> 2020-12-18

<160> 50

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 共同重链CDRH1

<400> 1

Ser Tyr Ala Met Ser

1 5

<210> 2

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 共同重链CDRH2

<400> 2

Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 3

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 共同重链CDRH3

<400> 3

Ser Tyr Gly Ala Phe Asp Tyr

1 5

<210> 4

<211> 116

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 共同重链VH

<400> 4

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Ser Tyr Gly Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 5

<211> 229

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 共同重链(VH-CH1)

<400> 5

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Ser Tyr Gly Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala

115 120 125

Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu

130 135 140

Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly

145 150 155 160

Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser

165 170 175

Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu

180 185 190

Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr

195 200 205

Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr

210 215 220

Cys Pro Pro Cys Pro

225

<210> 6

<211> 445

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 共同重链(VH-CH1-CH2-CH3)

<400> 6

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Ser Tyr Gly Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala

115 120 125

Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu

130 135 140

Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly

145 150 155 160

Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser

165 170 175

Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu

180 185 190

Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr

195 200 205

Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr

210 215 220

Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe

225 230 235 240

Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro

245 250 255

Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val

260 265 270

Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr

275 280 285

Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val

290 295 300

Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys

305 310 315 320

Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser

325 330 335

Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro

340 345 350

Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val

355 360 365

Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly

370 375 380

Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp

385 390 395 400

Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp

405 410 415

Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His

420 425 430

Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

435 440 445

<210> 7

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD47结合部分CDRL1

<400> 7

Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn

1 5 10

<210> 8

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD47结合部分CDRL2

<400> 8

Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser

1 5

<210> 9

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD47结合部分CDRL3

<400> 9

Gln Gln Met His Pro Arg Ala Pro Lys Thr

1 5 10

<210> 10

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD47结合部分VK

<400> 10

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Met His Pro Arg Ala Pro

85 90 95

Lys Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 11

<211> 215

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD47结合部分轻链(VKCK; K2)

<400> 11

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Met His Pro Arg Ala Pro

85 90 95

Lys Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala

100 105 110

Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser

115 120 125

Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu

130 135 140

Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser

145 150 155 160

Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu

165 170 175

Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val

180 185 190

Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys

195 200 205

Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 12

<211> 648

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CD47结合部分轻链(VKCK; 核酸); (K2)

<400> 12

gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60

atcacttgcc gggcaagtca gagcattagc agctatttaa attggtatca gcagaaacca 120

gggaaagccc ctaagctcct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180

aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240

gaagattttg caacttacta ctgtcagcag atgcacccgc gcgccccgaa gaccttcggc 300

caagggacca aggtggaaat caaacgtacg gtggctgcac catctgtctt catcttcccg 360

ccatctgatg agcagttgaa atctggaact gcctctgttg tgtgcctgct gaataacttc 420

tatcccagag aggccaaagt acagtggaag gtggataacg ccctccaatc gggtaactcc 480

caggagagtg tcacagagca ggacagcaag gacagcacct acagcctcag cagcaccctg 540

acgctgagca aagcagacta cgagaaacac aaagtctacg cctgcgaagt cacccatcag 600

ggcctgagct cgcccgtcac aaagagcttc aacaggggag agtgttaa 648

<210> 13

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD47结合部分恒定轻链kappa (CK)

<400> 13

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

1 5 10 15

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

20 25 30

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

35 40 45

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

50 55 60

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

65 70 75 80

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

85 90 95

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

100 105

<210> 14

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CEACAM5结合部分AC82 CDRL1;

<400> 14

Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Tyr Gly Leu Val Ser

1 5 10

<210> 15

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CEACAM5结合部分AC82 CDRL2

<400> 15

Gly Ile Asn Lys Arg Pro Ser

1 5

<210> 16

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CEACAM5结合部分AC82 CDRL3

<400> 16

Gly Thr Trp Asp Phe Ser Tyr Arg Val Asp

1 5 10

<210> 17

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CEACAM5结合部分AC84 CDRL1

<400> 17

Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ile Gly Leu Val Ser

1 5 10

<210> 18

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CEACAM5结合部分AC84 CDRL2

<400> 18

Asn Val Asn Thr Arg Pro Ser

1 5

<210> 19

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CEACAM5结合部分AC84 CDRL3

<400> 19

Gly Thr Trp Asp Phe Ser Tyr Arg Val Asp

1 5 10

<210> 20

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CEACAM5结合部分AC91 CDRL1

<400> 20

Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ile Gly Leu Val Ser

1 5 10

<210> 21

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CEACAM5结合部分AC91 CDRL2

<400> 21

Thr Val Asn Asn Arg Pro Ser

1 5

<210> 22

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CEACAM5结合部分AC91 CDRL3

<400> 22

Gly Thr Phe Asp Phe Ser Tyr Gly Ile Val

1 5 10

<210> 23

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CEACAM5结合部分AC100 CDRL1

<400> 23

Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Tyr Gly Leu Val Ser

1 5 10

<210> 24

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CEACAM5结合部分AC100 CDRL2

<400> 24

Asn Gly Asn Ile Arg Pro Ser

1 5

<210> 25

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CEACAM5结合部分AC100 CDRL3

<400> 25

Gly Thr Trp Asp Phe Ser Tyr Arg Val Asp

1 5 10

<210> 26

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CEACAM5结合部分AC117 CDRL1

<400> 26

Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ile Gly Leu Val Ser

1 5 10

<210> 27

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CEACAM5结合部分AC117 CDRL2

<400> 27

Asn Gly Asn Val Arg Pro Ser

1 5

<210> 28

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CEACAM5结合部分AC117 CDRL3

<400> 28

Gly Thr Trp Asp Phe Ser Tyr Arg Val Asp

1 5 10

<210> 29

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CEACAM5结合部分AC22 CDRL1

<400> 29

Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Ala Asn Gly Ile Val Ser

1 5 10

<210> 30

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CEACAM5结合部分AC22 CDRL2

<400> 30

Phe Asp Asn Leu Arg Pro Ser

1 5

<210> 31

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CEACAM5结合部分AC22 CDRL3

<400> 31

Gly Thr Trp Asp Phe Ser Tyr Gly Ile Val

1 5 10

<210> 32

<211> 109

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CEACAM5结合部分AC82 VL

<400> 32

Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Gln

1 5 10 15

Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Tyr Gly

20 25 30

Leu Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Gly Ile Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Thr Leu Gly Ile Thr Gly Leu Gln

65 70 75 80

Thr Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Phe Ser Tyr

85 90 95

Arg Val Asp Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105

<210> 33

<211> 109

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CEACAM5结合部分AC84 VL

<400> 33

Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Gln

1 5 10 15

Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ile Gly

20 25 30

Leu Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Asn Val Asn Thr Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Thr Leu Gly Ile Thr Gly Leu Gln

65 70 75 80

Thr Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Phe Ser Tyr

85 90 95

Arg Val Asp Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105

<210> 34

<211> 109

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CEACAM5结合部分AC91 VL

<400> 34

Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Gln

1 5 10 15

Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ile Gly

20 25 30

Leu Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Thr Val Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Thr Leu Gly Ile Thr Gly Leu Gln

65 70 75 80

Thr Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Phe Asp Phe Ser Tyr

85 90 95

Gly Ile Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105

<210> 35

<211> 109

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CEACAM5结合部分AC100 VL

<400> 35

Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Gln

1 5 10 15

Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Tyr Gly

20 25 30

Leu Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Asn Gly Asn Ile Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Thr Leu Gly Ile Thr Gly Leu Gln

65 70 75 80

Thr Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Phe Ser Tyr

85 90 95

Arg Val Asp Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105

<210> 36

<211> 109

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CEACAM5结合部分AC117 VL

<400> 36

Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Gln

1 5 10 15

Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ile Gly

20 25 30

Leu Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Asn Gly Asn Val Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Thr Leu Gly Ile Thr Gly Leu Gln

65 70 75 80

Thr Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Phe Ser Tyr

85 90 95

Arg Val Asp Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105

<210> 37

<211> 215

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CEACAM5结合部分AC82 VLCL

<400> 37

Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Gln

1 5 10 15

Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Tyr Gly

20 25 30

Leu Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Gly Ile Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Thr Leu Gly Ile Thr Gly Leu Gln

65 70 75 80

Thr Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Phe Ser Tyr

85 90 95

Arg Val Asp Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro

100 105 110

Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu

115 120 125

Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro

130 135 140

Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala

145 150 155 160

Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala

165 170 175

Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg

180 185 190

Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr

195 200 205

Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser

210 215

<210> 38

<211> 215

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CEACAM5结合部分AC84 VLCL

<400> 38

Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Gln

1 5 10 15

Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ile Gly

20 25 30

Leu Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Asn Val Asn Thr Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Thr Leu Gly Ile Thr Gly Leu Gln

65 70 75 80

Thr Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Phe Ser Tyr

85 90 95

Arg Val Asp Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro

100 105 110

Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu

115 120 125

Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro

130 135 140

Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala

145 150 155 160

Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala

165 170 175

Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg

180 185 190

Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr

195 200 205

Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser

210 215

<210> 39

<211> 215

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CEACAM5结合部分AC91 VLCL

<400> 39

Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Gln

1 5 10 15

Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ile Gly

20 25 30

Leu Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Thr Val Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Thr Leu Gly Ile Thr Gly Leu Gln

65 70 75 80

Thr Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Phe Asp Phe Ser Tyr

85 90 95

Gly Ile Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro

100 105 110

Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu

115 120 125

Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro

130 135 140

Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala

145 150 155 160

Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala

165 170 175

Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg

180 185 190

Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr

195 200 205

Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser

210 215

<210> 40

<211> 215

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CEACAM5结合部分AC100 VLCL

<400> 40

Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Gln

1 5 10 15

Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Tyr Gly

20 25 30

Leu Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Asn Gly Asn Ile Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Thr Leu Gly Ile Thr Gly Leu Gln

65 70 75 80

Thr Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Phe Ser Tyr

85 90 95

Arg Val Asp Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro

100 105 110

Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu

115 120 125

Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro

130 135 140

Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala

145 150 155 160

Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala

165 170 175

Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg

180 185 190

Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr

195 200 205

Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser

210 215

<210> 41

<211> 215

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CEACAM5结合部分AC117 VLCL

<400> 41

Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Gln

1 5 10 15

Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ile Gly

20 25 30

Leu Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Asn Gly Asn Val Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Thr Leu Gly Ile Thr Gly Leu Gln

65 70 75 80

Thr Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Phe Ser Tyr

85 90 95

Arg Val Asp Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro

100 105 110

Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu

115 120 125

Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro

130 135 140

Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala

145 150 155 160

Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala

165 170 175

Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg

180 185 190

Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr

195 200 205

Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser

210 215

<210> 42

<211> 215

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CEACAM5结合部分AC22 VLCL

<400> 42

Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Gln

1 5 10 15

Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Ala Asn Gly

20 25 30

Ile Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Phe Asp Asn Leu Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Thr Leu Gly Ile Thr Gly Leu Gln

65 70 75 80

Thr Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Phe Ser Tyr

85 90 95

Gly Ile Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro

100 105 110

Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu

115 120 125

Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro

130 135 140

Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala

145 150 155 160

Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala

165 170 175

Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg

180 185 190

Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr

195 200 205

Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser

210 215

<210> 43

<211> 106

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VK_SM3E

<400> 43

Glu Asn Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Ser Val Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Asn Ile Ala Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Pro Tyr Met

20 25 30

His Trp Leu Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr

35 40 45

Leu Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Pro Glu

65 70 75 80

Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Ser Tyr Pro Leu Thr

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 44

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VH_SM3E

<400> 44

Gln Val Lys Leu Glu Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Ser

20 25 30

Tyr Met His Trp Leu Arg Gln Gly Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Trp Ile Asp Pro Glu Asn Gly Asp Thr Glu Tyr Ala Pro Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Lys Ala Thr Phe Thr Thr Asp Thr Ser Ala Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gly Leu Ser Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Asn Glu Gly Thr Pro Thr Gly Pro Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 45

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 45

gtctgaagca ttatgtgttg aagc 24

<210> 46

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 46

gtgagtacat tcattgtact gtg 23

<210> 47

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 47

ttgtgtgact cttaactctc agag 24

<210> 48

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 48

gaggccactt gtgtagcgcc aagtg 25

<210> 49

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 49

gtgagtccat ggctgtcact g 21

<210> 50

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 50

cctgacttgg ctattctcag 20

Claims

a)所述第一结合部分包含含有SEQ ID NO:1的CDRH1、SEQ ID NO:2的CDRH2和SEQ IDNO:3的CDRH3的重链可变区作为重链可变区，

b1)SEQ ID NO:14的CDRL1、SEQ ID NO:15的CDRL2和SEQ ID NO:16的CDRL3，或

b2)SEQ ID NO:17的CDRL1、SEQ ID NO:18的CDRL2和SEQ ID NO:19的CDRL3，

b3)SEQ ID NO:20的CDRL1、SEQ ID NO:21的CDRL2和SEQ ID NO:22的CDRL3，

b4)SEQ ID NO:23的CDRL1、SEQ ID NO:24的CDRL2和SEQ ID NO:25的CDRL3，和

b5)SEQ ID NO:26的CDRL1、SEQ ID NO:27的CDRL2和SEQ ID NO:28的CDRL3，

c)所述第二结合部分包含含有SEQ ID NO:1的CDRH1、SEQ ID NO:2的CDRH2和SEQ IDNO:3的CDRH3的重链可变区作为重链可变区，

2.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其特征在于：在所述第一结合部分中包含SEQID NO:4的可变重链区作为可变重链区和选自SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36的可变轻链区作为可变轻链区，并且在所述第二结合部分中包含SEQ ID NO:4的可变重链区作为可变重链区和具有SEQ ID NO:10的可变轻链区作为可变轻链区。

3.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其特征在于：在第一结合部分中包含含有SEQID NO:5的重链和选自SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40和SEQID NO:41的轻链，并且在第二结合部分中包含SEQ ID NO:5的重链区和具有SEQ ID NO:11的轻链。

4.根据前述权利要求中任一项所述的双特异性抗体，其特征在于：包含SEQ ID NO:6的共同重链作为重链。

5.根据前述权利要求中任一项所述的双特异性抗体，其中所述抗体对所述第一结合部分为单价，并且对所述第二结合部分为单价。

6.根据前述权利要求中任一项所述的双特异性抗体，其中恒定和可变框架区序列是人类的。

7.根据前述权利要求中任一项所述的双特异性抗体，其中所述第一结合部分的轻链是λ轻链(VLCL)，并且所述第二结合部分的轻链是κ轻链(VKCK)。

8.根据前述权利要求中任一项所述的双特异性抗体，其中所述抗体是人IgG1型。

9.根据前述权利要求中任一项所述的双特异性抗体，其中所述抗体包含Fc区，所述Fc区已被糖工程化，以与未被糖工程化的相同的双特性抗体相比具有减少数量的岩藻糖残基。

10.根据前述权利要求中任一项所述的双特异性抗体，其特征在于：所述双特异性抗体与抗CEACAM5抗体SM3E竞争结合CEACAM5，所述SM3E包含SEQ ID NO:43和44的可变轻链区和可变重链区。

11.根据前述权利要求中任一项所述的双特异性抗体，其特征在于：以2至10nM的结合亲和力(KD)结合重组人CEACAM5。

12.根据前述权利要求中任一项所述的双特异性抗体，其特征在于：以100nM至600nM的结合亲和力结合人重组CD47。

13.根据前述权利要求中任一项所述的双特异性抗体，其特征在于：与重组CEACAM3结合的KD值和与重组CEACAM5结合的KD值的比率为100或更大。

14.根据权利要求13所述的双特异性抗体，其特征在于：与重组CEACAM3结合的KD值和与重组CEACAM5结合的KD值的比率为100至200。

15.根据前述权利要求中任一项所述的双特异性抗体，其特征在于：LoVo肿瘤细胞的吞噬指数最大值与双特异性抗体K2AC22的吞噬指数相比增加至少8％。

16.根据权利要求15所述的双特异性抗体，其特征在于：LoVo肿瘤细胞的吞噬指数最大值增加8％至20％。

17.根据前述权利要求中任一项所述的双特异性抗体，其特征在于：Ls174T肿瘤细胞的吞噬指数最大值与K2AC22的吞噬指数相比增加至少8％。

18.根据权利要求17所述的双特异性抗体，其特征在于：Ls174T肿瘤细胞的吞噬指数最大值增加8％至25％。

19.根据前述权利要求中任一项所述的双特异性抗体，其特征在于：抑制MKN-45细胞上CD47和SIRPα之间的相互作用的IC50比在相同实验条件下对K2AC22测量的IC50低10倍或更多。

20.根据权利要求19所述的双特异性抗体，其特征在于：以低10至30倍的IC50抑制MKN-45细胞上CD47和SIRPα之间的相互作用。

21.根据前述权利要求中任一项所述的双特异性抗体，其特征在于：以0.1nM或更低的IC50抑制MKN-45细胞上CD47和SIRPα之间的相互作用。

22.根据权利要求21所述的双特异性抗体，其特征在于：以0.1nM至0.04nM的IC50抑制MKN-45细胞上CD47和SIRPα之间的相互作用。

23.根据前述权利要求中任一项所述的双特异性抗体，其特征在于：不与赛必妥单抗竞争结合CEACAM5。

24.根据前述权利要求中任一项所述的双特异性抗体，其中所述第一双特异性抗体的特征在于，与人CEACAM5和CD3ε结合的第二双特异性抗体在300nM的浓度不会使第一双特异性抗体与MKN-45细胞或LS174T细胞的结合曲线的EC50向更高浓度偏移超过3倍。

25.根据权利要求24所述的双特异性抗体，其中所述第二双特异性抗体是TCB2014或赛必妥单抗。

26.一种分离的多核苷酸或一组多核苷酸，所述多核苷酸编码根据前述权利要求中任一项所述的双特异性抗体。

27.一种包含权利要求26所述的一种或多种多核苷酸的表达载体。

28.一种包含权利要求27所述的表达载体的宿主细胞。

29.产生根据权利要求1-25中任一项所述的双特异性抗体的方法，所述方法包括：a)在允许产生所述双特异性抗体的条件下培养权利要求28所述的宿主细胞，和b)分离所述抗体。

30.根据权利要求1-25中任一项所述的双特异性抗体，其用于治疗人类癌症。

31.根据权利要求30所使用的双特异性抗体，其特征在于：所述癌症是实体癌。

32.根据权利要求30所使用的双特异性抗体，其特征在于：所述癌症是结直肠癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、胃癌、胰腺癌、乳腺癌或表达CEACAM5的另一种癌症。

33.根据权利要求1-25中任一项所述的双特异性抗体，其用于制备治疗患有表达CEACAM5的癌症的受试者的药物。

34.根据权利要求1-25中任一项所述的双特异性抗体，其与第二双特异性抗体同时、单独或顺序组合用于治疗患有表达CEACAM5的癌症的受试者，所述第二双特异性抗体包含与人CEACAM5特异性结合的第三结合部分和与人CD3ε特异性结合的第四结合部分。

35.根据权利要求1-25中任一项所述的双特异性抗体，其与第二双特异性抗体同时、分离或顺序组合使用，其中所述第二双特异性抗体是TCB2014或赛必妥单抗。

36.根据权利要求34或35所使用的双特异性抗体，其特征在于：以6至15天的间隔将根据本发明的双特性抗体和第二双特异性抗体同时施用于所述受试者。

37.一种药物组合物，其包含权利要求1-25中任一项所述的双特异性抗体和药学上可接受的赋形剂或载剂。

38.根据权利要求37所述的药物组合物，其用作药物。

39.根据权利要求37或权利要求38所述的药物组合物，其用作治疗实体癌的药物。

40.根据权利要求37-39中任一项所述的药物组合物，其用作治疗结直肠癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、胃癌、胰腺癌或乳腺癌的药物。

41.一种治疗患有表达CEACAM5的癌症的受试者的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的权利要求1-25中任一项所述的双特异性抗体或权利要求37-40中任一项所述的药物组合物。

42.根据权利要求41所述的方法，其中所述癌症是人类癌症。

43.根据权利要求41或42所述的方法，其中所述受试者是患者。

44.根据权利要求41-43中任一项所述的方法，其特征在于：所述癌症是结直肠癌细胞、非小细胞肺癌(NSCLC)细胞、胃癌细胞、胰腺癌细胞、乳腺癌细胞或表达CEACAM5的另一肿瘤细胞。

45.根据权利要求41-44中任一项所述的方法，其中所述双特异性抗体与化学疗法或放射疗法组合施用。

46.一种治疗患有肿瘤的人类患者的方法，其包括施用有效量的权利要求1-25中任一项所述的CEACAM5 x CD47双特异性抗体和抗CEACAM5和CD3的第二双特异性抗体。

47.根据权利要求46所述的方法，其中所述CEACAM5 x CD47双特异性抗体与CEACAM5和CD3抗体不是竞争性的。

48.根据权利要求46或47所述的方法，其中所述抗体是同时施用的。

49.根据权利要求41-48中任一项所述的方法，其中向所述患者施用一个或多个剂量的0.01至10mg/kg的权利要求1-25中任一项所述的双特异性抗体。

50.根据权利要求46-48中任一项所述的方法，其中向所述患者施用一个或多个剂量的0.01至10mg/kg的CEACAM5 x CD3双特异性抗体和一个或多个剂量的1至20mg/kg的CEACAM5x CD47双特异性抗体。

51.根据权利要求46-50中任一项所述的方法，其中所述第二抗体是TCB2014或赛必妥单抗。

52.一种增加患有表达CEACAM5的癌症的受试者的生存时间的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的权利要求1-25中任一项所述的双特异性抗体。

53.根据权利要求52所述的方法，其特征在于：所述癌症是结直肠癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、胃癌、胰腺癌或乳腺癌。

54.根据权利要求52或53所述的方法，其中所述双特异性抗体与化学疗法和/或放射疗法组合施用。

55.根据权利要求52-54中任一项所述的方法，其中向所述患者施用一个或多个剂量的0.01至10mg/kg的权利要求1-25中任一项所述的双特异性抗体。