JP2024501809A - Ｃｅａｃａｍ５およびｃｄ４７に対する二重特異性抗体 - Google Patents

Abstract

本発明は、ヒト癌胎児性抗原ＣＥＡＣＡＭ５およびヒトＣＤ４７に結合する二重特異性抗体に関する。また、本発明は、このような二重特異性抗体をコードするポリヌクレオチド、およびベクター、ならびにこのようなポリヌクレオチドを含む宿主細胞に関する。本発明はさらに、このような抗体を選択および生産するための方法、ならびに疾患の処置においてこのような抗体を使用する方法に関する。本発明はまた、単剤療法および併用療法における二重特異性抗体の治療的使用に関する。

Description

配列表の参照
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発明の分野
本発明は、ヒト癌胎児性抗原ＣＥＡＣＡＭ５（ＣＥＡ）およびヒトＣＤ４７に結合する二重特異性抗体（ＣＥＡｘＣＤ４７二重特異性抗体）に関する。加えて、本発明は、このような二重特異性抗体をコードするポリヌクレオチド、およびベクター、ならびにこのようなポリヌクレオチドを含む宿主細胞に関する。本発明はさらに、このような抗体を選択および生産するための方法、ならびに疾患の処置においてこのような抗体を使用する方法に関する。本発明はまた、特にＣＥＡｘＣＤ３ Ｔ細胞二重特異性抗体（ＴＣＢ）および／またはＰＤ－１もしくはＰＤ－Ｌ１の阻害剤を用いた単剤療法および併用療法におけるＣＥＡｘＣＤ４７二重特異性抗体の治療的使用に関する。

発明の背景
ＣＥＡは、染色体１９ｑ１３上のＣＥＡＣＡＭおよび妊娠特異的糖タンパク質（ＰＳＧ）サブグループに分けられた２２個の遺伝子によってコードされるヒトの１２個の密接に関連したタンパク質を含むＣＥＡ関連細胞接着分子（ＣＥＡＣＡＭ）のファミリーに属する（Ｂｅａｕｃｈｅｍｉｎ Ｎ＆Ａｒａｂｚａｄｅｈ Ａ，Ｃａｎｃｅｒ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ Ｒｅｖ．２０１３）。ＣＥＡＣＡＭは、細胞－細胞認識などの様々な生理学的プロセスに関与し、組織構造の形成および新生血管形成からインスリン恒常性の調節、およびＴ細胞増殖に及ぶ細胞プロセスをモジュレートする；ＣＥＡＣＡＭはまた、宿主特異的ウイルスおよび細菌に対する受容体として同定されている（Ｋｕｅｓｐｅｒｔ Ｋら、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２００６）。ＣＥＡ（ＣＥＡＣＡＭ５またはＣＤ６６ｅ；ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ０６７３１）は、胚発生および胎児発生の初期に存在し、正常な成体組織におけるその発現を維持する。その主な発現部位は、結腸の円柱上皮細胞および杯細胞、特に陰窩の上３分の１および自由管腔表面にある。

ＣＥＡは、結腸直腸、胃、肺、および膵臓の癌（Ｂｅａｕｃｈｅｍｉｎ Ｎ＆Ａｒａｂｚａｄｅｈ Ａ，Ｃａｎｃｅｒ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ Ｒｅｖ．２０１３に概説されている）を含むがこれらに限定されない上皮起源の腫瘍で（過剰に）発現し、その頂端発現を失い、細胞表面全体に分布する（Ｈａｍｍａｒｓｔｒｏｍ，Ｓｅｍｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌ １９９９）。

ヒトＰＤ－１軸アンタゴニストと、Ｔ細胞を再配向させ活性化する抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体との組み合わせによりＣＥＡ発現がんを処置するための方法は、米国特許出願公開第２０１４０２４２０７９号および国際公開第２０１７１１８６５７号（これらはそれぞれ、その全体が参照により組み込まれる）に記載されており、臨床結果は、ＡＳＣＯ年次会議２０１７で提示された（Ｔａｂｅｒｎｅｒｏら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ３５，２０１７（ｓｕｐｐｌ；ａｂｓｔｒ ３００２））。

免疫チェックポイント経路の２つまたはそれを超える異なる標的に結合する免疫チェックポイントアンタゴニストと、ＣＥＡおよびＴ細胞表面抗原に結合するＴ細胞再誘導剤とを投与することにより腫瘍を処置する方法は、国際公開第２０１５１１２５３４号に記載されている。ＣＥＡＣＡＭ５および顆粒球に結合するクラスＩ抗体は、米国特許出願公開第２０１１００６４６５３号に記載されている。

ヒトＣＤ４７（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｑ０８７２２（ＣＤ４７＿ヒト；ＩＡＰ））は、リガンドであるトロンボスポンジン－１（ＴＳＰ－１）およびシグナル調節タンパク質アルファ（ＳＩＲＰα；ＣＤ１７２ａ；ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ｐ７８３２４）に結合する膜貫通タンパク質であり、免疫系に対する、特にＳＩＲＰαを発現するマクロファージに対する「私を食べないで」シグナルとして作用することができる。腫瘍細胞の表面上のＣＤ４７へのＳＩＲＰαの結合の強力な阻害（低いＩＣ５０）は、マクロファージによる腫瘍細胞の食作用を増加させるための手段である。ＣＤ４７は、アポトーシス、増殖、接着、および遊走を含む様々な細胞プロセスに関与している。さらに、免疫応答および血管新生応答において重要な役割を果たす。ＣＤ４７は、血液腫瘍および固形腫瘍の両方を有する患者由来の腫瘍細胞において過剰発現される。ＣＤ４７に対する抗体は、現在の技術水準に記載されており、リンパ腫および固形腫瘍などの血液悪性腫瘍、例えば胃がんを含む様々な腫瘍実体において有望な前臨床および初期臨床活性を示している（Ｗｅｉｓｋｏｐｆ Ｋ．、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ ７６（２０１７）１００－１０９；Ｈｕａｎｇ Ｙ他、Ｊ Ｔｈｏｒａｃ Ｄｉｓ、２０１７；９（２）：Ｅ１６８－Ｅ１７４；Ｋａｕｒら、Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、３（２０２０）１７９－１９２）。ＣＤ４７に結合するＩｇＧ１サブクラスの抗体は、Ｆｃ依存的に血小板の枯渇および赤血球（ＲＢＣ）およびヘモグロビンの減少をもたらし得る（例えば、米国特許出願公開第２０１４０１４０９８９号を参照のこと）。この有害効果を回避するために、国際公開第２０１７１９６７９３号では、抗ＣＤ４７抗体のＩｇＧ４サブクラスの突然変異体型（ＦｃγＲ結合を減少させるためにＳ２２８Ｐ突然変異およびＬ２３５Ｅ突然変異を有するＩｇＧ４ＰＥ）が記載されている。大幅に減少したＦｃγＲ結合およびエフェクター機能を有するこのような抗ＣＤ４７抗体は、このような血小板枯渇をもたらさない。ＣＤ４７およびＣＤ２０に対する単一ドメイン二重特異性抗体は、ｖｏｎ Ｂｏｍｍｅｌ ＰＥら（Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌ．７（２０１８）ｅ３８６３６１およびＰｉｃｃｉｏｎｅ ＥＣら、ｍＡｂｓ ７（２０１５）９４６－９５６）により記載されている。Ｄｈｅｉｌｌｙ Ｅら（Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒａ．２５（２０１７）５２３－５３３；国際公開第２０１４０８７２４８号も参照のこと）は、ＣＤ１９およびＣＤ４７に対する二重特異性抗体について記載している。

配列番号５の共通の重鎖（ＶＨ－ＣＨ１）および配列番号１０のＣＤ４７相互作用可変軽鎖領域ＶＬを含むＣＥＡＣＡＭ５およびＣＤ４７に対する二重特異性抗体は、国際公開第２０１９２３４５７６号、欧州特許第１９２１３００２号および米国特許第６２９４３７２６号に記載されている（それらの全体が参照により組み込まれる）。ＣＤ１９およびＣＤ４７に対する二重特異性抗体であって、配列番号５の共通重鎖と、配列番号１０のＣＤ４７相互作用可変軽領域ＶＬとを含む二重特異性抗体は、国際公開第２０１４０８７２４８号（その全体が参照により組み込まれる）に記載されている。国際公開第２０１８０９８３８４号は、ＣＤ４７およびＣＥＡＣＡＭ５を同時標的とする二重特異性抗体に関する。欧州特許第３６２３３８８号は、ＣＤ４７とＳＩＲＰαとの間の相互作用を遮断するための低親和性を有する腫瘍標的アームおよび融合タンパク質を含む二重特異性結合分子に関する。国際公開第２０１８／０５７９５５号は、ＣＤ４７とメソテリンの両方に結合し、共通の重鎖を含む二重特異性抗体に関する。国際公開第２０１９０１６４１１号は、ＣＤ４７および腫瘍抗原を標的とする（ｔａｒｅｔｉｎｇ）二重特異性抗体分子に関する。

血液悪性腫瘍の処置においてかなりの進歩がなされている。これは、いくつかのタイプの進行性固形腫瘍の処置においてなされた進歩とは対照的である。局所的に進行したまたは特に転移性の固形がんタイプの処置における一定の進歩にもかかわらず、結腸直腸がん、膵臓がん、肺がんなどの進行がんに罹患している患者の無増悪生存期間（ＰＦＳ）および全生存期間（ＯＳ）は依然としてかなり限られており、通常、治癒はない。多くの期待ががん免疫療法に寄せられており、限定的であるが確かな成功がある。腫瘍は、Ｔエフェクター細胞およびマクロファージのような他の免疫細胞による破壊からそれらの細胞を保護する手段を発達させる。過去１０年間のがん免疫療法ベースの戦略は、これらの腫瘍保護手段に対抗し、がん細胞に対してＴ細胞を再配向させのにいくらか成功した。そのような戦略の最も顕著な例は、特定の免疫チェックポイントの阻害剤／活性化因子である。例えば、ＰＤ－１軸アンタゴニストのようなチェックポイント阻害剤は、Ｔエフェクター細胞を再活性化して特定の固形がんと闘うことが示されている。しかし、すべての固形腫瘍タイプがＰＤ－１軸アンタゴニストに反応性であるわけではなく、反応性の種類においてさえ、例えば、抗ＰＤ－１またはＰＤ－Ｌ１抗体による処置からの関連利益を有する患者は、多くの場合、５０％よりもかなり少ない。例えば、進行性結腸直腸がんを有する患者の１０％未満がＰＤ－１軸の阻害剤による治療の対象となる（特に、がんにおけるマイクロサテライト不安定性ＭＳＩを示す進行性結腸直腸がん患者の約４％にはいくらかの利益がある）。

キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞による養子Ｔ細胞療法およびＴ細胞二重特異性抗体による治療は、血液悪性腫瘍において有望な臨床結果をもたらした。しかし、様々な固形腫瘍において養子Ｔ細胞療法、例えばＣＡＲ Ｔ細胞を用いた臨床研究は、大部分は奏効率を示さなかったか、またはごくわずかな奏効率を示した（例えば、Ｘｕら、Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ２０１７，１７，１０９９－１１０６；Ｇｒｅｅｎｂａｕｍら、Ｂｉｏｌ Ｂｌｏｏｄ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ ２０２０ Ｏｃｔ；２６（１０）：１７５９－１７６９）。

米国特許出願公開第２０１４０２４２０７９号、国際公開第２０１７０５５３８９号、米国特許出願公開第２０１４０２４２０８０号、およびＢａｃａｃら（Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，２２（１３）、３２８６－９７（２０１６））（それぞれ参照によりその全体が組み込まれる）は、ＣＥＡｘＣＤ３ Ｔ細胞二重特異性抗体を記載する。国際公開第２０１７０５５３８９号のＴ細胞二重特異性抗体は、前臨床研究でｃｉｂｉｓａｔａｍａｂと比較して、Ｔ細胞活性化の効力／有効性が大幅に増加したことを示し、これらのより高い効力のＣＥＡｘＣＤ３ Ｔ細胞二重特異性抗体の１つは臨床開発中であった（ＮＣＴ０３５３９４８４におけるＲＯ７１７２５０８）。本明細書で使用される場合、「ＴＣＢ２０１４」は、米国特許出願公開第２０１４０２４２０８０号に記載されているような２＋１フォーマットでＣＥＡおよびＣＤ３に結合する二重特異性抗体を指し、ＣＤＲとして、米国特許出願公開第２０１４０２４２０８０号の配列番号２７０～２７６および２９０～２９６に示されるＣＤＲ（参照によりその全体が組み込まれる、米国特許出願公開第２０１４０２４２０７９号の配列番号４～１０および２４～３０のＣＤＲも参照のこと）を含む。ＴａｂｅｒｎｅｒｏらのＡＳＣＯ年次総会２０１７（Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ３５，２０１７（ｓｕｐｐｌ；ａｂｓｔｒ ３００２））での発表には、ＣＥＡｘＣＤ３二重特異性抗体ＲＯ６９５８６８８（ｃｉｂｉｓａｔａｍａｂ）を単剤治療および抗ＰＤ－Ｌ１抗体アテゾリズマブと組み合わせた進行／転移性結腸直腸がん患者の第１相臨床データが含まれていた。安定な疾患および部分応答が、ｃｉｂｉｓａｔａｍａｂの単剤療法、およびＰＤ－Ｌ１阻害剤であるアテゾリズマブとの併用療法で見出されている。２０１７年以降、ｃｉｂｉｓａｔａｍａｂ ＣＥＡｘＣＤ３についての新しい臨床データは発表されていない。Ｑ３Ｗ １００ｍｇ ｃｉｂｉｓａｔａｍａｂとＰＤ－Ｌ１阻害剤であるアテゾリズマブ、およびＢ細胞殺傷抗ＣＤ２０抗体オビヌツズマブによる前処置（ｃｉｂｉｓａｔａｍａｂについて報告されているような抗薬物抗体ＡＤＡの形成を避けるため）を使用した１つの治験が２０１９年３月に掲載された（ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ ｇｏｖ．識別子ＮＣＴ０３８６６６３３９）。今日まで、データは公開されていない。最近、Ｑ３Ｗ １００ｍｇ ｃｉｂｉｓａｔａｍａｂ＋アテゾリズマブ＋ＲＯ７１２２９０による新しい臨床試験がマイクロサテライト安定性を示す進行性結腸直腸がんの患者において、掲載された（２０２１年４月、ＮＣＴ０４８２６００３）。ＲＯ７１２２９０は、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）およびＴ細胞共刺激因子４－１ＢＢに結合する二重特異性融合タンパク質であり、ＣＥＡｘＣＤ３と組み合わせると、Ｔ細胞のさらなる活性化を引き起こし、腫瘍細胞に対する有効性／殺傷の増加をもたらすが、毒性の増加、例えばサイトカイン放出も増加させた。一本鎖抗体であるさらなる二重特異性ＣＥＡｘＣＤ３抗体であるＭＥＤＩ－５６５（ＡＭＧ２１１）は臨床開発中であり、その抗体を用いた臨床試験の結果が発表されている（例えば、安定な疾患の誘導、例えば、Ｍ．Ｐｉｓｈｖａｉａｎら、Ｃｌｉｎ Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ Ｃａｎｃｅｒ．２０１６ ＤＥＣ；１５（４）３４５－３５１を参照のこと）。

ＣＥＡｘＣＤ３二重特異性抗体をＰＤ－Ｌ１阻害抗体と組み合わせた場合、効率の向上が報告された。これらのデータは、進行性固形腫瘍では、ＣＥＡｘＣＤ３二重特異性抗体を用いて有効性を達成し得ることを示している。しかし、全体的に、単剤療法およびさらにはＰＤ－Ｌ１阻害剤との組み合わせでは、臨床試験における患者の大部分が依然として進行性であり、奏効した者は、最大で部分奏効および安定疾患を示したが、完全奏効は達成されなかった。

ＣＥＡｘＣＤ３ ｃｉｂｉｓａｔａｍａｂのようなＴ細胞二重特異性抗体で有効性を高める１つのアプローチは、４－１ＢＢまたはＣＤ２８などの共刺激性Ｔ細胞受容体へのアゴニスト効果を介して追加のＴ細胞活性化を引き起こす第２の医薬との組み合わせである。Ｔ細胞二重特異性抗体の周知の副作用は、高いグレード、例えばグレード３またはさらにグレード５（死亡）であり得るサイトカイン放出症候群ＣＲＳの誘発である。Ｔ細胞共刺激受容体を標的とする二重特異性抗体をＴ細胞二重特異性抗体に追加すると、サイトカイン放出の大幅な増加およびそのためより高次のグレードのＣＲＳのリスクの増加を引き起こし得る。

より良好な結果を得るための別のアプローチは、例えば、Ｔ細胞二重特異性抗体にＰＤ－１チェックポイント軸の阻害剤を追加するだけではなく、さらなるチェックポイント阻害剤またはアゴニストを追加することであり得る。しかしこれまでのところ、結腸直腸がんなどの進行性固形腫瘍におけるこのような組み合わせアプローチに関する有望な臨床データはない。進行性固形腫瘍内におけるＴ細胞の限定的なアベイラビリティは確かに、Ｔ細胞二重特異性抗体＋ＰＤ－１軸阻害剤および／または他のチェックポイント阻害剤＋Ｔ細胞共刺激受容体における二重特異性アゴニストを用いて達成可能な有効性を制限する重要な機構である。
Ｔ細胞二重特異性抗体ＴＡＡｘＣＤ３（ＴＡＡ＝ＣＥＡおよび他の多くのような腫瘍関連抗原）は、多発性骨髄腫などの血液悪性腫瘍、例えばびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫などのＢ細胞悪性腫瘍を有する患者において非常に有効であるｃｉｂｉｓａｔａｍａｂ ＣＥＡｘＣＤ３の臨床結果は、進行性固形腫瘍にもＴＡＡｘＣＤ３の有効性があることを示すが（上記の文を参照）、血液悪性腫瘍で達成されるよりもはるかに低い。ＰＤ－１軸阻害剤を追加すると有効性が追加され得るが、たとえあったとしても限定的である。ＣＤ２８または４－１ＢＢなどの共刺激性Ｔ細胞受容体にアゴニスト性の二重特異性抗体または融合タンパク質を追加すると、前臨床試験における有効性が増大するが、毒性も増大する、例えば、サイトカイン放出の増加。Ｔ細胞のさらなる活性化を目指す代わりに、腫瘍細胞、他の免疫細胞、特にマクロファージに再配向させる治療剤を追加する方がより成功し得る。本発明は、１．単独療法においておよび／または２．組み合わせ療法（特にＣＥＡｘＣＤ３ Ｔ細胞二重特異性抗体との）として、ＣＥＡＣＡＭ５発現固形腫瘍に対してマクロファージを再配向させ活性化する二重特異性抗体ＣＥＡｘＣＤ４７を扱い、ＣＥＡｘＣＤ３二重特異性抗体の腫瘍細胞殺傷効果を増大させ、Ｔ細胞共刺激受容体に対する二重特異性アゴニストとの組み合わせとは対照的に、ＣＲＳのリスク増加を回避する。
ＣＥＡＣＡＭ５およびＣＤ４７に対する二重特異性抗体は、国際公開第２０１９２３４５７６号に記載されている。国際公開第２０１９２３４５７６号に記載されている例示的な二重特異性抗体の１つは、Ｋ２ＡＣ２２である（国際公開第２０１９２３４５７６号の配列番号６５は、Ｋ２ＡＣ２２のＣＥＡＣＡＭ５結合部分の軽鎖を示し、国際公開第２０１９２３４５７６号の配列番号６は、Ｋ２ＡＣ２２の共通の重鎖を示し、配列番号１０は、Ｋ２ＡＣ２２のＣＤ４７結合部分の軽鎖を示す）。しかしながら、ＣＥＡＣＡＭ５およびＣＤ４７に対する改善された二重特異性抗体、例えば、高い有効性と低い毒性、低い免疫原性および好ましい薬物動態特性とを組み合わせた改善された抗体が依然として必要とされている。したがって、本発明の目的は、先行技術のＣＥＡＣＡＭ５およびＣＤ４７に対する二重特異性抗体よりも有利なＣＥＡＣＡＭ５およびＣＤ４７に対する新規二重特異性抗体を提供することである。

米国特許出願公開第２０１４０２４２０７９号 国際公開第２０１７１１８６５７号 国際公開第２０１５１１２５３４号 米国特許出願公開第２０１１００６４６５３号

Ｂｅａｕｃｈｅｍｉｎ Ｎ＆Ａｒａｂｚａｄｅｈ Ａ，Ｃａｎｃｅｒ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ Ｒｅｖ．２０１３ Ｋｕｅｓｐｅｒｔ Ｋら、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２００６ Ｂｅａｕｃｈｅｍｉｎ Ｎ＆Ａｒａｂｚａｄｅｈ Ａ，Ｃａｎｃｅｒ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ Ｒｅｖ．２０１３ Ｈａｍｍａｒｓｔｒｏｍ，Ｓｅｍｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌ １９９９

本発明は、ヒトＣＥＡＣＡＭ５に結合することができる第１の結合部分およびヒトＣＤ４７に結合することができる第２の結合部分を有する新規二重特異性抗体を提供する。本発明による二重特異性抗体は、ＣＥＡＣＡＭ５を高量で発現する腫瘍細胞およびＣＥＡＣＡＭ５を低量で発現する腫瘍細胞の両方に対して、腫瘍細胞に対する高い食作用活性を誘導する。一実施形態では、二重特異性抗体は、免疫細胞、特にマクロファージの関与により、主に最適化された食作用／抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）を介してそれらの抗腫瘍細胞効果を誘導する。一実施形態では、本発明による二重特異性抗体は、ＣＥＡＣＡＭ５－ＣＤ４７抗体Ｋ２ＡＣ２２と比較して、それぞれ、ＣＥＡＣＡＭ５に対してＣＥＡＣＡＭ３への結合親和性の比の減少、ＫＤの比の増加を示す。一実施形態では、本発明による二重特異性抗体は、腫瘍細胞上に発現されるＣＤ４７へのＳＩＲＰαの結合を阻害し、腫瘍細胞の食作用を増加させる。ヒトＣＥＡＣＡＭ５およびヒトＣＤ４７に特異的に結合する開示された二重特異性抗体はまた、腫瘍の処置、特に固形腫瘍の処置における使用に適している。

一態様では、本発明は、１．ヒトＣＥＡＣＡＭ５（さらに「ＣＥＡ」とも称される）に特異的に結合する第１の結合部分と、ヒトＣＤ４７（さらに「ＣＤ４７」とも称される）に特異的に結合する第２の結合部分とを含む二重特異性抗体（さらに「ＣＥＡｘＣＤ４７二重特異性抗体」または「本発明による二重特異性抗体」とも称される）であって、
ａ）第１の結合部分は、重鎖可変領域として、配列番号１のＣＤＲＨ１、配列番号２のＣＤＲＨ２および配列番号３のＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域を含み、
ｂ）第１の結合部分は、軽鎖可変領域として、
ｂ１）配列番号１４のＣＤＲＬ１、配列番号１５のＣＤＲＬ２、および配列番号１６のＣＤＲＬ３、または
ｂ２）配列番号１７のＣＤＲＬ１、配列番号１８のＣＤＲＬ２、および配列番号１９のＣＤＲＬ３、
ｂ３）配列番号２０のＣＤＲＬ１、配列番号２１のＣＤＲＬ２、および配列番号２２のＣＤＲＬ３、
ｂ４）配列番号２３のＣＤＲＬ１、配列番号２４のＣＤＲＬ２、および配列番号２５のＣＤＲＬ３、ならびに
ｂ５）配列番号２６のＣＤＲＬ１、配列番号２７のＣＤＲＬ２、および配列番号２８のＣＤＲＬ３からなる群から選択されるＣＤＲＬのセットを含む軽鎖可変領域を含み、
ｃ）第２の結合部分は、重鎖可変領域として、配列番号１のＣＤＲＨ１、配列番号２のＣＤＲＨ２および配列番号３のＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域を含み、
かつ軽鎖可変領域として、配列番号７のＣＤＲＬ１、配列番号８のＣＤＲＬ２、および配列番号９のＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域を含むことを特徴とする二重特異性抗体を提供する。

本発明は、この態様のさらなる実施形態を含む。

一実施形態では、本発明は、ヒトＣＥＡＣＡＭ５に特異的に結合する第１の結合部分と、ヒトＣＤ４７に特異的に結合する第２の結合部分と、を含む二重特異性抗体であって、
ａ）第１および第２の結合部分は、それぞれ重鎖可変領域として、配列番号１のＣＤＲＨ１、配列番号２のＣＤＲＨ２および配列番号３のＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域を含み、
ｂ）第１の結合部分は、軽鎖可変領域として、配列番号１４のＣＤＲＬ１、配列番号１５のＣＤＲＬ２および配列番号１６のＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域を含み、
ｃ）第２の結合部分が、軽鎖可変領域として、配列番号７のＣＤＲＬ１、配列番号８のＣＤＲＬ２、および配列番号９のＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域を含む、ことを特徴とする二重特異性抗体に関する。

一実施形態では、本発明は、ヒトＣＥＡＣＡＭ５に特異的に結合する第１の結合部分と、ヒトＣＤ４７に特異的に結合する第２の結合部分と、を含む二重特異性抗体であって、
ａ）第１および第２の結合部分は、それぞれ重鎖可変領域として、配列番号１のＣＤＲＨ１、配列番号２のＣＤＲＨ２および配列番号３のＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域を含み、
ｂ）第１の結合部分は、軽鎖可変領域として、配列番号１７のＣＤＲＬ１、配列番号１８のＣＤＲＬ２および配列番号１９のＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域を含み、
ｃ）第２の結合部分が、軽鎖可変領域として、配列番号７のＣＤＲＬ１、配列番号８のＣＤＲＬ２、および配列番号９のＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域を含む、ことを特徴とする二重特異性抗体に関する。

一実施形態では、本発明は、ヒトＣＥＡＣＡＭ５に特異的に結合する第１の結合部分と、ヒトＣＤ４７に特異的に結合する第２の結合部分と、を含む二重特異性抗体であって、
ａ）第１および第２の結合部分は、それぞれ重鎖可変領域として、配列番号１のＣＤＲＨ１、配列番号２のＣＤＲＨ２および配列番号３のＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域を含み、
ｂ）第１の結合部分は、軽鎖可変領域として、配列番号２０のＣＤＲＬ１、配列番号２１のＣＤＲＬ２および配列番号２２のＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域を含み、
ｃ）第２の結合部分が、軽鎖可変領域として、配列番号７のＣＤＲＬ１、配列番号８のＣＤＲＬ２、および配列番号９のＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域を含む、ことを特徴とする二重特異性抗体に関する。

一実施形態では、本発明は、ヒトＣＥＡＣＡＭ５に特異的に結合する第１の結合部分と、ヒトＣＤ４７に特異的に結合する第２の結合部分と、を含む二重特異性抗体であって、
ａ）第１および第２の結合部分は、それぞれ重鎖可変領域として、配列番号１のＣＤＲＨ１、配列番号２のＣＤＲＨ２および配列番号３のＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域を含み、
ｂ）第１の結合部分は、軽鎖可変領域として、配列番号２３のＣＤＲＬ１、配列番号２４のＣＤＲＬ２および配列番号２５のＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域を含み、
ｃ）第２の結合部分が、軽鎖可変領域として、配列番号７のＣＤＲＬ１、配列番号８のＣＤＲＬ２、および配列番号９のＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域を含む、ことを特徴とする二重特異性抗体に関する。

一実施形態では、本発明は、ヒトＣＥＡＣＡＭ５に特異的に結合する第１の結合部分と、ヒトＣＤ４７に特異的に結合する第２の結合部分と、を含む二重特異性抗体であって、
ａ）第１および第２の結合部分は、それぞれ重鎖可変領域として、配列番号１のＣＤＲＨ１、配列番号２のＣＤＲＨ２および配列番号３のＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域を含み、
ｂ）第１の結合部分は、軽鎖可変領域として、配列番号２６のＣＤＲＬ１、配列番号２７のＣＤＲＬ２および配列番号２８のＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域を含み、
ｃ）第２の結合部分が、軽鎖可変領域として、配列番号７のＣＤＲＬ１、配列番号８のＣＤＲＬ２、および配列番号９のＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域を含む、ことを特徴とする二重特異性抗体に関する。

一実施形態では、本発明は、第１の結合部分において、配列番号４の可変重鎖領域を可変重鎖領域として含み、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５および配列番号３６からなる群から選択される可変軽鎖領域を可変軽鎖領域として含み、第２の結合部分において、可変重鎖領域として、配列番号４の可変重鎖領域を含み、可変軽鎖領域として、配列番号１０の可変軽鎖領域を含むことを特徴とする、本発明による二重特異性抗体に関する。

一実施形態では、本発明は、第１の結合部分において、配列番号４の可変重鎖領域を可変重鎖領域として含み、配列番号３２の可変軽鎖領域を可変軽鎖領域として含み、第２の結合部分において、可変重鎖領域として、配列番号４の可変鎖領域を含み、可変軽鎖領域として、配列番号１０の可変軽鎖領域を含むことを特徴とする、本発明による二重特異性抗体に関する。

一実施形態では、本発明は、第１の結合部分において、配列番号４の可変重鎖領域を可変重鎖領域として含み、配列番号３３の可変軽鎖領域を可変軽鎖領域として含み、第２の結合部分において、可変重鎖領域として、配列番号４の可変鎖領域を含み、可変軽鎖領域として、配列番号１０の可変軽鎖領域を含むことを特徴とする、本発明による二重特異性抗体に関する。

一実施形態では、本発明は、第１の結合部分において、配列番号４の可変重鎖領域を可変重鎖領域として含み、配列番号３４の可変軽鎖領域を可変軽鎖領域として含み、第２の結合部分において、可変重鎖領域として、配列番号４の可変鎖領域を含み、可変軽鎖領域として、配列番号１０の可変軽鎖領域を含むことを特徴とする、本発明による二重特異性抗体に関する。

一実施形態では、本発明は、第１の結合部分において、配列番号４の可変重鎖領域を可変重鎖領域として含み、配列番号３５の可変軽鎖領域を可変軽鎖領域として含み、第２の結合部分において、可変重鎖領域として、配列番号４の可変鎖領域を含み、可変軽鎖領域として、配列番号１０の可変軽鎖領域を含むことを特徴とする、本発明による二重特異性抗体に関する。

一実施形態では、本発明は、第１の結合部分において、配列番号４の可変重鎖領域を可変重鎖領域として含み、配列番号３６の可変軽鎖領域を可変軽鎖領域として含み、第２の結合部分において、可変重鎖領域として、配列番号４の可変鎖領域を含み、可変軽鎖領域として、配列番号１０の可変軽鎖領域を含むことを特徴とする、本発明による二重特異性抗体に関する。

一実施形態では、本発明は、第１の結合部分に、配列番号５の重鎖と、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０および配列番号４１からなる群から選択される軽鎖と、を含み、第２の結合部分に、配列番号５の重鎖と、配列番号１１を有する軽鎖と、を含むことを特徴とする、本発明による二重特異性抗体に関する。

一実施形態では、本発明は、第１の結合部分に、配列番号５の重鎖と、配列番号３７の軽鎖と、を含み、第２の結合部分に、配列番号５の重鎖と、配列番号１１を有する軽鎖と、を含むことを特徴とする、本発明による二重特異性抗体に関する。

一実施形態では、本発明は、第１の結合部分に、配列番号５の重鎖と、配列番号３８の軽鎖と、を含み、第２の結合部分に、配列番号５の重鎖と、配列番号１１を有する軽鎖と、を含むことを特徴とする、本発明による二重特異性抗体に関する。

一実施形態では、本発明は、第１の結合部分に、配列番号５の重鎖と、配列番号３９の軽鎖と、を含み、第２の結合部分に、配列番号５の重鎖と、配列番号１１を有する軽鎖と、を含むことを特徴とする、本発明による二重特異性抗体に関する。

一実施形態では、本発明は、第１の結合部分に、配列番号５の重鎖と、配列番号４０の軽鎖と、を含み、第２の結合部分に、配列番号５の重鎖と、配列番号１１を有する軽鎖と、を含むことを特徴とする、本発明による二重特異性抗体に関する。

一実施形態では、本発明は、第１の結合部分に、配列番号５の重鎖と、配列番号４１の軽鎖と、を含み、第２の結合部分に、配列番号５の重鎖と、配列番号１１を有する軽鎖と、を含むことを特徴とする、本発明による二重特異性抗体に関する。

一実施形態では、本発明は、Ｋ２ＡＣ８２、Ｋ２ＡＣ８４、Ｋ２ＡＣ９１、Ｋ２ＡＣ１００またはＫ２ＡＣ１１７二重特異性抗体のものと同じＣＥＡＣＡＭ５結合部分を含む二重特異性抗体に関する。このような実施形態では、二重特異性抗体は、
・配列番号１４～１６の軽鎖ＣＤＲ、配列番号３２のＶＬ、および／もしくは配列番号３７のＶＬＣＬ（Ｋ２ＡＣ８２）、
・配列番号１７～１９のＣＤＲ、配列番号３３のＶＬ、および／もしくは配列番号３８のＶＬＣＬ（Ｋ２ＡＣ８４）、
・配列番号２０～２２のＣＤＲ、配列番号３４のＶＬ、および／もしくは配列番号３９のＶＬＣＬ（Ｋ２ＡＣ９１）、
・配列番号２３～２５のＣＤＲ、配列番号３５のＶＬ、および／もしくは配列番号４０のＶＬＣＬ（Ｋ２ＡＣ１００）、
・配列番号２６～２８のＣＤＲ、配列番号３６のＶＬ、および／もしくは配列番号４１のＶＬＣＬ（Ｋ２ＡＣ１１７）、または
・前記抗体のＣＤＲ領域ならびに／または軽鎖および重鎖を含む誘導体、を含む。

一実施形態では、定常および可変フレームワーク領域配列はヒトのものである。

一実施形態では、本発明による二重特異性抗体は、第１および第２の結合部分がそれぞれ、免疫グロブリン重鎖および免疫グロブリン軽鎖を含むことを特徴とする。一実施形態では、本発明による二重特異性抗体は全長抗体である。一実施形態では、本発明による二重特異性抗体は、ヒトＩｇＧ１タイプのものであることを特徴とする。

一実施形態では、本発明による二重特異性抗体は、ラムダ軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）およびラムダ軽鎖定常（ＣＬ）ドメインを含むＣＥＡに特異的な第１の結合部分と、カッパ軽鎖可変ドメイン（ＶＫ）およびカッパ軽鎖定常ドメイン（ＣＫ）を含むＣＤ４７に特異的な第２の結合部分と、を含むことを特徴とする（κλ二重特異性抗体、κλ体）。そのような一実施形態では、第２の結合部分は、軽鎖ＬＣ（ＣＤ４７ ＶＫＣＫ）として配列番号１１の軽鎖を含む。配列番号１１のカッパ軽鎖は、可変軽鎖ドメインとして配列番号１０の可変軽鎖ドメイン（Ｍａｂ ＣＤ４７ ＶＫ）を含み、定常軽鎖ドメインとして配列番号１３の定常軽鎖ドメイン（ＣＤ４７ ＣＫ）を含む。

一実施形態では、本発明の二重特異性抗体は、完全ヒト二重特異性ＩｇＧ（特に、ＩｇＧ１）フォーマットのものであり、加えて、タイプ１またはタイプ２のκλ二重特異性抗体である。

一実施形態では、本発明による二重特異性抗体は、κλ二重特異性抗体であり、共通の重鎖（ｃＨＣ）を含むことを特徴とする。一実施形態では、共通の重鎖は、可変重鎖ドメインＶＨとして配列番号４の可変重鎖ドメインを含む。一実施形態では、本発明による二重特異性抗体は、配列番号５の共通の重鎖ＶＨ－ＣＨ１を含むことを特徴とする。一実施形態では、本発明による二重特異性抗体は、配列番号６の共通の重鎖（ＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３）を含むことを特徴とする。

一実施形態では、本発明による二重特異性抗体は、第１の結合部分が一価であり、第２の結合部分が一価であることを特徴とする。

一実施形態では、本発明による二重特異性抗体は、配列番号４３および４４の配列のＶＫおよびＶＨドメインとしてＶＫおよびＶＨドメインを含む抗ＣＥＡＣＡＭ５抗体ＳＭ３ＥとＣＥＡＣＡＭ５への結合について競合することを特徴とする。一実施形態では、本発明による二重特異性抗体は、ｃｉｂｉｓａｔａｍａｂおよび／またはＭＥＤＩ－５６５（ＡＭＧ ２１１；（ＭＤ Ｏｂｅｒｓｔら、ｍＡｂｓ ６（２０１４）１５７１－１５８４））とＣＥＡＣＡＭ５への結合について競合しないことを特徴とする。一実施形態では、本発明による二重特異性ＣＥＡｘＣＤ４７抗体を、ＣＥＡｘＣＤ３二重特異性抗体ｃｉｂｉｓａｔａｍａｂおよび／またはＭＥＤＩ－５６５と並行して投与することができる。

別の実施形態では、本発明による二重特異性抗体は、修飾されたオリゴ糖を有するＦｃ領域を有するように糖操作されていることを特徴とする。別の実施形態では、本発明による二重特異性抗体は、糖操作されていない同じ二重特異性抗体と比較して、フコース残基の数が減少するように糖操作されたＦｃ領域を含むことを特徴とする。

一実施形態では、本発明による二重特異性抗体は、低減された量のフコースをオリゴ糖鎖（複数可）に含む。

一実施形態では、本発明の二重特異性抗体は、Ｆｃ領域のＮ結合型オリゴ糖の５０％～１００％が非フコシル化されていることを特徴とする。

一実施形態では、本発明の二重特異性抗体は、本発明の二重特異性抗体のオリゴ糖鎖（複数可）中のフコース量が、アフコシル化法を適用しない場合、それぞれの抗体のフコース含有量と比較して８０％～１００％減少することを特徴とする。

一実施形態では、上記二重特異性抗体は、Ｆｃ領域中のＮ結合型オリゴ糖の８０％～１００％がバイセクト型でフコシル化されていないことを特徴とする。一般にＣＥＡＣＡＭ５およびＣＤ４７に結合するアフコシル化二重特異性抗体、ならびにそれらの産生および精製は、国際公開第２０１９２３４５７６号、米国特許第６２／９４３，７２６号および欧州特許第１９２１３００２号に記載されている。

一実施形態では、本発明の二重特異性抗体は、一置換Ｓ２３９Ｄ、Ｉ３３２Ｅ、Ｇ２３６Ａ、二置換Ｉ３３２ＥおよびＧ２３６Ａ、Ｓ２３９ＤおよびＩ３３２Ｅ、Ｓ２３９ＤおよびＧ２３６Ａならびに三置換Ｓ３２９ＤおよびＩ３３２ＥおよびＧ２３６Ａからなる群より選択されるＦｃ領域中の１つ、２つまたは３つのアミノ酸置換と、糖操作されていない以外は同じ二重特異性抗体と比較して減少した数のフコース残基を有するように糖操作されたＦｃ領域とを含むことを特徴とする。

一実施形態では、本発明の二重特異性抗体は、１００倍またはそれを超える、組換えＣＥＡＣＡＭ３および組換えＣＥＡＣＡＭ５への結合についてのＫＤ値の比を特徴とする（実施例３、表２）。

一実施形態では、本発明の二重特異性抗体は、１００～２００倍の、組換えＣＥＡＣＡＭ３および組換えＣＥＡＣＡＭ５への結合についてのＫＤ値の比を特徴とする。

一実施形態では、本発明の二重特異性抗体は、ＣＥＡＣＡＭ５およびＣＥＡＣＡＭ３への結合の相対的分離（識別的結合）を有する。二重特異性ＣＥＡｘＣＤ４７抗体Ｋ２ＡＣ２２と比較して、全長組換えヒトＣＥＡＣＡＭ５タンパク質への結合が増加したにもかかわらず、全長組換えヒトＣＥＡＣＡＭ３への結合は比例して増加しない。全長ＣＥＡＣＡＭ３対ＣＥＡＣＡＭ５への結合についてのＫＤの指数／比は、８３（Ｋ２ＡＣ２２）から１３７（Ｋ２ＡＣ８４）から１４６（Ｋ２ＡＣ１００）への増加を示す。これは、識別的結合の６５％～７６％の増加に等しい（実施例３、表２）。

一実施形態では、本発明による二重特異性抗体は、濃度依存的食作用（ヒトマクロファージによるＣＥＡＣＡＭ５発現腫瘍細胞株のＡＤＣＰ）を特徴とする。ＡＤＣＰは、通常１：３（ヒトマクロファージ：標的細胞（腫瘍細胞）；ＥＣ５０値および食作用の最大指数Ｅｍａｘについては、例えば図２および表６～９を参照のこと）のＥ：Ｔ比で、イメージングによる食作用指数（ＥＣ５０および／または最大値）として本発明に従って測定される。図２の結果は、Ｅ：Ｔが１：３で得られた。アッセイの詳細は、実施例７に記載されている。ＣｅｌｌＩｎｓｉｇｈｔ ＣＸ５に基づくイメージングアッセイ。特に明記しない限り、食作用指数値は、このようなイメージング方法によって測定される。

一実施形態では、本発明による二重特異性抗体は、Ｋ２ＡＣ２２の食作用指数と比較して、ＬｏＶｏ腫瘍細胞の最大の食作用指数（Ｅｍａｘ）の少なくとも８％の増加を特徴とする。一実施形態では、その増加は、Ｋ２ＡＣ２２の食作用指数と比較して、ＬｏＶｏ腫瘍細胞については８％～２０％である。一実施形態では、本発明による二重特異性抗体は、Ｋ２ＡＣ２２の食作用指数と比較して、Ｌｓ１７４Ｔ腫瘍細胞の最大の食作用指数が少なくとも８％の増加を特徴とする。一実施形態では、増加は、Ｋ２ＡＣ２２の食作用指数と比較して、Ｌｓ１７４Ｔ腫瘍細胞において８％～２５％である。（実施例７、表５）。ＬｏＶｏおよびＬＳ１７４Ｔは、ＣＥＡＣＡＭ５の発現がかなり低い腫瘍細胞である（実施例５の下の表３を参照のこと）。

一実施形態では、本発明による二重特異性抗体は、ヒトＣＤ４７とヒトＳＩＲＰαとの間の相互作用を阻害する。一実施形態では、本発明による二重特異性抗体は、ＭＫＮ－４５細胞上のＣＤ４７とＳＩＲＰαとの間の相互作用を、同じ実験条件下でＫ２ＡＣ２２について測定されたＩＣ５０よりも１０倍またはそれを超えて低いＩＣ５０で阻害する。一実施形態では、前記ファクターは１０～３０の間である。一実施形態では、本発明による二重特異性抗体は、ＭＫＮ－４５細胞上のＣＤ４７とＳＩＲＰαとの間の相互作用を０．１ｎＭまたはそれ未満のＩＣ５０で阻害する。一実施形態では、本発明による二重特異性抗体は、ＭＫＮ－４５細胞上のＣＤ４７とＳＩＲＰαとの間の相互作用を０．１ｎＭ～０．０４ｎＭのＩＣ５０で阻害する（実施例１０および表１２を参照のこと）。

一実施形態では、本発明による二重特異性抗体が、以下の特性：１００倍またはそれを超える組換えＣＥＡＣＡＭ３および組換えＣＥＡＣＡＭ５への結合についてのＫＤ値の比を有すること、ＣＥＡＣＡＭ５およびＣＥＡＣＡＭ３への結合の相対的分離を有すること、濃度依存的ＡＤＣＰを有すること、Ｋ２ＡＣ２２の食作用指数と比較してＬｏＶｏ腫瘍細胞の最大の食作用指数（Ｅｍａｘ）の少なくとも８％の増加を有すること、およびＫ２ＡＣ２２と比較して１０倍超低いＩＣ５０でヒトＣＤ４７とヒトＳＩＲＰαとの間の相互作用を阻害する能力を有することのうちの２またはそれを超えるものを有することを特徴とする。

二重特異性抗体Ｋ２ＡＣ２２は、ヒトＣＥＡＣＡＭ５およびヒトＣＤ４７に結合する二重特異性抗体であり、国際公開第２０１９２３４５７６号に記載されている。Ｋ２ＡＣ２２は、配列番号６の共通の重鎖を含み、ＣＥＡＣＡＭ５結合部分では配列番号４２の軽鎖を含み、ＣＤ４７結合部分では配列番号１１の軽鎖を含む。Ｋ２ＡＣ２２のＣＤＲを配列番号１～３、７～９、および２９～３１に示す（表１）。

一実施形態において、本発明による二重特異性抗体は、１００ｎＭ～６００ｎＭの結合親和性（ＫＤ）で組換えヒトＣＤ４７に結合することを特徴とし、一実施形態では、１００ｎＭ～５００ｎＭの結合親和性（バイオレイヤー干渉法によって測定）で結合することを特徴とする。

一実施形態では、本発明による二重特異性抗体が、２ｎＭ～１０ｎＭのＫＤで組換えヒトＣＥＡＣＡＭ５に結合することを特徴とする（実施例３、表２）。一実施形態では、本発明の二重特異性抗体は、現在の技術水準の二重特異性抗体Ｋ２ＡＣ２２（実施例３、表２）と比較して、１０倍～５０倍高い、一実施形態では、２０倍～５０倍高い結合親和性（より低いＫＤ）を有する。

一実施形態では、本発明による二重特異性抗体は、ｃｉｂｉｓａｔａｍａｂのようなＣＥＡｘＣＤ３ Ｔ細胞二重特異性抗体との併用処置に有用である。

一実施形態では、本発明による二重特異性抗体は、ＣＥＡＣＡＭ５に特異的に結合することを特徴とするが、腫瘍細胞、例えばＭＫＮ－４５およびＬＳ１７４Ｔ上のＣＥＡＣＡＭ５への結合について、ＴＣＢ２０１４およびｃｉｂｉｓａｔａｍａｂと競合しない（実施例８）。

一実施形態では、本発明による二重特異性抗体は、３００ｎＭの濃度でヒトＣＥＡＣＡＭ５およびＣＤ３ε（上掲）に結合する二重特異性抗体ＴＣＢ２０１４が、ＭＫＮ－４５細胞に対する本発明による二重特異性抗体の結合曲線のＥＣ５０を、または別の実施形態では、ＬＳ１７４Ｔ細胞に対して３倍を超えて、一実施形態ではより高濃度に向けて、シフトさせないことを特徴とする（実施例８および図５）。そのような場合、本発明による二重特異性抗体およびＴＣＢ２０１４は、「競合的でない」と定義され、前記ＣＥＡへの結合を有意に妨害することなくＣＥＡに同時に結合することができると考えられる。そのような場合、本発明による二重特異性抗体およびＴＣＢ２０１４は、「競合的でない」と定義され、前記ＣＥＡへの結合を有意に妨害することなくＣＥＡに同時に結合することができると考えられ、したがって、両方の薬物の治療レベルが血液および／または腫瘍組織中に同時に存在する場合であっても、食作用（ＣＥＡｘＣＤ４７）に対するその効果を妨げずに、またＴ細胞活性化（ＴＣＢ２０１４およびｃｉｂｉｓａｔａｍａｂ）に対するその効果を妨げずに発達することができる。これにより、ＴＣＢ２０１４またはｃｉｂｉｓａｔａｍａｂと本発明のＣＥＡｘＣＤ４７二重特異性抗体との併用処置が容易になる。

一実施形態では、ＣＥＡｘＣＤ３二重特異性抗体ＴＣＢ２０１４と組み合わせた本発明のＣＥＡｘＣＤ４７二重特異性抗体は、例えばＬｏＶｏまたはＬＳ１７４Ｔ腫瘍細胞と、同じ志願者のヒトドナーに由来するヒトマクロファージおよびＴ細胞とを含むアッセイにおいて、腫瘍細胞の少なくとも相加的またはさらには相乗的な％殺傷を示す。

一実施形態では、ＣＥＡｘＣＤ３二重特異性抗体ＴＣＢ２０１４と組み合わせた本発明のＣＥＡｘＣＤ４７二重特異性抗体は、例えばＬｏＶｏまたはＬＳ１７４Ｔ腫瘍細胞と、同じ志願者のヒトドナーに由来するヒトマクロファージおよびＴ細胞とを含むアッセイにおいて、腫瘍細胞の少なくとも相加的またはさらには相乗的な殺傷を示す。

本発明はさらに、本発明による二重特異性抗体をコードする１またはそれを超えるポリヌクレオチドを含む発現ベクターを提供する。

本発明はさらに、本発明による発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。

本発明は、本発明の二重特異性抗体の生産のための方法であって、
ａ）本発明の前記抗体の生産を可能にする条件下で、前記二重特異性抗体をコードする発現ベクターを含む宿主細胞を培養すること、および
ｂ）ＣＥＡＣＡＭ５およびＣＤ４７に特異的に結合することができる前記抗体を単離すること
を含むことを特徴とする方法をさらに提供する。

本発明の抗体をコードする第２のポリペプチドは、すべてのそれぞれの２つの異なる軽鎖および共通の重鎖をコードする１つのポリペプチド、またはそれぞれの軽鎖および重鎖を別個にコードする別個のポリペプチドであり得る。また、発現ベクターは、それぞれ２つの異なる軽鎖および共通の重鎖を発現する１つ、２つまたは３つのベクターであり得る。

本発明は、腫瘍細胞の細胞溶解を誘導する方法であって、前記腫瘍細胞を本発明の二重特異性抗体と接触させることを含む方法をさらに提供する。腫瘍細胞は、好ましくは患者中のヒト腫瘍細胞である。腫瘍細胞の細胞溶解を誘導する方法の一実施形態は、腫瘍細胞は、結腸直腸がん細胞、ＮＳＣＬＣ（非小細胞肺がん）細胞、胃がん細胞、膵臓がん細胞、乳がん細胞、またはＣＥＡＣＡＭ５を発現する別の腫瘍細胞である。

本発明は、ＣＥＡＣＡＭ５を発現するがんを有する被験体を処置する方法であって、前記被験体に治療有効量の本発明の二重特異性抗体を投与することを含む方法をさらに提供する。

本発明は、ＣＥＡＣＡＭ５を発現するがんを有する被験体の生存期間を増加させる方法であって、前記被験体に治療有効量の本発明の二重特異性抗体を投与することを含む方法をさらに提供する。本発明のさらなる実施形態は、前記がんが、結腸直腸がん、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、胃がん、膵臓がんまたは乳房であることを特徴とする本発明の方法である。

本発明はさらに、ＣＥＡＣＡＭ５を発現するがんを有する対象を処置する方法であって、治療有効量の本発明による二重特異性抗体を対象に投与することを含む方法を提供する。本発明のさらなる実施形態は、化学療法または放射線療法と組み合わせて本発明の二重特異性抗体をヒト被験体に投与することを特徴とする本発明の方法である。

本発明は、ＣＥＡＣＡＭ５を発現するがんを有する被験体を処置するための医薬の製造における本発明の二重特異性抗体の使用をさらに提供する。本発明のさらなる実施形態は、本発明の医薬の製造のための本発明の二重特異性抗体であり、がんは、結腸直腸がん、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、胃がん、膵臓がんおよび乳がんからなる群より選択されることを特徴とする。

本発明は、ＣＥＡＣＡＭ５を発現するがんを有する被験体の処置において、ヒトＣＥＡＣＡＭ５に特異的に結合する第３の結合部分と、ヒトＣＤ３εに特異的に結合する第４の結合部分とを含む第２の二重特異性抗体と同時に、別個にまたは逐次に組み合わせて使用するための本発明の二重特異性抗体をさらに提供する。本発明のさらなる実施形態は、ＣＥＡＣＡＭ５を発現するがんを有する被験体の処置において、ＴＣＢ２０１４またはｃｉｂｉｓａｔａｍａｂと同時に、別個にまたは逐次に組み合わせて使用するための本発明の二重特異性抗体である。

本発明のさらなる実施形態は、ＣＥＡＣＡＭ５を発現するがんを有する被験体の処置において、前記第２の二重特異性抗体と同時に、別個にまたは逐次に組み合わせて使用するための本発明の二重特異性抗体である。

本発明のさらなる実施形態は、本発明の二重特異性抗体および第２の二重特異性抗体が、６～１５日間隔で前記被験体に交互に投与されることを特徴とする、本発明の使用のための本発明の二重特異性抗体である。

本発明のさらなる実施形態は、本発明の二重特異性抗体および第２の二重特異性抗体が、６～１５日間隔で前記被験体に同時に投与されることを特徴とする、本発明の使用のための本発明の二重特異性抗体である。

本発明のさらなる実施形態は、本発明の使用のための、ヒトＣＥＡＣＡＭ５に特異的に結合する第１の結合部分と、本発明のヒトＣＤ４７に特異的に結合する第２の結合部分とを含む本発明の第１の二重特異性抗体であって、前記がんが、結腸直腸がん、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、胃がん、膵臓がんおよび乳がんであることを特徴とする本発明の第１の二重特異性抗体である。

本発明のさらなる実施形態は、腫瘍（がん）、特に固形腫瘍、特にＣＥＡを発現する固形がん、特に結腸直腸がん、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、胃がん、膵臓がんおよび乳がんと診断されたヒト患者の処置のための方法であって、有効量の本発明の二重特異性抗体と、ＣＥＡＣＡＭ５およびＣＤ３に対する上記第２の二重特異性抗体（一実施形態では、ＴＣＢ２０１４、一実施形態では、ｃｉｂｉｓａｔａｍａｂ）とを前記ヒト患者に投与することを含み、続いて、
前記患者に０．１～１０ｍｇ／ｋｇ、さらなる実施形態では０．５～１０ｍｇ／ｋｇ、さらなる実施形態では１～２ｍｇ／ｋｇの用量の前記第２の抗ＣＥＡｘＣＤ３抗体を例えば４～１２週間にわたって毎週または４～１２週間にわたってｑ２ｗ投与すること、およびこれらの４～１２週間後に、および前記抗ＣＥＡｘＣＤ３抗体のさらに２または３または４消失半減期を待った後に、前記患者に０．１～２０ｍｇ／ｋｇの用量の本発明の抗体を投与すること、
前記患者に本発明の前記抗体を、例えば、さらに１２週間、ｑ１、ｑ２ｗ、ｑ３ｗまたは必要に応じてｑ４ｗ投与すること、およびその後必要に応じて、ＣＥＡｘＣＤ３二重特異性抗体の投与、その後の本発明による二重特異性抗体の投与の前記サイクルを反復すること、および必要に応じてそのサイクルを再び反復することなど
を含む方法である。

本発明の前記ＣＥＡｘＣＤ３二重特異性抗体およびＣＥＡｘＣＤ４７二重特異性抗体が競合的ではないので、２つの二重特異性抗体はまた、患者が、並行して両二重特異性抗体の治療的に有効な血漿および組織濃度を経験する方法（「同時方法」）で投与され得、例えば、患者にほぼ同じ時間に０．１～１０ｍｇ／ｋｇ、さらなる実施形態では０．５～１０ｍｇ／ｋｇ、さらなる実施形態では１～２ｍｇ／ｋｇの用量のＣＥＡｘＣＤ３二重特異性抗体および３～３０ｍｇ／ｋｇ、さらなる実施形態では１～１０ｍｇ／ｋｇの用量の本発明のＣＥＡｘＣＤ４７二重特異性抗体を投与し、続いて、ｑ１ｗまたはｑ２ｗまたはｑ３ｗまたは必要に応じてｑ４ｗの頻度でこれらの組み合わせ投与を１回またはそれを超えて行う。「ｑ１ｗ」という用語は、週に１回の投与を意味する。ｑ２ｗは、２週間ごとの投与を意味するなど。

安全上の理由から、一実施形態では、本発明のｂｓＡｂを加えずに前記第２の抗体ＣＥＡｘＣＤ３による治療を開始し、ＣＥＡｘＣＤ３について典型的なサイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）が終わった後にのみ（通常、ＴＡＡｘＣＤ３抗体の２または３の用量後に）２つのｂｓＡｂの同時投与を開始することが必要になり得る。

本発明は、本発明の抗体と、薬学的に許容され得る賦形剤または担体とを含む医薬組成物をさらに提供する。

本発明は、医薬として使用するための、本発明の抗体を含む医薬組成物をさらに提供する。１つのそのような実施形態では、本発明は、固形腫瘍障害の処置における医薬として使用するための、本発明の抗体を含む医薬組成物を提供する。一実施形態では、医薬組成物は、結腸直腸がん、ＮＳＣＬＣ（非小細胞肺がん）、胃がん、膵臓がんまたは乳がんの処置における医薬として使用するための、本発明の抗体を含む。

本発明は、ＣＥＡＣＡＭ５を発現するがんを有する被験体の処置において、上で定義されるＴＣＢ２０１４またはｃｉｂｉｓａｔａｍａｂと同時に、別個にまたは逐次に組み合わせて使用するための、本発明の二重特異性抗体を含む組成物であって、３００ｎＭの濃度の前記第２の二重特異性抗体が、ＭＫＮ－４５および／またはＬＳ１７４Ｔ細胞への本発明の二重特異性抗体の結合曲線のＥＣ５０を一実施形態ではより高い濃度の方向に３倍超シフトさせない組成物である。本発明のさらなる実施形態は、がんが、結腸直腸がん、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、胃がん、膵臓がんまたは乳がんであることを特徴とする本発明の組成物である。

本発明は、医薬組成物の製造のための本発明の抗体の使用をさらに提供する。

本発明は、医薬組成物の製造のための、本発明の抗体と、薬学的に許容され得る賦形剤または担体との使用をさらに提供する。

本発明は、固形腫瘍障害の処置における医薬の製造のための本発明の抗体の使用をさらに提供する。本発明のさらなる実施形態は、結腸直腸がん、ＮＳＣＬＣ（非小細胞肺がん）、胃がん、膵臓がんまたは乳がんの処置における本発明の抗体の使用である。

本発明の別の態様は、腫瘍細胞の細胞溶解を誘導する方法であって、前記腫瘍細胞を、上記実施形態のいずれかの二重特異性抗体と接触させることを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、腫瘍細胞は、結腸直腸がん細胞、ＮＳＣＬＣ（非小細胞肺がん）、胃がん細胞、膵臓がん細胞または乳がん細胞である。一実施形態では、細胞溶解は、本発明による二重特異性抗体の抗体依存性細胞食作用および／または抗体依存性細胞媒介性細胞傷害により誘導される。

本発明の別の態様は、ＣＥＡＣＡＭ５を異常発現するがんを有する被験体を処置する方法であって、前記被験体に、治療有効量の上記実施形態のいずれかの二重特異性抗体を投与することを含む方法を提供する。

本発明の別の態様は、ＣＥＡＣＡＭ５を異常発現するがんを有する対象を処置する方法であって、治療有効量の上記実施形態のいずれかの二重特異性抗体を、ヒトＣＥＡおよびヒトＣＤ３に結合する二重特異性抗体と組み合わせて、対象に投与することを含む方法を提供する。本発明によるＣＥＡｘＣＤ３二重特異性抗体およびＣＥＡｘＣＤ４７二重特異性抗体が競合的ではないかまたは最小限に競合的であるにすぎないので、それらを逐次にだけではなく並行して（同時に）も与え得るが、これは、ＣＥＡｘＣＤ３二重特異性抗体によるＴ細胞の係合を介した、およびそれと同時に本発明によるＣＥＡｘＣＤ４７二重特異性抗体によるマクロファージの係合を介した腫瘍細胞殺傷が相加的であるか、または相乗的でさえあり得るので、非常に有益であり得、これは、両薬物を並行して与えると有効性が増加することを意味する。

本発明の別の態様は、ＣＥＡＣＡＭ５を異常発現するがんを有する被験体の無進行生存および／または全生存期間を増加させる方法であって、前記被験体に治療有効量の上記実施形態のいずれかの二重特異性抗体を投与することを含む方法を提供する。一実施形態では、がんは、結腸直腸がん、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、胃がん、膵臓がんまたは乳がん、またはＣＥＡＣＡＭ５を発現する別のがんである。

これらの方法の特定の実施形態では、本発明による二重特異性抗体は、化学療法または放射線療法と組み合わせて投与される。一実施形態では、被験体は、結腸直腸がんまたは肺がんまたは胃がんまたは膵臓がんまたは乳がん、またはＣＥＡＣＡＭ５を発現する別のがんを患っている患者である。

本発明の別の態様は、ＣＥＡＣＡＭ５を異常発現するがんを有する被験体を処置する方法であって、前記被験体に、ヒトＣＥＡおよびヒトＣＤ３イプシロンに対する二重特異性抗体と組み合わせて治療有効量の上記実施形態のいずれかの二重特異性抗体を投与することを含む方法を提供する。

本発明の別の態様は、ＣＥＡＣＡＭ５を異常発現するがんを有する被験体の無進行生存期間および／または全生存期間を増加させる方法であって、前記被験体に治療有効量の上記実施形態のいずれかの二重特異性抗体を投与することを含む方法を提供する。一実施形態では、がんは、結腸直腸がん、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、胃がん、膵臓がんまたは乳がんである。

これらの方法の特定の実施形態では、本発明による二重特異性抗体は、化学療法または放射線療法と組み合わせて投与される。一実施形態では、被験体は、結腸直腸がんまたは肺がんまたは胃がんまたは膵臓がんまたは乳がん、またはＣＥＡＣＡＭ５を発現する別のがんを有するがん患者である。

本発明の別の実施形態は、上記処置方法のいずれかのための本発明の二重特異性抗体の使用を提供する。一実施形態では、がんは、結腸直腸がん、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、胃がん、膵臓がんおよび乳がんからなる群より選択される。

現在の技術水準の二重特異性ＣＥＡｘＣＤ４７抗体Ｋ２ＡＣ２２と比較した、本発明による５つのＣＤ４７ｘＣＥＡＣＡＭ５二重特異性抗体（Ｋ２ＡＣ８２、Ｋ２ＡＣ８４、Ｋ２ＡＣ９１、Ｋ２ＡＣ１００およびＫ２ＡＣ１１７）の濃度依存的結合。これらの図はまた、６つのＣＥＡＣＡＭ５発現がん細胞株における対応する抗ＣＤ４７一価抗体、無関係のｈＩｇＧ１対照（ｈＩｇＧ１、ＣＤ４７一価についての線の下の線）および二価抗ＣＤ４７ ｍＡｂ（ｈＢ６Ｈ１２、点線）の結合を示す：（図１Ａ）ＳＫ－ＣＯ－１細胞、（図１Ｂ）ＭＫＮ－４５細胞、（図１Ｃ）ＨＰＡＦ－ＩＩ細胞、（図１Ｄ）ＳＮＵ－Ｃ１細胞、（図１Ｅ）Ｌｓ１７４Ｔ細胞および（図１Ｆ）ＬｏＶｏ細胞。本発明による二重特異性抗体のＥＣ５０は、Ｋ２ＡＣ２２のＥＣ５０より低く、本発明による二重特異性抗体の最大結合（ＭＦＩ）は、Ｋ２ＡＣ２２の最大結合より高い。 同上。 同上。

現在の技術水準のＣＥＡＣＡＭ５ｘＣＤ４７二重特異性抗体Ｋ２ＡＣ２２と比較した、本発明による２つのＣＥＡＣＡＭ５ｘＣＤ４７二重特異性抗体（Ｋ２ＡＣ８４およびＫ２ＡＣ１００）によって誘導されたＬｏＶｏがん細胞の濃度依存的食作用。これらの図はまた、対応する抗ＣＤ４７一価抗体およびアイソタイプ対照ｈＩｇＧ１によって誘導される食作用を示す。図２Ａ～２Ｆは、６人の異なるヒトドナー（（図２Ａ）ドナー８６２、（図２Ｂ）ドナー８７２、（図２Ｃ）ドナー８７３、（図２Ｄ）ドナー８６３、（図２Ｅ）ドナー８７４および（図２Ｆ）ドナー８６６）のＰＢＭＣ（末梢血単核細胞）由来のマクロファージを用いて得られたデータを示す。ほとんどのドナーで、本発明による２つの抗体によって誘導される食作用は、Ｋ２ＡＣ２２よりも優れている。 同上。 同上。

現在の技術水準のアフコシル化ＣＥＡＣＡＭ５ｘＣＤ４７二重特異性抗体Ｋ２ＡＣ２２と比較した、４～５個の本発明によるアフコシル化ＣＥＡＣＡＭ５ｘＣＤ４７二重特異性抗体（Ｋ２ＡＣ８２ ａｆｕｃｏ、Ｋ２ＡＣ８４ ａｆｕｃｏ、Ｋ２ＡＣ９１ ａｆｕｃｏ、Ｋ２ＡＣ１００ ａｆｕｃｏおよびＫ２ＡＣ１７７ ａｆｕｃｏ）によって誘導されたＣＥＡＣＡＭ５発現がん細胞の濃度依存的食作用。これらの図は、対応する抗ＣＤ４７一価抗体およびｈＩｇＧ１アイソタイプ対照（ｈＩｇＧ１）によって誘導される食作用も示す。図３Ａは、標的細胞としてＭＫＮ－４５を用い、２人のヒトドナー（ドナー（Ｄ）８３０、ドナー（Ｄ）８３１）のＰＢＭＣ由来のマクロファージ（末梢血単核細胞）を用いて得られたデータを示し、図３Ｂは、標的細胞としてＳＮＵ－Ｃ１を用い、２人のヒトドナー由来のマクロファージ（ドナー（Ｄ）８３１、ドナー（Ｄ）８３３）を用いて得られたデータを示す。ドナーに関して、本発明による抗体によって誘導される食作用は、Ｋ２ＡＣ２２よりも優れている。 同上。

現在の技術水準のＣＥＡＣＡＭ５ｘＣＤ４７二重特異性抗体Ｋ２ＡＣ２２と比較した、本発明による５つのＣＥＡＣＡＭ５ｘＣＤ４７二重特異性抗体（Ｋ２ＡＣ８２、Ｋ２ＡＣ８４、Ｋ２ＡＣ９１、Ｋ２ＡＣ１００およびＫ２ＡＣ１７７）によるＣＤ４７／ＳＩＲＰα遮断活性。この図はまた、対応する抗ＣＤ４７一価抗体によるＣＤ４７／ＳＩＲＰａ遮断活性を示す。２つの陰性対照を比較のために加え、ｈＩｇＧ１アイソタイプ対照（ｈＩｇＧ１）を加えたか、またはいかなるＡｂも加えなかった。二価ｍＡｂ ｈＢ６Ｈ１２を陽性対照として加えた。本発明による５つのＣＥＡＣＡＭ５ｘＣＤ４７二重特異性抗体（Ｋ２ＡＣ８２、Ｋ２ＡＣ８４、Ｋ２ＡＣ９１、Ｋ２ＡＣ１００およびＫ２ＡＣ１７７）はすべて、現在の技術水準のＣＥＡＣＡＭ５ｘＣＤ４７二重特異性抗体Ｋ２ＡＣ２２と比較して、改善された遮断活性を示した。

ＣＥＡＣＡＭ５発現細胞ＭＫＮ－４５の細胞表面における、抗ＣＥＡＣＡＭ５ ｍＡｂ、ＴＣＢ２０１４およびＴＣＢ２０１７の存在下でのＣＤ４７ｘＣＥＡＣＡＭ５二重特異性抗体Ｋ２ＡＣ１００の濃度依存的結合。Ｋ２ＡＣ１００を蛍光色素で直接標識し、３００ｎＭのＴＣＢ２０１４（暗い線、暗い三角形）または３０ｎＭのＴＣＢ２０１７（暗い線、黒いひし形）の存在下でＭＫＮ－４５細胞単独（暗い線、暗い円）への結合を追跡した。陰性対照（Ｃｔｒｌ）を使用した（ＴＣＢ２０１４またはＴＣＢ２０１７の存在下でのＩｇＧ１）。

用語は、以下のように特に定義されない限り、当技術分野で一般的に使用されるように本明細書で使用される。

本発明による抗体は、以下の特性のうちの１またはそれを超える有益な特性を有する：
‐ＣＥＡＣＡＭ３対ＣＥＡＣＡＭ５への結合についてのＫＤ値の比、
‐低ＣＥＡ発現腫瘍細胞における最大の食作用指数（Ｅｍａｘ）、および／または
‐腫瘍細胞の表面上のＣＤ４７へのＳＩＲＰαの結合の阻害（低ＩＣ５０）。

本発明による抗体は、驚くべきことに、実施例３および表２に示すように、ＣＥＡＣＡＭ３対ＣＥＡＣＡＭ５に対する結合の有益な比を示す。例えば、Ｋ２ＡＣ１００は、Ｋ２ＡＣ２２の結合親和性（ＫＤ）と比較して、ＣＥＡＣＡＭ５に対して２５倍高い結合親和性（より低いＫＤ）を示すが、驚くべきことに、ＣＥＡＣＡＭ３に対してわずか１４倍高い結合親和性（より低いＫＤ）を示す。同様に、Ｋ２ＡＣ８４は、Ｋ２ＡＣ２２の結合親和性（ＫＤ）と比較して、ＣＥＡＣＡＭ５に対して４６倍高い結合親和性（ＫＤ）を示すが、驚くべきことに、ＣＥＡＣＡＭ３に対してわずか２８倍高い結合親和性（ＫＤ）を示す。したがって、ＣＥＡＣＡＭ５への結合についてのＫＤ値に対するＣＥＡＣＡＭ３への結合についてのＫＤ値の比は、Ｋ２ＡＣ２２については８３であるが、Ｋ２ＡＣ１００については１４６であり、Ｋ２ＡＣ８４については１３７である。

ＣＥＡＣＡＭ５またはＣＥＡＣＡＭ６などのいくつかのファミリーメンバーは上皮細胞によって発現されるが、ＣＥＡＣＡＭ３（ＣＧＭ１またはＣＤ６６ｄ；ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ４０１９８）などの他のファミリーメンバーは、例えば細菌感染の排除に関与する細胞型であるヒト顆粒球上に排他的に発現される（Ｋｕｅｓｐｅｒｔ Ｋら、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２００６、Ｐｉｌｓ Ｓら、Ｉｎｔ Ｊ Ｍｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００８）。ＣＥＡＣＡＭ５とＣＥＡＣＡＭ３との間の高い配列相同性にもかかわらず、ＣＥＡＣＡＭ３は、ＣＥＡＣＡＭファミリーの他のメンバーとは対照的に細胞－細胞接着を支持せず、むしろ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、Ｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、およびＭｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ（Ｋｕｒｏｋｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９１；Ｐｉｌｓ Ｓら、Ｉｎｔ Ｊ Ｍｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００８）を含む限られたセットのグラム陰性菌のオプソニン非依存的な認識および排除を媒介する。ＣＥＡＣＡＭ３は、自然免疫系の食作用性受容体として論じられている（Ｓｃｈｍｉｔｔｅｒら、Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ．２００４）。本発明者らの知識によれば、ＣＥＡＣＡＭ５およびＣＤ４７に対する二重特異性抗体は、もしＣＥＡＣＡＭ３にも相当に結合するならば、好中球顆粒球に有害作用を及ぼすであろうし、好中球の数を減少させ得る、すなわち食作用の増加によって好中球減少症を誘導し得る。これは、即時の医学的介入なしに生命を脅かす可能性がある細菌感染症を発症するリスクを高め得る。高い結合親和性は、低いＫＤを特徴とする。ＣＥＡＣＡＭ５とＣＥＡＣＡＭ３との間のＣＥＡ標的化二重特異性抗体の分布は、これらの２つのＣＥＡＣＡＭファミリーメンバーに対する結合親和性の比によって決定される。ＣＥＡＣＡＭ５への結合についてのＫＤに対してＣＥＡＣＡＭ３への結合についてのＫＤの比が高いことは、ＣＥＡＣＡＭ５への結合と比較してＣＥＡＣＡＭ３への二重特異性抗体の結合が少ないことを意味し、これは有益であろう。

本発明による抗体は、驚くべきことに、一実施形態では、それぞれの細胞株におけるＫ２ＡＣ２２の食作用指数と比較して、低ＣＥＡ発現腫瘍細胞（ＬｏＶｏ細胞株など）における食作用指数の有益な最大値（Ｅｍａｘ）を示す。表５によれば、本発明の二重特異性抗体は、最新技術の二重特異性抗体Ｋ２ＡＣ２２と比較して、ＬｏＶｏ細胞（細胞表面上の４０００個のＣＥＡＣＡＭ５）の食作用指数曲線の最大値が８．５～１７％高いことを示す。ＬＳ１７４Ｔ細胞（細胞表面上の２６０００個のＣＥＡＣＡＭ５）の場合、食作用指数の最大値は、Ｋ２ＡＣ２２と比較して本発明の抗体について８．７～２０．６％高い（表５）。ＳＮＵ－Ｃ１またはＭＫＮ－４５などのより高いＣＥＡＣＡＭ５発現細胞では、Ｅｍａｘの増加はより低い。

したがって、より高いパーセンテージの患者を、本発明による二重特異性抗体で首尾よく処置することができた。

実施例５および１１に開示されるように、悪性細胞におけるＣＥＡ発現は、ＲＮＡ発現または細胞表面ＣＥＡ分子の計数に関して有意に変動し得る。本発明の二重特異性抗体の食作用活性を研究するために使用されるＣＥＡ発現がん細胞株は、細胞表面上に平均１０８，０００個のＣＥＡ標的を発現する（実施例５、表３）。がん患者（結腸直腸および肺）の新鮮な腫瘍組織に由来するオルガノイドを、実施例１１に記載される方法によって調査した。これらの主要オルガノイドのＣＥＡＣＡＭ５の平均発現は、細胞あたり２８，０００個のＣＥＡＣＡＭ５標的として見出されており、すなわち表３に示すように細胞株上の平均発現よりも約４倍低い。したがって、ＣＥＡＣＡＭ５発現がより低い悪性細胞の食作用のために改善されている二重特異性抗体は、腫瘍治療での使用に有利であり得る。したがって、例えば肺腺癌、結腸直腸がんおよび他のＣＥＡＣＡＭ５発現腫瘍における不均一なおよび／またはかなり低い発現を考えると、そのような患者は、本発明のＣＥＡｘＣＤ４７二重特異性抗体で首尾よく処置することができる。

本発明による抗体は、驚くべきことに、実施例１０および図４に示されるように、抗体Ｋ２ＡＣ２２と比較して、腫瘍細胞の表面上のＣＤ４７へのＳＩＲＰαの結合の有益な阻害（低いＩＣ５０）を示す。マクロファージ上のＳＩＲＰαと腫瘍細胞上のＣＤ４７との相互作用は、腫瘍細胞の食作用を阻害し、これはこの相互作用の効果的な阻害が食作用を増加させることを意味する。

本明細書で使用される場合、「Ｅｍａｘ」という用語は、化合物の最大活性を表す。例えば、細胞殺傷アッセイでは、Ｅｍａｘは、所与の時間枠内でのマクロファージによるがん細胞の排除／殺傷（例えばカルセインＡＭで標識されている、実施例７を参照のこと）を表す。これは、腫瘍浸潤マクロファージの総数が限られているため、臨床的に重要であると推定される：例えば、腫瘍細胞の数の２倍が時間間隔当たりに排除される場合、これは、１回当たり同じ数の腫瘍細胞を排除するために存在する必要があるマクロファージの数の半分に等しい。

本明細書で使用される場合、「ＥＣ５０」という用語は、最大活性の半分（Ｅｍａｘ／２）に達する化合物濃度を表す。低ＥＣ５０は、より少ない量の化合物を注入することを必要とする場合に有用であり、したがって、例えば、より高いＥＣ５０および／または潜在的により低い副作用率と比較してより低い製造コストを達成するのに有用である。したがって、ＥｍａｘおよびＥＣ５０は、化合物活性の異なる態様を記載する。同等のＥｍａｘの２つの化合物では、より低い濃度で同じ治療効果を達成することができ、したがって投与される薬物の量が少なくなり、達成される副作用の割合が潜在的に低くなるので、ＥＣ５０が重要になる。

本明細書で使用される場合、「抗原結合部分」および「結合部分」という用語は、その最も広い意味で、ＣＥＡ、ＣＤ４７およびＣＤ３などの抗原決定基に特異的に結合する抗体の部分を指す。

より具体的には、本明細書で使用される場合、膜結合ヒト癌胎児性抗原（ＣＥＡ、ＣＥＡＣＡＭ５と同じ）またはＣＤ４７に結合する結合部分は、ＣＥＡまたはＣＤ４７、より具体的には細胞表面または膜結合ＣＥＡまたはＣＤ４７に特異的に結合する。したがって、各結合部分は、ＣＥＡまたはＣＤ４７のいずれかに結合する。「特異的に結合する、に特異的な、に結合する」は、結合が抗原に選択的であり、望ましくないまたは非特異的な相互作用と区別され得ることを意味する。いくつかの実施形態では、非関連非標的タンパク質への抗標的抗体の結合の程度は、例えば、バイオレイヤー干渉法、例えば、Ｏｃｔｅｔ（登録商標）、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、例えばＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）、酵素結合免疫吸着（ＥＬＩＳＡ）またはフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）により測定される場合、前記標的への抗体の結合よりも約１０倍、好ましくは＞１００倍未満である。標的は、本明細書で議論されるタンパク質、例えばＣＥＡ、ＣＤ４７およびＣＤ３εである。

ＣＥＡおよびＣＤ４７に特異的に結合する、ＣＥＡおよびＣＤ４７に結合する、ならびにＣＥＡおよびＣＤ４７に特異的なという語句は、一実施形態では、ＣＥＡＣＡＭ５およびＣＤ４７を発現する腫瘍細胞のターゲティングにおいて抗体が治療剤として有用であるような十分な親和性で、標的ＣＥＡおよびＣＤ４７に結合することができる抗体、例えば二重特異性抗体を指す。特定のＥＣ５０値を有するＭＫＮ－４５、ＳＮＵ－Ｃ１、ＬＳ１７４Ｔ、ＳＫ－ＣＯ－１、ＨＰＡＦ－ＩＩおよび／またはＬｏＶｏ細胞への結合への言及は、フローサイトメトリーによって測定されるＥＣ５０値を指す（実施例６参照）。

本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、２つの重鎖および２つの軽鎖を含む抗体を指す。一実施形態では、抗体は全長抗体である。本明細書で使用される場合、「抗体重鎖」という用語は、全長抗体について定義される可変領域および定常領域からなる抗体重鎖を指す。本明細書で使用される場合、「抗体軽鎖」という用語は、全長抗体について定義される可変領域および定常領域からなる抗体軽鎖を指す。

「全長抗体」という用語は、２つの「全長抗体重鎖」および２つの「全長抗体軽鎖」からなる抗体を表す。「全長抗体重鎖」は、Ｎ末端からＣ末端方向に、抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、抗体定常重鎖ドメイン１（ＣＨ１）、抗体ヒンジ領域（ＨＲ）、抗体重鎖定常ドメイン２（ＣＨ２）および抗体重鎖定常ドメイン３（ＣＨ３）からなるポリペプチドであり、ＶＨ－ＣＨ１－ＨＲ－ＣＨ２－ＣＨ３と略される。「全長抗体軽鎖」は、Ｎ末端からＣ末端方向に、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）および抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）からなるポリペプチドであり、ＶＬ－ＣＬと略される。抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）は、κ（カッパ）またはλ（ラムダ）であり得る。２つの全長抗体ドメインは、ＣＬドメインとＣＨ１ドメインとの間および全長抗体重鎖のヒンジ領域間のポリペプチド間ジスルフィド結合を介して互いに連結される。典型的な全長抗体の例は、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２）、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥのような天然抗体である。本発明の全長抗体は、一実施形態ではヒトＩｇＧ１タイプのものであり、さらなる一実施形態では以下で定義されるようにＦｃ部分中に１つもしくはそれを超えるアミノ酸置換を含み、および／またはＡｓｎ２９７に結合した多糖鎖で糖操作されている。本発明の全長抗体は、それぞれがＶＨとＶＬとの対により形成される２つの結合部分であって、一方がＣＥＡに結合し、他方がＣＤ４７に結合する２つの結合部分を含む。

本明細書で使用され、上で言及される場合、「相補性決定領域」（ＣＤＲ）は、重鎖および軽鎖ポリペプチドの両方の可変領域内に見られる非隣接抗原結合部位（抗原結合領域としても公知である）を表す。ＣＤＲは「超可変領域」（ＨＶＲ）とも称され、その用語は、本明細書では、抗原結合領域を形成する可変領域の部分に関して、「ＣＤＲ」という用語と互換的に使用される。この特定の領域は、Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ（１９９１）に記載されており、これは参照により本明細書に組み込まれる。Ｋａｂａｔにより定義されるＣＤＲを包含する適切なアミノ酸残基は、以下の配列表に記載されている。特定のＣＤＲを包含する正確な残基番号は、ＣＤＲの配列およびサイズに応じて変動する。当業者は、抗体の可変領域アミノ酸配列を考慮して、どの残基が特定のＣＤＲを含むかをルーチンに決定し得る。本明細書で使用される場合、「配列番号ｘのＣＤＲＬ１を含む」という用語は、言及される可変軽鎖のＣＤＲＬ１領域が配列番号ｘのものである（ＣＤＲＬ１として配列番号ｘのＣＤＲＬ１を含む）ことを指す。これは他のＣＤＲにも当てはまる。別段示されない限り、ＨＶＲ残基は、本明細書では上記のＫａｂａｔらに従ってナンバリングされ、「ＣＤＲ」と命名され、本発明による二重特異性抗体における他の特定のアミノ酸残基位置のナンバリングへの言及もまた、Ｋａｂａｔナンバリングシステムに従う。

本明細書で使用される場合、「Ｆｃ領域」および「Ｆｃドメイン」という用語は、ＩｇＧ重鎖のＣ末端領域を指す；ＩｇＧ１抗体の場合、Ｃ末端領域は－ＣＨ２－ＣＨ３を含む（上記を参照のこと）。ＩｇＧ重鎖のＦｃ領域中の境界はわずかに変動し得るが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、通常、位置Ｃｙｓ２２６のアミノ酸残基からカルボキシル末端まで広がるとして定義される。定常領域は技術水準で周知であり、例えば、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａにより記載されている（例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｇ．，ａｎｄ Ｗｕ，Ｔ．Ｔ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２８（２０００）２１４－２１８；Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７２（１９７５）２７８５－２７８８を参照のこと）。

ＩｇＧ分子は、各重鎖に１つずつ、そのＦｃ領域に２つのＮ結合型オリゴ糖を担持する。任意の糖タンパク質として、抗体は、同じポリペプチド骨格を共有するが、グリコシル化部位に結合した異なるオリゴ糖を有するグリコフォームの集団として産生される。グリカン部分中のフコース含有量が減少した抗体は、通常フコシル化抗体（Ｎｉｗａ Ｒら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ、６４、２１２７～３３、２００４）と比較して、より高い抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性を示す。フコース付加に関与する遺伝子（α１，６－フコシルトランスフェラーゼ；ＦＵＴ８）の両方の対立遺伝子をノックアウトした細胞株は、米国特許第６９４６２９２号、米国特許第７４２５４４６号、米国特許第８０６７２３２号に記載されている（それぞれその全体が参照により組み込まれる）。そのような細胞株を使用して、本発明による二重特異性抗体は、フコース含有量が減少し、ＡＤＣＣおよび抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）が増加したグリカン部分を用いて産生され得る。フコース含有量が減少した抗体を産生するために使用することができる別の技術は、米国特許第８６４２２９２号に記載されている（参照により本明細書に組み込まれる）。この技術は、ＣＨＯ細胞株などのような抗体産生細胞株への異種細菌酵素の安定な組み込みを構成するように設計されている。この手段により、Ｄ－マンノースからのフコースのデノボ合成が遮断される。さらに、産生細胞を、フコースを含まない培地で培養すると、結果として、安定したレベルのアフコシル化を有する抗体が産生される。本発明のアフコシル化二重特異性抗体を産生および精製するための例示的な方法は、実施例９（１．および２．）に記載されている。

Ｆｃドメイン内の変異はまた、異なるＦｃ受容体に対するＦｃドメインの結合特性を変化させることができる（国際公開第２００４０６３３５１号、国際公開第２００４０９９２４９号、国際公開第２００５０１８６６９号、国際公開第２００５０６３８１５号、国際公開第２００５１１０４７４号、国際公開第２００５０５６７５９号、国際公開第２００５０９２９２５号、国際公開第２００５０１８５７２号、国際公開第２００６０１９４４７号、国際公開第２００６１１６２６０号、国際公開第２００６０２３４２０号、国際公開第２００６０４７３５０号、国際公開第２００６０８５９６７号、国際公開第２００６１０５３３８号、国際公開第２００７０２１８４１号、国際公開第２００７００８９４３号、国際公開第２００７０２４２４９号、国際公開第２００７０４１６３５号、国際公開第２００７０４８０７７号、国際公開第２００７０４４６１６号、国際公開第２００７１０６７０７号、国際公開第２００８０２２１５２号、国際公開第２００８１４０６０３号、国際公開第２００８０３６６８８号、国際公開第２００８０９１７９８号、国際公開第２００８０９１９５４号、国際公開第２００８０９２１１７号、国際公開第２００８０９８１１５号、国際公開第２００８１２１１６０号、国際公開第２００８１５０４９４号、国際公開第２０１００３３７３６号、国際公開第２０１４１１３５１０号（それぞれその全体が参照により本明細書に組み込まれる））。

「エピトープ」という用語は、抗体に特異的に結合することができる任意のポリペプチド決定基を含む。特定の実施形態では、「エピトープ」は、分子の化学的に活性な表面基、例えばアミノ酸、糖側鎖、ホスホリルまたはスルホニルを含み、特定の実施形態では、特定の三次元構造特徴およびまたは特定の電荷特徴を有し得る。エピトープは、抗体が結合する標的の領域である。一実施形態では、本発明の二重特異性抗体は、ＣＥＡＣＡＭ５のＮ末端ドメイン（アミノ酸３５～１４４のＩｇ様Ｖタイプドメイン、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ０６７３１）に結合する。ＣＥＡＣＡＭ５へのＣＥＡｘＣＤ４７二重特異性抗体の結合位置は、エピトープビニングを介して達成される。エピトープビニングでは、ペアワイズコンビナトリアル方式で抗体を試験し、同じ結合領域について競合する抗体をビンに一緒にグループ化する。競合試験は、本明細書では、技術水準にしたがって、および本明細書に記載されているように抗ＣＥＡ抗体を用いて実施される。一実施形態では、本発明の二重特異性抗体は、ＣＥＡＣＡＭ５への結合について、参照抗体ＳＭ３Ｅと競合する。競合は、０．５μｇ／ｍｌの濃度のビオチン化ヒトＣＥＡＣＡＭ５を固定化し、参照の連続希釈（６７ｎＭ～０．０９ｎＭ）と共にインキュベートするアッセイにより測定される。本発明のＣＥＡｘＣＤ４７二重特異性抗体を０．１μｇ／ｍｌ、室温で１時間追加する。プレートを洗浄し、結合したＣＥＡｘＣＤ４７二重特異性抗体を検出する。

本明細書で使用される場合、「共通重鎖（ｃＨＣ）」という用語は、Ｎ末端からＣ末端方向に、抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、抗体定常重鎖ドメイン１（ＣＨ１）、抗体ヒンジ領域（ＨＲ）、抗体重鎖定常ドメイン２（ＣＨ２）および抗体重鎖定常ドメイン３（ＣＨ３）からなるポリペプチドを指し、ＶＨ－ＣＨ－ＨＲ－ＣＨ２－ＣＨ３と略される。本発明の二重特異性抗体に適切な共通重鎖は、国際公開第２０１２０２３０５３号、国際公開第２０１３０８８２５９号、国際公開第２０１４０８７２４８号および国際公開第２０１６１５６５３７号（これらはそれぞれ、その全体が参照により組み込まれる）に記載されている抗ＣＤ４７抗体の重鎖である。一実施形態では、本発明による二重特異性抗体の共通の重鎖は、重鎖ＣＤＲとして、配列番号１のＣＤＲＨ１、配列番号２のＣＤＲＨ２および配列番号３のＣＤＲＨ３を含む。一実施形態では、本発明による二重特異性抗体のｃＨＣは、重鎖可変領域ＶＨとして配列番号４のＶＨ領域を含む。一実施形態では、本発明による二重特異性抗体の共通の重鎖ｃＨＣのＦａｂ部分は、配列番号５（ＶＨ－ＣＨ１）のものである。一実施形態では、本発明による二重特異性抗体の共通の重鎖ｃＨＣは、配列番号６（ＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３）のものである。配列番号６は、ＩｇＧ１ Ｆｃ部分をさらに含む重鎖である。一実施形態では、本発明による抗体は、ｃＨＣ（κλ体）を含むκλ二重特異性抗体である。

「κλボディフォーマットは、標準的なＩｇＧ分子と区別不可能な二重特異性抗体であって、標準的なモノクローナル抗体と区別不可能な特徴を有する二重特異性抗体のアフィニティー精製を可能にし（例えば、国際公開第２０１３０８８２５９号、国際公開第２０１２０２３０５３号を参照のこと）、患者において免疫原性の可能性がないかまたは低いことを約束する。

共通重鎖を含む本発明の二重特異性抗体は、例えば、国際公開第２０１２０２３０５３号（その全体が参照により組み込まれる）にしたがって作製され得る。国際公開第２０１２０２３０５３号に記載されている方法は、ヒト免疫グロブリンと構造が同一の二重特異性抗体を生成する。このタイプの分子は、２コピーのユニークな重鎖ポリペプチドと、定常カッパドメインに融合された第１の軽鎖可変領域と、定常ラムダドメインに融合された第２の軽鎖可変領域とから構成される。一方の結合部位はＣＥＡへの特異性を示し、他方の部位はＣＤ４７への特異性を示し、それぞれに対して重鎖および各軽鎖が寄与する。軽鎖可変領域は、ラムダまたはカッパファミリーのものであり得、好ましくは、それぞれラムダおよびカッパ定常ドメインに融合される。これは、非天然ポリペプチド結合の生成を回避するために好ましい。しかしながら、第１の特異性については、カッパ軽鎖可変ドメインを定常ラムダドメインに融合することにより、または第２の特異性については、ラムダ軽鎖可変ドメインを定常カッパドメインに融合することにより、本発明の二重特異性抗体を得ることも可能である。その場合、他の軽鎖は常に、完全にカッパ（ＶＬおよびＣＬ）または完全にラムダである（いわゆる、カッパラムダ二重特異性抗体のハイブリッドフォーマット）。国際公開第２０１２０２３０５３号に記載されている二重特異性抗体は「κλボディ」である。このκλ－ボディフォーマットは、標準的なモノクローナル抗体と区別不可能な特徴を有する標準的なＩｇＧ分子と区別不可能な二重特異性抗体のアフィニティー精製を可能にするので、例えば、アミノ酸架橋または他の非天然エレメントを含む以前のフォーマットと比較して好ましい。

本明細書で使用される場合、「ＣＥＡ」および「ＣＥＡＣＡＭ５」という用語は、細胞表面糖タンパク質および腫瘍関連抗原（Ｇｏｌｄ ａｎｄ Ｆｒｅｅｄｍａｎ，Ｊ Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１２１：４３９－４６２，１９６５；Ｂｅｒｉｎｓｔｅｉｎ ＮＬ，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ．，２０：２１９７－２２０７，２００２）であるヒト癌胎児性抗原（ＣＥＡ，ＣＥＡＣＡＭ－５またはＣＤ６６ｅ；ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ０６７３１）を指す。本明細書で使用される場合、「ＣＥＡＣＡＭ３」という用語は、癌胎児性抗原関連細胞接着分子（ＣＥＡＣＡＭ）ファミリーのメンバーでもあるヒトＣＥＡＣＡＭ３（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ４０１９８（ＣＥＡＭ３＿ＨＵＭＡＮ）を指す。さらなる情報およびＣＥＡファミリーの他のメンバーに関する情報については、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇに見られ得る。

一実施形態では、本発明による二重特異性抗体は、ＴＣＢ２０１４と競合的ではない。二重特異性抗ＣＥＡＣＡＭ５×抗ＣＤ３ε抗体ｃｉｂｉｓａｔａｍａｂは、Ｂａｃａｃら（Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，２２（１３）、３２８６－９７（２０１６））に記載されている。ＴＣＢ２０１４の抗体鎖は、米国特許出願公開第２０１４０２４２０７９号（米国特許出願公開第２０１４０２４２０７９号（その全体が参照により組み込まれる）の配列番号１、２、２１、２２、２３および２７）に記載されている。さらなる二重特異性ＣＥＡｘＣＤ３ Ｍａｂ（ＴＣＢ２０１７）は、電荷修飾（ＣＤ３結合剤中のＶＨ／ＶＬ交換、ＣＥＡ結合剤中の電荷修飾、ヒト化ＣＥＡ結合剤）を有する分子Ｂ「２＋１ ＩｇＧ ＣｒｏｓｓＦａｂ，ｉｎｖｅｒｔｅｄ」として国際公開第２０１７０５５３８９号に記載されている（国際公開第２０１７０５５３８９号（参照によりその全体が組み込まれる）の配列番号３４、３６～３８を参照のこと）。本明細書で使用される場合、一実施形態では、「二重特異性ＣＥＡ×ＣＤ３抗体」は、抗体ＴＣＢ２０１４、ｃｉｂｉｓａｔａｍａｂまたは抗体ＴＣＢ２０１７を指す。

ｃｉｂｉｓａｔａｍａｂ、ＴＣＢ２０１４およびＴＣＢ２０１７は、細胞膜の近位に位置するＣＥＡＣＡＭ５のエピトープに結合する。対照的に、本発明のＣＥＡｘＣＤ４７二重特異性抗体は、ＣＥＡＣＡＭ５のＮ末端に近い細胞膜の遠位のエピトープに結合し、ＣＥＡＣＡＭ５への結合についてｃｉｂｉｓａｔａｍａｂ、ＴＣＢ２０１４およびＴＣＢ２０１７と競合しない。

「本明細書で使用される場合、「ＣＤ４７に特異的に結合する」、「ＣＤ４７に結合する」および「ＣＤ４７結合部分」という用語は、本発明の二重特異性抗体の文脈では、ヒトＣＤ４７に対する特異性を指す。ヒトＣＤ４７は複数回膜貫通タンパク質であり、３つの細胞外ドメイン（アミノ酸１９～１４１、１９８～２０７および２５７～２６８；ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｑ０８７２２を参照のこと）を含む。本明細書で使用される場合、「ＣＤ４７への結合親和性」は、バイオレイヤー干渉法（Ｏｃｔｅｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）および／または表面プラズモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）によって定量的に（ＫＤ）測定される。一実施形態では、本発明による二重特異性抗体のＣＤ４７への結合は、１またはそれを超える前記細胞外ドメインを介して起こる。

一実施形態では、本発明による抗体の第２の結合部分（ヒトＣＤ４７に特異的に結合する）は、軽鎖ＣＤＲとして配列番号７のＣＤＲＬ１、配列番号８のＣＤＲＬ２および配列番号９のＣＤＲＬ３を含む軽鎖と、重鎖ＣＤＲとして配列番号１のＣＤＲＬ１、配列番号２のＣＤＲＬ２および配列番号３のＣＤＲＬ３を含む重鎖とを特徴とする。一実施形態では、本発明による抗体の第２の結合部分（ヒトＣＤ４７に特異的に結合する）は、配列番号１０のカッパ軽鎖可変領域を特徴とする。一実施形態では、本発明による抗体の第２の結合部分（ヒトＣＤ４７に特異的に結合する）は、配列番号１１のカッパ軽鎖を特徴とする。一実施形態では、本発明による抗体の第２の結合部分（ヒトＣＤ４７に特異的に結合する）は、配列番号４の重鎖可変領域を特徴とする。一実施形態では、本発明による抗体の第２の結合部分（ヒトＣＤ４７に特異的に結合する）は、配列番号５の重鎖を特徴とする。一実施形態では、本発明による抗体の第２の結合部分（ヒトＣＤ４７に特異的に結合する）は、配列番号６の重鎖を特徴とする。

本明細書中で使用されるとき、用語「配列番号５の重鎖を特徴とする」とは、表１に示されるように、本発明による抗体のＦａｂ部分である重鎖のＶＨ－ＣＨ１部分のことを指す。そのような重鎖は、加えて、一般的な知識によれば、ヒンジ領域ＣＨ２、ＣＨ３としてさらなる部分を含むことができ、Ｆ（ａｂ’）_２フォーマットのような任意の抗体フォーマットであり得る。好ましいフォーマットは、上記のような共通の重鎖フォーマットである。

本明細書で使用される場合、「ＣＥＡに特異的に結合する」、「ＣＥＡに結合する」および「ＣＥＡ結合部分」という用語は、組換えヒトＣＥＡＣＡＭ５への本発明の二重特異性抗体の結合を指し、前記抗体は、組換えヒトＣＥＡＣＡＭ５への結合のＫＤ値と比較して１００倍またはそれを超えるＫＤ値で組換えヒトＣＥＡＣＡＭ３に結合する。本明細書で使用される「ＫＤ」という用語は、本発明による二重特異性抗体とその抗原ＣＥＡＣＡＭ５またはＣＥＡＣＡＭ３との間の平衡解離定数を指し、ｎＭで指定され、例えば表面プラズモン共鳴および／またはバイオレイヤー干渉法（実施例３）によって測定することができる。

細胞上のＣＥＡ（ＣＥＡＣＡＭ５）への結合を、ＬｏＶｏ、ＬＳ１７４Ｔ、ＭＫＮ－４５、ＳＮＵ－Ｃ１、ＳＫ－ＣＯ－１、ＨＰＡＦ－ＩＩなどの異なる腫瘍細胞株を使用することによって測定する。本発明による抗体の濃度は、上で定義した細胞への結合について得られるＥＣ５０値およびＥｍａｘ値に関して適切な範囲で変動する。本発明の二重特異性抗体の結合曲線を図１Ａ～１Ｆに示し、ＥＣ５０およびＥｍａｘを表４に列挙する。

本明細書で使用される場合、「膜結合ヒトＣＥＡ」という用語は、細胞の膜部分にまたは細胞の表面、特に腫瘍細胞の表面に結合したヒト癌胎児性抗原（ＣＥＡ）を指す。

本明細書で使用される場合、「ヒトＣＥＡおよびヒトＣＤ３に結合する二重特異性抗体」および「ＣＥＡｘＣＤ３ Ｍａｂ」という用語は、ヒトＣＥＡＣＡＭ５およびＣＤ３εに結合する二重特異性抗体を意味する。そのような抗体は、例えば、ｃｉｂｉｓａｔａｍａｂ、「ＴＣＢ２０１４」および「ＴＣＢ２０１７」である。本明細書で使用される場合、「ＴＣＢ２０１４」は、配列番号１、２、２１、および２２として米国特許出願公開第２０１４０２４２０７９号（その全体が参照により組み込まれる）に記載されているようなＣＥＡおよびＣＤ３に結合する二重特異性抗体を指す。本明細書で使用される場合、「ＴＣＢ２０１７」は、電荷修飾（ＣＤ３結合剤中のＶＨ／ＶＬ交換、ＣＥＡ結合剤中の電荷修飾、ヒト化ＣＥＡ結合剤）を有する２＋１ ＩｇＧ ＣｒｏｓｓＦａｂ，ｉｎｖｅｒｔｅｄ」フォーマットの分子Ｂを指す；国際公開第２０１７０５５３８９号（その全体が参照により組み込まれる）の配列番号３４、３６～３８。さらなるＣＥＡｘＣＤ３ Ｍａｂは、国際公開第２００７０７１４２６号、国際公開第２０１３０１２４１４号、国際公開第２０１５１１２５３４号、国際公開第２０１７１１８６７５号、米国特許出願公開第２０１４０２４２０７９号および国際公開第２０１７０５５３８９号（それぞれその全体が参照により組み込まれる）に記載されている。さらなるＣＥＡｘＣＤ３ Ｍａｂはｃｉｂｉｓａｔａｍａｂ（旧ＲＯ６９５８６８８）（例えば、Ｂａｃａｃら、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，２２（１３）、３２８６－９７（２０１６）を参照のこと）である。一実施形態では、本発明による前記ＣＥＡｘＣＤ４７ Ｍａｂは、競合的ではなく、かつ／またはＴＣＢ２０１４もしくはＴＣＢ２０１７と同じヒトＣＥＡＣＡＭ５のエピトープに結合しない。

本明細書で使用される場合、「ＣＤ３ε」および「ＣＤ３」は、ヒトＣＤ３ε（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ０７７６６（ＣＤ３Ｅ＿ＨＵＭＡＮ）を指す。「ＣＤ３ε（ＣＤ３）に対する抗体」および「抗ＣＤ３ε（ＣＤ３）抗体」という用語は、ＣＤ３εに特異的に結合する抗体に関する。一実施形態では、ＣＤ３εに対する抗体は、抗ＣＤ３抗体ＳＰ３４（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓカタログ番号５６５９８３）と同じエピトープに特異的に結合する。

一実施形態では、本発明の二重特異性抗体は、ＭＫＮ－４５および／またはＬＳ１７４Ｔ細胞上に提示されるＣＥＡへの結合について、ＴＣＢ２０１４および／またはＴＣＢ２０１７と競合しない。したがって、３００ｎＭ（ＴＣＢ２０１４）または３０ｎＭ（ＴＣＢ２０１７）の濃度のＴＣＢ２０１４は、ＭＫＮ－４５および／またはＬＳ１７４Ｔ細胞に対する本発明の前記二重特異性抗体の食作用指数曲線のＥＣ５０を一実施形態ではより高い濃度の方向に３倍超シフトさせない。

３００ｎＭのＴＣＢ２０１４の濃度が選択されたのは、この大きさの濃度が、１００ｍｇ ｉｖのようなｃｉｂｉｓａｔａｍａｂの治療有効用量で処置された患者の血漿中で測定されたからである（ｃｉｂｉｓａｔａｍａｂのＰＫデータについては、Ｍｅｌｅｒｏら、ＡＳＣＯ ２０１７，Ａｂｓｔｒａｃｔ ２５４９ ａｎｄ Ｐｏｓｔｅｒ Ｎｏ．４１，Ａｂｓｔｒａｃｔ ｉｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ３５，ｎｏ．１５＿ｓｕｐｐｌ（Ｍａｙ ２０，２０１７）２５４９－２５４９を参照のこと、それぞれの臨床結果については、Ｔａｂｅｒｎｅｒｏら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．３５，２０１７（ｓｕｐｐｌ．Ａｂｓｔｒ．３００２）を参照のこと）。ＰＤ－Ｌ１阻害剤と組み合わせたｃｉｂｉｓａｔａｍａｂの現在活発に募集されている研究では、１００ｍｇのｃｉｂｉｓａｔａｍａｂが投与される（ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖ識別子：ＮＣＴ０３８６６２３９）。ＴＣＢ２０１７は前臨床調査中であり、ＴＣＢ２０１４よりも約１０～１００倍強力である（Ｔ細胞依存性細胞傷害性ＴＤＣＣアッセイにおける結合親和性または腫瘍細胞溶解によって測定される場合；国際公開第２０１７０５５３８９号を参照されたい）。したがって、ＴＣＢ２０１７による本発明の二重特異性抗体の食作用曲線のＥＣ５０のシフトを３０ｎＭのＴＣＢ２０１７で試験した。

結合の競合は、ＭＫＮ－４５細胞への結合曲線のフローサイトメトリーベースの測定およびこの結合曲線のＥＣ５０の決定により決定され得る。非競合は、３００ｎＭのＴＣＢ２０１４がアッセイに追加された場合に、ＥＣ５０が一実施形態ではより高い濃度の方向に３倍未満シフトすることを意味する。３００ｎＭは、ＣＥＡｘＣＤ３二重特異性抗体（ＴＣＢ２０１４）の治療活性用量／血漿濃度の範囲内の濃度である（Ｊ．Ｔａｂｅｒｎｅｒｏら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．３５，２０１７（ｓｕｐｐｌ．Ａｂｓｔｒ．３００２））。ＴＣＢ２０１７による非競合は、３０ｎＭのＴＣＢ２０１７がアッセイに追加された場合に、ＥＣ５０が３倍未満シフトすることを意味する。

本明細書で使用される場合、「競合的でない」という用語は、３００ｎＭ（ＴＣＢ２０１４）または３０ｎＭ（ＴＣＢ２０１７）の濃度の第２の抗体（ＣＥＡｘＣＤ３εに対する二重特異性抗体、例えばＴＣＢ２０１４またはＴＣＢ２０１７）が、ＭＫＮ－４５細胞に対する本発明の二重特異性抗体の結合曲線のＥＣ５０を３倍超に、一実施形態では、より高い濃度に向けて、シフトさせないことを意味する。

本明細書で使用される場合、「ＡＤＣＰ」という用語は、抗体依存性細胞食作用を指す。本明細書で使用される場合、本発明による、食作用、食作用のＥＣ５０値、食作用の最大値、および食作用指数は、「イメージング」によって、例えばＬｏＶｏ、ＬＳ１７４Ｔ、ＳＮＵ－Ｃ１および／またはＭＫＮ－４５などの腫瘍細胞株で測定される食作用を指す。エフェクター（マクロファージ）：標的（腫瘍）細胞比が例えば１：１または１：３でのインキュベーション、および読み出しとしての「食作用指数」（イメージング決定ＡＤＣＰ）を用いた適切なイメージング方法は、実施例７に記載されている。本明細書中で使用される場合、「前記二重特異性抗体の食作用」は、前記抗体によって引き起こされる／誘導される食作用を意味する。

「ヒトＩｇＧ」および「ｈＩｇＧ」という用語は、ヒト抗体アイソタイプを指す。実験設定で使用される場合、これらの用語は、ＣＤ４７およびＣＥＡＣＡＭ５に特異的に結合しないヒト免疫グロブリンＩｇＧ（例えばＢｉｏ－Ｒａｄから入手可能）の市販の臨床グレードの均一な調製物を指す。

抗ＣＥＡ抗原結合分子を使用する治療用途および方法
本発明のＣＥＡＣＡＭｘＣＤ４７二重特異性抗体は、単剤療法において、またはｃｉｂｉｓａｔａｍａｂ、ＴＣＢ２０１４またはＴＣＢ２０１７のようなＣＥＡｘＣＤ３ Ｔ細胞二重特異性抗体および／もしくはＰＤ－１軸アンタゴニストとの併用療法において、主に腫瘍細胞のマクロファージ媒介性食作用による、またＡＤＣＣにもよる、固形腫瘍の処置のために最適化される。本発明の抗体およびＣＥＡｘＣＤ３ Ｔ細胞二重特異性抗体は、以下に記載されるように投与され得る。

特定の実施形態では、疾患または固形腫瘍は、限定されないが、結腸直腸腫瘍、非小細胞肺腫瘍、胃腫瘍、膵臓腫瘍および乳房腫瘍の群を含む、ＣＥＡＣＡＭ５を発現またはさらには過剰発現するがんである。特定の実施形態では、腫瘍は結腸直腸腫瘍である。特定の実施形態では、腫瘍は、胃腫瘍または胃食道接合部腫瘍である。特定の実施形態では、腫瘍は、ＣＥＡＣＡＭ５およびＨＥＲ－２を発現する胃腫瘍／胃食道接合部腫瘍である。特定の実施形態では、腫瘍は、肺腫瘍である。本明細書に記載されるすべての治療用途の使用方法、使用、組み合わせなどは、特にこれらの腫瘍／疾患の処置のための実施形態である。

本発明者らは、本発明の抗体が、抗薬物抗体（ＡＤＡ）の中和または有効性の喪失により、低いＡＤＡ形成能を示すかもしくはＡＤＡ形成能を示さず、または薬物曝露の喪失を示すことを認識する。

一実施形態では、本発明は、インビボで癌腫（がん、腫瘍、例えばヒト癌腫）、特にＣＥＡＣＡＭ５発現腫瘍を処置する方法を提供する。この方法は、被験体に、本発明の二重特異性抗体を含有する医薬有効量の組成物を投与することを含む。「被験体」は、ヒト被験体、一実施形態では、がん／腫瘍／癌腫を患っている患者を意味する。

ＣＥＡＣＡＭ５発現は、様々な腫瘍実体、特に結腸直腸癌腫、膵臓腺癌、胃がん、非小細胞肺がん、乳がんなどで見出され得る。胃腸管における健常な正常腺上皮では、ＣＥＡＣＡＭ５は、細胞の頂端表面上において偏向パターンで主に発現される。この偏向発現パターンは、全身投与される抗ＣＥＡ単一特異性または二重特異性抗体によるアクセス可能性を制限するので、潜在的な毒性を健常組織に制限する。本発明の抗体の低親和性ＣＤ４７結合と一緒に、これは、本発明の抗体によるこのような正常細胞の食作用の欠如または制限につながる。胃腸および他の悪性腫瘍の細胞では、この偏向発現パターンは喪失する。ＣＥＡＣＡＭ５は、がん細胞の細胞表面全体にわたって等しく発現されるが、これは、がん細胞が、正常健常細胞よりも本発明の抗体にはるかに良好にアクセス可能であり、本発明のＣＥＡｘＣＤ４７二重特異性抗体により、または上記組み合わせにより選択的に殺傷され得ることを意味する。がん細胞におけるＣＥＡＣＡＭ５の発現は、非悪性細胞における発現よりも大部分が高い。

一実施形態では、本発明の二重特異性抗体は、進行性固形腫瘍、一実施形態ではＣＥＡＣＡＭ５発現腫瘍の処置のための単剤療法において使用され得る。一実施形態では、本発明の二重特異性抗体は、同時、別個または逐次の組み合わせでＣＥＡｘＣＤ３ Ｍａｂと組み合わせて使用される。一実施形態では、本発明の二重特異性抗体は、同時、別個または逐次の組み合わせでＣＥＡｘＣＤ３ Ｍａｂおよび／またはＰＤ－１軸アンタゴニストと組み合わせて使用される。一実施形態では、本発明の二重特異性抗体は、同時、別個または逐次の組み合わせでＰＤ－１軸アンタゴニストと組み合わせて使用される。このようなＰＤ－１軸アンタゴニストは、例えば、国際公開第２０１７１１８６７５号に記載されている。そのような組み合わせは、マクロファージおよびＴ細胞によって固形がんを攻撃する。１つのＣＥＡｘＣＤ３ Ｍａｂが臨床開発中である（ｃｉｂｉｓａｔａｍａｂ；ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ：ＮＣＴ０３８６６２３９を参照されたい）。ＭＥＤＩ－５６５は臨床開発中であったが、ｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖ．では活発な臨床試験を特定することができなかった。一実施形態では、ＣＥＡおよびＣＤ３に対する二重特異性抗体として、抗体ＴＣＢ２０１４またはｃｉｂｉｓａｔａｍａｂが使用される。

ＴＣＢ２０１４およびｃｉｂｉｓａｔａｍａｂで使用されるＣＥＡへのバインダーは、抗ＣＥＡ抗体ＰＲ１Ａ３に由来する（例えば、欧州特許第２６８１２４４号を参照のこと）。この抗体は、細胞膜に近接して位置するＣＥＡのいわゆるＢ３ドメインに結合する。ＴＣＢ２０１４は、ＣＥＡに対する低いｎＭ結合親和性を有し、高用量で有効性を示す（用量および患者当たり４０～６００ｍｇ；（例えば、Ｊ．Ｔａｂｅｒｎｅｒｏら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．３５，２０１７（ｓｕｐｐｌ．Ａｂｓｔｒ．３００２）を参照のこと）。最高用量では、細胞表面上のほぼすべてのＣＥＡ標的がＴＣＢ２０１４により占有される。発明者らの知識によると、ｃｉｂｉｓａｔａｍａｂ、ＴＣＢ２０１４またはＴＣＢ２０１７とＣＥＡｘＣＤ４７との組み合わせは、同時に両薬物の治療血漿レベルを生成でき、両薬物が、重複しない異なるエピトープにそれぞれ結合してＣＥＡ抗原に対して非競合的である場合には、最良の結果（相加的またはさらには相乗的）を達成する。

本明細書で使用される場合、本発明の抗体と、ヒトＣＥＡおよびヒトＣＤ３εに結合する第２の二重特異性抗体との「組み合わせ、同時、別個または逐次の組み合わせ」という用語は、２つの抗体（または、本発明の抗体とＣＥＡｘＣＤ３ ＭａｂとＰＤ－１軸アンタゴニストとの組み合わせの場合には、３つの抗体）の別個または一緒のいずれかの任意の投与を指し、例えば別個、逐次、同時、併用、時間差または交互投与において併用療法の利益を得るために設計された適切な投与レジメンの一部として、２つまたは３つの抗体が投与される。したがって、２つまたは３つの抗体は、同じ医薬組成物の一部として、または別個の医薬組成物のいずれかで投与され得る。本発明の抗体は、第２の二重特異性抗体の投与の前に、それと同時にまたはその後にまたはそれらのいくつかの組み合わせで投与され得る。本発明の抗体が反復間隔で患者に投与される場合、第２の二重特異性抗体は、本発明の抗体の各投与の前に、それと同時にもしくはその後にもしくはそれらのいくつかの組み合わせで、または本発明の抗体による処置に関連して異なる間隔で、または本発明の抗体による処置過程の前に、その間の任意の時点にもしくはその後に単回投与で投与され得る。一実施形態では、本発明の抗体および第２の二重特異性抗体は、一実施形態では、本発明の抗体および第２の抗体の投与の間の６～１５日間の間隔で交互投与で投与される。このような交互投与では、第１の用量は、本発明の抗体または第２の抗体であり得る。

「ＰＤ－１軸アンタゴニスト」という用語は、抗ＰＤ－１抗体または抗ＰＤ－Ｌ１抗体を指す。抗ＰＤ－１抗体は、例えば、ペンブロリズマブ（Ｋｅｙｔｒｕｄａ（登録商標）、ＭＫ－３４７５）、ニボルマブ、ピジリズマブ、ランブロリズマブ、ＭＥＤＩ－０６８０、ＰＤＲ００１およびＲＥＧＮ２８１０である。抗ＰＤ－１抗体は、例えば、５国際公開第２００８１５６７１号、国際公開第２０１３１７３２２３号、国際公開第２０１５０２６６３４号、米国特許第７５２１０５１号、米国特許第８００８４４９号、米国特許第８３５４５０９号、国際公開第２００９１１４３３５号、国際公開第２０１５０２６６３４号、国際公開第２００８１５６７１２号、国際公開第２０１５０２６６３４号、国際公開第２００３０９９１９６号、国際公開第２００９１０１６１１号、国際公開第２０１０／０２７４２３号、国際公開第２０１０／０２７８２７号、国際公開第２０１０／０２７８２８号、国際公開第２００８／１５６７１２号および国際公開第２００８／１５６７１２号（これらはそれぞれ、その全体が参照により組み込まれる）に記載されている。

抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、例えば、アテゾリズマブ、ＭＤＸ－１ １０５、デュルバルマブおよびアベルマブである。抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、例えば、国際公開第２０１５０２６６３４号、国際公開第２０１３／０１９９０６号、国際公開第２０１００７７６３４号、米国特許第８３８３７９６号、国際公開第２０１００７７６３４号、国際公開第２００７００５８７４号および国際公開第２０１６００７２３５号（これらはそれぞれ、その全体が参照により組み込まれる）に記載されている。

本発明の抗体および第２の二重特異性抗体の併用投与に関して、両化合物は、１つの単一剤形で、または別個の剤形で、例えば２つの異なるもしくは同一の剤形で存在し得る。

本発明の抗体および第２の抗体がＣＥＡＣＡＭ５に関して競合しない場合、一実施形態では、医師が所望する場合には、両抗体は同時投与され得る。本発明の抗体および第２の抗体がＣＥＡＣＡＭ５に関して競合する場合、一実施形態では、両抗体は交互投与で投与される。

本発明の抗体は、典型的には、当技術分野で公知のように、患者が処置されているがんの（有効性および安全性の両方の観点から）最も有効な処置を提供する投与レジメンで患者に投与される。好ましくは、腫瘍細胞は、Ｔ細胞およびマクロファージにより同時に攻撃され、このアプローチの完全な治療可能性を達成するために、本発明によるＣＥＡｘＣＤ３およびＣＥＡｘＣＤ４７二重特異性抗体は、細胞表面上のＣＥＡへの結合に関して非競合的でなければならない。

上記のように、投与される抗体の量および本発明の抗体の投与のタイミングは、処置されている患者のタイプ（例えば、性別、年齢、体重）および症状、処置されている疾患または症状の重症度、ならびに投与経路に依存し得る。例えば、本発明の抗体および第２の抗体は、０．１～１００ｍｇ／ｋｇ体重／日／週の範囲の用量で、単回もしくは分割投与で、または連続注入により患者に投与され得る。一実施形態では、本発明の抗体および第２の抗体はそれぞれ、０．１～３０ｍｇ／ｋｇの範囲の用量で患者に投与される。いくつかの場合では、上記範囲の下限未満の投与量レベルが適切であり得るが、他の場合では、いかなる有害な副作用も引き起こさずにさらに高い用量が用いられ得る。

本明細書で使用される場合、「抗体の半減期」という用語は、通常の薬物動態アッセイで測定された場合の前記抗体の消失半減期を指す。本発明の抗体と、ＣＥＡおよびＣＤ３に対する第２の二重特異性抗体とは、３～１４日間の消失半減期を有する。

別の態様では、本発明はまた、疾患、特にＣＥＡＣＡＭ５が発現される、特に同じ細胞タイプの正常組織と比較してＣＥＡＣＡＭ５が異常発現される（例えば、細胞表面上において異なるパターンで過剰発現または発現される）細胞増殖障害の処置における本発明の二重特異性抗体の使用を対象とする。このような障害としては、限定されないが、結腸直腸がん、ＮＳＣＬＣ（非小細胞肺がん）、胃がん、胃食道がん、膵臓がんおよび乳がんが挙げられる。ＣＥＡＣＡＭ５発現レベルは、種々の最新の方法により（例えば、免疫組織化学アッセイ、免疫蛍光アッセイ、免疫酵素アッセイ、ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリー、ラジオイムノアッセイなどを介して）決定され得る。

一態様では、本発明の二重特異性抗体は、ＣＥＡＣＡＭ５を発現するインビボまたはインビトロの細胞をターゲティングするために使用され得る。本発明の二重特異性抗体は、腫瘍細胞のＡＤＣＰおよびＡＤＣＣの誘導を介した腫瘍形成の予防、腫瘍の根絶および腫瘍成長または転移の阻害において特に有用である。本発明の二重特異性抗体は、ＣＥＡＣＡＭ５を発現する任意の腫瘍を処置するために使用され得る。本発明の二重特異性抗体で処置され得る特定の悪性腫瘍としては、限定されないが、結腸直腸がん、非小細胞肺がん、胃がん、胃食道接合部がん、膵臓がんおよび乳がんが挙げられる。

本発明の二重特異性抗体は、薬学的に許容され得る剤形、例えばボーラスとして静脈内的に、または筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、皮下、関節内、滑液嚢内、髄腔内、経口、局所もしくは吸入経路による一定期間にわたる連続注入によりヒトに投与され得るものを含む以下で議論されているもので、哺乳動物、好ましくはヒトに投与される。本発明の二重特異性抗体はまた、腫瘍内、腫瘍周囲、病変内または病変周囲経路により適切に投与されて、局所的および全身的な治療効果を発揮する。

疾患の処置について、本発明の二重特異性抗体の適切な投与量は、処置すべき疾患のタイプ、疾患の重症度および経過、以前の治療、患者の病歴および抗体に対する反応、ならびに主治医の裁量に依存する。本発明の二重特異性抗体は、一度にまたは一連の処置にわたって患者に適切に投与される。本発明は、ＣＥＡＣＡＭ５を発現する腫瘍細胞（本明細書でがん細胞とも称される）を選択的に殺傷するための方法を提供する。

前記方法は、本発明の二重特異性抗体と前記腫瘍細胞との相互作用を含む。これらの腫瘍細胞は、結腸直腸癌腫、非小細胞肺癌腫（ＮＳＣＬＣ）、胃癌腫、胃食道接合部がん、膵臓癌腫および乳癌腫を含むヒト癌腫に由来し得る。

別の態様では、本発明は、異常なＣＥＡＣＡＭ５発現に関する疾患を処置するための医薬の製造のための本発明の二重特異性抗体の使用を対象とする。特定の実施形態では、疾患は、限定されないが、結腸直腸腫瘍、非小細胞肺腫瘍、胃腫瘍、胃食道接合部腫瘍、膵臓腫瘍および乳房腫瘍を含む、ＣＥＡＣＡＭ５を発現またはさらには過剰発現するがんである。特定の実施形態では、腫瘍は結腸直腸腫瘍である。

組成物、製剤、投与量および投与経路
一態様では、本発明は、本発明の二重特異性抗体と、薬学的に許容され得る担体とを含む医薬組成物を対象とする。本発明はさらに、がんなどの疾患の処置の方法における、またはがんなどの疾患の処置のための医薬の製造におけるこのような医薬組成物の使用を対象とする。具体的には、本発明は、疾患の処置のための、より具体的にはがんの処置のための方法であって、治療有効量の本発明の医薬組成物を投与することを含む方法を対象とする。

一態様では、本発明は、上記で定義されるように、ヒト癌腫、腫瘍を処置するための医薬組成物、組み合わせおよび方法を包含する。例えば、本発明は、ヒト癌腫の処置において使用するための医薬組成物であって、医薬有効量の本発明の抗体と、薬学的に許容され得る担体とを含む医薬組成物を含む。

本発明の二重特異性抗体組成物は、限定されないが、静脈内、腹腔内、経口、リンパ内または直接腫瘍内投与を含む従来の投与様式を使用して投与され得る。静脈内投与または皮下投与が好ましい。

本発明の一態様では、本発明の二重特異性抗体を含有する治療製剤は、所望の純度を有する抗体を任意の薬学的に許容され得る担体、賦形剤または安定剤と混合することにより（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０））、凍結乾燥製剤または液体製剤の形態で保存のために調製される。許容され得る担体、賦形剤または安定剤は、用いられる投与量および濃度でレシピエントに非毒性である。インビボ投与に使用すべき製剤は滅菌のものでなければならない。これは、滅菌濾過膜による濾過により容易に達成される。本発明の医薬組成物のための最も有効な投与様式および投与レジメンは、疾患の重症度および経過、患者の症状および処置に対する反応、ならびに処置医師の判断に依存する。したがって、組成物の投与量は、均一な用量であり得るか、または個々の患者、例えば体重に適合され得る。それにもかかわらず、本発明の組成物の有効用量は、一般に、０．１～３０ｍｇ／ｋｇの範囲内であり得る。

本発明の二重特異性抗体は、１５０ｋＤａ／モルの大きさの分子量を有する。一実施形態では、それらはＦｃ部分を保有する。患者における消失半減期は３～１４日間の範囲内である。この半減期は、限定されないが、１日に１回、１週間に１回または２週間またはさらに４週間ごとに１回の投与を可能にする。

本発明の二重特異性抗体およびそれらの各組成物は、限定されないが、液体溶液または懸濁液、錠剤、ピル、粉末、坐剤、ポリマーマイクロカプセルまたは微小胞、リポソームおよび注射液または注入液を含む様々な剤形であり得る。好ましい形態は、投与様式および治療用途に依存する。

本発明の二重特異性抗体を含む組成物は、良好な医療行為と合う方法で製剤化、投薬および投与される。この文脈における考慮要因としては、処置されている特定の疾患または障害、処置されている特定の哺乳動物、個々の患者の臨床症状、疾患または障害の原因、薬剤の送達部位、投与方法、投与スケジュール、および医者に公知の他の要因が挙げられる。

製品
本発明の別の態様では、上記障害の処置、予防および／または診断に有用な材料を含有する製品が提供される。製品は、容器と、容器の上のまたはそれに付随するラベルまたは添付文書とを含む。適切な容器としては、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ、輸液バッグなどが挙げられる。容器は、様々な材料、例えばガラスまたはプラスチックから形成され得る。容器は、それ自体により、または別の組成物と組み合わせて症状を処置、予防および／もしくは診断するために有効な組成物を保持し、滅菌アクセスポートを有し得る（例えば、容器は、皮下注射針により穿刺可能なストッパーを有する輸液バッグまたはバイアルであり得る）。組成物中の少なくとも１つの活性剤は、本発明の二重特異性抗体である。ラベルまたは添付文書は、組成物が、選択した症状を処置するために使用されることを示す。また、製品は、（ａ）組成物がその中に含まれる第１の容器であって、前記組成物が本発明の二重特異性抗体を含む第１の容器；および（ｂ）組成物がその中に含まれる第２の容器であって、前記組成物がさらなる細胞毒性剤または他の治療剤を含む第２の容器を含み得る。本発明のこの実施形態における製品は、組成物が特定の症状を処置するために使用され得ることを示す添付文書をさらに含み得る。あるいはまたは加えて、製品は、薬学的に許容され得るバッファー、例えば注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル液およびデキストロース溶液を含む第２の（または第３の）容器をさらに含み得る。それは、他のバッファー、希釈剤、フィルタ、針およびシリンジを含む商業的および利用者的な観点から望ましい他の材料をさらに含み得る。

発明のさらなる実施形態
１．ヒトＣＥＡＣＡＭ５に特異的に結合する第１の結合部分と、ヒトＣＤ４７に特異的に結合する第２の結合部分とを含む二重特異性抗体であって、
ａ）前記第１の結合部分は、重鎖可変領域として、配列番号１のＣＤＲＨ１、配列番号２のＣＤＲＨ２および配列番号３のＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域を含み、
ｂ）前記第１の結合部分は、軽鎖可変領域として、
ｂ１）配列番号１４のＣＤＲＬ１、配列番号１５のＣＤＲＬ２、および配列番号１６のＣＤＲＬ３、または
ｂ２）配列番号１７のＣＤＲＬ１、配列番号１８のＣＤＲＬ２、および配列番号１９のＣＤＲＬ３、
ｂ３）配列番号２０のＣＤＲＬ１、配列番号２１のＣＤＲＬ２、および配列番号２２のＣＤＲＬ３、
ｂ４）配列番号２３のＣＤＲＬ１、配列番号２４のＣＤＲＬ２、および配列番号２５のＣＤＲＬ３、ならびに
ｂ５）配列番号２６のＣＤＲＬ１、配列番号２７のＣＤＲＬ２、および配列番号２８のＣＤＲＬ３からなる群から選択されるＣＤＲＬのセットを含む軽鎖可変領域を含み、
ｃ）前記第２の結合部分は、重鎖可変領域として、配列番号１のＣＤＲＨ１、配列番号２のＣＤＲＨ２および配列番号３のＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域を含み、
かつ軽鎖可変領域として、配列番号７のＣＤＲＬ１、配列番号８のＣＤＲＬ２、および配列番号９のＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域を含むことを特徴とする二重特異性抗体。
２．前記第１の結合部分において、配列番号４の可変重鎖領域を可変重鎖領域として含み、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５および配列番号３６からなる群から選択される可変軽鎖領域を可変軽鎖領域として含み、前記第２の結合部分において、可変重鎖領域として、配列番号４の可変重鎖領域を含み、可変軽鎖領域として、配列番号１０の可変軽鎖領域を含むことを特徴とする、実施形態１に記載の二重特異性抗体。
３．前記第１の結合部分において、配列番号５を含む重鎖、および配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０および配列番号４１からなる群から選択される軽鎖を含むこと、ならびに、前記第２の結合部分において、配列番号５の重鎖、および配列番号１１を有する軽鎖を含むことを特徴とする、実施形態１に記載の二重特異性抗体。
４．重鎖として配列番号６の共通の重鎖を含むことを特徴とする、先行する実施形態のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。
５．前記第１の結合部分について一価であり、前記第２の結合部分について一価である、前述の実施形態のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
６．定常および可変フレームワーク領域配列がヒトのものである、前述の実施形態のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
７．前記第１の結合部分の前記軽鎖がラムダ軽鎖（ＶＬＣＬ）であり、前記第２の結合部分の前記軽鎖がカッパ軽鎖（ＶＫＣＫ）である、先行する実施形態のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。
８．ヒトＩｇＧ１タイプである、前述の実施形態のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
９．前記抗体が、糖操作されていない同じ二重特異性抗体と比較して、フコース残基の数が減少するように糖操作されたＦｃ領域を含む、先行する実施形態のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。
１０．前記二重特異性抗体が、配列番号４３および４４の前記可変軽鎖領域および可変重鎖領域を含む抗ＣＥＡＣＡＭ５抗体ＳＭ３Ｅと、ＣＥＡＣＡＭ５への結合について競合することを特徴とする、先行する実施形態のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。
１１．２～１０ｎＭの結合親和性（ＫＤ）で組換えヒトＣＥＡＣＡＭ５に結合することを特徴とする、先行する実施形態のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。
１２．１００ｎＭ～６００ｎＭの結合親和性でヒト組換えＣＤ４７に結合することを特徴とする、先行する実施形態のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。
１３．１００倍またはそれを超える、組換えＣＥＡＣＡＭ３および組換えＣＥＡＣＡＭ５への前記結合についての前記ＫＤ値の比を特徴とする、先行する実施形態のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。
１４．１００～２００倍の、組換えＣＥＡＣＡＭ３および組換えＣＥＡＣＡＭ５への前記結合についての前記ＫＤ値の比を特徴とする、実施形態１３に記載の二重特異性抗体。
１５．二重特異性抗体Ｋ２ＡＣ２２の食作用指数と比較して、ＬｏＶｏ腫瘍細胞の最大の食作用指数の少なくとも８％の増加を特徴とする、先行する実施形態のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。
１６．ＬｏＶｏ腫瘍細胞について８％～２０％の最大の食作用指数の増加を特徴とする、実施形態１５記載の二重特異性抗体。
１７．Ｋ２ＡＣ２２の食作用指数と比較して、Ｌｓ１７４Ｔ腫瘍細胞の最大の食作用指数の少なくとも８％の増加を特徴とする、先行する実施形態のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。
１８．Ｌｓ１７４Ｔ腫瘍細胞について８％～２５％の最大の食作用指数の増加を特徴とする、実施形態１７記載の二重特異性抗体。
１９．ＭＫＮ－４５細胞上のＣＤ４７とＳＩＲＰαとの間の相互作用を、同じ実験条件下でＫ２ＡＣ２２について測定されたＩＣ５０よりも１０倍またはそれを超えて低い前記ＩＣ５０で阻害することを特徴とする、先行する実施形態のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。
２０．ＭＫＮ－４５細胞上のＣＤ４７とＳＩＲＰαとの間の相互作用を１０倍～３０倍のＩＣ５０で阻害することを特徴とする、実施形態１９に記載の二重特異性抗体。
２１．ＭＫＮ－４５細胞上のＣＤ４７とＳＩＲＰαとの間の相互作用を０．１ｎＭまたはそれ未満のＩＣ５０で阻害することを特徴とする、先行する実施形態のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。
２２．ＭＫＮ－４５細胞上のＣＤ４７とＳＩＲＰαとの間の相互作用を０．１ｎＭ～０．０４ｎＭのＩＣ５０で阻害することを特徴とする、実施形態２１に記載の二重特異性抗体。
２３．ＣＥＡＣＡＭ５への結合についてｃｉｂｉｓａｔａｍａｂと競合しないことを特徴とする、先行する実施形態のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。
２４．前記第１の二重特異性抗体が、３００ｎＭの濃度において、ヒトＣＥＡＣＡＭ５およびＣＤ３εに結合する第２の二重特異性抗体が、ＭＫＮ－４５細胞に対するまたはＬＳ１７４Ｔ細胞に対する前記第１の二重特異性抗体の結合曲線のＥＣ５０を、より高い濃度に向かって３倍を超えてシフトさせないことを特徴とする、先行する実施形態のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。
２５．前記第２の二重特異性抗体が、ＴＣＢ２０１４またはｃｉｂｉｓａｔａｍａｂである、実施形態２４に記載の二重特異性抗体。
２６．先行する実施形態のいずれか１項に記載の二重特異性抗体をコードする単離されたポリヌクレオチドまたは一群のポリヌクレオチド。
２７．実施形態２６に記載される単数のポリヌクレオチドまたは複数のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
２８．実施形態２７に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
２９．ａ）実施形態２８に記載の宿主細胞を、前記二重特異性抗体の産生を可能にする条件下で培養することと、ｂ）前記抗体を単離することと、を含む、実施形態１～２５のいずれか１項に記載の二重特異性抗体の産生のための方法。
３０．ヒトがんの治療に使用するための、実施形態１～２５のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。
３１．前記がんが固形がんであることを特徴とする、実施形態３０に記載の使用のための二重特異性抗体。
３２．前記がんが、結腸直腸がん、ＮＳＣＬＣ（非小細胞肺がん）、胃がん、膵臓がん、乳がん、または別のＣＥＡＣＡＭ５発現がんであることを特徴とする、実施形態３０に記載の使用のための二重特異性抗体。
３３．ＣＥＡＣＡＭ５を発現するがんを有する対象を処置するための医薬品の製造に使用するための、実施形態１～２５のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。
３４．ＣＥＡＣＡＭ５を発現するがんを有する対象の処置において、ヒトＣＥＡＣＡＭ５に特異的に結合する第３の結合部分と、ヒトＣＤ３εに特異的に結合する第４の結合部分と、を含む第２の二重特異性抗体と同時、別個または逐次の組み合わせで使用するための、実施形態１～２５のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。
３５．前記第２の二重特異性抗体が、ＴＣＢ２０１４またはｃｉｂｉｓａｔａｍａｂである、同時、別個または逐次の組み合わせで使用するための、実施形態１～２５のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。
３６．本発明による二重特異性抗体および前記第２の二重特異性抗体が、前記対象に６～１５日間隔で同時に投与されることを特徴とする、実施形態３４または３５に記載の使用のための二重特異性抗体。
３７．実施形態１～２５のいずれか１項に記載の二重特異性抗体と、薬学的に許容され得る賦形剤または担体とを含む医薬組成物。
３８．医薬品として使用するための、実施形態３７に記載の医薬組成物。
３９．固形がんの処置における医薬品として使用するための、実施形態３７または実施形態３８に記載の医薬組成物。
４０．結腸直腸がん、ＮＳＣＬＣ（非小細胞肺がん）、胃がん、膵臓がんまたは乳がんの処置における医薬品として使用するための、実施形態３７～３９のいずれか１項に記載の医薬組成物。
４１．ＣＥＡＣＡＭ５を発現するがんを有する対象を処置する方法であって、治療有効量の実施形態１～２５のいずれか１項に記載の二重特異性抗体または実施形態３７～４０のいずれか１項に記載の医薬組成物を、前記対象に投与することを含む方法。
４２．前記がんがヒトがんである、実施形態４１に記載の方法。
４３．前記対象が患者である、実施形態４１または４２に記載の方法。
４４．前記がんが、結腸直腸がん細胞、ＮＳＣＬＣ（非小細胞肺がん）細胞、胃がん細胞、膵臓がん細胞、乳がん細胞、またはＣＥＡＣＡＭ５を発現する別の腫瘍細胞であることを特徴とする、実施形態４１～４３のいずれか１項に記載の方法。
４５．前記二重特異性抗体を化学療法または放射線治療と組み合わせて投与する、実施形態４１～４４のいずれか１項に記載の方法。
４６．腫瘍を有するヒト患者を処置する方法であって、有効量の実施形態１～２５のいずれか１項に記載のＣＥＡＣＡＭ５×ＣＤ４７二重特異性抗体ならびにＣＥＡＣＡＭ５およびＣＤ３に対する第２の二重特異性抗体を投与することを含む方法。
４７．前記ＣＥＡＣＡＭ５×ＣＤ４７二重特異性抗体ならびに前記ＣＥＡＣＡＭ５およびＣＤ３抗体が競合的でない、実施形態４６に記載の方法。
４８．前記抗体を同時に投与する、実施形態４６または４７に記載の方法。
４９．前記患者が、０．０１ｍｇ／ｋｇ～１０ｍｇ／ｋｇの実施形態１～２５のいずれか１項に記載の二重特異性抗体の１またはそれを超える用量を投与される、実施形態４１～４８のいずれか１項に記載の方法。
５０．患者に、０．０１ｍｇ／ｋｇ～１０ｍｇ／ｋｇの前記ＣＥＡＣＡＭ５×ＣＤ３二重特異性抗体の１またはそれを超える用量および１ｍｇ／ｋｇ～２０ｍｇ／ｋｇの前記ＣＥＡＣＡＭ５×ＣＤ４７二重特異性抗体の１またはそれを超える用量を投与する、実施形態４６～４８のいずれか１項に記載の方法。
５１．前記第２の抗体が、ＴＣＢ２０１４またはｃｉｂｉｓａｔａｍａｂである、実施形態４６～５０のいずれか１項に記載の方法。
５２．ＣＥＡＣＡＭ５を発現するがんを有する対象の生存時間を延長する方法であって、前記方法が、治療有効量の実施形態１～２５のいずれか１項に記載の二重特異性抗体を前記対象に投与することを含む、方法。
５３．前記がんが、結腸直腸がん、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、胃がん、膵臓がん、または乳がんであることを特徴とする、実施形態５２に記載の方法。
５４．前記二重特異性抗体を化学療法および／または放射線治療と組み合わせて投与する、実施形態５２または５３のいずれか１項に記載の方法。
５５．前記患者が、０．０１ｍｇ／ｋｇ～１０ｍｇ／ｋｇの実施形態１～２５のいずれか１項に記載の二重特異性抗体の１またはそれを超える用量を投与される、実施形態５２～５４のいずれか１項に記載の方法。

実施例１：ヒトＣＥＡＣＡＭ５のクローニング、発現および精製；ｈｕＣＥＡＣＡＭ３およびｈｕＣＤ４７の供給源。
ＣＥＡＣＡＭ５の完全細胞外ドメイン（ＥＣＤ）に対応する配列をｐＥＡＫ８哺乳動物発現ベクター（Ｅｄｇｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｍｄ．）にサブクローニングした。Ｃ末端にＡｖｉｔａｇ（商標）（Ａｖｉｄｉｔｙ，Ｄｅｎｖｅｒ Ｃｏｌｏ．）およびヘキサヒスチジンタグ、ヒトＦｃ領域またはマウスＦｃ領域を導入するようにベクターを改変した。ＤＮＡシークエンシングにより、構築物を検証した。．組換え可溶性タンパク質の精製を、ＩＭＡＣ（固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー）、ＦｃＸＬまたはＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＩｇＧ－Ｆｃ（ｍｓ）アフィニティーマトリックスによって行った。ヒトＣＥＡＣＡＭ３およびビオチン化ＣＥＡＣＡＭ３は、ＡＣＲＯＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｎｅｗａｒｋ ＵＳＡ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）から入手可能である。ヒトＣＤ４７およびビオチン化ＣＤ４７は、国際公開第２０１９２３４５７６号に記載されているように産生することができ、またはＡＣＲＯＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｎｅｗａｒｋ ＵＳＡから入手可能である。

実施例２：ラムダおよびカッパ軽鎖を保有する二重特異性抗体の発現および精製
共発現させるべき鎖の１つをそれぞれ発現する複数のベクターのトランスフェクション、または複数の遺伝子の発現を駆動するベクターの使用などの異なる方法で、同時発現を達成し得る。ベクターｐＮｏｖｉ κＨλは、米国特許出願公開第２０１２／０１８４７１６号および国際公開第２０１２／０２３０５３号（これらはそれぞれ、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているように１つの重鎖、１つのカッパ軽鎖および１つのラムダ軽鎖の共発現を可能にするように以前に生成された。ヒトサイトメガロウイルスプロモーター（ｈＣＭＶ）により３つの遺伝子の発現を駆動し、ベクターはまた、安定細胞株の選択および樹立を可能にするグルタミンシンテターゼ遺伝子（ＧＳ）を含有する。哺乳動物細胞における一過性発現のために、抗ｈＣＥＡＣＡＭ５ ＩｇＧλまたは抗ｈＣＤ４７ ＩｇＧκのＶＬ遺伝子をベクターｐＮｏｖｉ κＨλにクローニングした。適切な細胞数および（ウシ胎仔血清を含有する）培養培地量を含む適切なフラスコ中で、Ｐｅａｋ細胞またはＣＨＯ細胞を培養する。製造業者の指示にしたがってＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００）を使用して、プラスミドＤＮＡを細胞にトランスフェクトする。産生中に、ＯｃｔｅｔＲＥＤ９６を使用して、トランスフェクト細胞の上清中の抗体濃度を測定する。抗体濃度に応じて、トランスフェクションの５～７日後に上清を回収し、１３００ｇで１０分間遠心分離することにより清澄化する。精製プロセスは、３つのアフィニティー工程から構成される。最初に、ＦｃＸＬアフィニティーマトリックス（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）をＰＢＳで洗浄し、次いで、清澄化上清に追加する。＋４℃における一晩のインキュベーション後、上清を２０００ｇで１０分間遠心分離し、フロースルーを保存し、樹脂をＰＢＳで２回洗浄する。次いで、樹脂をＡｍｉｃｏｎ Ｐｒｏカラムに移し、ｐＨ３．０の５０ｍＭグリシンを含有する溶液を溶出に使用する。いくつかの溶出画分を生成し、プールし、５０ｋＤａ Ａｍｉｃｏｎ（商標）超遠心フィルタユニット（Ｍｅｒｃｋ ＫＧａＡ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用してＰＢＳに対して脱塩する。Ｎａｎｏｄｒｏｐ分光光度計（ＮａｎｏＤｒｏｐ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，Ｄｅｌ．）を使用して、上清由来の全ヒトＩｇＧを含有する溶出産物を定量し、適切な量のカッパセレクトアフィニティーマトリックス（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）と共に室温および２０ｒｐｍで１５分間インキュベートする。インキュベーション、樹脂回収、溶出および脱塩工程を前記のように実施する。２回の先の精製と同じプロセスを適用してラムダＦａｂセレクトアフィニティーマトリックス（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、最後のアフィニティー精製工程を実施する。Ｎａｎｏｄｒｏｐを使用して、最終産物を定量する。変性および還元条件で電気泳動により、精製二重特異性抗体を分析する。製造業者（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，Ｃａｌｉｆ．，ＵＳＡ）により記載されているように、Ｐｒｏｔｅｉｎ ８０キットと共にＡｇｉｌｅｎｔ ２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒを使用する。４μＬの精製サンプルを、ジチオスレイトール（ＤＴＴ；Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．）を補充したサンプルバッファーと混合する。サンプルを９５℃で５分間加熱し、次いで、チップにロードする。Ｌｉｍｕｌｕｓ Ａｍｅｂｏｃｙｔｅ Ｌｙｓａｔｅ試験（ＬＡＬ；Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，Ｍａｓｓ．）を使用して、エンドトキシン汚染について、すべてのサンプルを試験する。

実施例３：ＫＤ測定．
ａ）組換えヒトＣＥＡＣＡＭ５に対するＡｂのＫＤを測定するための実験手順（Ｏｃｔｅｔ）
組換え可溶性ヒトＣＥＡＣＡＭ５についての本発明のＣＤ４７ｘＣＥＡＣＡＭ５二重特異性抗体の抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５アームの親和性を、バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）技術を使用して決定した。ＯｃｔｅｔＲＥＤ９６機器およびプロテインＡバイオセンサーを使用した（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）。測定は３０℃で行った。水和、プレコンディショニングおよびキネティック緩衝液（ＰＢＳ、０．００２％ Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０、０．０１％ ＢＳＡ、Ｋａｔｈｏｎ；Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）中のベースラインステップの後、キネティック緩衝液中０．５μｇ／ｍＬのκλ体をバイオセンサーに５分間ロードした。次いで、バイオセンサーを、５０ｎＭから開始した２倍希釈倍率の組換えヒトＣＥＡＣＡＭ５細胞外ドメイン（ＥＣＤ）可溶性タンパク質（自社製）の段階希釈液に浸漬した。会合相および解離相をそれぞれ６００秒間監視した。１０ｍＭグリシンｐＨ１．７を使用してバイオセンサーを再生した。標準取得率を適用した（５．０Ｈｚ、２０で平均化）。基準ウェル減算、ベースライン上のＹ位置合わせを用い、ステップ間補正なしで曲線を処理した。親和性は、完全な会合および解離工程に、１：１グローバルフィッティングモデルを適用して測定した。組換えヒトＣＤ４７に対する本発明の二重特異性抗体の結合親和性（ＫＤ）を、同じ実験手順によって決定した。この手順によって決定されるＣＥＡＣＡＭ５に対する本発明の例示的二重特異性抗体のＫＤを以下の表２に示す。

ｂ）組換えヒトＣＥＡＣＡＭ３に対するＡｂのＫＤを測定するための実験手順（Ｏｃｔｅｔ）
組換え可溶性ヒトＣＥＡＣＡＭ３についての本発明のＣＤ４７ｘＣＥＡＣＡＭ５二重特異性抗体の抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５アームの親和性を、バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）技術およびＯｃｔｅｔＲＥＤ９６機器を使用して決定した。抗Ｈｉｓタグ抗体を負荷したＨＩＳ１Ｋバイオセンサー（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を使用して、ｈｉｓタグ化組換えｈｕＣＥＡＣＡＭ３（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，＃９８６８－ＣＭ）を捕捉した。測定は３０℃で行った。水和、プレコンディショニングおよびキネティック緩衝液（ＰＢＳ、０．００２％ Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０、０．０１％ ＢＳＡ、Ｋａｔｈｏｎ；Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）中のベースラインステップの後、キネティック緩衝液中５μｇ／ｍＬの組換えｈｕＣＥＡＣＡＭ３をバイオセンサーに５分間ロードした。次いで、バイオセンサーを、６６７ｎＭから開始した２倍希釈率のκλ体の段階希釈液に浸漬した。会合相および解離相をそれぞれ６０秒間および１２０秒間監視した。１０ｍＭグリシンｐＨ１．７を使用してバイオセンサーを再生した。標準取得率を適用した（５．０Ｈｚ、２０で平均化）。曲線は、二重基準減算、ベースライン上のＹ位置合わせ、およびステップ間補正を用いて処理した。親和性は、完全会合工程および解離工程の最初の５秒間に、１：１グローバルフィッティングモデルを適用して測定した。この手順によって決定されるＣＥＡＣＡＭ３についての本発明の例示的二重特異性抗体のＫＤを以下の表２に示す。

実施例４：参照抗体ＳＭ３Ｅとの競合によるＣＤ４７ｘＣＥＡＣＡＭ５二重特異性抗体のエピトープビニング。
エピトープビニングは、本発明の抗体の結合、例えば代替的に本発明の二重特異性抗体の第１の結合部分の関連二価抗ＣＥＡ（標的タンパク質）抗体の結合を特性評価するために使用される競合イムノアッセイである。標的タンパク質に結合する抗体の競合遮断プロファイルを、この標的タンパク質にも結合する新規の抗体であって、結合エピトープが既に確立／公開されている抗体に対して作成する。この参照抗体との競合は、抗体が同じまたは近接して位置するエピトープを有し、それらが一緒に「ビニングされる」ことを示す。本発明のＣＤ４７ｘＣＥＡＣＡＭ５二重特異性抗体がＣＥＡＣＡＭ５参照抗体と競合する能力を、マウスＦｃ領域（標準的な方法を使用して産生されたｍＡｂ）を有するＳＭ３Ｅ（米国特許出願公開第２００５０１４７６１４号）由来の参照抗体を使用した組換えヒトＣＥＡＣＡＭ５に対するＥＬＩＳＡによって試験する。ＳＭ３Ｅは、ＣＥＡのＮ末端の細胞膜遠位部分により多く結合する。

ビオチン化ヒトＣＥＡＣＡＭ５をストレプトアビジンコーティング９６ウェルプレートに０．５μｇ／ｍｌでコーティングし、連続希釈の参照ｍＡｂ（０．０９ｎＭ～６７ｎＭ）またはマウスＦｃ領域を保有する無関係なｍＡｂと共に１時間インキュベートする。本発明のＣＤ４７ｘＣＥＡＣＡＭ５二重特異性抗体を０．１μｇ／ｍｌで室温で１時間追加する。プレートを洗浄し、結合したＣＤ４７ｘＣＥＡＣＡＭ５二重特異性抗体を抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）－ＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）で検出する。洗浄後、Ａｍｐｌｅｘ Ｒｅｄ試薬を用いて、プレートを明らかにする。Ｓｙｎｅｒｇｙ ＨＴプレートリーダー（Ｂｉｏｔｅｋ）により、蛍光シグナルを測定する。

本発明のＣＤ４７×ＣＥＡＣＡＭ５二重特異性抗体を用いて競合実験を行った。Ｋ２ＡＣ８２、Ｋ２ＡＣ８４、Ｋ２ＡＣ９１、Ｋ２ＡＣ１００およびＫ２ＡＣ１１７の結合は、それぞれの競合的（すなわち、ツール）抗体により８０％またはそれを超えて低下した。ＣＤ４７ｘＣＥＡＣＡＭ５二重特異性抗体は、本明細書では、二重特異性抗体の結合が参照ツール抗体の最高濃度で８０％またはそれを超えて低下した場合にＳＭ３Ｅ抗体と競合的であると同定される。ＣＤ４７ｘＣＥＡＣＡＭ５二重特異性抗体は、ツール抗体を添加した場合と添加しなかった場合の結果を比較すると、ＣＥＡＣＡＭ５への結合が２０％未満減少する場合、ツール抗体と非競合的であると同定される。

実施例５：６つの異なるがん細胞株の細胞表面でのＣＥＡＣＡＭ５およびＣＤ４７の標的密度（すなわち、数）の定量。
６つの異なるがん細胞株の細胞表面でのＣＥＡＣＡＭ５およびＣＤ４７の標的密度（すなわち、数）が測定された。試験された細胞株は、ヒト胃腺がん細胞（ＭＫＮ－４５、ＤＳＭＺ ＡＣＣ ４０９）、ヒト結腸直腸がん細胞（ＳＫ－ＣＯ－１（ＡＴＣＣ；ＨＴＢ－３９）、ＳＮＵ－Ｃ１（ＡＴＣＣ；ＣＲＬ－５９７２）、Ｌｓ１７４Ｔ（ＡＴＣＣ；ＣＬ－１８８）およびＬｏＶｏ（ＡＴＣＣ；ＣＣＬ－２２９））または膵臓腺癌細胞（ＨＰＡＦ－ＩＩ、ＡＴＣＣ、ＣＲＬ－１９９７）であった。

ＱＩＦＩＫＩＴ（登録商標）（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｄａｋｏ）は、間接免疫蛍光アッセイを使用するフローサイトメトリーによる細胞表面抗原の定量に使用された。ＱＩＦＩＫＩＴ（登録商標）は、異なるが明確に定義された量のマウスモノクローナル抗体（Ｍａｂ）でコーティングされた一連の６つのビーズ集団からなる。ビーズは、特定の一次マウスモノクローナル抗体で標識された細胞を模倣する。異なる細胞標本を異なる一次抗体で標識し、次いで同じ較正ビーズセットを使用して定量することができる。

細胞をそれらの適応培地中で培養し、トリプシン－ＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）で剥離し、遠心分離し（３分、３５０ｇ）、冷ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ、２％ ＢＳＡ－Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ製）に再懸濁し、０、２２μｍ（Ｓｔｅｒｉｃｕｐ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で濾過して３．１０６個の細胞／ｍＬを得た。各サンプルの３．１０^５個の細胞をＶ底プレートにプレーティングした。１μＬのＦｃγＲ遮断試薬を各ウェルに添加し、プレートを４℃で１０分間インキュベートした。最終濃度２０μｇ／ｍＬのヒトＣＥＡＣＡＭ５（＃ｓｃ－２３９２８；ｍＩｇＧ１（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ））およびヒトＣＤ４７（内部生産；Ｂ６Ｈ１２；マウス骨格）に対する一次抗体１０μＬを細胞に添加し、４℃で３０分間インキュベートした。細胞を２００μＬのＰＢＳ ＢＳＡ ２％で２回洗浄し、４００ｇで３分間遠心分離した。１００μＬのビーズ（ＱＩＦＩＫＩＴ（登録商標）の設定または較正）を細胞と共に洗浄し、同様に処理した。キットからの二次抗体１００μＬ（ＰＢＳ ＢＳＡ ２％中１／５０）を各ウェルに添加し、４℃で３０～４５分間インキュベートした。細胞を遠心分離（３分、４℃で４００ｇ）して上清を捨て、２回洗浄した。最後の遠心分離後、細胞を１３０μＬのＣｅｌｌＦｉｘに再懸濁し、ＣｙｔｏＦｌｅｘサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）で取得した。分析はＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用して行い、および幾何平均をＥｘｃｅｌファイルにエクスポートした。較正ビーズからのＭＦＩ値を使用して線形回帰を行った。細胞の抗体結合能（ＡＢＣ）をこの回帰直線から外挿した。アイソタイプ対照から特異的染色の１つに対するＡＢＣを差し引くことによって、特異的抗体結合能（ｓＡＢＣ）を得た。この分析からのデータを以下の表３に示す。

実施例６：ＣＥＡＣＡＭ５発現がん細胞株に対するＣＥＡｘＣＤ４７二重特異性抗体の結合の測定（ＥＣ５０および最大結合Ｅｍａｘ）。
ＣＤ４７ｘＣＥＡＣＡＭ５二重特異性抗体の結合は、ＣＥＡＣＡＭ５発現ヒト胃腺癌細胞（例えば、ＭＫＮ－４５）、ＣＥＡＣＡＭ５発現ヒト結腸直腸がん細胞（ＳＫ－ＣＯ－１、ＳＮＵ－Ｃ１、Ｌｓ１７４Ｔ、ＬｏＶｏ）およびＣＥＡＣＡＭ５発現膵臓腺癌細胞（ＨＰＡＦ－ＩＩ）で試験された。

細胞を回収し、カウントし、生存率についてチェックし、ＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ２％ＢＳＡ、０．１％ＮａＮ３）に細胞３×１０^６個／ｍｌで再懸濁した。１００μｌの細胞懸濁液をＶ底９６ウェルプレートに分配した（細胞３×１０^５個／ウェル）。１３００ｒｐｍ、４℃で３分間遠心分離することにより、上清を除去した。次いで、漸増濃度の本発明の抗体をウェルに追加し、４℃で１５分間インキュベートした。細胞を冷ＦＡＣＳバッファーで２回洗浄し、ＰＥ（Ｒ－フィコエリトリン）コンジュゲートマウス抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ二次抗体（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ、ＦＡＣＳバッファーで１：１００プレ希釈）と共に４℃でさらに１５分間再インキュベートした。細胞を冷ＦＡＣＳバッファーで２回洗浄し、１：１５０００希釈ＳｙｔｏｘＢｌｕｅ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含む３００μｌのＦＡＣＳバッファーに再懸濁した。蛍光、具体的に、蛍光平均蛍光活性（ＭＦＩ）は、Ｃｙｔｏｆｌｅｘ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）フローサイトメーターを使用して決定された。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ７ソフトウェアを使用して、結合曲線ならびにＥＣ５０およびＥｍａｘ値を得て計算した。この分析からのデータを以下の表４に示す。

^＊ＭＦＩ－平均蛍光強度
Ｎ／Ａ－該当なし－この細胞株におけるこのＡｂについての利用可能なデータなし

表４のデータは、本発明による二重特異性抗体はすべて、Ｋ２ＡＣ２２と比較してかなり低いＥＣ５０およびかなり高いＥｍａｘを示すことを示す。

表４に示されるように、本発明による二重特異性抗体は、１０～３０ｎＭのＥＣ５０値でＳＫ－ＣＯ１細胞に、５～１５ｎＭのＥＣ５０値でＭＫＮ－４５細胞に、５～１５ｎＭのＥＣ５０値でＨＰＡＦ－ＩＩ細胞に、１～１０のＥＣ５０値でＳＮＵ－Ｃ１細胞に、３～１５ｎＭのＥＣ５０値でＬＳ１７４Ｔ細胞に、および／または１５～２５ｎＭのＥＣ５０値でＬｏＶｏ細胞に結合する。

また、表４に示されるように、本発明による二重特異性抗体は、０．５～１．５（ＭＦＩｘ１０^６）のＥｍａｘ値を有するＳＫ－ＣＯ１細胞、１～２（ＭＦＩｘ１０^６）のＥｍａｘ値を有するＭＫＮ－４５細胞、０．５～１．５（ＭＦＩｘ１０^６）のＥｍａｘ値を有するＨＰＡＦ－ＩＩ細胞、０．２～０．６（ＭＦＩｘ１０^６）のＥｍａｘ値を有するＳＮＵ－Ｃ１細胞、０．０５～０．２（ＭＦＩｘ１０^６）のＥｍａｘ値を有するＬＳ１７４Ｔ細胞および／または０．２～０．５（ＭＦＩｘ１０^６）のＥｍａｘ値を有するＬｏＶｏ細胞に結合する。

実施例７：抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）のそれぞれの食作用（食作用指数）の測定。
本発明のＣＥＡＣＡＭ５ｘＣＤ４７二重特異性抗体の食作用性インビトロ活性を、６つのＣＥＡＣＡＭ５発現がん細胞株（ＭＫＮ－４５、ＳＫ－ＣＯ－１、ＳＮＵ－Ｃ１、Ｌｓ１７４Ｔ、ＬｏＶｏおよびＨＰＡＦ－ＩＩ）を使用して評価した。同じ細胞株および実験手順を使用して比較のためにＫ２ＡＣ２２を評価した。

アッセイは、ＣｅｌｌＩｎｓｉｇｈｔ ＣＸ５ Ｈｉｇｈ Ｃｏｎｔｅｎｔ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ Ｐｌａｔｆｏｒｍを利用するイメージングベースの方法に依存する。評価された読み出しは、食作用指数であり、１００個のマクロファージによって呑み込まれた標的細胞の平均数として定義される。

１．マクロファージの調製：フィコール勾配により、異なる健康なドナー由来の（細胞株に応じて、５～７名の異なるドナー由来の）バフィーコートからヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離した。２０ｎｇ／ｍＬのヒトマクロファージコロニー刺激因子（Ｍ－ＣＳＦ）（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）の存在下、完全培地（ＲＰＭＩ１６４０、１０％熱不活化胎児子牛血清［Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ］）、２ｍＭ Ｌ－グルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳバッファー、２５ｍｇ／ｍＬゲンタマイシン（すべてＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ製）および５０ｍＭ ２－メルカプトエタノール（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中でＰＢＭＣを７日間培養することにより、マクロファージを生成した。続いて、細胞培養培地を交換することにより分化段階（＋１日目）で非接着細胞を排除し、細胞解離バッファー（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用して、マクロファージに相当する接着細胞を分離し、サイトメトリーベースのＡＤＣＰ実験の場合には、使用日（７日目、８日目または９日目）に完全培地で洗浄した。細胞イメージングベースのＡＤＣＰの場合には、６日目に、細胞解離バッファーを使用してマクロファージを分離し、９６オプティカルプレート（Ｃｏｓｔａｒ）に３０’０００個／ウェルで播種した。

２．食作用活性の評価（ＣｅｌｌＩｎｓｉｇｈｔ（商標）ベースのアッセイ）
マイクロプレートウェルに付着した（カルセインレッドオレンジで染色した）マクロファージを、異なる濃度の試験抗体の存在下で、カルセインＡＭ標識標的腫瘍細胞と共に１：３のエフェクター：標的細胞比で３７℃で３０分間（ＭＫＮ４５およびＳＮＵ－Ｃ１）または２．５時間（ＬｏＶｏおよびＬｓ１７４Ｔ）コインキュベートした。インキュベーション期間の終了時に、上清を完全培養培地に交換し、ＣｅｌｌＩｎｓｉｇｈｔ（商標）ＣＸ５ハイコンテントスクリーニングプラットフォームを用いてマイクロプレートをイメージングした。１ウェル当たり１５００個のマクロファージを取得および分析した。食作用は、二重陽性事象（マクロファージ＋標的腫瘍細胞）として証明され、ＣｅｌｌＩｎｓｉｇｈｔ（商標）製造業者のソフトウェアにより食作用指数を計算した。

図２および表５、６、７、８、９に示されるすべての結果は、４つのＣＥＡＣＡＭ５発現がん細胞株（ＭＫＮ－４５、ＳＮＵ－Ｃ１、Ｌｓ１７４Ｔ、ＬｏＶｏ）で得られた。エフェクター細胞対標的／腫瘍細胞の比は１：３である。

本発明による５つの二重特異性抗体はすべて、Ｋ２ＡＣ２２と比較してより良好な結合を示した（より低いＥＣ５０およびより高いＥｍａｘ、実施例６、表４を参照のこと）。驚くべきことに、Ｋ２ＡＣ２２と比較した本発明の抗体の最大達成食作用指数Ｅｍａｘ ＡＤＣＰの％増加は、低ＣＥＡＣＡＭ５発現細胞株ＬｏＶｏおよびＬｓ１７４Ｔにおいて最も強かった。

これらの結果は、異なるヒトドナーから得られたマクロファージを用いた実験において得られた。そのような実験から得られたデータを表６（ＭＫＮ－４５細胞について）、表７（ＳＮＵ－Ｃ１細胞について）、表８（Ｌｓ１７４Ｔ細胞について）および表９（ＬｏＶｏ細胞について）に示す。

実施例８：本発明の二重特異性抗体とＣＥＡＣＡＭ５に結合する他の治療用抗体との間のＣＥＡＣＡＭ５への結合についての競合の測定。
ＣＥＡＣＡＭ５を発現する細胞への結合アッセイは、実施例６に記載されているように実施された。このアッセイは、ｃｉｂｉｓａｔａｍａｂまたはＴＣＢ２０１４のようなＣＥＡｘＣＤ３二重特異性抗体を結合アッセイに添加した場合、ＭＫＮ－４５およびＬＳ１７４Ｔがん細胞株に対する本発明の二重特異性抗体の結合曲線のシフトを測定するために使用することができる。３００ｎＭの抗体が本発明の二重特異性抗体の結合曲線を３倍未満シフトさせる場合、抗体は非競合的と見なされる。

この実験では、ＴＣＢ２０１４またはＴＣＢ２０１７のいずれかの抗ＣＥＡＣＡＭ５ ｍＡｂの存在下で、ＣＤ４７ｘＣＥＡＣＡＭ５二重特異性抗体Ｋ２ＡＣ１００の濃度依存的な結合を測定した。この結合は、ＣＥＡＣＡＭ５発現ＭＫＮ－４５細胞の細胞表面で測定された。Ｋ２ＡＣ１００を蛍光色素で直接標識し、３００ｎＭのＴＣＢ２０１４（暗い線、暗い三角形）または３０ｎＭのＴＣＢ２０１７（暗い線、黒いひし形）の存在下で、ＭＫＮ－４５細胞単独（暗い線、暗い円）への結合を追跡した。陰性対照（Ｃｔｒｌ）が使用された（ＴＣＢ２０１４またはＴＣＢ２０１７の存在下でのＩｇＧ１）。この実験の結果を図５に示す。これらのデータは、３００ｎＭのＴＣＢ２０１４が添加された場合、本発明のＣＥＡｘＣＤ４７二重特異性抗体Ｋ２ＡＣ１００のＭＫＮ－４５腫瘍細胞への結合曲線のシフトがないか、または最小であったことを示している。したがって、Ｋ２ＡＣ１００抗体は、ＣＥＡＣＡＭ５結合に関して、ＴＣＢ２０１４およびＴＣＢ２０１７抗体と競合しない。

実施例９：本発明のアフコシル化二重特異性抗体の産生。
表１０および１１は、本発明の二重特異性抗体アフコシル化バージョンによる２つの細胞株（ＭＫＮ－４５およびＳＮＵ－Ｃ１）の食作用の結果を示す（ＥＣ５０およびＥｍａｘ）。本発明の二重特異性抗体のアフコシル化バージョンは、以下の方法によって産生され、精製された。

１．産生
本発明のそれぞれの二重特異性抗体のためのプラスミド（それぞれのベクターについて、プラスミドは実施例２を参照のこと）をトランスフェクトしたＣＨＯプールを、Ｔｈｏｍｓｏｎ ｅｒｌｅｎデバイスに細胞０．３×１０^６個／ｍＬの生細胞濃度で接種し、それぞれフコシル化およびアフコシル化抗体の生産について作業容量は７００ｍＬまたは１００ｍＬであった。ＣＤＡＣＦ培地ＣＤＣＨＯおよび適合供給レジームを使用して、１５日間フェドバッチモードですべてのプールを操作した。アフコシル化抗体の生産については、Ｒｉｌｌａｈａｎら、Ｎａｔｕｒｅ Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２０１２ Ｊｕｌ；８（７）：６６１－８により記載されているアフコシル化戦略に基づいて、および欧州特許出願公開第２２８２７７３号に基づいて、０、５、８および１１日目にフェドバッチプロセス中に、２００μＭフコース阻害剤（１，３，４－トリ－Ｏ－アセチル－２－デオキシ－２－フルオロ－Ｌ－フコース）のボーラスを追加した。１５日間のフェドバッチ培養後に、フコシル化またはアフコシル化抗体を含有する本発明の二重特異性抗体プール上清の回収を実施した。Ｓａｒｔｏｃｌｅａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ（登録商標）Ｌａｂ Ｖ Ｃｅｌｌ Ｈａｒｖｅｓｔｉｎｇ Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ ｓｙｓｔｅｍを使用して、ＣＨＯプール上清の回収物を清澄化した（供給業者の指示を参照のこと）。

２．精製
本発明のフコシル化およびアフコシル化二重特異性抗体の精製は、３段階アフィニティー精製プロセスで完了した。適切な容量のアフィニティーマトリックスを有するカラムを使用するために、精製の開始前に、ＯｃｔｅｔＲＥＤ９６を使用して、二重特異性抗体プールの上清中の抗体濃度を測定した。フコシル化またはアフコシル化二重特異性抗体を含有する各清澄化ＣＨＯプール上清を、事前調整なしでＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ（ＭＳＳ）カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にロードして、細胞培養汚染物質の大部分を除去した。次いで、低ｐＨホールドによりＭＳＳ溶出液を処理してウイルスを不活化し、Ｔｒｉｓ １Ｍ ｐＨ９を用いてｐＨ６で中和した。次いで、ＭＳＳ溶出液をＬａｍｂｄａＦａｂＳｅｌｅｃｔ（ＬＦＳ）カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にロードして、単一特異性κ（モノκ）を除去した。次いで、ＬＦＳ溶出液をｐＨ６でｐＨ調整した。ＬＦＳをＣａｐｔｏ Ｌ（ＣＬ）カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にロードして、単一特異性λ（モノλ）を除去した。保存前に、ＣＬ溶出液をｐＨ調整した。次いで、最終材料を濃縮し、最終製剤バッファーにダイアフィルトレーションし、Ｎａｎｏｄｒｏｐを使用してその濃度を調整した。フコシル化およびアフコシル化二重特異性抗体を等分し、送達まで－８０℃で保存した。製造業者（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，Ｃａｌｉｆ．，ＵＳＡ）により記載されているようにＰｒｏｔｅｉｎ ８０キットを使用して、Ａｇｉｌｅｎｔ ２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒを用いて変性および還元条件における電気泳動により、大きさについて精製二重特異性抗体を分析した。ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ Ｈ－Ｃｌａｓｓ Ｂｉｏ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｗａｔｅｒｓ）を使用してサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ－ＵＰＬＣ）により、凝集レベルを評価した。Ｍｕｌｔｉｐｈｏｒ ＩＩ電気泳動システム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して等電点電気泳動技術（ＩＥＦ）により、精製二重特異性抗体の電荷変異体分析を実行した。ＬａｂＣｈｉｐ ＧＸＩＩ Ｔｏｕｃｈ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）によりスループットマイクロチップ－ＣＥ法を使用して、フコシル化およびアフコシル化Ｋ２ＡＣ５およびＫ２ＡＣ２２抗体のＮ結合複合体二分岐糖型の相対分布を決定した。Ｌｉｍｕｌｕｓ Ａｍｅｂｏｃｙｔｅ Ｌｙｓａｔｅ試験（ＬＡＬ；Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，Ｍａｓｓ）を使用して、エンドトキシン汚染についてすべての抗体を試験した。本発明のａｆｕｃ二重特異性抗体は＞７０％のアフコシル化を示した。

これらのアフコシル化ＣＥＡｘＣＤ４７二重特異性抗体を使用して、表１０および１１、ならびに図３Ａおよび３Ｂに示されている結果を得た。

３．本発明のアフコシル化二重特異性抗体を生産する他の方法
３．１．ＦＵＴ８陰性生産細胞株を使用することによる
あるいは、本発明者らの知識によれば、以下の方法にしたがっても、本発明のアフコシル化二重特異性抗体を生産し得る。

材料および方法は、Ｎａｏｋｏ Ｙａｍａｎｅ－Ｏｈｎｕｋｉら、Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．；８７（２００４）６１４－６２２にしたがう。

チャイニーズハムスターＦＵＴ８ ｃＤＮＡの単離
発明者らの知識に従って、ＲＮｅａｓｙ（登録商標）Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用してＣＨＯ／ＤＧ４４細胞から全ＲＮＡを単離し、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）のためのＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ第１鎖合成システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用してオリゴｄＴで逆転写する。マウスＦＵＴ８ ｃＤＮＡ（Ｈａｙａｓｈｉ，２０００；ＤＮＡ Ｓｅｑ １１：９１－９６）から設計されたプライマー
５Ｖ－ＧＴＣＴＧＡＡＧＣＡＴＴＡＴＧＴＧＴＴＧＡＡＧＣ－３Ｖ（配列番号４５）および
５Ｖ－ＧＴＧＡＧＴＡＣＡＴＴＣＡＴＴＧＴＡＣＴＧＴＧ－３Ｖ（配列番号４６）
を使用してＰＣＲにより、一本鎖ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞ｃＤＮＡからチャイニーズハムスターＦＵＴ８ ｃＤＮＡを増幅する。

ＦＵＴ８遺伝子座のターゲティング構築物
発明者らの知識に従って、２つの置換ベクターｐＫＯＦＵＴ８ＮｅｏおよびｐＫＯＦＵＴ８Ｐｕｒｏを使用して、ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞におけるＦＵＴ８遺伝子の標的破壊を行う。ターゲティング構築物を確立するために、プローブとしてチャイニーズハムスターＦＵＴ８ ｃＤＮＡを用いてＣＨＯ－Ｋ１細胞Ｅゲノムライブラリー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）をスクリーニングすることにより、第１のコードエクソンを含むＦＵＴ８遺伝子の９．０ｋｂ断片を単離する。翻訳開始部位を含有する２３４ｂｐのセグメントを、ｌｏｘＰ部位に隣接するそれぞれプラスミド ｐＫＯＳｅｌｅｃｔＮｅｏまたはｐＫＯＳｅｌｅｃｔＰｕｒｏ（Ｌｅｘｉｃｏｎ，ＴＸ）由来のネオマイシン耐性遺伝子（Ｎｅｏｒ）カセットまたはピューロマイシン耐性遺伝子（Ｐｕｒｏｒ）カセットで置換する。プラスミドｐＫＯＳｅｌｅｃｔＤＴ（Ｌｅｘｉｃｏｎ）のジフテリア毒素遺伝子（ＤＴ）カセットを５Ｖ相同領域に挿入する。得られたターゲティング構築物ｐＫＯＦＵＴ８ＮｅｏおよびｐＫＯＦＵＴ８Ｐｕｒｏは、１．５ｋｂの５Ｖ相同配列および５．３ｋｂの３Ｖ相同配列を含んでいた。トランスフェクション前に、ユニークなＳａｌＩ部位でターゲティング構築物を線状化する。

相同組換え体のトランスフェクションおよびスクリーニング
発明者らの知識に従って、Ｂｉｏ－Ｒａｄ ＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒ（登録商標）ＩＩを使用して、３５０Ｖおよび２５０ＡＦで４Ａｇの線状化ｐＫＯＦＵＴ８ＮｅｏをサブコンフルエントＣＨＯ／ＤＧ４４細胞（１．６ １０６）にエレクトロポレーションする。エレクトロポレーション後、６００Ａｇ／ｍＬ Ｇ４１８（Ｎａｃａｌａｉ Ｔｅｓｑｕｅ，Ｋｙｏｔｏ，Ｊａｐａｎ）を用いて、トランスフェクタントを選択する。以下のプライマー：
５Ｖ－ＴＴＧＴＧＴＧＡＣＴＣＴＴＡＡＣＴＣＴＣＡＧＡＧ－３Ｖ（配列番号４７）および
５Ｖ－ＧＡＧＧＣＣＡＣＴＴＧＴＧＴＡＧＣＧＣＣＡＡＧＴＧ－３Ｖ（配列番号４８）
を使用して、以前に報告されている改変マイクロ抽出法（Ｒａｍｉｒｅｚ－Ｓｏｌｉｓら、１９９２；Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ ２０１：３３１－３３５．）により、９６ウェルプレートでゲノムＰＣＲを実施する。

ゲノムＰＣＲを使用して得られた１．７ｋｂ断片により相同組換え体を同定し、以下のプライマー：
５Ｖ－ＧＴＧＡＧＴＣＣＡＴＧＧＣＴＧＴＣＡＣＴＧ－３Ｖ（配列番号４９）および
５Ｖ－ＣＣＴＧＡＣＴＴＧＧＣＴＡＴＴＣＴＣＡＧ－３Ｖ（配列番号５０）
を用いて増幅した２２１ｂｐ断片を使用してサザンブロット分析により確認する。

ヘミ接合性クローンを、前記のように、線状化ｐＫＯＦＵＴ８Ｐｕｒｏを使用した第２ラウンドの相同組換えと、１５Ａｇ／ｍＬピューロマイシン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）による薬物選択とに供する。Ｃｒｅ－リコンビナーゼ発現ベクターｐＢＳ１８５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、同定したホモ接合性破壊体にエレクトロポレーションして、両ＦＵＴ８対立遺伝子由来の薬物耐性遺伝子カセットを除去する。

ＦＵＴ８（－）細胞によるモノクローナル抗体の産生
発明者らの知識に従って、本発明の二重特異性抗体をコードする発現ベクターをＦＵＴ８（－）細胞株にエレクトロポレーションし、ヒポキサンチンおよびチミジンを欠く培地で選択する。Ｅｘ－Ｃｅｌｌ（登録商標）３０１培地（ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｌｅｎｅｘａ，ＫＳ）中で、コンフルエントなトランスフェクタントを１週間培養する。ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を使用して、培養上清から抗体を精製する。さらなる精製工程は、陰イオン／陽イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、および特に上記カッパまたはラムダ選択樹脂を使用した精製であり得る。

３．２．産生細胞培地からの細胞外フコースの回収プラス細胞内フコース生合成の酵素的介入
好ましくは、本発明者らの知識によれば、本発明のアフコシル化二重特異性抗体はまた、下記の方法／技術に従って、また、米国特許第８６４２２９２号に記載されるように製造され得る。この技術は、ＣＨＯ細胞株などのような抗体産生細胞株への異種細菌酵素の安定な組み込みを構成するように設計されている。これにより、Ｄ－マンノースからのフコースのデノボ合成が遮断される。さらに、産生細胞を、フコースを含まない培地で培養すると、結果として、安定したレベルのアフコシル化を有する抗体が産生される。

真核細胞では、フコースは２つの経路
ａ）サルベージ経路を介して細胞外空間またはリソソームから、および
ｂ）フコースのデノボ合成経路におけるＤ－マンノースからのフコースのデノボ合成によって、を介して生成される。

サルベージ経路は、培養培地からのフコースの除去によって完全に遮断することができる。デノボ生合成経路は、この経路の中間体ＧＤＰ－４－ケト－６－デオキシ－Ｄ－マンノースをＧＤＰ－４－ケト－６－デオキシ－Ｄ－ガラクトースの代わりにＧＤＰ－Ｄ－ラムノースに変換することによって遮断することができる。これは、ＲＭＤをコードする遺伝子を産生細胞株に安定に組み込むことによって、細菌酵素ＧＤＰ－６－デオキシ－Ｄ－リキソ－４－ヘキスロースレダクターゼ（ＲＭＤ）を産生細胞株にそれぞれ導入することによって達成される。産生細胞株において発現されるＲＭＤの量がかなり少ない場合でさえ、産生細胞のデノボ合成経路を完全に遮断する。

この技術は、本発明のアフコシル化抗体の産生のために、ならびに本発明の抗体を既に産生し、フコース含有量が８０％～１００％減少した抗体を産生するように操作される既存の産生細胞株に合わせて、設計される産生細胞株、例えばＣＨＯ系細胞株を構築するために使用される。

図３Ａおよび３Ｂならびに表１０および１１に示されるすべての結果は、２つのＣＥＡＣＡＭ５発現がん細胞株（ＭＫＮ－４５およびＳＮＵ－Ｃ１）で得られた。エフェクター細胞対標的／腫瘍細胞の比は１：３である。これらの結果は、３人の異なるヒトドナーから得られたマクロファージを用いた実験で得られた。そのような実験から得られたデータを表１０（ＭＫＮ－４５細胞について）および表１１（ＳＮＵ－Ｃ１細胞について）に示す。

実施例１０
腫瘍細胞上のＳＩＲＰαとＣＤ４７との相互作用の遮断
本発明の二重特異性抗体のＳＩＲＰα阻害効力（ＩＣ５０）を測定するための実験設定：

以下に記載されるような、可溶性ＳＩＲＰαとＭＫＮ－４５細胞の表面に発現されるヒトＣＤ４７との相互作用を監視する細胞ベースのアッセイを、遮断活性の検出のために使用した。本発明による二重特異性抗体を用いた濃度応答実験により、阻害曲線（図４参照）およびＩＣ５０値（表１２参照）の決定が可能になった。

ＣＤ４７およびＣＥＡＣＡＭ５の両方を発現するＭＫＮ－４５がん細胞をＣＦＳＥバイオレットで染色して、イメージングシステム（ＣＸ５）が細胞を検出することを可能にした。簡単に記載すると、３’０００個の染色されたＭＫＮ－４５細胞／ウェルを３８４オプティカルウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ）に播種し、濃度を高めた本発明の二重特異性抗体（１．９ｐＭ～３３３ｎＭ、４回反復）とともに５０分間インキュベートした。次いで、抗マウスＩｇＧ－Ｆｃ ＡＦ６４７結合抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ １：２０００に希釈）と予め混合した固定濃度のＳＩＲＰα－マウスＦｃを最終濃度５０ｎｇ／ｍＬで添加した。３時間３０分のインキュベーション後、プレート上の検出された結合ＳＩＲＰαによって放出された蛍光シグナルの画像をイメージングシステム（ＣＸ５、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を用いて取得した。蛍光シグナル（平均蛍光強度ＭＦＩ）を試験した用量範囲に従ってプロットし、ＩＣ５０をソフトウェア（Ｐｒｉｓｍ、ＧｒａｐｈＰａｄ）によって計算した。結果を表１２に示す。

実施例１１：ａ．がん患者由来の新鮮なサンプルからのがん細胞におけるＣＥＡＣＡＭ５発現を得るため（Ｑｉｆｉｋｉｔデータ）およびｂ．食作用データを得るためのオルガノイド手順
患者の一次サンプルに由来するオルガノイドを、標準的な方法（酵素消化および／または機械的解離）によって単一細胞懸濁液として調製した。１０μＬの抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５一次抗体（＃ｓｃ－２３９２８；ｍＩｇＧ１（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）；最終濃度２０μｇ／ｍＬ）を細胞に添加し、４℃で３０分間インキュベートした。細胞を洗浄し、遠心分離した。１００μＬのビーズ（ＱＩＦＩＫＩＴ（登録商標）の設定または較正）を細胞と共に洗浄し、同様に処理した。キットからの二次抗体１００μＬ（ＰＢＳ ＢＳＡ ２％中１／５０）を各ウェルに添加し、４℃で３０～４５分間インキュベートした。細胞を遠心分離して上清を捨て、２回洗浄した。最後の遠心分離の後、細胞を再懸濁し、サイトメーターで取得した。分析は、特定のソフトウェアを使用して行い、および幾何平均をＥｘｃｅｌファイルにエクスポートした。較正ビーズからのＭＦＩ値を使用して線形回帰を行った。細胞の抗体結合能（ＡＢＣ）をこの回帰直線から外挿した。アイソタイプ対照から特異的染色の１つに対するＡＢＣを差し引くことによって、特異的抗体結合能（ｓＡＢＣ）を得た。

これらの主要オルガノイドのＣＥＡＣＡＭ５の平均発現は、細胞あたり２８，０００個のＣＥＡＣＡＭ５標的であること、すなわち表５の細胞株での平均発現よりも約４倍低いことが分かった。

本発明の二重特異性抗体およびヒトドナー由来のマクロファージを添加した場合、がん患者の一次サンプルに由来するオルガノイドを使用して、濃度依存的食作用／食作用指数を試験することもできる（実施例７参照）。同じ方法を使用することによって、本発明者らの知識によれば、本発明の二重特異性抗体とＣＥＡｘＣＤ３二重特異性抗体との組み合わせも、ヒトドナー由来のＴ細胞も添加した場合に試験することができる。

実施例１２：抗腫瘍活性：組織切片培養
本発明者らの知見によれば、本発明による二重特異性抗体の抗腫瘍活性は、ＣＥＡ発現腫瘍と診断された患者由来の腫瘍組織切片培養物（Ｓｏｅｎｎｉｃｈｓｅｎら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ Ｃａｎｃｅｒ ２０１８を参照のこと）において、それぞれ単剤および併用処置として評価することができる。

１．組織切片の培養および処置
新鮮な腫瘍組織サンプルを切断し、以前に公開されたように取り扱う（Ｓｏｅｎｎｉｃｈｓｅｎら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ Ｃａｎｃｅｒ ２０１８）。手短に言えば、外科的切除および最初の肉眼的病理学的評価の直後に、組織チョッパを使用して腫瘍サンプルを３５０μｍの切片に切断する。次いで、組織切片直径を、３ｍｍのコアリングツールを使用することによって標準化する。３つの組織切片をランダムにプールし、メンブレンインサート上に置き、６ウェルプレート中で培養する。切片を３７℃および５％ ＣＯ２の標準化条件下でインキュベートする。標準的な細胞培養培地で前培養した後、切片トリプレットを、それぞれ単独でまたは組み合わせて（例えば、ＰＤ－Ｌ１阻害剤を用いて）、１２０時間まで本発明による二重特異性抗体に曝露する。化合物曝露後、腫瘍切片を、４％パラホルムアルデヒドを用いて一晩固定する。

２．染色
パラホルムアルデヒド固定切片をパラフィンに包埋し、５μｍ切片に加工する。組織病理学的側面および腫瘍細胞の割合を評価するために、ヘマトキシリンおよびエオシン（ＨＥ）染色を行う。全体的な細胞数、腫瘍細胞数、および増殖を免疫蛍光染色によって分析する。要するに、パラフィン切片を脱パラフィンする。抗原回収後、切片を０．３％ ＰＢＳ／Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘで洗浄し、５％正常ヤギ血清で３０分間ブロッキングする。サイトケラチン（ＡＥ１ｂ３）、Ｋｉ６７、および切断ＰＡＲＰに対する一次抗体をそれぞれ０．５％ウシ血清アルブミンに希釈し、４℃で一晩インキュベートする。切片を０．３％リン酸緩衝食塩水／Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘですすぎ、二次抗体で標識する。核をＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２で染色する。さらなる染色（例えばＣＥＡ発現のために）を含めてもよい。

３．データ解析
蛍光顕微鏡を使用して蛍光染色切片から組織切片あたり５枚の写真（２０倍）を撮影する。Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２、サイトケラチン、Ｋｉ６７、および切断ＰＡＲＰ染色について、染色特異的セグメント化アルゴリズムを用いて陽性画素数を決定する。増殖／アポトーシス腫瘍面積は、サイトケラチン陽性画素に囲まれたＫｉ６７／切断ＰＡＲＰ陽性核の画素を分析することによって計算される。すべての写真について、総細胞数（Ｈｏｅｃｈｓｔ陽性）、腫瘍細胞数（Ｈｏｅｃｈｓｔ陽性およびサイトケラチン陽性）、および増殖腫瘍細胞数（Ｈｏｅｃｈｓｔ－、サイトケラチン－およびＫｉ６７－陽性／切断ＰＡＲＰ）を計算する。腫瘍細胞数を総細胞数に対して正規化し、増殖腫瘍細胞数を腫瘍細胞数に対して正規化して、写真ごとに異なる腫瘍細胞画分を考慮する。次いで、単一の画像値から平均切片値が計算される。条件についての平均値は、平均切片値を使用して計算される。

実施例１３：インビボ抗腫瘍活性。
本発明者らの知見によれば、本発明による二重特異性抗体の抗腫瘍活性は、トランスジェニックマウスにおいて、それぞれ同様に単剤および併用処置として評価することができる。

１．細胞株の作製および成長試験
例えばマウス結腸がん細胞株ＣＴ２６またはＭＣ３８に基づくｈＣＥＡＣＡＭ５（Ｔｇ）ｈＣＤ４７（Ｔｇ）ｍＣＤ４７（ｋｏ）細胞株を作製する。内在性マウスＣＤ４７遺伝子のノックアウト（ＫＯ）を、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を使用することによって行い、その後、細胞選別によってＫＯクローンを単離する。内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を使用してｈＣＤ４７とｈＣＥＡＣＡＭ５の両方の発現を駆動するカセットでＫＯクローンをトランスフェクトした後、例えば全体的な発現レベルおよび発現比に基づいて操作されたクローンを単離する。３つの検証されたクローンを選択して、その後、最終クローンの選択のためにそれらの生着／腫瘍形成性をインビボで試験する。

２．インビボ抗腫瘍活性
ヒトＣＤ３ｅを発現するＢＡＬＢ／ｃＪＧｐｔバックグラウンドのマウス系統（Ｔ００１５５０ヘテロ接合ＢＡＬＢ／ｃ－ｈＣＤ３ＥＴ／Ｗｔマウス）およびヒトＣＤ４７／ヒトＳＩＲＰα（Ｔ０３７２６４ホモ接合ＢＡＬＢ／ｃ－ｈＣＤ４７／ｈＳＩＲＰαマウス）は、ＧｅｍＰｈａｒｍａｔｅｃｈで入手可能である。あるいは、ヒトＣＤ３ｅを発現するＣ５７ＢＬ／６／Ｂｃｇｅｎバックグラウンドのマウス系統（ホモ接合Ｂ－ｈＣＤ３Ｅマウス）およびヒトＣＤ４７／ヒトＳＩＲＰα（ホモ接合Ｂ－ｈＳＩＲＰα／ｈＣＤ４７マウス）は、Ｂｉｏｃｙｔｏｇｅｎで入手可能である。２つのマウス系統を交配して、三重ヒト化ｈＣＤ３ｅ／ｈＳＩＲＰａ／ｈＣＤ４７マウスを得、その子孫を、単剤または併用処置のいずれかとして本発明による二重特異性抗体を試験するためのその後の実験に使用する。

三重ヒト化ｈＣＤ３ｅ／ｈＳＩＲＰａ／ｈＣＤ４７マウスに、ＣＴ２６－ｈＣＥＡＣＡＭ５（Ｔｇ）ｈＣＤ４７（Ｔｇ）ｍＣＤ４７（ｋｏ）細胞株（ＢＡＬＢ／ｃバックグラウンド）またはＭＣ３８－ｈＣＥＡＣＡＭ５（Ｔｇ）ｈＣＤ４７（Ｔｇ）ｍＣＤ４７（ｋｏ）細胞株（Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンド）のいずれかを０日目に接種する。コホートにおける中程度の腫瘍サイズが、例えば、２００ｍｍ^３に達したら、単剤としての、同様にまた、組み合わせての本発明による二重特異性抗体による処置が、１匹のマウスの腫瘍体積が、例えば、３０００ｍｍ^３を超えるか、または、事前に指定された動物保護エンドポイントおよびケアエンドポイントのいずれか１またはそれを超えるものが生じるまで、例えば、２処置／週の間隔で静脈内ボーラスとして開始される。腫瘍体積および体重を週に３回測定する。腫瘍体積は、以下の式を使用してｍｍ^３で与えられる：ＴＶ＝０．５ａ×ｂ２、式中、ａおよびｂはそれぞれ腫瘍の長径および短径である。

Claims (55)

1. ヒトＣＥＡＣＡＭ５に特異的に結合する第１の結合部分と、ヒトＣＤ４７に特異的に結合する第２の結合部分とを含む二重特異性抗体であって、
   ａ）前記第１の結合部分は、重鎖可変領域として、配列番号１のＣＤＲＨ１、配列番号２のＣＤＲＨ２および配列番号３のＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域を含み、
   ｂ）前記第１の結合部分は、軽鎖可変領域として、
   ｂ１）配列番号１４のＣＤＲＬ１、配列番号１５のＣＤＲＬ２、および配列番号１６のＣＤＲＬ３、または
   ｂ２）配列番号１７のＣＤＲＬ１、配列番号１８のＣＤＲＬ２、および配列番号１９のＣＤＲＬ３、
   ｂ３）配列番号２０のＣＤＲＬ１、配列番号２１のＣＤＲＬ２、および配列番号２２のＣＤＲＬ３、
   ｂ４）配列番号２３のＣＤＲＬ１、配列番号２４のＣＤＲＬ２、および配列番号２５のＣＤＲＬ３、ならびに
   ｂ５）配列番号２６のＣＤＲＬ１、配列番号２７のＣＤＲＬ２、および配列番号２８のＣＤＲＬ３からなる群から選択されるＣＤＲＬのセットを含む軽鎖可変領域を含み、
   ｃ）前記第２の結合部分は、重鎖可変領域として、配列番号１のＣＤＲＨ１、配列番号２のＣＤＲＨ２および配列番号３のＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域を含み、
   かつ軽鎖可変領域として、配列番号７のＣＤＲＬ１、配列番号８のＣＤＲＬ２、および配列番号９のＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域を含むことを特徴とする二重特異性抗体。
2. 前記第１の結合部分において、配列番号４の可変重鎖領域を可変重鎖領域として含み、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５および配列番号３６からなる群から選択される可変軽鎖領域を可変軽鎖領域として含み、前記第２の結合部分において、可変重鎖領域として、配列番号４の可変重鎖領域を含み、可変軽鎖領域として、配列番号１０の可変軽鎖領域を含むことを特徴とする、請求項１に記載の二重特異性抗体。
3. 前記第１の結合部分において、配列番号５を含む重鎖、および配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０および配列番号４１からなる群から選択される軽鎖を含むこと、ならびに、前記第２の結合部分において、配列番号５の重鎖領域、および配列番号１１を有する軽鎖を含むことを特徴とする、請求項１に記載の二重特異性抗体。
4. 重鎖として配列番号６の共通の重鎖を含むことを特徴とする、先行する請求項のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。
5. 前記第１の結合部分について一価であり、前記第２の結合部分について一価である、前述の請求項のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
6. 定常および可変フレームワーク領域配列がヒトのものである、前述の請求項のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
7. 前記第１の結合部分の前記軽鎖がラムダ軽鎖（ＶＬＣＬ）であり、前記第２の結合部分の前記軽鎖がカッパ軽鎖（ＶＫＣＫ）である、先行する請求項のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。
8. ヒトＩｇＧ１タイプである、前述の請求項のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
9. 前記抗体が、糖操作されていない同じ二重特異性抗体と比較して、フコース残基の数が減少するように糖操作されたＦｃ領域を含む、先行する請求項のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。
10. 前記二重特異性抗体が、配列番号４３および４４の前記可変軽鎖領域および可変重鎖領域を含む抗ＣＥＡＣＡＭ５抗体ＳＭ３Ｅと、ＣＥＡＣＡＭ５への結合について競合することを特徴とする、先行する請求項のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。
11. ２～１０ｎＭの結合親和性（ＫＤ）で組換えヒトＣＥＡＣＡＭ５に結合することを特徴とする、先行する請求項のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。
12. １００ｎＭ～６００ｎＭの結合親和性でヒト組換えＣＤ４７に結合することを特徴とする、先行する請求項のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。
13. １００倍またはそれを超える、組換えＣＥＡＣＡＭ３および組換えＣＥＡＣＡＭ５への前記結合についての前記ＫＤ値の比を特徴とする、先行する請求項のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。
14. １００～２００倍の、組換えＣＥＡＣＡＭ３および組換えＣＥＡＣＡＭ５への前記結合についての前記ＫＤ値の比を特徴とする、請求項１３に記載の二重特異性抗体。
15. 二重特異性抗体Ｋ２ＡＣ２２の食作用指数と比較して、ＬｏＶｏ腫瘍細胞の最大の食作用指数の少なくとも８％の増加を特徴とする、先行する請求項のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。
16. ＬｏＶｏ腫瘍細胞について８％～２０％の最大の食作用指数の増加を特徴とする、請求項１５記載の二重特異性抗体。
17. Ｋ２ＡＣ２２の食作用指数と比較して、Ｌｓ１７４Ｔ腫瘍細胞の最大の食作用指数の少なくとも８％の増加を特徴とする、先行する請求項のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。
18. Ｌｓ１７４Ｔ腫瘍細胞について８％～２５％の最大の食作用指数の増加を特徴とする、請求項１７記載の二重特異性抗体。
19. ＭＫＮ－４５細胞上のＣＤ４７とＳＩＲＰαとの間の相互作用を、同じ実験条件下でＫ２ＡＣ２２について測定されたＩＣ５０よりも１０倍またはそれを超えて低い前記ＩＣ５０で阻害することを特徴とする、先行する請求項のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。
20. ＭＫＮ－４５細胞上のＣＤ４７とＳＩＲＰαとの間の相互作用を１０倍～３０倍のＩＣ５０で阻害することを特徴とする、請求項１９に記載の二重特異性抗体。
21. ＭＫＮ－４５細胞上のＣＤ４７とＳＩＲＰαとの間の相互作用を０．１ｎＭまたはそれ未満のＩＣ５０で阻害することを特徴とする、先行する請求項のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。
22. ＭＫＮ－４５細胞上のＣＤ４７とＳＩＲＰαとの間の相互作用を０．１ｎＭ～０．０４ｎＭのＩＣ５０で阻害することを特徴とする、請求項２１に記載の二重特異性抗体。
23. ＣＥＡＣＡＭ５への結合についてｃｉｂｉｓａｔａｍａｂと競合しないことを特徴とする、先行する請求項のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。
24. 前記第１の二重特異性抗体が、３００ｎＭの濃度において、ヒトＣＥＡＣＡＭ５およびＣＤ３εに結合する第２の二重特異性抗体が、ＭＫＮ－４５細胞に対するまたはＬＳ１７４Ｔ細胞に対する前記第１の二重特異性抗体の結合曲線のＥＣ５０を、より高い濃度に向かって３倍を超えてシフトさせないことを特徴とする、先行する請求項のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。
25. 前記第２の二重特異性抗体が、ＴＣＢ２０１４またはｃｉｂｉｓａｔａｍａｂである、請求項２４に記載の二重特異性抗体。
26. 先行する請求項のいずれか１項に記載の二重特異性抗体をコードする単離されたポリヌクレオチドまたは一群のポリヌクレオチド。
27. 請求項２６に記載される単数のポリヌクレオチドまたは複数のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
28. 請求項２７に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
29. ａ）請求項２８に記載の宿主細胞を、前記二重特異性抗体の産生を可能にする条件下で培養することと、ｂ）前記抗体を単離することと、を含む、請求項１～２５のいずれか１項に記載の二重特異性抗体の産生のための方法。
30. ヒトがんの治療に使用するための、請求項１～２５のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。
31. 前記がんが固形がんであることを特徴とする、請求項３０に記載の使用のための二重特異性抗体。
32. 前記がんが、結腸直腸がん、ＮＳＣＬＣ（非小細胞肺がん）、胃がん、膵臓がん、乳がん、または別のＣＥＡＣＡＭ５発現がんであることを特徴とする、請求項３０に記載の使用のための二重特異性抗体。
33. ＣＥＡＣＡＭ５を発現するがんを有する対象を処置するための医薬品の製造に使用するための、請求項１～２５のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。
34. ＣＥＡＣＡＭ５を発現するがんを有する対象の処置において、ヒトＣＥＡＣＡＭ５に特異的に結合する第３の結合部分と、ヒトＣＤ３εに特異的に結合する第４の結合部分と、を含む第２の二重特異性抗体と同時、別個または逐次の組み合わせで使用するための、請求項１～２５のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。
35. 前記第２の二重特異性抗体が、ＴＣＢ２０１４またはｃｉｂｉｓａｔａｍａｂである、同時、別個または逐次の組み合わせで使用するための、請求項１～２５のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。
36. 本発明による二重特異性抗体および前記第２の二重特異性抗体が、前記対象に６～１５日間隔で同時に投与されることを特徴とする、請求項３４または３５に記載の使用のための二重特異性抗体。
37. 請求項１～２５のいずれか１項に記載の二重特異性抗体と、薬学的に許容され得る賦形剤または担体とを含む医薬組成物。
38. 医薬品として使用するための、請求項３７に記載の医薬組成物。
39. 固形がんの処置における医薬品として使用するための、請求項３７または請求項３８に記載の医薬組成物。
40. 結腸直腸がん、ＮＳＣＬＣ（非小細胞肺がん）、胃がん、膵臓がんまたは乳がんの処置における医薬品として使用するための、請求項３７～３９のいずれか１項に記載の医薬組成物。
41. ＣＥＡＣＡＭ５を発現するがんを有する対象を処置する方法であって、治療有効量の請求項１～２５のいずれか１項に記載の二重特異性抗体または請求項３７～４０のいずれか１項に記載の医薬組成物を、前記対象に投与することを含む方法。
42. 前記がんがヒトがんである、請求項４１に記載の方法。
43. 前記対象が患者である、請求項４１または４２に記載の方法。
44. 前記がんが、結腸直腸がん細胞、ＮＳＣＬＣ（非小細胞肺がん）細胞、胃がん細胞、膵臓がん細胞、乳がん細胞、またはＣＥＡＣＡＭ５を発現する別の腫瘍細胞であることを特徴とする、請求項４１～４３のいずれか１項に記載の方法。
45. 前記二重特異性抗体を化学療法または放射線治療と組み合わせて投与する、請求項４１～４４のいずれか１項に記載の方法。
46. 腫瘍を有するヒト患者を処置する方法であって、有効量の請求項１～２５のいずれか１項に記載のＣＥＡＣＡＭ５×ＣＤ４７二重特異性抗体ならびにＣＥＡＣＡＭ５およびＣＤ３に対する第２の二重特異性抗体を投与することを含む方法。
47. 前記ＣＥＡＣＡＭ５×ＣＤ４７二重特異性抗体ならびに前記ＣＥＡＣＡＭ５およびＣＤ３抗体が競合的でない、請求項４６に記載の方法。
48. 前記抗体を同時に投与する、請求項４６または４７に記載の方法。
49. 前記患者が、０．０１ｍｇ／ｋｇ～１０ｍｇ／ｋｇの請求項１～２５のいずれか１項に記載の二重特異性抗体の１またはそれを超える用量を投与される、請求項４１～４８のいずれか１項に記載の方法。
50. 患者に、０．０１ｍｇ／ｋｇ～１０ｍｇ／ｋｇの前記ＣＥＡＣＡＭ５×ＣＤ３二重特異性抗体の１またはそれを超える用量および１ｍｇ／ｋｇ～２０ｍｇ／ｋｇの前記ＣＥＡＣＡＭ５×ＣＤ４７二重特異性抗体の１またはそれを超える用量を投与する、請求項４６～４８のいずれか１項に記載の方法。
51. 前記第２の抗体が、ＴＣＢ２０１４またはｃｉｂｉｓａｔａｍａｂである、請求項４６～５０のいずれか１項に記載の方法。
52. ＣＥＡＣＡＭ５を発現するがんを有する対象の生存時間を延長する方法であって、前記方法が、治療有効量の請求項１～２５のいずれか１項に記載の二重特異性抗体を前記対象に投与することを含む、方法。
53. 前記がんが、結腸直腸がん、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、胃がん、膵臓がん、または乳がんであることを特徴とする、請求項５２に記載の方法。
54. 前記二重特異性抗体を化学療法および／または放射線治療と組み合わせて投与する、請求項５２または５３のいずれか１項に記載の方法。
55. 前記患者が、０．０１ｍｇ／ｋｇ～１０ｍｇ／ｋｇの請求項１～２５のいずれか１項に記載の二重特異性抗体の１またはそれを超える用量を投与される、請求項５２～５４のいずれか１項に記載の方法。

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