ES2967381T3 - Anticuerpos biespecíficos contra CEACAM5 y CD47 - Google Patents
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Abstract
La presente invención se refiere a anticuerpos biespecíficos que se unen al antígeno carcinoembrionario humano CEACAM5 y al CD47 humano. Además, la presente invención se refiere a polinucleótidos que codifican dichos anticuerpos biespecíficos y a vectores y células huésped que comprenden dichos polinucleótidos. La invención se refiere además a métodos para seleccionar y producir dichos anticuerpos y a métodos para usar dichos anticuerpos en el tratamiento de enfermedades. La invención también se refiere al uso terapéutico de los anticuerpos biespecíficos en monoterapia y en terapia combinada. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Anticuerpos biespecíficos contra CEACAM5 y CD47
Referencia al listado de secuencias
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CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a anticuerpos biespecíficos que se unen al antígeno carcinoembrionario humano CEACAM5 (CEA) y al CD47 humano (anticuerpos biespecíficos CEAxCD47). Además, la presente invención se refiere a polinucleótidos que codifican dichos anticuerpos biespecíficos y a vectores y células huésped que comprenden dichos polinucleótidos. La invención se refiere además a procedimientos para seleccionar y producir dichos anticuerpos y a procedimientos de uso de dichos anticuerpos en el tratamiento de enfermedades. La invención también se refiere al uso terapéutico de los anticuerpos biespecíficos CEAxCD47 en monoterapia.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
El CEA pertenece a la familia de moléculas de adhesión celular relacionadas con CEA (CEACAM) que comprende 12 proteínas estrechamente relacionadas en seres humanos codificadas por 22 genes divididos entre los subgrupos CEACAM y glicoproteínas específicas del embarazo (PSG) en el cromosoma 19q 13 (Beauchemin N y Arabzadeh A, Cancer Metastasis Rev. 2013). Los CEACAM están involucrados en una diversidad de procesos fisiológicos, tales como el reconocimiento célula-célula, y modulan procesos celulares que varían de la configuración de la arquitectura tisular y la neovascularización a la regulación de la homeostasis de la insulina y la proliferación de células T; los CEACAM también se han identificado como receptores de virus y bacterias específicos del huésped (Kuespert K et al., Curr Opin Cell Biol.
2006). El CEA (CEACAM5 o CD66e; UniProtKB - P06731) está presente de forma temprana en el desarrollo embrionario y fetal y mantiene su expresión en tejidos adultos normales. Su principal sitio de expresión se encuentra en células epiteliales columnares y caliciformes del colon, en particular en el tercio superior de la cripta y en la superficie luminal libre.
El CEA se (sobre)expresa en tumores de origen epitelial, incluidos, pero sin limitación, carcinomas colorrectales, gástricos, pulmonares y pancreáticos (revisado por Beauchemin N y Arabzadeh A, Cancer Metastasis Rev. 2013), en los que pierde su expresión apical, lo que produce su distribución a lo largo de toda la superficie celular (Hammarstrom, Semin Cancer Biol 1999).
Un procedimiento para tratar cáncer que expresa CEA mediante una combinación de un antagonista del eje PD-1 humano y un anticuerpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3 que redirecciona y activa células T se menciona en los documentos US20140242079 y WO2017118657 y se han presentado resultados clínicos en
la reunión anual de ASCO de 2017 (Tabernero et al., J Clin Oncol 35, 2017 (supl.; resumen 3002)).
Un procedimiento para tratar tumores mediante la administración de antagonistas de puntos de control inmunitario que se unen a dos o más dianas diferentes de una vía de puntos de control inmunitario, y un agente de redireccionamiento de células T que se une a CEA y un antígeno de superficie de células T se mencionan en el documento WO2015112534. Un anticuerpo de clase I que se une a CEACAM5 y granulocitos se menciona en el documento US20110064653.
El CD47 humano (UniProtKB - Q08722 (CD47_HUMAN; IAP)) es una proteína transmembrana que se une a los ligandos trombospondina-1 (TSP-1) y la proteína alfa reguladora de señales (SIRPa; CD172a; UniProtKB P78324) y puede actuar como una señal de "no me comas" para el sistema inmunológico, especialmente para macrófagos que expresan SIRPa. La potente inhibición (CI50 baja) de la unión de SIRPa a CD47 en la superficie de células tumorales es una medida para aumentar la fagocitosis de células tumorales por parte de los macrófagos. El CD47 está involucrado en una diversidad de procesos celulares, incluida la apoptosis, la proliferación, la adhesión y la migración. Además, desempeña un papel clave en las respuestas inmunitarias y angiogénicas. El CD47 se sobreexpresa en células tumorales de pacientes con tumores tanto hematológicos como sólidos. En el estado de la técnica se describen anticuerpos contra CD47 que han mostrado actividad preclínica y clínica temprana prometedora en diferentes entidades tumorales, incluidas neoplasias malignas hematológicas tales como linfoma y tumores sólidos, por ejemplo, cáncer gástrico (Weiskopf K., European Journal of Cancer 76 (2017) 100-109; Huang Y et al., J Thorac Dis 2017;9(2):E168-E174; Kaur et al., Antibody Therapeutics, 3 (2020) 179-192). Los anticuerpos de la subclase IgG1 que se unen a CD47 pueden provocar el agotamiento de las plaquetas y la reducción de los glóbulos rojos (RBC) y la hemoglobina de una forma dependiente de Fc (véase, por ejemplo, el documento US20140140989). Para evitar este efecto adverso, en el documento WO2017196793 se describe una forma mutante de la subclase IgG4 de un anticuerpo anti-CD47 (IgG4PE, con la mutación S228P y una mutación L235E para reducir la unión a FcyR). Dicho anticuerpo anti-CD47 con unión a FcyR y función efectora muy reducidas no da como resultado dicho agotamiento de plaquetas. Un anticuerpo biespecífico de dominio único contra CD47 y CD20 se ha descrito por von Bommel PE et al. (Oncoimmunol. 7 (2018) e386361) y Piccione EC et al. (mAbs 7 (2015)946-956). Dheilly E. et al. (Mol. Thera. 25 (2017) 523-533; véase también el documento WO2014087248) describe un anticuerpo biespecífico contra CD19 y CD47.
En los documentos WO2019234576, EP19213002, y US62943726 se describen anticuerpos biespecíficos contra CEACAM5 y CD47 que comprenden una cadena pesada común de SEQ ID NO: 5 (VH-CH1) y una región variable de cadena ligera que interactúa con CD47 VL de<s>E<q>ID NO: 10. Un anticuerpo biespecífico contra CD19 y CD47 que comprende una cadena pesada común de SEQ ID NO: 5 y una región variable de cadena ligera VL que interactúa con CD47 de SEQ ID NO: 10 se describe en el documento WO2014087248, dirigido conjuntamente a CD47 y CEACAM5. El documento EP3623388 se refiere a moléculas de unión biespecíficas que comprenden un brazo dirigido a tumores y una proteína de fusión con baja afinidad para bloquear la interacción entre CD47 y SIRPa. El documento WO 2018/057955 se refiere a anticuerpos biespecíficos que se unen tanto a CD47 como a mesotelina y que comprenden una cadena pesada común. El documento WO2019016411 se refiere a moléculas de anticuerpos biespecíficos dirigidos a CD47 y un antígeno tumoral.
Se han logrado avances considerables en el tratamiento de neoplasias malignas hematológicas. Esto contrasta con los avances producidos en el tratamiento de diversos tipos de tumores sólidos avanzados. A pesar de ciertos avances en el tratamiento de tipos de cáncer sólido localmente avanzado o especialmente metastásico, la supervivencia libre de progresión (SSP) y la supervivencia general (SG) de pacientes que padecen cáncer avanzado tales como cáncer colorrectal, cáncer de páncreas, cáncer de pulmón, etc., sigue siendo bastante limitada y normalmente no hay cura. Se han puesto muchas esperanzas en la inmunoterapia contra el cáncer y se han logrado determinados éxitos, pero limitados. Los tumores desarrollan medidas para proteger sus células de la destrucción por parte de las células T efectoras y otras células inmunitarias tales como los macrófagos. Las estrategias basadas en inmunoterapia contra el cáncer en las últimas décadas han tenido cierto éxito en contrarrestar estas medidas protectoras de tumores y redireccionar las células T contra las células cancerosas. Los ejemplos más destacados de dichas estrategias son los inhibidores/activadores de determinados puntos de control inmunitario. Por ejemplo, se ha demostrado que los inhibidores de puntos de control, tales como los antagonistas del eje PD-1, reactivan las células T efectoras para combatir determinados cánceres sólidos. Pero no todos los tipos de tumores sólidos responden a los antagonistas del eje PD-1 e, incluso en los tipos que responden, a menudo una proporción muy inferior al 50% de los pacientes obtienen un beneficio relevante de, por ejemplo, el tratamiento con un anticuerpo anti-PD-1 o PD-L1. Por ejemplo, menos del 10% de los pacientes con cáncer colorrectal avanzado son elegibles para la terapia con inhibidores del eje PD-1 (especialmente el, aproximadamente, 4% de los pacientes con cáncer colorrectal avanzado que muestran inestabilidad microsatelital MSI en el cáncer que padecen obtienen algún beneficio).
La terapia de células T adoptiva con células T del receptor de antígeno quimérico (CAR) y la terapia con anticuerpos biespecíficos de células T proporcionaron resultados clínicos prometedores en neoplasias malignas hematológicas. Pero los estudios clínicos con terapias de células T adoptivas, por ejemplo, células T CAR, en varios tumores sólidos, en su mayor parte no mostraron tasas de respuesta o mostraron, únicamente, tasas de respuesta reducidas (por ejemplo Xu et al., Expert Review of Anticancer Therapy 2017, 17, 1099-1106; Greenbaum et al., Biol Blood Marrow Transplant 2020 Oct; 26(10):1759-1769).
Los docum entos US20140242079, WO2017055389, US20140242080, y Bacac et al. (Clin. Cancer Res., 22(13), 3286 97 (2016)) describen anticuerpos biespecíficos de células T CEAxCD3. Los anticuerpos biespecíficos de células T del documento WO2017055389 muestran una potencia/eficacia de activación de células T fuertemente aumentada en comparación con cibisatamab en estudios preclínicos; uno de estos anticuerpos biespecíficos de células T CEAxCD3 de mayor potencia se encontraba en desarrollo clínico (RO7172508 en NCT03539484). Tal como se utiliza en el presente documento, "TCB2014" se refiere a un anticuerpo biespecífico que se une a CEA y CD3 en el formato 2+1 tal como se describe en el documento US20140242080, que comprende como CDR las CDR que se muestran en las SEQ ID NO: 270-276 y 290-296 del documento US20140242080 (véase también las CDR de SEQ ID NO: 4-10 y 24-30 del documento US20140242079); la presentación de Tabanero et.al. en la reunión anual de ASCO de 2017 (J Clin Oncol 35, 2017 (supl.; resumen 3002)) incluyó datos clínicos de fase 1 en pacientes con cáncer colorrectal avanzado/metastásico, con el anticuerpo biespecífico CEAxCD3 RO 6958688 (cibisatamab) en monoterapia y en combinación con el anticuerpo anti-PD-L1 atezolizumab. Se ha encontrado una enfermedad estable y respuestas parciales con cibisatamab en monoterapia, así como en combinación con el inhibidor de PD-L1 atezolizumab. Desde 2017 no se han publicado nuevos datos clínicos de Cibisatamb CEAxCD3. En marzo de 2019 se publicó un ensayo en el que se utilizaron 100 mg de cibisatamb una vez cada tres semanas (Q3W) más el inhibidor de PD-L1 atezolizumab y un tratamiento previo con el anticuerpo anti-CD20 que destruye las células B Obinutuzumab (para evitar la formación de anticuerpos antifármaco ADA tal como se notificó para cibisatamab) (Identificador de ClinicalTrials gov. NCT038666339). Hasta la fecha no se han publicado datos. Recientemente se publicó un nuevo ensayo clínico con 100 mg de Cibisatamb más atezolizumab más RO712290 Q3W (abril de 2021, NCT04826003) en pacientes con cáncer colorrectal avanzado que muestran estabilidad microsatelital. La RO712290 es una proteína de fusión biespecífica que se une a la proteína activadora de fibroblastos (FAP) y al factor coestimulador de células T 4-1BB, provocando una activación adicional de las células T que da lugar a una mayor eficacia/eliminación de células tumorales si se combina con CEAxCD3, pero también a una mayor toxicidad, por ejemplo un aumento de la liberación de citocinas. El MEDI-565 (AMG211), otro anticuerpo CEAxCD3 biespecífico, un anticuerpo monocatenario, se encuentra en desarrollo clínico y se han publicado resultados de ensayos clínicos con ese anticuerpo (por ejemplo, inducción de enfermedad estable, véase, por ejemplo M. Pishvaian et al., Clin Colorectal Cáncer. D iciembre de 2016;15(4) 345-351).
Se ha informado de una mayor eficacia cuando el anticuerpo biespecífico CEAxCD3 se combinó con un anticuerpo inhibidor de PD-L1. Estos datos muestran que se puede lograr eficacia con un anticuerpo biespecífico CEAxCD3 en tumores sólidos avanzados. Pero, en general, en monoterapia y también en combinación con un inhibidor de PD-L1, la mayor parte de los pacientes en el estudio clínico todavía se encontraban en progreso y los que respondieron mostraron, en el mejor de los casos, respuestas parciales y enfermedad estable, pero no se lograron respuestas completas.
Un enfoque para obtener una mayor eficacia con un anticuerpo biespecífico de células T tal como cibisatamb CEAxCD3 es la combinación con un segundo medicamento que provoca una activación adicional de las células T por medio de un efecto agonista sobre los receptores coestimuladores de células T tales como 4-1BB o CD28 y otros. Un efecto secundario bien conocido de los anticuerpos biespecíficos de células T es la inducción de un síndrome de liberación de citocinas (CRS) que puede ser de mayor grado, por ejemplo de grado 3 o incluso de grado 5 (muerte). La adición de anticuerpos biespecíficos dirigidos a los receptores coestimuladores de células T a anticuerpos biespecíficos de células T puede provocar un aumento considerable de la liberación de citocinas y, por lo tanto, un riesgo más elevado de padecer un CRS de mayor grado.
Otro enfoque para obtener mejores resultados podría ser, por ejemplo, añadir a los anticuerpos biespecíficos de células T no solo un inhibidor del eje del punto de control PD-1, sino también añadir más inhibidores o agonistas del punto de control. Pero hasta la fecha no hay datos clínicos prometedores disponibles para este enfoque de combinación en cáncer sólido avanzado tal como el cáncer colorrectal, etc. La disponibilidad limitada de células T dentro de los tumores sólidos avanzados es sin duda un mecanismo importante que limita la eficacia que se puede lograr con anticuerpos biespecíficos de células T más inhibidores del eje PD-1 y/u otros inhibidores de puntos de control o más agonistas biespecíficos en los receptores coestimuladores de células T.
Los anticuerpos biespecíficos de células T TAAxCD3 (TAA = antígeno asociado a tumores tal como CEA y muchos otros) son muy eficaces en pacientes con neoplasias malignas hematológicas tales como mieloma múltiple, neoplasias malignas de células B tales como, por ejemplo, linfoma difuso de células B grandes, linfoma folicular, etc. Los resultados clínicos con Cibisatamb CEAxCD3 muestran que existe eficacia de TAAxCD3 también en tumores sólidos avanzados (véase el texto anterior), pero mucho menor que la lograda en neoplasias malignas hematológicas. La adición de inhibidores del eje PD-1 puede aumentar la eficacia, pero en todo caso esta es limitada. La adición de un anticuerpo biespecífico o una proteína de fusión agonista en un receptor coestimulador de células T tal como CD28 o 4-1BB aumenta la eficacia en pruebas preclínicas, pero también la toxicidad, produciéndose, por ejemplo, un aumento de la liberación de citocinas. En lugar de intentar una activación adicional de las células T, podría tener más éxito añadir un agente terapéutico que redireccione las células tumorales otras células inmunitarias, especialmente macrófagos. La presente invención trata de anticuerpos biespecíficos CEAxCD47 que redireccionan y activan macrófagos contra tumores sólidos que expresan CEACAM5 en 1. monoterapia y/o 2. como terapia de combinación, especialmente con anticuerpos biespecíficos de células T CEAxCD3 para aumentar el efecto de destrucción de células tumorales de los anticuerpos biespecíficos CEAxCD3 y para evitar, a diferencia de la combinación con agonistas biespecíficos en los receptores coestimuladores de células T, un mayor riesgo de CRS.
En el documento WO2019234576 se describen anticuerpos biespecíficos contra CEACAM5 y CD47. Un ejemplo de anticuerpo biespecífico descrito en el documento WO2019234576 es K2AC22 (la SEQ ID NO: 65 del documento WO2019234576 muestra la cadena ligera de la parte de unión a CEACAM5 de K2AC22, la SEQ ID NO: 6 del documento WO2019234576 muestra la cadena pesada común de K2AC22 y la SEQ ID NO: 10 muestra la cadena ligera de la parte de unión a CD47 de K2AC22). Sin embargo, todavía existe la necesidad de anticuerpos biespecíficos mejorados contra CEACAM5 y CD47, por ejemplo anticuerpos mejorados que combinen alta eficacia con baja toxicidad, baja inmunogenicidad y propiedades farmacocinéticas favorables. Por lo tanto, un objeto de la presente invención es proporcionar nuevos anticuerpos biespecíficos contra CEACAM5 y CD47 que sean ventajosos con respecto a los anticuerpos biespecíficos contra CEACAM5 y CD47 de la técnica anterior. El documento WO2018098384 se refiere a un anticuerpo Fab CEACAM5xCD47 biespecífico sin función efectora. El documento WO2018057955. El documento WO2018057955 se refiere a un anticuerpo biespecífico mesotelina x CD47. El documento WO2019016411 se refiere a mezclas de anticuerpos multiespecíficos.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN
La presente invención proporciona nuevos anticuerpos biespecíficos con una primera parte de unión capaz de unirse a CEACAM5 humano y una segunda parte de unión capaz de unirse a CD47 humano. Los anticuerpos biespecíficos según la invención inducen una alta actividad fagocítica contra células tumorales, tanto contra células tumorales que expresan CEACAM5 en cantidades elevadas como contra células tumorales que expresan CEACAM5 en cantidades reducidas. En una forma de realización, los anticuerpos biespecíficos inducen sus efectos sobre células antitumorales principalmente mediante fagocitosis optimizada/fagocitosis celular dependiente de anticuerpos (ADCP) debido a la implicación de células inmunitarias, especialmente macrófagos. En una forma de realización, los anticuerpos biespecíficos según la invención muestran una relación disminuida de afinidad de unión a CEACAM3 con respecto a CEACAM5, respectivamente una relación aumentada de KD con respecto al anticuerpo K2AC22 de CEACAM5-CD47. En una forma de realización, los anticuerpos biespecíficos según la invención inhiben la unión de SIRPa a CD47 expresado en células tumorales y aumentan la fagocitosis de las células tumorales. Los anticuerpos biespecíficos divulgados que se unen específicamente a CEACAM5 humano y CD47 humano también son adecuados para su uso en el tratamiento de tumores, especialmente en el tratamiento de tumores sólidos.
En un aspecto, la presente invención proporciona un anticuerpo biespecífico (denominado en adelante también "anticuerpo biespecífico CEAxCD47", o un "anticuerpo biespecífico según la invención") que comprende una primera parte de unión que se une específicamente a CEACAM5 humano (denominado también "CEA") y una segunda parte de unión que se une específicamente a CD47 humano (denominada también "CD47") caracterizado por que:
a) la primera parte de unión comprende como región variable de cadena pesada una región variable de cadena pesada que comprende una C<d>R<h>1 de SEQ ID NO: 1, una CDRH2 de SEQ ID NO: 2 y una CDRH3 de SEQ ID NO: 3,
b) la primera parte de unión comprende como región variable de cadena ligera una región variable de cadena ligera que comprende un conjunto de CDRL seleccionado del grupo que consiste en CDRL1 de SEQ ID NO: 17, CDRL2 de SEQ ID NO: 18 y CDRL3 de SEQ ID NO: 19, o una CDRL1 de SEQ ID NO: 23, una CDRL2 de SEQ ID NO: 24 y una CDRL3 de SEQ ID NO: 25, y
c) la segunda parte de unión comprende como región variable de cadena pesada una región variable de cadena pesada que comprende una CDRH1 de SEQ ID NO: 1, una CDRH2 de s Eq ID NO: 2 y una CDRH3 de SEQ ID NO: 3,
y como región variable de cadena ligera una región variable de cadena ligera que comprende una CDRL1 de SEQ ID NO: 7, una CDRL2 de SEQ ID NO: 8 y una CDRL3 de SEQ ID NO: 9.
La invención comprende formas de realización adicionales de este aspecto:
Un ejemplo para entender la invención es un anticuerpo biespecífico, que comprende una primera parte de unión que se une específicamente a CEACAM5 humano y una segunda parte de unión que se une específicamente a CD47 humano caracterizado por que
a) la primera y la segunda partes de unión comprenden cada una como región variable de cadena pesada una región variable de cadena pesada que comprende una CDRH1 de SEQ ID NO: 1, una CDRH2 de s Eq ID NO: 2 y una CDRH3 de SEQ ID NO: 3,
b) la primera parte de unión comprende como región variable de cadena ligera una región variable de cadena ligera que comprende una CDRL1 de SEQ ID NO: 14, una CDRL2 de SEQ ID NO: 15 y una CDRL3 de SEQ ID NO: 16, y
c) la segunda parte de unión comprende como región variable de cadena ligera una región variable de cadena ligera que comprende una CDRL1 de SEQ ID NO: 7, una CDRL2 de SEQ ID NO: 8 y una CDRL3 de SEQ ID NO: 9.
En una forma de realización, la invención se refiere a un anticuerpo biespecífico, que comprende una primera parte de unión que se une específicamente a CEACAM5 humano y una segunda parte de unión que se une específicamente a CD47 humano caracterizado por que
a) la primera y la segunda partes de unión comprenden como región variable de cadena pesada una región variable de cadena pesada que comprende una CDRH1 de SEQ ID NO: 1, una CDRH2 de SEQ ID NO: 2 y una CDRH3 de SEQ ID NO: 3,
b) la primera parte de unión comprende como región variable de cadena ligera una región variable de cadena ligera que comprende una CDRL1 de SEQ ID NO: 17, una CDRL2 de SEQ ID NO: 18 y una CDRL3 de SEQ ID NO: 19, y
c) la segunda parte de unión comprende como región variable de cadena ligera una región variable de cadena ligera que comprende una CDRL1 de SEQ ID NO: 7, una CDRL2 de SEQ ID NO: 8 y una CDRL3 de SEQ ID NO: 9.
Un ejemplo para entender la invención es un anticuerpo biespecífico, que comprende una primera parte de unión que se une específicamente a CEACAM5 humano y una segunda parte de unión que se une específicamente a CD47 humano caracterizado por que
a) la primera y la segunda partes de unión comprenden como región variable de cadena pesada una región variable de cadena pesada que comprende una CDRH1 de SEQ ID NO: 1, una CDRH2 de SEQ ID NO: 2 y una CDRH3 de SEQ ID NO: 3,
b) la primera parte de unión comprende como región variable de cadena ligera una región variable de cadena ligera que comprende una CDRL1 de SEQ ID NO: 20, una CDRL2 de SEQ ID NO: 21 y una CDRL3 de SEQ ID NO: 22.
c) la segunda parte de unión comprende como región variable de cadena ligera una región variable de cadena ligera que comprende una CDRL1 de SEQ ID NO: 7, una CDRL2 de SEQ ID NO: 8 y una CDRL3 de SEQ ID NO: 9.
En una forma de realización, la invención se refiere a un anticuerpo biespecífico, que comprende una primera parte de unión que se une específicamente a CEACAM5 humano y una segunda parte de unión que se une específicamente a CD47 humano caracterizado por que
a) la primera y la segunda partes de unión comprenden como región variable de cadena pesada una región variable de cadena pesada que comprende una CDRH1 de SEQ ID NO: 1, una CDRH2 de SEQ ID NO: 2 y una CDRH3 de SEQ ID NO: 3,
b) la primera parte de unión comprende como región variable de cadena ligera una región variable de cadena ligera que comprende una CDRL1 de SEQ ID NO: 23, una CDRL2 de SEQ ID NO: 24 y una CDRL3 de SEQ ID NO: 25.
c) la segunda parte de unión comprende como región variable de cadena ligera una región variable de cadena ligera que comprende una CDRL1 de SEQ ID NO: 7, una CDRL2 de SEQ ID NO: 8 y una CDRL3 de SEQ ID NO: 9.
Un ejemplo para entender la invención es un anticuerpo biespecífico, que comprende una primera parte de unión que se une específicamente a CEACAM5 humano y una segunda parte de unión que se une específicamente a CD47 humano caracterizado por que
a) la primera y la segunda partes de unión comprenden como región variable de cadena pesada una región variable de cadena pesada que comprende una CDRH1 de SEQ ID NO: 1, una CDRH2 de SEQ ID NO: 2 y una CDRH3 de SEQ ID NO: 3,
b) la primera parte de unión comprende como región variable de cadena ligera una región variable de cadena ligera que comprende una CDRL1 de SEQ ID NO: 26, una CDRL2 de SEQ ID NO: 27 y una CDRL3 de SEQ ID NO: 28.
c) la segunda parte de unión comprende como región variable de cadena ligera una región variable de cadena ligera que comprende una CDRL1 de SEQ ID NO: 7, una CDRL2 de SEQ ID NO: 8 y una CDRL3 de SEQ ID NO: 9.
En una forma de realización, la invención se refiere a un anticuerpo biespecífico según la invención, caracterizado por que comprende en la primera parte de unión como región variable de cadena pesada una región variable de cadena pesada de SEQ ID NON y como región variable de cadena ligera una región variable de cadena ligera seleccionada del grupo que consiste en<s>E<q>ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35 y SEQ ID NO: 36 y por que comprende en la segunda parte de unión como región variable de cadena pesada una región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 4 y como región variable de cadena ligera una región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 10.
En una forma de realización, la invención se refiere a un anticuerpo biespecífico según la invención, caracterizado por que comprende en la primera parte de unión como región variable de cadena pesada una región variable de cadena pesada de SEQ ID NON y como región variable de cadena ligera una región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 32 y por que comprende en la segunda parte de unión como región variable de cadena pesada una región variable de cadena de SEQ ID<n>O<n>y como región variable de cadena ligera una región variable de cadena ligera que tiene la SEQ ID NO: 10.
En una forma de realización, la invención se refiere a un anticuerpo biespecífico según la invención, caracterizado por que comprende en la primera parte de unión como región variable de cadena pesada una región variable de cadena pesada de SEQ ID NON y como región variable de cadena ligera una región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 33 y por que comprende en la segunda parte de unión como región variable de cadena pesada una región variable de cadena de SEQ ID n On y como región variable de cadena ligera una región variable de cadena ligera que tiene la SEQ ID NO: 10.
En una forma de realización, la invención se refiere a un anticuerpo biespecífico según la invención, caracterizado por que comprende en la primera parte de unión como región variable de cadena pesada una región variable de cadena pesada de SEQ ID NON y como región variable de cadena ligera una región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 34 y por que comprende en la segunda parte de unión como región variable de cadena pesada una región variable de cadena de SEQ ID<n>O<n>y como región variable de cadena ligera una región variable de cadena ligera que tiene la SEQ ID NO: 10.
En una forma de realización, la invención se refiere a un anticuerpo biespecífico según la invención, caracterizado por que comprende en la primera parte de unión como región variable de cadena pesada una región variable de cadena pesada de SEQ ID NON y como región variable de cadena ligera una región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 35 y por que comprende en la segunda parte de unión como región variable de cadena pesada una región variable de cadena de SEQ ID n On y como región variable de cadena ligera una región variable de cadena ligera que tiene la SEQ ID NO: 10.
En una forma de realización, la invención se refiere a un anticuerpo biespecífico según la invención, caracterizado por que comprende en la primera parte de unión como región variable de cadena pesada una región variable de cadena pesada de SEQ ID NON y como región variable de cadena ligera una región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 36 y por que comprende en la segunda parte de unión como región variable de cadena pesada una región variable de cadena de SEQ ID NON y como región variable de cadena ligera una región variable de cadena ligera que tiene la SEQ ID NO: 10.
En una forma de realización, la invención se refiere a un anticuerpo biespecífico según la invención, caracterizado por que comprende en la primera parte de unión una cadena pesada de SEQ ID NO: 5 y una cadena ligera seleccionada del grupo que consiste en SEQ<i>D NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40 y SEQ ID NO: 41 y por que comprende en la segunda parte de unión una cadena pesada de SEQ ID NO: 5 y una cadena ligera que tiene la SEQ ID NO: 11.
En una forma de realización, la invención se refiere a un anticuerpo biespecífico según la invención, caracterizado por que comprende en la primera parte de unión una cadena pesada de SEQ ID NO: 5 y una cadena ligera de SEQ ID NO: 37 y por que comprende en la segunda parte de unión una cadena pesada de SEQ ID NO: 5 y una cadena ligera que tiene la SEQ ID NO: 11.
En una forma de realización, la invención se refiere a un anticuerpo biespecífico según la invención, caracterizado por que comprende en la primera parte de unión una cadena pesada de SEQ ID NO: 5 y una cadena ligera de SEQ ID NO: 38 y por que comprende en la segunda parte de unión una cadena pesada de SEQ ID NO: 5 y una cadena ligera que tiene la SEQ ID NO: 11.
En una forma de realización, la invención se refiere a un anticuerpo biespecífico según la invención, caracterizado por que comprende en la primera parte de unión una cadena pesada de SEQ ID NO: 5 y una cadena ligera de SEQ ID NO: 39 y por que comprende en la segunda parte de unión una cadena pesada de SEQ ID NO: 5 y una cadena ligera que tiene la SEQ ID NO: 11.
En una forma de realización, la invención se refiere a un anticuerpo biespecífico según la invención, caracterizado por que comprende en la primera parte de unión una cadena pesada de SEQ ID NO: 5 y una cadena ligera de SEQ ID NO: 40 y por que comprende en la segunda parte de unión una cadena pesada de SEQ ID NO: 5 y una cadena ligera que tiene la SEQ ID NO: 11.
En una forma de realización, la invención se refiere a un anticuerpo biespecífico según la invención, caracterizado por que comprende en la primera parte de unión una cadena pesada de SEQ ID NO: 5 y una cadena ligera de SEQ ID NO: 41 y por que comprende en la segunda parte de unión una cadena pesada de SEQ ID NO: 5 y una cadena ligera que tiene la SEQ ID NO: 11.
En una forma de realización, la invención se refiere a un anticuerpo biespecífico que comprende partes de unión a CEACAM5 que son las mismas que las del anticuerpo biespecífico K2AC82, K2AC84, K2AC91, K2AC100 o K2AC117. En dicha forma de realización, el anticuerpo biespecífico comprende:
• las CDR de cadena ligera de SEQ ID NO: 14-16, VL de SEQ ID NO: 32 y/o VLCL de SEQ ID NO: 37 (K2AC82),
• las CDR de SEQ ID NO: 17-19, VL de SEQ ID NO: 33 y/o VLCL de SEQ ID NO: 38 (K2AC84),
• las CDR de SEQ ID NO: 20-22, VL de SEQ ID NO: 34 y/o VLCL de SEQ ID NO: 39 (K2AC91),
• las CDR de SEQ ID NO: 23-25, VL de SEQ ID NO: 35 y/o VLCL de SEQ ID NO: 40 (K2AC100),
• las CDR de SEQ ID NO: 26-28, VL de SEQ ID NO: 36 y/o VLCL de SEQ ID NO: 41 (K2AC117), o
• derivados que comprenden las regiones CDR y/o las cadenas ligera y pesada de dichos anticuerpos tal como se han descrito anteriormente.
En una forma de realización, las secuencias de la región estructural constante y variable son humanas.
En una forma de realización, el anticuerpo biespecífico según la invención se caracteriza por que cada una de la primera y la segunda partes de unión comprende una cadena pesada de inmunoglobulina y una cadena ligera de inmunoglobulina. En una forma de realización, el anticuerpo biespecífico según la invención es un anticuerpo de longitud completa. En una forma de realización, el anticuerpo biespecífico según la invención se caracteriza por que es de tipo IgG1 humano.
En una forma de realización, el anticuerpo biespecífico según la invención se caracteriza por que comprende una primera parte de unión específica para CEA, que comprende un dominio variable de cadena ligera lambda (VL) y un dominio constante de cadena ligera lambda (CL) y una segunda parte de unión específica para CD47, que comprende un dominio variable de cadena ligera kappa (VK) y un dominio constante de cadena ligera kappa (CK) (anticuerpo biespecífico<k>A, cuerpo<k>A). En una de dichas formas de realización, la segunda parte de unión comprende como cadena ligera LC (CD47 VKCK) la cadena ligera de SEQ ID NO: 11. La cadena ligera kappa de SEQ ID NO: 11 comprende como dominio variable de cadena ligera el dominio variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 10 (mAb CD47 VK) y como dominio constante de cadena ligera el dominio constante de cadena ligera de SEQ ID NO: 13 (CD47 CK).
En una forma de realización, el anticuerpo biespecífico según la invención tiene un formato de IgG biespecífico completamente humano (especialmente IgGl) y además un anticuerpo biespecífico<k>A.
En una forma de realización, el anticuerpo biespecífico según la invención se caracteriza por que es un anticuerpo biespecífico<k>A y por que comprende una cadena pesada común (cHC). En una forma de realización, la cadena pesada común comprende como dominio variable de cadena pesada VH un dominio variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 4. En una forma de realización, el anticuerpo biespecífico según la invención se caracteriza por que comprende una cadena pesada común VH-CH1 de SEQ ID NO: 5. En una forma de realización, el anticuerpo biespecífico según la invención se caracteriza por que comprende una cadena pesada común (VH-CH1-CH2-CH3) de SEQ ID NO: 6.
En una forma de realización, el anticuerpo biespecífico según la invención se caracteriza por que es monovalente para la primera parte de unión y monovalente para la segunda parte de unión.
En una forma de realización, el anticuerpo biespecífico según la invención se caracteriza por que compite por la unión a CEACAM5 con el anticuerpo anti-CEACAM5 SM3E, que comprende como dominios VK y VH los VK y VH de secuencias SEQ ID NO: 43 y 44. En una forma de realización, el anticuerpo biespecífico según la invención se caracteriza por que no compite por la unión a CEACAM5 con cibisatamab y/o con MEDI-565 (AMG211; (MD Oberst et al., mAbs 6 (2014) 1571 1584)). En una forma de realización, los anticuerpos biespecíficos CEAxCD47 según la invención se pueden administrar en paralelo con los anticuerpos biespecíficos CEAxCD3 cibisatamab y/o MEDI-565.
En otra forma de realización, el anticuerpo biespecífico según la invención se caracteriza por que se ha modificado mediante glicoingeniería para que tenga una región Fc con oligosacáridos modificados. En otra forma de realización, el anticuerpo biespecífico según la invención se caracteriza por que comprende una región Fc que se ha modificado mediante glucoingeniería para que tenga un número reducido de residuos de fucosa en comparación con el mismo anticuerpo biespecífico que no se ha modificado mediante glicoingeniería.
En una forma de realización, el anticuerpo biespecífico según la invención comprende una cantidad reducida de fucosa en la(s) cadena(s) de oligosacárido.
En una forma de realización, el anticuerpo biespecífico según la invención se caracteriza por que del 50% al 100% de los oligosacáridos unidos a N en la región Fc no están fucosilados.
En una forma de realización, el anticuerpo biespecífico según la invención se caracteriza porque la cantidad de fucosa en la(s) cadena(s) de oligosacárido del anticuerpo biespecífico según la invención se reduce entre el 80% y el 100% en comparación con el contenido de fucosa del anticuerpo respectivo si no se aplica ningún procedimiento de afucosilación.
En una forma de realización, el anticuerpo biespecífico se caracteriza por que del 80% al 100% de los oligosacáridos unidos a N en la región Fc están bisecados y no fucosilados. En los documentos WO2019234576, US 62/943,726 y EP19213002 se se describen anticuerpos biespecíficos afucosilados que se unen a CEACAM5 y CD47 en general y su producción y purificación.
En una forma de realización, el anticuerpo biespecífico según la invención se caracteriza por que comprende una, dos o tres sustituciones de aminoácidos en la región Fc seleccionadas del grupo que consiste en monosustituciones S239D, I332E, G236A, o bisustituciones I332E y G236A, S239D e I332E, S239D y G236A, y la sustitución triple S329D e I332E y G236A; y una región Fc que se ha modificado mediante glicoingeniería para que tenga un número reducido de residuos de fucosa en comparación con el mismo anticuerpo biespecífico pero sin modificar mediante glucoingeniería.
En una forma de realización, los anticuerpos biespecíficos según la invención se caracterizan por una relación de los valores de KD para la unión a CEACAM3 recombinante y CEACAM5 recombinante de un factor de 100 o superior (Ejemplo 3, tabla 2).
En una forma de realización, los anticuerpos biespecíficos según la invención se caracterizan por una relación de los valores de KD para la unión a CEACAM3 recombinante y CEACAM5 recombinante de un factor de entre 100 y 200.
En una forma de realización, los anticuerpos biespecíficos de la presente invención tienen un desacoplamiento relativo de unión a CEACAM5 y CEACAM3 (unión discriminativa). A pesar de una mayor unión, en comparación con el anticuerpo biespecífico CEAxCD47 K2AC22, a la proteína CEACAM5 humana recombinante de longitud completa, la unión a CEACAM3 humana recombinante de longitud completa no aumenta de forma proporcional. El cociente/la relación de KD para la unión a CEACAM3 de longitud completa frente a CEACAM5 muestra un aumento de 83 (K2AC22) a 137 (K2AC84) a 146 (K2AC100). Esto equivale a un aumento del 65% al 76% en la unión discriminativa (Ejemplo 3, tabla 2).
En una forma de realización, los anticuerpos biespecíficos según la invención se caracterizan por una fagocitosis dependiente de la concentración (ADCP de líneas celulares tumorales que expresan CEACAM5 por macrófagos humanos). La ADCP se mide según la invención como índice de fagocitosis (CE50 y/o máximo) mediante obtención de imágenes, normalmente con una relación E:T de 1:3 (macrófagos humanos:células diana (células tumorales); véanse, por ejemplo, la figura 2 y las tablas 6 a 9 para valores de CE50 y para índice máximo de fagocitosis Emáx). Los resultados de la figura 2 se han obtenido con una E:T de 1:3. Los detalles del ensayo se describen en el Ejemplo 7; ensayo de obtención de imágenes basado en CellInsight CX5. A menos que se indique lo contrario, los valores del índice de fagocitosis se miden mediante dicho procedimiento de obtención de imágenes.
En una forma de realización, los anticuerpos biespecíficos según la invención se caracterizan por un aumento de al menos el 8% en el máximo del índice de fagocitosis (Emáx) de células tumorales LoVo en comparación con el índice de fagocitosis de K2AC22. En una forma de realización, el aumento se encuentra entre el 8% y el 20% para células tumorales LoVo en comparación con el índice de fagocitosis de K2AC22. En una forma de realización, el anticuerpo biespecífico según la invención se caracteriza por un aumento de al menos el 8% en el máximo del índice de fagocitosis de células tumorales Ls174T en comparación con el índice de fagocitosis de K2AC22. En una forma de realización, el aumento se encuentra entre el 8% y el 25% para células tumorales Ls174T en comparación con el índice de fagocitosis de K2AC22. (Ejemplo 7, tabla 5). LoVo y LS174T son células tumorales con una expresión bastante reducida de CEACAM5 (véase la tabla 3 en el Ejemplo 5).
En una forma de realización, los anticuerpos biespecíficos según la invención inhiben la interacción entre CD47 humano y SIRPa humano. En una forma de realización, los anticuerpos biespecíficos según la invención inhiben la interacción entre CD47 y SIRPa en células MKN-45 con una CI50 que es inferior en un factor de 10 o superior a la CI50 medida para K2AC22 en las mismas condiciones experimentales. En una forma de realización, dicho factor se encuentra entre 10 y 30. En una forma de realización, los anticuerpos biespecíficos según la invención inhiben la interacción entre CD47 y SIRPa en células MKN-45 con una CI50 de 0,1 nM o inferior. En una forma de realización, los anticuerpos biespecíficos según la invención inhiben la interacción entre CD47 y SIRPa en células MKN-45 con una CI50 de 0,1 nM a 0,04 nM (véanse el Ejemplo 10 y la tabla 12).
En una forma de realización, los anticuerpos biespecíficos según la invención se caracterizan por que poseen dos o más de las siguientes propiedades: tener una relación de los valores de KD para la unión a CEACAM3 recombinante y CEACAM5 recombinante de un factor de 100 o superior, tener un desacoplamiento relativo de unión a CEACAM5 y CEACAM3, tener una ADCP dependiente de la concentración, tener al menos un aumento del 8% en el máximo del índice de fagocitosis (Emáx) de células tumorales LoVo en comparación con el índice de fagocitosis de K2AC22, y tener la capacidad de inhibir la interacción entre CD47 humano y SIRPa humano a una CI50 más de 10 veces inferior en comparación con K2AC22.
El anticuerpo biespecífico K2AC22 es un anticuerpo biespecífico que se une a CEACAM5 humano y CD47 humano y se describe en el documento WO2019234576. El K2AC22 comprende una cadena pesada común de SEQ ID NO: 6, en la parte de unión a CEACAM5 la cadena ligera de SEQ ID NO: 42, y en la parte de unión a CD47 la cadena ligera de SEQ ID NO: 11; las CDR de K2AC22 se muestran en las SEQ ID NO: 1-3, 7-9 y 29-31 (tabla 1).
En una forma de realización, el anticuerpo biespecífico según la invención se caracteriza por que se une a CD47 humano recombinante con una afinidad de unión (KD) de 100 nM a 600 nM, y en una forma de realización con una afinidad de unión de 100 nM a 500 nM (medida por interferometría de biocapa).
En una forma de realización, el anticuerpo biespecífico según la invención se caracteriza por que se une a CEACAM5 humano recombinante con una KD de entre 2 nM y 10 nM (Ejemplo 3, tabla 2). En una forma de realización, los anticuerpos biespecíficos de la invención tienen una afinidad de unión de 10 a 50 veces superior (KD más baja), y en una forma de realización de 20 a 50 veces, en comparación con el anticuerpo biespecífico K2AC22 del estado de la técnica (Ejemplo 3, tabla 2).
En una forma de realización, los anticuerpos biespecíficos según la invención son útiles para el tratamiento de combinación con anticuerpos biespecíficos de células T CEAxCD3 tales como cibisatamab.
En una forma de realización, el anticuerpo biespecífico según la invención se caracteriza por que se une específicamente a CEACAM5 pero no compite con TCB2014 y cibisatamab por unirse a CEACAM5 en células tumorales, por ejemplo MKN-45 y LS174T (Ejemplo 8).
En una forma de realización, el anticuerpo biespecífico según la invención se caracteriza por que el anticuerpo biespecífico TCB2014, que se une a CEACAM5 y CD3<s>humanos (anteriormente), en una concentración de 300 nM, no desplaza la CE50 de la curva de unión del anticuerpo biespecífico según la invención a células MKN-45 o en otra forma de realización a células LS174T en más de un factor de 3, en una forma de realización hacia concentraciones más altas (Ejemplo 8 y figura 5). En tal caso, el anticuerpo biespecífico según la invención y TCB2014 se definen como "no competitivos" y se consideran capaces de unirse simultáneamente a CEA sin interferir significativamente en la unión a dicho CEA. En tal caso, el anticuerpo biespecífico según la invención y TCB2014 se definen como "no competitivos" y se consideran capaces de unirse simultáneamente a CEA sin interferir significativamente en su unión a dicho CEA y, por lo tanto, pueden desarrollar su efecto sobre la fagocitosis (CEAxCD47) sin alteraciones y también su efecto sobre la activación de las células T (TCB2014 y cibisatamab) sin alteraciones, incluso cuando hay simultáneamente presencia de niveles terapéuticos de ambos fármacos en la sangre y/o el tejido tumoral. Esto facilita el tratamiento de combinación de TCB2014 o cibisatamab con anticuerpos biespecíficos CEAxCD47 de la invención.
En una forma de realización, los anticuerpos biespecíficos CEAxCD47 de la invención combinados con el anticuerpo biespecífico CEAxCD3 TCB2014 muestran un % de destrucción al menos aditivo o incluso sinérgico de células tumorales en un ensayo que contiene, por ejemplo, células tumorales LoVo o LS174T y células T y macrófagos humanos derivados del mismo donante humano voluntario.
En una forma de realización, los anticuerpos biespecíficos CEAxCD47 de la invención combinados con el anticuerpo biespecífico CEAxCD3 TCB2014 muestran una destrucción al menos aditiva o incluso sinérgica de células tumorales en un ensayo que contiene, por ejemplo, células tumorales LoVo o LS174T y células T y macrófagos humanos derivados del mismo donante humano voluntario.
La presente invención proporciona además un vector de expresión que comprende uno o más polinucleótidos que codifican un anticuerpo biespecífico según la invención.
La presente invención proporciona además una célula huésped que comprende el vector de expresión según la invención.
La presente invención proporciona además un procedimiento para la producción de un anticuerpo biespecífico según la invención, caracterizado por que comprende:
a) cultivar una célula huésped que comprende un vector de expresión que codifica dicho anticuerpo biespecífico en condiciones que permitan la producción de dicho anticuerpo de la invención, y
b) aislar dicho anticuerpo, en el que dicho anticuerpo es capaz de unirse específicamente a CEACAM5 y CD47.
El segundo polipéptido que codifica el anticuerpo de la invención puede ser un polipéptido que codifica las dos cadenas ligeras diferentes respectivas y la cadena pesada común o polipéptidos separados que codifican por separado las cadenas ligera y pesada respectivas. Además, el vector de expresión puede ser uno, dos o tres vectores que expresen las dos respectivas cadenas ligeras diferentes y la com
La presente invención proporciona además un anticuerpo según la invención para su uso en un procedimiento para inducir la lisis celular de una célula tumoral, que comprende poner en contacto la célula tumoral con dicho anticuerpo. La célula tumoral es una célula tumoral humana, preferentemente de un paciente. En una forma de realización, se induce la lisis celular de una célula tumoral, siendo la célula tumoral una célula de cáncer colorrectal, una célula de NSCLC (cáncer de pulmón de células no pequeñas), una célula de cáncer gástrico, una célula de cáncer de páncreas, una célula de cáncer de mama u otra célula tumoral que expresa CEACAM5. La presente invención proporciona además un anticuerpo según la invención para su uso
en un procedimiento para tratar a un sujeto que tiene un cáncer que expresa CEACAM5, comprendiendo el procedimiento administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de dicho anticuerpo.
La presente invención proporciona además un anticuerpo según la invención para su uso en un procedimiento para aumentar el tiempo de supervivencia en un sujeto que tiene un cáncer que expresa CEACAM5, comprendiendo dicho procedimiento administrar a dicho sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de dicho anticuerpo. En una forma de realización adicional de la invención, en dicho procedimiento el cáncer es cáncer colorrectal, cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC), cáncer gástrico, cáncer de páncreas o de mama. La presente invención proporciona además un anticuerpo según la invención para
su uso en un procedimiento para tratar a un sujeto que tiene un cáncer que expresa CEACAM5, comprendiendo el procedimiento administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de dicho anticuerpo. En otra forma de realización de la invención, el anticuerpo biespecífico según la invención se administra en combinación con quimioterapia o radioterapia a un sujeto humano.
Cualquier referencia en la descripción a procedimientos de tratamiento o diagnósticoin vivose refiere a los compuestos, las composiciones farmacéuticas y los medicamentos de la presente invención para su uso en procedimientos de tratamiento del cuerpo humano o animal mediante terapia o para diagnósticoin vivo.
La presente invención proporciona además un anticuerpo biespecífico según la invención, para su uso en combinación simultánea, separada o secuencial con un segundo anticuerpo biespecífico que comprende una tercera parte de unión que se une específicamente a CEACAM5 humano y una cuarta parte de unión que se une específicamente a CD3s humano en el tratamiento de un sujeto que tiene un cáncer que expresa CEACAM5. Una forma de realización adicional de la invención es un anticuerpo biespecífico según la invención para su uso en combinación simultánea, separada o secuencial con TCB2014 o cibisatamab en el tratamiento de un sujeto que tiene un cáncer que expresa CEACAM5.
Una forma de realización adicional de la invención es un anticuerpo biespecífico según la invención, para su uso en combinación simultánea, separada o secuencial con dicho segundo anticuerpo biespecífico en el tratamiento de un sujeto que tiene un cáncer que expresa CEACAM5.
Una forma de realización adicional de la invención es un anticuerpo biespecífico según la invención, para su uso según la invención, caracterizado por que el anticuerpo biespecífico según la invención y el segundo anticuerpo biespecífico se administran a dicho sujeto de forma alterna en intervalos de 6 a 15 días.
Una forma de realización adicional de la invención es un anticuerpo biespecífico según la invención para su uso según la invención, caracterizado por que el anticuerpo biespecífico según la invención y el segundo anticuerpo biespecífico se administran a dicho sujeto simultáneamente en intervalos de 6 a 15 días.
Una forma de realización adicional de la invención es un primer anticuerpo biespecífico según la invención que comprende una primera parte de unión que se une específicamente a CEACAM5 humano y una segunda parte de unión que se une específicamente a CD47 humano según la invención para su uso según la invención, caracterizado por que dicho cáncer es cáncer colorrectal, cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC), cáncer gástrico, cáncer de páncreas y cáncer de mama.
También se divulga un anticuerpo según la invención para su uso en un procedimiento para el tratamiento de un paciente humano diagnosticado con un tumor (cáncer), especialmente un tumor sólido, especialmente un cáncer sólido que expresa CEACAM5, especialmente cáncer colorrectal, cáncer pulmón de células no pequeñas (NSCLC), cáncer gástrico, cáncer de páncreas y cáncer de mama, que comprende administrar una cantidad eficaz de un anticuerpo biespecífico según la invención y un segundo anticuerpo biespecífico tal como se ha descrito anteriormente, contra CEA y CD3 (en una forma de realización TCB2014, en una forma de realización cibisatamab), al paciente humano, comprendiendo el procedimiento administrar posteriormente al paciente una dosis de 0,1 a 10 mg/kg, en una forma de realización adicional de 0,5 a 10 mg/kg, en una forma de realización adicional de 1 a 2 mg/kg de dicho segundo anticuerpo anti CEAxCD3, por ejemplo semanalmente a lo largo de 4 a 12 semanas o q2w a lo largo de 4 a 12 semanas y administrar después de estas 4 a 12 semanas y después de esperar 2 o 3 o 4 semividas de eliminación adicionales de dicho anticuerpo anti CEAxCD3 al paciente una dosis de 0,1 a 20 mg/kg de un anticuerpo según la invención,
administrar al paciente dicho anticuerpo según la invención q1w, q2w, q3w u opcionalmente q4w, por ejemplo, cada 12 semanas, esperar 2 o 3 o 4 semividas de eliminación de dicho anticuerpo según la invención y después opcionalmente repetir dicho ciclo de administración del anticuerpo biespecífico CEA x CD3 seguido de la administración del anticuerpo biespecífico según la invención y opcionalmente repetir de nuevo ese ciclo, etc.
Como dicho anticuerpo biespecífico CEA x CD3 y el anticuerpo biespecífico CEA x CD47 según la invención no son competitivos, los dos anticuerpos biespecíficos también pueden administrarse de una forma ("forma simultánea") que el paciente experimente concentraciones plasmáticas y tisulares terapéuticamente eficaces de ambos anticuerpos biespecíficos en paralelo, por ejemplo mediante la administración al paciente aproximadamente al mismo tiempo una dosis de 0,1 a 10 mg/kg, en una forma de realización adicional de 0,5 a 10 mg/kg, en una forma de realización adicional de 1 a 2 mg/kg del anticuerpo biespecífico CEA x CD3 y una dosis de 3 a 30 mg/kg, en una forma de realización adicional de 1 a 10 mg/kg, del anticuerpo biespecífico CEA x CD47 según la invención, seguidas de una o más de estas administraciones combinadas con una frecuencia de q1w o q2w o q3w u opcionalmente q4w. El término "q1w" significa administración una vez por semana; q2w significa administración cada dos semanas, etc.
Por razones de seguridad, puede ser necesario en una forma de realización comenzar la terapia con dicho segundo anticuerpo CEAxCD3 sin añadir un anticuerpo biespecífico (bsAb) de la invención y comenzar la administración simultánea de los dos bsAb solo después de que haya concluido el síndrome de liberación de citoquinas (CRS) típico de un CEAxCD3 (generalmente después de 2 o 3 dosis de un anticuerpo TAAxCD3).
La presente invención proporciona además una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo según la invención y un excipiente o vehículo farmacéuticamente aceptable.
La presente invención proporciona además una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo según la invención para su uso como medicamento. En una de dichas formas de realización, la presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo según la invención para su uso como medicamento en el tratamiento de trastornos de tumores sólidos. En una forma de realización, la composición farmacéutica comprende un anticuerpo según la invención para su uso como medicamento en el tratamiento del cáncer colorrectal, NSCLC (cáncer de pulmón de células no pequeñas), cáncer gástrico, cáncer de páncreas o cáncer de mama.
La presente invención proporciona además una composición que comprende un anticuerpo biespecífico según la invención para su uso en combinación simultánea, separada o secuencial en el tratamiento de un sujeto que tiene un cáncer que expresa CEACAM5, con TCB2014 o cibisatamab tal como se han definido anteriormente, en el que dicho segundo anticuerpo biespecífico en una concentración de 300 nM no desplaza la CE50 de la curva de unión a células MKN-45 y/o LS174T del anticuerpo biespecífico según la invención en más de un factor de 3, en una forma de realización hacia concentraciones más altas. Una forma de realización adicional de la invención es una composición según la invención, caracterizada por que el cáncer es cáncer colorrectal, cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC), cáncer gástrico, cáncer de páncreas o cáncer de mama.
La presente invención proporciona además un anticuerpo según la invención para su uso en la fabricación de un medicamento en el tratamiento de trastornos de tumores sólidos. Una forma de realización adicional de la invención es un anticuerpo según la invención para su uso en el tratamiento del cáncer colorrectal, NSCLC (cáncer de pulmón de células no pequeñas), cáncer gástrico, cáncer de páncreas o cáncer de mama. Otro aspecto de la invención proporciona un anticuerpo según la invención
para su uso en un procedimiento para inducir la lisis celular de una célula tumoral que comprende poner en contacto la célula tumoral con el anticuerpo biespecífico de cualquiera de las formas de realización descritas anteriormente. En algunas formas de realización, la célula tumoral es una célula de cáncer colorrectal, NSCLC (cáncer de pulmón de células no pequeñas), una célula de cáncer gástrico, una célula de cáncer de páncreas o una célula de cáncer de mama. En una forma de realización, la lisis celular se induce mediante fagocitosis celular dependiente de anticuerpos y/o citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos del anticuerpo biespecífico según la invención. Otro aspecto de la invención proporciona un anticuerpo según la invención
para su uso en un procedimiento de tratamiento de un sujeto que tiene un cáncer que expresa anormalmente CEACAM5, comprendiendo el procedimiento administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo biespecífico de cualquiera de las formas de realización descritas anteriormente.
Otro aspecto de la invención proporciona un procedimiento de tratamiento de un sujeto que tiene un cáncer que expresa anormalmente CEACAM5, comprendiendo el procedimiento administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo biespecífico de cualquiera de las formas de realización descritas anteriormente en combinación con un anticuerpo biespecífico que se une a CEA humano y CD3 humano. Como los anticuerpos biespecíficos CEAxCD3 y los anticuerpos biespecíficos CEAxCD47 según la invención no compiten o solo compiten mínimamente, pueden administrarse no solo de forma secuencial sino también en paralelo (simultáneamente), lo que puede ser una ventaja porque la destrucción de células tumorales mediante la implicación de células T por el anticuerpo biespecífico CEAxCD3 y al mismo tiempo mediante la implicación de macrófagos por el anticuerpo biespecífico CEAxCD47 según la invención puede ser aditiva o incluso sinérgica, lo que significa que la eficacia aumenta si ambos fármacos se administran en paralelo.
Otro aspecto de la invención proporciona un procedimiento para aumentar la supervivencia libre de progresión y/o el tiempo de supervivencia general en un sujeto que tiene un cáncer que expresa anormalmente CEACAM5, comprendiendo dicho procedimiento administrar a dicho sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo biespecífico de cualquiera de las formas de realización descritas anteriormente. En una forma de realización, el cáncer es cáncer colorrectal, cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC), cáncer gástrico, cáncer de páncreas o cáncer de mama u otro cáncer que exprese CEACAM5.
En determinadas formas de realización de estos procedimientos, el anticuerpo biespecífico según la invención se administra en combinación con quimioterapia o radioterapia. En una forma de realización, el sujeto es un paciente que padece cáncer colorrectal o cáncer de pulmón o cáncer gástrico o cáncer de páncreas o cáncer de mama u otro cáncer que exprese CEACAM5.
Otro aspecto de la invención proporciona un anticuerpo según la invención para su uso en un procedimiento para tratar a un sujeto que tiene un cáncer que expresa anormalmente CEACAM5, comprendiendo el procedimiento administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo biespecífico de cualquiera de las formas de realización descritas anteriormente en combinación con un anticuerpo biespecífico contra CEA humano y CD3epsilon humano.
Otro aspecto de la invención proporciona un anticuerpo según la invención para su uso en un procedimiento para aumentar el tiempo de supervivencia libre de progresión y/o el tiempo de supervivencia general en un sujeto que tiene un cáncer que expresa anormalmente CEACAM5, comprendiendo dicho procedimiento administrar a dicho sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo biespecífico de cualquiera de las formas de realización descritas anteriormente. En una forma de realización, el cáncer es cáncer colorrectal, cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC), cáncer gástrico, cáncer de páncreas o cáncer de mama.
En determinadas formas de realización de estos procedimientos, el anticuerpo biespecífico según la invención se administra en combinación con quimioterapia o radioterapia. En una forma de realización, el sujeto es un paciente con cáncer con cáncer colorrectal o cáncer de pulmón o cáncer gástrico o cáncer de páncreas o cáncer de mama u otro cáncer que expresa CEACAM5.
Otra forma de realización de la invención proporciona un anticuerpo según la invención para su uso en cualquiera de los procedimientos de tratamiento descritos anteriormente. En una forma de realización, el cáncer se selecciona del grupo que consiste en cáncer colorrectal, cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC), cáncer gástrico, cáncer de páncreas y cáncer de mama.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figuras 1A-1F.Unión dependiente de la concentración de cinco anticuerpos biespecíficos CD47xCEACAM5 según la invención (K2AC82, K2AC84, K2AC91, K2AC100 y K2AC117) en comparación con el anticuerpo biespecífico CEAxCD47 K2AC22 del estado de la técnica. Estas figuras también muestran la unión del correspondiente anticuerpo monovalente anti-CD47, de un control de hIgG irrelevante 1 (hIgG 1, línea bajo la línea para CD47 monovalente), y de un mAb anti-CD47 bivalente (hB6H12, línea de puntos) en seis líneas<celulares de cáncer que expresan CEACAM5: (Fig. 1A) células>SK-C<o>-1,<(Fig. 1B) células m>K<n>-45,<(Fig. 1C)>células HPAF-II, (Fig. 1D) células SNU-C1, (Fig. 1E) células Ls174T y (Fig. 1F) células LoVo. Las CE50 de los anticuerpos biespecíficos según la invención son inferiores a las CE50 de K2AC22, y la unión máxima (MFI) de los anticuerpos biespecíficos según la invención es superior a la unión máxima de K2AC22.
Figuras 2A-2F.Fagocitosis dependiente de la concentración de células cancerosas LoVo inducida por dos anticuerpos biespecíficos CEACAM5xCD47 según la invención (K2AC84 y K2AC100) en comparación con el anticuerpo biespecífico CEACAM5xCD47 K2AC22 del estado de la técnica. Estas figuras también muestran la fagocitosis inducida por el correspondiente anticuerpo monovalente anti-CD47 y un control de isotipo hIgG 1. Las figuras 2A-2F muestran los datos obtenidos con macrófagos derivados de PBMC (células mononucleares de sangre periférica) de seis donantes humanos diferentes ((Fig. 2A) donante 862; (Fig. 2B) donante 872; (Fig. 2C) donante 873; (Fig. 2D) donante 863; (Fig. 2E) donante 874 y (Fig. 2F) donante 866). En la mayor parte de los donantes, la fagocitosis inducida por los dos anticuerpos según la invención es superior a K2AC22.
Figuras 3A-3B.Fagocitosis dependiente de la concentración de células cancerosas que expresan CEACAM5 inducida por cuatro a cinco anticuerpos biespecíficos CEACAM5xCD47 afucosilados según la invención (K2AC82 afuco, K2AC84 afuco, K2AC91 afuco, K2AC100 afuco y K2AC177 afuco) en comparación con el anticuerpo biespecífico CEACAM5xCD47 afucosilado del estado de la técnica K2AC22. Estas figuras también muestran la fagocitosis inducida por el correspondiente anticuerpo monovalente anti-CD47 y un control de isotipo hIgG1 (hIgG1). La figura 3A muestra los datos obtenidos con MKN-45 como células diana y con macrófagos derivados de PBMC (células mononucleares de sangre periférica) de dos donantes humanos (donante (D) 830; donante (D) 831) y la figura 3B muestra los datos obtenidos con SNU-C1 como células diana y con macrófagos derivados de dos donantes humanos (donante (D) 831; donante (D) 833). En los donantes, la fagocitosis inducida por los anticuerpos según la invención es superior a K2AC22.
Figura 4.Actividad de bloqueo de CD47/SIRPa por cinco anticuerpos biespecíficos CEACAM5xCD47 según la invención (K2AC82, K2AC84, K2AC91, K2AC100 y K2AC177) en comparación con el anticuerpo biespecífico CEACAM5xCD47 K2AC22 del estado de la técnica. Esta figura también muestra la actividad de bloqueo de CD47/SIRPa por el correspondiente anticuerpo monovalente anti-CD47. Se añadieron dos controles negativos con fines comparativos, con la adición de un control de isotipo hIgG 1 (hIgG1) o sin ningún Ab. Se añadió el mAb bivalente hB6H12 como control positivo. Los cinco anticuerpos biespecíficos CEACAM5xCD47 según la invención (K2AC82, K2AC84, K2AC91, K2AC100 y K2AC177) mostraron una actividad de bloqueo mejorada en comparación con el anticuerpo biespecífico CEACAM5xCD47 K2AC22 del estado de la técnica.
Figura 5.Unión dependiente de la concentración del anticuerpo biespecífico K2AC100 CD47xCEACAM5 en presencia de mAb anti-CEACAM5, TCB2014 y TCB 2017, en la superficie celular de células que expresan CEACAM5, MKN-45. K2AC100 se marcó directamente con un fluorocromo para seguir su unión solo en células MKN-45 (línea oscura, círculos oscuros), en presencia de 300 nM de TCB2014 (línea oscura, triángulos oscuros) o 30 nM de TCB2017 (línea oscura, rombos negros). Se utilizaron controles negativos (Ctrl) (IgG1 en presencia de TCB2014 o TCB2017).
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
Los términos se utilizan en el presente documento tal como se utilizan generalmente en la técnica, a menos que se definan de otra forma en lo sucesivo.
Los anticuerpos según la invención tienen una o más propiedades beneficiosas entre las siguientes propiedades:
• relación de valores de KD para la unión a CEACAM3 frente a CEACAM5
• máximo de índice de fagocitosis (Emáx) en células tumorales con baja expresión de CEA, y/o
• inhibición (CI50 baja) de la unión de SIRPa a CD47 en la superficie de células tumorales.
Los anticuerpos según la invención muestran sorprendentemente una relación beneficiosa de unión a CEACAM3 frente a CEACAM5 tal como se muestra en el Ejemplo 3 y la tabla 2. Por ejemplo, K2AC100 muestra una afinidad de unión 25 veces superior (KD inferior) a CEACAM5 pero sorprendentemente solo una afinidad de unión 14 veces superior (KD inferior) a CEACAM3, en comparación con las afinidades de unión (KD) de K2AC22. De forma similar, K2AC84 muestra una afinidad de unión (KD) 46 veces superior a CEACAM5 pero sorprendentemente solo una afinidad de unión (KD) 28 veces superior a CEACAM3, en comparación con las afinidades de unión (KD) de K2AC22. Por lo tanto, la relación entre el valor de KD para la unión a CEACAM3 y el valor de KD para la unión a c Ea CAM5 es 83 para K2AC22, pero es 146 para K2AC100 y 137 para K2AC84.
Mientras que varios miembros de la familia tales como CEACAM5 o CEACAM6 se expresan mediante células epiteliales, otros miembros de la familia, tales como CEACAM3 (CGM1 o CD66d; UniProtKB - P40198), se expresan exclusivamente en granulocitos humanos, un tipo de célula, por ejemplo, involucrado en el aclaramiento de la infección bacteriana (Kuespert K et al., Curr Opin Cell Biol. 2006; Pils S et al., Int J Med Microbiol. 2008). A pesar de la alta homología de secuencia entre CEACAM5 y CEACAM3, CEACAM3 no favorece la adhesión célula-célula a diferencia de otros miembros de la familia CEACAM, sino que más bien media en el reconocimiento y la eliminación independiente de opsonina de un conjunto restringido de bacterias Gram-negativas, incluidas Neisseria gonorrhoeae, Hemophilus influenzae y Moraxella catarrhalis (Kuroki et al., J. Biol. Chem. 1991; Pils S et al., Int J Med Microbiol. 2008). CEACAM3 se presenta como receptor fagocítico del sistema inmunológico innato (Schmitter et al., J Exp Med. 2004). Según el conocimiento de los inventores, un anticuerpo biespecífico contra CEACAM5 y CD47, si se uniera considerablemente también a CEACAM3, tendría un efecto adverso sobre los granulocitos neutrófilos y podría disminuir el número de neutrófilos, es decir, inducir neutropenia mediante un aumento de la fagocitosis. Esto podría aumentar el riesgo de desarrollar infecciones bacterianas que, sin una intervención médica inmediata, pueden poner en peligro la vida. La afinidad de unión alta se caracteriza por una KD baja. La distribución de un anticuerpo biespecífico dirigido a CEA entre CEACAM 5 y CEACAM3 se determina mediante la relación de las afinidades de unión a estos dos miembros de la familia CEACAM. Una relación alta de la KD para la unión a CEACAM3 frente a la KD para la unión a CEACAM5 significa menos unión del anticuerpo biespecífico a CEACAM3 en comparación con la unión a CEACAM5, lo que sería beneficioso.
Los anticuerpos según la invención muestran sorprendentemente un valor máximo del índice de fagocitosis (Emáx) beneficioso, en una forma de realización en células tumorales con baja expresión de CEA (tal como la línea celular LoVo) en comparación con el índice de fagocitosis de K2AC22 en la línea celular respectiva. Según la tabla 5, los anticuerpos biespecíficos de la presente invención muestran un máximo del 8,5 al 17% superior de la curva del índice de fagocitosis de las células LoVo (4000 CEACAM5 en la superficie celular) en comparación con el anticuerpo biespecífico del estado de la técnica K2AC22. Para las células LS174T (26000 CEACAM5 en la superficie celular) el máximo del índice de fagocitosis es de entre el 8,7 y el 20,6% superior para los anticuerpos de la invención en comparación con K2AC22 (tabla 5). En células que expresan CEACAM5 de forma más elevada, tales como SNU-C1 o MKN-45, el aumento de Emáx es inferior.
Por lo tanto, un mayor porcentaje de pacientes podría tratarse con éxito con anticuerpos biespecíficos según la invención.
Tal como se divulga en los Ejemplos 5 y 11, la expresión de CEA en células malignas puede variar significativamente en términos de expresión de ARN o enumeración de moléculas de CEA de la superficie celular. Las líneas celulares de cáncer que expresan CEA utilizadas para estudiar la actividad de fagocitosis de los anticuerpos biespecíficos de la presente invención expresan en promedio 108.000 dianas de CEA en la superficie celular (Ejemplo 5, tabla 3). Se han investigado organoides derivados de tejido tumoral fresco de pacientes con cáncer (colorrectal y de pulmón) mediante los procedimientos descritos en el Ejemplo 11. Se ha descubierto que la expresión promedio de CEACAM5 de estos organoides primarios es de 28.000 dianas de CEACAM5 por célula, es decir, un factor de aproximadamente 4 inferior a la expresión promedio en las líneas celulares tal como se muestran en la tabla 3. Los anticuerpos biespecíficos mejorados para la fagocitosis de células malignas con una menor expresión de CEACAM5 podrían, por lo tanto, ser favorables para su uso en terapia tumoral. Dada la expresión heterogénea y/o bastante baja, por ejemplo en adenocarcinoma de pulmón, en cáncer colorrectal y otros tumores que expresan CEACAM5, dichos pacientes pueden, por lo tanto, tratarse con éxito con anticuerpos biespecíficos CEAxCD47 de la presente invención.
Los anticuerpos según la invención muestran sorprendentemente una inhibición beneficiosa (CI50 baja) de la unión de SIRPaaCD47 en la superficie de las células tumorales en comparación con el anticuerpo K2AC22, tal como se muestra en el Ejemplo 10 y la figura 4. La interacción de SIRPa en macrófagos con CD47 en las células tumorales inhibe la fagocitosis de las células tumorales, es decir, la inhibición eficaz de esta interacción aumenta la fagocitosis.
Tal como se utiliza en el presente documento, el término "Emáx" describe la actividad máxima de un compuesto. Por ejemplo, en un ensayo de destrucción celular, una Emáx describe la eliminación/destrucción de células cancerosas (por ejemplo, marcadas con calceína AM, véase el Ejemplo 7) por macrófagos dentro de un periodo de tiempo determinado. Se presume que esto tiene una gran importancia clínica ya que el número total de macrófagos que se infiltran en el tumor es limitado: si, por ejemplo, se elimina el doble de células tumorales por intervalo de tiempo, esto equivale a que deben estar presentes la mitad del número de macrófagos para eliminar el mismo número de células tumorales por unidad de tiempo.
Tal como se utiliza en el presente documento, el término "CE50" describe la concentración del compuesto a la que se alcanza la mitad de la actividad máxima (Emáx/2). Una CE50 baja es útil para que se necesite infundir una menor cantidad de compuesto y, por lo tanto, lograr, por ejemplo, un menor coste de producción en comparación con una CE50 más alta y/o potencialmente también una menor tasa de efectos secundarios. Por lo tanto, Emáx y CE50 describen diferentes aspectos de la actividad del compuesto. Para dos compuestos con una Emáx comparable, la CE50 cobra importancia, ya que se podría lograr el mismo efecto terapéutico a una concentración más baja y, por lo tanto, se podría administrar menos cantidad de fármaco y producirse una tasa potencialmente más baja de efectos secundarios.
Tal como se utilizan en el presente documento, los términos "parte de unión a antígeno" y "parte de unión" se refieren en su sentido más amplio a una parte de un anticuerpo que se une específicamente a un determinante antigénico tal como CEA, CD47 y CD3.
Más específicamente, tal como se utiliza en el presente documento, una parte de unión que se une al antígeno carcinoembrionario humano (CEA, lo mismo que CEACAM5) unido a la membrana o a CD47 se une específicamente a CEA o CD47, más particularmente a CEA o CD47 unido a la superficie celular o a la membrana. Por lo tanto, cada parte de unión se une o bien a CEA o bien a CD47. Por "unión específica, específico para, unión a" se entiende que la unión es selectiva para el antígeno y puede discriminarse de interacciones no deseadas o no específicas. En algunas formas de realización, el grado de unión de un anticuerpo anti-diana a una proteína no diana no relacionada es aproximadamente 10 veces, preferentemente >100 veces inferior a la unión del anticuerpo a dicha diana medido, por ejemplo, mediante interferometría de biocapa, por ejemplo Octet®, resonancia de plasmón superficial (SPR), por ejemplo Biacore®, inmunoabsorción ligada a enzimas (ELISA) o citometría de flujo (FACS). Las dianas son las proteínas analizadas en el presente documento, por ejemplo CEA, CD47 y CD3s.
Las frases que se unen específicamente a CEA y CD47, que se unen a CEA y CD47 y que son específicas para CEA y CD47 se refieren en una forma de realización a un anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo biespecífico, que es capaz de unirse a las dianas CEA y CD47 con una afinidad suficiente de tal manera que el anticuerpo sea útil como agente terapéutico para células tumorales que expresan CEACAM5 y CD47. La referencia a la unión a células MKN-45, SNU-C1, LS174T, SK-CO-1, HPAF-II y/o LoVo con un valor de CE50 particular se refiere a un valor de CE50 medido mediante citometría de flujo (véase el Ejemplo 6).
Tal como se utiliza en el presente documento, el término "anticuerpo" se refiere a un anticuerpo que comprende dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras. En una forma de realización, el anticuerpo es un anticuerpo de longitud completa. Tal como se utiliza en el presente documento, el término "cadena pesada de anticuerpo" se refiere a una cadena pesada de anticuerpo, que consiste en una región variable y una región constante tal como se definen para un anticuerpo de longitud completa. Tal como se utiliza en el presente documento, el término "cadena ligera de anticuerpo" se refiere a una cadena ligera de anticuerpo, que consiste en una región variable y una región constante tal como se definen para un anticuerpo de longitud completa.
El término "anticuerpo de longitud completa" indica un anticuerpo que consiste en dos "cadenas pesadas de anticuerpo de longitud completa" y dos "cadenas ligeras de anticuerpo de longitud completa". Una "cadena pesada de anticuerpo de longitud completa" es un polipéptido que consiste en la dirección N-terminal a C-terminal de un dominio variable de cadena pesada (VH) de anticuerpo, un dominio constante 1 de cadena pesada (CH1) de anticuerpo, una región bisagra (HR) de anticuerpo, un dominio constante 2 de cadena pesada (CH2) de anticuerpo y un dominio constante 3 de cadena pesada (CH3) de anticuerpo, abreviado como VH-CH1-HR-CH2-CH3. Una "cadena ligera de anticuerpo de longitud completa" es un polipéptido que consiste en la dirección N-terminal a C-terminal de un dominio variable de cadena ligera (VL) de anticuerpo, y un dominio constante de cadena ligera (CL) de anticuerpo, abreviado como VL-CL. El dominio constante de cadena ligera (CL) del anticuerpo puede ser k (kappa) o A (lambda). Los dos dominios del anticuerpo de longitud completa están unidos entre sí mediante enlaces disulfuro interpolipeptídicos entre el dominio CL y el dominio CH1 y entre las regiones bisagra de las cadenas pesadas del anticuerpo de longitud completa. Ejemplos de anticuerpos de longitud completa típicos son anticuerpos naturales tales como IgG (por ejemplo, IgG 1 e IgG2), IgM, IgA, IgD e IgE. El anticuerpo de longitud completa según la invención es, en una forma de realización, de tipo IgG1 humano, que comprende en una forma de realización adicional una o más sustituciones de aminoácidos en la parte Fc tal como se definen más adelante y/o está modificado mediante glicoingeniería en la cadena de polisacárido unida a Asn297. El anticuerpo de longitud completa según la invención comprende dos partes de unión formadas cada una por un par de VH y VL, una que se une a c Ea y la otra que se une a CD47.
Tal como se utiliza en el presente documento y se ha mencionado anteriormente, "región o regiones determinantes de la complementariedad" (<c>D<r>) describe los sitios de combinación de antígenos no contiguos (también conocidos como regiones de unión a antígeno) que se encuentran dentro de la región variable de polipéptidos de cadena pesada y ligera. Las CDR también se denominan "regiones hipervariables" (HVR), y ese término se utiliza indistintamente en el presente documento con el término "CDR" con referencia a las porciones de la región variable que forman las regiones de unión al antígeno. Esta región particular se ha descrito por Kabat Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991). Los residuos de aminoácidos apropiados con las CDR definidas por Kabat se exponen más adelante en la tabla de listado de secuencias. Los números exactos de residuos que abarcan una CDR particular variarán dependiendo de la secuencia y el tamaño de la CDR. Los expertos en la técnica pueden determinar de forma rutinaria qué residuos comprenden una CDR particular dada la secuencia de aminoácidos de la región variable del anticuerpo. Tal como se utiliza en el presente documento, el término "que comprende una CDRL1 de SEQ ID NO: x" se refiere a que la región CDRL1 de la cadena ligera variable referida es de SEQ ID NO: x (que comprende como CDRL1 una CDRL1 de SEQ ID NO: x). Esto también se aplica para las demás CDR. A menos que se indique lo contrario, los residuos de HVR se numeran en el presente documento según Kabat et al., anteriormente, y se denominan "CDR" y las referencias a la numeración de otras posiciones de residuos de aminoácidos específicos en los anticuerpos biespecíficos según la invención también se indican según el sistema de numeración de Kabat.
Tal como se utilizan en el presente documento, los términos "región Fc" y "dominio Fc" se refieren a una región C-terminal de una cadena pesada de IgG; en el caso de un anticuerpo IgG1, la región C-terminal comprende -CH2-CH3 (véase anteriormente). Aunque los límites de la región Fc de una cadena pesada de IgG pueden variar ligeramente, la región Fc de la cadena pesada de IgG humana normalmente se define de forma que se extienda desde el residuo de aminoácido de la posición Cys226 hasta el extremo carboxilo terminal. Las regiones constantes son bien conocidas en el estado de la técnica y se describen, por ejemplo, por Kabat, E.A., (véanse, por ejemplo, Johnson, G., y Wu, T.T., Nucleic Acids Res.28 (2000) 214-218; Kabat, E.A., et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72 (1975) 2785- 2788).
Una molécula de IgG porta dos oligosacáridos unidos a N en su región Fc, uno en cada cadena pesada. Como cualquier glicoproteína, un anticuerpo se produce como una población de glicoformas que comparten la misma estructura polipeptídica pero tienen diferentes oligosacáridos unidos a los sitios de glicosilación. Los anticuerpos con un contenido reducido de fucosa en restos de glicano muestran una mayor actividad de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) en comparación con un anticuerpo fucosilado de forma normal (Niwa R et al., Cancer Res, 64, 2127-33, 2004). Una línea celular con desactivación de ambos alelos para los genes responsables de la adición de fucosa (a1,6-fucosiltransferasa; FUT8) se describe en los documentos US6946292, US7425446, US8067232. Usando una línea celular de este tipo, los anticuerpos biespecíficos según la invención se pueden producir con restos glicano que tienen un contenido de fucosa reducido y una ADCC y una fagocitosis celular dependiente de anticuerpos (ADCP) aumentadas. Otra tecnología que puede usarse para producir anticuerpos con contenido reducido de fucosa se describe en el documento US8642292 (que se incorpora el presente documento por referencia). Esta tecnología está diseñada para configurar la integración estable de una enzima bacteriana heteróloga en una línea celular productora de anticuerpos tal como una línea celular CHO u otras. Con esta medida se bloquea la síntesisde novode fucosa a partir de D-manosa. Si además las células de producción se cultivan en un medio libre de fucosa, se producen como resultado anticuerpos con un nivel estable de afucosilación. Un ejemplo de un procedimiento para producir y purificar los anticuerpos biespecíficos afucosilados de la presente invención se describe en el Ejemplo 9 (1. y 2.).
Las mutaciones dentro del dominio Fc también pueden alterar las propiedades de unión del dominio Fc a los diferentes receptores Fc (documentos WO2004063351, WO2004099249; WO2005018669, WO2005063815, WO2005110474, WO2005056759, WO20050929 25, WO2005018572, WO2006019447, WO2006116260, WO2006023420, WO2006047350, WO2006085967, WO20061 05338, WO2007021841, WO2007008943, WO2007024249, WO2007041635, WO2007048077, WO2007044616, WO20 07106707, WO2008022152, WO2008140603, WO2008036688, WO2008091798, WO2008091954, WO2008092117, W O2008098115, WO2008121160, WO2008150494, WO2010033736, WO2014113510.
El término "epítopo" incluye cualquier determinante polipeptídico capaz de unirse específicamente a un anticuerpo. En determinadas formas de realización, "epítopo" incluye agrupaciones superficiales químicamente activas de moléculas tales como aminoácidos, cadenas laterales de azúcar, fosforilo o sulfonilo y, en determinadas formas de realización, puede tener características estructurales tridimensionales específicas o características de carga específicas. Un epítopo es una región de una diana que se une mediante un anticuerpo. En una forma de realización, el anticuerpo biespecífico de la invención se une al dominio N-terminal de CEACAM5 (dominio de tipo V similar a Ig de los aminoácidos 35 - 144, UniProtKB - P06731). La ubicación de unión de los anticuerpos biespecíficos CEAxCD47 a CEACAM5 se logra mediante una combinación de epítopos. En una combinación de epítopos, los anticuerpos se someten a ensayo de forma combinatoria por pares y los anticuerpos que compiten por la misma región de unión se agrupan en combinaciones. Los ensayos de competencia se realizan en el presente documento con anticuerpos anti-CEA según el estado de la técnica y tal como se describe en el presente documento. En una forma de realización, el anticuerpo biespecífico de la invención compite por la unión a CEACAM5 con el anticuerpo de referencia SM3E. La competencia se mide mediante un ensayo en el que se inmoviliza CEACAM5 humano biotinilado en una concentración de 0,5 pg/ml y se incuba con diluciones en serie (de 67 nM a 0,09 nM) de la referencia. Los anticuerpos biespecíficos CEAxCD47 de la presente invención se añaden a 0,1 pg/ml durante 1 hora a temperatura ambiente. Se lava la placa y se detectan los anticuerpos biespecíficos CEAxCD47 unidos.
Tal como se utiliza en el presente documento, el término "una cadena pesada común" (cHC) se refiere a un polipéptido que consiste en la dirección N-terminal a C-terminal en un dominio variable de cadena pesada (VH) de anticuerpo, un dominio constante 1 de cadena pesada (CH1) de anticuerpo, una región bisagra (HR) de anticuerpo, un dominio constante 2 de cadena pesada (CH2) de anticuerpo y un dominio constante 3 de cadena pesada (CH3) de anticuerpo, abreviado como VH-CH-HR-CH2-CH3. Las cadenas pesadas comunes adecuadas para los anticuerpos biespecíficos según la invención son cadenas pesadas de un anticuerpo anti-CD47 tal como se describen en los documentos WO2012023053, WO2013088259, WO2014087248, y WO2016156537. En una forma de realización, la cadena pesada común del anticuerpo biespecífico según la invención comprende como CDR de cadena pesada una<CDRH1 de SEQ ID NO: 1, una CDRH2 de>S<e>Q<ID NO: 2 y una CDRH3 de>S<e>Q<ID NO: 3. En una forma de realización,>la cHC del anticuerpo biespecífico según la invención comprende como región variable de cadena pesada VH una región VH de SEQ ID NO: 4. En una forma de realización, la parte Fab de la cadena pesada común cHC del anticuerpo biespecífico según la invención es de SEQ ID NO: 5 (VH-CH1). En una forma de realización, la cadena pesada común cHC del anticuerpo biespecífico según la invención es de SEQ ID NO: 6 (VH-CH1-CH2-CH3). La SEQ ID NO: 6, es una cadena pesada que comprende además una parte Fc de IgG1. En una forma de realización, el anticuerpo según la invención es un anticuerpo biespecífico kA que comprende una cHC (cuerpo kA).
El formato de cuerpo kA permite la purificación por afinidad de anticuerpos biespecíficos que no se pueden distinguir de una molécula de IgG estándar y con características que no se pueden distinguir de un anticuerpo monoclonal estándar (véanse, por ejemplo, los documentos WO2013088259, WO2012023053), lo que promete un potencial de inmunogenicidad bajo o nulo en los pacientes.
Los anticuerpos biespecíficos de la invención, que comprenden una cadena pesada común, se pueden preparar, por ejemplo, según el documento WO2012023053. Los procedimientos descritos en el documento WO2012023053 generan anticuerpos biespecíficos que son idénticos en estructura a una inmunoglobulina humana. Este tipo de molécula está compuesta por dos copias de un polipéptido de cadena pesada único, una primera región variable de cadena ligera fusionada a un dominio constante Kappa y una segunda región variable de cadena ligera fusionada a un dominio constante Lambda. Un sitio de unión muestra especificidad por CEA y el otro sitio muestra especificidad por CD47, contribuyendo a cada uno la cadena pesada y la cadena ligera respectiva. Las regiones variables de cadena ligera pueden ser de la familia Lambda o Kappa y están preferentemente fusionadas a dominios constantes Lambda y Kappa, respectivamente. Esto se prefiere para evitar la generación de uniones polipeptídicas no naturales. Sin embargo, también es posible obtener anticuerpos biespecíficos de la invención fusionando un dominio variable de cadena ligera Kappa con un dominio constante Lambda para una primera especificidad o fusionando un dominio variable de cadena ligera Lambda con un dominio constante Kappa para la segunda especificidad. La otra cadena ligera es entonces siempre completamente kappa (VL y CL) o completamente lambda (los denominados formatos híbridos de anticuerpos biespecíficos kappa lambda). Los anticuerpos biespecíficos descritos en el documento WO 2012023053 son "cuerpos kA". Este formato de cuerpo kA permite la purificación por afinidad de un anticuerpo biespecífico que no se distingue de una molécula de IgG estándar con características que no se distinguen de un anticuerpo monoclonal estándar y, por lo tanto, es favorable en comparación con formatos anteriores que incluyen, por ejemplo, puentes de aminoácidos u otros elementos no naturales.
Tal como se utilizan en el presente documento, los términos "CEA" y "CEACAM5" se refieren al antígeno carcinoembrionario humano (CEA, CEACAM-5 o CD66e; UniProtKB - P06731) que es una glicoproteína de la superficie celular y un antígeno asociado a tumores (Gold y Freedman, J Exp. Med., 121:439-462, 1965; Berinstein NL, J Clin Oncol., 20:2197-2207, 2002). Tal como se utiliza en el presente documento, el término "CEACAM3" se refiere a CEACAM3 humano (UniProtKB - P40198 (CEAM3_HUMAN) que también es miembro de la familia de moléculas de adhesión celular relacionadas con el antígeno carcinoembrionario (CEACAM). Más información e información sobre otros miembros de la familia CEA se puede encontrar en http://www.uniprot.org.
En una forma de realización, el anticuerpo biespecífico según la invención no es competitivo con TCB2014. El anticuerpo biespecífico anti-CEACAM5 * anti-CD3s cibisatamab se describe por Bacac et al. (Clin. Cancer Res., 22(13), 3286-97<(2016)). Las cadenas de anticuerpos de TCB2014 se describen en el documento US20140242079 (SEQ ID n>O:<1,2, 21,>22, 23, y 27 del documento US20140242079. Otro mAb CEAxCD3 biespecífico (TCB2017) se describe en el documento WO2017055389 como molécula B "2+1 IgG CrossFab, invertida" con modificaciones de carga (intercambio VH/VL en agente de unión a CD3, modificación de carga en agente de unión a CEA, agente de unión a CEA humanizado) (véanse las SEQ ID NO: 34, 36-38 del documento WO2017055389 ). Tal como se utiliza en el presente documento en una forma de realización, "anticuerpo biespecífico CEA * CD3" se refiere al anticuerpo TCB2014, cibisatamab o anticuerpo TCB2017.
Cibisatamab, TCB2014 y TCB2017 se unen a epítopos de CEACAM5 ubicados de forma proximal a la membrana celular. Por el contrario, los anticuerpos biespecíficos CEAxCD47 de la presente invención se unen a un epítopo distal de la membrana celular cerca del extremo N de CEACAM5 y no compiten con cibisatamab, TCB2014 y TCB2017 por la unión a CEACAM5.
Tal como se utilizan en el presente documento, los términos "unión específica a CD47", "unión a CD47" y "parte de unión a CD47" se refieren en el contexto de los anticuerpos biespecíficos según la invención a la especificidad por CD47 humano. El CD47 humano es una proteína de membrana de múltiples pasos y comprende tres dominios extracelulares (aminoácidos 19-141, 198-207 y 257-268; véase UniProtKB - Q08722). Tal como se utiliza en el presente documento, la "afinidad de unión a CD47" se mide cuantitativamente (KD) mediante interferometría de biocapa (tecnología Octet) y/o resonancia de plasmón superficial (tecnología Biacore). En una forma de realización, la unión del anticuerpo biespecífico según la invención a CD47 se produce a través de uno o más de dichos dominios extracelulares.
En una forma de realización, la segunda parte de unión del anticuerpo según la invención (que se une específicamente a CD47 humano) se caracteriza por una cadena ligera que comprende como CDR de cadena ligera una CDRL1 de SEQ ID NO: 7, una CDRL2 de SEQ ID NO: 8 y una CDRL3 de SEQ ID NO: 9, y una cadena pesada que comprende como CDR de cadena pesada una CDRL1 de SEQ ID NO: 1, una CDRL2 de SEQ ID NO: 2 y una CDRL3 de Se Q ID NO: 3. En una forma de realización, la segunda parte de unión del anticuerpo según la invención (que se une específicamente a CD47 humano) se caracteriza por una región variable de cadena ligera kappa de SEQ ID NO: 10. En una forma de realización, la segunda parte de unión del anticuerpo según la invención (que se une específicamente a CD47 humano) se caracteriza por una cadena ligera kappa de SEQ ID NO: 11. En una forma de realización, la segunda parte de unión del anticuerpo según la invención (que se une específicamente a CD47 humano) se caracteriza por una región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 4. En una forma de realización, la segunda parte de unión del anticuerpo según la invención (que se une específicamente a CD47 humano) se caracteriza por una cadena pesada de SEQ ID NO: 5. En una forma de realización, la segunda parte de unión del anticuerpo según la invención (que se une específicamente a CD47 humano) se caracteriza por una cadena pesada de SEQ ID NO: 6.
Tal como se utiliza en el presente documento, la expresión "se caracteriza por una cadena pesada de SEQ ID NO: S" se refiere, tal como se muestra en la tabla 1, a la parte VH-CH1 de la cadena pesada que es la parte Fab del anticuerpo según la invención. Dicha cadena pesada puede comprender además, y según el conocimiento común, partes adicionales como región bisagra, CH2, CH3, y puede estar en cualquier formato de anticuerpo, como en formato F(ab')2. El formato preferido es el formato de cadena pesada común tal como se ha descrito anteriormente.
Tal como se utilizan en el presente documento, los términos "unión específica a CEA", "unión a CEA" y "parte de unión a CEA" se refieren a la unión de un anticuerpo biespecífico según la invención a CEACAM5 humano recombinante, en la que dicho anticuerpo se une a CEACAM3 humano recombinante con un valor de KD de 100 veces o superior en comparación con el valor de KD de la unión a CEACAM5 humano recombinante. El término "KD", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a la constante de disociación en equilibrio entre el anticuerpo biespecífico según la invención y su antígeno CEACAM5 o CEACAM3 y se especifica en nM y puede medirse, por ejemplo, por resonancia de plasmón superficial y/o interferometría de biocapa (Ejemplo 3).
La unión a CEA (CEACAM5) en las células se mide utilizando diferentes líneas de células tumorales tales como LoVo, LS174T, MKN-45, SNU-C1, SK-CO-1, HPAF-II. La concentración del anticuerpo según la invención se varía en un intervalo apropiado con respecto al valor de CE50 resultante y al valor de Emáx para la unión a células tal como se ha definido anteriormente. Las curvas de unión de anticuerpos biespecíficos de la invención se muestran en las figuras 1A-1F, la CE50 y la Emáx se enumeran en la tabla 4.
Tal como se utiliza en el presente documento, el término "CEA humano unido a membrana" se refiere al antígeno carcinoembrionario (CEA) humano que está unido a una porción de membrana de una célula o a la superficie de una célula, en particular, la superficie de una célula tumoral.
Tal como se utilizan en el presente documento, los términos "anticuerpo biespecífico que se une a CEA humano y CD3 humano" y "MAb CEAxCD3" significan un anticuerpo biespecífico que se une a CEACAM5 y CD3s humanos. Dichos anticuerpos son, por ejemplo, cibisatamab, "TCB2014" y "TCB2017". Tal como se utiliza en el presente documento "TCB2014" se refiere a un anticuerpo biespecífico que se une a CEA y CD3 tal como se describe en el documento US20140242079 como Se Q ID NO: 1, 2, 21 y 22. Tal como se utiliza en el presente documento, "TCB2017" se refiere a la molécula B en el formato "2+1 IgG CrossFab, invertido" con modificaciones de carga (intercambio VH/VL en agente de unión a CD3, modificación de carga en agente de unión a CEA, agente de unión a CEA humanizado); SEQ ID NO 34, 36-38 del documento WO2017055389 (que se incorpora por referencia en su totalidad)). Otros mAb CeAxCD3 se describen en los documentos WO2007071426, WO2013012414, WO2015112534, WO2017118675, US20140242079 y WO2017055389. Otro mAb CEAxCD3 es cibisatamab (anteriormente RO6958688) (véase, por ejemplo, Bacac et al., Clin. Cancer Res., 22(13), 3286-97 (2016)). En una forma de realización, dicho mAb CEAxCD47 según la invención no es competitivo y/o no se une al mismo epítopo de CEACAM5 humano que TCB2014 o TCB2017.
Tal como se utiliza en el presente documento, "CD3s" y "CD3" se refieren a CD3s humano (UniProtKB - P07766 (CD3E_HUMAN). Los términos "anticuerpo contra CD3s (CD3)" y "anticuerpo anti-CD3s (CD3)" se relacionan con un anticuerpo que se une específicamente a CD3s. En una forma de realización, el anticuerpo contra CD3s se une específicamente al mismo epítopo que el anticuerpo anti-CD3 SP34 (N° de catálogo de BD Biosciences 565983).
En una forma de realización, el anticuerpo biespecífico de la invención no compite con TCB2014 y/o TCB2017 por la unión a CEA tal como se presenta en células MKN-45 y/o LS174T. Por lo tanto, TCB2014 en una concentración de 300 nM (TCB2014) o 30 nM (TCB2017) no desplaza la CE50 de la curva del índice de fagocitosis de dicho anticuerpo biespecífico de la invención para células MKN-45 y/o LS174T en más de un factor de 3, en una forma de realización hacia concentraciones más altas.
Se seleccionó la concentración de TCB2014 300 nM porque se midieron concentraciones de esta magnitud en el plasma de pacientes tratados con dosis terapéuticamente eficaces de cibisatamab tales como 100 mg iv (para datos farmacocinéticos de cibisatamab, véase Melero et al., ASCO 2017, Resumen 2549 y Cartel N° 41, Resumen de Journal of Clinical Oncology 35, N° 15_supl. (20 de mayo, 2017) 2549-2549), para los respectivos resultados clínicos, véase Tabernero et al., J. Clin. Oncol. 35, 2017 (supl., resumen 3002)). En un estudio de reclutamiento de forma activa realizado actualmente de cibisatamab en combinación con un inhibidor de PD-L1, se administran 100 mg de cibisatamab (Identificador de ClinicalTrials.gov: NCT03866239). TCB2017 es en investigaciones preclínicas de aproximadamente 10 a 100 veces más potente que TCB2014 (medido por afinidad de unión o lisis de células tumorales en un ensayo TDCC de citotoxicidad celular dependiente de células T; véase el documento WO2017055389). Por lo tanto, el desplazamiento de la CE50 de las curvas de fagocitosis de los anticuerpos biespecíficos de la invención por TCB2017 se ha analizado a 30 nM de TCB2017.
La competencia en la unión se puede determinar mediante medición basada en citometría de flujo de la curva de unión a células MKN-45 y determinación de la CE50 de esta curva de unión. La no competencia significa que la CE50 se desplaza en menos de un factor de 3, en una forma de realización hacia concentraciones más altas, si se añaden 300 nM de TCB2014 al ensayo. 300 nM es una concentración en el intervalo de dosis/concentraciones plasmáticas terapéuticamente activas del anticuerpo biespecífico CEA x CD3 (TCB2014) (Tabernero et al., J. Clin. Oncol. 35, 2017 (supl., resumen 3002)). La no competencia de TCB2017 significa que la CE50 se desplaza en menos de un factor de 3 si se añaden 30 nM de TCB2017 al ensayo.
Tal como se utiliza en el presente documento, el término "no competitivo" significa que un segundo anticuerpo (anticuerpo biespecífico contra CEAxCD3e, tal como TCB2014 o TCB2017) a una concentración de 300 nM (TCB20l4) o 30 nM (TCB2017) no desplaza la CE50 de la curva de unión del anticuerpo biespecífico de la invención a células MKN-45 en más de un factor de 3, en una forma de realización hacia concentraciones más altas.
Tal como se utiliza en el presente documento, el término "ADCP" se refiere a fagocitosis celular dependiente de anticuerpos. Tal como se utiliza en el presente documento la fagocitosis, el valor CE50 de fagocitosis, el máximo de fagocitosis y el índice de fagocitosis según la invención se refieren a fagocitosis medida con líneas de células tumorales tales como, por ejemplo, LoVo, LS174T, SNU-C1 y/o MKN-45 mediante "obtención de imágenes". Un procedimiento de obtención de imágenes apropiado, con incubación en una relación de células efectoras (macrófagos):célula diana (tumoral) de, por ejemplo 1: 1 o 1:3 y con el "índice de fagocitosis" como lectura (ADCP determinado por obtención de imágenes") se describe en el Ejemplo 7. Tal como se utiliza en el presente documento "fagocitosis de dicho anticuerpo biespecífico" significa fagocitosis provocada/inducida por dicho anticuerpo.
Los términos "IgG humana" y "hIgG" se refieren a un isotipo de anticuerpo humano. Tal como se utilizan en configuraciones experimentales, estos términos se refieren a una preparación homogénea de grado clínico de inmunoglobulina humana IgG disponible comercialmente (disponible, por ejemplo, de Bio-Rad) que no se une específicamente a CD47 y CEACAM5.
Aplicaciones terapéuticas y procedimientos de uso de moléculas de unión al antígeno anti-CEA
Los anticuerpos biespecíficos CEACAM x CD47 según la invención están optimizados para el tratamiento de tumores sólidos principalmente mediante fagocitosis de las células tumorales mediada por macrófagos, pero también mediante ADCC, ya sea en monoterapia o en terapia de combinación junto con anticuerpos biespecíficos de células T CEAxCD3 tales como cibisatamab, TCB2014 o TCB2017 y/o antagonista del eje PD-1. El anticuerpo según la invención y el anticuerpo biespecífico de células T CEAxCD3 se pueden administrar tal como se describe más adelante.
En una forma de realización particular, la enfermedad, respectivamente el tumor sólido, es un cáncer que expresa o incluso sobreexpresa CEACAM5, incluidos, pero sin limitación, el grupo de tumores colorrectales, tumores de pulmón de células no pequeñas, tumores gástricos, tumores de páncreas y tumores de mama. En una forma de realización particular, el tumor es un tumor colorrectal. En una forma de realización particular, el tumor es un tumor gástrico o un tumor de la unión gastroesofágica. En una forma de realización particular, el tumor es un tumor gástrico/tumor de la unión gastroesofágica que expresa CEACAM5 y HER-2. En una forma de realización particular, el tumor es un tumor de pulmón. Todos los procedimientos de uso, usos, combinaciones, etc., de aplicaciones terapéuticas descritos en el presente documento son especialmente formas de realización para el uso de un anticuerpo según la invención para el tratamiento de estos tumores/enfermedades.
Los inventores reconocen que los anticuerpos según la invención muestran un potencial de formación de anticuerpos antifármaco (ADA) bajo o nulo, respectivamente, pérdida de exposición al fármaco debido a la neutralización de ADA, respectivamente, pérdida de eficacia.
En una forma de realización, la invención proporciona un anticuerpo según la invención para su uso en un procedimiento para tratar carcinomas (cáncer, tumores, por ejemplo, carcinomas humanos), especialmente tumores que expresan CEACAM5,in vivo.Este procedimiento comprende administrar a un sujeto una cantidad farmacéuticamente eficaz de una composición que contiene un anticuerpo biespecífico de la invención. Por "sujeto" se entiende un sujeto humano, en una forma de realización un paciente que padece cáncer/tumor/carcinoma.
La expresión de CEACAM5 se puede encontrar en diversas entidades tumorales, especialmente en carcinoma colorrectal, adenocarcinoma de páncreas, cáncer gástrico, cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer de mama, entre otros. En los epitelios glandulares normales, sanos, del aparato gastrointestinal, el CEACAM5 se expresa principalmente en un patrón polarizado en la superficie apical de las células. Este patrón de expresión polarizado limita la accesibilidad de los anticuerpos monoespecíficos o biespecíficos anti-CEA que se administran sistémicamente y, por lo tanto, limita la toxicidad potencial para los tejidos sanos. Junto con la unión a CD47 de baja afinidad del anticuerpo de la invención, esto da lugar a una fagocitosis limitada o nula de dichas células normales por el anticuerpo de la invención. Este patrón de expresión polarizado se pierde en las células de los tumores gastrointestinales y otros tumores malignos. El CEACAM5 se expresa igualmente en toda la superficie celular de las células cancerosas, lo que significa que las células cancerosas son mucho más accesibles a un anticuerpo de la invención que las células sanas normales y pueden ser destruidas selectivamente por los anticuerpos biespecíficos CEAxCD47 de la invención, respectivamente, mediante las combinaciones mencionadas anteriormente. La expresión de CEACAM5 en células cancerosas es mayoritariamente superior que la expresión en células no malignas.
En una forma de realización, los anticuerpos biespecíficos de la presente invención se pueden usar en monoterapia para el tratamiento de tumores sólidos avanzados, en una forma de realización tumores que expresan CEACAM5. En una forma de realización, se usa un anticuerpo biespecífico según la invención en combinación con un mAb CEAxCD3 en combinación simultánea, separada o secuencial. En una forma de realización, se usa un anticuerpo biespecífico según la invención en combinación con un mAb CEAxCD3 y/o un antagonista del eje PD-1 en combinación simultánea, separada o secuencial. En una forma de realización, se usa un anticuerpo biespecífico según la invención en combinación con un antagonista del eje PD-1 en combinación simultánea, separada o secuencial. Dichos antagonistas del eje PD-1 se describen, por ejemplo, en el documento WO2017118675. Estas combinaciones atacan el cáncer sólido mediante macrófagos y células T. Un mAb CEAxCD3 se encuentra en desarrollo clínico (cibisatamab; véase el identificador de ClinicalTrials.gov: NCT03866239). MEDI-565 estaba en desarrollo clínico pero no se pudo identificar ningún ensayo clínico activo en Clinicaltrials.gov. En una forma de realización, como anticuerpo biespecífico contra CEA y CD3 se usa el anticuerpo TCB2014 o cibisatamab.
El agente de unión a CEA utilizado en TCB2014 y cibisatamab se deriva del anticuerpo anti-CEA PR1A3 (véase, por ejemplo, el documento EP2681244B1). Este anticuerpo se une al denominado dominio B3 de CEA ubicado de forma proximal a la membrana celular. TCB2014 tiene una baja afinidad de unión nM al CEA y muestra eficacia en dosis altas (entre 40 y 600 mg por dosis y paciente; (véase, por ejemplo, Tabernero et al., J. Clin. Oncol. 35, 2017 (supl., resumen 3002)). En las dosis más altas, casi todas las dianas de<c>E<a>en las superficies celulares están ocupados por TCB2014. Según el conocimiento de los inventores, la combinación de cibisatamab, TCB2014 o TCB2017 con CEAxCD47 puede generar niveles plasmáticos terapéuticos de ambos fármacos al mismo tiempo y lograr mejores resultados (aditivos o incluso sinérgicos), si ambos fármacos no son competitivos por el antígeno CEA que se une respectivamente a diferentes epítopos que no se superponen.
Tal como se utilizan en el presente documento los términos "combinación, combinación simultánea, separada o secuencial" de un anticuerpo según la invención y un segundo anticuerpo biespecífico que se une a CEA humano y CD3s humano se refieren a cualquier administración de los dos anticuerpos (o tres anticuerpos en caso de la combinación de un anticuerpo de la invención, un mAb CEAxCD3 y un antagonista del eje PD-1), ya sea por separado o juntos, administrándose los dos o tres anticuerpos como parte de un régimen de dosis apropiado diseñado para obtener el beneficio de una terapia de combinación, por ejemplo en administración separada, secuencial, simultánea, concurrente, cronológicamente escalonada o alterna. Por lo tanto, los dos o tres anticuerpos pueden administrarse como parte de la misma composición farmacéutica o en composiciones farmacéuticas separadas. El anticuerpo según la invención se puede administrar antes, al mismo tiempo o después de la administración del segundo anticuerpo biespecífico, o en alguna combinación de los mismos. Cuando el anticuerpo según la invención se administra al paciente a intervalos repetidos, el segundo anticuerpo biespecífico se puede administrar antes, al mismo tiempo o después de cada administración del anticuerpo de la invención o alguna combinación de los mismos, o en diferentes intervalos con respecto al tratamiento con el anticuerpo de la invención, o en una dosis única antes, en cualquier momento durante o después del curso del tratamiento con el anticuerpo de la invención. En una forma de realización, el anticuerpo según la invención y el segundo anticuerpo biespecífico se administran en administración alterna, en una forma de realización, en intervalos de 6 a 15 días entre la administración del anticuerpo de la invención y el segundo anticuerpo. En dicha administración alterna, la primera dosis puede ser el anticuerpo de la invención o el segundo anticuerpo.
El término "antagonista del eje PD-1" se refiere a un anticuerpo anti-PD-1 o un anticuerpo anti-PD-L1. Los anticuerpos anti-PD-1 son, por ejemplo, pembrolizumab (Keytruda®, MK-3475), nivolumab, pidilizumab, lambrolizumab, MEDI-0680, PDR001 y REGN2810. Los anticuerpos anti-PD-1 se describen, por ejemplo, en los documentos WO200815671, WO2013173223, WO2015026634, US7521051, US8008449, US8354509, WO20091 14335, WO2015026634, WO2008156712, WO2015026634, WO2003099196, WO2009101611, WO2010/027423, WO20 10/027827, WO2010/027828, WO2008/156712 y WO2008/156712.
Los anticuerpos anti-PD-Ll son, por ejemplo, atezolizumab, MDX-1 105, durvalumab y avelumab. Los anticuerpos anti-PD-Ll se describen, por ejemplo, en los documentos WO2015026634, WO2013/019906, WO2010077634, US8383796, WO2010077634, WO2007005874 y WO2016007235.
Con respecto a la administración combinada del anticuerpo según la invención y el segundo anticuerpo biespecífico, ambos compuestos pueden estar presentes en una forma de dosificación única o en formas de dosificación separadas, por ejemplo en dos formas de dosificación diferentes o idénticas.
Si el anticuerpo de la invención y el segundo anticuerpo no compiten con respecto a CEACAM5, en una forma de realización, ambos anticuerpos, si lo desea el médico, pueden administrarse simultáneamente. Si el anticuerpo de la invención y el segundo anticuerpo compiten con respecto a CEACAM5, en una forma de realización ambos anticuerpos se administran en administración alterna.
El anticuerpo de la invención normalmente se administrará al paciente en un régimen de dosis que proporcione el tratamiento más eficaz del cáncer (tanto desde el punto de vista de la eficacia como de la seguridad) del que se está tratando al paciente, tal como se conoce en la técnica. Preferentemente, las células tumorales son atacadas al mismo tiempo por células T y macrófagos; para lograr el potencial terapéutico completo de este enfoque, los anticuerpos biespecíficos CEAxCD3 y CEAxCD47 según la invención tienen que ser no competitivos con respecto a la unión a CEA en la superficie celular.
Tal como se ha explicado anteriormente, la cantidad de anticuerpo administrada y el momento de la administración del anticuerpo de la invención pueden depender del tipo (por ejemplo, sexo, edad, peso) y la condición general del paciente que se está tratando, la gravedad de la enfermedad o afección que se está tratando y de la vía de administración. Por ejemplo, el anticuerpo de la invención y el segundo anticuerpo se pueden administrar a un paciente en dosis que varían de 0,1 a 100 mg/kg de peso corporal por día o por semana en dosis únicas o divididas, o mediante infusión continua. En una forma de realización, cada uno de los anticuerpos de la invención y el segundo anticuerpo se administran a un paciente en dosis que varían de 0,1 a 30 mg/kg. En algunos casos, pueden ser adecuados niveles de dosificación por debajo del límite inferior del intervalo mencionado anteriormente, mientras que en otros casos se pueden emplear dosis aún mayores sin causar ningún efecto secundario perjudicial.
Tal como se utiliza en el presente documento, el término "semivida del anticuerpo" se refiere a la semivida de eliminación de dicho anticuerpo medida en un ensayo farmacocinético habitual. Un anticuerpo según la invención y el segundo anticuerpo biespecífico contra CEA y CD3 tienen una semivida de eliminación de 3 a 14 días.
En otro aspecto, la invención también se refiere al anticuerpo biespecífico según la invención para su uso en el tratamiento de enfermedades, particularmente trastornos de proliferación celular en los que se expresa CEACAM5, particularmente en los que CEACAM5 se expresa de forma anormal (por ejemplo, se sobreexpresa o se expresa en un patrón diferente en la superficie celular) en comparación con el tejido normal del mismo tipo de célula. Dichos trastornos incluyen, pero sin limitación, cáncer colorrectal, NSCLC (cáncer de pulmón de células no pequeñas), cáncer gástrico, cáncer gastroesofágico, cáncer de páncreas y cáncer de mama. Los niveles de expresión de CEACAM5 pueden determinarse mediante diferentes procedimientos del estado de la técnica conocidos (por ejemplo, mediante ensayo inmunohistoquímico, ensayo de inmunofluorescencia, ensayo inmunoenzimático, ELISA, citometría de flujo, radioinmunoensayo, etc.).
En un aspecto, se pueden usar anticuerpos biespecíficos de la invención para dirigirlos a célulasin vivooin vitroque expresan CEACAM5. Los anticuerpos biespecíficos de la invención son particularmente útiles en la prevención de la formación de tumores, la erradicación de tumores y la inhibición del crecimiento o metástasis de tumores mediante la inducción de ADCP y ADCC de células tumorales. Los anticuerpos biespecíficos de la invención se pueden usar para tratar cualquier tumor que exprese CEACAM5. Las neoplasias malignas particulares que pueden tratarse con los anticuerpos biespecíficos de la invención incluyen, pero sin limitación, cáncer colorrectal, cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer gástrico, cáncer de la unión gastroesofágica, cáncer de páncreas y cáncer de mama.
Los anticuerpos biespecíficos de la invención se administran a un mamífero, preferentemente un ser humano, en una forma de dosificación farmacéuticamente aceptable tal como las que se analizan a continuación, incluidas aquellas que se pueden administrar a un ser humano por vía intravenosa en embolada o mediante infusión continua durante un periodo de tiempo, por vía intramuscular, intraperitoneal, intracerebroespinal, subcutánea, intraarticular, intrasinovial, intratecal, oral, tópica o por inhalación. Los anticuerpos biespecíficos de la invención también se administran adecuadamente por vía intratumoral, peritumoral, intralesional o perilesional, para que ejerzan efectos terapéuticos tanto locales como sistémicos.
Para el tratamiento de la enfermedad, la dosificación apropiada de anticuerpos biespecíficos de la invención dependerá del tipo de enfermedad que hay que tratar, la gravedad y el curso de la enfermedad, la terapia previa, el historial clínico del paciente y la respuesta al anticuerpo, y el criterio del médico tratante. El anticuerpo biespecífico de la invención se administra adecuadamente al paciente de una sola vez o durante una serie de tratamientos. La presente invención proporciona un procedimiento para destruir selectivamente células tumorales (también denominadas en el presente documento células cancerosas) que expresan CEACAM5.
Este procedimiento comprende la interacción de los anticuerpos biespecíficos de la invención con dichas células tumorales. Estas células tumorales pueden ser de un carcinoma humano que incluye carcinoma colorrectal, carcinoma de pulmón de células no pequeñas (NSCLC), carcinoma gástrico, cáncer de la unión gastroesofágica, carcinoma de páncreas y carcinoma de mama.
En otro aspecto, la invención se refiere a anticuerpos biespecíficos de la invención para su uso en la fabricación de un medicamento para tratar una enfermedad relacionada con la expresión anormal de CEACAM5. En una forma de realización particular, la enfermedad es un cáncer que expresa o incluso sobreexpresa CEACAM5, incluidos, pero sin limitación, tumores colorrectales, tumores de pulmón de células no pequeñas, tumores gástricos, tumores de la unión gastroesofágica, tumores pancreáticos y tumores de mama. En una forma de realización particular, los tumores son tumores colorrectales.
Composiciones, formulaciones, dosificaciones y vías de administración
En un aspecto, la presente invención se refiere a composiciones farmacéuticas que comprenden los anticuerpos biespecíficos de la presente invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable. La presente invención se refiere además a un anticuerpo según la invención para su uso en composiciones farmacéuticas en el procedimiento de tratamiento de enfermedades, tales como el cáncer, o en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de enfermedades, tales como el cáncer. Específicamente, la presente invención se refiere a un anticuerpo según la invención para su uso en el tratamiento de enfermedades, y más particularmente, para el tratamiento del cáncer, comprendiendo el procedimiento administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de la composición farmacéutica de la invención.
En un aspecto, la presente invención abarca composiciones, combinaciones y procedimientos farmacéuticos para su uso en el tratamiento de carcinomas y tumores humanos, tal como se han definido anteriormente. Por ejemplo, la invención incluye composiciones farmacéuticas para su uso en el tratamiento de carcinomas humanos que comprenden una cantidad farmacéuticamente eficaz de un anticuerpo de la presente invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
Las composiciones de anticuerpos biespecíficos de la invención se pueden administrar usando modos de administración convencionales que incluyen, pero sin limitación, administración intravenosa, intraperitoneal, oral, intralinfática o intratumoral directa. Se prefiere la administración intravenosa o subcutánea.
En un aspecto de la invención, las formulaciones terapéuticas que contienen los anticuerpos biespecíficos de la invención se preparan para su almacenamiento mezclando un anticuerpo que tiene el grado de pureza deseado con vehículos, excipientes o estabilizantes farmacéuticamente aceptables opcionales (Remington's Pharmaceutical Sciences 16a edición, Osol, A. Ed. (1980)), en forma de formulaciones liofilizadas o formulaciones líquidas. Los vehículos, excipientes o estabilizantes aceptables no son tóxicos para los receptores en las dosis y concentraciones empleadas. Las formulaciones que se utilizarán para la administraciónin vivodeben ser estériles. Esto se logra fácilmente mediante filtración a través de membranas de filtración estériles. El modo más eficaz de administración y régimen de dosificación para las composiciones farmacéuticas de la presente invención depende de la gravedad y el curso de la enfermedad, la condición general del paciente y la respuesta al tratamiento y el criterio del médico tratante. En consecuencia, las dosis de las composiciones pueden ser dosis fijas o pueden adaptarse al paciente individual, por ejemplo el peso corporal. Sin embargo, una dosis eficaz de las composiciones de esta invención se encontrará generalmente en el intervalo de 0,1 a 30 mg/kg.
Los anticuerpos biespecíficos de la presente invención tienen un peso molecular de una magnitud de 150 kDa por mol. Portan en una forma de realización una parte Fc. La semivida de eliminación en pacientes se encuentra en el intervalo de 3 a 14 días. Esta semivida permite, pero sin limitación, la administración una vez al día, una vez a la semana o una vez cada dos semanas o incluso 4 semanas.
Los anticuerpos biespecíficos de la presente invención y sus respectivas composiciones pueden estar presentes en una diversidad de formas de dosificación que incluyen, pero sin limitación, soluciones o suspensiones líquidas, comprimidos, píldoras, polvos, supositorios, microcápsulas o microvesículas poliméricas, liposomas y soluciones inyectables o infundibles. La forma preferida depende del modo de administración y de la aplicación terapéutica.
La composición que comprende un anticuerpo biespecífico de la presente invención se formulará, dosificará y administrará de forma consistente con la buena práctica médica. Los factores que se deben considerar en este contexto incluyen la enfermedad o trastorno particular que se está tratando, el mamífero particular que se está tratando, la condición clínica del paciente individual, la causa de la enfermedad o trastorno, el lugar de administración del agente, el procedimiento de administración, la programación de la administración y otros factores conocidos por los médicos.
Artículos de fabricación
En otro aspecto de la invención, se proporciona un artículo de fabricación que contiene materiales útiles para el tratamiento, la prevención y/o el diagnóstico de los trastornos descritos anteriormente. El artículo de fabricación comprende un recipiente y una etiqueta o prospecto en el recipiente o asociado con el mismo. Los recipientes adecuados incluyen, por ejemplo, frascos, viales, jeringas, bolsas de solución intravenosa, etc. Los recipientes pueden formarse a partir de una diversidad de materiales tales como vidrio o plástico. El recipiente contiene una composición que es eficaz por sí misma o combinada con otra composición para tratar, prevenir y/o diagnosticar la afección y puede tener un puerto de acceso estéril (por ejemplo, el recipiente puede ser una bolsa de solución intravenosa o un vial que tiene un tapón perforable) mediante una aguja de inyección hipodérmica). Al menos un principio activo de la composición es un anticuerpo biespecífico de la invención. La etiqueta o el prospecto indica que la composición se usa para tratar la afección de elección. Además, el artículo de fabricación puede comprender (a) un primer recipiente con una composición contenida en el mismo, en el que la composición comprende un anticuerpo biespecífico de la invención; y (b) un segundo recipiente con una composición contenida en el mismo, en el que la composición comprende un agente citotóxico o terapéutico adicional. El artículo de fabricación en esta forma de realización de la invención puede comprender además un prospecto que indique que las composiciones se pueden usar para tratar una afección particular. Como alternativa, o adicionalmente, el artículo de fabricación puede comprender además un segundo (o tercer) recipiente que comprende un tampón farmacéuticamente aceptable, tal como agua bacteriostática para inyección (BWFI), solución salina tamponada con fosfato, solución de Ringer y solución de dextrosa. Puede incluir además otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y de usuario, incluidos otros tampones, diluyentes, filtros, agujas y jeringas.
Tabla 1: Listado de secuencias
EJEMPLOS
Ejemplo 1: Clonación, expresión y purificación de CEACAM5 humano; fuente de huCEACAM3 y huCD47
La secuencia correspondiente al dominio extracelular (ECD) completo CEACAM5 se subclonó en el vector de expresión de mamíferos pEAK8 (Edge Biosystems, Gaithersburg, Md.). Los vectores se modificaron para introducir un Avitag™ (Avidity, Denver, Colo.) y una etiqueta de hexahistidina, una región Fc humana o una región Fc de ratón en el extremo C-terminal. Los constructos se verificaron mediante secuenciación de ADN. La purificación de la proteína soluble recombinante se llevó a cabo mediante IMAC (cromatografía de afinidad de iones metálicos inmovilizados), FcXL o matriz de afinidad de IgG-Fc (ms) CaptureSelect™; el CEACAM3 humano y el CEACAM3 biotinilado están disponibles en ACROBiosystems, Newark, Estados Unidos (Thermo Ffisher Scientific). El CD47 humano y el CD47 biotinilado se pueden producir tal como se describe en el documento WO2019234576 o están disponibles en ACROBiosystems, Newark, Estados Unidos.
Ejemplo 2: Expresión y purificación de anticuerpos biespecíficos que portan una cadena ligera Lambda y una cadena ligera Kappa
La expresión simultánea se puede lograr de diferentes maneras, tales como la transfección de múltiples vectores, cada uno de los cuales expresa una de las cadenas que se van a coexpresar, o mediante el uso de vectores que impulsan la expresión de múltiples genes. Previamente se generó un vector pNovi<k>HA para permitir la coexpresión de una cadena pesada, una cadena ligera Kappa y una cadena ligera Lambda tal como se describe en los documentos US 2012/0184716 y WO 2012/023053. La expresión de los tres genes está impulsada por promotores del citomegalovirus humano (hCMV) y el vector también contiene un gen de glutamina sintetasa (GS) que permite la selección y el establecimiento de líneas celulares estables. Los genes VL de la IgGA anti-hCEACAM5 o de la IgGK anti-hCD47 se clonaron en el vector pNovi kHA, para la expresión transitoria en células de mamífero. Las células pico o células CHO se cultivan en un matraz apropiado con un número de células y un volumen de medio de cultivo (que contiene suero bovino fetal) adecuados. El ADN plasmídico se transfecta en las células utilizando Lipofectamine 2000) según las instrucciones del fabricante. La concentración de anticuerpos en el sobrenadante de las células transfectadas se mide durante la producción utilizando OctetRED96. Según la concentración de anticuerpos, los sobrenadantes se recogen de 5 a 7 días después de la transfección y se clarifican mediante centrifugación a 1300 g durante 10 min. El proceso de purificación se compone de tres etapas de afinidad. En primer lugar, la matriz de afinidad de FcXL (Thermo Fisher Scientific) se lava con PBS y después se añade al sobrenadante clarificado. Después de la incubación durante la noche a 4°C, los sobrenadantes se centrifugan a 2000 g durante 10 minutos, se almacena el flujo y la resina se lava dos veces con PBS. Después, la resina se transfiere a columnas Amicon Pro y se usa para la elución una solución que contiene glicina 50 mM a pH 3,0. Se generan, se agrupan y se desalan varias fracciones de elución frente a PBS utilizando unidades de filtrado de ultracentrifugadora Amicon™ de 50 kDa (Merck KGaA, Darmstadt, Alemania). El producto eluido, que contiene IgG humanas totales del sobrenadante, se cuantifica usando un espectrofotómetro Nanodrop (NanoDrop Technologies, Wilmington, Del.) y se incuba durante 15 min a temperatura ambiente y 20 rpm con el volumen apropiado de matriz de afinidad Kappa select (GE Healthcare). Las etapas de incubación, recuperación de resina, elución y desalinización se realizan tal como se ha descrito anteriormente. La última etapa de purificación por afinidad se realiza utilizando la matriz de afinidad lambda Fab select (GE Healthcare) aplicando el mismo proceso que para las dos purificaciones anteriores. El producto final se cuantifica utilizando el Nanodrop. Los anticuerpos biespecíficos purificados se analizan mediante electroforesis en condiciones desnaturalizantes y reductoras. El bioanalizador Agilent 2100 se utiliza con el kit Protein 80 tal como describe el fabricante (Agilent Technologies, Santa Clara, Calif., Estados Unidos). Se mezclan 4 pl de muestras purificadas con tampón de muestra suplementado con ditiotreitol (DTT; Sigma Aldrich, St. Louis, MO). Las muestras se calientan a 95°C durante 5 minutos y después se cargan en el chip. Todas las muestras se analizan para detectar contaminación por endotoxinas utilizando el ensayo de lisado de amebocitos de Limulus (LAL; Charles River Laboratories, Wilmington, Mass.).
Ejemplo 3: Medición de KD
a) Procedimiento experimental para medir la KD de un Ab con respecto a CEACAM5 humano recombinante (Octet)
La afinidad del brazo anti-CEACAM5 humano de los anticuerpos biespecíficos CD47xCEACAM5 de la invención por CEACAM5 humano soluble recombinante se determinó utilizando la tecnología de interferometría de biocapa (BLI). Se utilizó un instrumento OctetRED96 y biosensores de Proteína A (Sartorius). La medición se realizó a 30°C. Después de la hidratación, el acondicionamiento previo y una etapa inicial en tampón cinético (PBS, Tween 20 al 0,002%, BSA al 0,01%, Kathon; Sartorius), los biosensores se cargaron durante 5 minutos con el cuerpo<k>A a 0,5 pg/ml en tampón cinético. Después, los biosensores se sumergieron en una dilución en serie de proteína soluble del dominio extracelular (ECD) de CEACAM5 humano recombinante (producido internamente), comenzando a 50 nM con un factor de dilución 2x. Las fases de asociación y disociación se supervisaron durante 600 segundos cada una. Los biosensores se regeneraron usando glicina 10 mM, pH 1,7. Se aplicó una frecuencia de adquisición estándar (5,0 Hz, con un promedio de 20). Las curvas se procesaron con una sustracción del pocillo de referencia, una alineación Y en la línea base, sin corrección entre etapas. La afinidad se midió aplicando un modelo de ajuste general 1:1 en las etapas completas de asociación y disociación. La afinidad de unión (KD) de los anticuerpos biespecíficos de la invención al CD47 humano recombinante se determinó mediante el mismo procedimiento experimental. Las KD de anticuerpos biespecíficos de ejemplo de la invención con respecto a CEACAM5, determinadas mediante este procedimiento, se muestran en la tabla 2 siguiente.
b) Procedimiento experimental para medir la KD de un Ab con respecto a CEACAM3 humano recombinante (Octet)
La afinidad de los brazos anti-CEACAM5 humano de los anticuerpos biespecíficos CD47xCEACAM5 de la invención por CEACAM3 humano soluble recombinante se determinó utilizando la tecnología de interferometría de biocapa (BLI) y un instrumento OctetRED96. Se utilizaron biosensores HIS1K (Sartorius), cargados con un anticuerpo anti-etiqueta His, para capturar huCEACAM3 recombinante etiquetado con His (R&D Systems, N° 9868-CM). La medición se realizó a 30°C. Después de la hidratación, el preacondicionamiento y una etapa inicial en tampón cinético (PBS, Tween 20 al 0,002%, BSA al 0,01%, Kathon; Sartorius), los biosensores se cargaron durante 5 minutos con huCEACAM3 recombinante a 5 pg/ml en tampón cinético. Después, los biosensores se sumergieron en una dilución en serie de cuerpos<k>A, comenzando a 667 nM con un factor de dilución 2x. Las fases de asociación y disociación se supervisaron durante 60 segundos y 120 segundos respectivamente. Los biosensores se regeneraron usando glicina 10 mM, pH 1,7. Se aplicó una frecuencia de adquisición estándar (5,0 Hz, con un promedio de 20). Las curvas se procesaron con una doble sustracción de referencia, una alineación Y en la línea base y una corrección entre etapas. La afinidad se midió aplicando un modelo de ajuste general 1:1 en la etapa de asociación completa y los primeros 5 segundos de la etapa de disociación. Las KD de anticuerpos biespecíficos de ejemplo de la invención con respecto a CEACAM3, determinadas mediante este procedimiento, se muestran en la tabla 2 siguiente.
Tabla 2 Afinidades de unión (KD; nM) del brazo anti-CEACAM5 para los 3 (tres) anticuerpos biespecíficos CD47xCEACAM5, K2AC84, K2AC100 K2AC22 comparación medidas por Octet.
Ejemplo 4: Combinación de epítopos de anticuerpos biespecíficos CD47xCEACAM5 mediante competencia con el anticuerpo de referencia SM3E
La combinación de epítopos es un inmunoensayo competitivo utilizado para caracterizar la unión de anticuerpos según la invención o, por ejemplo, alternativamente la unión de anticuerpos la unión de los anticuerpos anti-CEA (proteína diana) bivalentes relacionados de la primera parte de unión de los anticuerpos biespecíficos de la invención. Se crea un perfil de bloqueo competitivo de un nuevo anticuerpo que se une a la proteína diana contra anticuerpos que también se unen a esta proteína diana y para los cuales el epítopo de unión ya se ha establecido/publicado. La competencia con este anticuerpo de referencia indica que el anticuerpo tiene el mismo epítopo o uno situado en la cercanía y están "combinados" entre sí. La capacidad de los anticuerpos biespecíficos CD47xCEACAM5 de la presente invención para competir con los anticuerpos de referencia CEACAM5 se analiza mediante ELISA en CEACAM5 humano recombinante con un anticuerpo de referencia derivado de SM3E (documento US20050147614) que porta una región Fc de ratón (mAb producido usando procedimientos estándar). SM3E se une más a la parte distal de la membrana celular, N-terminal, del CEA.
Se recubre CEACAM5 humano biotinilado a 0,5 pg/ml en una placa de 96 pocillos recubierta con estreptavidina y se incuba con diluciones en serie del mAb de referencia (de 0,09 nM a 67 nM) o un mAb no relacionado que porta una región Fc de ratón durante 1 hora. Los anticuerpos biespecíficos CD47xCEACAM5 de la presente invención se añaden a 0,1 pg/ml durante 1 hora a temperatura ambiente. La placa se lava y los anticuerpos biespecíficos CD47xCEACAM5 unidos se detectan con una IgG(Fc)-HRP antihumana (Jackson ImmunoResearch). Después del lavado, la placa se revela con el reactivo Amplex Red. La señal de fluorescencia se mide en un lector de placas Synergy HT (Biotek).
Se realizaron experimentos de competencia con los anticuerpos biespecíficos CD47 * CEACAM5 de la presente invención. La unión de K2AC82, K2AC84, K2AC91, K2AC100 y K2AC117 se redujo mediante el anticuerpo competitivo respectivo (es decir, herramienta) en un 80% o más. Un anticuerpo biespecífico CD47xCEACAM5 se identifica en el presente documento como competitivo con el anticuerpo SM3E cuando la unión del anticuerpo biespecífico se reduce en un 80% o más con la concentración más alta del anticuerpo herramienta de referencia. Un anticuerpo biespecífico CD47xCEACAM5 se identifica como no competitivo con un anticuerpo herramienta en caso de que la unión a CEACAM5 se reduzca en menos del 20% si se comparan los resultados con y sin adición de un anticuerpo herramienta.
Ejemplo 5: Cuantificación de la densidad objetivo (es decir, número) de CEACAM5 y CD47 en la superficie celular de 6 líneas celulares de cáncer diferentes
Se midió la densidad objetivo (es decir, el número) de CEACAM5 y CD47 en la superficie celular de 6 líneas celulares de cáncer diferentes. Las líneas celulares analizadas fueron células de adenocarcinoma gástrico humano (MKN-45, DSMZ ACC 409), células de cáncer colorrectal humano (SK-CO-1 (ATCC; HTB-39); SNU-C1 (ATCC; CRL-5972); Ls174T (ATCC; CL-188) y LoVo (ATCC; CCL-229)), o células de adenocarcinoma pancreático (HPAF-II, ATCC, CRL-1997).
Se utilizó QIFIKIT® (Agilent Dako) para la determinación cuantitativa de antígenos de la superficie celular mediante citometría de flujo utilizando un ensayo de inmunofluorescencia indirecta. El QIFIKIT® consiste en una serie de 6 poblaciones de perlas recubiertas con cantidades diferentes, pero bien definidas, de un anticuerpo monoclonal (mAb) de ratón. Las perlas imitan a las células marcadas con un anticuerpo monoclonal primario de ratón específico. Se pueden marcar diferentes especímenes de células con diferentes anticuerpos primarios y después cuantificarlas utilizando el mismo conjunto de perlas de calibración.
Las células se cultivaron en su medio adaptado, se separaron con tripsina-EDTA (Sigma Aldrich), se centrifugaron (3 min, 350 g) y se resuspendieron en tampón fAc S frío (PBS, BSA al 2% - de Sigma Aldrich), se filtraron a través de 0,22 pm (Stericup, Millipore)) para obtener 3.106 células/ml. 3.105 células de cada muestra se sembraron en una placa con fondo en V. Se añadió 1 pl de reactivo de bloqueo de F<cy>R a cada pocilio y la placa se incubó a 4°C durante 10 minutos. Se añadieron a las células 10 pl de anticuerpo primario contra CEACAM5 humano (N° sc-23928; mIgGI (Santa Cruz)) y CD47 humano (producción interna; B6H12; columna vertebral de ratón), a una concentración final de 20 pg/ml, y se incubaron 30 min a 4°C. Las células se lavaron dos veces con 200 pl de PBS BSA al 2% y se centrifugaron a 400 g durante 3 min. Se lavaron 100 pl de perlas (configuración o calibración a partir de QIFIKIT®) junto con las células y se trataron de forma idéntica. Se añadieron 100 pl de anticuerpo secundario del kit (1/50 en PBS BSA al 2%) a cada pocillo y se incubaron durante 30 a 45 min a 4°C. Las células se centrifugaron (3 min, 400 g a 4°C) para descartar el sobrenadante y se lavaron dos veces. Después de la última centrifugación, las células se resuspendieron en 130 pl de CellFix y se adquirieron en un citómetro CytoFlex (Beckman Coulter). El análisis se realizó utilizando el programa informático FlowJo y las medias geométricas se exportaron a un archivo de Excel. Se realizó una regresión lineal utilizando valores de MFI de las perlas de calibración. La capacidad de unión a anticuerpos (ABC) de las células se extrapoló a partir de esta línea de regresión. La capacidad de unión a anticuerpos específicos (sABC) se obtuvo restando la ABC del control de isotipo a la de la tinción específica. Los datos de este análisis se presentan en la tabla 3 siguiente.
Tabla 3 Densidad ob etivo de CEACAM5 CD47 en la su erficie celular de 6 líneas celulares de cáncer
Ejemplo 6: Medición de la unión de anticuerpos biespecíficos CEAxCD47 a líneas celulares de cáncer que expresan CEACAM5 (CE<50>y unión máxima Emáx).
La unión de los anticuerpos biespecíficos CD47xCEACAM5 se analizó en células de adenocarcinoma gástrico humano que expresan CEACAM5 (por ejemplo, MKN-45), en células de cáncer colorrectal humano que expresan CEACAM5 (SK-C<o>-1,<SNU-C1, Ls174T y LoVo) y en células de adenocarcinoma de páncreas que expresan CEACAM5 (HPAF-II).>
Las células se recogieron, se contaron, se comprobó su viabilidad y se resuspendieron a 3x10® células/ml en tampón FACS (PBS BSA al 2%, NaN3 al 0,1%). Se distribuyeron 100 pl de la suspensión celular en placas de 96 pocillos con fondo en V (3 x 105 células/pocillo). El sobrenadante se eliminó mediante centrifugación durante 3 minutos a 4°C, 1300 rpm. Después se añadieron concentraciones crecientes del anticuerpo según la invención a los pocillos y se incubaron durante 15 minutos a 4°C. Las células se lavaron dos veces con tampón FACS frío y se volvieron a incubar durante 15 minutos más a 4°C con el anticuerpo secundario IgG Fc antihumano de ratón conjugado con PE (R-ficoeritrina) (SouthernBiotech, prediluido 1:100 en tampón FACS). Las células se lavaron dos veces con tampón FACS frío y se resuspendieron en 300 pl de tampón FACS con SytoxBlue diluido 1:15000 (Life Technologies). La fluorescencia, específicamente la actividad de fluorescencia media (MFI), se determinó utilizando un citómetro de flujo Cytoflex (Millipore). Las curvas de unión y los valores de CE50 y Emáx se obtuvieron y calcularon utilizando el programa informático GraphPad Prism7. Los datos de este análisis se presentan en la tabla 4 siguiente.
Tabla 4 CE<50>(nM) y unión Emáx(MFI) de 6 anticuerpos biespecíficos CD47xCEACAM5 en líneas celulares de cáncer humano que expresan CEACAM5 y CD47 (comparación K2AC22).
Líneas celulares Anticuerpos biespecíficos CD47xCEACAM5
2AC22 2AC8 2AC8 2AC9 2AC10 2AC117 SK-CO-1CE50 (nM) 24 17,3 12 12,7 14,7 14,7 máx (MFI*;x10 0,52 0,9 1 1,3 0,9 1,1MKN-45CE50 (nM) 21,3 10 7,3 8 8,7 8
máx (MFI*;x10 1,16 1,18 1,52 1,64 1,3 1,35HPAF-IICE50 (nM) 19,3 11,3 8,7 N/A 8 7,3 máx (MFI*;x10 0,67 0,94 1,27 N/A 1,1 1,2SNU-C1CE50 (nM) 10,7 4,4 2,47 2,53 3,27 3,13 máx (MFI*;x10 0,24 0,28 0,37 0,4 0,3 0,37Ls174TCE50 (nM) 28 11,3 5,6 6 4,5 6,7 máx (MFI*;x10 0,073 0,077 0,089 0 ,1 0,07 0,07LoVo CE50 (nM) 44 22 16 16 18,7 20
máx (MFI*;x10 0,23 0,26 0,36 0,38 0,28 0,32 *MFI - Intensidad media de fluorescencia
N/A - No aplicable - no hay datos disponibles para este Ab en esta línea celular
Los datos de la tabla 4 muestran que todos los anticuerpos biespecíficos según la invención muestran una CE50 considerablemente más reducida y una Emáx más alta en comparación con K2AC22.
Tal como se muestra en la tabla 4, los anticuerpos biespecíficos según la invención se unen a células SK-CO1 con un valor de CE50 de 10 a 30 nM, a células MKN-45 con un valor de CE5 de 5 a 15 nM, a células HPAF-II con un valor de CE5 de 5 a 15 nM, a células SNU-C1 con un valor de CE5 de 1 a 10, a células LS174T con un valor de CE5 de 3 a 15 nM y/o a células LoVo con un valor de CE5 de 15 a 25 nM.
También tal como se muestra en la tabla 4, los anticuerpos biespecíficos según la invención se unen a células SK-CO1 con un valor de Emáx de 0,5 a 1,5 (MFI x 106), a células MKN-45 con un valor de Emáx de 1 a 2 (MFI*106), a células HPAF-II con un valor de Emáx de 0,5 a 1,5 (MFI x 106), a células SNU-C1 con un valor de Emáx de 0,2 a 0,6 (MFI x 106), a células LS174T con un valor de Emáx de 0,05 a 0,2 (MFI x 106), y/o a células LoVo con un valor de Emáx de 0,2 a 0,5 (MFI x 106).
Ejemplo 7: Medición de fagocitosis (índice de fagocitosis) respectivamente de fagocitosis celular dependiente de anticuerpos (ADCP).
La actividad fagocíticain vitrode los anticuerpos biespecíficos CEACAM5xCD47 de la invención se evaluó utilizando 6 líneas celulares de cáncer que expresan CEACAM5 (MKN-45, SK-CO-1, SNU-C1, Ls174T, LoVo y HPAF-II). K2AC22 se evaluó con fines de comparación utilizando las mismas líneas celulares y procedimientos experimentales.
El ensayo se basa en un procedimiento basado en obtención de imágenes, que utiliza la plataforma de detección de alto contenido CellInsight CX5. La lectura evaluada es el índice de fagocitosis, definido como el número promedio de células diana engullidas por 100 macrófagos.
1. Preparación de los macrófagos:
Se aislaron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) humanas a partir de capas leucocitarias, de diferentes donantes sanos (de 5 a 7 donantes diferentes, dependiendo de la línea celular), mediante gradiente de Ficoll. Los macrófagos se generaron cultivando PBMC durante 7 a 9 días en medio completo (RPMI 1640, suero de ternera fetal inactivado por calor al 10% [Invitrogen]), L-glutamina 2 mM, piruvato de sodio 1 mM, tampón HEPES 10 mM, 25 mg/l de gentamicina (todos de Sigma-Aldrich) y 2-mercaptoetanol 50 mM (Thermo Fisher Scientific)) en presencia de 20 ng/ml de factor estimulante de colonias de macrófagos humanos (M-CSF) (PeproTech). Posteriormente, las células no adherentes se eliminaron en la fase de diferenciación (día+1) mediante el intercambio del medio de cultivo celular, y las células adherentes que representan macrófagos se separaron usando tampón de disociación celular (Sigma-Aldrich) y se lavaron en medio completo el día de su uso (día 7, día 8 o día 9) para el experimento ADCP basado en citometría. Para ADCP basado en obtención de imágenes celulares, los macrófagos se separaron el día 6 usando tampón de disociación celular y se sembraron a 30.000 por pocillo en una placa óptica de 96 (Costar).
2. Evaluación de la actividad de fagocitosis (ensayo basado en CellInsight™)
Los macrófagos (teñidos con calceína roja anaranjada) adheridos a los pocillos de la microplaca se incubaron conjuntamente con células tumorales diana marcadas con Calceína AM en una relación células efectoras:diana de 1:3 durante 30 minutos (MKN45 y SNU-C1) o 2,5 horas (LoVo y Ls174T) a 37 grados C en presencia de diferentes concentraciones de los anticuerpos analizados. Al final del periodo de incubación, los sobrenadantes se reemplazaron por medio de cultivo completo y se obtuvieron imágenes de las microplacas con una plataforma de detección de alto contenido CX5 CellInsight™. Se adquirieron y se analizaron 1500 macrófagos por pocillo. La fagocitosis se evidenció como eventos doblemente positivos (macrófago célula tumoral diana) y los índices de fagocitosis se calcularon mediante el programa informático CellInsight™ del fabricante.
Todos los resultados que se muestran en la figura 2 y las tablas 5, 6, 7, 8, 9 se obtuvieron con 4 líneas celulares de cáncer que expresan CEACAM5 (MKN-45, SNU-C1, Ls174T, LoVo); con una relación de célula efectora a célula diana/tumoral de 1:3.
Tabla 5 Porcentaje de aumento en el máximo del índice de fagocitosis evaluado para 5 anticuerpos biespecíficos CEACAM5xCD47 en comparación con el Ab biespecífico K2AC22.
Los cinco anticuerpos biespecíficos según la invención mostraron una mejor unión en comparación con K2AC22 (CE50 inferior y Emáx superior, véase el Ejemplo 6, tabla 4). Sorprendentemente, el aumento porcentual del índice de fagocitosis máximo alcanzado Emáx ADCP de los anticuerpos de la invención en comparación con K2AC22 fue más fuerte en las líneas celulares con baja expresión de CEACAM5 LoVo y Ls174T.
Estos resultados se obtuvieron en experimentos utilizando macrófagos obtenidos de diferentes donantes humanos. Los datos obtenidos de dichos experimentos se muestran en la tabla 6 (para células MKN-45), en la tabla 7 (para células SNU-C1), en la tabla 8 (para células Ls174T) y en la tabla 9 (para células LoVo).
Tabla 6 Evaluación in vitro de CE<50>(pg/ml) y Emáx de la actividad de fagocitosis de 6 anticuerpos biespecíficos CEACAM5xCD47 (K2AC82, K2AC84, K2AC91, K2AC100, K2AC117 y K2AC22 (comparación)) utilizando la línea celular de cáncer humano MKN-45 como diana con 7 donantes diferentes D de macrófa os.
Tabla 7 Evaluación in vitro de CE<50>(pg/ml) y Emáx a partir de la actividad de fagocitosis de 6 anticuerpos biespecíficos CEACAM5xCD47 (K2AC82, K2AC84, K2AC91, K2AC100 y K2AC117 y K2AC22) utilizando la línea celular de cáncer humano SNU-C1 como diana con 5 donantes D de macrófa os diferentes.
Tabla 8 CE<50>y Emáx de actividad de fagocitosis de 6 anticuerpos biespecíficos CD47xCEACAM5 en la línea celular de cáncer humano Ls174T con 5 donantes diferentes de macrófa os.
Tabla 9 CE<50>y Emáxde actividad de fagocitosis de 6 anticuerpos biespecíficos CD47xCEACAM5 en la línea celular de cáncer humano LoVo con 6 donantes diferentes de macrófa os.
Ejemplo 8: Medición de la competencia por la unión a CEACAM5 entre los anticuerpos biespecíficos de la invención y otros anticuerpos terapéuticos que se unen a CEACAM5.
Se realizó un ensayo de unión a células que expresan CEACAM5 tal como se describe en el Ejemplo 6. Este ensayo se puede usar para medir el desplazamiento de la curva de unión de los anticuerpos biespecíficos de la invención a líneas celulares de cáncer MKN-45 y LS174T si se añaden anticuerpos biespecíficos CEAxCD3 tales como cibisatamab o TCB2014 al ensayo de unión. Un anticuerpo se consideró no competitivo si 300 nM del anticuerpo desplazan la curva de unión de un anticuerpo biespecífico de la invención en menos de un factor de 3.
En este experimento, la unión dependiente de la concentración del anticuerpo biespecífico K2AC100 CD47xCEACAM5 se midió en presencia de mAb anti-CEACAM5, ya sea TCB2014 o TCB 2017. Esta unión se midió en la superficie celular de células MKN-45 que expresan CEACAM5. K2AC100 se marcó directamente con un fluorocromo para seguir su unión solo en células MKN-45 (línea oscura, círculos oscuros), en presencia de 300 nM de TCB2014 (línea oscura, triángulos oscuros) o 30 nM de TCB2017 (línea oscura, rombos negros). Se utilizaron controles negativos (Ctrl) (IgG1 en presencia de TCB2014 o TCB2017). Los resultados de este experimento se muestran en la figura 5. Estos datos muestran que hubo un desplazamiento mínimo o nulo de la curva de unión del anticuerpo biespecífico CEAxCD47 K2AC100 de la presente invención a células tumorales MKN-45 si se añaden 300 nM de TCB2014. Por lo tanto, el anticuerpo K2AC100 no es competitivo con los anticuerpos TCB2014 y TCB2017 con respecto a la unión a CEACAM5.
Ejemplo 9: Producción de anticuerpos biespecíficos afucosilados de la invención.Las tablas 10 y 11 muestran los resultados para la fagocitosis de dos líneas celulares (MKN-45 y SNU-C1) mediante versiones afucosiladas de los anticuerpos biespecíficos de la invención (CE50 y Emáx). Las versiones afucosiladas de los anticuerpos biespecíficos de la invención se produjeron y se purificaron mediante los siguientes procedimientos:
1. Producción
El conjunto de CHO transfectado con el plásmido para el anticuerpo biespecífico respectivo de la invención (para vectores, respectivamente, plásmidos, véase el Ejemplo 2) se inoculó a una concentración de células viables de 0,3 x 106 células/ml en un dispositivo Thomson erlen con un volumen de trabajo de 700 ml o 100 ml para la producción de anticuerpos fucosilados y afucosilados, respectivamente. Todos los conjuntos se operaron en un modo de lotes alimentados de 15 días de duración utilizando medio CDACF CDCHO y un régimen de alimentación adaptado. Para la producción de anticuerpos afucosilados, se añadió un bolo de inhibidor de fucosa (1,3,4-tri-O-acetil-2-desoxi-2-fluoro-L-fucosa) 200 pM los días 0, 5, 8 y 11 durante el proceso por lotes alimentados basado en la estrategia de afucosilación descrita por Rillahan et al. Nature Chem. Biol. 2012 Jul;8(7):661-8 y basada en el documento EP2282773. La recolección de los sobrenadantes de las mezclas de anticuerpos biespecíficos de la invención que contienen anticuerpos fucosilados o afucosilados se realizó después de 15 días de cultivo por lotes alimentados. Las recolecciones de sobrenadantes de conjuntos de CHO se clarificaron utilizando el Sistema Sartorius de recolección de células Lab VSartoclear Dynamics® (véanse las instrucciones del proveedor).
2. Purificación
La purificación de anticuerpos biespecíficos fucosilados y afucosilados de la invención se realizó mediante un proceso de purificación por afinidad de tres etapas. Antes de comenzar la purificación, se midió la concentración de anticuerpos en el sobrenadante de los conjuntos de anticuerpos biespecíficos utilizando OctetRED96 para utilizar columnas con el volumen apropiado de matriz de afinidad. Cada sobrenadante del conjunto de CHO clarificado que contenía anticuerpos<biespecíficos fucosilados o afucosilados se cargó en una columna MabSelect SuRe (MSS)>(G<e Healthcare) sin ajuste>previo, para eliminar la mayor parte de los contaminantes del cultivo celular. Después, el eluato de MSS se trató manteniendo un pH bajo para inactivar los virus y se neutralizó a pH 6 con Tris 1 M pH 9. Después se cargó el eluato de MSS en la columna LambdaFabSelect (LFS) (GE Healthcare) para eliminar<k>monoespecífico (mono<k>). Después se ajustó el pH del eluato de LFS a pH 6. El LFS se cargó en la columna Capto L (CL) (GE Healthcare) para eliminar A monoespecífico (mono A). El pH del eluato de CL se ajustó antes del almacenamiento. Después, el material final se concentró y se sometió a diafiltración en el tampón de formulación final, ajustándose su concentración utilizando Nanodrop. Se tomaron partes alícuotas de los anticuerpos biespecíficos fucosilados y afucosilados y se almacenaron a -80°C hasta su administración. Se analizó el tamaño de los anticuerpos biespecíficos purificados mediante electroforesis en condiciones desnaturalizantes y reductoras con el bioanalizador Agilent 2100 utilizando el kit Protein 80 tal como se describe por el fabricante (Agilent Technologies, Santa Clara, Calif., Estados Unidos). El nivel de agregación se evaluó mediante cromatografía de exclusión por tamaño (SEC-UPLC) utilizando el sistema ACQUITY UPLC H-Class Bio (Waters). El análisis de variantes de carga de anticuerpos biespecíficos purificados se realizó mediante la técnica de enfoque isoeléctrico(IEF)utilizando el sistema de electroforesis Multiphor II (GE Healthcare). La distribución relativa de glicoformas biantenarias complejas unidas a N de anticuerpos K2AC5 y K2AC22 fucosilados y afucosilados se determinó utilizando el procedimiento de microchip de procesamiento-CE en el LabChip GXII Toque (Perkin Elmer). Todos los anticuerpos se analizaron para detectar contaminación por endotoxinas utilizando la prueba de lisado de amebocitos de Limulus (LAL; Charles River Laboratories, Wilmington, Mass). Los anticuerpos biespecíficos afuc de la invención mostraron una afucosilación >70%.
Estos anticuerpos biespecíficos CEAxCD47 afucosilados se usaron para obtener los resultados mostrados en las tablas 10 y 11 y en las figuras 3A y 3B.
3. Otros procedimientos para producir anticuerpos biespecíficos afucosilados de la invención
3.1 Utilizando la línea celular de producción negativa FUT 8
Alternativamente, y según el conocimiento de los inventores, los anticuerpos biespecíficos afucosilados según la invención también se pueden producir según el procedimiento siguiente:
El material y los procedimientos están de acuerdo con Naoko Yamane-Ohnuki et al., Biotech. Bioeng.; 87 (2004) 614 622.
Aislamiento del ADNc de FUT8 de hámster chino
Según el conocimiento de los inventores, el ARN total se aísla de células CHO/DG44 utilizando el sistema RNeasy® Mini Kit (Qiagen, Hilden, Alemania) y transcripción inversa con oligo-dT utilizando un sistema de síntesis de primera cadena Superscript para la reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa (RT-PCR) (Invitrogen, Carlsbad, CA). El ADNc de FUT8 de hámster chino se amplifica a partir de ADNc de células CHO/DG44 monocatenarias mediante PCR utilizando los cebadores
5V-GTCTGAAGCATTATGTGTTGAAGC-3V (SEQ ID NO: 45) y
5V-GTGAGTACATTCATTGTACTGTG-3V (SEQ ID NO: 46), diseñados a partir del ADNc de FUT8 murino (Hayashi, 2000; DNA Seq 11:91-96).
Constructo de direccionamiento del locus FUT8
Según el conocimiento de los inventores, la alteración dirigida del gen FUT8 en células CHO/DG44 se lleva a cabo utilizando dos vectores de sustitución, pKOFUT8Neo y pKOFUT8Puro. El fragmento de 9,0 kb del gen FUT8 que incluye el primer exón codificante se aísla examinando la biblioteca genómica E de células CHO-K1 (Stratagene, La Jolla, CA) con el ADNc de FUT8 del hámster chino como sonda para establecer los constructos de direccionamiento. Un segmento de 234 pb que contiene el sitio de inicio de la traducción se reemplaza por el casete del gen de resistencia a la neomicina (Neor) o el casete del gen de resistencia a la puromicina (Puror) del plásmido pKOSelectNeo o pKOSelectPuro (Lexicon, TX), respectivamente, flanqueados por sitios loxP. El casete del gen de la toxina diftérica (DT) del plásmido pKOSelectDT (Lexicon) se inserta en la región homóloga 5V. Los constructos de direccionamiento resultantes, pKOFUT8Neo y pKOFUT8Puro, incluían la secuencia homóloga de 5V de 1,5 kb y la secuencia homóloga de 3V de 5,3 kb. Antes de la transfección, los constructos de direccionamiento se linealizan en un sitio SalI único.
Transfección y detección de recombinantes homólogos
Según el conocimiento de los inventores, se electroporan células CHO/DG44 subconfluentes (1,6 x 106) con 4 Ag de pKOFUT8Neo linealizado a 350 V y 250 AF usando un Bio-Rad GenePulser® II. Después de la electroporación, los transfectantes se seleccionan con 600 Ag/ml de G418 (Nacalai Tesque, Kyoto, Japón). La PCR genómica se realiza en placas de 96 pocillos mediante el procedimiento de microextracción modificado notificado anteriormente (Ramirez-Solis et al., 1992; Anal Biochem 201:331-335.) usando los cebadores siguientes:
5V-TTGTGTGACTCTTAACTCTCAGAG-3V (SEQ ID NO: 47) y
5V-GAGGCCACTTGTGTAGCGCCAAGTG-3V (SEQ ID NO: 48).
Los recombinantes homólogos se identifican mediante el fragmento de 1,7 kb obtenido mediante PCR genómica y se confirman mediante análisis de inmunotransferencia Southern utilizando el fragmento de 221 pb amplificado con los siguientes cebadores:
5V-GTGAGTCCATGGCTGTCACTG-3V (SEQ ID NO: 49) y
5V-CCTGACTTGGCTATTCTCAG-3V (SEQ ID NO: 50).
El clon hemicigoto se somete a una segunda ronda de recombinación homóloga utilizando pKOFUT8Puro linealizado y selección de fármaco con 15 Ag/ml de puromicina (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) tal como se ha descrito anteriormente. Los disruptores homocigotos identificados se electroporan con el vector de expresión Cre-recombinasa pBS185 (Invitrogen) para eliminar los casetes del gen de resistencia a los fármacos de ambos alelos FUT8.
Producción de anticuerpos monoclonales por células FUT8(-)
Según el conocimiento de los inventores, las líneas celulares FUT8(-) se electroporan con un vector de expresión que codifica un anticuerpo biespecífico según la invención y se seleccionan en medios carentes de hipoxantina y timidina. Los transfectantes confluentes se cultivan en Medio Ex-Cell® 301 (JRH Biosciences, Lenexa, KS) durante 1 semana. El anticuerpo se purifica a partir de sobrenadantes de cultivo utilizando MabSelect™ (Amersham Biosciences, Piscataway, Nueva Jersey). Otras etapas de purificación pueden ser cromatografía de intercambio aniónico/catiónico, cromatografía de exclusión molecular y especialmente purificación usando resinas selectivas kappa o lambda tal como se ha descrito anteriormente.
3,2. Mediante la recuperación de fucosa extracelular del medio celular de producción más intervención enzimática con la biosíntesis de fucosa intracelular
Preferentemente, y según el conocimiento de los inventores, los anticuerpos biespecíficos afucosilados de la invención también se pueden producir según el procedimiento/tecnología siguiente, que se describe en el documento US8642292. Esta tecnología está diseñada para configurar la integración estable de una enzima bacteriana heteróloga en una línea celular productora de anticuerpos tal como una línea celular CHO u otras. De este modo se bloquea la síntesisde novode fucosa a partir de D-manosa. Si además las células de producción se cultivan en un medio carente de fucosa, se producen como resultado anticuerpos con un nivel estable de afucosilación.
En las células eucariotas la fucosa se genera a través de dos rutas,
a) desde el espacio extracelular o lisosoma a través de la vía de rescate y
b) por síntesis de novo de fucosa a partir de D-manosa en la vía de síntesis de novo de fucosa
La vía de rescate puede bloquearse completamente mediante la omisión de fucosa del medio de cultivo. La vía de biosíntesisde novose puede bloquear convirtiendo la PIB-4-ceto-6-desoxi-D-manosa intermedia de esta vía en GDP-D-ramnosa en lugar de GDP-4-ceto-6-desoxi-D-galactosa. Esto se realiza llevando la enzima bacteriana GDP-6-desoxi-D-lixo-4-hexulosa reductasa (RMD) a la línea celular de producción, respectivamente mediante la integración estable del gen que codifica RMD en la línea celular de producción. Incluso cantidades bastante bajas de RMD expresadas en la línea celular de producción bloquean completamente la vía de síntesisde novode la célula de producción.
Esta tecnología se utilizará para construir líneas celulares de producción, por ejemplo líneas celulares basadas en CHO, diseñadas para la producción de anticuerpos afucosilados de la invención, así como líneas celulares de producción existentes que ya producen anticuerpos de la invención y están diseñadas para producir anticuerpos con un contenido de fucosa reducido entre el 80% y el 100%.
Todos los resultados mostrados en las figuras 3A y 3B y las tablas 10 y 11 se obtuvieron con 2 líneas celulares de cáncer que expresan CEACAM5 (MKN-45 y SNU-C1); con una relación de célula efectora a célula diana/tumoral de 1:3. Estos resultados se obtuvieron en experimentos utilizando macrófagos obtenidos de tres donantes humanos diferentes. Los datos obtenidos de dichos experimentos se muestran en la tabla 10 (para células MKN-45) y en la tabla 11 (para células SNU-C1).
Tabla 10 Evaluaciónin vitrode CE<50>(pg/ml) y Emáx(índice máximo de fagocitosis) a partir de la actividad de fagocitosis de 6 anticuerpos biespecíficos c Ea CAM5xCD47 afucosilados (K2AC82 afuco, K2AC84 afuco, K2AC91 afuco, K2AC100 afuco, K2AC117 afuco y K2AC22 afuco (comparación)) utilizando la línea celular de cáncer humano MKN45 como diana con 2 donantes diferentes D de macrófa os
Tabla 11 Evaluaciónin vitrode CE<50>(pg/ml) y Emáxa partir de la actividad de fagocitosis de 6 anticuerpos biespecíficos CEACAM5xCD47 afucosilados (K2AC82 afuco, K2AC84 afuco, K2AC91 afuco, K2AC100 afuco, K2AC117 afuco y K2AC22 afuco (comparación)) utilizando la línea celular de cáncer humano SNU-C1 como diana con 2 donantes diferentes D de macrófa os.
Ejemplo 10:
Bloqueo de la interacción de SIRPa con CD47 en células tumorales.
Configuración experimental para la medición de la potencia de inhibición de SIRPa (CI50) de los anticuerpos biespecíficos de la presente invención:
Para la detección de la actividad de bloqueo se utilizó el ensayo basado en células que supervisa la interacción de SIRPa soluble con CD47 humano expresado en la superficie de células MKN-45 tal como se describe a continuación. Los experimentos de concentración-respuesta con anticuerpos biespecíficos según la invención permitieron la determinación de las curvas de inhibición (véase la figura 4) y de los valores de CI50 (véase la tabla 12).
Las células de cáncer MKN-45, que expresan CD47 y CEACAM5, se tiñeron con violeta CFSE para permitir que el sistema de obtención de imágenes (CX5) detectara las células. Brevemente, se sembraron 3.000 células MKN-45 teñidas por pocillo en una placa de 384 pocillos ópticos (Costar) y se incubaron durante 50 minutos con concentraciones aumentadas de anticuerpos biespecíficos de la invención (1,9 pM a 333 nM, por cuadruplicado). Después, se añadió una concentración fija de SIRPa-Fc de ratón premezclada con anticuerpo anti-IgG-Fc de ratón acoplado AF647 (Jackson Immunoresearch diluido 1:2000) a 50 ng/ml finales. Después de una incubación de 3 horas y 30 minutos, se adquirieron imágenes de las señales de fluorescencia emitidas por el SIRPa unido detectado en las placas con el sistema de obtención de imágenes (CX5, Thermo Fisher). Las señales de fluorescencia (intensidad media de fluorescencia MFI) se representaron según el intervalo de dosis analizado y el programa informático (Prism, GraphPad) calculó la CI50. Los resultados se muestran en la tabla 12:
Tabla 12 CI<50>(nM) medida con el ensayo de bloqueo de CD47/SIRPa para 5 anticuerpos biespecíficos CEACAM5xCD47 de la presente invención (K2AC82, K2AC84, K2AC91, K2ACl0o y K2AC117) en comparación con el anticuerpo biespecífico CEAxCD47 K2AC22 del estado de la técnica (usando MKN-45 como células que expresan hCD47.
Ejemplo 11: Procedimiento de organoides para a. obtener la expresión de CEACAM5 en células de cáncer a partir de muestras recientes de pacientes con cáncer (datos de Qifikit) y b. para obtener datos de fagocitosis
Los organoides derivados de muestras primarias de pacientes se prepararon como suspensión de células individuales mediante procedimientos estándar (digestión enzimática y/o disociación mecánica). Se añadieron a las células 10 pl de anticuerpo primario anti-CEACAM5 humano ((N° sc-23928; mIgGI (Santa Cruz); concentración final 20 pg/ml) y se incubaron durante 30 minutos a 4°C. Las células se lavaron y se centrifugaron. Se lavaron 100 pl de perlas (configuración o calibración a partir de QIFIKIT®) junto con las células y se trataron de forma idéntica. Se añadieron 100 pl de anticuerpo secundario del kit (1/50 en PBS BSA al 2%) a cada pocillo y se incubaron durante 30 a 45 min a 4°C. Las células se centrifugaron para descartar el sobrenadante y se lavaron dos veces. Después de la última centrifugación, se resuspendieron las células adquiridas en un citómetro. El análisis se realizó mediante un programa informático específico y medias geométricas exportadas a un archivo Excel. Se realizó una regresión lineal utilizando valores de MFI de las perlas de calibración. La capacidad de unión a anticuerpos (ABC) de las células se extrapoló a partir de esta línea de regresión. La capacidad de unión a anticuerpos específicos (sABC) se obtuvo restando la ABC del control de isotipo a la de la tinción específica.
Se ha descubierto que la expresión promedio de CEACAM5 de estos organoides primarios es de 28.000 dianas CEACAM5 por célula, es decir, un factor de aproximadamente 4 veces inferior a la expresión promedio en las líneas celulares de la tabla 5.
Los organoides derivados de muestras primarias de pacientes con cáncer también se pueden usar para estudiar fagocitosis dependiente de la concentración/índice de fagocitosis si se añaden anticuerpos biespecíficos de la invención y macrófagos de donantes humanos (véase el Ejemplo 7). Usando los mismos procedimientos, según el conocimiento de los inventores, también se pueden estudiar combinaciones de los anticuerpos biespecíficos de la invención con anticuerpos biespecíficos CEAxCD3 si también se añaden células T de donantes humanos.
Ejemplo 12: Actividad antitumoral: cultivos de rodajas de tejido.
Según el conocimiento de los inventores, la actividad antitumoral de un anticuerpo biespecífico según la invención se puede evaluar como principio activo individual así como en tratamiento de combinación, respectivamente, en cultivos de rodajas de tejido tumoral (véase Sonnichsen et al., Clinical Colorectal Cancer 2018) de pacientes diagnosticados con tumores que expresan CEA.
1. Cultivo y tratamiento de rodajas de tejido.
Las muestras de tejido tumoral fresco se cortan y se manipulan tal como se ha publicado previamente (Sonnichsen et al., Clinical Colorectal Cancer 2018). En resumen, inmediatamente después de la resección quirúrgica y la primera evaluación patológica macroscópica, las muestras de tumor se cortan en rodajas de 350 pm utilizando un cortador de tejido. Después se estandariza el diámetro de la rodaja de tejido utilizando una herramienta de extracción de núcleos de 3 mm. Se agrupan aleatoriamente tres rodajas de tejido, se colocan sobre insertos de membrana y se cultivan en placas de 6 pocillos. Las rodajas se incuban en condiciones estandarizadas de 37°C y el 5% de CO2. Después del precultivo en medio de cultivo celular estándar, los tripletes de rodajas se exponen a anticuerpos biespecíficos según la invención individualmente o en combinación (por ejemplo, con inhibidores de PD-L1), respectivamente, durante hasta 120 horas. Después de la exposición al compuesto, las rodajas de tumor se fijan durante la noche usando paraformaldehído al 4%.
2. Tinción
Se embeben rodajas fijadas con paraformaldehído en parafina y se procesan en secciones de 5 pm. La tinción con hematoxilina y eosina (HE) se realiza para evaluar los aspectos histopatológicos y la proporción de células tumorales. El recuento celular general, el recuento de células tumorales y la proliferación se analizan mediante tinción inmunofluorescente. En resumen, se desparafinan secciones de parafina. Después de la recuperación del antígeno, las secciones se lavan con PBS/TritonX al 0,3% y se bloquean con suero de cabra normal al 5% durante 30 minutos. Anticuerpos primarios contra citoqueratinas (AE1
1>
3), Ki67 y PARP escindida, respectivamente, se diluyen en albúmina sérica bovina al 0,5% y se incuban a 4°C durante la noche. Las secciones se enjuagan con solución salina tamponada con fosfato al 0,3%/TritonX y se marcan con anticuerpos secundarios. Los núcleos se tiñen con Hoechst 33342. Se pueden incluir tinciones adicionales (por ejemplo, para la expresión de CEA).
3. Análisis de los datos
Se toman cinco imágenes (20x) por rodaja de tejido a partir de secciones teñidas con fluorescencia utilizando un microscopio fluorescente. El recuento de píxeles positivos se determina para las tinciones Hoechst 33342, citoqueratina, Ki67 y PARP escindida con algoritmos de segmentación específicos de la tinción. El área del tumor en proliferación/apoptótico se calcula analizando píxeles de núcleos positivos para Ki67/PARP escindida rodeados por píxeles positivos para citoqueratina. Para cada imagen, se calcula el recuento total de células (positivas a Hoechst), el recuento de células tumorales (positivas a Hoechst y citoqueratina) y el recuento de células tumorales en proliferación (positivas a Hoechst, citoqueratina y Ki67/PARP escindida). El recuento de células tumorales se normaliza con respecto al recuento de células totales y el recuento de células tumorales en proliferación se normaliza con respecto al recuento de células tumorales para considerar diferentes fracciones de células tumorales por imagen. Después, los valores medios de rodajas se calculan a partir de valores de imágenes individuales. Los valores medios de las condiciones se calculan utilizando valores medios de rodajas.
Ejemplo 13: Actividad antitumoral in vivo.
Según el conocimiento de los inventores, la actividad antitumoral de un anticuerpo biespecífico según la invención puede evaluarse como principio activo individual así como en tratamiento de combinación, respectivamente, en ratones transgénicos.
1. Generación de líneas celulares y pruebas de crecimiento.
Se generará una línea celular hCEACAM5(Tg)hCD47(Tg)mCD47(ko), por ejemplo basada en las líneas celulares de cáncer de colon murino CT26 o MC38. La desactivación (KO) del gen CD47 endógeno de ratón se realiza utilizando CRISPR/Cas9 con el posterior aislamiento de clones KO mediante clasificación celular. Se realiza la transfección de los clones KO con un casete que impulsa la expresión tanto de hCD47 como de hCEACAM5 utilizando un sitio de entrada de ribosoma interno (IRES), seguido del aislamiento de clones modificados genéticamente basándose, por ejemplo, en niveles y relación de expresión general. Se seleccionarán tres clones validados para analizar posteriormente su injerto/tumorigenicidadin vivopara la selección del clon final.
2. Actividad antitumoral in vivo
Cepas de ratones de fondo BALB/cJGpt que expresan CD3e humano (ratones BALB/c-hCD3ET/Wt heterocigotos To0l550) y CD47 humano/SIRPa humano (ratones BALB/c-hCD47/hSIRPa homocigotos T037264) están disponibles en GemPharmatech. Alternativamente, las cepas de ratones de fondo C57BL/6/Bcgen que expresan CD3e humano (ratones B-hCD3E homocigotos) y CD47 humano/SlRPa humano (ratones B-hSIRPa/hCD47 homocigotos) están disponibles en Biocytogen. Las dos cepas de ratón se cruzarán para obtener ratones hCD3e/hSIRPa/hCD47 triplemente humanizados, y la descendencia se usará para experimentos posteriores para analizar un anticuerpo biespecífico según la invención, ya sea como principio activo único o en tratamiento de combinación.
Se inoculan ratones hCD3e/hSIRPa/hCD47 triplemente humanizados con la línea celular CT26-hCEACAM5(Tg)hCD47(Tg)mCD47(ko) (fondo BALB/c) o con la línea celular MC38-hCEACAM5(Tg)hCD47(Tg)mCD47(ko) (fondo C57BL/6) el día 0. Una vez que el tamaño medio del tumor en la cohorte alcanza, por ejemplo, 200 mm3, el tratamiento con un anticuerpo biespecífico según la invención como principio activo individual así como en combinación se inicia por vía i.v. en embolada en un intervalo de, por ejemplo, 2 tratamientos/semana hasta que un ratón muestre un volumen tumoral de por ejemplo, más de 3000 mm3 o acontezca uno o más de los criterios de valoración de cuidado y protección animal preespecificados. El volumen del tumor y el peso corporal se miden tres veces por semana. El volumen del tumor se expresa en mm3 utilizando la fórmula siguiente: TV = 0,5 a x b2, en la que a y b son los diámetros largo y corto del tumor, respectivamente.
Claims (27)
1. Un anticuerpo biespecífico, que comprende una primera parte de unión que se une específicamente a CEACAM5 humano y una segunda parte de unión que se une específicamente a CD47 humano caracterizado por que
a) la primera parte de unión comprende como región variable de cadena pesada una región variable de cadena pesada que comprende una CDRH1 de SEQ ID NO: 1, una CDRH2 de SEQ ID<n>O: 2 y una CDRH3 de SEQ ID NO: 3, b) la primera parte de unión comprende como región variable de cadena ligera una región variable de cadena ligera que comprende un conjunto de CDRL seleccionado del grupo que consiste en
una CDRL1 de SEQ ID NO: 17, una CDRL2 de SEQ ID NO: 18 y una CDRL3 de SEQ ID NO: 19, o
una CDRL1 de SEQ ID NO: 23, una CDRL2 de SEQ ID NO: 24 y una CDRL3 de SEQ ID NO: 25, y
c) la segunda parte de unión comprende como región variable de cadena pesada una región variable de cadena pesada que comprende una CDRH1 de SEQ ID NO: 1, una CDRH2 de SEQ ID NO: 2 y una CDRH3 de SEQ ID NO: 3, y como región variable de cadena ligera una región variable de cadena ligera que comprende una CDRL1 de SEQ ID NO: 7, una CDRL2 de SEQ ID NO: 8 y una CDRL3 de SEQ ID NO: 9.
2. Un anticuerpo biespecífico según la reivindicación 1, caracterizado por que comprende una primera parte de unión que se une específicamente a CEACAM5 humano y una segunda parte de unión que se une específicamente a CD47 humano, caracterizado por que comprende en la primera parte de unión como región variable de cadena pesada una región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 4 y como región variable de cadena ligera una región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 33 o SEQ ID NO: 35 y por que comprende en la segunda parte de unión como región variable de cadena pesada una región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 4 y como región variable de cadena ligera una región variable de cadena ligera que tiene la s Eq ID NO: 10.
3. Un anticuerpo biespecífico que comprende una primera parte de unión que se une específicamente a CEACAM5 humano y una segunda parte de unión que se une específicamente a CD47 humano, caracterizado por que comprende en la primera parte de unión como región variable de cadena pesada una región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 4 y como región variable de cadena ligera una región variable de cadena ligera seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34 y SEQ ID NO: 36 y por que comprende en la segunda parte de unión como región variable de cadena pesada una región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 4 y como región variable de cadena ligera una región variable de cadena ligera que tiene la SEQ ID NO: 10.
4. El anticuerpo biespecífico según la reivindicación 2, caracterizado por que comprende en la primera parte de unión una cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 5 y una cadena ligera seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 38 o la SEQ ID NO: 40 y por que comprende en la segunda parte de unión una región de cadena pesada de SEQ ID NO: 5 y una cadena ligera que tiene la SEQ ID NO: 11.
5. El anticuerpo biespecífico según la reivindicación 3, caracterizado por que comprende en la primera parte de unión una cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 5 y una cadena ligera seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 37, la SEQ ID NO: 39 y la SEQ ID NO: 41 y por que comprende en la segunda parte de unión una región de cadena pesada de SEQ ID NO: 5 y una cadena ligera que tiene la SEQ ID NO: 11.
6. El anticuerpo biespecífico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicho anticuerpo es monovalente para la primera parte de unión y monovalente para la segunda parte de unión.
7. El anticuerpo biespecífico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que dicho anticuerpo comprende una región Fc que se ha modificado mediante glucoingeniería para que tenga un número reducido de residuos de fucosa en comparación con el mismo anticuerpo biespecífico que no se ha modificado mediante glucoingeniería.
8. El anticuerpo biespecífico de la reivindicación 1, caracterizado por una relación de los valores de KD para la unión a CEACAM3 recombinante y CEACAM5 recombinante de un factor de 100 o superior.
9. El anticuerpo biespecífico de la reivindicación 1, caracterizado por un aumento de al menos el 8% en el máximo del índice de fagocitosis de células tumorales LoVo en comparación con el índice de fagocitosis del anticuerpo biespecífico K2AC22, que comprende una cadena pesada común de SEQ ID NO: 6, una cadena ligera de la parte de unión a CD47 de SEQ ID NO: 42, y una cadena ligera de unión a CEACAM5 de SEQ ID NO: 11.
10. El anticuerpo biespecífico de la reivindicación 9, caracterizado por un aumento en el máximo del índice de fagocitosis de entre el 8% y el 20% para células tumorales LoVo.
11. El anticuerpo biespecífico de la reivindicación 1, caracterizado por que inhibe la interacción entre CD47 y SIRPa en células MKN-45 con una CI50 de 0,1 nM o inferior.
12. El anticuerpo biespecífico de la reivindicación 11, caracterizado por que inhibe la interacción entre CD47 y SIRPa en células MKN-45 con una CI50 de 0,1 nM a 0,04 nM.
13. El anticuerpo biespecífico de la reivindicación 1, en el que dicho anticuerpo biespecífico se caracteriza por que cibisatamab en una concentración de 300 nM no desplaza la CE50 de la curva de unión de dicho anticuerpo biespecífico a células MKN-45 o células LS174T en más de un factor de 3 hacia concentraciones más altas.
14. Un polinucleótido aislado o un conjunto de polinucleótidos que codifican un anticuerpo biespecífico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13.
15. Un vector de expresión que comprende el polinucleótido o los polinucleótidos de la reivindicación 14.
16. Una célula huésped que comprende el vector de expresión de la reivindicación 15.
17. Un procedimiento para la producción de un anticuerpo biespecífico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, que comprende a) cultivar una célula huésped según la reivindicación 16 en condiciones que permitan la producción de dicho anticuerpo biespecífico, y b) aislar dicho anticuerpo.
18. El anticuerpo biespecífico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 para su uso en una terapia de un cáncer humano.
19. Un anticuerpo biespecífico para su uso según la reivindicación 18, caracterizado por que el cáncer es un cáncer sólido.
20. Un anticuerpo biespecífico para su uso según la reivindicación 19, caracterizado por que el cáncer es un cáncer colorrectal, NSCLC (cáncer de pulmón de células no pequeñas), cáncer gástrico, cáncer de páncreas, cáncer de mama u otro cáncer que expresa CEACAM5.
21. El anticuerpo biespecífico de una cualquiera de las reivindicaciones 1-13 para su uso en combinación simultánea, separada o secuencial con un segundo anticuerpo biespecífico que comprende una tercera parte de unión que se une específicamente a CEACAM5 humano y una cuarta parte de unión que se une específicamente a CD3s humano en el tratamiento de un sujeto que tiene un cáncer que expresa CEACAM5.
22. El anticuerpo biespecífico de la reivindicación 21, en el que el segundo anticuerpo biespecífico es cibisatamab.
23. El anticuerpo biespecífico para su uso según la reivindicación 21 o 22, caracterizado por que el anticuerpo biespecífico según la invención y el segundo anticuerpo biespecífico se administran a dicho sujeto simultáneamente en intervalos de 6 a 15 días.
24. Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo biespecífico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 y un excipiente o vehículo farmacéuticamente aceptable.
25. La composición farmacéutica de la reivindicación 24, para su uso como medicamento.
26. La composición farmacéutica de la reivindicación 24, para su uso como medicamento en el tratamiento de un cáncer sólido.
27. La composición farmacéutica de la reivindicación 24 para su uso como medicamento en el tratamiento de cáncer colorrectal, NSCLC (cáncer de pulmón de células no pequeñas), cáncer gástrico, cáncer de páncreas o cáncer de mama.
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CA2691357C (en) | 2007-06-18 | 2014-09-23 | N.V. Organon | Antibodies to human programmed death receptor pd-1 |
CN104548091A (zh) | 2008-02-11 | 2015-04-29 | 治疗科技公司 | 用于肿瘤治疗的单克隆抗体 |
WO2009114335A2 (en) | 2008-03-12 | 2009-09-17 | Merck & Co., Inc. | Pd-1 binding proteins |
AU2009242453B2 (en) | 2008-05-02 | 2014-12-04 | Seagen Inc. | Methods and compositions for making antibodies and antibody derivatives with reduced core fucosylation |
EA023148B1 (ru) | 2008-08-25 | 2016-04-29 | Эмплиммьюн, Инк. | Композиции на основе антагонистов pd-1 и их применение |
EP2324055A2 (en) | 2008-08-25 | 2011-05-25 | Amplimmune, Inc. | Pd-1 antagonists and methods of use thereof |
HUE042901T2 (hu) | 2008-09-17 | 2019-07-29 | Xencor Inc | Készítmények és eljárások IgE által közvetített rendellenességek kezelésére |
EP4169951A1 (en) | 2008-12-09 | 2023-04-26 | F. Hoffmann-La Roche AG | Anti-pd-l1 antibodies and their use to enhance t-cell function |
US8287865B2 (en) | 2009-09-16 | 2012-10-16 | Immunomedics, Inc. | Class I anti-CEA antibodies and uses thereof |
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UA115030C2 (uk) | 2011-03-02 | 2017-09-11 | Рош Глікарт Аг | Антитіло, яке зв'язується зі зв'язаним з мембраною карциноембріональним антигеном (сеа) |
WO2013012414A1 (en) | 2011-07-18 | 2013-01-24 | Medimmune, Llc | Dosing regimens for treatment of cea-expressing cancers |
KR20190133790A (ko) | 2011-08-01 | 2019-12-03 | 제넨테크, 인크. | Pd-1 축 결합 길항제 및 mek 억제제를 사용하는 암 치료 방법 |
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JP6740244B2 (ja) | 2015-03-31 | 2020-08-12 | ノビミューン エスアー | ヘテロ多量体タンパク質複合体のアセンブリおよび産生を最適化する方法 |
CA2990755A1 (en) | 2015-10-02 | 2017-04-06 | F. Hoffman-La Roche Ag | Bispecific anti-ceaxcd3 t cell activating antigen binding molecules |
GB2546072B (en) | 2016-01-05 | 2019-07-10 | Bja Trading Ltd | Attachment assembly and method of using same |
WO2017118675A1 (en) | 2016-01-08 | 2017-07-13 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Methods of treating cea-positive cancers using pd-1 axis binding antagonists and anti-cea/anti-cd3 bispecific antibodies |
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