BR112020022595A2 - anticorpos específicos para gucy2c e usos dos mesmos - Google Patents

anticorpos específicos para gucy2c e usos dos mesmos Download PDF

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Gurkan Guntas
Madan Katragadda
Divya Mathur
Adam Reid ROOT
Lidia Mosyak
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Abstract

“anticorpos específicos para gucy2c e usos dos mesmos”. a presente invenção refere-se a anticorpos que especificamente se ligam a gucy2c e usos dos mesmos no tratamento do câncer. a presente invenção também fornece novos anticorpos biespecíficos compreendendo tais anticorpos e usos dos mesmos no tratamento de câncer.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para “ANTI- CORPOS ESPECÍFICOS PARA GUCY2C E USOS DOS MESMOS”.
LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS
[001] Este pedido está sendo preenchido eletronicamente via EFS- Web e inclui uma listagem de sequência enviada eletronicamente em formato .txt. O arquivo .txt contém uma listagem de sequência intitulada "PC72377-PRV2_Sequência_Listing_ST25_05142019.txt" criada em 14 de maio de 2019 e com um tamanho de 738 KB. A listagem de se- quência contida neste arquivo .txt é parte do relatório descritivo e é in- corporada neste documento por referência em sua íntegra.
CAMPO DA INVENÇÃO
[002] A presente invenção refere-se a anticorpos, por exemplo, an- ticorpos de tamanho natural ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, que se ligam especificamente a GUCY2c (Guanilil ciclase C) e/ou CD3 (Cluster de Diferenciação 3). A presente invenção refere-se ainda a anticorpos biespecíficos que se ligam especificamente a CD3 e a um antígeno de células tumorais (por exemplo, anticorpos biespecífi- cos que se ligam especificamente a CD3 e GUCY2c). A presente inven- ção também se refere a moléculas relacionadas, por exemplo, ácidos nucleicos que codificam tais anticorpos ou anticorpos biespecíficos, composições e métodos relacionados, por exemplo, métodos para pro- duzir e purificar tais anticorpos e anticorpos biespecíficos, e seu uso em diagnósticos e terapêuticas.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
[003] O câncer é a principal causa de morte em todo o mundo, sendo responsável por mais de 7 milhões de mortes a cada ano. A mor- talidade por câncer está quase universalmente relacionada à dissemi- nação de tumores primários para sítios distantes formando metástases e, em finalmente levando à morte. Isso é particularmente verdadeiro para câncer gastrointestinal, incluindo adenocarcinoma de esôfago, es- tômago, cólon e reto. O câncer colorretal (CRC) continua sendo o quarto câncer mais diagnosticado e a segunda principal causa de morte por câncer nos Estados Unidos (Siegel RL, Miller KD, Jemal A. Cancer sta- tistics, 2016. CA Cancer J Clin., 66: 7–30, 2016). Em todo o mundo, o câncer colorretal é responsável por até 1,2 milhões de novos casos e
600.000 mortes por ano (Brenner H, Kloor M, Pox CP. Câncer colorretal. Lancet, 383: 1490502, 2014).
[004] A guanilil ciclase C (GUCY2c) (também conhecida como STAR, Receptor ST, GUC2C, GUCY2C, GC-C e GCC) é um receptor de superfície celular de transmembrana que atua na manutenção do flu- ido intestinal, homeostase eletrolítica e proliferação celular (Carrithers et al., Proc Natl Acad Sci USA 100: 3018-3020, 2003; Mann et al., Bio- chem Biophys Res Commun 239: 463-466, 1997; Pitari et al., Proc Natl Acad Sci USA 100: 2695-2699, 2003); Nº de acesso GenBank NM.sub.- 004963 e Nº de acesso GenPept NP-004954). Esta função é mediada através da ligação de guanilina (Wiegand et al. FEBS Lett. 311: 150- 154, 1992) e uroguanilina (Hamra et al. Proc Natl Acad Sci USA 9 (22): 10464-10468, 1993). GUCY2c também é um receptor para enterotoxina estável ao calor (ST) que é um peptídeo produzido por E. coli, bem como outros organismos infecciosos (Rao, MC Ciba Found. Symp. 112: 74- 93, 1985; Knoop FC e Owens, MJ Pharmacol. Toxicol. Methods 28: 67- 72, 1992). A ligação de ST a GUCY2c ativa uma cascata de sinal que resulta em doença entérica, por exemplo, diarreia.
[005] GUCY2c foi caracterizado como uma proteína envolvida em cânceres, incluindo câncer colorretal, câncer de pâncreas, câncer gás- trico, câncer hepático e câncer de esôfago (Carrithers et al., Dis Colon Reto 39: 171-181, 1996; Buc et al. Eur J Cancer 41: 1618-1627, 2005; Carrithers et al., Gastroenterology 107: 1653-1661, 1994; Urbanski et al., Biochem Biophys Acta 1245: 29-36, 1995).
[006] Como uma proteína da superfície celular, GUCY2c pode ser- vir como um alvo terapêutico para proteínas de ligação ao receptor, como anticorpos ou ligantes. GUCY2c é expresso no lado apical das células epiteliais que revestem a mucosa do intestino delgado, intestino grosso e reto (Carrithers et al., Dis Colon Reto 39: 171-181, 1996). A expressão de GUCY2 é mantida após transformação neoplásica de cé- lulas epiteliais intestinais, com expressão em todos os tumores colorre- tais primários e metastáticos (Carrithers et al., 1996; Buc et al .; Car- rithers et al., 1994). A expressão de GUCY2c também foi detectada em células esofágicas diagnosticadas como esôfago de Barrett, câncer de esôfago e câncer gástrico.
[007] Permanece uma necessidade de moléculas e/ou composi- ções que possam ter como alvo e se ligar especificamente a células de câncer colorretal metastizadas. Existe uma necessidade de métodos melhorados de tratamento de indivíduos que são suspeitos de sofrerem de câncer colorretal, especialmente indivíduos que são suspeitos de so- frerem de metástase de células de câncer colorretal.
[008] Várias estratégias foram desenvolvidas para gerar anticor- pos biespecíficos capazes de recrutamento de células T para mediar a morte de células tumorais. Tais anticorpos biespecíficos podem fazer uma ponte entre uma célula tumoral e uma célula efetora do sistema imunológico humano (célula NK, célula T, monócito, macrófago ou gra- nulócito) permitindo assim a morte específica da célula tumoral. Embora tais anticorpos biespecíficos tenham se mostrado favoráveis a aplica- ções terapêuticas, por exemplo, para conceitos terapêuticos para o tra- tamento de tumores, permanece uma necessidade de anticorpos bies- pecíficos que têm como alvo células tumorais positivas para GUCY2c de uma maneira altamente potente e específica. Tal molécula seria útil como um agente terapêutico em casos de malignidades GI, no trata- mento de câncer e na detecção de GUCY2c nas células.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[009] A presente invenção fornece anticorpos, incluindo anti- corpos biespecíficos em que os anticorpos que especificamente ligam-se a GUCY2c. A invenção também fornece anticorpos bies- pecíficos que são capazes de ligarem-se a GUCY2c e a CD3.
[0010] Em um aspecto, a invenção fornece anticorpo que espe- cificamente liga-se a guanilil ciclase C (GUCY2c), em que o anti- corpo compreende: (a) uma região variável de cadeia pesada (VH) compreendendo uma região de determinação de complementari- dade VH (VH CDR1), duas regiões de determinação de comple- mentaridade VH (VH CDR2), e três regiões de determinação de complementaridade VH (VH CDR3) das sequência de VH mos- trada em SEQ ID NO: 11, 19, 26, 33, 41, 48, 52, 57, 60, 62, 64, 65, 67, 69, 71, ou 73; e/ou (b) uma região variável de cadeia leve (VL) compreendendo uma região de determinação de complementari- dade VL (VL CDR1), duas regiões de determinação de comple- mentaridade VL (VL CDR2), e três regiões de determinação de complementaridade VL (VL CDR3) da sequência VL mostrada em SEQ ID NO: 92, 100,104, 106, 112, 119, 125, 129, 134, 136, 137, 138, 140, 143, 145, 147, 150, 152, 156, 158, 160, 162, 166, 170, 171, 172, 173, 174 ou 175.
[0011] Em uma modalidade, a invenção fornece um anticorpo que especificamente liga-se a GUCY2c, em que o anticorpo com- preende: (a) uma região VH compreendendo (i) um VH CDR1 com- preendendo uma sequência de SEQ ID NO: 12, 20, 27, 34, 42, 74, 257, 258, 259, 260, ou 261; (ii) um VH CDR2 compreendendo uma sequência de SEQ ID NO: 13, 21, 28, 35, 43, 53, 66, 68, 70, 72, 75, 262, 263, 264, 265, 266, ou 267; e (iii) um VH CDR3 compre- endendo uma sequência de SEQ ID NO: 14, 22, 29, 36, ou 44; e/ou
(b) uma região VL compreendendo (i) um VL CDR1 compreen- dendo uma sequência de SEQ ID NO: 93, 101, 105, 107, 113, 120, 148, 153, 163, ou 167; (ii) a VL CDR2 compreendendo uma se- quência de SEQ ID NO: 78, 94, 102, 108, 114, 141, 144, 146, 149, 151, 157, 159, 161, 164, ou 168; e (iii) um VL CDR3 compreen- dendo uma sequência de SEQ ID NO: 95, 109, 115, 121, 142, 154, 165, ou 169.
[0012] Em uma modalidade, a invenção fornece um anticorpo, em que: (a) a região VH compreende (i) um VH CDR1 compreen- dendo a sequência de SEQ ID NO: 74; (ii) um VH CDR2 compre- endendo a sequência de SEQ ID NO: 75; e iii) um VH CDR3 com- preendendo a sequência de SEQ ID NO: 29; e/ou (b) a região VL compreende (i) um VL CDR1 compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 148; (ii) um VL CDR2 compreendendo a sequência deSEQ ID NO: 149; e (iii) a VL CDR3 compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 142.
[0013] Em outra modalidade, a invenção fornece um anticorpo, em que: (a) a região VH compreende SEQ ID NO: 11, 19, 26, 33, 41, 48, 52, 57, 60, 62, 64, 65, 67, 69, 71, ou 73; e/ou (b) a região VL compreende SEQ ID NO: 92, 100,104,106, 112, 119, 125, 129, 134, 136, 137, 138, 140, 143, 145, 147, 150,152, 156, 158, 160, 162, 166, 170, 171, 172, 173, 174, ou 175.
[0014] Ainda em outra modalidade, a invenção fornece um an- ticorpo, em que a região VH compreende a sequência de SEQ ID NO: 73; e em que a região VL compreende a sequência de SEQ ID NO: 147.
[0015] Em uma modalidade, a invenção fornece um anticorpo, caracterizado pelo fato de que a região VH compreende a sequên- cia de SEQ ID NO: 73, ou uma variante do mesmo com uma ou várias substituições de aminoácido conservativo em resíduos que não estão dentro da região VH; e/ou em que a região VL compre- ende a sequência de SEQ ID NO: 147, ou uma variante do mesmo com uma ou várias substituições de aminoácido conservativo em aminoácidos que não estão dentro da região VL.
[0016] Em uma modalidade, a invenção fornece um anticorpo que liga-se a GUCY2c compreendendo: um GUCY2c VL CDR1 compreendendo aminoácidos tendo a sequência RASESV-XL1.30- XL1.30a-YG-XL1.30d-SLLQ; um GUCY2c VL CDR2 compreen- dendo aminoácidos tendo a sequência apresentada em SEQ ID NO: 149; um GUCY2c VL CDR3 compreendendo aminoácidos tendo a sequência apresentada em SEQ ID NO: 142; um GUCY2c VH CDR1 compreendendo aminoácidos tendo a sequência GFTFS-XH1.31-XH1.32-WMH; um GUCY2c VH CDR2 compreen- dendo aminoácidos tendo a sequência EIK- XH2.52A-XH2.53- XH2.54-XH2.55-XH2.56-XH2.57-NVHEKFKD; e um GUCY2c VH CDR3 compreendendo aminoácidos tendo a sequência T-XH3.96- XH3.97-XH3.98-XH3.99-XH3.100-G-XH3.100B-WF-XH3.100E- XH3.101-V, caracterizado pelo fato de que cada um dos quais XL1.30,XL1.30a,XL1.30d,XH1.31,XH1.32,XH2.52A, XH2.53, XH2.54, XH2.55, XH2.56, XH2.57, XH3.96, XH3.97, XH3.98, XH3.99, XH3.100, XH3.100B, XH3.100E, e XH3.101 independen- temente é um resíduo de aminoácido de acordo com as colunas 4 e 5 das Tabelas 42A e 42B.
[0017] Em um aspecto, XL1.30 é D, N ou S; XL1.30a é Y, W ou I; XL1.30d é T, S ou H; XH1.31 é S, R, W, Y, A, H, P, Y, T, N, K, D, G ou V; XH1.32 é Y, R, L, T, K, P, I, N, M, V ou S; XH2.52A é P, T ou V; XH2.53 é S, A, L ou R; XH2.54 é N, T, R, H, K, M, S, A, Y, T ou I; XH2.55 é E, R, K, N, Y, G, L, A, M, S, H, D ou Q; XH2.56 é L, W, Y, F, V, I, N ou H; XH2.57 é T, M, S, L, N, Q ou V; XH3.96 é I, F ou K; XH3.97 é T, V, L, I, M, F, Y ou A; XH3.98 é T, N, R, G,
L ou I; XH3.99 é T, K, L, W, A, S, M, P, N ou R; XH3.100 é E, G, A, H, S, D, T, R, Q, K, Y, L ou M; XH3.100B é Y ou H; XH3.100E é F ou L; e XH3.101 é D, Y, E ou S.
[0018] Em uma modalidade, a invenção fornece um anticorpo, em que o anticorpo é selecionado do grupo consistindo em um fragmento Fab, um fragmento Fab’, um fragmento F(ab’)2, um fra- gmento Fd, um fragmento Fv, um fragmento Fv de cadeia simples (scFv), um fragmento Fv estabilizado de dissulfeto (dsFv), um fra- gmento de anticorpo de domínio único (dAb), um anticorpo mono- clonal, um anticorpo quimérico, um anticorpo biespecífico, um an- ticorpo triespecífico, um anticorpo multiespecífico, um diacorpo heterodimérico biespecífico, um lgG heterodimérico biespecífico, um anticorpo policlonal, um anticorpo rotulado, um anticorpo hu- manizado, um anticorpo humano e fragmentos dos mesmos.
[0019] Em outra modalidade, o anticorpo da presente invenção também compreende uma estrutura VH humanizada ou humana e uma estrutura VL humana ou humanizada. Em algumas modalida- des, a estrutura VH compreende uma sequência de SEQ ID NO: 5, 6, 7, 8, 15, 16, 17, 18, 23, 24, 25, 30, 31, 32, 37, 38, 39, 40, 45, 46, 47, 49, 50, 51, 54, 55, 56, 58, 59, 61, ou 63; e/ou a estrutura VL compreende uma sequência de SEQ ID NO: 80, 81, 82, 83, 86, 87, 88, 89, 96, 97, 98, 99, 103, 110, 111, 116, 117, 118, 122, 123, 124, 126, 127, 128, 130, 131, 132, 133, 135, 139, ou 155.
[0020] Em outra modalidade, a invenção fornece um anticorpo monoclonal humano isolado que liga-se a um epitopo no domínio extracelular GUCY2c, em que o epitopo compreende pelo menos um resíduo de aminoácido selecionado de resíduos de aminoácido R73, S74, S75, T76, E78, G79, L80, L82, L83, R84 ou I86 de SEQ ID NO: 406.
[0021] Em um aspecto, o epitopo compreende pelo menos dois,
pelo menos três, pelo menos quarto, pelo menos cinco, pelo me- nos seis, pelo menos sete, pelo menos oito, pelo menos nove, ou pelo menos dez resíduos de aminoácido selecionados de resíduos de aminoácido R73, S74, S75, T76, E78, G79, L80, L82, L83, R84 ou I86 de SEQ ID NO: 406. Em outro aspecto, o epitopo compre- ende os resíduos de aminoácido R73, S74, S75, T76, E78, G79, L80, L82, L83, R84 ou I86 de SEQ ID NO: 406. Em um outro as- pecto, o epitopo compreende aminoácidos tendo uma sequência como apresentado em SEQ ID NO: 406. Em um outro aspecto, o epitopo é um epitopo funcional.
[0022] Em outro aspecto, o anticorpo humano isolado e os con- tatos de aminoácido de epitopo GUCY2c estão dentro de 3.8 An- gstroms como determinado por cristalografia. Como empregado aqui, “dentro de 3.8 Angstroms” significa que os contatos são me- nores do que ou iguais a 3.8 Angstroms.
[0023] Em um aspecto, o anticorpo da presente invenção é um anticorpo biespecífico. Em outro aspecto, a invenção fornece um anticorpo biespecífico que especificamente liga-se a GUCY2c e CD3, em que o anticorpo biespecífico compreende uma primeira cadeia de polipeptídeo e uma segunda cadeia de polipeptídeo.
[0024] Em uma modalidade, (a) a primeira cadeia de polipeptí- deo compreende, na direção do N-terminal ao C-terminal: (i) um Domínio 1, compreendendo um VL de um anticorpo GUCY2c (GUCY2c VL), e um VH de um anticorpo CD3 (CD3 VH), e (ii) um primeiro domínio de promoção de heterodímero; e (b) a segunda cadeia de polipeptídeo compreende, na direção do N-terminal ao C-terminal: (i) um Domínio 2, compreendendo um VL de um anti- corpo CD3 (CD3 VL), e um VH de um anticorpo GUCY2c (GUCY2c VH), e (ii) um segundo domínio de promoção de heterodímero; em que o GUCY2c VL e o GUCY2c VH formam um domínio que espe- cificamente liga-se a GUCY2c; e o CD3 VL e o CD3 VH formam um domínio que especificamente liga-se a CD3.
[0025] Em outra modalidade, (a) a primeira cadeia de polipep- tídeo compreende, na direção do N-terminal ao C-terminal: (i) um Domínio 1, compreendendo um CD3 VL, e um GUCY2c VH, e (ii) um primeiro domínio de promoção de heterodímero; e (b) a se- gunda cadeia de polipeptídeo compreende, na direção do N-termi- nal ao C-terminal: (i) um Domínio 2 compreendendo um GUCY2c VL, e um CD3 VH, e (ii) um segundo domínio de promoção de he- terodímero; em que o GUCY2c VL e o GUCY2c VH formam um domínio que especificamente liga-se a GUCY2c; e o CD3 VL e o CD3 VH formam um domínio que especificamente liga-se a CD3.
[0026] Em outra modalidade, (a) a primeira cadeia de polipep- tídeo compreende, na direção do N-terminal ao C-terminal: (i) um Domínio 1, compreendendo um GUCY2c VH, e um CD3 VL, e (ii) um primeiro domínio de promoção de heterodímero; e (b) a se- gunda cadeia de polipeptídeo compreende, na direção do N-termi- nal ao C-terminal: (i) um Domínio 2, compreendendo um CD3 VH, e um GUCY2c VL, e (ii) um segundo domínio de promoção de he- terodímero; em que o GUCY2c VH e o GUCY2c VL formam um domínio que especificamente liga-se um GUCY2c; e o CD3 VH e o CD3 VL formam um domínio que especificamente liga-se a CD3.
[0027] Em uma outra modalidade, (a) a primeira cadeia de po- lipeptídeo compreende, na direção do N-terminal ao C-terminal: (i) um Domínio 1, compreendendo uma VH de CD3, e um GUCY2c VL, e (ii) um primeiro domínio de promoção de heterodímero; e (b) a segunda cadeia de polipeptídeo compreende, na direção do N- terminal ao C-terminal: (i) um Domínio 2, compreendendo um
GUCY2c VH, e um CD3 VL, e (ii) um segundo domínio de promo- ção de heterodímero, em que o GUCY2c VL e o GUCY2c VH for- mam um domínio que especificamente liga-se um GUCY2c; e o CD3 VL e o CD3 VH formam um domínio que especificamente liga- se a CD3.
[0028] Em algumas modalidades de cada uma das anteceden- tes, o primeiro domínio de promoção de heterodímero e o segundo domínio de promoção de heterodímero cada qual compreende um domínio CH2 e um domínio CH3, caracterizado pelo fato de que a sequência de aminoácido de cada um do domínio CH2 e/ou domí- nio CH3 é modificada para induzir a heterodimerização e/ou esta- bilizar o anticorpo biespecífico.
[0029] Em algumas tais modalidades, a sequência de aminoá- cido do domínio CH2 e/ou domínio CH3 compreende pelo menos uma modificação de aminoácido, em que: (a) o domínio CH3 do primeiro domínio de promoção de heterodímero forma uma protu- berância; e (b) o domínio CH3 do segundo domínio de promoção de heterodímero forma um buraco.
[0030] Em outra tal modalidade, o domínio CH3 do primeiro do- mínio de promoção de heterodímero compreende as mutações Y349C e/ou T366W; e o domínio CH3 do segundo domínio de pro- moção de heterodímero compreende as mutações S354C, T366S, L368A, e/ou Y407V, (numeração de acordo com o índice EU).
[0031] Em uma modalidade particular de cada uma das ante- cedentes, o primeiro domínio de promoção de heterodímero com- preende uma sequência de SEQ ID NO: 188; em que o segundo domínio de promoção de heterodímero compreende uma sequên- cia de SEQ ID NO: 189.
[0032] Nas modalidades adicionais, o GUCY2c VL e o CD3 VH são ligados por um ligante de glicina-serina; e o CD3 VL e o
GUCY2c VH são ligados por um ligante de glicina-serina. Em al- gumas tais modalidades, o ligante de glicina-serina é o Ligante 1 compreendendo uma sequência de SEQ ID NO: 190. Em outras modalidades, o ligante de glicina-serina é o Ligante 2 compreen- dendo uma sequência de SEQ ID NO: 191.
[0033] Em outras modalidades de cada uma das antecedentes, o Domínio 1 é covalentemente ligado ao primeiro domínio de pro- moção de heterodímero por meio de um ligante de cisteína; e o Domínio 2 é covalentemente ligado ao segundo domínio de pro- moção de heterodímero por meio de um ligante de cisteína; em que o ligante de cisteína compreende pelo menos cinco aminoáci- dos. Em algumas tais modalidades, o ligante de cisteína é o Li- gante 3 compreendendo uma sequência de SEQ ID NO: 192.
[0034] Em algumas modalidades, a primeira cadeia de polipep- tídeo é covalentemente ligada à segunda cadeia de polipeptídeo por pelo menos uma ligação de dissulfeto. Em algumas tais moda- lidades, pelo menos uma ligação de dissulfeto forma-se entre o Ligante 3 da primeira cadeia de polipeptídeo e o Ligante 3 da se- gunda cadeia de polipeptídeo. Em outra tal modalidade, pelo me- nos uma ligação de dissulfeto é formada entre o primeiro domínio de promoção de heterodímero e o segundo domínio de promoção de heterodímero. Em modalidades específicas, cada ligação de dissulfeto é formada ligando-se dois resíduos de cisteína.
[0035] Em outras modalidades de qualquer uma das antece- dentes, o anticorpo biespecífico da presente invenção compre- ende (a) um GUCY2c VH CDR1 compreendendo uma sequência de SEQ ID NO: 12, 20, 27, 34, 42, 74, 257, 258, 259, 260, ou 261; (b) um GUCY2c VH CDR2 compreendendo uma sequência de SEQ ID NO: 13, 21, 28, 35, 43, 53, 66, 68, 70, 72, 75, 262, 263, 264, 265, 266, ou 267; (c) um GUCY2c VH CDR3 compreendendo uma sequência de SEQ ID NO: 14, 22, 29, 36, ou 44; (d) uma VL de GUCY2c CDR1 compreendendo uma sequência de SEQ ID NO: 93, 101, 105, 107, 113, 120, 148, 153, 163, ou 167; (e) uma VL de GUCY2c CDR2 compreendendo uma sequência de SEQ ID NO: 78, 94, 102, 108, 114, 141, 144, 146, 149, 151, 157, 159, 161, 164, ou 168; e (f) uma GUCY2c VL CDR3 compreendendo uma sequên- cia de SEQ ID NO: 95, 109, 115, 121, 142, 154, 165, ou 169.
[0036] Em uma modalidade particular, o anticorpo biespecífico da presente invenção compreende (a) um GUCY2c VH CDR1 com- preendendo uma sequência de SEQ ID NO: 74, ou 259; (b) um GUCY2c VH CDR2 compreendendo uma sequência deSEQ ID NO: 75, ou 267; (c) um GUCY2c VH CDR3 compreendendo uma se- quência deSEQ ID NO: 29; (d) um GUCY2c VL CDR1 compreen- dendo uma sequência de SEQ ID NO: 148; (e) um GUCY2c VL CDR2 compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 149; e (f) um GUCY2c VL CDR3 compreendendo uma sequência deSEQ ID NO:
142.
[0037] Em modalidades específicas, o anticorpo biespecífico compreende: (a) uma região VH de GUCY2c compreendendo uma sequência de SEQ ID NO: 73; e (b) uma região VL de GUCY2c compreendendo a sequência mostrada em SEQ ID NO: 147.
[0038] Em modalidades adicionais, a invenção fornece anticor- pos biespecíficos compreendendo (a) um CD3 VH CDR1 compre- endendo uma sequência de SEQ ID NO: 2, 268, ou 277; (b) um CD3 VH CDR2 compreendendo uma sequência de SEQ ID NO: 3, 10, 269, ou 270; (c) um CD3 VH CDR3 compreendendo uma se- quência de SEQ ID NO: 4; (d) um CD3 VL CDR1 compreendendo uma sequência de SEQ ID NO: 77, 85, 91, 278, 279, ou 280; (e) um CD3 VL CDR2 compreendendo a SEQ ID NO: 78, ou 281; e (f) um CD3 VL CDR3 compreendendo uma sequência de SEQ ID NO:
79.
[0039] Em uma modalidade particular, a invenção fornece um anticorpo biespecífico compreendendo (a) um CD3 VH CDR1 com- preendendo a sequência de SEQ ID NO: 2, ou 268; (b) um CD3 VH CDR2 compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 10, ou 270; (c) um CD3 VH CDR3 compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 4; (d) um CD3 VL CDR1 compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 91; (e) um CD3 VL CDR2 compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 78; e (f) um CD3 VL CDR3 compreendendo a sequên- cia de SEQ ID NO: 79.
[0040] Em uma modalidade, a invenção fornece um anticorpo biespecífico compreendendo: (a) uma região VH de CD3 compre- endendo a sequência de SEQ ID NO: 1, 9, ou 273; e (b) uma região VL de CD3 compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 76, 84, 90, 274, 275, ou 276. Em uma modalidade particular, o anticorpo biespecífico da presente invenção compreende: (a) uma região VH de CD3 compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 9; e (b) uma região VL de CD3 compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 90.
[0041] Em uma modalidade, a invenção fornece um anticorpo biespecífico compreendendo: um GUCY2c VL CDR1 compreen- dendo aminoácidos tendo a sequência RASESV-XL1.30-XL1.30a- YG-XL1.30d-SLLQ; um GUCY2c VL CDR2 compreendendo amino- ácidos tendo a sequência apresentada em SEQ ID NO: 149; um GUCY2c VL CDR3 compreendendo aminoácidos tendo a sequên- cia apresentada em SEQ ID NO: 142; um GUCY2c VH CDR1 com- preendendo aminoácidos tendo a sequência GFTFS-XH1.31- XH1.32-WMH; um GUCY2c VH CDR2 compreendendo aminoáci- dos tendo a sequência EIK-XH2.52A-XH2.53-XH2.54-XH2.55- XH2.56-XH2.57-NVHEKFKD; e um GUCY2c VH CDR3 compreen- dendo aminoácidos tendo a sequência T-XH3.96-XH3.97-XH3.98-
XH3.99-XH3.100-G-XH3.100B-WF-XH3.100E-XH3.101-V, em que cada uma de XL1.30,XL1.30a,XL1.30d,XH1.31,XH1.32,XH2.52A, XH2.53, XH2.54, XH2.55, XH2.56, XH2.57, XH3.96, XH3.97, XH3.98, XH3.99, XH3.100, XH3.100B, XH3.100E, e XH3.101 inde- pendentemente é um resíduo de aminoácido de acordo com as colunas 4 e 5 das Tabelas 42A e 42B.
[0042] Em um aspecto, XL1.30 é D, N ou S; XL1.30a é Y, W ou I; XL1.30d é T, S ou H; XH1.31 é S, R, W, Y, A, H, P, Y, T, N, K, D, G ou V; XH1.32 é Y, R, L, T, K, P, I, N, M, V ou S; XH2.52A é P, T ou V; XH2.53 é S, A, L ou R; XH2.54 é N, T, R, H, K, M, S, A, Y, T ou I; XH2.55 é E, R, K, N, Y, G, L, A, M, S, H, D ou Q; XH2.56 é L, W, Y, F, V, I, N ou H; XH2.57 é T, M, S, L, N, Q ou V; XH3.96 é I, F ou K; XH3.97 é T, V, L, I, M, F, Y ou A; XH3.98 é T, N, R, G, L ou I; XH3.99 é T, K, L, W, A, S, M, P, N ou R; XH3.100 é E, G, A, H, S, D, T, R, Q, K, Y, L ou M; XH3.100B é Y ou H; XH3.100E é F ou L; e XH3.101 é D, Y, E ou S.
[0043] Em outra modalidade, a invenção fornece um anticorpo biespecífico que liga-se a um epitopo no domínio GUCY2c extra- celular, caracterizado pelo fato de que o epitopo compreende pelo menos um resíduo de aminoácido selecionado dos resíduos de aminoácido R73, S74, S75, T76, E78, G79, L80, L82, L83, R84 ou I86 de SEQ ID NO: 406.
[0044] Em um aspecto, o epitopo compreende pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo me- nos seis, pelo menos sete, pelo menos oito, pelo menos nove, ou pelo menos dez resíduos de aminoácido selecionados de resíduos de aminoácido R73, S74, S75, T76, E78, G79, L80, L82, L83, R84 ou I86 de SEQ ID NO: 406. Em outro aspecto, o epitopo compre- ende os resíduos de aminoácido R73, S74, S75, T76, E78, G79,
L80, L82, L83, R84 ou I86 de SEQ ID NO: 406. Em um outro as- pecto, o epitopo compreende aminoácidos tendo uma sequência como apresentado em SEQ ID NO: 406. Em um outro aspecto, o epitopo é um epitopo funcional.
[0045] Em outro aspecto, o anticorpo humano isolado e os con- tatos de aminoácido do epitopo GUCY2c estão dentro de 3.8 An- gstroms como determinado por cristalografia.
[0046] Em um aspecto, a invenção fornece um anticorpo bies- pecífico que especificamente liga-se a GUCY2c e compete para a ligação com o anticorpo biespecífico como descrito aqui.
[0047] Em um aspecto, a invenção fornece um anticorpo bies- pecífico que especificamente liga-se a GUCY2c e CD3, em que o anticorpo biespecífico compreende uma primeira cadeia de poli- peptídeo e uma segunda cadeia de polipeptídeo, e em que: (a) uma primeira cadeia de polipeptídeo compreende as seguintes re- giões na seguinte ordem em uma direção do N-terminal ao C-ter- minal: um VL de um anticorpo GUCY2c (GUCY2c VL) (SEQ ID NO: 147) – Ligante 1 (SEQ ID NO: 190) – um VH de um anticorpo CD3 (CD3 VH) (SEQ ID NO: 9) – Ligante 3 (SEQ ID NO: 192) – um primeiro domínio de promoção de heterodímero (SEQ ID NO: 188); e (b) uma segunda cadeia de polipeptídeo compreende as seguin- tes regiões na seguinte ordem em uma direção do N-terminal ao C-terminal: um VL de um anticorpo CD3 (CD3 VL) (SEQ ID NO: 90) – Ligante 2 (SEQ ID NO: 191) – um VH de um anticorpo GUCY2c (GUCY2c VH) (SEQ ID NO: 73)- Ligante 3 (SEQ ID NO: 192) – um segundo domínio de promoção de heterodímero (SEQ ID NO: 189); em que o GUCY2c VL e o GUCY2c VH formam um domínio que especificamente liga-se a GUCY2c; e o CD3 VL e o CD3 VH formam um domínio que especificamente liga-se a CD3; em que o Ligante 3 da primeira cadeia de polipeptídeo e o Ligante
3 da segunda cadeia de polipeptídeo são covalentemente ligados um ao outro pelas duas ligações de dissulfeto; em que o primeiro domínio de promoção de heterodímero e o segundo domínio de promoção de heterodímero cada qual compreende um domínio CH2 e um domínio CH3; em que o domínio CH3 do primeiro domí- nio de promoção de heterodímero forma uma protuberância, e o domínio CH3 do segundo domínio de promoção de heterodímero forma um buraco; em que pelo menos uma ligação de dissulfeto é formada entre o domínio CH3 do primeiro domínio de promoção de heterodímero e o domínio CH3 do segundo domínio de promo- ção de heterodímero.
[0048] Em algumas modalidades, a invenção fornece um anti- corpo biespecífico também compreendendo uma estrutura de VH humanizada ou humana, e uma estrutura de VL humanizada ou humana. Em algumas tais modalidades, o anticorpo biespecífico é um anticorpo humanizado. Em modalidades específicas, a estru- tura de VH compreende uma sequência de SEQ ID NO: 5, 6, 7, 8, 15, 16, 17, 18, 23, 24, 25, 30, 31, 32, 37, 38, 39, 40, 45, 46, 47, 49, 50, 51, 54, 55, 56, 58, 59, 61, ou 63; e/ou a estrutura de VL compreende uma sequência de SEQ ID NO: 80, 81, 82, 83, 86, 87, 88, 89, 96, 97, 98, 99, 103, 110, 111, 116, 117, 118, 122, 123, 124, 126, 127, 128, 130, 131, 132, 133, 135, 139, ou 155.
[0049] Em um aspecto, o anticorpo biespecífico da presente in- venção especificamente liga-se a GUCY2c e CD3, caracterizado pelo fato de que o anticorpo biespecífico compreende uma pri- meira cadeia de polipeptídeo e uma segunda cadeia de polipeptí- deo; em que a primeira cadeia de polipeptídeo é produzida pelo vetor de expressão com ATCC Acesso Nº PTA-124944; e uma se- gunda cadeia de polipeptídeo é produzida pelo vetor de expressão com ATCC Acesso Nº PTA-124943.
[0050] Em modalidades particulares, o anticorpo ou o anticorpo biespecífico da presente invenção (a) liga-se ao domínio extra- cellular de GUCY2c humano; (b) demonstra um soro extendido e meia vida de tumor de entre 30 min a 100 dias; e/ou (c) demonstra um valor de EC50 inferior entre 0,0001 nM e 100 nM na presença de níveis de expressão de GUCY2c aumentados ou níveis de den- sidade receptora aumentados.
[0051] A presente invenção também fornece uma composição farmacêutica compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo ou um anticorpo biespecífico descrito aqui, e um veículo farmaceuticamente aceitável.
[0052] Em outro aspecto, a presente invenção fornece um mé- todo de tartar um distúrbio associado a GUCY2c em um paci ente em necessidade deste, compreendendo administrar ao paciente um anticorpo GUCY2c da presente invenção. A presente invenção também fornece um método de tartar um distúrbio associado a GUCY2c em um paciente em necessidade deste, compreendendo administrar ao paciente um anticorpo biespecífico da presente in- venção. A presente invenção também fornece um método de tratar um distúrbio associado a GUCY2c em um paciente em necessi- dade do mesmo, compreendendo administrar ao paciente uma composição farmacêutica compreendendo um anticorpo GUCY2c ou um anticorpo biespecífico descrito aqui. Em algumas tais mo- dalidades, o distúrbio associado a GUCY2c é câncer. Em modali- dades específicas, o câncer é um câncer do sistema digestivo se- lecionado do grupo consistindo em esôfago, estômago, intestino delgado, cólon, reto, ânus, fígado, vesícula biliar, apêndice, dutos biliares e pâncreas.
[0053] A presente invenção também fornece um método de tra-
tar um distúrbio associado a GUCY2c em um paciente em neces- sidade do mesmo, compreendendo administrar ao paciente um an- ticorpo biespecífico como descrito aqui, ou uma composição far- macêutica compreendendo um anticorpo biespecífico como des- crito aqui, em que uma resposta de célula T citolítica é ativada.
[0054] Em um aspecto, a presente invenção fornece um anti- corpo, um anticorpo biespecífico, ou uma composição farmacêu- tica como descrito aqui para o uso em terapia. A presente invenção também fornece um anticorpo, ou um anticorpo biespecífico como descrito aqui para o uso na fabricação de um medicamento para o uso em terapia. Em algumas modalidades, a terapia é um trata- mento de um distúrbio associado a GUCY2c. Em modalidades es- pecíficas, o distúrbio associado a GUCY2c é câncer. Em algumas modalidades, o câncer é um câncer do sistema digestivo selecio- nado do grupo consistindo em esôfago, estômago, intestino del- gado, cólon, reto, ânus, fígado, vesícula biliar, apêndice, dutos bi- liares e pâncreas. Em modalidades específicas, a terapia ativa uma resposta de célula T citolítica.
[0055] Em um aspecto, a presente invenção fornece um polinu- cleotídeo que codifica um anticorpo ou um anticorpo biespecífico como descrito aqui. Em outra modalidade, a invenção fornece um vetor compreendendo polinucleotídeos como descritos aqui. Ainda em outra modalidade, a invenção fornece uma célula hospedeira compreendendo os vetores como descrito aqui. Em algumas tais modalidades, a célula hospedeira recombinantemente produz o anticorpo ou o anticorpo biespecífico como descrito aqui. Em mo- dalidades específicas, a célula hospedeira é selecionada do grupo consistindo em linhagens celulares bacterianas, linhagens de cé- lula de mamífero, linhagens de célula de inseto e linhagens de mastócitos. Em uma modalidade particular, a linhagem de célula de mamífero é uma linhagem de célula CHO. Em uma modalidade, o anticorpo ou o anticorpo biespecífico é produzido empregando- se um sistema de síntese de proteína livre de célula in vitro.
[0056] Em um aspecto, a presente invenção fornece um mé- todo de produzir um anticorpo GUCY2c ou um anticorpo biespecí- fico como descrito aqui, compreendendo cultivar uma célula hos- pedeira, sob condições que resultam na produção de um anticorpo GUCY2c ou um anticorpo biespecífico como descrito aqui, e puri- ficar o anticorpo ou o anticorpo biespecífico do sobrenadante de cultura.
[0057] Em outro aspecto, a presente invenção fornece um uso de um anticorpo GUCY2c, um anticorpo biespecífico, uma compo- sição farmacêutica, um polinucleotídeo, um vetor, ou uma célula hospedeira como descrito aqui, na fabricação de um medicamento para tratar um distúrbio associado a GUCY2c.
[0058] Em outra modalidade, a presente invenção fornece uma composição compreendendo os anticorpos biespecíficos da inven- ção e um segundo agente terapêutico.
[0059] Em outra modalidade, a presente invenção fornece uma composição compreendendo os anticorpos biespecíficos da inven- ção e um agente antidiarreico.
[0060] Em um aspecto, o agente antidiarreico inclui, porém não é limitado a, subgalato de bismuto, lactobacilus acidofilus, saca- romyces boulardii, loperamida/simeticona, atropina/difenoxilato, atropina/difenoxina, sacaromyces boulardii lyo, lactobacilus acido- filus, loperamida, subsalicilato de bismuto, lactobacilus acidofi- lus/lactobacilus bulgaricus, lactobacilus ramnosus, atapulgita, cro- felemer, fluoroquinolona, antibiótico ou octreotida.
[0061] Em outro aspecto, a presente invenção fornece o uso de uma composição compreendendo um anticorpo GUCY2c biespecí- fico e um agente antidiarreico como descrito aqui, na fabricação de um medicamento para tratar um distúrbio associado a GUCY2c.
[0062] Outras modalidades se tornarão evidentes a partir da revisão da descrição detalhada. Onde os aspectos ou modalidades da invenção são descritos em termos de um grupo Markush ou outros grupos de alternativas, a presente invenção abrange não apenas o grupo inteiro listado como um todo, porém também cada membro do grupo individualmente e todos os subgrupos possíveis do grupo principal, e também o grupo principal ausente um ou mais dos membros do grupo. A presente invenção também visiona a exclusão explícita de um ou mais dos membros do grupo na inven- ção reivindicada. BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS/DESENHOS
[0063] As Figuras 1A, 1B, 1C e 1D descrevem as químicas de quatro representações alternativas de anticorpos biespecíficos CD3-GUCY2c tendo um primeiro domínio de promoção de hetero- dímero e segundo domínio de promoção de heterodímero compre- endendo uma cadeia de Fc otimizada para associar por meio de uma associação “protuberância em buraco”.
[0064] A Figura 2 descreve a ligação de (A) GUCY2C-0247, e (B) anticorpos biespecíficos GUCY2C-1608 às células de tumor T84 empregando-se citometria de fluxo com base no ensaio.
[0065] A Figura 3 descreve citometria de fluxo com base no en- saio para determinar a ligação de (A) GUCY2C-0247, e (B) anti- corpos biespecíficos GUCY2C-1608 às células T humanas vir- gens.
[0066] A Figura 4A descreve GUCY2C-1608 e células T huma- nas virgens de recrutamento GUCY2C-0247 para induzir a morte cellular nas células de tumores T84. A Figura 4B descreve a ativi- dade da célula T citotóxica mediada por GUCY2C-1608 vista nas linhagens de célula de tumor expressando GUCY2c, LS1034. A Figura 4C descreve a atividade da célula T citotóxica mediada por GUCY2C-1608 é vista nas linhagens de célula de tumor expres- sando GUCY2c, LS174T. A Figura 4D descreve que nenhuma ati- vidade é observada com GUCY2C-1608 na linhagem de célula GUCY2c-negativa.
[0067] As Figuras 5A a 5F descrevem a análise in vitro da libe- ração de citocina induzida no recrutamento mediado por GUCY2C- 1608 de células T humanas virgens às células T84 expressando GUCY2c. O ensaio com base em Luminex mostrou a super-regu- lação de IFN-gama humano (Figura 5A), IL10 (Figura 5B), IL2 (Fi- gura 5C), IL4 (Figura 5D), IL6 (Figura 5E), e TNF-alfa (Figura 5F).
[0068] A Figura 6 descreve a inibição do crescimento do tumpor dependente de dose por GUCY2C-0247 em tumores de xenoen- xerto de linhagem de célula de carcinoma colorretal T84 em um modelo de transferência adotivo.
[0069] A Figura 7 descreve a inibição do crescimento de tumor dependente de dose por GUCY2C-0247 em tumores de xenoen- xerto de linhagem de célula de carcinoma colorretal HT55 em um modelo de transferência adotivo.
[0070] A Figura 8 descreve a inibição do crescimento de tumor dependente de dose por GUCY2C-1608 em tumores de xenoen- xerto de linhagem de célula de carcinoma colorretal HT55 em um modelo de transferência adotivo.
[0071] A Figura 9 descreve inibição do crescimento de tumor dependente de dose pelos anticorpos GUCY2c biespecíficos, GUCY2C-0247 e GUCY2C-1608, em tumores de xenoenxerto de linhagem de célula LS1034 de câncer colorretal em um modelo de transferência adotivo.
[0072] A Figura 10 descreve a inibição do crescimento de tumor por anticorpos GUCY2c biespecíficos, GUCY2C-0074, GUCY2C- 0098 e GUCY2C-0105, em tumores de xenoenxerto de linhagem de célula LS1034 de câncer colorretal em uma inibição de cresci- mento de tumor de modelo de transferência adotivo por anticorpos biespecíficos GUCY2c, GUCY2C-0074, GUCY2C-0098 e GUCY2C-0105, em tumores de xenoenxerto de linhagem de célula LS1034 de câncer colorretal em um modelo de transferência ado- tivo.
[0073] A Figura 11 descreve a inibição do crescimento de tumor dependente de dose por GUCY2C-0098 em tumores de xenoen- xerto derivados de paciente de carcinoma colorretal PDX-CRX- 11201 em um modelo de transferência adotivo.
[0074] A Figura 12 descreve a inibição do crescimento de tumor dependente de dose por GUCY2C-1608 em tumores de xenoen- xerto derivados de paciente de carcinoma colorretal PDX-CRX- 11201 em um modelo de transferência adotivo.
[0075] A Figura 13 descreve a inibição do crescimento de tumor por GUCY2C-0240 em PDX-CRX-11201 tumores de xenoenxerto derivados de paciente de carcinoma colorretal em um modelo de transferência adotivo.
[0076] A Figura 14 descreve a inibição do crescimento de tumor pela inibição do crescimento de tumor GUCY2C-0098 em PDX- CRX-12213 tumores de xenoenxerto derivados de paciente de car- cinoma colorretal em um modelo de transferência adotivo.
[0077] A Figura 15 descreve a inibição do crescimento de tumor por GUCY2C-0247 em PDX-CRX-24225 tumores de xenoenxerto derivados de paciente de carcinoma colorretal em um modelo de transferência adotivo.
[0078] A Figura 16 descreve a caracterização da indução de cGMP e a capacidade de neutralização de GUCY2c-CD3 biespe- cífico em células T84.
[0079] A Figura 17 descreve a análise de LC/MS de GUCY2C- 1608 após a purificação.
[0080] A Figura 18 descreve a citotoxicidade mediada por cé- lula T biespecífica anti-GUCY2C com variantes anti-CD3. Biespe- cíficos Anti-GUCY2c com diferentes variantes de CD3 recrutam células T humanas virgens para induzir a morte das células em células de tumor T84.
[0081] A Figura 19 descreve GUCY2c ECD Competição de Peptídeo DELFIA ELISA.
[0082] A Figura 20 descreve a competição DELFIA ELISA com anticorpo MS20.
[0083] A Figura 21 descreve os detalhes da interface de ligação do peptídeo GUCY2c e peptídeo scFv GUCY2C-1608 por meio de cristalografia.
[0084] A Figura 22 descreve a estrutura de cristal dos dois sí- tios de ligação de antigen sobre o anticorpo GUCY2c CD3 biespe- cífico mostrando que eles são separados por cerca de 70 Å e são localizados nos lados opostos da molécula, diretamente através uma da outra.
[0085] A Figura 23 descreve os resultados dos estudos de com- binação com Anti-VEGF e axitinib que mostraram a inibição do crescimento de tumor aditivo em combinação com GUCY2c CD3 biespecífico.
[0086] A Figura 24 descreve os resultados dos estudos de com- binaçaõ com Anti-PD1 que mostraram inibição do crescimento de tumor aditivo em combinação com GUCY2c CD3 biespecífico.
[0087] A Figura 25 descreve os resultados dos estudos de com- binação com Anti-PD-L1 que mostraram a inibição do crescimento de tumor aditivo em combinação com GUCY2c CD3 biespecífico.
DESCRIÇÃO DETALHADA
[0088] A invenção descrita aqui fornece anticorpos que especi- ficamente ligam-se a GUCY2c (por exemplo, GUCY2c humano, GUCY2c de camundongo, GUCY2c de rato, GUCY2c de cinomo- lgo). Também, a invenção descrita aqui fornece anticorpos bies- pecíficos que especificamente ligam-se a CD3 (por exemplo, CD3 humano) e um antígeno de tumor (por exemplo, GUCY2c). A in- venção também fornece polinucleotídeos codificando estes anti- corpos, composições compreendendo estes anticorpos, e métodos de preparar e empregar estes anticorpos. A invenção também for- nece métodos para tratar uma condição associada com a expres- são de GUCY2c em um indivíduo, tal como câncer, empregando- se os anticorpos (por exemplo, GUCY2, CD3 ou anticorpo biespe- cífico), como descrito aqui. Técnicas Gerais
[0089] A prática da presente invenção empregará, a menos que de outra forma indicado, técnicas convencionais de biologia mole- cular (incluindo técnicas recombinantes), microbiologia, biologia celular, bioquímica e imunologia, os quais estão dentro da experi- ência da técnica. Tais técnicas são explanadas completamente na literatura, tais como Clonagem Molecular: A Laboratory Manual, segunda edição (Sambrook e outro(s), 1989) Cold Spring Harbor Press; Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed., 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J.E. Cellis, ed., 1998) Academic Press; Animal Cell Cul- ture (R.I. Freshney, ed., 1987); Introduction to Cell and Tissue Cul- ture (J.P. Mather and P.E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and
Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffiths, e D.G. Newell, eds., 1993-1998) J. Wiley and Sons; Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir and C.C. Blackwell, eds.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller and M.P. Calos, eds., 1987); Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel e ou- tro(s), eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis e outro(s), eds., 1994); Current Protocols in Immunology (J.E. Co- ligan e outro(s), eds., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999); Immunobiology (C.A. Janeway and P. Tra- vers, 1997); anticorpos (P. Finch, 1997); anticorpos: a practical approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); Anticorpos Mo- noclonais: a practical approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Empregando-se anticorpos: a la- boratory manual (E. Harlow and D. Lane (Cold Spring Harbor La- boratory Press, 1999); Os anticorpos (M. Zanetti and J.D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995). Em alguns casos, os termos com significados comumente entendidos são definidos aqui com clareza e/ou referência pronto, e a inclusão de tais definições aqui não deveria ser necessariamente construída para representar uma diferença substancial sobre o que é geralmente entendido na técnica.
[0090] A invenção será agora descrita em detalhes como forma de referência empregando-se as seguintes definições e exemplos. Todas as patentes e publicações, incluindo todas as sequências descritas dentro de tais patentes e publicações, referidas aqui são expressamente incorporadas por referência. Definições
[0091] Em geral, a menos que de outra forma indicado, todos os termos da técnica, notações e outros termos científicos ou ter- minologia empregados aqui, são pretendidos ter os significados comumente entendidos por aqueles versados na técnica a qual esta invenção pertence. Por exemplo, o termo “e/ou” como empre- gado em uma frase tal como “A e/ou B” aqui, é pretendido incluir ambos A e B; A ou B; A (sozinho); e B (sozinho). Também, o termo “e/ou” como empregado em uma frase tal como “A, B, e/ou C” é pretendido abranger cada uma das seguintes modalidades: A, B, e C; A, B, ou C; A ou C; A ou B; B ou C; A e C; A e B; B e C; A (sozinho); B (sozinho); e C (sozinho).
[0092] Como empregado aqui, as formas singulares “um”, “uma” e “o(a)” incluem suas correspondentes referências de plural, a menos que o contexto claramente dite de outra forma.
[0093] Como empregado aqui, as variações numéricas são in- clusivas dos números definindo a faixa.
[0094] Os termos “cerca de”, “aproximadamente”, e similares, quando precedendo uma lista de valores numéricos ou faixa, refe- rem-se a cada valor individual na lista ou faixa independentemente como se cada valor individual na lista ou faixa fosse imediata- mente precedido por aquele termo. Os termos significam que os valores aos quais o mesmo refere-se são exatamente, perto de, ou similar a eles. Por exemplo, em algumas modalidades, cerca de ou aproximadamente, um valor particular pode indicar um valor de 99%, 95%, ou 90% daquele valor. Como um exemplo, a expres- são “cerca de 100” inclui 99 e 101 e todos os valores entre (por exemplo, 99,1, 99,2, 99,3, 99,4, 99,5, etc.). Como outro exemplo, onde a temperatura é de 70° C, “cerca de” ou “aproximadamente” 70° C pode ser igual a 69° C, 66° C, ou 63° C. Deve ser entendido que estes são meramente exemplos.
[0095] Como empregado aqui “dentro de 3,8 Angstroms” signi- fica os contatos são menores do que ou iguais a 3.8 Angstroms como determinado por cristalografia.
[0096] Como empregado aqui, os ácidos nucleicos são escritos da esquerda para a direita na direção de 5' a 3'; as sequências de aminoácido são escritas da esquerda para a direita na orientação amino a carbóxi, respectivamente. Os Praticantes são particular- mente direcionados a Sambrook e outro(s), 1989, e Ausubel FM e outro(s), 1993, para as definições e termos da técnica. Deve ser entendido que esta invenção não é limitada à metodologia particu- lar, protocolos, e reagentes descritos, como estes podem variar.
[0097] Os termos “polipeptídeo”, “oligopeptídeo”, “peptídeo” e “proteína” são empregados alternadamente aqui para referirem-se às cadeias de aminoácidos de qualquer comprimento, preferivel- mente, relativamente pequenas (por exemplo, 10-100 aminoáci- dos). A cadeia pode ser linear ou ramificada, ela pode compreen- der aminoácidos modificados, e/ou pode ser interrompida por não- aminoácidos. Os termos também abrangem uma cadeia de amino- ácido que foi naturalmente modificada ou por intervenção; por exemplo, formação de ligação de dissulfeto, glicosilação, lipida- ção, acetilação, fosforilação, ou qualquer outra manipulação ou modificação, tal como conjugação com um componente de rotula- gem. Também incluídos dentro da definição estão, por exemplo, os polipeptídeos contendo um ou mais análogos de um aminoácido (incluindo, por exemplo, aminoácidos não naturais, etc.), bem como outras modificações conhecidas na técnica. É entendido que os polipeptídeos podem ocorrer como cadeias únicas ou cadeias associadas. Preferivelmente, os polipeptídeos de mamífero (poli- peptídeos que originalmente foram derivados de um organismo de mamífero) são empregados, mais preferivelmente aqueles que são diretamente secretados no meio.
[0098] Um "anticorpo" é uma molécula de imunoglobulina capaz de ligação específica a um alvo, como um carboidrato, polinucleotídeo, li- pídeo, polipeptídeo, etc., através de pelo menos um sítio de reconheci- mento de antígeno, localizado na região variável da molécula de imuno- globulina. Como aqui usado, o termo abrange um policlonal, um anti- corpo monoclonal, um anticorpo quimérico, um anticorpo biespecífico, anticorpo específico duplo, anticorpo bifuncional, um anticorpo triespe- cífico, um anticorpo multiespecífico, um diacorpo heterodimérico bies- pecífico, um IgG heterodimérico biespecífico, um anticorpo rotulado, um anticorpo humanizado, um anticorpo humano e seus fragmentos (tal como Fab, Fab’, F(ab’)2, Fv), cadeia única (ScFv) e anticorpos de domí- nio (incluindo, por exemplo, anticorpos de tubarão e camelídeo), proteí- nas de fusão compreendendo um anticorpo e qualquer outra configura- ção modificada da molécula de imunoglobulina que compreende um sí- tio de reconhecimento de antígeno. Um anticorpo inclui um anticorpo de qualquer classe, como IgG, IgA ou IgM (ou sua subclasse), e o anticorpo não precisa ser de nenhuma classe particular. Dependendo da sequên- cia de aminoácidos do anticorpo da região constante de suas cadeias pesadas, as imunoglobulinas podem ser atribuídas a diferentes classes. Existem cinco classes principais de imunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, e várias delas podem ser divididas em subclasses (isotipos), por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2. As regiões constantes da cadeia pesada que correspondem às diferentes classes de imuno- globulinas são chamadas alfa, delta, épsilon, gama e mu, respectiva- mente. As estruturas de subunidades e configurações tridimensionais de diferentes classes de imunoglobulinas são bem conhecidas. A inven- ção também inclui "análogo(s) de anticorpo", outras estruturas não ba- seadas em proteína de molécula de anticorpo, por exemplo, proteínas de fusão e/ou imunoconjugados que usam CDRs para fornecer ligação de antígeno específica. Os anticorpos da invenção podem ser derivados de qualquer espécie, incluindo, mas não se limitando a camundongo, humano, camelo, lhama, peixe, tubarão, cabra, coelho, frango e bovino.
[0099] O termo "anticorpo" inclui ainda moléculas de imunoglobulina compreendendo quatro cadeias polipeptídicas, duas cadeias pesadas (H) e duas cadeias leves (L) interligadas por ligações dissulfeto, bem como multímeros das mesmas (por exemplo, IgM). Cada cadeia pesada compreende uma região variável da cadeia pesada (aqui abreviada como HC VR ou VH) e uma região constante da cadeia pesada. Uma "região variável" de um anticorpo se refere à região variável da cadeia leve do anticorpo ou à região variável da cadeia pesada do anticorpo, sozinha ou em combinação. A região constante da cadeia pesada com- preende três domínios, CH1, CH2 e CH3. Os domínios CH1 e CH2 são conectados por uma região de articulação. Cada cadeia leve compre- ende uma região variável da cadeia leve (aqui abreviada como LC VR ou VL) e uma região constante da cadeia leve. A região constante da cadeia leve compreende um domínio (CL1). As regiões VH e VL podem ser subdivididas em regiões de hipervariabilidade, denominadas regiões determinantes de complementaridade (CDRs), intercaladas com regi- ões que são mais conservadas, denominadas regiões estruturais (FR). Cada VH e VL é composto por três CDRs e quatro FRs, arranjados do terminal amino ao terminal carbóxi na seguinte ordem: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Em diferentes modalidades da invenção, as FRs do anticorpo CD3 (ou sua porção de ligação ao antígeno) podem ser idênticas às sequências germinativas humanas ou podem ser modi- ficadas natural ou artificialmente. Uma sequência de consenso de ami- noácidos pode ser definida com base em uma análise lado a lado de dois ou mais CDRs. Os CDRs em cada cadeia são mantidos juntos em estreita proximidade pelos FRs e, com os CDRs da outra cadeia, contri- buem para a formação do sítio de ligação ao antígeno dos anticorpos.
[00100] O termo "fragmento de ligação ao antígeno" ou "fragmento de anticorpo" ou "porção de ligação ao antígeno", como aqui usado, re- fere-se a um ou mais fragmentos de um anticorpo que retém a habili- dade de se ligar especificamente a um antígeno. Exemplos de fragmen- tos de ligação abrangidos pelo termo "fragmento de ligação ao antígeno" de um anticorpo incluem (i) um domínio variável de cadeia pesada de anticorpo (VH) e/ou um domínio variável de cadeia leve de anticorpo (VL), ou um par de VH/VL derivados de anticorpos de comprimento total ou fragmentos de anticorpos, tal como um domínio VH e/ou um domínio VL; (ii) um fragmento Fab, um fragmento monovalente que consiste nos domínios VL, VH, CL e CH1; (iii) um fragmento Fab', que é essencial- mente um Fab com parte da região de articulação (por exemplo, Funda- mental Immunology, Paul ed., 3.sup.rd ed.1993; (iv) um fragmento F(ab')2, um fragmento bivalente compreendendo dois fragmentos Fab ligados por uma ponte dissulfeto na região de articulação; (v) um frag- mento Fd que consiste nos domínios VH e CH1; (vi) um fragmento Fv que consiste nos domínios VL e VH de um único braço de um anticorpo; (vii) um fragmento Fv de cadeia única (scFv), uma única cadeia de pro- teína na qual as regiões VL e VH se emparelham para formar moléculas monovalentes (por exemplo, Bird et al. (1988) Science 242:423-426; e Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879- 5883); (viii) um fragmento Fv estabilizado por dissulfeto (dsFv), um Fv com uma ligação dissulfeto intermolecular projetada para estabilizar o par VH-VL; (ix) um único fragmento de anticorpo de domínio variável (sdAb ou dAb) (por exemplo, Ward et al., (1989) Nature 341: 544-546), que é composto por um domínio variável de cadeia pesada e desprovido de cadeia leve ; (x) uma região determinante de complementaridade (CDR); e quaisquer de- rivados dos mesmos.
[00101] Como aqui usado, um "fragmento de ligação ao antígeno" de um anticorpo pode compreender pelo menos um domínio variável. O domínio variável pode ser de qualquer tamanho ou composição de ami- noácidos e geralmente compreenderá pelo menos um CDR que é adja- cente a ou em estrutura com uma ou mais sequências de estrutura. Como aqui usado, um "fragmento de ligação ao antígeno de um anti- corpo" pode compreender um homodímero ou heterodímero (ou outro multímero) de qualquer uma das configurações de região variável e do- mínio constante listadas abaixo em associação não covalente entre si e/ou com uma ou mais regiões VH ou VL monoméricas (por exemplo, por ligação(ões) dissulfeto). Por exemplo, a região variável pode ser dimérica e conter dímeros VH-VH, VH-VL ou VL-VL. As configurações de domínios variáveis e constantes que podem ser encontrados dentro de um fragmento de ligação ao antígeno de um anticorpo da presente invenção incluem: VH-CH1; VH-CH2; VH-CH3; VH-CH1-CH2; VH-CH1- CH2-CH3; VH-CH2-CH3; VH-VL-CL, VH-VL-CH1, VH-VL-CH2; VH-CL; VL-CH1; VL-CH2; VL-CH3; VL-CH1-CH2; VL-CH1-CH2-CH3; VL-CH2- CH3; e VL-CL. As regiões variáveis e os domínios constantes podem ser diretamente ligados entre si ou podem ser ligados por uma articula- ção total ou parcial ou região de ligação. Uma região de articulação pode consistir em pelo menos 2 (por exemplo, 5, 10, 15, 20, 40, 60 ou mais) aminoácidos que resultam em uma ligação flexível ou semiflexível entre regiões variáveis adjacentes e/ou domínios constantes em uma única molécula de polipeptídeo.
[00102] Como aqui usado, um "domínio de ligação" compreende qualquer região de um polipeptídeo (por exemplo, anticorpo) que é res- ponsável pela ligação seletiva a uma molécula de interesse (por exem- plo, um antígeno, ligante, receptor, substrato ou inibidor). Domínios de ligação exemplares incluem uma região variável de anticorpo, domínio de ligação ao receptor, domínio de ligação do ligante e um domínio en- zimático.
[00103] Como aqui usado, o termo "estrutura aceptora humana" é uma estrutura compreendendo a sequência de aminoácidos de uma es- trutura variável de cadeia leve (VL) ou uma estrutura variável de cadeia pesada (VH) derivada de uma estrutura de imunoglobulina humana ou uma estrutura de consenso humano, conforme definido abaixo. Uma es- trutura aceptora humana "derivada de" uma estrutura de imunoglobulina humana ou uma estrutura de consenso humana pode compreender a mesma sequência de aminoácidos deste, ou pode conter modificações na sequência de aminoácidos. Em algumas modalidades, o número de modificações de aminoácidos é 10 ou menos, 9 ou menos, 8 ou menos, 7 ou menos, 6 ou menos, 5 ou menos, 4 ou menos, 3 ou menos, ou 2 ou menos. Em algumas modalidades, a estrutura de aceitação humana VL é idêntica em sequência à sequência de estrutura de imunoglobulina humana de VL ou sequência de estrutura de consenso humana.
[00104] Como aqui usado, um anticorpo "amadurecido por afinidade" refere-se a um anticorpo com uma ou mais modificações em uma ou mais regiões variáveis (que incluem os CDRs e FRs em comparação com um anticorpo parental, que não possui tais modificações, e em que tais modificações resultam em uma melhoria na afinidade do anticorpo para um antígeno).
[00105] Como aqui usado, o termo "região Fc", "domínio Fc", "cadeia Fc" ou termos análogos são usados para definir uma região C-terminal de uma cadeia pesada de IgG. A região Fc de uma IgG compreende dois domínios constantes, CH2 e CH3. O domínio CH2 de uma região Fc de IgG humana geralmente se estende dos aminoácidos 231 ao ami- noácido 340 de acordo com o sistema de numeração do índice EU, ou do aminoácido 244 ao aminoácido 360 de acordo com o sistema de nu- meração de Kabat. O domínio CH3 de uma região Fc de IgG humana geralmente se estende dos aminoácidos 341 a 447 de acordo com o sistema de numeração do índice EU ou do aminoácido 361 ao aminoá- cido 478 de acordo com o sistema de numeração de Kabat. O domínio
CH2 de uma região Fc de IgG humana (também referida como domínio "Cγ 2") é único por não estar intimamente emparelhado com outro do- mínio. Em vez disso, duas cadeias de carboidratos ramificadas ligadas a N são interpostas entre os dois domínios CH2 de uma IgG nativa in- tacta. A região Fc pode compreender sequências Fc nativas ou varian- tes. Embora os limites da sequência Fc de uma cadeia pesada de imu- noglobulina possam variar, a sequência Fc da cadeia pesada de IgG humana é geralmente definida para se estender a partir de um resíduo de aminoácido próximo à posição Cys226, ou próximo à posição Pro230, até o terminal carboxila da sequência Fc. A menos que especi- ficado aqui de outra forma, a numeração de resíduos de aminoácidos na região Fc ou região constante está de acordo com o sistema de nu- meração EU, também chamado de índice EU, conforme descrito em Ka- bat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ª Ed . Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991.
[00106] Em certas modalidades, uma cadeia Fc começa na região de articulação logo a montante do sítio de clivagem da papaína e termina no C-terminal do anticorpo. Consequentemente, uma cadeia Fc com- pleta compreende pelo menos um domínio de articulação, um domínio CH2 e um domínio CH3. Em certas modalidades, uma cadeia Fc com- preende pelo menos um de: um domínio de articulação (por exemplo, região de articulação superior, média e/ou inferior), um domínio CH2, um domínio CH3, um domínio CH4 ou uma variante, porção, ou frag- mento da mesma. Em certas modalidades, um domínio Fc compreende uma cadeia Fc completa (ou seja, um domínio de articulação, um domí- nio CH2 e um domínio CH3). Em certas modalidades, uma cadeia Fc compreende um domínio de articulação (ou parte dele) fundido a um domínio CH3 (ou parte dele). Em certas modalidades, uma cadeia Fc compreende um domínio CH2 (ou parte dele) fundido a um domínio CH3 (ou parte dele). Em certas modalidades, uma cadeia Fc consiste em um domínio CH3 ou parte do mesmo. Em certas modalidades, uma cadeia Fc consiste em um domínio de articulação (ou parte dele) e um domínio CH3 (ou parte dele). Em certas modalidades, uma cadeia Fc consiste em um domínio CH2 (ou parte dele) e um domínio CH3. Em certas mo- dalidades, uma cadeia Fc consiste em um domínio de articulação (ou parte dele) e um domínio CH2 (ou parte dele). Em certas modalidades, uma cadeia Fc carece de pelo menos uma porção de um domínio CH2 (por exemplo, todo ou parte de um domínio CH2). Uma cadeia Fc aqui geralmente se refere a um polipeptídeo compreendendo toda ou parte da cadeia Fc de uma cadeia pesada de imunoglobulina. Isso inclui, mas não está limitado a, polipeptídeos compreendendo os domínios CHI, de articulação, CH2 e/ou CH3 inteiros, bem como fragmentos de tais pep- tídeos compreendendo apenas, por exemplo, os domínios de articula- ção, CH2 e CH3. A cadeia Fc pode ser derivada de uma imunoglobulina de qualquer espécie e/ou qualquer subtipo, incluindo, mas não se limi- tando a, um anticorpo IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgD, IgA, IgE ou IgM hu- mano. O domínio Fc engloba moléculas Fc nativas e Fc variantes. Tal como acontece com as variantes de Fc e Fc's nativos, o termo cadeia de Fc inclui moléculas na forma monomérica ou multimérica, quer dige- ridas do anticorpo inteiro ou produzidas por outros meios. Em algumas modalidades, a cadeia Fc compreende as porções carboxiterminais de ambas as cadeias pesadas mantidas juntas por dissulfetos. Em certas modalidades, uma cadeia Fc consiste em um domínio CH2 e um domí- nio CH3.
[00107] Conforme usado na técnica, "receptor Fc" e "FcR" descre- vem um receptor que se liga à região Fc de um anticorpo. O FcR prefe- rido é um FcR humano de sequência nativa. Além disso, um FcR prefe- rido é aquele que se liga a um anticorpo IgG (um receptor gama) e inclui receptores das subclasses FcγRI, FcγRII e FcγRIII, incluindo variantes alélicas e formas combinadas alternativas desses receptores. Os recep- tores FcγRII incluem FcγRIIA (um "receptor de ativação") e FcγRIIB (um "receptor de inibição"), que têm sequências de aminoácidos semelhan- tes que diferem principalmente nos seus domínios citoplasmáticos. FcRs são revisados em Ravetch e Kinet, Ann. Rev. Immunol., 9:457-92, 1991; Capel et al., Immunomethods, 4:25-34, 1994; e de Haas et al., J. Lab. Clin. Med., 126:330-41, 1995. “FcR” também inclui o receptor neo- natal, FcRn, que é responsável pela transferência de IgGs maternos para o feto (Guyer et al., J. Immunol., 117:587, 1976; e Kim et al., J. Immunol., 24:249, 1994).
[00108] Uma "região Fc de sequência nativa" ou "região Fc de tipo selvagem" compreende uma sequência de aminoácidos idêntica à se- quência de aminoácidos de uma região Fc encontrada na natureza. Por Fc de IgG humana de "tipo selvagem" entende-se uma sequência de aminoácidos que ocorre naturalmente dentro da população humana. Claro, assim como a sequência Fc pode variar ligeiramente entre os in- divíduos, uma ou mais alterações podem ser feitas em uma sequência de tipo selvagem e ainda permanecer dentro do escopo da invenção. Por exemplo, a região Fc pode conter alterações adicionais que não es- tão relacionadas à presente invenção, como uma mutação em um sítio de glicosilação, inclusão de um aminoácido não natural ou uma mutação "protuberância-em-buracos".
[00109] Uma "região Fc variante" ou "cadeia Fc variante" compre- ende uma sequência de aminoácidos que difere daquela de uma região Fc de sequência nativa em virtude de pelo menos uma modificação de aminoácido ainda reter pelo menos uma função efetora da região Fc de sequência nativa. Em algumas modalidades, a cadeia Fc variante tem pelo menos uma substituição de aminoácido em comparação com uma cadeia Fc de sequência nativa ou à região Fc de um polipeptídeo pa- rental, por exemplo, de cerca de uma a cerca de dez substituições de aminoácidos e, de preferência, de cerca de uma a cerca de cinco subs- tituições de aminoácidos em uma cadeia Fc de sequência nativa ou na cadeia Fc do polipeptídeo parental. A cadeia Fc variante aqui possuirá de preferência pelo menos cerca de 80% de identidade de sequência com uma cadeia Fc de sequência nativa e/ou com uma cadeia Fc de um polipeptídeo parental, e mais preferencialmente, pelo menos cerca de 90% de identidade de sequência com a mesma, mais preferencial- mente, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo me- nos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99% de identidade de sequência com esta.
[00110] Como aqui usado, o termo "funções efetoras" refere-se às atividades biológicas atribuíveis à cadeia Fc (uma cadeia Fc de sequên- cia nativa ou cadeia Fc variante de sequência de aminoácidos) de um anticorpo e variam com o isotipo do anticorpo. Exemplos de funções efetoras de anticorpos incluem: ligação de C1q e citotoxicidade depen- dente do complemento; Ligação ao receptor Fc; citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos (ADCC); fagocitose; regulação negativa de receptores de superfície celular (por exemplo, receptor de células B); e ativação de células B. Essas funções efetoras geralmente requerem que a cadeia Fc seja combinada com um domínio de ligação (por exemplo, uma região variável de anticorpo) e podem ser avaliadas usando vários ensaios conhecidos na técnica para avaliar tais funções efetoras de anticorpo. Uma medição exemplar da função efetora é atra- vés da ligação Fcγ3 e/ou C1q.
[00111] As funções efetoras de anticorpos são determinadas por se- quências na cadeia Fc; esta cadeia também é a parte reconhecida pelos receptores Fc (FcR) encontrados em certos tipos de células.
[00112] Em algumas modalidades, um polipeptídeo Fc compreende parte ou a totalidade de uma sequência de articulação de tipo selvagem
(geralmente em seu N-terminal). Em algumas modalidades, um polipep- tídeo Fc não compreende uma sequência de articulação funcional ou de tipo selvagem.
[00113] A "região de articulação", "sequência de articulação" e suas variações, tal como aqui utilizadas, incluem o significado conhecido na técnica, que é ilustrado em, por exemplo, Janeway et al., ImmunoBio- logy: the immune system in health and disease, Elsevier Science Ltd., NY (4th ed., 1999); Bloom et al., Protein Science, 6:407-415, 1997; e Humphreys et al., J. Immunol. Methods, 209:193-202, 1997.
[00114] A "região de articulação semelhante à imunoglobulina", "se- quência de articulação semelhante à imunoglobulina" ou variações das mesmas, tal como aqui utilizadas, se referem à região de articulação e sequência de articulação de uma molécula semelhante à imunoglobu- lina ou semelhante a um anticorpo, por exemplo, imunoadesinas). Em algumas modalidades, a região de articulação semelhante a imunoglo- bulina pode ser de ou derivada de qualquer subtipo IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4, ou de IgA, IgE, IgD ou IgM, incluindo suas formas quiméricas, por exemplo, uma região de articulação IgG1 quimérica 1/2.
[00115] Em algumas modalidades, a região de articulação pode ser do subtipo de IgG1 humana que se estende do aminoácido 216 ao ami- noácido 230 de acordo com o sistema de numeração do índice EU, ou do aminoácido 226 ao aminoácido 243 de acordo com o sistema de nu- meração de Kabat. Em algumas modalidades, a sequência pode ser EPKSCDKTHTCPPCP (SEQ ID NO: 186). Os versados na técnica po- dem diferir em sua compreensão dos aminoácidos exatos correspon- dentes aos vários domínios da molécula de IgG. Assim, o N-terminal ou C-terminal dos domínios delineados acima podem se estender ou ser encurtado por 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou mesmo 10 aminoácidos.
[00116] Em algumas modalidades, a região de articulação pode ser mutada por um ou mais aminoácidos. Em algumas modalidades, a re- gião de articulação pode ser truncada e conter apenas uma porção de toda a região de articulação. Em algumas modalidades, a região de ar- ticulação pode conter apenas os últimos 5 aminoácidos da região de articulação.
[00117] Como aqui usado, os termos "ligado", "fundido", "fusão", "co- valentemente ligado", "covalentemente acoplado" e "geneticamente fun- dido" são usados indistintamente. Esses termos referem-se à união de dois ou mais elementos ou componentes, por qualquer meio, incluindo combinação química ou meios recombinantes. Como aqui usado, o termo "ligado covalentemente" significa que as porções especificadas estão diretamente ligadas covalentemente umas às outras, ou então são indiretamente covalentemente unidas umas às outras por meio de uma porção ou porções intervenientes, como um peptídeo ou porção de liga- ção. Numa forma de realização preferida, as porções são fundidas co- valentemente. Um tipo de ligação covalente é uma ligação peptídica. Métodos de conjugação química (por exemplo, usando agentes de reti- culação heterobifuncionais) são conhecidos na técnica. Porções fundi- das também podem ser fundidas geneticamente. Como aqui usado, o termo "fundido geneticamente", "ligado geneticamente" ou "fundido ge- neticamente" refere-se à ligação colinear covalente ou fixação de duas ou mais proteínas, polipeptídeos ou fragmentos dos mesmos por meio de seus esqueletos peptídicos individuais, por meio de expressão gené- tica de uma única molécula de polinucleotídeo que codifica essas prote- ínas, polipeptídeos ou fragmentos. Essa fusão genética resulta na ex- pressão de uma única sequência genética contígua. As fusões genéti- cas preferidas estão na estrutura, isto é, duas ou mais estruturas de leitura aberta (ORFs) são fundidas para formar uma ORF mais longa e contínua, de uma maneira que mantém a estrutura de leitura correta dos ORFs originais. Assim, a proteína de fusão recombinante resultante é um único polipeptídeo contendo dois ou mais segmentos de proteína que correspondem a polipeptídeos codificados pelas ORFs originais (tais segmentos não são normalmente assim unidos na natureza). Neste caso, o único polipeptídeo é clivado durante o processamento para pro- duzir moléculas diméricas compreendendo duas cadeias polipeptídicas.
[00118] Como aqui usado, o termo "modificação" refere-se a uma substituição, inserção e/ou deleção de aminoácidos em uma sequência polipeptídica, uma alteração em uma fração quimicamente ligada a uma proteína ou uma modificação de uma função de uma proteína, por exemplo, um anticorpo. Por exemplo, uma modificação pode ser uma função alterada de um anticorpo, ou uma estrutura de carboidrato alte- rada ligada a uma proteína. Como aqui usado, uma "modificação de aminoácido" refere-se a uma mutação (substituição), inserção (adição) ou deleção de um ou mais resíduos de aminoácido em um anticorpo. O termo "mutação de aminoácido" denota a substituição de pelo menos um resíduo de aminoácido existente com outro resíduo de aminoácido diferente (por exemplo, o resíduo de aminoácido de substituição). O termo "deleção de aminoácidos" denota a remoção de pelo menos um resíduo de aminoácido em uma posição predeterminada em uma se- quência de aminoácidos. Por exemplo, a mutação L234A denota que o resíduo de aminoácido lisina na posição 234 em uma região Fc de anti- corpo é substituído pelo resíduo de aminoácido alanina (substituição de lisina por alanina), (numeração de acordo com o sistema de numeração de índice EU). Um "resíduo de aminoácido de ocorrência natural" denota um resíduo de aminoácido do grupo que consiste em alanina (código de três letras: Ala, código de uma letra: A), arginina (Arg, R), asparagina (Asn, N), ácido aspártico (Asp, D), cisteína (Cys, C), glutamina (Gin, Q), ácido glutâmico (Glu, E), glicina (Gly, G), histidina (His, H), isoleucina (He, I), leucina (Leu, L), lisina (Lys, K), metionina (Met, M), fenilalanina (Phe, F), prolina (Pro, P), serina (Ser, S), treonina (Thr, T), triptofano
(Trp, W), tirosina (Tyr, Y) e valina (Val, V).
[00119] Como aqui usado, uma "substituição conservadora de ami- noácido" é aquela em que o resíduo de aminoácido é substituído por um resíduo de aminoácido com uma cadeia lateral semelhante. Famílias de resíduos de aminoácidos com cadeias laterais semelhantes foram defi- nidas na técnica. Essas famílias incluem aminoácidos com cadeias la- terais básicas (por exemplo, lisina, arginina, histidina), cadeias laterais ácidas (por exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico), cadeias laterais polares sem carga (por exemplo, asparagina, glutamina, serina, treo- nina, tirosina, cisteína), cadeias laterais não polares (por exemplo, gli- cina, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano), cadeias laterais ramificadas beta (por exemplo, treonina, va- lina, isoleucina) e cadeias laterais aromáticas (por exemplo, tirosina, fe- nilalanina, triptofano, histidina).
[00120] Como aqui usado, um resíduo de aminoácido "não essen- cial" é um resíduo que pode ser alterado a partir da sequência de tipo selvagem do agente de ligação, por exemplo, o anticorpo, sem abolir ou, sem alterar substancialmente uma atividade biológica, enquanto um resíduo de aminoácido "essencial" resulta em tal mudança. Em um an- ticorpo, um resíduo de aminoácido essencial pode ser um resíduo de- terminante de especificidade (SDR).
[00121] O termo "agente" é usado neste documento para denotar uma macromolécula biológica, um extrato feito de materiais biológicos, uma mistura de macromoléculas biológicas, um composto químico, uma mistura de compostos químicos e/ou uma mistura de compostos quími- cos e macromoléculas biológicas. O termo "agente terapêutico" refere- se a um agente que possui atividade biológica.
[00122] Como aqui usado, "anticorpo monoclonal" refere-se a um an- ticorpo obtido a partir de uma população de anticorpos substancialmente homogêneos, isto é, os anticorpos individuais que compreendem a po- pulação são idênticos, exceto para possíveis mutações de ocorrência natural que podem estar presentes em quantidades menores. Os anti- corpos monoclonais são altamente específicos, sendo direcionados contra um único sítio antigênico. Além disso, em contraste com as pre- parações de anticorpos policlonais, que normalmente incluem diferentes anticorpos direcionados contra diferentes determinantes (epitopos), cada anticorpo monoclonal é direcionado contra um único determinante no antígeno. O modificador "monoclonal" indica o caráter do anticorpo como sendo obtido de uma população substancialmente homogênea de anticorpos, e não deve ser interpretado como requerendo a produção do anticorpo por qualquer método particular. Por exemplo, os anticorpos monoclonais a serem usados de acordo com a presente invenção po- dem ser feitos pelo método de hibridoma primeiro descrito por Kohler e Milstein, Nature 256: 495, 1975, ou podem ser feitos por métodos de DNA recombinante, como descrito em Patente Norte Americana No.
4.816.567. Os anticorpos monoclonais também podem ser isolados de bibliotecas de fagos geradas usando as técnicas descritas em McCaf- ferty et al., Nature 348: 552-554, 1990, por exemplo.
[00123] Os anticorpos da presente invenção podem ser "anticorpos humanizados". Como aqui usado, o anticorpo "humanizado" refere-se a formas de anticorpos não humanos (por exemplo, camundongo, rato, coelho, primata não humano ou outro mamífero) que são imunoglobuli- nas quiméricas, cadeias de imunoglobulinas ou fragmentos das mes- mas (tais como Fv, Fab, Fab', F (ab') 2 ou outras subsequências de li- gação ao antígeno de anticorpos) que contêm um ou mais resíduos de aminoácidos introduzidos a partir de uma fonte que é não humana. Es- ses resíduos de aminoácidos não humanos são frequentemente referi- dos como resíduos de "importação", que são tipicamente retirados de um domínio variável de "importação". Um resíduo, sequência ou anti- corpo de importação tem uma afinidade e/ou especificidade desejada ou outra atividade biológica de anticorpo desejável como aqui descrito.
[00124] Preferivelmente, os anticorpos humanizados são imunoglo- bulinas humanas (anticorpo receptor) em que os resíduos de uma região de terminação de complementaridade (CDR) do receptor são substituí- dos por resíduos de uma CDR de uma espécie não humana (anticorpo doador), como camundongo, rato ou coelho com a especificidade, afini- dade e capacidade desejada. Em alguns casos, os resíduos da região estrutural de Fv (FR) da imunoglobulina humana são substituídos por resíduos não humanos correspondentes. Além disso, o anticorpo huma- nizado pode compreender resíduos que não são encontrados nem no anticorpo receptor nem na CDR importada ou sequências estruturais, mas são incluídos para refinar e otimizar ainda mais o desempenho do anticorpo. Em geral, o anticorpo humanizado compreenderá substanci- almente todas as de pelo menos uma, e tipicamente duas, regiões vari- áveis, nas quais todas ou substancialmente todas as regiões CDR cor- respondem às de uma imunoglobulina não humana e todas ou substan- cialmente todas as regiões FR são aquelas de uma sequência de con- senso de imunoglobulina humana. O anticorpo humanizado otimamente também compreenderá pelo menos uma porção de uma região ou do- mínio constante de imunoglobulina (Fc), tipicamente o de uma imuno- globulina humana. Preferidos são os anticorpos com cadeias Fc modifi- cadas como descrito em WO 99/58572. Outras formas de anticorpos humanizados têm um ou mais CDRs (CDR L1, CDR L2, CDR L3, CDR H1, CDR H2 ou CDR H3) que são alterados em relação ao anticorpo original, que também são denominados um ou mais CDRs "derivados de” um ou mais CDRs do anticorpo original. Humanizado, conforme usado aqui, pretende incluir anticorpos desimunizados.
[00125] Como aqui usado, "anticorpo humano" significa um anticorpo com uma sequência de aminoácidos correspondente àquela de um an- ticorpo produzido por um humano e/ou que foi feito usando qualquer uma das técnicas para fazer anticorpos humanos conhecidos pelos ver- sados na técnica ou divulgados aqui. Consequentemente, o termo "an- ticorpo humano", conforme aqui utilizado, pretende incluir anticorpos possuindo regiões variáveis e constantes derivadas de sequências de imunoglobulina da linha germinativa humana. Os anticorpos humanos da invenção podem incluir resíduos de aminoácidos não codificados por sequências de imunoglobulina da linha germinativa humana (por exem- plo, mutações introduzidas por mutagênese aleatória ou específica do sítio in vitro ou por mutação somática in vivo), por exemplo, nos CDRs e em particular no CDR3. Esta definição de um anticorpo humano inclui anticorpos compreendendo pelo menos um polipeptídeo de cadeia pe- sada humana ou pelo menos um polipeptídeo de cadeia leve humana. Um exemplo é um anticorpo compreendendo polipeptídeos de cadeia leve de murino e de cadeia pesada humana. Os anticorpos humanos podem ser produzidos usando várias técnicas conhecidas na arte. Em uma modalidade, o anticorpo humano é selecionado a partir de uma bi- blioteca de fagos, onde essa biblioteca de fagos expressa anticorpos humanos (Vaughan et al., Nature Biotechnology, 14:309-314, 1996; Sheets et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 95:6157-6162, 1998; Hooge- nboom e Winter, J. Mol. Biol., 227:381, 1991; Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581, 1991). Os anticorpos humanos também podem ser produzidos por imunização de animais nos quais os loci de imunoglobulina humana foram transgenicamente introduzidos no lugar dos loci endógenos, por exemplo, camundongos nos quais os genes de imunoglobulina endó- gena foram parcial ou completamente inativados. Esta abordagem é descrita na Patente Norte Americana Nos. 5.545.807; 5.545.806;
5.569.825; 5.625.126; 5.633.425; e 5.661.016. Alternativamente, o anti- corpo humano pode ser preparado imortalizando linfócitos B humanos que produzem um anticorpo direcionado contra um antígeno alvo (tais linfócitos B podem ser recuperados de um indivíduo ou da clonagem de célula única do cDNA, ou podem ter sido imunizados in vitro). Ver, por exemplo, Cole et al. Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77, 1985; Boerner et al., J. Immunol., 147(1):86-95, 1991; e Patente Norte Americana No. 5.750.373.
[00126] Os anticorpos humanos da presente invenção podem existir em pelo menos duas formas que estão associadas à heterogeneidade de articulação. Por exemplo, a molécula de imunoglobulina compreende uma construção estável de quatro cadeias de aproximadamente 150 a 160 kDa na qual os dímeros são mantidos juntos por uma ligação dis- sulfeto intercadeia de cadeia pesada. Alternativamente, os dímeros não estão ligados através de ligações dissulfeto entre cadeias e uma molé- cula de cerca de 75 a 80 kDa é formada composta por uma cadeia leve e pesada acoplada covalentemente (meio-anticorpo).
[00127] Como aqui usado, o termo "anticorpo humano recombinante" destina-se a incluir todos os anticorpos humanos que são preparados, expressos, criados ou isolados por meios recombinantes, tais como an- ticorpos expressos usando um vetor de expressão recombinante trans- fectado em uma célula hospedeira (descrito mais abaixo), anticorpos isolados de uma biblioteca de anticorpos humanos combinatórios re- combinantes (descritos mais abaixo), anticorpos isolados de um animal (por exemplo, um camundongo) que é transgênico para genes de imu- noglobulina humana (ver, por exemplo, Taylor et al. (1992) Nucl. Acids Res. 20: 6287-6295) ou anticorpos preparados, expressos, criados ou isolados por qualquer outro meio que envolva a união de sequências de genes de imunoglobulina humana a outras sequências de DNA. Esses anticorpos humanos recombinantes têm regiões variáveis e constantes derivadas de sequências de imunoglobulina da linha germinativa hu-
mana. Em certas modalidades, no entanto, tais anticorpos humanos re- combinantes são submetidos à mutagênese in vitro (ou, quando um ani- mal transgênico para sequências de Ig humana é usado, mutagênese somática in vivo) e, assim, as sequências de aminoácidos das regiões VH e VL dos anticorpos recombinante são sequências que, embora de- rivadas de e relacionadas às sequências VH e VL da linha germinativa humana, podem não existir naturalmente dentro do repertório da linha germinativa de anticorpo humano in vivo.
[00128] Os anticorpos da invenção podem ser anticorpos "quiméri- cos" em que uma porção da cadeia pesada e/ou leve é idêntica ou ho- móloga às sequências correspondentes em anticorpos derivados de uma espécie particular ou pertencente a uma classe de anticorpo parti- cular ou subclasse, enquanto o restante da(s) cadeia(s) é idêntica ou homóloga às sequências correspondentes em anticorpos derivados de outra espécie ou pertencentes à outra classe ou subclasse de anticor- pos, bem como fragmentos de tais anticorpos, desde que exibam o ati- vidade biológica (Patente Norte Americana 4.816.567; e Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 :6851-6855, 1984). Os anticorpos quimé- ricos de interesse aqui incluem anticorpos primatizados compreendendo sequências de ligação ao antígeno de região variável derivadas de um primata não humano (por exemplo, Macaco do Velho Mundo, Símio, etc.) e sequências de região constante humana.
[00129] Um "anticorpo monovalente" compreende um sítio de ligação ao antígeno por molécula (por exemplo, IgG ou Fab). Em alguns casos, um anticorpo monovalente pode ter mais de um sítio de ligação ao antí- geno, mas os sítios de ligação são de diferentes antígenos.
[00130] Um "anticorpo monoespecífico" refere-se a um anticorpo ou preparação de anticorpo que compreende dois sítios de ligação ao an- tígeno idênticos por molécula (por exemplo, IgG), de modo que os dois locais de ligação liguem epitopo idêntico no antígeno. Assim, eles com- petem entre si na ligação a uma molécula de antígeno. Este termo inclui um "anticorpo monoclonal" ou "composição de anticorpo monoclonal". A maioria dos anticorpos encontrados na natureza são monoespecífi- cos. Em alguns casos, um anticorpo monoespecífico também pode ser um anticorpo monovalente (por exemplo, Fab).
[00131] Um "anticorpo bivalente" compreende dois sítios de ligação ao antígeno por molécula (por exemplo, IgG). Em alguns casos, os dois sítios de ligação têm as mesmas especificidades de antígeno. No en- tanto, os anticorpos bivalentes podem ser biespecíficos.
[00132] Como aqui usado, um "anticorpo biespecífico", "anticorpo es- pecífico duplo", "anticorpo bifuncional", "heteromultímero", "complexo heteromultimérico", "diacorpo heterodimérico biespecífico" ou um "poli- peptídeo heteromultimérico" é uma molécula compreendendo pelo me- nos um primeiro polipeptídeo e um segundo polipeptídeo, em que o se- gundo polipeptídeo difere na sequência de aminoácidos do primeiro po- lipeptídeo em pelo menos um resíduo de aminoácido. Em alguns casos, o biespecífico é um anticorpo híbrido artificial com duas regiões de ca- deia pesada e região de cadeia leve diferentes. Preferivelmente, o anti- corpo biespecífico tem especificidade de ligação para pelo menos dois ligantes, antígenos ou sítios de ligação diferentes. Consequentemente, os anticorpos biespecíficos podem ligar simultaneamente dois antíge- nos diferentes. Os dois sítios de ligação ao antígeno de um anticorpo biespecífico se ligam a dois epitopos diferentes, que podem residir no mesmo ou em diferentes alvos de proteína, por exemplo, alvo de tumor.
[00133] Um "antígeno alvo", um "antígeno de célula alvo", um "antí- geno tumoral" ou um "antígeno tumoral específico", Como aqui usado, refere-se a um terminante antigênico apresentado na superfície de uma célula alvo, por exemplo, uma célula em um tumor, tal como uma célula cancerosa ou uma célula do estroma tumoral.
[00134] Os termos "carga (load) de mutação", "carga (load) mutacio- nal", "carga (burden) de mutação" e "carga (burden) mutacional" são usados indistintamente neste documento. Carga mutacional tumoral é uma medida do número de mutações dentro de um genoma tumoral, definido como o número total de mutações por área de codificação de um genoma tumoral. Há uma grande variabilidade na carga de mutação dentro dos tipos de tumores, variando de apenas algumas a milhares de mutações (Alexandrov LB et al., Nature 2013;500(7463):415-421; Law- rence MS et al., Nature 2013;499:214–218; Vogelstein B et al., Science, 2013;339:1546–1558.
[00135] Como aqui usado, a primeira cadeia polipeptídica e a se- gunda cadeia polipeptídica do "anticorpo biespecífico" compreendem pelo menos um VL de um anticorpo e uma região VH de anticorpo ou fragmento do mesmo, em que ambos os domínios de ligação de anti- corpo estão compreendidos em uma cadeia de único polipeptídeo e em que as regiões VL e VH em cada cadeia polipeptídica são de diferentes anticorpos.
[00136] O anticorpo biespecífico, anticorpo específico duplo, anti- corpo bifuncional, heteromultímero, complexo heteromultimérico, dia- corpo heterodimérico biespecífico ou o polipeptídeo heteromultimérico pode formar estruturas terciárias de ordem superior onde outros poli- peptídeos, além do primeiro e segundo polipeptídeos estão presentes. Os polipeptídeos do heteromultímero podem interagir uns com os outros por uma ligação covalente não peptídica (por exemplo, ligação dissul- feto) e/ou uma interação não covalente (por exemplo, ligações de hidro- gênio, ligações iônicas, forças de van der Waals e/ou interações hidro- fóbicas).
[00137] O anticorpo biespecífico, anticorpo específico duplo, anti- corpo bifuncional, heteromultímero, complexo heteromultimérico, dia- corpo heterodimérico biespecífico ou o polipeptídeo heteromultimérico pode ser preparado construindo fragmentos de sFv com ligantes curtos (por exemplo, cerca de 3 a 10 resíduos) entre os Regiões VH e VL tais que o pareamento intercadeia, mas não intracadeia das regiões V é al- cançado, resultando em um fragmento bivalente, isto é, fragmento com dois sítios de ligação ao antígeno. Os anticorpos biespecíficos podem ser derivados de anticorpos de comprimento total ou fragmentos de an- ticorpos (por exemplo, anticorpos biespecíficos F(ab′)2). Diacorpos são descritos mais detalhadamente em, por exemplo, EP404.097; WO93 11161; e Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448,
1993. Anticorpos específicos são heterodímeros de dois fragmentos sFv "crossover" nos quais as regiões VH e VL dos dois anticorpos estão presentes em diferentes cadeias polipeptídicas.
[00138] Como aqui usado, um "anticorpo isolado" significa um anti- corpo que foi identificado e separado e/ou recuperado de pelo menos um componente de seu ambiente natural. Por exemplo, um anticorpo que foi separado ou removido de pelo menos um componente de um organismo, ou de um tecido ou célula em que o anticorpo existe natu- ralmente ou é produzido naturalmente, é um "anticorpo isolado" para os fins da presente invenção. Um anticorpo isolado também inclui um anti- corpo in situ dentro de uma célula recombinante. Os anticorpos isolados são anticorpos que foram submetidos a pelo menos uma etapa de puri- ficação ou isolamento. De acordo com certas modalidades, um anti- corpo isolado pode ser substancialmente livre de outro material celular e/ou produtos químicos.
[00139] Como aqui usado, o termo "ligado" ou "ligações" refere-se a uma ligação direta de ligação peptídica entre uma primeira e uma se- gunda sequência de aminoácidos ou uma ligação que envolve uma ter- ceira sequência de aminoácidos que é ligada por peptídeo a e entre a primeira e a segunda sequência de aminoácidos. Por exemplo, um pep-
tídeo ligante ligado à extremidade C-terminal de uma sequência de ami- noácidos e à extremidade N-terminal da outra sequência de aminoáci- dos.
[00140] Como aqui usado, o termo "ligante" refere-se a uma sequên- cia de aminoácidos de dois ou mais aminoácidos de comprimento. O ligante pode consistir em aminoácidos neutros polares ou não polares. Um ligante pode ter, por exemplo, 2 a 100 aminoácidos de comprimento, tal como entre 2 e 50 aminoácidos de comprimento, por exemplo, 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, ou 50 aminoácidos de comprimento. Um ligante pode ser "clivável", por exemplo, por autoclivagem ou clivagem enzimática ou química. Sítios de clivagem em sequências de aminoáci- dos e enzimas e produtos químicos que clivam em tais locais são bem conhecidos na técnica e também são aqui descritos.
[00141] Como aqui usado, o termo "ligação dissulfeto" ou "ligação dissulfeto de cisteína-cisteína" refere-se a uma interação covalente en- tre duas cisteínas em que os átomos de enxofre das cisteínas são oxi- dados para formar uma ligação dissulfeto. A energia média da ligação de uma ligação dissulfeto é cerca de 60 kcal/mol em comparação com 1 a 2 kcal/mol para uma ligação de hidrogênio. No contexto desta inven- ção, as cisteínas que formam a ligação dissulfureto estão dentro das regiões estruturais do anticorpo de cadeia simples e servem para esta- bilizar a conformação do anticorpo. Os resíduos de cisteína podem ser introduzidos, por exemplo, por mutagênese dirigida ao sítio, de modo que ligações dissulfeto de estabilização possam ser feitas dentro da mo- lécula.
[00142] A "designação de saliência no buraco" é análoga à designa- ção de "protuberância e cavidade" e pode ser usada indistintamente.
[00143] Uma "protuberância" ou "saliência" refere-se a pelo menos uma cadeia lateral de aminoácido que se projeta da interface do primeiro polipeptídeo e é, portanto, posicionável em uma cavidade compensató- ria na interface adjacente (ou seja, a interface do segundo polipeptídeo), de modo que para estabilizar o heterodímero e, assim, favorecer a for- mação de heterodímero sobre a formação de homodímero, por exem- plo. A protuberância pode existir na interface original ou pode ser intro- duzida sinteticamente (por exemplo, alterando o ácido nucleico que co- difica a interface). Normalmente, o ácido nucleico que codifica a inter- face do primeiro polipeptídeo é alterado para codificar a protuberância. Para conseguir isso, o ácido nucleico que codifica pelo menos um resí- duo de aminoácido original na interface do primeiro polipeptídeo é subs- tituído por ácido nucleico que codifica pelo menos um resíduo de ami- noácido de importação que tem um volume de cadeia lateral maior do que o resíduo de aminoácido original. O limite superior para o número de resíduos originais que são substituídos é o número total de resíduos na interface do primeiro polipeptídeo. Certos resíduos de importação para a formação de uma protuberância são geralmente resíduos de ami- noácidos de ocorrência natural e são preferencialmente selecionados de arginina (R), fenilalanina (F), tirosina (Y) e triptofano (W).
[00144] A protuberância ou saliência é "posicionável" na cavidade ou buraco, o que significa que a localização espacial da protuberância e cavidade na interface do primeiro polipeptídeo e do segundo polipeptí- deo, respectivamente, e os tamanhos da protuberância e da cavidade são tais que o a protuberância pode estar localizada na cavidade sem perturbar significativamente a associação normal do primeiro e do se- gundo polipeptídeos na interface. Uma vez que protuberâncias como fenilalanina (F), tirosina (Y) e triptofano (W) normalmente não se esten- dem perpendicularmente a partir do eixo da interface, o alinhamento de uma protuberância com uma cavidade correspondente depende da mo- delagem do par protuberância/cavidade com base em uma estrutura tri-
dimensional, tal como a obtida por cristalografia de raios X ou ressonân- cia magnética nuclear (RMN). Isso pode ser alcançado usando técnicas amplamente aceitas na técnica.
[00145] Uma "cavidade" ou "orifício" refere-se a pelo menos uma ca- deia lateral de aminoácido que é recuada da interface do segundo poli- peptídeo e, portanto, acomoda uma protuberância correspondente na interface adjacente do primeiro polipeptídeo. A cavidade pode existir na interface original ou pode ser introduzida sinteticamente (por exemplo, alterando o ácido nucleico que codifica a interface). Normalmente, o ácido nucleico que codifica a interface do segundo polipeptídeo é alte- rado para codificar a cavidade. Para conseguir isso, o ácido nucleico que codifica pelo menos um resíduo de aminoácido original na interface do segundo polipeptídeo é substituído por DNA que codifica pelo menos um resíduo de aminoácido "importado" que tem um volume de cadeia lateral menor do que o resíduo de aminoácido original. O limite superior para o número de resíduos originais que são substituídos é o número total de resíduos na interface do segundo polipeptídeo. Certos resíduos de importação para a formação de uma cavidade são geralmente resí- duos de aminoácidos de ocorrência natural e são preferencialmente se- lecionados de alanina (A), serina (S), treonina (T) e valina (V).
[00146] Os termos "interface", "resíduo de interface", "aminoácido de interface", "resíduo de contato" ou "aminoácido de contato", como aqui usado, normalmente refere-sem a qualquer resíduo de aminoácido pre- sente no domínio que pode estar envolvido nos contatos do primeiro polipeptídeo e do segundo polipeptídeo.
[00147] Um resíduo de "aminoácido original" é aquele que é substi- tuído por um resíduo de "aminoácido de importação" que pode ter um volume de cadeia lateral menor ou maior do que o resíduo original. O resíduo de aminoácido de importação pode ser um resíduo de aminoá-
cido de ocorrência natural ou não natural, mas de preferência é o pri- meiro. Resíduos de aminoácidos de "ocorrência natural" são aqueles resíduos codificados pelo código genético. Por resíduo de aminoácido de "ocorrência não natural" entende-se um resíduo que não é codificado pelo código genético, mas que é capaz de ligar covalentemente resí- duo(s) de aminoácido adjacente(s) na cadeia polipeptídica. Exemplos de resíduos de aminoácidos de ocorrência não natural são norleucina, ornitina, norvalina, homoserina e outros análogos de resíduos de ami- noácidos, tais como aqueles descritos em Ellman et al., Meth. Enzym. 202: 301-336 (1991), por exemplo. Em algumas modalidades, o método da presente invenção pode envolver a substituição de pelo menos um resíduo de aminoácido original, mas mais de um resíduo original pode ser substituído. Normalmente, não mais do que os resíduos totais na interface do primeiro ou segundo polipeptídeo podem compreender re- síduos de aminoácidos originais que são substituídos.
[00148] O termo "competir", como aqui usado em relação a um anti- corpo, significa que um primeiro anticorpo, ou um fragmento de ligação ao antígeno (ou porção) do mesmo, se liga a um epitopo de uma ma- neira suficientemente semelhante à ligação de um segundo anticorpo, ou uma porção de ligação ao antígeno do mesmo, de modo que o resul- tado da ligação do primeiro anticorpo com seu epitopo cognato seja de- tectavelmente diminuído na presença do segundo anticorpo em compa- ração com a ligação do primeiro anticorpo na ausência do segundo an- ticorpo. A alternativa, em que a ligação do segundo anticorpo ao seu epitopo também é detectavelmente diminuída na presença do primeiro anticorpo, pode, mas não precisa ser o caso. Ou seja, um primeiro anti- corpo pode inibir a ligação de um segundo anticorpo ao seu epitopo sem que esse segundo anticorpo iniba a ligação do primeiro anticorpo ao seu respectivo epitopo. No entanto, onde cada anticorpo inibe de forma de-
tectável a ligação do outro anticorpo com seu epitopo ou ligante cog- nato, seja na mesma, maior ou menor extensão, os anticorpos são cha- mados de "competição cruzada" entre si para a ligação de seu respec- tivo epitopo(s). Ambos os anticorpos competidores e de competição cru- zada são abrangidos pela presente invenção. Independentemente do mecanismo pelo qual essa competição ou competição cruzada ocorre (por exemplo, impedimento estérico, mudança conformacional ou liga- ção a um epitopo comum, ou porção do mesmo), o especialista na téc- nica apreciaria, com base nos ensinamentos fornecidos neste docu- mento, que tal anticorpos de competição e/ou de competição cruzada são abrangidos e podem ser úteis para os métodos aqui divulgados.
[00149] Como aqui usado, "citotoxicidade mediada por células de- pendentes de anticorpos" ou "ADCC" refere-se a uma reação mediada por células em que células citotóxicas não específicas que expressam receptores Fc (FcRs) (por exemplo, células assassinas naturais (NK), neutrófilos e macrófagos) reconhecem o anticorpo ligado a uma célula- alvo e, subsequentemente, causam a lise da célula-alvo. A atividade ADCC de uma molécula de interesse pode ser avaliada usando um en- saio ADCC in vitro, tal como o descrito na Patente Norte Americana
5.500.362 ou 5.821.337. As células efetoras úteis para tais ensaios in- cluem células mononucleares de sangue periférico (PBMC) e células NK. Alternativamente, ou adicionalmente, a atividade ADCC da molé- cula de interesse pode ser avaliada in vivo, por exemplo, em um modelo animal como o divulgado em Clynes et al., PNAS (USA), 95: 652-656,
1998.
[00150] Como aqui usado, uma "citotoxicidade dependente do com- plemento" ou "CDC" refere-se à lise de um alvo na presença de com- plemento. A via de ativação do complemento é iniciada pela ligação do primeiro componente do sistema do complemento (C1q) a uma molé-
cula (por exemplo, um anticorpo) complexada com um antígeno cog- nato. Para avaliar a ativação do complemento, um ensaio de CDC, por exemplo, como descrito em Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Me- thods, 202: 163, 1996, podem ser realizados.
[00151] Como aqui usado, os termos "liga-se imunoespecifica- mente", "reconhece imunoespecificamente", "liga-se especificamente", "reconhece especificamente" e termos análogos referem-se a molécu- las, por exemplo, domínios de ligação que se ligam especificamente a um antígeno (por exemplo, epitopo ou complexo imune) e não se ligam especificamente a outra molécula. Uma molécula que se liga especifi- camente a um antígeno pode se ligar a outros peptídeos ou polipeptí- deos com afinidade inferior, conforme determinado por ensaios conhe- cidos na técnica, por exemplo, imunoensaios, BIACORE™ ou outros ensaios. Preferivelmente, as moléculas que se ligam especificamente a um antígeno não apresentam reação cruzada com outras proteínas.
[00152] “Condições moderadamente rigorosas” adequadas incluem pré-lavagem em uma solução de 5 X SSC, 0,5% SDS, 1,0 mM EDTA (pH 8,0); hibridização a 50 °C a 65 °C, 5 X SSC, durante a noite; seguido por lavagem duas vezes a 65 °C por 20 minutos com cada um de 2X, 0,5X e 0,2X SSC contendo SDS a 0,1%.
[00153] Como aqui usado, "condições altamente rigorosas" ou "con- dições de alta rigidez" são aquelas que: (1) empregam baixa força iônica e alta temperatura para a lavagem, por exemplo, cloreto de sódio a 0,015 M/citrato de sódio a 0,0015 M/0,1 % de dodecilsulfato de sódio a 50 °C; (2) empregar durante a hibridização um agente desnaturante, tal como formamida, por exemplo, 50% (v/v) de formamida com 0,1% de albumina de soro bovino/0,1% de Ficoll/0,1% de polivinilpirrolidona/tam- pão de fosfato de sódio a 50 mM em pH 6,5 com cloreto de sódio a 750mM, citrato de sódio a 75 mM a 42 °C; ou (3) empregar 50% de formamida, 5 x SSC (NaCl a 0,75 M, citrato de sódio a 0,075 M), fosfato de sódio a 50 mM (pH 6,8), 0,1% de pirofosfato de sódio, 5 x solução de Denhardt, DNA de espermatozoide de salmão sonicado (50 µg/ml), 0,1% de SDS e 10% de sulfato de dextrana a 42 °C, com lavagens a 42 °C em 0,2 x SSC (cloreto de sódio/citrato de sódio) e 50% de formamida a 55 °C, seguido por uma lavagem de alto rigor consistindo em 0,1 x SSC contendo EDTA a 55 °C. O versado na técnica reconhecerá como ajustar a temperatura, força iônica, etc., como necessário para acomo- dar fatores como o comprimento da sonda e similares.
[00154] As proteínas de ligação, domínios de ligação, CDRs ou anti- corpos (como amplamente definido aqui) podem ser identificados de acordo com as definições de Kabat, Chothia, a acumulação de Kabat e Chothia, AbM, contato, North e/ou definições conformacionais ou qual- quer método de determinação de CDR bem conhecido na técnica. Ver, por exemplo, Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunologi- cal Interest, 5ª edição. (regiões hipervariáveis); Chothia et al., Nature 342:877-883, 1989 (estruturas de laço estrutural). A identidade dos re- síduos de aminoácidos em um anticorpo específico que compõe um CDR pode ser determinada usando métodos bem conhecidos na téc- nica. A definição AbM de CDRs é um meio-termo entre Kabat e Chothia e usa o software de modelagem de anticorpos AbM da Oxford Molecular (Accelrys®). A definição de "contato" de CDRs é baseada em contatos antígenos observados, estabelecidos em MacCallum et al., J . Mol. Biol., 262: 732-745, 1996. A definição "conformacional" de CDRs é baseada em resíduos que fazem contribuições entálpicas para a ligação ao antí- geno (ver, por exemplo, Makabe et al., J. Biol. Chem., 283: 1156-1166, 2008). North identificou conformações CDR canônicas usando um con- junto preferido diferente de definições de CDR (North et al., J. Mol. Biol. 406: 228-256, 2011). Em outra abordagem, aqui referida como a "defi- nição conformacional" de CDRs, as posições dos CDRs podem ser iden- tificadas como os resíduos que fazem contribuições entálpicas para a ligação ao antígeno (Makabe et al., J Biol. Chem. 283: 1156-1166, 2008). Ainda outras definições de limite de CDR podem não seguir es- tritamente uma das abordagens acima, mas, no entanto, se sobrepõem a pelo menos uma parte dos CDRs de Kabat, embora possam ser en- curtados ou alongados à luz da previsão ou descobertas experimentais de resíduos ou grupos de resíduos específicos ou mesmo CDRs inteiros não afetam significativamente a ligação ao antígeno. Como aqui usado, um CDR pode referir-se a CDRs definidos por qualquer abordagem co- nhecida na técnica, incluindo combinações de abordagens. Os métodos usados neste documento podem utilizar CDRs definidos de acordo com qualquer uma dessas abordagens. Para qualquer modalidade contendo mais de um CDR, os CDRs (ou outro resíduo do anticorpo) podem ser definidos de acordo com qualquer um de Kabat, Chothia, estendido (combinação de Kabat e Chothia), North, estendido, AbM, contato e/ou definições conformacionais.
[00155] Os resíduos em um domínio variável são numerados de acordo com Kabat, que é um sistema de numeração usado para regiões variáveis de cadeia pesada ou regiões variáveis de cadeia leve da com- pilação de anticorpos. Ver, Kabat et al., Sequences of Proteins of Immu- nological Interest, 5ª Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991. Usando este sistema de numeração, a se- quência de aminoácidos linear real pode conter menos ou mais amino- ácidos correspondentes a um encurtamento de, ou inserção em, um FR ou CDR da região variável. Por exemplo, uma região variável de cadeia pesada pode incluir uma única inserção de aminoácido (resíduo 52a de acordo com Kabat) após o resíduo 52 de H2 e resíduos inseridos (por exemplo, resíduos 82a, 82b e 82c, de acordo com Kabat) após FR de cadeia pesada resíduo 82. A numeração de Kabat de resíduos pode ser determinada para um determinado anticorpo por alinhamento em regi-
ões de homologia da sequência do anticorpo com uma sequência nu- merada de Kabat "padrão". Vários algoritmos para atribuição de nume- ração de Kabat estão disponíveis. O algoritmo implementado na versão
2.3.3 do Abysis (www.abysis.org) foi usado aqui para atribuir numeração de Kabat às regiões variáveis VL CDR1, VL CDR2, VL CDR3, VH CDR2 e VH CDR3. A definição AbM foi usada para VH CDR1. Posições espe- cíficas de resíduos de aminoácidos em um anticorpo também podem ser numeradas de acordo com Kabat.
[00156] Como aqui usado, o termo "biblioteca de exibição de fago" refere-se a uma população de bacteriófagos, cada um dos quais contém um cDNA estranho fundido de forma recombinante em estrutura com uma proteína de superfície. O fago exibe a proteína estranha codificada pelo cDNA em sua superfície. Após a replicação em um hospedeiro bac- teriano, tipicamente E. coli, o fago que contém o cDNA estranho de in- teresse é selecionado pela expressão da proteína estranha na superfí- cie do fago.
[00157] O termo "epitopo" refere-se à porção de uma molécula capaz de ser reconhecida por, fazer contato e/ou ser ligada por um anticorpo em uma ou mais das regiões de ligação ao antígeno do anticorpo co- nhecidas como paratopo. Um antígeno simples pode ter mais de um epitopo. Assim, diferentes anticorpos podem se ligar a diferentes áreas em um antígeno e podem ter diferentes efeitos biológicos. Os epitopos geralmente consistem em um agrupamento de moléculas de superfície quimicamente ativa, como aminoácidos ou cadeias laterais de açúcar, e têm características estruturais tridimensionais específicas, bem como características de carga específicas. Conforme usado neste documento, os epitopos podem ser conformacionais ou lineares. Um epitopo confor- macional é produzido por aminoácidos justapostos espacialmente de di- ferentes segmentos da cadeia polipeptídica linear. Um epitopo linear é aquele produzido por resíduos de aminoácidos adjacentes em uma ca- deia polipeptídica. Em certas modalidades, um epitopo pode incluir fra- ções de sacarídeos, grupos fosforila ou grupos sulfonila no antígeno.
[00158] O termo "epitopo antigênico", tal como aqui usado, é definido como uma porção de um polipeptídeo ao qual um anticorpo pode se ligar especificamente conforme determinado por qualquer método bem conhecido na técnica, por exemplo, por imunoensaios convencionais. Um "epitopo não linear" ou "epitopo conformacional" compreende poli- peptídeos não contíguos (ou aminoácidos) dentro da proteína antigê- nica à qual se liga um anticorpo específico para o epitopo. Uma vez que um epitopo desejado em um antígeno é determinado, é possível gerar anticorpos para esse epitopo, por exemplo, usando as técnicas aqui descritas.
[00159] Os termos "ligação específica" ou "especificamente ligado", quando usados em referência à interação de um anticorpo e uma prote- ína ou peptídeo, referem-se a uma interação que depende da presença de uma estrutura particular (isto é, o antígeno determinante ou epitopo) na proteína; em outras palavras, o anticorpo está reconhecendo e se ligando a uma estrutura de proteína específica, ao invés de proteínas em geral. Por exemplo, se um anticorpo é específico para o epitopo "A", a presença de uma proteína contendo o epitopo A (ou A livre, não rotu- lado) em uma reação contendo "A" rotulado e o anticorpo irá reduzir a quantidade de A rotulado ligado ao anticorpo.
[00160] Em certas modalidades, "se liga especificamente" significa, por exemplo, que um anticorpo se liga a uma proteína com um KD de cerca de 0,1 nM ou menos, mas mais geralmente menos do que cerca de 1μM. Em certas modalidades, "se liga especificamente" significa que um anticorpo se liga a um alvo às vezes com um KD de pelo menos cerca de 0,1 μM ou menos, em outras vezes, pelo menos cerca de 0,01 μM ou menos, e outras vezes pelo menos cerca de 1 nM ou Menos.
Devido à identidade de sequência entre proteínas homólogas em espé- cies diferentes, a ligação específica pode incluir um anticorpo que reco- nhece uma proteína em mais de uma espécie (por exemplo, GUCY2c humano e GUCY2c de camundongo). Da mesma forma, devido à ho- mologia dentro de certas regiões de sequências polipeptídicas de pro- teínas diferentes, a ligação específica pode incluir um anticorpo que re- conhece mais de uma proteína. Entende-se que, em certas modalida- des, um anticorpo ou porção de ligação que se liga especificamente a um primeiro alvo pode ou não se ligar especificamente a um segundo alvo. Tal como, "ligação específica" não requer necessariamente (em- bora possa incluir) ligação exclusiva, isto é, ligação a um único alvo. Assim, um anticorpo pode, em algumas modalidades, ligar especifica- mente mais de um alvo. Em certas modalidades, vários alvos podem ser ligados pelo mesmo sítio de ligação ao antígeno no anticorpo. Por exem- plo, um anticorpo pode, em certos casos, compreender dois sítios de ligação ao antígeno idênticos, cada um dos quais se liga especifica- mente ao mesmo epitopo em duas ou mais proteínas. Em certas moda- lidades alternativas, um anticorpo pode ser multiespecífico e compreen- der pelo menos dois sítios de ligação ao antígeno com especificidades diferentes. A título de exemplo não limitativo, um anticorpo biespecífico pode compreender um sítio de ligação ao antígeno que reconhece um epitopo em uma proteína (por exemplo, CD3 humano) e compreende ainda um segundo sítio de ligação ao antígeno diferente que reconhece um epitopo diferente em uma segunda proteína. Geralmente, mas não necessariamente, a referência à ligação significa ligação específica.
[00161] Um anticorpo que se liga especificamente a um antígeno pode se ligar a outros peptídeos ou polipeptídeos com afinidade inferior, conforme determinado por ensaios conhecidos na técnica, por exemplo, imunoensaios, BIACORE ™ ou outros ensaios. De preferência, o anti- corpo que se liga especificamente a um antígeno não apresenta reação cruzada com outras proteínas.
[00162] Os termos "ligação não específica" ou “ligação à base”, quando usados em referência à interação de um anticorpo e uma prote- ína ou peptídeo, referem-se a uma interação que não depende da pre- sença de uma estrutura particular (isto é, o anticorpo se liga a proteínas em geral, em vez de uma estrutura particular, tal como um epitopo).
[00163] O termo "kon" ou "ka", como aqui usado, refere-se à constante de taxa para associação de um anticorpo a um antígeno. Especifica- mente, as constantes de taxa (kon/ka e koff/kd) e constantes de dissocia- ção de equilíbrio são medidas usando o anticorpo inteiro (isto é, biva- lente) e proteínas monoméricas GUCY2c.
[00164] O termo "koff" ou “kd,” como aqui usado, refere-se à constante de taxa para a dissociação de um anticorpo do complexo anticorpo/an- tígeno.
[00165] O termo "KD", como aqui usado, refere-se à constante de dis- sociação de equilíbrio de uma interação anticorpo-antígeno.
[00166] Como aqui usado, o termo "afinidade de ligação" geralmente refere-se à força da soma total de interações não covalentes entre um único sítio de ligação de uma molécula (por exemplo, um anticorpo) e seu parceiro de ligação (por exemplo, um antígeno). A menos que indi- cado de outra forma, como aqui usado, "afinidade de ligação" refere-se à afinidade de ligação intrínseca que reflete uma interação 1:1 entre os membros de um par de ligação (por exemplo, anticorpo e antígeno). A afinidade de uma molécula X por seu parceiro Y geralmente pode ser representada pela constante de dissociação (KD). A afinidade de uma molécula X por seu parceiro Y geralmente pode ser representada pela constante de dissociação (Kd). Por exemplo, o Kd pode ser cerca de 200 nM, 150 nM, 100 nM, 60 nM, 50 nM, 40 nM, 30 nM, 20 nM, 10 nM, 8 nM, 6 nM, 4 nM, 2 nM, 1 nM, ou mais forte. A afinidade pode ser me- dida por métodos comuns conhecidos na técnica, incluindo aqueles aqui descritos. Os anticorpos de baixa afinidade geralmente se ligam ao an- tígeno lentamente e tendem a se dissociar prontamente, enquanto os anticorpos de alta afinidade geralmente se ligam ao antígeno mais rapi- damente e tendem a permanecer ligados por mais tempo. Uma varie- dade de métodos de medição da afinidade de ligação é conhecida na técnica, qualquer um dos quais pode ser usado para os fins da presente invenção. Em particular, o termo "afinidade de ligação" se destina a re- ferir-se à taxa de dissociação de uma interação antígeno-anticorpo par- ticular. O KD é a relação da taxa de dissociação, também chamada de "índice de desaceleração (koff)", para a taxa de associação ou "índice de associação (kon)". Assim, KD é igual a koff/kon e é expresso como uma concentração molar (M). Conclui-se que quanto menor o KD, mais forte é a afinidade de ligação. Portanto, um KD de 1 μM indica afinidade de ligação fraca em comparação com um KD de 1 nM. Os valores de KD para anticorpos podem ser determinados usando métodos bem estabe- lecidos na técnica. Um método para determinar o KD de um anticorpo é usando ressonância plasmônica de superfície (SPR), normalmente usando um sistema biossensor, tal como um sistema BIACORE™. A análise cinética BIACORE™ compreende a análise da ligação e disso- ciação de um antígeno de chips com moléculas imobilizadas (por exem- plo, moléculas compreendendo domínios de ligação de epitopo), em sua superfície. Outro método para determinar o KD de um anticorpo é usando Interferometria de Bio-camada, normalmente usando tecnologia OCTET® (sistema Octet QKe, ForteBio).
[00167] "Biologicamente ativo", "atividade biológica" e "característi- cas biológicas" com respeito a um anticorpo biespecífico da presente invenção, tal como um anticorpo, fragmento ou derivado do mesmo, sig- nifica ter a capacidade de se ligar a uma molécula biológica, exceto onde especificado de outra forma.
[00168] Como aqui sado, os termos "ácidos nucleicos" e "sequências de nucleotídeos" incluem moléculas de DNA (por exemplo, cDNA ou DNA genômico), moléculas de RNA (por exemplo, mRNA), combina- ções de moléculas de DNA e RNA ou DNA híbrido/Moléculas de RNA e análogos de moléculas de DNA ou RNA. Tais análogos podem ser ge- rados usando, por exemplo, análogos de nucleotídeos, que incluem, mas não estão limitados a, inosina ou bases tritiladas. Esses análogos também podem compreender moléculas de DNA ou RNA compreen- dendo estruturas modificadas que emprestam atributos benéficos às moléculas, tais como, por exemplo, resistência a nuclease ou uma ca- pacidade aumentada de atravessar membranas celulares. Os ácidos nucleicos ou sequências de nucleotídeos podem ser de fita única, fita dupla, podem conter tanto porções de fita única quanto de fita dupla, e podem conter porções de fita tripla, mas preferivelmente são DNA de fita dupla.
[00169] A presente invenção também inclui polinucleotídeos que co- dificam os anticorpos da invenção, incluindo os polipeptídeos e regiões de ligação dos anticorpos. Os polinucleotídeos que codificam as molé- culas da invenção podem ser obtidos e a sequência de nucleotídeos dos polinucleotídeos determinada por qualquer método conhecido na téc- nica.
[00170] Os polinucleotídeos que codificam os anticorpos da presente invenção podem incluir o seguinte: apenas a sequência codificadora para a variante, a sequência codificadora para a variante e sequências codificadoras adicionais tais como um polipeptídeo funcional, ou uma sequência sinal ou secretória ou uma sequência de pró-proteína; a se- quência codificadora para o anticorpo e sequência não codificadora, tal como íntrons ou sequência não codificadora 5’ e/ou 3’ da sequência co- dificadora para o anticorpo. O termo “polinucleotídeo codificando um an- ticorpo” abrange um polinucleotídeo que inclui sequência codificadora adicional para a variante, porém também um polinucleotídeo que inclui sequência codificadora e/ou não codificadora adicional. É conhecido na técnica que uma sequência de polinucleotídeo que é otimizada para uma célula de hospedeiro específica/sistema de expressão pode ser prontamente obtida da sequência de aminoácido da proteína desejada (veja GENEART® AG, Regensburg, Alemanha).
[00171] Os anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno dos mes- mos da presente invenção podem ter substituições de aminoácido con- servativas ou não essenciais adicionais, que não têm um efeito subs- tancial nas funções de polipeptídeo. Se uma substituição particular será tolerada ou não, isto é, não afetará adversamente propriedades biológi- cas, tais como atividade de ligação, pode ser determinado em Bowie, JU et al. Science 247: 1306-1310,1990 ou Padlan et al. FASEB J. 9: 133-139, 1995.
[00172] Como aqui usado, o termo "isolado" refere-se ao material que é removido de seu ambiente original (por exemplo, o ambiente na- tural se ele é de ocorrência natural). Por exemplo, um polinucleotídeo de ocorrência natural ou polipeptídeo presente em um animal vivo não é isolado, porém o mesmo polinucleotídeo ou polipeptídeo que é sepa- rado de alguns ou todos os materiais coexistentes no sistema natural é isolado. Tal polinucleotídeo pode ser parte de um vetor e/ou tal polinu- cleotídeo ou polipeptídeo pode ser parte de uma composição, por exem- plo, uma mistura, solução ou suspensão ou compreendendo uma célula isolada ou uma célula cultivada que compreende o polinucleotídeo ou polipeptídeo, e ainda ser isolado no vetor ou composição que não é parte de seu ambiente natural.
[00173] Como aqui usado, o termo "replicon" refere-se a qualquer elemento genético, tal como um plasmídeo, um cromossomo ou um ví- rus, que se comporta como uma unidade autônoma de replicação de polinucleotídeo dentro de uma célula.
[00174] Como aqui usado, o termo "operacionalmente ligado" refere-
se a uma situação em que os componentes descritos estão em um re- lacionamento que lhes permite funcionar da maneira pretendida. Por exemplo, uma sequência de controle "operacionalmente ligada" a uma sequência codificadora é ligada de maneira tal que a expressão da se- quência codificadora seja alcançada em condições adequadas ou com- patíveis com a sequência de controle. Geralmente, "operacionalmente ligado" significa que as sequências de DNA sendo ligadas são contíguas e, no caso de um condutor secretor, contíguas e em fase de leitura. En- tretanto, realçadores não precisam ser contíguos. A ligação é realizada por ligação em sítios de restrição convenientes. Se tais sítios não exis- tem, os adaptadores de oligonucleotídeos sintéticos ou ligantes são usa- dos de acordo com prática convencional.
[00175] Como aqui usado, "vetor” significa uma construção, que é capaz de liberar, e, preferivelmente, expressar, um ou mais genes ou sequências de interesse em uma célula de hospedeiro. Exemplos de vetores incluem, mas não são limitados a, vetores virais, vetores de ex- pressão de RNA ou DNA nus, plasmídeo, cosmídeo ou vetores de fago, vetores de expressão de DNA ou RNA associados com agentes de con- densação catiônicos, vetores de expressão DNA ou RNA encapsulados em lipossomas, e certas células eucarióticas, tais como células produ- toras.
[00176] Como aqui usado, o termo “sequência de controle de expres- são" ou "sequência de controle" refere-se a uma sequência de polinu- cleotídeo que é necessária para efetuar a expressão de uma sequência codificadora a qual ela é ligada. A natureza de tais sequências de con- trole difere dependendo do organismo do hospedeiro. Por exemplo, em procariontes, tais sequências de controle geralmente incluem um pro- motor, um sítio de ligação ribossômico e terminadores e, em alguns ca- sos, realçadores. O termo "sequência de controle", portanto, pretende incluir no mínimo todos os componentes cuja presença é necessária para a expressão, e também pode incluir componentes adicionais cuja presença é vantajosa, por exemplo, sequências condutoras.
[00177] Uma "célula hospedeira" inclui uma célula individual ou cul- tura de células que pode ser ou foi um recipiente para vetores para in- corporação de inserções de polinucleotídeos. Células de hospedeiro in- cluem progênie de uma única célula hospedeira, e a progênie pode não necessariamente ser completamente idêntica (em morfologia ou em complemento de DNA genômico) à célula precursora original devido à mutação natural, acidental, ou deliberada. Uma célula hospedeira inclui células transfectadas in vivo com um polinucleotídeo desta invenção.
[00178] Como aqui usado, “células de mamífero” incluem referência a células derivadas de mamíferos incluindo humanos, ratos, camundon- gos, porquinho-da-índia, chimpanzés ou macacos. As células podem ser cultivadas in vivo ou in vitro.
[00179] Como aqui usado, o termo "produto purificado" refere-se a uma preparação do produto que foi isolada dos constituintes celulares com que o produto é normalmente associado e/ou de outros tipos de células que podem estar presentes na amostra de interesse.
[00180] Como aqui usado, "substancialmente puro" refere-se ao ma- terial que é pelo menos 50% puro (isto é, livre de contaminantes), mais preferivelmente, pelo menos 90% puro, mais preferivelmente, pelo me- nos 95% puro, ainda mais preferivelmente, pelo menos 98% puro, e mais preferivelmente, pelo menos 99% puro.
[00181] Como aqui usado, o termo "câncer" ou “canceroso” refere-se a ou descreve uma condição fisiológica em mamíferos que é tipicamente caracterizada por crescimento celular desregulado, uma neoplasia ou um tumor resultante de crescimento descontrolado anormal de células. Em alguns aspectos, câncer refere-se a um tumor primário maligno sem metástase, que permaneceu localizado. Em outros aspectos, câncer re- fere-se a um tumor maligno, que invadiu e destruiu estruturas corporais vizinhas e se espalhou para sítios distantes. Em alguns aspectos, o cân- cer é associado com um antígeno de câncer específico. Exemplos de câncer incluem, mas não são limitados a, câncer da cavidade oral e fa- ringe, o sistema digestivo (por exemplo, o esôfago, estômago, intestino delgado, cólon, reto, ânus, fígado, vesícula biliar, apêndice, ductos bili- ares e pâncreas), ou o sistema endócrino. Em certas modalidades, o câncer de sistema digestivo é um câncer do esôfago, estômago, intes- tino delgado, cólon, reto, ânus, fígado, vesícula biliar, apêndice, ductos biliares e pâncreas.
[00182] Como aqui usado, o termo "câncer de esôfago" destina-se a incluir a definição médica bem aceita que define câncer de esôfago como uma condição médica caracterizada por câncer de células do esô- fago. Exemplos de câncer de esôfago incluem adenocarcinoma, carci- noma de células escamosas, coriocarcinoma, linfoma, sarcoma, e cân- cer de célula pequena.
[00183] Câncer "gastrointestinal" (GI) é um termo para o grupo de cânceres que afetam o sistema digestivo. Como aqui usado, o termo "câncer de estômago" ou “câncer gástrico” destina-se a incluir a defini- ção médica bem aceita que define câncer de estômago como uma con- dição médica caracterizada por câncer de células do estômago. Em par- ticular, câncer de estômago ou câncer gástrico é uma doença em que células malignas se formam no revestimento do estômago. Câncer de estômago ou gástrico pode se desenvolver em qualquer parte do estô- mago e pode se espalhar por todo o estômago e para outros órgãos; particularmente o esôfago, pulmões e o fígado.
[00184] Como aqui usado, o termo "câncer colorretal" ou "câncer de intestino", destina-se a incluir a definição médica bem aceita que define câncer colorretal como uma condição médica caracterizada por câncer de células do trato intestinal abaixo do intestino delgado (isto é, o intes-
tino grosso (cólon), incluindo o ceco, cólon ascendente, cólon trans- verso, cólon descendente, e cólon sigmóide, e reto). Além disso, como aqui usado, o termo "câncer colorretal" destina-se a incluir também con- dições médicas que são caracterizadas por câncer de células do duo- deno e intestino delgado (jejuno e íleo). A definição de câncer colorretal usada aqui é mais expansiva que a definição médica comum, mas é fornecida como tal, uma vez que as células do duodeno e intestino del- gado também contém GUCY2c.
[00185] Como aqui usado, o termo “célula maligna”, ou “malignidade” refere-se a tumores ou células tumorais que são invasivos e/ou capazes de sofrer metástase, isto é, uma célula cancerosa.
[00186] Como aqui usado, o termo “tratar”, “tratando” ou “tratamento” é um método para obter resultados benéficos ou clínicos desejados. Para o propósito da presente invenção, tratamento é definido como a administração de uma molécula de anticorpo GUCY2c (por exemplo, anticorpo monoclonal GUCY2c ou anticorpo biespecífico ou multiespe- cífico GUCY2c) a um indivíduo, por exemplo, um paciente. Tal adminis- tração pode ser, por exemplo, por administração direta ao indivíduo ou por aplicação a um tecido isolado ou célula de um indivíduo que é retor- nado para o indivíduo. A molécula de anticorpo GUCY2c pode ser ad- ministrada sozinha ou em combinação com um ou mais agentes. O tra- tamento pode ser para curar, sarar, aliviar, atenuar, alterar, remediar, melhorar, paliar, aperfeiçoar ou afetar o distúrbio, os sintomas do distúr- bio ou a predisposição para o transtorno, por exemplo, um câncer. Em algumas modalidades, o tratamento é útil em qualquer um ou mais dos seguintes: (a) tratamento, prevenção, ou melhora de um ou mais sinto- mas de uma condição associada com células malignas expressando GUCY2c em um indivíduo (por exemplo, câncer relacionado ao gastroi- ntestinal tal como câncer colorretal (CRC)); (b) inibição do crescimento ou progressão de tumor em um indivíduo que tem um tumor maligno expressando GUCY2c; (c) inibição da metástase de células de câncer (maligno) expressando GUCY2c em um indivíduo que tem uma ou mais células malignas expressando GUCY2c; (d) indução da regressão (por exemplo, regressão a longo prazo) de um tumor expressando GUCY2c; (e) exercer a atividade citotóxica em células malignas expressando GUCY2c; (f) aumento da sobrevivência livre de progressão de um indi- víduo com um distúrbio associado com GUCY2c; (g) aumento da sobre- vivência geral de um indivíduo com um distúrbio associado com GUCY2c; (h) redução do uso de agentes quimioterápicos ou citotóxicos adicionais em um indivíduo com um distúrbio associado com GUCY2c; (i) redução da carga de tumor em um indivíduo com um distúrbio asso- ciado com GUCY2c; ou (j) bloqueio de interação GUCY2c com outros fatores a serem ainda identificados. Embora não desejando ser limitado pela teoria, acredita-se que o tratamento causa a inibição, esgotamento ou morte de uma célula in vitro ou in vivo, ou de outra forma reduz a capacidade de uma célula, incluindo uma célula aberrante, de mediar um distúrbio, por exemplo, um distúrbio como descrito aqui, tal como câncer.
[00187] Um “agente antidiarreico” como aqui usado significa um me- dicamento que para ou retarda diarreia. Além de cuidados de suporte que podem incluir administração de fluidos junto com a interrupção da lactose, álcool, produtos de alta osmolaridade, esses antidiarreicos po- dem ser coadministrados ou em combinação com GUCY2c biespecífica. Agentes antidiarreicos incluem, mas não são limitados a, subgalato de bismuto, lactobacillus acidophilus, saccharomyces boulardii, lopera- mida/simeticona, atropina/difenoxilato, atropina/difenoxina, saccha- romyces boulardii lyo, lactobacillus acidophilus, loperamida, subsalici- lato de bismuto, lactobacillus acidophilus/lactobacillus bulgaricus, lacto- bacillus rhamnosus, atapulgita, crofelemer, fluoroquinolona, antibiótico ou octreotida. Ver, Bensen et al. Recommended Guidelines for the trea- tment of Cancer Treatment-Induced Diarrhea. Journal of Clinical Onco- logy 14: 2918-2926, 2004.
[00188] Como aqui usado, o termo “indivíduo” destina-se a incluir qualquer animal (por exemplo, um mamífero), incluindo, mas não limi- tado a, seres humanos, primatas não humanos, roedores, e similares, que deve ser o destinatário de um tratamento particular. Por exemplo, um indivíduo pode ser um paciente (por exemplo, um paciente humano ou um paciente veterinário), tendo um câncer. Tipicamente, os termos "pessoa," "indivíduo" e "paciente" são usados alternadamente em refe- rência a um indivíduo humano.
[00189] O termo “animais não humanos” da invenção inclui todos os vertebrados não humanos, por exemplo, mamíferos não humanos e não mamíferos, tais como primatas não humanos, ovelhas, cães, vacas, ga- linhas, anfíbios, répteis, camundongos, ratos, coelhos ou cabras, etc., a menos que de outro modo indicado.
[00190] Como aqui usado, o termo "farmaceuticamente aceitável" re- fere-se a um produto ou composto aprovado (ou aprovável) por uma agência reguladora do governo Federal ou um governo do estadual ou listado na Farmacopeia Norte-Americana ou outra farmacopeia geral- mente reconhecida para uso em animais, incluindo humanos.
[00191] Como aqui usado, os termos "excipiente, veículo ou adju- vante farmaceuticamente aceitável" ou "veículo farmacêutico aceitável" referem-se a um excipiente, veículo ou adjuvante que pode ser adminis- trado a um indivíduo, junto com pelo menos um anticorpo da presente divulgação, e que não destrói a atividade do anticorpo. O excipiente, veículo, ou adjuvante deve ser não tóxico quando administrado com um anticorpo em doses suficientes para liberar um efeito terapêutico.
[00192] Como aqui usado, o termo “melhoramento” significa uma di- minuição ou melhora de um ou mais sintomas em comparação com a não administração de uma molécula de anticorpo da invenção. “Melho- ramento” também inclui encurtamento ou redução na duração de um sintoma.
[00193] Como aqui usado, os termos "prevenir", "prevenindo" e "pre- venção" referem-se à prevenção da recorrência ou início de um ou mais sintomas de um distúrbio em um indivíduo como resultado da adminis- tração de um agente profilático ou terapêutico.
[00194] Como aqui usado, uma “quantidade eficaz,” "quantidade te- rapeuticamente eficaz,” “quantidade terapeuticamente suficiente,” ou “dosagem eficaz” referem-se a qualquer quantidade de um agente tera- pêutico que é eficaz ou suficiente, após administração de dose única ou múltipla a um indivíduo, na prevenção, cura, melhoria, tratamento ou gestão de uma doença, distúrbio ou efeito colateral, ou diminuição da taxa de avanço de uma doença ou distúrbio, ou no prolongamento da cura, alívio, atenuação ou melhoramento da condição de um indivíduo com um distúrbio como descrito aqui além do esperado na ausência de tal tratamento. O termo também inclui dentro de seu escopo, quantida- des eficazes para melhorar a função fisiológica normal. Uma quantidade eficaz pode ser considerada no contexto de administrar um ou mais agentes terapêuticos, e um único agente pode ser considerado determi- nado em uma quantidade eficaz se, em conjunto com um ou mais outros agentes, um resultado desejável pode ser ou é alcançado.
[00195] Como aqui usado, “inibindo o crescimento” do tumor ou cân- cer refere-se a retardar, cessar, interromper ou parar seu crescimento e/ou metástases e não indica necessariamente uma eliminação total do crescimento do tumor.
[00196] Potência é uma medida da atividade de um agente terapêu- tico expresso em termos da quantidade necessária para produzir um efeito de determinada intensidade. Um agente altamente potente evoca uma resposta maior em baixas concentrações em comparação com um agente de menor potência que evoca uma resposta menor em baixas concentrações. Potência é uma função de afinidade e eficácia. A eficá- cia refere-se à capacidade do agente terapêutico de produzir uma res- posta biológica após se ligar a um ligante alvo e à magnitude quantita- tiva dessa resposta. Como aqui usado, o termo “metade da concentra- ção eficaz máxima (EC50)” refere-se à concentração de um agente tera- pêutico que causa uma resposta no meio do caminho entre a linha de base e máxima após um tempo de exposição especificado. O agente terapêutico pode causar inibição ou estimulação. O valor de EC50 é co- mumente usado, e é usado aqui, como uma medida de potência.
[00197] Como aqui usado, “terapia de combinação” ou administração “em combinação com” refere-se ao uso de mais do que um agente pro- filático e/ou terapêutico. O uso do termo “terapia de combinação” ou "em combinação" não restringe a ordem em que agentes profiláticos e/ou terapêuticos são administrados a um indivíduo com um distúrbio. Em outras palavras, a terapia de combinação pode ser feita por tratamento separado, sequencial ou simultâneo com os agentes terapêuticos. Em caso de “administração sequencial”, o primeiro agente administrado pode estar exercendo algum efeito fisiológico no indivíduo quando o se- gundo agente é administrado ou se torna ativo no indivíduo.
[00198] O termo “administração simultânea” como aqui usado em re- lação à administração de agente profilático e/ou terapêutico refere-se à administração de agentes de modo que os agentes individuais estão presentes dentro de um indivíduo ao mesmo tempo. Administração si- multânea pode ser afetada pelas moléculas sendo formuladas em uma única composição, ou em composições separadas administradas ao mesmo tempo ou em tempo similar. Administração sequencial pode es- tar em qualquer ordem como necessário.
[00199] Como aqui usado, “GUCY2c,” refere-se a guanilila ciclase C de mamífero (GUCY2c), preferivelmente proteína GUCY2c humana. O termo “GUCY2c” pode ser usado alternadamente com o termo “GUCY2C”. Uma sequência de nucleotídeo para GUCY2c humana é di- vulgada como Acesso GenBank No.: NM.sub.-004963, que é incorpo- rado aqui por referência. A sequência de aminoácido para GUCY2c hu- mana é divulgada como Acesso GenBank No. NP.sub.-004954, que é incorporado aqui por referência.
[00200] Tipicamente, uma variante alélica de ocorrência natural tem uma sequência de aminoácido pelo menos 95%, 97% ou 99% idêntica à proteína descrita em Acesso GenBank No. NP.sub.-004954. A prote- ína GUCY2c é caracterizada como uma proteína de receptor de super- fície celular de transmembrana, e acredita-se que desempenhe um pa- pel crítico na manutenção do fluido intestinal, homeostase de eletrólitos e proliferação celular.
[00201] Como aqui usado, um “anticorpo que se liga a GUCY2c,” um “anticorpo que reconhece GUCY2c,” um “anticorpo anti-GUCY2c,” uma “molécula de anticorpo anti-GUCY2c” ou um “anticorpo GUCY2c” com- preende uma molécula que combina pelo menos um domínio de ligação de um anticorpo (como definido aqui) com pelo menos um domínio de ligação de um anticorpo anti-GUCY2c (como definido neste pedido). A molécula de anticorpo GUCY2c da presente invenção inclui anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos que interagem com ou reconhecem, por exemplo, se ligam (por exemplo, se ligam especifi- camente) a GUCY2c, por exemplo, GUCY2c humana, GUCY2c de ca- mundongo, GUCY2c de rato, GUCY2c cinomolga.
[00202] O termo “Cluster de diferenciação 3” ou “CD3” refere-se a um complexo de proteína multimérico, conhecido historicamente como o complexo T3, e é composto de quatro cadeias de polipeptídeos distin- tas; epsilon (ε), gama (γ), delta (δ) e zeta (ζ) que se agrupam e funcio- nam como três pares de dímeros (εγ, εδ, ζζ). O complexo CD3 serve como um correceptor de célula T que se associa não covalentemente com o receptor de célula T (TCR) (Smith-Garvin et al. 2009) e gera um sinal de ativação em linfócitos T. O complexo de proteína CD3 é uma característica definidora da linhagem de células T, portanto, os anticor- pos CD3 podem ser usados efetivamente como marcadores de células T (Chetty e Gatter, Journal of Pathology, Vol 172, 4, 303-301 (1994)). Sabe-se bem que anticorpos CD3 induzem a geração de células T cito- tóxicas por meio da ativação da produção de linfocina endógena e são capazes de matar seletivamente alvos tumorais (Yun et al., Cancer Re- search, 49:4770-4774, 1989).
[00203] Mais especificamente, células T expressam complexos TCR que são capazes de induzir respostas imune específicas do antígeno (Smith-Garvin et al., Annula Review of Immunology, 27: 1, 591-619 (2009)). Antígenos são peptídeos expressados por células tumorais e células infectadas por vírus capazes de estimular respostas imunes. An- tígenos expressos intracelularmente são ligados às principais moléculas de histocompatibilidade classe I (MHC classe I) e transportados para a superfície onde são expostos às células T. Se a afinidade de ligação do TCR ao MHC de classe I no complexo com o antígeno for suficiente, a formação de uma sinapse imune será iniciada. Sinalização através da sinapse imune é mediada pelos correceptores CD3 que formam dímeros εδ, εγ e ζζ. Esses dímeros se associam com o TCR e geram um sinal de ativação em linfócitos T. Esta cascata de sinalização direciona morte mediada por células T da célula expressando antígeno. Citotoxicidade é mediada pela liberação e transferência de granzima B e perforina da célula T para a célula alvo.
[00204] Como aqui usado, um "anticorpo que se liga a CD3", um "an- ticorpo que reconhece CD3", um "anticorpo anti-CD3", uma "molécula de anticorpo CD3" ou um "anticorpo CD3" incluem anticorpos e frag- mentos de ligação ao antígeno dos mesmos que reconhecem especifi- camente uma subunidade de CD3 única (por exemplo, épsilon, delta,
gama ou zeta), bem como anticorpos e fragmentos de ligação ao antí- geno dos mesmos que reconhecem especificamente um complexo di- mérico de duas subunidades CD3 (por exemplo, dímeros CD3 gama/épsilon, delta/épsilon, e zeta/zeta). O CD3 épsilon humano é indi- cado em Acesso GenBank No. NM_000733. Os anticorpos e fragmen- tos de ligação ao antígeno da presente invenção podem ligar CD3 solú- vel e/ou CD3 expresso na superfície celular. CD3 solúvel inclui proteínas CD3 naturais, bem como variantes de proteína CD3 recombinante, tais como, por exemplo, construções de CD3 monoméricos e diméricos, que não possuem um domínio de transmembrana ou não estão de outro modo associados com uma membrana celular.
[00205] Anticorpos direcionados contra CD3 são capazes de gerar um sinal de ativação em linfócitos T. Outros ligantes de ativação de cé- lulas T podem ser usados bem como, incluindo, sem limitação, CD28, CD134, CD137 e CD27.
[00206] Os anticorpos biespecíficos CD3 contornam a necessidade de envolvimento de MHC-peptídeo/TCR e, em vez disso, recrutam cé- lulas T para células alvo expressando o antígeno de superfície celular. Uma subdivisão do biespecífico se liga a um antígeno de superfície ce- lular associado ao tumor, e a outra subdivisão se liga à proteína CD3, que é uma parte do complexo TCR em células T. Coenvolvimento de CD3 em células T e antígeno alvo em células tumorais por meio de um anticorpo biespecífico leva a resposta citotóxica. Portanto, sem ser limi- tado pela teoria, acredita-se que anticorpos biespecíficos da presente invenção pode permitir que a célula T contorne a necessidade de inte- ração do TCR e MHC classe I em complexo com antígeno e, em vez disso, redirecione as células T para as células alvo por meio do coen- volvimento direto de CD3 (tal como CD3 epsilon) expresso na célula T e GUCY2c expressa no tumor.
[00207] Como aqui usado, o termo "anticorpo biespecífico CD3-
GUCY2c" refere-se a uma molécula projetada para aproveitar as células T de um indivíduo para matar células cancerosas, direcionando para as células tumorais expressando uma molécula desejada. Em certas mo- dalidades, a molécula desejada é GUCY2c humana. Em algumas mo- dalidades, o anticorpo biespecífico CD3-GUCY2c compreende dois do- mínios Fv. Em algumas modalidades, o anticorpo biespecífico CD3- GUCY2c compreende um primeiro domínio Fv direcionado para GUCY2c e um segundo domínio Fv direcionado para CD3. Os domínios Fv podem ser domínios scFv.
[00208] Como aqui usado, o "primeiro polipeptídeo" é qualquer poli- peptídeo que deve ser associado com um segundo polipeptídeo. O pri- meiro polipeptídeo e segundo polipeptídeo se encontram em uma inter- face. Além da interface, o primeiro polipeptídeo pode compreender um ou mais domínios adicionais, tais como "domínios de ligação" (por exemplo, um domínio variável de anticorpo, domínio de ligação ao re- ceptor, domínio de ligação ao ligante ou domínio enzimático) ou domí- nios constantes de anticorpo (ou partes dos mesmos) incluindo domí- nios CH2, CH1 e CL. Normalmente, o primeiro polipeptídeo irá compre- ender pelo menos um domínio que é derivado de um anticorpo. Este domínio é convenientemente um domínio constante, tal como o domínio CH3 de um anticorpo e pode formar a interface do primeiro polipeptídeo. Primeiros polipeptídeos exemplares incluem polipeptídeos de cadeia pesada de anticorpo, quimeras combinando um domínio constante com um domínio de ligação de um polipeptídeo heterólogo, polipeptídeos de receptor, polipeptídeos de ligante e polipeptídeos de domínio variável de anticorpo (por exemplo, anticorpos biespecíficos).
[00209] Além da interface, o segundo polipeptídeo pode compreen- der domínios adicionais, tais como um "domínio de ligação" (por exem- plo, um domínio variável de anticorpo, domínio de ligação ao receptor, domínio de ligação ao ligante ou domínio enzimático), ou domínios constantes de anticorpo (ou partes dos mesmos) incluindo domínios CH2, CH1 e CL. Normalmente, o segundo polipeptídeo irá compreender pelo menos um domínio que é derivado de um anticorpo. Este domínio convenientemente é uma região constante, tal como o domínio CH3 de um anticorpo e pode formar a interface do segundo polipeptídeo. Se- gundos polipeptídeos exemplares incluem polipeptídeos de cadeia pe- sada de anticorpo, quimeras combinando um domínio constante de an- ticorpo com um domínio de ligação de um polipeptídeo heterólogo, e polipeptídeos de domínio variável de anticorpo (por exemplo, anticorpos biespecíficos).
[00210] Como aqui usado, o termo "complexo" ou "complexado" re- fere-se à associação de duas ou mais moléculas que interagem umas com as outras por meio de ligações e/ou forças (por exemplo, forças de van der waals, hidrofóbicas, hidrofílicas) que não são ligações peptídi- cas. Em uma modalidade, o complexo é heteromultimérico. Deve ser entendido que o termo "complexo de proteína" ou "complexo de polipep- tídeo" como aqui usado inclui complexos que têm uma entidade não proteica conjugada a uma proteína no complexo de proteína (por exem- plo, incluindo, mas não limitado a, moléculas químicas tais como uma toxina ou um agente de detecção).
[00211] Embora quaisquer materiais e métodos similares ou equiva- lentes aos descritos aqui possam ser usados na prática ou teste da pre- sente invenção, os materiais e métodos preferidos são agora descritos. Materiais e Métodos
[00212] Várias técnicas para a produção de anticorpos foram descri- tas, incluindo o método tradicional de hibridoma para produção de anti- corpos monoclonais, técnicas recombinantes para produção de anticor- pos (incluindo anticorpos quiméricos, por exemplo, anticorpos humani- zados), produção de anticorpos em animais transgênicos e a tecnologia de exibição de fagos recentemente descrita para preparar anticorpos
"totalmente humanos". Essas técnicas são descritas brevemente a se- guir.
[00213] Anticorpos policlonais para o antígeno de interesse geral- mente podem ser criados em animais por múltiplas injeções subcutâ- neas (sc) ou intraperitoneais (ip) do antígeno e um adjuvante. O antí- geno (ou um fragmento contendo a sequência de aminoácidos alvo) pode ser conjugado a uma proteína que é imunogênica na espécie a ser imunizada, por exemplo, albumina sérica, tireoglobulina bovina ou inibi- dor de tripsina de soja usando um agente bifuncional ou derivatizante, por exemplo, éster de maleimidobenzoil sulfossucinimida (conjugação através de resíduos de cisteína) ou N-hidroxissucinimida (através de re- síduos de lisina). Os animais são imunizados contra os conjugados imu- nogênicos ou derivados e algumas semanas depois os animais são re- forçados por injeção subcutânea em múltiplos sítios. 7 a 14 dias depois, os animais são sangrados e o soro é testado para os títulos de anticor- pos. Os animais recebem reforços até que o título estabilize. De prefe- rência, o animal recebe um reforço com o conjugado do mesmo antí- geno, mas conjugado com uma proteína diferente e/ou através de um reagente de reticulação diferente. Os conjugados também podem ser feitos em cultura de células recombinantes como fusões de proteínas. Além disso, agentes de agregação, tais como alume são usados para realçar a resposta imune.
[00214] Os anticorpos monoclonais podem ser obtidos de uma popu- lação de anticorpos substancialmente homogêneos usando o método de hibridoma primeiro descrito por Kohler & Milstein, Nature 256:495, 1975 ou podem ser feitos por métodos de DNA recombinante (Cabilly et al., Patente Norte-Americana No. 4.816.567). No método de hibridoma, um camundongo ou outro animal hospedeiro apropriado é imunizado como descrito acima para induzir linfócitos que produzem, ou são capa- zes de produzir, anticorpos que irão se ligar especificamente à proteína usada para imunização. Alternativamente, linfócitos podem ser imuniza- dos in vitro. Linfócitos são então fundidos com células de mieloma usando um agente de fusão adequado, tal como polietilenoglicol, para formar uma célula de hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies: Prin- ciples and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986). As células de hibridoma assim preparadas são semeadas e cultivadas em um meio de cultura adequado que preferivelmente contém uma ou mais substâncias que inibem o crescimento ou a sobrevivência das células de mieloma parentais não fundidas. Além disso, as células de hibridoma podem ser cultivadas in vivo como tumores de ascite em um animal. Os anticorpos monoclonais secretados pelos subclones são adequadamente separa- dos do meio de cultura, fluido ascítico ou soro por procedimentos con- vencionais de purificação de imunoglobulina, tais como, por exemplo, Proteína A-Sefarose, cromatografia de hidroxilapatita, eletroforese em gel, diálise ou cromatografia de afinidade.
[00215] A expressão de anticorpo, fragmentos de ligação ao antí- geno de um anticorpo, ou qualquer construção de anticorpo pode ser realizada em células procarióticas ou eucarióticas apropriadas de hos- pedeiro como células CHO, células NSO, células SP2/0, células HEK293, células COS, células PER.C6, levedura, ou células de E.coli, e o anticorpo secretado é recuperado e colhido das células (um sobre- nadante de cultura de células, um sobrenadante de cultura de células condicionado, um lisado de células ou um volume clarificado). Métodos gerais de produção de anticorpos são bem conhecidos no estado da técnica e descritos, por exemplo, nos artigos de revisão da Makrides, S.C., Protein Expr. Purif. 17: 183-202, 1999; Geisse, S., et al., Protein Expr. Purif. 8: 271-282, 1986; Kaufman, R.J., MoI. Biotechnol. 16: 151- 160, 2000; Werner, R.G., Drug Res. 48:870-880, 1998. Em uma moda- lidade específica, a cultura de células é uma cultura de células de ma- míferos, tal como uma cultura de células de ovário de hamster chinês
(CHO).
[00216] Em várias modalidades, os anticorpos isolados ou recupera- dos podem ser submetidos a etapas de purificação adicionais usando métodos convencionais de cromatografia conhecidos na técnica. Em particular, métodos de purificação são contemplados para incluir, mas não estão limitados a, cromatografia de afinidade (por exemplo, uma cromatografia de afinidade de Proteína A), cromatografia de permuta de íon (por exemplo, uma cromatografia de permuta de ânion ou uma cro- matografia de permuta de cátion), cromatografia de interação hidrofó- bica, cromatografia em hidroxilapatita, cromatografia de filtração em gel e/ou diálise. Entre esses, um método de purificação preferido é o uso de cromatografia de Proteína A. A matriz à qual o ligante de afinidade está ligado é mais frequentemente agarose, mas outras matrizes estão disponíveis.
[00217] Outras técnicas para purificação de anticorpo, tais como fra- cionamento em uma coluna de permuta de íon, precipitação de etanol, cromatografia de pressão elevada de fase reversa, precipitação de eta- nol, HPLC de fase reversa, cromatografia em sílica, cromatografia em heparina Sepharose ™, cromatografia em uma resina de permuta de ânion ou cátion (tal como uma coluna de ácido poliaspártico), cromato- focagem, eletroforese usando SDS-PAGE, e precipitação de sulfato de amônio são também conhecidas na técnica. A lista de métodos de puri- ficação acima é meramente exemplar na natureza e não se destina a ser uma recitação limitante.
[00218] Alternativamente, é possível produzir animais transgênicos (por exemplo, camundongos) que são capazes, após imunização, de produzir um repertório completo de anticorpos humanos na ausência de produção de imunoglobulina endógena. Por exemplo, foi descrito que a deleção homozigótica do gene da região de junção da cadeia pesada do anticorpo (J.sub.H) em camundongos mutantes quiméricos e da linha germinativa resulta em inibição completa de produção de anticorpos en- dógenos. Transferência do arranjo de gene de imunoglobulina de linha germinativa humano em tais camundongos mutantes de linha germina- tiva irá resultar na produção de anticorpos humanos após desafio do antígeno. Ver, por exemplo, Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2551-255;1993 e Jakobovits et al., Nature 362:255-258, 1993).
[00219] Em algumas modalidades, os anticorpos da presente inven- ção podem ser humanizados com retenção de alta afinidade para o an- tígeno e outras propriedades biológicas favoráveis. Métodos para hu- manizar anticorpos não humanos são bem conhecidos na técnica. A hu- manização pode ser essencialmente realizada seguindo o método de Winter e colegas de trabalho (Jones et al., Nature 321:522-525, 1986; Riechmann et al., Nature 332:323-327, 1988; Verhoeyen et al., Science 239:1534-1536, 1988), substituindo sequências de CDRs ou CDR de roedores pelas sequências correspondentes de um anticorpo humano. Portanto, tais anticorpos humanizados são anticorpos quiméricos (Ca- billy, supra), caracterizado pelo fato de que substancialmente menos do que um domínio variável humano intacto foi substituído pela sequência correspondente de uma espécie não humana. Na prática, os anticorpos humanizados são tipicamente anticorpos humanos em que alguns resí- duos de CDR, e possivelmente alguns resíduos de FR, são substituídos por resíduos de sítios análogos em anticorpos de roedores. É importante que os anticorpos sejam humanizados com retenção de alta afinidade para o antígeno e outras propriedades biológicas favoráveis. Para al- cançar este objetivo, de acordo com um método preferido, anticorpos humanizados são preparados por um processo de análise das sequên- cias parentais e vários produtos humanizados conceituais usando mo- delos tridimensionais das sequências parentais e humanizadas. Mode- los tridimensionais de imunoglobulina são familiares para os versados na técnica. Programas de computador que ilustram e exibem estruturas conformacionais tridimensionais prováveis de sequências de imunoglo- bulina candidatas selecionadas estão disponíveis. A inspeção dessas exibições permite a análise do provável papel dos resíduos no funcio- namento da sequência de imunoglobulina candidata, isto é, a análise de resíduos que influenciam a capacidade da imunoglobulina candidata de se ligar ao seu antígeno. Desta forma, resíduos de FR podem ser sele- cionados e combinados a partir do consenso e da sequência de impor- tação de modo que a característica de anticorpo desejada, tal como afi- nidade aumentada para o(s) antígeno(s) alvo, seja alcançada. Para de- talhes adicionais ver WO 92/22653, publicado 23 de dezembro de 1992.
[00220] Anticorpos da presente invenção também podem ser gera- dos usando vários métodos de exibição de fago conhecidos na técnica. Em métodos de exibição de fago, domínios de anticorpo funcionais são exibidos na superfície de partículas de fago que carregam as sequên- cias de polinucleotídeo que os codificam. Em um aspecto particular, tal fago pode ser utilizado para exibir domínios de ligação ao antígeno, tais como Fab e Fv ou Fv estabilizado por ligação dissulfeto, expresso de um repertório ou biblioteca de anticorpos combinatórios (por exemplo, humano ou murino). Fago expressando um domínio de ligação ao antí- geno que se liga ao antígeno de interesse pode ser selecionado ou iden- tificado com antígeno, por exemplo, usando antígeno marcado ou antí- geno ligado ou capturado em uma superfície sólida ou de conta. O fago usado nesses métodos é normalmente fago filamentoso, incluindo fd e M13. Os domínios de ligação ao antígeno são expressos como uma pro- teína fundida recombinantemente ao gene III do fago ou à proteína do gene VIII. Exemplos de métodos de exibição de fago que podem ser usados para fazer as imunoglobulinas, ou fragmentos das mesmas, da presente invenção incluem aqueles descritos em Brinkmann et al. "Phage Display Of Disulfide-Stabilized Fv Fragments," J. Immunol. Me- thods, 182:41-50, 1995.
[00221] As características funcionais dos múltiplos isotipos de IgG, e domínios dos mesmos, são bem conhecidas na técnica. As sequências de aminoácidos de IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4 são conhecidas na técnica. A seleção e/ou combinações de dois ou mais domínios de isotipos de IgG específicos para uso nos métodos da invenção pode ser baseada em qualquer parâmetro conhecido dos isotipos principais, incluindo afi- nidade para FcγR. Por exemplo, uso de regiões ou domínios de isotipos de IgG que exibem ligação limitada ou nenhuma ligação a FcγRIIB, por exemplo, IgG2 ou IgG4, pode encontrar uso particular onde um anti- corpo biespecífico é desejado para ser projetado para maximizar a liga- ção a um receptor de ativação e minimizar a ligação a um receptor ini- bitório. Da mesma forma, uso de cadeias ou domínios Fc de isotipos de IgG conhecidos por se ligar preferencialmente a C1q ou FcγRIIIA, por exemplo, IgG3 pode ser combinado com modificações de aminoácidos Fc conhecidas na técnica para aumentar a citotoxidade mediada por cé- lulas dependentes de anticorpos (ADCC) e/ou citotoxidade dependente de complemento (CDC), para projetar um anticorpo biespecífico de modo que a atividade da função efetora, por exemplo, ativação do com- plemento ou ADCC, seja maximizada. De forma similar, as mutações podem ser feitas nas cadeias Fc ou domínios de isotipos de IgG que minimizam ou eliminam a função efetora da cadeia Fc.
[00222] Durante o processo de descoberta, a geração e caracteriza- ção de anticorpos podem elucidar informações sobre epitopos desejá- veis. A partir desta informação, é então possível rastrear competitiva- mente os anticorpos para a ligação ao mesmo epitopo. Uma abordagem para conseguir isso é conduzir estudos de competição e competição cruzada para encontrar anticorpos que competem ou competem entre si, por exemplo, os anticorpos competem por ligação ao antígeno. Um método é identificar o epitopo ao qual os anticorpos se ligam, ou "ma- peamento de epitopo". Existem muitos métodos conhecidos na técnica para mapear e caracterizar a localização de epitopos em proteínas, in- cluindo resolver a estrutura cristalina de um complexo-antígeno, ensaios de competição, ensaios de expressão de fragmentos de genes e en- saios baseados em peptídeos sintéticos, como descrito, por exemplo, em Capítulo 11 de Harlow and Lane, Using Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.,
1999. Em um exemplo adicional, o mapeamento de epitopo pode ser usado para determinar a sequência à qual um anticorpo se liga. O ma- peamento de epitopos está comercialmente disponível em várias fontes, por exemplo, Pepscan Systems (Edelhertweg 15, 8219 PH Lelystad, The Netherlands). Em um exemplo adicional, mutagênese de um domí- nio de ligação ao antígeno, experimentos de troca de domínio e muta- gênese de varredura de alanina podem ser realizados para identificar resíduos requeridos, suficientes, e/ou necessários para a ligação ao epi- topo. A afinidade de ligação e a taxa de dissociação de uma interação de domínio de ligação ao antígeno podem ser determinadas por ensaios de ligação competitiva. Um exemplo de um ensaio de ligação competi- tiva é um radioimunoensaio compreendendo a incubação do antígeno marcado e a detecção da molécula ligada ao antígeno marcado. A afi- nidade da molécula da presente invenção por um antígeno e as taxas de dissociação de ligação podem ser determinadas dos dados de satu- ração por análise de Scatchard.
[00223] As afinidades e propriedades de ligação dos anticorpos da presente invenção para um antígeno podem ser inicialmente determina- das usando ensaios in vitro (ensaios com base em bioquímica e imuno- logia) conhecidos na técnica para domínio de ligação ao antígeno, in- cluindo, mas não limitados a ensaio imunoabsorvente ligado a enzima (ELISA), ensaio de ressonância de plasmônio de superfície (SPR), In- terferometria de biocamada, ou ensaios de imunoprecipitação. As mo- léculas da invenção podem ter propriedades de ligação similares em modelos in vivo (tais como aqueles descritos e divulgados aqui) como aqueles em ensaios com base em in vitro. Entretanto, a presente inven- ção não exclui moléculas da invenção que não exibem o fenótipo dese- jado em ensaios com base em in vitro, mas exibem o fenótipo desejado in vivo.
[00224] Um formato de anticorpo biespecífico opcional é uma estra- tégia derivada de Fv com base em uma estrutura de diacorpo heterodi- mérico biespecífico, covalentemente ligada, também conhecida como proteínas de redirecionamento de afinidade dupla (DART®), que são descritas em, por exemplo, em Publicações de Patente Norte-Ameri- cana Nos. 2007/0004909, 2009/0060910, e 2010/0174053).
[00225] Uma vez que uma sequência de ácido nucleico codificando moléculas da invenção (isto é, domínio de ligação) foi obtida, o vetor para a produção das moléculas pode ser produzido por tecnologia de DNA recombinante usando técnicas bem conhecidas na técnica.
[00226] Os polinucleotídeos codificando os domínios de ligação de anticorpo (por exemplo, anticorpo GUCY2c ou anticorpo biespecífico CD3-GUCY2c) da presente invenção podem incluir uma sequência de polinucleotídeo de controle de expressão operacionalmente ligada ao anticorpo codificando sequências, incluindo regiões promotoras natural- mente associadas ou heterólogas conhecidas na técnica. As sequên- cias de controle de expressão podem ser sistemas promotores eucarió- ticos em vetores capazes de transformar ou transfectar células hospe- deiras eucarióticas, porém sequência de controles para hospedeiros procarióticos pode também ser usada. Uma vez que o vetor foi incorpo- rado na linhagem celular do hospedeiro apropriado, a célula do hospe- deiro é propagada sob condições adequadas para expressar as sequên- cias de nucleotídeo, e, como desejado, para a coleção e purificação dos anticorpos. Linhagens celulares eucarióticas incluem as linhagens celu-
lares de CHO, várias linhagens celulares de COS, células HeLa, linha- gens celulares de mieloma, células B transformadas, ou linhagens celu- lares de rim embrionário humano.
[00227] Em uma modalidade, o DNA codificando os anticorpos da in- venção é isolado e sequenciado usando procedimentos convencionais (por exemplo, usando sondas de oligonucleotídeos que são capazes de se ligar especificamente a genes codificando as cadeias pesadas e le- ves de anticorpos murinos). As células de hibridoma da invenção ser- vem como uma fonte preferida de tal DNA. Uma vez isolado, o DNA pode ser colocado em vetores de expressão, que são então transfecta- dos para células de hospedeiro tais como células de COS símias, célu- las de CHO, ou células de mieloma que de outro modo não produzem proteína de imunoglobulina, para obter a síntese de anticorpos mono- clonais nas células hospedeiras recombinantes. O DNA também pode ser modificado, por exemplo, substituindo a sequência codificadora por domínios constantes de cadeia pesada e leve humanos no lugar das sequências murinas homólogas, Morrison et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 81:6851, 1984. Dessa maneira, são preparados anticorpos quiméricos que têm a especificidade de ligação de um anticorpo monoclonal anti- antígeno aqui.
[00228] Como uma proteína da superfície celular, GUCY2c pode ser- vir como um alvo terapêutico para proteínas de ligação ao receptor, tal como anticorpos ou ligantes. No tecido intestinal normal, GUCY2c é ex- presso no lado apical das junções estreitas das células epiteliais que formam uma barreira entre o ambiente luminal e o compartimento vas- cular (Almenoff et al., Mol Microbiol 8: 865-873, 1993; e Guarino et al., Dig Dis Sci 32: 1017-1026, 1987). Como tal, administração intravenosa sistêmica de uma proteína terapêutica de ligação a GUCY2c terá efeito mínimo nos receptores intestinais de GUCY2c presentes em células normais, ao mesmo tempo que terá acesso a células neoplásicas do sistema gastrointestinal, incluindo células cancerosas de cólon malignas ou metastáticas, tumores do cólon extraintestinais ou metastáticos, tu- mores do esôfago ou tumores do estômago, ou adenocarcinoma na jun- ção gastroesofágica. Além disso, GUCY2c internaliza através da endo- citose mediada por receptor após a ligação do ligante (Buc et al. Eur J Cancer 41: 1618-1627, 2005; Urbanski et al., Biochem Biophys Acta 1245: 29-36, 1995).
[00229] A expressão específica de tecido e a associação de GUCY2c com câncer, por exemplo, de origem gastrointestinal, (por exemplo, cân- cer de cólon, câncer de estômago ou câncer de esôfago), podem ser exploradas para permitir o uso de GUCY2c como um marcador de diag- nóstico para esta doença (Carrithers et al., Dis Colon Reto 39:171-181, 1996; Buc et al. Eur J Cancer 41: 1618-1627, 2005).
[00230] A presente invenção fornece um anticorpo que se liga a GUCY2c (por exemplo, GUCY2c humana (por exemplo, SEQ ID NO: 224 que é um derivado de número de acesso: NP_004954.2)) e é útil em qualquer um ou mais dos seguintes: (a) tratamento, prevenção, ou melhora de um ou mais sintomas de uma condição associada com cé- lulas malignas expressando GUCY2c em um indivíduo (por exemplo, câncer relacionado ao gastrointestinal, tal como câncer colorretal (CRC)); (b) inibição do crescimento ou progressão de tumor em um in- divíduo que tem um tumor maligno expressando GUCY2c; (c) inibição das células de metástase de câncer (maligno) expressando GUCY2c em um indivíduo que tem uma ou mais células malignas expressando GUCY2c; (d) indução da regressão (por exemplo, regressão a longo prazo) de um tumor expressando GUCY2c; (e) exercer a atividade cito- tóxica em células malignas expressando GUCY2c; (f) aumento da so- brevivência livre de progressão de um indivíduo com um distúrbio asso- ciado com GUCY2c; (g) aumento da sobrevivência geral de um indiví- duo com um distúrbio associado com GUCY2c; (h) redução do uso de agentes quimioterápicos ou citotóxicos adicionais em um indivíduo com um distúrbio associado com GUCY2c; (i) redução da carga de tumor em um indivíduo com um distúrbio associado com GUCY2c; ou (j) bloqueio da interação de GUCY2c com outros fatores a serem ainda identifica- dos.
[00231] Em um aspecto, é fornecido um anticorpo compreendendo (a) uma região variável de cadeia pesada (VH) compreendendo uma região de determinação de complementariedade um VH (CDR1 VH), uma região de determinação de complementariedade dois VH (CDR2 VH), e uma região de determinação de complementariedade três VH (CDR3 VH) da sequência VH mostrada em SEQ ID NO: 11, 19, 26, 33, 41, 48, 52, 57, 60, 62, 64, 65, 67, 69, 71, ou 73; e/ou (b) uma região variável de cadeia leve (VL) compreendendo uma região de determina- ção de complementariedade um VL (CDR1 VL), uma região de determi- nação de complementariedade dois VL (CDR2 VL), e uma região de determinação de complementariedade três VL (CDR3 VL) da sequência de VL mostrada em SEQ ID NO: 92, 100, 104, 106, 112, 119, 125, 129, 134, 136, 137, 138, 140, 143, 145, 147, 150, 152, 156, 158, 160, 162, 166, 170, 171, 172, 173, 174, ou 175.
[00232] Em outro aspecto, é fornecido um anticorpo tendo qualquer uma de sequência de cadeia pesada parcial e/ou qualquer uma de se- quência de cadeia leve parcial como listado em Tabela 1. Em uma mo- dalidade, a invenção fornece um anticorpo compreendendo uma região VH e/ou uma região VL, caracterizado pelo fato de que : (a) a região VH compreende SEQ ID NO: 11, 19, 26, 33, 41, 48, 52, 57, 60, 62, 64, 65, 67, 69, 71, ou 73; e/ou (b) a região VL compreende SEQ ID NO: 92, 100, 104,106, 112, 119, 125, 129, 134, 136, 137, 138, 140, 143, 145, 147, 150,152, 156, 158, 160, 162, 166, 170, 171, 172, 173, 174, ou 175.
Tabela 1 Descrição Sequência GUCY2C-0074_VH EVQLQQSGAELARPGASVNLSCKASGYTFTTYWMQWVKQRPGQGLEWIGAIYPGDGMTTY-
TQKFKDKATLTADKSSSTAYMQLSSLASEDSAVYYCVRKGMDYWGQGTSVTVSS (SEQ ID NO:11) GUCY2C-0077_VH EVQLQQSGAELARPGASVKLSCKASGYTFTKYWMQWIKQRPGQGLEWIGAIYPGDGFTTY-
TQKFKGKATLTADKSSNTAYMQLSSLASEDSAVYYCARRNYGRTYGGDYWGQGTSVTVSS (SEQ ID NO:19) GUCY2C-0098_VH QVQLQQPGAELVKPGASVKLSCKASGYTFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGEIKPSNGLT-
NYIEKFKNKATLTVDKSATTAYMQLSSLTAEDSAVYYCTRTITTTEGYWFFDVWGAGTTVTVSS (SEQ ID NO: 26) GUCY2C-0104_VH EVQLQQSGAELVKPGASVKLSCTASGFNIKDTYIHWVKQRPEQGLEWIGRID-
PANGNANYDPKFQGKATITADTSSNTAYLQLSSLTSEDTAVFYCSSLGTGTYWGQGTTLTVSS (SEQ ID NO: 33) GUCY2C-0105_VH EVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYSFTDYIMLWVKQSH-
GKSLEWIGNSNPYYGSTSYNLKFKGKATLTVDKSSSTAYMHLNSLTSEDSAVYYCARSGYYGSSPYWYFDVW
GAGTTVTVSS (SEQ ID NO:41) GUCY2C-0240_VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTTYWMQWVRQAPGKGLEWIGAIYPGDGMTTY-
TQKFKDRFTISADKAKNSAYLQMNSLRAEDTAVYYCVRKGMDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 48) GUCY2C-0315_VH QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTTYWMQWVRQAPGQGLEWIGAIYPGDGMTTY-
TQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCVRKGMDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 52) GUCY2C-0179_VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSFTDYIMLWVR-
QAPGKGLEWIGNSNPYYGSTSYNLKFKGRFTISVDKAKNSAYLQMNSLRAEDTAVYYCARSGYYGSSPYWYF
DVWGQGTMVTVSS (SEQ ID NO: 57) GUCY2C-0193_VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYWMHWVRQAPGKGLEWIGEIKPSNGLT-
NYIEKFKNRFTISVDKAKNSAYLQMNSLRAEDTAVYYCTRTITTTEGYWFFDVWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 60) GUCY2C-0210_VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYWMHWVRQAPGKGLEWIAEIKPSNGLT-
NYIEKFKNRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARTITTTEGYWFFDVWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 62) GUCY2C-0212_VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYWMHWVRQAPGKGLEWIGEIKPSNGLT-
NYIEKFKNRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARTITTTEGYWFFDVWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 64) GUCY2C-1186_VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYWMHWVRQAPGKGLEWIGEIKPSNGLT-
NIHPKFKNRFTISVDKAKNSAYLQMNSLRAEDTAVYYCTRTITTTEGYWFFDVWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 65) GUCY2C-1476_VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYWMHWVRQAPGKGLEWIGEIKPSNGLT-
NVHEKFKNRFTISVDKAKNSAYLQMNSLRAEDTAVYYCTRTITTTEGYWFFDVWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 67) GUCY2C-1478_VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYWMHWVRQAPGKGLEWIGEIKPSNGLT-
NVHEKFKNRFTISVDKAKNSAYLQMNSLRAEDTAVYYCTRTITTTEGYWFFDVWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 69) GUCY2C-1512_VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYWMHWVRQAPGKGLEWIGEIKPSNGLT-
NYAEQFKNRFTISVDKAKNSAYLQMNSLRAEDTAVYYCTRTITTTEGYWFFDVWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 71) GUCY2C-1554_VH; GUCY2C- EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMHWVRQAPGKGLEWIGEIKPSNELT- 1608_VH NVHEKFKDRFTISVDKAKNSAYLQMNSLRAEDTAVYYCTRTITTTEGYWFFDVWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 73) GUCY2C-0074_VL DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVDNYGISFMNWFQQKPGQPPKLLI-
YAASNPGSGVPARFSGSGSGTDFSLNIHPLEEDDTAMFFCQQSKEVPYTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 92) GUCY2C-0077_VL DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVDNFDISFMNWFQQKPGQPPKLLI-
YAASNQGSGVPARFSGSGSGTDFSLNIHPMEEDDTAMYFCQQSKEVPYTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 100) GUCY2C-0078_VL DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRAGESVDNFDISFMNWFQQKPGQPPKLLI-
YAASNQGSGVPARFSGSGSGTDFSLNIHPMEEDDTAMYFCQQSKEVPYTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 104)
GUCY2C-0098_VL DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVDYYGTSLMQWYQQKPGQPPKLLIYAASN-
VESGVPARFSGSGSGTDFSLNIHPVEEDDIAMYFCQQTRKVYTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 106) GUCY2C-0104_VL DIVMTQSPASLAVSLGQRATISCRASKGVTTSGYSYMHWYQQKPGQPPKLLIYLASN-
LESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQHSREFPLTFGAGTKLELK (SEQ ID NO: 112) GUCY2C-0105_VL DIVMTQSPSSLAVSVGEKVTVSCKSSQSLLYSSNQKNYLAWYQQRPGQSPKLLI-
YWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLSISSVKAEDLAVYYCQQYYSYPTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 119) GUCY2C-0240_VL DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDNYGISFMNWFQQKPGKAPKLLI-
YAASNPGSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSKEVPYTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 125) GUCY2C-0315_VL EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASESVDNYGISFMNWYQQKPGQAPRLLI-
YAASNPGSGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSKEVPYTFGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 129) GUCY2C-0179_VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKSSQSLLYSSNQKNYLAWYQQKPGKSPKLLI-
YWASTRESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYSYPTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 134) GUCY2C-0193_VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDYYGTSLMQWYQQKPGKAPKLLIYAASN-
VESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTRKVYTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 136) GUCY2C-0210_VL DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDYYGTSLMQWYQQKPGKAPKLLIYAASN-
VESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTRKVYTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 137) GUCY2C-0247_VL DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDYYGTSLMQWYQQKPGKPPKLLIYAASN-
VESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTRKVYTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 138) GUCY2C-1186_VL DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDYYGTSLMQWYQQKPGKAPKLLIYAAS-
KRYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTRKAYTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 140) GUCY2C-1467_VL DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDYYGTSLMQWYQQKPGKAPKLLIYAASKLWS-
GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTRKVYTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 143) GUCY2C-1476_VL DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDYYGTSLMQWYQQKPGKAPKLLIYAAS-
KVAPGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTRKAYTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 145) GUCY2C-1478_VL; GUCY2C- DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDYYGSSLLQWYQQKPGKAPKLLIYAASKLAS- 1608_VL GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTRKAYTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 147) GUCY2C-1481_VL DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDYYGTSLMQWYQQKPGKAPKLLIYAAS-
NIAPGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTRKAYTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 150) GUCY2C-1512_VL DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDYYGSSLMQWYQQKPGKAPKLLIYAAS-
KRYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTRKEYTFGQGTKLKIK (SEQ ID NO: 152) GUCY2C-1518_VL DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDYYGSSLMQWYQQKPGKAPKLLI-
YAASNVAPGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTRKAYTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 156) GUCY2C-1526_VL DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDYYGSSLMQWYQQKPGKAPKLLIYAASH-
RASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTRKAYTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 158) GUCY2C-1527_VL DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDYYGTSLMQWYQQKPGKAPKLLIYAASN-
VASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTRKEYTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 160) GUCY2C-1538_VL DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDYYGHSLMQWYQQKPGKAPKLLIYAASN-
RYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTRKAYSFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 162) GUCY2C-1554_VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVDYYGSSLLQWYQQKPGKAPKLLIYDASKLAS-
GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQERKAYTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 166) GUCY2C-1555_VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVDYYGSSLLQWYQQKPGKAPKLLIYAASKLAS-
GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQERKAYTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 170) GUCY2C-1556_VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVDYYGSSLLQWYQQKPGKAPKLLIYDASKLAS-
GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTRKAYTFGQGTKLEIK
(SEQ ID NO: 171) GUCY2C-1557_VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVDYYGSSLLQWYQQKPGKAPKLLIYAASKLAS-
GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTRKAYTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 172) GUCY2C-1590_VL DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDYYGSSLLQWYQQKPGKAPKLLIYDASKLAS-
GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQERKAYTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 173) GUCY2C-1591_VL DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDYYGSSLLQWYQQKPGKAPKLLIYAASKLAS-
GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQERKAYTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 174) GUCY2C-1592_VL DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDYYGSSLLQWYQQKPGKAPKLLIYDASKLAS-
GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTRKAYTFGQGTKLEIK (S.EQ ID NO: 175)
[00233] Na Tabela 1, as sequências sublinhadas são sequências de CDR de acordo com Kabat e em negrito de acordo com Chothia. A de- finição AbM foi usada para VH CDR1.
[00234] A invenção também fornece porções de CDR de anticorpos para GUCY2c. As regiões de contato CDR são regiões de um anticorpo que imbuem especificidade para o anticorpo para um antígeno. Em ge- ral, as regiões de contato de CDR incluem as posições de resíduo nas zonas de CDR e Vernier que são restritas a fim de manter a estrutura de alça adequada para o anticorpo se ligar a um antígeno específico. Veja, por exemplo, Makabe et al., J. Biol. Chem., 283: 1156-1166, 2007. A determinação das regiões CDR inclui-se bem na experiência na arte. O algoritmo implementado no lançamento da versão 2.3.3 do Abysis (www.abysis.org) foi usado aqui para atribuir numeração de Kabat a re- giões variáveis, VL CDR1, VL CDR2, VL CDR3, VH CDR2 e VH CDR3, exceto para VH CDR1. A definição AbM foi usada para VH CDR1.
[00235] Em um aspecto, é fornecido um desejo tendo qualquer uma das sequências de CDR de VH e/ou qualquer uma das sequências de CDR de VL conforme listado na Tabela 2. Em um aspecto, a invenção fornece um anticorpo que se liga especificamente à guanilil ciclase C (GUCY2c), caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende: (a) uma região variável de cadeia pesada (VH) compreendendo (i) uma re- gião determinante de complementaridade VH um (VH CDR1) compre- endendo SEQ ID NO: 12, 20, 27, 34, 42, 74, 257, 258, 259, 260 ou 261; (ii) uma região determinante complementar de VH dois (VH CDR2) que compreende a SEQ ID NO: 13, 21, 28, 35, 43, 53, 66, 68, 70, 72, 75, 262, 263, 264, 265, 266, ou 267; e (iii) uma região determinante com- plementar de VH três (VH CDR3) compreendendo SEQ ID NO: 14, 22, 29, 36 ou 44; e/ou (b) uma região variável de cadeia leve (VL) compre- endendo (i) uma região determinante de complementaridade de VL (VL CDR1) compreendendo SEQ ID NO: 93, 101, 105, 107, 113, 120, 148, 153, 163, ou 167; (ii) uma região determinante complementar de VL dois (VL CDR2) que compreende a SEQ ID NO: 78, 94, 102, 108, 114, 141, 144, 146, 149, 151, 157, 159, 161, 164 ou 168; e (iii) uma região deter- minante complementar de VH três (VL CDR3) compreendendo SEQ ID NO: 95, 109, 115, 121, 142, 154, 165 ou 169.
[00236] Em uma modalidade específica, a invenção fornece um anti- corpo em que: (a) a região VH compreende (i) uma VH CDR1 compre- endendo a sequência de SEQ ID NO: 74ou 259; (ii) um VH CDR2 com- preendendo a sequência de SEQ ID NO: 75ou 267; e iii) um VH CDR3 compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 29; e/ou (b) a região VL compreende (i) uma VL CDR1 compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 148; (ii) uma VL CDR2 compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 149; e (iii) uma VL CDR3 compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 142. Tabela 2 Cadeia Pesada mAb VH CDR1 VH CDR2 VH CDR3 GUCY2C-0074_VH GYTFTTYWMQ AIYPGDGMTTYTQKFKD KGMDY (SEQ ID NO: 12)(ABM); (SEQ ID NO: 13) Kabat); (SEQ ID NO: 14) TYWMQ (SEQ ID NO: 257) (Kabat) YPGDGM (SEQ ID NO: 262) (Chothia) GUCY2C-0077_VH GYTFTKYWMQ(SEQ ID NO: AIYPGDGFTTYTQKFKG RNYGRTYGGDY 20)(ABM); (SEQ ID NO: 21) Kabat); (SEQ ID NO: 22) KYWMQ (SEQ ID NO: 258) (Kabat) YPGDGF (SEQ ID NO: 263) (Chothia) GUCY2C-0098_VH GYTFTSYWMH (SEQ ID EIKPSNGLTNYIEKFKN TITTTEGYWFFDV NO:27)(ABM); (SEQ ID NO: 28)(Kabat); (SEQ ID NO: 29) SYWMH (SEQ ID NO:259) (Kabat) KPSNGL (SEQ ID NO: 264) (Chothia) GUCY2C-0104_VH GFNIKDTYIH RIDPANGNANYDPKFQG LGTGTY (SEQ ID NO: 34) (ABM); (SEQ ID NO: 35) (Kabat); (SEQ ID NO: 36)
DTYIH (SEQ ID NO: 260) (Kabat) DPANGN (SEQ ID NO: 265) (Chothia) GUCY2C-0105_VH GYSFTDYIML NSNPYYGSTSYNLKFKG SGYYGSSPYWYFDV
(SEQ ID NO: 42) (ABM); (SEQ ID NO: 43)(Kabat); (SEQ ID NO: 44)
DYIML (SEQ ID NO: 261) (Kabat) NPYYGS (SEQ ID NO: 266) (Chothia) GUCY2C-0240_VH GYTFTTYWMQ AIYPGDGMTTYTQKFKD KGMDY
(SEQ ID NO: 12) (ABM); (SEQ ID NO: 13) (Kabat); (SEQ ID NO: 14)
TYWMQ (SEQ ID NO: 257) (Kabat) YPGDGM (SEQ ID NO: 262) (Chothia)
GUCY2C-0315_VH GYTFTTYWMQ AIYPGDGMTTYTQKFQG KGMDY
(SEQ ID NO: 12)(ABM); (SEQ ID NO: 53) (Kabat); (SEQ ID NO: 14)
TYWMQ (SEQ ID NO: 257) (Kabat) YPGDGM (SEQ ID NO: 262) (Chothia) GUCY2C-0179_VH GYSFTDYIML NSNPYYGSTSYNLKFKG SGYYGSSPYWYFDV (SEQ ID NO: 42) (ABM); (SEQ ID NO: 43) (Kabat); (SEQ ID NO: 44) DYIML (SEQ ID NO: 261) (Kabat) NPYYGS(SEQ ID NO: 266) (Chothia) GUCY2C-0193_VH GYTFTSYWMH EIKPSNGLTNYIEKFKN TITTTEGYWFFDV
(SEQ ID NO: 27) (ABM); (SEQ ID NO: 28)(Kabat); (SEQ ID NO: 29)
SYWMH (SEQ ID NO: 259) (Kabat) KPSNGL(SEQ ID NO: 264) (Chothia) GUCY2C-0210_VH GYTFTSYWMH EIKPSNGLTNYIEKFKN TITTTEGYWFFDV
(SEQ ID NO: 27) (ABM); (SEQ ID NO: 28)(Kabat); (SEQ ID NO: 29)
SYWMH(SEQ ID NO: 259) (Kabat) KPSNGL(SEQ ID NO: 264) (Chothia) GUCY2C-0212_VH GYTFTSYWMH EIKPSNGLTNYIEKFKN TITTTEGYWFFDV
(SEQ ID NO: 27) (ABM); (SEQ ID NO: 28)(Kabat); (SEQ ID NO: 29)
SYWMH(SEQ ID NO: 259) (Kabat) KPSNGL(SEQ ID NO: 264) (Chothia) GUCY2C-1186_VH GYTFTSYWMH EIKPSNGLTNIHPKFKN TITTTEGYWFFDV
(SEQ ID NO: 27) (ABM); (SEQ ID NO: 66) (Kabat); (SEQ ID NO: 29)
SYWMH(SEQ ID NO: 259) (Kabat) KPSNGL(SEQ ID NO: 264) (Chothia) GUCY2C-1476_VH GYTFTSYWMH EIKPSNGLTNYNEKFKN TITTTEGYWFFDV (SEQ ID NO: 68) (Kabat); (SEQ ID NO: 27) (ABM); (SEQ ID NO: 29) KPSNGL(SEQ ID NO: 264) (Chothia) SYWMH (SEQ ID NO: 259) (Kabat) GUCY2C-1478_VH GYTFTSYWMH EIKPSNGLTNVHEKFKN TITTTEGYWFFDV
(SEQ ID NO: 27) (ABM); (SEQ ID NO: 70) (Kabat); (SEQ ID NO: 29)
SYWMH (SEQ ID NO: 259) (Kabat) KPSNGL(SEQ ID NO: 264) (Chothia) GUCY2C-1512_VH GYTFTSYWMH EIKPSNGLTNYAEQFKN TITTTEGYWFFDV
(SEQ ID NO: 27) (ABM); (SEQ ID NO: 72) (Kabat); (SEQ ID NO: 29)
SYWMH (SEQ ID NO: 259) (Kabat) KPSNGL (SEQ ID NO: 264) (Chothia) GUCY2C-1554_VH; GFTFSSYWMH EIKPSNELTNVHEKFKD TITTTEGYWFFDV GUCY2C-1608_VH (SEQ ID NO: 74) (SEQ ID NO: 75) (Kabat); (SEQ ID NO: 29) (ABM); KPSNEL (SEQ ID NO: 267) (Chothia) SYWMH (SEQ ID NO: 259) (Kabat) Cadeia leve mAb VL CDR1 VL CDR2 VL CDR3
GUCY2C-0074_VL RASESVDNYGISFMN AASNPGS QQSKEVPYT
(SEQ ID NO: 93) (SEQ ID NO: 94) (SEQ ID NO: 95) GUCY2C-0077_VL RASESVDNFDISFMN AASNQGS QQSKEVPYT
(SEQ ID NO:101) (SEQ ID NO: 102) (SEQ ID NO: 95) GUCY2C-0078_VL RAGESVDNFDISFMN AASNQGS QQSKEVPYT
(SEQ ID NO: 105) (SEQ ID NO: 102) (SEQ ID NO: 95) GUCY2C-0098_VL RASESVDYYGTSLMQ AASNVES QQTRKVYT
(SEQ ID NO: 107) (SEQ ID NO: 108) (SEQ ID NO: 109) GUCY2C-0104_VL RASKGVTTSGYSYMH LASNLES QHSREFPLT
(SEQ ID NO: 113) (SEQ ID NO: 114) (SEQ ID NO: 115) GUCY2C-0105_VL KSSQSLLYSSNQKNYLA WASTRES QQYYSYPT
(SEQ ID NO: 120) (SEQ ID NO: 78) (SEQ ID NO: 121) GUCY2C-0240_VL RASESVDNYGISFMN AASNPGS QQSKEVPYT
(SEQ ID NO: 93) (SEQ ID NO: 94) (SEQ ID NO: 95) GUCY2C-0315_VL RASESVDNYGISFMN AASNPGS QQSKEVPYT
(SEQ ID NO: 93) (SEQ ID NO: 94) (SEQ ID NO: 95) GUCY2C-0179_VL KSSQSLLYSSNQKNYLA WASTRES QQYYSYPT
(SEQ ID NO: 120) (SEQ ID NO: 78) (SEQ ID NO: 121) GUCY2C-0193_VL RASESVDYYGTSLMQ AASNVES QQTRKVYT
(SEQ ID NO: 107) (SEQ ID NO: 108) (SEQ ID NO: 109) GUCY2C-0210_VL RASESVDYYGTSLMQ AASNVES QQTRKVYT
(SEQ ID NO: 107) (SEQ ID NO: 108) (SEQ ID NO: 109) GUCY2C-0247_VL RASESVDYYGTSLMQ AASNVES QQTRKVYT
(SEQ ID NO: 107) (SEQ ID NO: 108) (SEQ ID NO: 109) GUCY2C-1186_VL RASESVDYYGTSLMQ AASKRYS QQTRKAYT
(SEQ ID NO: 107) (SEQ ID NO: 141) (SEQ ID NO: 142) GUCY2C-1467_VL RASESVDYYGTSLMQ AASKLWS QQTRKVYT
(SEQ ID NO: 107) (SEQ ID NO: 144) (SEQ ID NO: 109) GUCY2C-1476_VL RASESVDYYGTSLMQ AASKVAP QQTRKAYT
(SEQ ID NO: 107) (SEQ ID NO: 146) (SEQ ID NO: 142) GUCY2C-1478_VL; RASESVDYYGSSLLQ AASKLAS QQTRKAYT
(SEQ ID NO: 148) (SEQ ID NO: 149) (SEQ ID NO: 142) GUCY2C-1481_VL RASESVDYYGTSLMQ AASNIAP QQTRKAYT (SEQ ID NO: 151) (SEQ ID NO: 107) (SEQ ID NO: 142) GUCY2C-1512_VL RASESVDYYGSSLMQ AASKRYS QQTRKEYT
(SEQ ID NO: 153) (SEQ ID NO: 141) (SEQ ID NO: 154) GUCY2C-1518_VL RASESVDYYGSSLMQ AASNVAP QQTRKAYT
(SEQ ID NO: 153) (SEQ ID NO: 157) (SEQ ID NO: 142) GUCY2C-1526_VL RASESVDYYGSSLMQ AASHRAS QQTRKAYT
(SEQ ID NO: 153) (SEQ ID NO: 159) (SEQ ID NO: 142) GUCY2C-1527_VL RASESVDYYGTSLMQ AASNVAS QQTRKEYT (SEQ ID NO: 107) (SEQ ID NO: 161) (SEQ ID NO: 154) GUCY2C-1538_VL RASESVDYYGHSLMQ AASNRYS QQTRKAYS
(SEQ ID NO: 163) (SEQ ID NO: 164) (SEQ ID NO: 165) GUCY2C-1554_VL RASQSVDYYGSSLLQ DASKLAS QQERKAYT (SEQ ID NO: 167) (SEQ ID NO: 168) (SEQ ID NO: 169) GUCY2C-1555_VL RASQSVDYYGSSLLQ AASKLAS QQERKAYT (SEQ ID NO: 167) (SEQ ID NO: 149) (SEQ ID NO: 169) GUCY2C-1556_VL RASQSVDYYGSSLLQ DASKLAS QQTRKAYT (SEQ ID NO: 167) (SEQ ID NO: 168) (SEQ ID NO: 142) GUCY2C-1557_VL RASQSVDYYGSSLLQ AASKLAS QQTRKAYT (SEQ ID NO: 167) (SEQ ID NO: 149) (SEQ ID NO: 142) GUCY2C-1590_VL RASESVDYYGSSLLQ DASKLAS QQERKAYT (SEQ ID NO: 148) (SEQ ID NO: 168) (SEQ ID NO: 169) GUCY2C-1591_VL RASESVDYYGSSLLQ AASKLAS QQERKAYT (SEQ ID NO: 148) (SEQ ID NO: 149) (SEQ ID NO: 169) GUCY2C-1592_VL RASESVDYYGSSLLQ DASKLAS QQTRKAYT (SEQ ID NO: 148) (SEQ ID NO: 168) (SEQ ID NO: 142) GUCY2C-1608_VL RASESVDYYGSSLLQ AASKLAS QQTRKAYT (SEQ ID NO: 148) (SEQ ID NO: 149) (SEQ ID NO: 142)
[00237] Em um aspecto, é fornecido um anticorpo tendo qualquer uma de sequência de cadeialeve parcial e/ou qualquer uma de sequên- cia de cadeia pesada parcial como listado na Tabela 3. Em uma moda- lidade, é fornecidoum anticorpo isolado, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que especificamente se liga a CD3, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende: uma região VH compreen- dendo uma VH CDR1, VH CDR2, e VH CDR3 da sequência VH mos- trada na SEQ ID NO: 1, 9, ou 273; e/ou uma região VL compreendendo VL CDR1, VL CDR2, e VL CDR3 da sequência VL mostrada na SEQ ID NO: 76, 84, 90, 274, 275, ou 276. Tabela 3 Descrição Sequência CD3-0001_VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMTWVRQAPGKGLEWVAFIRNRAR-
GYTSDHNPSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRPSYYVLDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO:1) CD3-0006_VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMTWVR-
QAPGKGLEWVAFIRNQARGYTSDHNPSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRPSYYVLDYWG
QGTTVTVSS (SEQ ID NO: 9) 2B5-1038 VH, EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMTWVR- 2B5-1039 VH, QAPGKGLEWVAFIRNQARGYTSDHNPSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRPSYYVLDYWG 2B5-1040 VH QGTTVTVSS (SEQ ID NO: 273)
CD3-0001_VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCTSSQSLFNVRSRKNYLAWYQQKPGKAPKLLI-
YWASTRESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCKQSYDLFTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 76) CD3-0004_VL DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKKSSQSLFNVRSRKNYL-
AWYQQKPGQPPKLLISWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCKQSYDLFTFGSGTKLEIK (SEQ ID NO: 84) CD3-0006_VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCTSSQSLFNVRSQKNYLAWYQQKPGKAPKLLI-
YWASTRESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCKQSYDLFTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 90) 2B5-1038 VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCTSDQSLFNVRSGKNYLAWYQQKPGKAPKLLIYWAS-
DRESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCKQSYDLFTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 274) 2B5-1039 VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCTSSESLFNVRSGKNYLAWYQQKPGKAPKLLIYWAS-
DRESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCKQSYDLFTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 275) 2B5-1040 VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCTSSQSLFNVRSGKNYLAWYQQKPGKAPKLLIYWAS-
DRESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCKQSYDLFTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 276)
[00238] Na Tabela 3, as sequências sublinhadas são sequências CDR de acordo com Kabat e em negrito de acordo com Chothia. A de- finição AbM foi usada para VH CDR1.
[00239] A Tabela 4 fornece exemplos de sequências de CDR para anticorpos CD3 fornecidos aqui. Tabela 4 Cadeia Pesada mAb VH CDR1 VH CDR2 VH CDR3 CD3-0001_VH GFTFSDYYMT FIRNRARGYTSDHNPSVKG (SEQ ID NO: 3) DRPSYYVLDY (SEQ ID NO: 2) (ABM); (Kabat); (SEQ ID NO: 4) DYYMT(SEQ ID NO: 268) (Kabat) RNRARGYT (SEQ ID NO: 269) (Chothia) CD3-0006_VH GFTFSDYYMT FIRNQARGYTSDHNPSVKG(SEQ ID NO: 10) DRPSYYVLDY (SEQ ID NO: 2) (Kabat); (SEQ ID NO: 4) (ABM); RNQARGYT (SEQ ID NO: 270) (Chothia) DYYMT(SEQ ID NO: 268) (Kabat) 2B5-1038 DYYMT FIRNQARGYTSDHNPSVKG DRPSYYVLDY (SEQ ID NO: 268) (Kabat) (SEQ ID NO: 10) (Kabat) (SEQ ID NO: 4) GFTFSDY (SEQ ID NO: 277) (Chothia) RNQARGYT (SEQ ID NO: 270) (Chothia)
GFTFSDYYMT (SEQ ID NO: 2) (estendida) 2B5-1039 DYYMT FIRNQARGYTSDHNPSVKG DRPSYYVLDY (SEQ ID NO: 268) (Kabat) (SEQ ID NO: 10) (Kabat) (SEQ ID NO: 4) GFTFSDY (SEQ ID NO: 277) (Chothia) RNQARGYT (SEQ ID NO: 270) (Chothia)
GFTFSDYYMT (SEQ ID NO: 2) (estendida) 2B5-1040 DYYMT FIRNQARGYTSDHNPSVKG DRPSYYVLDY (SEQ ID NO: 268) (Kabat) (SEQ ID NO: 10) (Kabat) (SEQ ID NO: 4) GFTFSDY (SEQ ID NO: 277) (Chothia) RNQARGYT (SEQ ID NO: 270) (Chothia)
GFTFSDYYMT (SEQ ID NO: 2) (estendida) Cadeia leve mAb VL CDR1 VL CDR2 VL CDR3 CD3-0001_VL TSSQSLFNVRSRKNYLA WASTRES KQSYDLFT (SEQ ID NO: 77) (SEQ ID NO: 78) (SEQ ID NO: 79) CD3-0004_VL KSSQSLFNVRSRKNYLA WASTRES KQSYDLFT (SEQ ID NO: 85) (SEQ ID NO: 78) (SEQ ID NO: 79) CD3-0006_VL TSSQSLFNVRSQKNYLA WASTRES KQSYDLFT (SEQ ID NO: 91) (SEQ ID NO: 78) (SEQ ID NO: 79) 2B5-1038 TSDQSLFNVRSGKNYLA WASDRES KQSYDLFT (SEQ ID NO: 278) (SEQ ID NO: 281) (SEQ ID NO: 79) 2B5-1039 TSSESLFNVRSGKNYLA (SEQ ID NO: WASDRES KQSYDLFT 279) (SEQ ID NO: 281) (SEQ ID NO: 79) 2B5-1040 TSSQSLFNVRSGKNYLA (SEQ ID NO: WASDRES KQSYDLFT 280) (SEQ ID NO: 281) (SEQ ID NO: 79)
[00240] Em uma modalidade, a invenção fornece um anticorpo bies- pecífico em que: (a) o GUCY2c VL CDR1 compreende uma sequência de SEQ ID NO: 93, 101, 105, 107, 113, 120, 148, 153, 163 ou 167; o GUCY2c VL CDR2 compreende uma sequência da SEQ ID NO: 78, 94, 102, 108, 114, 141, 144, 146, 149, 151, 157, 159, 161, 164 ou 168; e uma GUCY2c VL CDR3 compreende uma sequência da SEQ ID NO: 95, 109, 115, 121, 142, 154, 165 ou 169; (b) o CD3 VH CDR1 compre- ende uma sequência de SEQ ID NO: 2, 268 ou 277; o CD3 VH CDR2 compreende uma sequência de SEQ ID NO: 3, 10, 269 ou 270; e o CD3 VH CDR3 compreende uma sequência da SEQ ID NO: 4; (c) o CD3 VL CDR1 compreende uma sequência de SEQ ID NO: 77, 85, 91, 278, 279 ou 280; o CD3 VL CDR2 compreende uma sequência da SEQ ID NO: 78 ou 281; e o CD3 VL CDR3 compreende a sequência da SEQ ID NO: 79; e (d) o GUCY2c VH CDR1 compreende uma sequência de SEQ ID NO: 12, 20, 27, 34, 42, 74, 257, 258, 259, 260 ou 261; o GUCY2c VH CDR2 compreende uma sequência da SEQ ID NO: 13, 21, 28, 35, 43, 53, 66, 68, 70, 72, 75, 262, 263, 264, 265, 266 ou 267; e o GUCY2c VH CDR3 compreende uma sequência de SEQ ID NO: 14, 22, 29, 36 ou 44.
[00241] Em algumas de tais modalidades, a invenção fornece um an- ticorpo biespecífico em que: (a) o GUCY2c VH CDR1 compreende a sequência de SEQ ID NO: 74ou 259; (b) o GUCY2c VH CDR2 compre- ende a sequência de SEQ ID NO: 75ou 267; (c) o GUCY2c VH CDR3 compreende a sequência de SEQ ID NO: 29; (d) o GUCY2c VL CDR1 compreende a sequência de SEQ ID NO: 148; (e) o GUCY2c VL CDR2 compreende a sequência de SEQ ID NO: 149; e (f) o GUCY2c VL CDR3 compreende a sequência de SEQ ID NO: 142.
[00242] Em outras modalidades de cada um dos anteriores, a inven- ção fornece um anticorpo biespecífico em que: (a) o CD3 VH CDR1 compreende a sequência de SEQ ID NO: 2, 268 ou 277; (b) o CD3 VH CDR2 compreende a sequência da SEQ ID NO: 10 ou 270; (c) o CD3 VH CDR3 compreende a sequência da SEQ ID NO: 4; (d) o CD3 VL CDR1 compreende a sequência da SEQ ID NO: 91, 278, 279 ou 280; (e) o CD3 VL CDR2 compreende a sequência da SEQ ID NO: 78 ou 281; e (f) o CD3 VL CDR3 compreende a sequência da SEQ ID NO: 79.
[00243] Em uma modalidade particular, a invenção fornece um poli- nucleotídeo compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codi- fica as regiões variáveis da cadeia pesada e/ou da cadeia leve de um anticorpo como aqui descrito e na Tabela 5, Tabela 37A e Tabela 37B, incluindo: CD3-0001, CD3- 0004, CD3-0006, GUCY2C-0074, GUCY2C- 0077, GUCY2C-0078, GUCY2C-0098, GUCY2C-0104, GUCY2C-0105, GUCY2C-0240, GUCY2C-0315, GUCY2C-0179, GUCY2C-0179, GUCY2C-0179, GUCY2C-0179, GUCY3 GUCY2C-0212, GUCY2C- 0241, GUCY2C-0247, GUCY2C-1186, GUCY2C-1467, GUCY2C-1478, GUCY2C-1481, GUCY2C-1512, GUCY2C-1518, GUCY2C-1526, GUCY2C-1527, GUCY2C-1538, GUCY2C- 1554, GUCY2C-1555, GUCY2C-1556, GUCY2C-1557, GUCY2C-1590, GUCY2C-1591, GUCY2C-1592, GUCY2C-1608, huIGHV3-7, huIGKV1-39, GUCY248C- 0405, GUCY248C-0405, GUCY248C-0405, GUCY248C-0405, GUCY248C-0405, GUCY2C-0250, GUCY2C-1678, GUCY2C-1679 ou GUCY2C-1680.
[00244] As sequências aqui detalhadas descrevem anticorpos GUCY2c, anticorpos CD3 e anticorpos biespecíficos CD3-GUCY2c. Em algumas modalidades, esses anticorpos são referidos por seu ID de clone (por exemplo, GUCY2C-0098). Esses IDs de clone podem ser usados para se referir ao anticorpo maduro (por exemplo, anticorpo bi- específico IgG ou CD3). O clone ID também pode se referir às regiões VH ou VL únicas encontradas nesse anticorpo.
Para IDs de clones que representam anticorpos biespecíficos CD3-GUCY2c (por exemplo, GUCY2C-0098), também pode ter uma única região de anticorpo anti- CD3 (por exemplo, regiões VL e/ou VH) incorporada na proteína ma- dura.
A Tabela 5 mostra o formato do anticorpo e a região anti-CD3 (se houver) presente nessa proteína madura.
As tabelas 37A e 37B mos- tram ainda as sequências componentes destes anticorpos GUCY2c ma- duros, IgGs anti-CD3 e anticorpos biespecíficos CD3-GUCY2c.
Tabela 5 Sequência Descrição Formato Região Anti-CD3
CD3-0001 Anticorpo anti-CD3 IgG CD3-0001
CD3-0004 Anticorpo anti-CD3 IgG CD3-0004
CD3-0006 Anticorpo anti-CD3 IgG CD3-0006
GUCY2C-0074 Anticorpo biespecífico CD3-GUCY2c CD3 biespecífico CD3-0004
GUCY2C-0077 Anticorpo biespecífico CD3-GUCY2c CD3 biespecífico CD3-0004
GUCY2C-0078 Anticorpo biespecífico CD3-GUCY2c CD3 biespecífico CD3-0004
GUCY2C-0098 Anticorpo biespecífico CD3-GUCY2c CD3 biespecífico CD3-0004
GUCY2C-0104 Anticorpo biespecífico CD3-GUCY2c CD3 biespecífico CD3-0004
GUCY2C-0105 Anticorpo biespecífico CD3-GUCY2c CD3 biespecífico CD3-0004
GUCY2C-0240 Anticorpo biespecífico CD3-GUCY2c CD3 biespecífico CD3-0004
GUCY2C-0315 Anticorpo biespecífico CD3-GUCY2c CD3 biespecífico CD3-0004
GUCY2C-0179 Anticorpo biespecífico CD3-GUCY2c CD3 biespecífico CD3-0004
GUCY2C-0193 Anticorpo GUCY2c IgG None None GUCY2C-0210 Anticorpo GUCY2c IgG None GUCY2C-0212 Anticorpo GUCY2c IgG None GUCY2C-0241 Anticorpo GUCY2c IgG
GUCY2C-0247 Anticorpo biespecífico CD3-GUCY2c CD3 biespecífico CD3-0004 Anticorpo biespecífico CD3-GUCY2c GUCY2C-1186 CD3 biespecífico CD3-0006 Anticorpo biespecífico CD3-GUCY2c GUCY2C-1467 CD3 biespecífico CD3-0006 Anticorpo biespecífico CD3-GUCY2c GUCY2C-1476 CD3 biespecífico CD3-0006 Anticorpo biespecífico CD3-GUCY2c GUCY2C-1478 CD3 biespecífico CD3-0006 Anticorpo biespecífico CD3-GUCY2c GUCY2C-1481 CD3 biespecífico CD3-0006 Anticorpo biespecífico CD3-GUCY2c GUCY2C-1512 CD3 biespecífico CD3-0006 Anticorpo biespecífico CD3-GUCY2c GUCY2C-1518 CD3 biespecífico CD3-0006 Anticorpo biespecífico CD3-GUCY2c GUCY2C-1526 CD3 biespecífico CD3-0006
Anticorpo biespecífico CD3-GUCY2c GUCY2C-1527 CD3 biespecífico CD3-0006 Anticorpo biespecífico CD3-GUCY2c GUCY2C-1538 CD3 biespecífico CD3-0006 Anticorpo biespecífico CD3-GUCY2c GUCY2C-1554 CD3 biespecífico CD3-0006 Anticorpo biespecífico CD3-GUCY2c GUCY2C-1555 CD3 biespecífico CD3-0006 Anticorpo biespecífico CD3-GUCY2c GUCY2C-1556 CD3 biespecífico CD3-0006 Anticorpo biespecífico CD3-GUCY2c GUCY2C-1557 CD3 biespecífico CD3-0006 Anticorpo biespecífico CD3-GUCY2c GUCY2C-1590 CD3 biespecífico CD3-0006 Anticorpo biespecífico CD3-GUCY2c GUCY2C-1591 CD3 biespecífico CD3-0006 Anticorpo biespecífico CD3-GUCY2c GUCY2C-1592 CD3 biespecífico CD3-0006 Anticorpo biespecífico CD3-GUCY2c GUCY2C-1608 CD3 biespecífico CD3-0006 huIGHV3-7 Linha germinativa VH de imunoglobulina humana VH NA huIGKV1-39 Linha germinativa VL de imunoglobulina humana VL NA GUCY2C-0405 Proteína de fusão scFv-Fc Anti-GUCY2c fusão scFv-Fc NA GUCY2C-0486 Anticorpo GUCY2c IgG NA GUCY2C-1640 Anticorpo GUCY2c IgG NA GUCY2C-0250 Anticorpo biespecífico CD3-GUCY2c CD3 biespecífico CD3-0001 GUCY2C-1678 Anticorpo biespecífico CD3-GUCY2c CD3 biespecífico 2B5-1038 GUCY2C-1679 Anticorpo biespecífico CD3-GUCY2c CD3 biespecífico 2B5-1039 GUCY2C-1680 Anticorpo biespecífico CD3-GUCY2c CD3 biespecífico 2B5-1040
[00245] Alguns dos anticorpos CD3 fornecidos neste documento po- dem ser referidos por mais de um nome. Por exemplo, CD3-0001 pode ser referido como 2B5v1 ou h2B5v1; CD3-0004 pode ser referido como 2B4 ou h2B4; e CD3-0006 pode ser referido como 2B5v6 ou h2B5v6.
[00246] Alguns dos anticorpos CD3 fornecidos aqui incluem, mas não estão limitados a, variantes de CD3-0006 (também referido como 2B5v6 ou h2B5v6). Por exemplo, as variantes de CD3-0006 incluem, mas não estão limitadas a, 2B5-1038, 2B5-1039 e 2B5-1040.
[00247] A afinidade de ligação (KD) dos anticorpos como aqui des- critos para GUCY2c (tal como GUCY2c humano (por exemplo, (SEQ ID NO: 224, 230 ou 232), ou para CD3 (SEQ ID NO: 242), pode ser cerca de 0,001 nM a cerca de 6500 nM. Em algumas modalidades, a afinidade de ligação é de cerca de 6500 nM, 6000 nM, 5500 nM, 4500 nM, 4000 nM, 3500 nM, 3000 nM, 2500 nM, 2000 nM, 1500 nM, 1000 nM, 750 nM, 500 nM, 400 nM, 300 nM, 250 nM, 200 nM, 150 nM, 100 nM, 75 nM, 50 nM, 45 nM, 40 nM, 35 nM, 30 nM, 25 nM, 20 nM, 19 nM, 17 nM, 16 nM, 15 nM, 10 nM, 8 nM, 7,5 nM, 7 nM, 6,5 nM, 6 nM, 5,5 nM, 5 nM, 4 nM,
3 nM, 2 nM, 1 nM, 0,5 nM, 0,3 nM, 0,1 nM, 0,01 nM, 0,002 nM ou 0,001 nM. Em algumas modalidades, a afinidade de ligação é inferior a cerca de 6500 nM, 6000 nM, 5500 nM, 5000 nM, 4000 nM, 3000 nM, 2000 nM, 1000 nM, 900 nM, 800 nM, 500 nM, 250 nM, 200 nM, 100 nM, 50 nM, 30 nM, 20 nM, 10 nM, 7,5 nM, 7 nM, 6,5 nM, 6 nM, 5 nM, 4,5 nM, 4 nM, 3,5 nM, 3 nM, 2,5 nM, 2 nM, 1,5 nM, 1 nM, 0,5 nM, 0,1 nM, 0,05 nM, 0,01 nM ou nM inferior. Em uma determinada modalidade, o anticorpo tem um KD de cerca de 80 a cerca de 200 pM, de preferência cerca de 100 a cerca de 150 pM.
[00248] Em algumas modalidades, a presente invenção fornece um anticorpo que se liga a GUCY2c e/ou CD3 e compete com o anticorpo como aqui descrito, incluindo: CD3-0001, CD3-0004, CD3-0006, GUCY2C-0074, GUCY2C-0077, GUCY2C-0078, GUCY2C-0098, GUCY2C-0104, GUCY2C-0105, GUCY2C-0240, GUCY2C-0315, GUCY2C-0179, GUCY2C-0193, GUCY2C-0210, GUCY2C-02CY2C- 0212, GUCY2C-0212C 1186, GUCY2C-1467, GUCY2C-1478, GUCY2C-1481, GUCY2C-1512, GUCY2C-1518, GUCY2C-1526, GUCY2C-1527, GUCY2C-1538, GUCY2C-1554, GUCY2C-1555, GUCY2C-1555, 1557C GUCY2C-1590, GUCY2C-1591, GUCY2C- 1592, GUCY2C-1608, huIGHV3-7, huIGKV1-39, GUCY2C-0405, GUCY2C-0486, GUCY2C-1640, GUCY2C-0250, GUCY2C-1678, GUCY2C-1679, e GUCY2C -1680 (Tabela 5).
[00249] Em um aspecto, é fornecido um anticorpo de qualquer uma das sequências da região de estrutura conforme listado na Tabela 6. Em algumas modalidades, a invenção fornece um anticorpo como aqui des- crito, compreendendo ainda uma estrutura de VH humana ou humani- zada e uma estrutura de VL humana ou humanizada. Em algumas des- sas modalidades, a estrutura VH compreende uma sequência de SEQ ID NO: 5, 6, 7, 8, 15, 16, 17, 18, 23, 24, 25, 30, 31, 32, 37, 38, 39, 40, 45, 46, 47, 49, 50, 51, 54, 55, 56, 58, 59, 61 ou 63; e/ou a VL de estrutura compreende uma sequência de SEQ ID NO: 80, 81, 82, 83, 86, 87, 88, 89, 96, 97, 98, 99, 103, 110, 111, 116, 117, 118, 122, 123, 124, 126, 127, 128, 130, 131, 132, 133, 135, 139 ou 155. Tabela 6 Descrição de Região de Estrutura Sequência CD3-0001_VH FW_H1 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS (SEQ ID No: 5) CD3-0001_VH FW_H2 WVRQAPGKGLEWVA (SEQ ID No: 6) CD3-0001_VH FW_H3 RFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR (SEQ ID No: 7) CD3-0001_VH FW_H4 WGQGTTVTVSS (SEQ ID No: 8) GUCY2C-0074_VH FW_H1 EVQLQQSGAELARPGASVNLSCKAS (SEQ ID No: 15) GUCY2C-0074_VH FW_H2 WVKQRPGQGLEWIG (SEQ ID No: 16) GUCY2C-0074_VH FW_H3 KATLTADKSSSTAYMQLSSLASEDSAVYYCVR (SEQ ID No: 17) GUCY2C-0074_VH FW_H4 WGQGTSVTVSS (SEQ ID No: 18) GUCY2C-0077_VH FW_H1 EVQLQQSGAELARPGASVKLSCKAS (SEQ ID No: 23) GUCY2C-0077_VH FW_H2 WIKQRPGQGLEWIG (SEQ ID No: 24) GUCY2C-0077_VH FW_H3 KATLTADKSSNTAYMQLSSLASEDSAVYYCAR (SEQ ID No: 25) GUCY2C-0098_VH FW_H1 QVQLQQPGAELVKPGASVKLSCKAS (SEQ ID No: 30) GUCY2C-0098_VH FW_H3 KATLTVDKSATTAYMQLSSLTAEDSAVYYCTR (SEQ ID No: 31) GUCY2C-0098_VH FW_H4 WGAGTTVTVSS (SEQ ID No: 32) GUCY2C-0104_VH FW_H1 EVQLQQSGAELVKPGASVKLSCTAS (SEQ ID NO: 37) GUCY2C-0104_VH FW_H2 WVKQRPEQGLEWIG (SEQ ID NO: 38) GUCY2C-0104_VH FW_H3 KATITADTSSNTAYLQLSSLTSEDTAVFYCSS (SEQ ID NO: 39) GUCY2C-0104_VH FW_H4 WGQGTTLTVSS (SEQ ID NO: 40) GUCY2C-0105_VH FW_H1 EVQLQQSGPELVKPGASVKISCKAS (SEQ ID NO: 45) GUCY2C-0105_VH FW_H2 WVKQSHGKSLEWIG (SEQ ID NO: 46) GUCY2C-0105_VH FW_H3 KATLTVDKSSSTAYMHLNSLTSEDSAVYYCAR (SEQ ID NO: 47) GUCY2C-0240_VH FW_H2 WVRQAPGKGLEWIG (SEQ ID NO: 49) GUCY2C-0240_VH FW_H3 RFTISADKAKNSAYLQMNSLRAEDTAVYYCVR (SEQ ID NO: 50) GUCY2C-0240_VH FW_H4 WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 51) GUCY2C-0315_VH FW_H1 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKAS (SEQ ID NO: 54) GUCY2C-0315_VH FW_H2 WVRQAPGQGLEWIG (SEQ ID NO: 55) GUCY2C-0315_VH FW_H3 RVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCVR (SEQ ID NO: 56) GUCY2C-0179_VH FW_H3 RFTISVDKAKNSAYLQMNSLRAEDTAVYYCAR
(SEQ ID NO: 58) GUCY2C-0179_VH FW_H4 WGQGTMVTVSS (SEQ ID NO: 59) GUCY2C-0193_VH FW_H3 RFTISVDKAKNSAYLQMNSLRAEDTAVYYCTR (SEQ ID NO: 61) GUCY2C-0210_VH FW_H2 WVRQAPGKGLEWIA (SEQ ID NO: 63) CD3-0001_VL FW_L1 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO: 80) CD3-0001_VL FW_L2 WYQQKPGKAPKLLIY (SEQ ID NO: 81) CD3-0001_VL FW_L3 GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC (SEQ ID NO: 82) CD3-0001_VL FW_L4 FGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 83) CD3-0004_VL FW_L1 DIVMTQSPDSLAVSLGERATINC (SEQ ID NO: 86) CD3-0004_VL FW_L2 WYQQKPGQPPKLLIS (SEQ ID NO: 87) CD3-0004_VL FW_L3 GVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYC (SEQ ID NO: 88) CD3-0004_VL FW_L4 FGSGTKLEIK (SEQ ID NO: 89) GUCY2C-0074_VL FW_L1 DIVLTQSPASLAVSLGQRATISC (SEQ ID NO: 96) GUCY2C-0074_VL FW_L2 WFQQKPGQPPKLLIY (SEQ ID NO: 97) GUCY2C-0074_VL FW_L3 GVPARFSGSGSGTDFSLNIHPLEEDDTAMFFC (SEQ ID NO: 98) GUCY2C-0074_VL FW_L4 FGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 99) GUCY2C-0077_VL FW_L3 GVPARFSGSGSGTDFSLNIHPMEEDDTAMYFC (SEQ ID NO: 103) GUCY2C-0098_VL FW_L2 WYQQKPGQPPKLLIY (SEQ ID NO: 110) GUCY2C-0098_VL FW_L3 GVPARFSGSGSGTDFSLNIHPVEEDDIAMYFC (SEQ ID NO: 111) GUCY2C-0104_VL FW_L1 DIVMTQSPASLAVSLGQRATISC (SEQ ID NO: 116) GUCY2C-0104_VL FW_L3 GVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYC (SEQ ID NO: 117) GUCY2C-0104_VL FW_L4 FGAGTKLELK (SEQ ID NO: 118) GUCY2C-0105_VL FW_L1 DIVMTQSPSSLAVSVGEKVTVSC (SEQ ID NO: 122) GUCY2C-0105_VL FW_L2 WYQQRPGQSPKLLIY (SEQ ID NO: 123) GUCY2C-0105_VL FW_L3 GVPDRFTGSGSGTDFTLSISSVKAEDLAVYYC (SEQ ID NO: 124) GUCY2C-0240_VL FW_L1 DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO: 126) GUCY2C-0240_VL FW_L2 WFQQKPGKAPKLLIY (SEQ ID NO: 127) GUCY2C-0240_VL FW_L4 FGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 128) GUCY2C-0315_VL FW_L1 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSC (SEQ ID NO: 130) GUCY2C-0315_VL FW_L2 WYQQKPGQAPRLLIY (SEQ ID NO: 131) GUCY2C-0315_VL FW_L3 GIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYC (SEQ ID NO: 132) GUCY2C-0315_VL FW_L4 FGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 133) GUCY2C-0179_VL FW_L2 WYQQKPGKSPKLLIY
(SEQ ID NO: 135) GUCY2C-0247_VL FW_L2 WYQQKPGKPPKLLIY (SEQ ID NO: 139) GUCY2C-1512_VL FW_L4 FGQGTKLKIK (SEQ ID NO: 155)
[00250] Em uma modalidade, a invenção fornece um anticorpo, ca- racterizado pelo fato de que a região VH compreende a sequência de SEQ ID NO: 73, ou uma variante desta com uma ou várias substituições conservativas de aminoácidos em resíduos que não estão dentro da re- gião CDR; e/ou em que a região VL compreende a sequência da SEQ ID NO: 147, ou uma variante desta com uma ou várias substituições de aminoácidos conservativas em aminoácidos que não estão dentro da região CDR.
[00251] Em um aspecto, a invenção fornece um anticorpo biespecí- fico que se liga especificamente a GUCY2c e CD3, caracterizado pelo fato de que o anticorpo biespecífico compreende uma primeira cadeia de polipeptídeo e uma segunda cadeia de polipeptídeo. Em uma moda- lidade, a primeira cadeia de polipeptídeo compreende uma sequência de aminoácidos como mencionado em uma ou mais das SEQ ID NOs: 216 e 220. Em outra modalidade, a segunda cadeia de polipeptídeo compreende uma sequência de aminoácidos como mencionado em uma ou mais das SEQ ID NOs: 216 e 220. Em uma forma de realização preferida, a primeira cadeia de polipeptídeo compreende uma sequên- cia de aminoácidos de SEQ ID NO: 216; e a segunda cadeia de polipep- tídeo compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 220. Em algumas de tais modalidades, o anticorpo biespecífico capaz de li- gação específica a um epitopo de GUCY2c e a um epitopo de CD3 com- preendendo uma primeira cadeia de lipeptídeo e uma segunda cadeia de polipeptídeo, caracterizado pelo fato de que a primeira cadeia de po- lipeptídeo compreende uma sequência de SEQ ID NO: 216 e a segunda cadeia de polipeptídeo compreende uma sequência de SEQ ID NO: 220. Em uma modalidade, a segunda cadeia de polipeptídeo é qualquer po- lipeptídeo que deve ser associado à primeira cadeia de polipeptídeo por meio de uma interface.
[00252] Em tal modalidade, a invenção fornece um anticorpo biespe- cífico, caracterizado pelo fato de que : (a) a primeira cadeia de polipep- tídeo compreende, na direção do N-terminal para o C-terminal: (i) um Domínio 1, compreendendo uma VL de um anticorpo GUCY2c (GUCY2c VL), e uma VH de um anticorpo CD3 (CD3 VH), e (ii) um pri- meiro domínio de promoção de heterodímero; e (b) a segunda cadeia de polipeptídeo compreende, na direção do N-terminal para o C-termi- nal: (i) um Domínio 2, compreendendo uma VL de um anticorpo anti- CD3 (CD3 VL), e uma VH de um anticorpo GUCY2c ( GUCY2c VH), e (ii) um segundo domínio de promoção de heterodímero; em que o GUCY2c VL e o GUCY2c VH formam um domínio que se liga especifi- camente a GUCY2c; e o CD3 VL e o CD3 VH formam um domínio que se liga especificamente ao CD3.
[00253] Em outra tal modalidade, (a) a primeira cadeia de polipeptí- deo compreende, na direção do N-terminal para o C-terminal: (i) um Do- mínio 1, compreendendo um CD3 VL e um GUCY2c VH, e (ii) um pri- meiro domínio de promoção de heterodímero; e (b) a segunda cadeia de polipeptídeo compreende, na direção do N-terminal para o C-termi- nal: (i) um Domínio 2 compreendendo um GUCY2c VL e um CD3 VH, e (ii) um segundo domínio de promoção de heterodímero; em que o GUCY2c VL e o GUCY2c VH formam um domínio que se liga especifi- camente a GUCY2c; e o CD3 VL e o CD3 VH formam um domínio que se liga especificamente ao CD3.
[00254] Em ainda outra tal modalidade, (a) a primeira cadeia de poli- peptídeo compreende, na direção do N-terminal para o C-terminal: (i) um Domínio 1, compreendendo um CD3 VL e um GUCY2c VH, e (ii) um primeiro domínio de promoção de heterodímero; e (b) a segunda cadeia de polipeptídeo compreende, na direção do N-terminal para o C-termi- nal: (i) um Domínio 2, compreendendo um GUCY2c VL e um CD3 VH,
e (ii) um segundo domínio de promoção de heterodímero; em que o GUCY2c VH e o GUCY2c VL formam um domínio que se liga especifi- camente a GUCY2c; e o CD3 VL e o CD3 VH formam um domínio que se liga especificamente ao CD3.
[00255] Em ainda outra modalidade, (a) a primeira cadeia de polipep- tídeo compreende, na direção do N-terminal para o C-terminal: (i) um Domínio 1, compreendendo um CD3 VH e um GUCY2c VL, e (ii) um primeiro domínio de promoção de heterodímero; e (b) a segunda cadeia de polipeptídeo compreende, na direção do N-terminal para o C-termi- nal: (i) um Domínio 2, compreendendo um GUCY2c VH e um CD3 VL, e (ii) um segundo domínio de promoção de heterodímero, caracterizado pelo fato de que o GUCY2c VL e o GUCY2c VH formam um domínio que especificamente se liga a GUCY2c; e o CD3 VL e o CD3 VH formam um domínio que se liga especificamente ao CD3.
[00256] A invenção também fornece polinucleotídeos isolados que codificam os anticorpos da invenção e vetores e células hospedeiras compreendendo os polinucleotídeos. Em um aspecto, um polinucleotí- deo compreende uma sequência de nucleotídeo que codifica as regiões variáveis da cadeia pesada, as regiões variáveis da cadeia leve, as re- giões CDR, as regiões de estrutura, as cadeias Fc de protuberância em buraco, as primeiras cadeias polipeptídicas e as segundas cadeias po- lipeptídicas, conforme listado nas Tabelas 1-7 e 38. Em certas modali- dades, um polinucleotídeo compreende uma sequência que codifica qualquer um dos anticorpos CD3-0001, CD3-0004, CD3-0006, GUCY2C-0074, GUCY2C-0077, GUCY2C-0078, GUCY2C-0098, GUCY2C-0104, GUCY2C-0105, GUCY2C-0240, GUCY2C-0315, GUCY2C-0179, GUCY2C-0193, GUCY2C-0210, GUCY2C -0212, GUCY2C-0241, GUCY2C-0247, GUCY2C-1186, GUCY2C-1467, GUCY2C-1478, GUCY2C-1481, GUCY2C-1512, GUCY2C-1518, GUCY2C-1526, GUCY2C-15272C-15272C, GUCY2C-1555, GUCY2C-
1556, GUCY2C-1557, GUCY2C-1590, GUCY2C-1591, GUCY2C-1592, GUCY2C-1608, huIGHV3-7, huIGKV1-39, GUCY2C-0405, GUCY2C- 0486, GUCY2C-16402CYUCY2C-16402C GUCY2C-1679 ou GUCY2C-
1680.
[00257] A sequência que codifica o anticorpo de interesse pode ser mantida em um vetor em uma célula hospedeira e a célula hospedeira pode então ser expandida e congelada para uso futuro. Vetores (inclu- indo vetores de expressão) e células hospedeiras são ainda descritos neste documento.
[00258] A invenção também abrange proteínas de fusão compreen- dendo um ou mais fragmentos ou regiões dos anticorpos desta inven- ção. Em uma modalidade, é fornecido um polipeptídeo de fusão que compreende pelo menos 10 aminoácidos contíguos da região variável da cadeia leve mostrada na SEQ ID NO: 76, 84, 90, 92, 100.104.106, 112, 119, 125, 129, 134, 136, 137, 138, 140, 143, 145, 147, 150,152, 156, 158, 160, 162, 166, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 274, 275 ou 276; e/ou pelo menos 10 aminoácidos contíguos da região variável da cadeia pesada mostrada na SEQ ID NO: 1, 9, 11, 19, 26, 33, 41, 48, 52, 57, 60, 62, 64, 65, 67, 69, 71, 73 ou 273. Em outras modalidades, é fornecido um polipeptídeo de fusão que compreende pelo menos cerca de 10, pelo menos cerca de 15, pelo menos cerca de 20, pelo menos cerca de 25, ou pelo menos cerca de 30 aminoácidos contíguos de a região vari- ável da cadeia leve e/ou pelo menos cerca de 10, pelo menos cerca de 15, pelo menos cerca de 20, pelo menos cerca de 25, ou pelo menos cerca de 30 aminoácidos contíguos da região variável da cadeia pe- sada. Em outra modalidade, o polipeptídeo de fusão compreende uma região variável da cadeia leve e/ou uma região variável da cadeia pe- sada, como mostrado em qualquer um dos pares de sequência selecio- nados entre SEQ ID NOs: 73 e 147; 69 e 147; 60 e 138; 48 e 125; ou 26 e 106. Em outra modalidade, o polipeptídeo de fusão compreende um ou mais CDR(s). Em ainda outras modalidades, o polipeptídeo de fusão compreende CDR H3 (VH CDR3) e/ou CDR L3 (VL CDR3). Para os propósitos desta invenção, uma proteína de fusão contém um ou mais anticorpos e outro sequência de aminoácido à qual não está ligada na molécula nativa, por exemplo, uma sequência heteróloga ou uma se- quência homóloga de outra região. Sequências heterólogas exemplares incluem, mas não estão limitadas a, uma marcação, como uma marca- ção FLAG ou uma marcação 6His. As marcações são bem conhecidas na técnica. Um polipeptídeo de fusão pode ser criado por métodos co- nhecidos na técnica, por exemplo, sinteticamente ou recombinante- mente. Normalmente, as proteínas de fusão desta invenção são feitas através da preparação e expressão de um polinucleotídeo que as codi- fica usando métodos recombinantes aqui descritos, embora também possam ser preparadas por outros meios conhecidos na técnica, inclu- indo, por exemplo, síntese química.
[00259] A invenção também abrange scFv de anticorpos desta inven- ção. Os fragmentos da região variável de cadeia única são feitos ligando regiões variáveis da cadeia leve e/ou pesada usando um peptídeo de ligação curto (Bird et al., Science 242: 423-426, 1988). Um exemplo de um peptídeo de ligação é GGGGSGGGGSGGGGSG (SEQ ID NO: 193), que faz uma ponte de aproximadamente 3,5 nm entre o terminal carbóxi de uma região variável e o terminal amino da outra região variável. Li- gantes de outras sequências foram projetados e usados (Bird et al., Sci- ence 242: 423-426, 1988). Os ligantes devem ser polipeptídeos curtos e flexíveis e, de preferência, compostos por menos de cerca de 20 resí- duos de aminoácidos. Os ligantes podem, por sua vez, ser modificados para funções adicionais, como fixação de drogas ou fixação a suportes sólidos. As variantes de cadeia única podem ser produzidas de forma recombinante ou sintética. Para a produção sintética de scFv, um sinte- tizador automatizado pode ser usado. Para a produção recombinante de scFv, um plasmídeo adequado contendo polinucleotídeo que codifica o scFv pode ser introduzido em uma célula hospedeira adequada, seja eucariótica, como levedura, planta, inseto ou células de mamífero, ou procariótica, como E. coli. Os polinucleotídeos que codificam a scFv de interesse podem ser feitos por manipulações de rotina, como a ligação de polinucleotídeos. A scFv resultante pode ser isolada usando técnicas padrão de purificação de proteínas conhecidas na técnica.
[00260] Outras formas de anticorpos de cadeia única, como diacor- pos ou minicorpos, também estão incluídas. Diacorpos são anticorpos bivalentes biespecíficos nos quais as regiões variáveis de cadeia pe- sada (VH) e variáveis de cadeia leve (VL) são expressas em uma única cadeia polipeptídica, mas usando um ligante que é muito curto para per- mitir o emparelhamento entre os dois domínios na mesma cadeia, for- çando assim os domínios a parearem com domínios complementares de outra cadeia e criando dois sítios de ligação ao antígeno (veja, por exemplo, Holliger, P., et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 90: 6444-6448, 1993; Poljak, RJ, et al., Structure 2: 1121-1123, 1994). O minicorpo in- clui as regiões VL e VH de um anticorpo nativo fundido à região de arti- culação e ao domínio CH3 da molécula de imunoglobulina. Veja, por exemplo, Patente Norte-americana 5.837.821.
[00261] Em um aspecto, a invenção fornece composições (tais como composições farmacêuticas) compreendendo qualquer um dos polinu- cleotídeos da invenção. Em algumas modalidades, a composição com- preende um vetor de expressão que compreende um polinucleotídeo que codifica qualquer um dos anticorpos aqui descritos. Em ainda outras modalidades, a composição compreende um ou ambos os polinucleotí- deos mostrados em SEQ ID NO: 246 (codificando a primeira cadeia de polipeptídeo GUCY2C-1608) e SEQ ID NO: 247 (codificando a segunda cadeia de polipeptídeo GUCY2C-1608). Os vetores de expressão e a administração de composições de polinucleotídeo são ainda descritos neste documento.
[00262] Polinucleotídeos complementares a qualquer uma de tais se- quências também estão incluídos na presente invenção. Os polinucleo- tídeos podem ser de fita simples (codificação ou antisense) ou de fita dupla e podem ser DNA (genômico, cDNA ou sintético) ou moléculas de RNA. As moléculas de RNA incluem mRNAs maduros e imaturos, como mRNAs precursores (pré-mRNA) ou mRNAs nucleares heterogêneos (hnRNA) e mRNAs maduros. Sequências codificantes ou não codifican- tes adicionais podem, mas não precisam, estar presentes dentro de um polinucleotídeo da presente invenção, e um polinucleotídeo pode, mas não precisa, ser ligado a outras moléculas e/ou materiais de suporte.
[00263] Os polinucleotídeos podem compreender uma sequência na- tiva (isto é, uma sequência endógena que codifica um anticorpo ou uma porção do mesmo) ou podem compreender uma variante dessa sequên- cia. As variantes de polinucleotídeo contêm uma ou mais substituições, adições, deleções e/ou inserções de modo que a imunorreatividade do polipeptídeo codificado não seja diminuída, em relação a uma molécula imunorreativa nativa. O efeito na imunorreatividade do polipeptídeo co- dificado pode geralmente ser avaliado como descrito neste documento. As variantes exibem preferivelmente pelo menos cerca de 70% de iden- tidade, mais preferivelmente, pelo menos cerca de 80% de identidade, ainda mais preferivelmente, pelo menos cerca de 90% de identidade, e mais preferivelmente, pelo menos cerca de 95% de identidade com uma sequência de polinucleotídeo que codifica um anticorpo nativo ou uma parte dele.
[00264] Duas sequências de polinucleotídeo ou polipeptídicas são di- tas "idênticas" se a sequência de nucleotídeos ou aminoácidos nas duas sequências for a mesma quando alinhadas para correspondência má- xima conforme descrito abaixo. Comparações entre duas sequências são tipicamente realizadas comparando as sequências em uma janela de comparação para identificar e comparar regiões sítios de similaridade de sequência. Uma "janela de comparação", como aqui usado, refere- se a um segmento de pelo menos cerca de 20 posições contíguas, ge- ralmente 30 a cerca de 75, ou 40 a cerca de 50, caracterizado pelo fato de que uma sequência pode ser comparada a uma sequência de refe- rência do mesmo número de posições contíguas após as duas sequên- cias estarem alinhadas de maneira ideal.
[00265] O alinhamento ideal de sequências para comparação pode ser conduzido usando o programa Megalign no Lasergene suíte of bioin- formatics software (DNASTAR, Inc., Madison, WI), usando parâmetros padrão. Preferivelmente, a "porcentagem de identidade de sequência" é determinada comparando de duas sequências idealmente alinha- dasna janela de comparação de pelo menos 20 posições, caracterizado pelo fato de que a porção da sequência de polinucleotídeo ou polipeptí- deo na janela de comparação pode compreender adições ou deleções (isto é, lacunas) de 20 por cento ou menos, geralmente 5 a 15 por cento, ou 10 a 12 por cento, em comparação com as sequências de referência (que não compreende adições ou deleções) para o alinhamento ideal das duas sequências. A porcentagem é calculada determinando o nú- mero de posições em que as bases de ácido nucleico idênticas ou resí- duo de aminoácido ocorrem em ambas as sequências para produzir o número de posições combinadas, dividindo o número de posições com- binadas pelo número total de posições na sequência de referência (isto é, o tamanho da janela) e multiplicando os resultados por 100 para obter a porcentagem de identidade da sequência.
[00266] As variantes podem também, ou alternativamente, ser subs- tancialmente homólogas a um gene nativo, ou uma porção ou comple- mento do mesmo. Essas variantes de polinucleotídeo são capazes de hibridizar sob condições moderadamente rigorosas com uma sequência de DNA de ocorrência natural que codifica um anticorpo nativo (ou uma sequência complementar).
[00267] Será apreciado por aqueles versados na técnica que, como resultado da degeneração do código genético, existam muitas sequên- cias de nucleotídeos que codifiquem um polipeptídeo como aqui des- crito. Alguns desses polinucleotídeos apresentam homologia mínima com a sequência de nucleotídeos de qualquer gene nativo. No entanto, os polinucleotídeos que variam devido a diferenças na utilização de có- dons são especificamente contemplados pela presente invenção. Além disso, alelos dos genes compreendendo as sequências de polinucleotí- deo aqui fornecidas incluem-se no escopo da presente invenção. Alelos são genes endógenos que são alterados como resultado de uma ou mais mutações, como deleções, adições e/ou substituições de nucleotí- deos. O mRNA e a proteína resultantes podem, mas não precisam, ter uma estrutura ou função alterada. Os alelos podem ser identificados usando técnicas padrão (como hibridização, amplificação e/ou compa- ração de sequência de banco de dados).
[00268] Em um aspecto, a invenção fornece um método para prepa- rar qualquer um dos polinucleotídeos aqui descritos. Por exemplo, os polinucleotídeos desta invenção podem ser obtidos usando síntese quí- mica, métodos recombinantes ou PCR. Os métodos de síntese química de polinucleotídeos são bem conhecidos na técnica e não precisam ser descritos em detalhes aqui. Alguém versado na técnica pode usar as sequências fornecidas neste documento e um sintetizador de DNA co- mercial para produzir uma sequência de DNA desejada.
[00269] Para a preparação de polinucleotídeos usando métodos re- combinantes, um polinucleotídeo compreendendo uma sequência dese- jada pode ser inserido em um vetor adequado, e o vetor por sua vez pode ser introduzido em uma célula hospedeira adequada para replica- ção e amplificação, como também descrito aqui. Os polinucleotídeos podem ser inseridos em células hospedeiras por qualquer meio conhe- cido na técnica. As células são transformadas pela introdução de um polinucleotídeo exógeno por absorção direta, endocitose, transfecção, união a F ou eletroporação. Uma vez introduzido, o polinucleotídeo exó- geno pode ser mantido dentro da célula como um vetor não integrado (tal como um plasmídeo) ou integrado no genoma da célula hospedeira. O polinucleotídeo assim amplificado pode ser isolado da célula hospe- deira por métodos bem conhecidos na técnica (por exemplo, Sambrook et al., 1989).
[00270] Alternativamente, PCR permite a reprodução de sequências de DNA. A tecnologia de PCR é bem conhecida na técnica e é descrita na Patentes Norte-americanas Nos. 4.683.195, 4.800.159, 4.754.065 e
4.683.202, bem como PCR: The Polymerase Chain Reaction, Mullis et al. eds., Birkauswer Press, Boston, 1994.
[00271] O RNA pode ser obtido usando o DNA isolado em um vetor apropriado e inserindo-o em uma célula hospedeira adequada. Quando a célula se replica e o DNA é transcrito em RNA, o RNA pode então ser isolado usando métodos bem conhecidos dos versados na técnica, como mencionado em Sambrook et al., 1989, supra, por exemplo.
[00272] Os vetores de clonagem adequados podem ser construídos de acordo com técnicas padrão ou podem ser selecionados de um grande número de vetores de clonagem disponíveis na técnica. Embora o vetor de clonagem selecionado possa variar de acordo com a célula hospedeira a ser usada, os vetores de clonagem úteis geralmente terão a capacidade de se auto-replicar, podem possuir um único alvo para uma endonuclease de restrição particular e/ou podem transportar genes para um marcador que pode ser usado na seleção de clones contendo o vetor. Exemplos adequados incluem plasmídeos e vírus bacterianos, por exemplo, pUC18, pUC19, Bluescript (por exemplo, pBS SK +) e seus derivados, mp18, mp19, pBR322, pMB9, ColE1, pCR1, RP4, DNAs de fago e vetores de transporte, como pSA3 e pAT28. Estes e muitos ou- tros vetores de clonagem são disponibilizados por fornecedores comer- ciais tais como BioRad, Strategene e Invitrogen.
[00273] Os vetores de expressão geralmente são construções de po- linucleotídeo replicáveis que contêm um polinucleotídeo de acordo com a invenção. Está implícito que um vetor de expressão deve ser replicável nas células hospedeiras como epissomas ou como parte integrante do DNA cromossômico. Os vetores de expressão adequados incluem, mas não estão limitados a, plasmídeos, vetores virais, incluindo adenovírus, vírus adeno-associados, retrovírus, cosmídeos e vetores de expressão divulgados na Publicação PCT Nº WO 87/04462. Os componentes do vetor podem geralmente incluir, mas não estão limitados a, um ou mais dos seguintes: um sinal sequência; uma origem de replicação; um ou mais genes marcadores; elementos de controle da transcrição adequa- dos (tais como promotores, realçadores e terminadores). Para a expres- são (isto é, translação), um ou mais elementos de controle da translação também são geralmente requeridos, como sítios de ligação ao ribos- somo, sítios de iniciação da translação e códons de interrupção.
[00274] Os vetores contendo os polinucleotídeos de interesse podem ser introduzidos na célula hospedeira por qualquer um de vários méto- dos apropriados, incluindo eletroporação, transfecção empregando clo- reto de cálcio, cloreto de rubídio, fosfato de cálcio, DEAE-dextrano ou outras substâncias; bombardeio de microprojéteis; lipofecção; e infec- ção (por exemplo, onde o vetor é um agente infeccioso, tal como o vírus vaccinia). A escolha de introduzir vetores ou polinucleotídeos depen- derá frequentemente das características da célula hospedeira.
[00275] Quaisquer células hospedeiras capazes de superexpressar DNAs heterólogos podem ser usadas com o propósito de isolar os ge- nes que codificam o anticorpo, polipeptídeo ou proteína de interesse. Exemplos não limitativos de células hospedeiras de mamíferos incluem,
mas não se limitam a células COS, HeLa e CHO. Veja também Publica- ção PCT Nº WO 87/04462. As células hospedeiras não mamíferas ade- quadas incluem procariotas (tais como E. coli ou B. subtillis) e leveduras (tais como S. cerevisae, S. pombe; ou K. lactis). De preferência, as cé- lulas hospedeiras expressam os cDNAs em um nível de cerca de 5 ve- zes maior, mais preferivelmente, 10 vezes maior, ainda mais preferivel- mente, 20 vezes maior do que aquele do anticorpo endógeno corres- pondente, ou proteína GUCY2c ou domínio aGUCY2c (por exemplo, do- mínios 1-4) que é realizado por um imunoensaio ou FACS. Uma célula que superexpressa o anticorpo ou proteína de interesse pode ser iden- tificada.
[00276] Em um aspecto, uma molécula de anticorpo GUCY2c terá uma afinidade para GUCY2c, por exemplo, medida por ligação direta ou ensaios de ligação de competição na faixa de afinidade picomolar a mi- cromolar, de preferência na faixa de picomolar a nanomolar baixa.
[00277] Os anticorpos biespecíficos podem ser preparados usando os anticorpos aqui divulgados. Os métodos para preparar anticorpos bi- específicos são conhecidos na técnica (veja, por exemplo, Suresh et al., Methods in Enzymology 121: 210, 1986). Tradicionalmente, a produção recombinante de anticorpos biespecíficos foi baseada na coexpressão de dois pares de cadeia pesada-cadeia leve de imunoglobulina, com as duas cadeias pesadas tendo especificidades diferentes (Millstein e Cu- ello, Nature 305, 537-539, 1983).
[00278] Em outra modalidade, o anticorpo biespecífico, conforme descrito neste documento, compreende um anticorpo humano de com- primento total, caracterizado pelo fato de que uma região variável de anticorpo da proteína heterodimérica é capaz de recrutar a atividade de uma célula imune efetora humana ligando-se especificamente a um an- tígeno efetor (por exemplo, antígeno CD3) localizado na célula imune efetora humana, e em que uma segunda região variável de anticorpo da proteína heterodimérica é capaz de se ligar especificamente a um antí- geno alvo. Em algumas modalidades, o anticorpo humano tem um isó- tipo IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4. Em algumas modalidades, a proteína heterodimérica compreende uma cadeia Fc imunologicamente inerte.
[00279] A célula imune efetora humana pode ser qualquer uma de uma variedade de células imunes efetoras conhecidas na técnica. Por exemplo, a célula imune efetora pode ser um membro da linhagem de células linfóides humanas, incluindo, mas não se limitando a, uma célula T (por exemplo, uma célula T citotóxica), uma célula B e uma célula exterminadora natural (NK). A célula imune efetora também pode ser, por exemplo, sem limitação, um membro da linhagem mieloide humana, incluindo, mas não se limitando a, um monócito, um granulócito neutro- fílico e uma célula dendrítica. Essas células imunes efetoras podem ter um efeito citotóxico ou apoptótico em uma célula alvo ou outro efeito desejado após a ativação por ligação de um antígeno efetor.
[00280] O antígeno efetor é um antígeno (por exemplo, uma proteína ou um polipeptídeo) que é expresso na célula imune efetora humana. Exemplos de antígenos efetores que podem ser ligados pela proteína heterodimérica (por exemplo, um anticorpo heterodimérico ou um anti- corpo biespecífico) incluem, mas não estão limitados a, complexo CD3 humano (ou CD3 (cluster de diferenciação)), CD16, NKG2D, NKp46, CD2, CD28, CD25, CD64 e CD89.
[00281] A célula alvo pode ser uma célula nativa ou estranha aos hu- manos. Em uma célula-alvo nativa, a célula pode ter sido transformada para ser uma célula maligna ou patologicamente modificada (por exem- plo, uma célula-alvo nativa infectada com um vírus, um plasmódio ou uma bactéria). Em uma célula-alvo estranha, a célula é um patógeno invasor, como uma bactéria, um plasmódio ou um vírus.
[00282] O antígeno alvo é expresso em uma célula alvo em uma con-
dição doente (por exemplo, uma doença inflamatória, uma doença pro- liferativa (por exemplo, câncer), um distúrbio imunológico, uma doença neurológica, uma doença neurodegenerativa, uma doença autoimune, uma doença infecciosa (por exemplo, uma infecção viral ou uma infec- ção parasitária), uma reação alérgica, uma doença do enxerto versus hospedeiro ou uma doença do hospedeiro versus enxerto). Um antígeno alvo não é um antígeno efetor. Exemplos de antígenos alvo incluem, mas não estão limitados a, GUCY2c, BCMA, EpCAM (molécula de ade- são de células epiteliais), CCR5 (receptor de quimiocina tipo 5), CD19, HER (receptor de fator de crescimento epidérmico humano) -2/neu, HER- 3, HER-4, EGFR (receptor de fator de crescimento epidérmico), PSMA, CEA, MUC-1 (Mucina), MUC2, MUC3, MUC4, MUC5AC, MUC5B, MUC7, CIhCG, Lewis-Y, CD20, CD33, CD30, gangliósido GD3, 9-O-acetil-GD3, GM2, Globo H, fucosil GM1, Poly SA, GD2, Carboani- drase IX (MN/CA IX), CD44v6, Shh (Sonic Hedgehog), Wue-1, antígeno de células plasmáticas, IgE (ligado à membrana), MCSP (Proteoglicano de Sulfato de Condroitina de Melanoma), CCR8, precursor de TNF-alfa, STEAP, mesotelina, antígeno A33, PSCA (Antígeno de CélulaTronco da Próstata), Ly-6; desmogleína 4, neoepitopo de E-caderina, receptor fetal de acetilcolina, CD25, marcador CA19-9, marcador CA-125 e receptor MIS (substância inibitória de mueller) tipo II, sTn (antígeno Tn sialilado; TAG-72), FAP (antígeno de ativação de fibroblastos ), endosialina, EG- FRvIII, LG, SAS e CD63.
[00283] Em uma modalidade, a invenção fornece um anticorpo bies- pecífico, caracterizado pelo fato de que : (a) um GUCY2c VL CDR1, um GUCY2c VL CDR2 e um GUCY2c VL CDR3 de um GUCY2c VL com- preendendo a sequência mostrada em SEQ ID NO: 92, 100, 104, 106, 112, 119, 125, 129, 134, 136, 137, 138, 140, 143, 145, 147, 150, 152, 156, 158, 160, 162, 166, 170, 171, 172, 173, 174, ou 175; (b) um CD3 VH CDR1, um CD3 VH CDR2 e um CD3 VH CDR3 de um CD3 VH compreendendo a sequência mostrada em SEQ ID NOS: 1, 9 ou 273; (c) um CD3 VL CDR1, um CD3 VL CDR2 e um CD3 VL CDR3 de um CD3 VL compreendendo a sequência mostrada na SEQ ID NO: 76, 84, 90, ou 274, 275 ou 276; e/ou (d) um GUCY2c VH CDR1, um GUCY2c VH CDR2, e um GUCY2c VH CDR3 de um GUCY2c VH compreen- dendo a sequência mostrada em SEQ ID NO: 11, 19, 26, 33, 41, 48, 52, 57, 60, 62, 64, 65, 67, 69, 71 ou 73.
[00284] Em uma modalidade particular, a presente invenção fornece um anticorpo biespecífico em que: (a) a região VH de GUCY2c compre- ende uma sequência de SEQ ID NO: 73; e (b) a região GUCY2c VL compreende uma sequência de SEQ ID NO: 147.
[00285] Em algumas modalidades, a invenção fornece um anticorpo biespecífico em que: (a) o GUCY2c VL CDR1 compreende uma sequên- cia de SEQ ID NO: 93, 101, 105, 107, 113, 120, 148, 153, 163 ou 167; o GUCY2c VL CDR2 compreende uma sequência da SEQ ID NO: 78, 94, 102, 108, 114, 141, 144, 146, 149, 151, 157, 159, 161, 164 ou 168; e uma GUCY2c VL CDR3 compreende uma sequência da SEQ ID NO: 95, 109, 115, 121, 142, 154, 165 ou 169; (b) o CD3 VH CDR1 compre- ende uma sequência de SEQ ID NO: 2, 268 ou 277; o CD3 VH CDR2 compreende uma sequência de SEQ ID NO: 3, 10, 269 ou 270; e o CD3 VH CDR3 compreende uma sequência da SEQ ID NO: 4; (c) o CD3 VL CDR1 compreende uma sequência de SEQ ID NO: 77, 85, 91, 278, 279 ou 280; o CD3 VL CDR2 compreende uma sequência da SEQ ID NO: 78 ou 281; e o CD3 VL CDR3 compreende a sequência da SEQ ID NO: 79; e (d) o GUCY2c VH CDR1 compreende uma sequência de SEQ ID NO: 12, 20, 27, 34, 42, 74, 257, 258, 259, 260 ou 261; o GUCY2c VH CDR2 compreende uma sequência da SEQ ID NO: 13, 21, 28, 35, 43, 53, 66, 68, 70, 72, 75, 262, 263, 264, 265, 266 ou 267; e o GUCY2c VH CDR3 compreende uma sequência de SEQ ID NO: 14, 22, 29, 36 ou 44.
[00286] Em algumas modalidades, os anticorpos úteis na presente invenção são anticorpos monoclonais, anticorpos policlonais, fragmen- tos de anticorpos (por exemplo, Fab, Fab ', F (ab') 2, Fv, Fc, etc.), anti- corpos quiméricos, anticorpos biespecíficos, anticorpos heteroconjuga- dos, cadeia única (ScFv), seus mutantes, proteínas de fusão compreen- dendo uma porção de anticorpo (por exemplo, um anticorpo de domí- nio), anticorpos humanizados e qualquer outra configuração modificada da molécula de imunoglobulina que compreende um sítio de reconheci- mento de antígeno da especificidade necessária, incluindo variantes de glicosilação de anticorpos, variantes de sequência de aminoácidos de anticorpos e anticorpos modificados covalentemente. Os anticorpos po- dem ser murinos, ratos, humanos ou qualquer outra origem (incluindo anticorpos quiméricos ou humanizados).
[00287] Em algumas modalidades, o anticorpo GUCY2c ou CD3, conforme descrito neste documento, é um anticorpo monoclonal. Por exemplo, o anticorpo GUCY2c ou CD3 é um anticorpo monoclonal hu- manizado ou um anticorpo monoclonal quimérico.
[00288] A presente invenção abrange um anticorpo biespecífico com- preendendo uma cadeia ou domínio Fc, ou porções do mesmo. Em al- gumas modalidades, a cadeia Fc, ou porção(ões) da mesma, compre- ende um ou mais domínios constantes da cadeia Fc de IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4 (por exemplo, um domínio CH2 ou CH3). Em outra modalidade, a invenção abrange moléculas que compreendem uma cadeia Fc ou porção da mesma, caracterizado pelo fato de que a cadeia Fc ou porção da mesma compreende pelo menos uma modificação de aminoácido (por exemplo, substituição) em relação a uma cadeia Fc de tipo selva- gem comparável ou porção desta. As regiões Fc variantes são bem co- nhecidas na técnica e são utilizadas principalmente para alterar o fenó- tipo do anticorpo que compreende a região Fc variante, conforme tes- tado em qualquer um dos ensaios de atividade de ligação ou função efetora bem conhecidos na técnica, por exemplo, ELISA, SPR análise ou ADCC. Essas cadeias Fc variantes, ou porções das mesmas, podem estender a meia-vida e estabilidade plasmática exibida por um anticorpo biespecífico da invenção que compreende uma cadeia Fc ou uma por- ção da mesma. Em outra modalidade, a invenção abrange o uso de qualquer variante Fc conhecida na técnica.
[00289] Em uma modalidade, uma ou mais modificações são feitas nos aminoácidos da cadeia Fc para reduzir a afinidade e avidez da ca- deia Fc e, assim, a molécula de anticorpo biespecífico da invenção, para um ou mais receptores FcγR. Em uma modalidade específica, a inven- ção abrange anticorpos biespecíficos que compreendem uma cadeia Fc variante, ou porção da mesma, caracterizado pelo fato de que a cadeia Fc variante compreende pelo menos uma modificação de aminoácido em relação a uma cadeia Fc de tipo selvagem cuja região Fc variante se liga apenas a um FcγR, caracterizado pelo fato de que o FcγR é FcγRIIIA. Em outra modalidade específica, a invenção abrange anticor- pos biespecíficos compreendendo uma cadeia Fc variante, ou porção da mesma, caracterizado pelo fato de que a cadeia Fc variante compre- ende pelo menos uma modificação de aminoácido em relação a uma cadeia Fc de tipo selvagem cuja região Fc variante se liga apenas a um FcγR, caracterizado pelo fato de que o FcγR é FcγRIIA. Em outra mo- dalidade específica, a invenção abrange anticorpos biespecíficos com- preendendo uma cadeia Fc variante ou porção da mesma, caracterizado pelo fato de que a Fc variante chaincompreende pelo menos uma mo- dificação de aminoácido em relação a uma cadeia Fc de tipo selvagem, cuja cadeia Fc variante se liga apenas a um FcγR, caracterizado pelo fato de que o FcγR é FcγRIIB. Em outra modalidade, a invenção abrange moléculas que compreendem uma cadeia Fc variante em que a variante confere ou medeia a atividade ADCC diminuída (ou outra fun- ção efetora) e/ou uma ligação aumentada a FcγRIIB (CD32B), em rela- ção a uma molécula que não compreende nenhuma cadeia Fc ou que compreende uma cadeia Fc de tipo selvagem, conforme medido usando métodos conhecidos por um versado na técnica e aqui descritos.
[00290] A invenção também abrange o uso de uma região Fc com- preendendo domínios ou regiões de dois ou mais isótipos de IgG. Como conhecido na técnica, a modificação de aminoácidos da região Fc pode afetar profundamente a função efetora mediada por Fc e/ou atividade de ligação. No entanto, essas alterações nas características funcionais podem ser ainda mais refinadas e/ou manipuladas quando implementa- das no contexto de isótipos IgG selecionados. Da mesma forma, as ca- racterísticas nativas do isótipo Fc podem ser manipuladas por uma ou mais modificações de aminoácidos. Os múltiplos isótipos IgG (isto é, IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4) exibem diferentes propriedades físicas e fun- cionais, incluindo meia-vida sérica, fixação do complemento, afinidades de ligação FcγR e atividades de função efetora (por exemplo, ADCC, CDC) devido às diferenças em as sequências de aminoácidos de suas regiões de articulação e/ou Fc.
[00291] Em uma modalidade, a modificação de aminoácidos e a re- gião Fc de IgG são independentemente selecionadas com base em suas respectivas atividades de ligação separada e/ou função efetora, a fim de criar um anticorpo biespecífico com as características desejadas. Em uma modalidade particular, as modificações de aminoácidos e as regiões de articulação/Fc de IgG foram testadas separadamente quanto à ligação e/ou atividade de função efetora, conforme descrito neste do- cumento ou conhecido na técnica no contexto de uma IgG1. Em uma modalidade, a modificação de aminoácidos e a região de articulação/Fc de IgG apresentam funcionalidade semelhante, por exemplo, atividade ADCC diminuída (ou outra função efetora) e/ou uma ligação aumentada a FcγRIIB no contexto do anticorpo biespecífico ou outro contendo Fc molécula (por exemplo, e imunoglobulina). Em outra modalidade, a in- venção abrange regiões Fc variantes compreendendo combinações de modificações de aminoácidos conhecidas na técnica e regiões IgG se- lecionadas que exibem novas propriedades, propriedades essas que não foram detectáveis quando as modificações e/ou regiões foram in- dependentemente testadas como aqui descrito.
[00292] Em algumas modalidades, o primeiro domínio de promoção de heterodímero e o segundo domínio de promoção de heterodímero compreendem, cada um, uma região Fc que compreende um domínio CH2 e um domínio CH3, caracterizado pelo fato de que a sequência de aminoácidos de cada um do domínio CH2 e/ou o CH3 compreende em pelo menos uma modificação de aminoácido em comparação com a re- gião Fc de tipo selvagem, para formar uma protuberância ou um buraco.
[00293] Em algumas modalidades, o primeiro domínio de promoção de heterodímero e o segundo domínio de promoção de heterodímero compreendem, cada um, um domínio CH2 e um domínio CH3, caracte- rizado pelo fato de que a sequência de aminoácidos de cada um dos domínios CH2 e/ou cada um dos domínios CH3 é modificado para con- duzir a heterodimerização e/ou estabilizar o anticorpo biespecífico
[00294] Em algumas modalidades semelhantes, os anticorpos bies- pecíficos da presente invenção compreendem um primeiro domínio de promoção de heterodímero na primeira cadeia de polipeptídeo e um se- gundo domínio de promoção de heterodímero na segunda cadeia poli- peptídica. Tomados em conjunto, o primeiro e o segundo domínios pro- motores de heterodímero conduzem a heterodimerização e/ou estabili- zam o anticorpo biespecífico (por exemplo, pela interação de uma pro- tuberância e um buraco em domínios promotores de heterodímero com- plementares) e/ou servem para estabilizar o anticorpo biespecífico.
[00295] Em algumas modalidades, o primeiro domínio de promoção de heterodímero e o segundo domínio de promoção de heterodímero não são botões ou ambos os buracos; e/ou em que o primeiro domínio de promoção de heterodímero e o segundo domínio de promoção de heterodímero formam uma região Fc de imunoglobulina IgG.
[00296] Em algumas modalidades, o primeiro domínio de promoção de heterodímero pode compreender uma cadeia Fc com um domínio CH2 e/ou CH3 modificado para compreender uma protuberância (protu- berância) ou um buraco (cavidade). Em algumas de tais modalidades, a sequência de aminoácidos do domínio CH2 e/ou o domínio CH3 com- preende pelo menos uma modificação de aminoácido, caracterizado pelo fato de que: (a) o domínio CH3 do primeiro domínio promotor de heterodímero forma uma protuberância; e (b) o domínio CH3 do se- gundo domínio de promoção de heterodímero forma um buraco. Em ou- tra tal modalidade, o domínio CH3 do primeiro domínio de promoção de heterodímero compreende as mutações Y349C e/ou T366W, para for- mar uma protuberância; e o domínio CH3 do segundo domínio de pro- moção de heterodímero compreende as mutações S354C, T366S, L368A e/ou Y407V, para formar um buraco, (numeração de acordo com o índice EU). Em algumas modalidades específicas, as mutações levam a uma função efetora reduzida.
[00297] Em algumas modalidades, o primeiro domínio de promoção de heterodímero pode compreender um domínio CH2 e/ou CH3 modifi- cado para compreender uma protuberância (protuberância) compreen- dendo uma sequência de SEQ ID NO: 188, se o segundo domínio de promoção de heterodímero compreender um domínio CH2 e/ou CH3 modificado para compreender um buraco (cavidade). Em outra modali- dade, o primeiro domínio de promoção de heterodímero pode compre- ender um buraco (cavidade), se o segundo domínio de promoção de heterodímero compreender um domínio CH2 e/ou CH3 modificado para compreender uma protuberância (protuberância). Em uma modalidade particular de cada uma das anteriores, o primeiro domínio de promoção de heterodímero compreende uma sequência de SEQ ID NO: 188, para formar uma protuberância; e em que o segundo domínio de promoção de heterodímero compreende uma sequência da SEQ ID NO: 189, para formar um buraco. A Tabela 7 fornece as sequências de aminoácidos para as cadeias Fc de protuberância e buraco e as primeiras cadeias de polipeptídeo e as segundas cadeias de polipeptídeo dos anticorpos bi- específicos GUCY2c com os vários anticorpos GUCY2c e CD3 aqui des- critos (SEQ ID NOs: 196, 197, 199, 200, 202, 203, 205, 206, 210, 211, 216, 217, 219.220, 248, 249, 282, 283, 284, 285, 286 e 287). Tabela 7 Cadeia Fc de protuberância APEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAK- (SEQ ID NO: 188) TKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSREEMTKNQVSLWCL
VKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG Cadeia Fc de buraco APEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAK- (SEQ ID NO: 189) TKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCREEMTKNQVSLSCA
VKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG GUCY2C-0074_Protu- DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVDNYGISFMNWFQQKPGQPPKLLI- berância YAASNPGSGVPARFSGSGSGTDFSLNIHPLEEDDTAMFFCQQSKEVPYTFGGGTKLEIKGGGSGGGGEVQLVESGGGL (SEQ ID NO: 196) VQPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMTWVRQAPGKGLEWVAFIRNRAR-
GYTSDHNPSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRPSYYVLDYWGQGTTVTVSSGCPPCPAPEAAGA PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAK- TKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSREEMTKNQVSLWCL
VKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG GUCY2C-0074_buraco DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLFNVRSRKNYL- (SEQ ID NO: 197) AWYQQKPGQPPKLLISWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCKQSYDLFTFGSGTKLEIKGGGSGG GGEVQLQQSGAELARPGASVNLSCKASGYTFTTYWMQWVKQRPGQGLEWIGAIYPGDGMTTY-
TQKFKDKATLTADKSSSTAYMQLSSLASEDSAVYYCVRKGMDYWGQGTSVTVSSGCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPK DTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAK- TKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCREEMTKNQVSLSCA
VKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG GUCY2C-0098_Protu- DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVDYYGTSLMQWYQQKPGQPPKLLIYAASN- berância VESGVPARFSGSGSGTDFSLNIHPVEEDDIAMYFCQQTRKVYTFGGGTKLEIKGGGSGGGGEVQLVESGGGLVQPGGSL (SEQ ID NO: 199) RLSCAASGFTFSDYYMTWVRQAPGKGLEWVAFIRNRARGYTSDHNPSVKGRFTISRDNAK-
NSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRPSYYVLDYWGQGTTVTVSSGCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVT CVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCK- VSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDG
SFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG GUCY2C-0098_Buraco DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLFNVRSRKNYL- (SEQ ID NO: 200) AWYQQKPGQPPKLLISWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCKQSYDLFTFGSGTKLEIKGGGSGG GGQVQLQQPGAELVKPGASVKLSCKASGYTFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGEIKPSNGLT-
NYIEKFKNKATLTVDKSATTAYMQLSSLTAEDSAVYYCTRTITTTEGYWFFDVWGAGTTVTVSSGCPPCPAPEAAGAPSV FLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAK- TKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCREEMTKNQVSLSCA
VKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG GUCY2C-0105_Protu- DIVMTQSPSSLAVSVGEKVTVSCKSSQSLLYSSNQKNYLAWYQQRPGQSPKLLI- berância YWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLSISSVKAEDLAVYYCQQYYSYPTFGGGTKLEIKGGGSGGGGEVQLVESGGGLV (SEQ ID NO: 202) QPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMTWVRQAPGKGLEWVAFIRNRAR-
GYTSDHNPSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRPSYYVLDYWGQGTTVTVSSGCPPCPAPEAAGA PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAK- TKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSREEMTKNQVSLWCL
VKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG GUCY2C-0105_Buraco DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLFNVRSRKNYL- (SEQ ID NO: 203) AWYQQKPGQPPKLLISWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCKQSYDLFTFGSGTKLEIKGGGSGG GGEVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYSFTDYIMLWVKQSH-
GKSLEWIGNSNPYYGSTSYNLKFKGKATLTVDKSSSTAYMHLNSLTSEDSAVYYCARSGYYGSSPYWYFDVWGAGTTVT VSSGCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWY- VDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCREE MTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGS-
FFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG GUCY2C-0240_Protu- DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDNYGISFMNWFQQKPGKAPKLLI- berância YAASNPGSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSKEVPYTFGQGTKLEIKGGGSGGGGEVQLVESGGGLV (SEQ ID NO: 205) QPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMTWVRQAPGKGLEWVAFIRNRAR-
GYTSDHNPSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRPSYYVLDYWGQGTTVTVSSGCPPCPAPEAAGA PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAK- TKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSREEMTKNQVSLWCL
VKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG GUCY2C-0240_Buraco DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLFNVRSRKNYL- (SEQ ID NO: 206) AWYQQKPGQPPKLLISWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCKQSYDLFTFGSGTKLEIKGGGSGG GGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTTYWMQWVRQAPGKGLEWIGAIYPGDGMTTY-
TQKFKDRFTISADKAKNSAYLQMNSLRAEDTAVYYCVRKGMDYWGQGTLVTVSSGCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKD TLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAK- TKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCREEMTKNQVSLSCA
VKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG GUCY2C-0247_Protu- DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDYYGTSLMQWYQQKPGKPPKLLIYAASN- berância VESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTRKVYTFGQGTKLEIKGGGSGGGGEVQLVESGGGLVQPGGSL (SEQ ID NO: 210) RLSCAASGFTFSDYYMTWVRQAPGKGLEWVAFIRNRARGYTSDHNPSVKGRFTISRDNAK-
NSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRPSYYVLDYWGQGTTVTVSSGCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVT CVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCK- VSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDG
SFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG GUCY2C-0247_Buraco DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLFNVRSRKNYL- (SEQ ID NO: 211) AWYQQKPGQPPKLLISWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCKQSYDLFTFGSGTKLEIKGGGSGG GGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYWMHWVRQAPGKGLEWIGEIKPSNGLT-
NYIEKFKNRFTISVDKAKNSAYLQMNSLRAEDTAVYYCTRTITTTEGYWFFDVWGQGTLVTVSSGCPPCPAPEAAGAPSV FLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAK- TKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCREEMTKNQVSLSCA
VKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG GUCY2C-1478_Protu- DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDYYGSSLLQWYQQKPGKAPKLLIYAASKLAS- berância; GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTRKAYTFGQGTKLEIKGGGSGGGGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLS GUCY2C-1608_Protu- CAASGFTFSDYYMTWVRQAPGKGLEWVAFIRNQARGYTSDHNPSVKGRFTISRDNAKNSLY- berância LQMNSLRAEDTAVYYCARDRPSYYVLDYWGQGTTVTVSSGCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVV (SEQ ID NO: 216) DVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCK-
VSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDG
SFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG GUCY2C-1478_Buraco DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCTSSQSLFNVRSQKNYLAWYQQKPGKAPKLLI- (SEQ ID NO: 217) YWASTRESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCKQSYDLFTFGGGTKVEIKGGGGSGGGGEVQLVESGGGLV QPGGSLRLSCAASGYTFTSYWMHWVRQAPGKGLEWIGEIKPSNGLTNVHEKFKNRFTIS-
VDKAKNSAYLQMNSLRAEDTAVYYCTRTITTTEGYWFFDVWGQGTLVTVSSGCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMI SRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAK- TKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCREEMTKNQVSLSCA
VKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG GUCY2C-1608_Buraco DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCTSSQSLFNVRSQKNYLAWYQQKPGKAPKLLI- (SEQ ID NO: 220) YWASTRESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCKQSYDLFTFGGGTKVEIKGGGGSGGGGEVQLVESGGGLV QPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMHWVRQAPGKGLEWIGEIKPSNELTNVHEKFKDRFTIS-
VDKAKNSAYLQMNSLRAEDTAVYYCTRTITTTEGYWFFDVWGQGTLVTVSSGCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMI SRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAK- TKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCREEMTKNQVSLSCA
VKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG GUCY2C-0250_Protu- DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDYYGTSLMQWYQQKPGKAPKLLIYAASN- berância VESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTRKVYTFGQGTKLEIKGGGSGGGGEVQLVESGGGLVQPGGSL (SEQ ID NO: 248 RLSCAASGFTFSDYYMTWVRQAPGKGLEWVAFIRNRARGYTSDHNPSVKGRFTISRDNAK-
NSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRPSYYVLDYWGQGTTVTVSSGCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVT CVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCK- VSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDG
SFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG GUCY2C-0250_Buraco DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCTSSQSLFNVRSRKNYLAWYQQKPGKAPKLLI- (SEQ ID NO: 249 YWASTRESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCKQSYDLFTFGGGTKVEIKGGGSGGGGEVQLVESGGGLVQ PGGSLRLSCAASGYTFTSYWMHWVRQAPGKGLEWIGEIKPSNGLTNYIEKFKNRFTIS-
VDKAKNSAYLQMNSLRAEDTAVYYCTRTITTTEGYWFFDVWGQGTLVTVSSGCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMI SRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAK- TKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCREEMTKNQVSLSCA VKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDYYGSSLLQWYQQKPGKAPKLLIYAASKLAS-
GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTRKAYTFGQGTKLEIKGGGSGGGGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLS GUCY2C-1678_Protu- CAASGFTFSDYYMTWVRQAPGKGLEWVAFIRNQARGYTSDHNPSVKGRFTISRDNAKNSLY- berância
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VKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDYYGSSLLQWYQQKPGKAPKLLIYAASKLAS- GUCY2C-1679_Protu- GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTRKAYTFGQGTKLEIKGGGSGGGGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLS berância CAASGFTFSDYYMTWVRQAPGKGLEWVAFIRNQARGYTSDHNPSVKGRFTISRDNAKNSLY-
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VSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDG
SFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG GUCY2C-1679_Buraco DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCTSSQSLFNVRSGKNYLAWYQQKPGKAPKLLIYWAS-
DRESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCKQSYDLFTFGGGTKVEIKGGGGSGGGGEVQLVESGGGLVQPG (SEQ ID NO: 285) GSLRLSCAASGFTFSSYWMHWVRQAPGKGLEWIGEIKPSNELTNVHEKFKDRFTIS-
VDKAKNSAYLQMNSLRAEDTAVYYCTRTITTTEGYWFFDVWGQGTLVTVSSGCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMI SRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAK- TKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCREEMTKNQVSLSCA
VKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG GUCY2C-1680_Protu- DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDYYGSSLLQWYQQKPGKAPKLLIYAASKLAS- berância GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTRKAYTFGQGTKLEIKGGGSGGGGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLS (SEQ ID NO: 286) CAASGFTFSDYYMTWVRQAPGKGLEWVAFIRNQARGYTSDHNPSVKGRFTISRDNAKNSLY-
LQMNSLRAEDTAVYYCARDRPSYYVLDYWGQGTTVTVSSGCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVV DVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCK- VSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDG
SFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG GUCY2C-1680_Buraco DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCTSSESLFNVRSGKNYLAWYQQKPGKAPKLLIYWAS- (SEQ ID NO: 287) DRESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCKQSYDLFTFGGGTKVEIKGGGGSGGGGEVQLVESGGGLVQPG GSLRLSCAASGFTFSSYWMHWVRQAPGKGLEWIGEIKPSNELTNVHEKFKDRFTIS-
VDKAKNSAYLQMNSLRAEDTAVYYCTRTITTTEGYWFFDVWGQGTLVTVSSGCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMI SRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAK- TKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCREEMTKNQVSLSCA VKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
[00298] Uma maneira de determinar a afinidade de ligação de anti- corpos a GUCY2c ou CD3 é medindo a afinidade de ligação de frag- mentos Fab monofuncionais do anticorpo. Para obter fragmentos Fab monofuncionais, um anticorpo (por exemplo, IgG) pode ser clivado com papaína ou expresso de forma recombinante. A afinidade de um frag- mento Fab GUCY2c de um anticorpo pode ser determinada por resso- nância plasmônica de superfície (sistema de ressonância plasmônica de superfície (SPR) BIACORE™ 3000™, BIACORE ™, INC, Piscataway NJ) equipado com chips sensores de estreptavidina pré-imobilizados (SA) ou Fc anti-camundongo ou Fc anti-humano utilizando tampão de execução HBS-EP (HEPES 0,01 M, pH 7,4, NaCl 0,15 M, EDTA 3 mM,
Tensoativo P20 0,005% v/v). GUCY2c humano de fusão biotinilado ou Fc pode ser diluído em tampão HBS-EP a uma concentração de menos de 0,5 μg/mL e injetado através dos canais de chip individuais usando tempos de contato variáveis, para obter duas faixas de densidade de antígeno, tanto 50 a 200 unidades de resposta (RU) para estudos ciné- ticos detalhados ou 800 a 1.000 RU para ensaios de avaliação. Estudos de regeneração demonstraram que NaOH a 25 mM em etanol 25% v/v remove eficazmente o Fab ligado, ao mesmo tempo em que mantêm a atividade de GUCY2c no chip por mais de 200 injeções. Normalmente, diluições em série (abrangendo concentrações de 0,1 a 10x KD esti- mado) de amostras de Fab purificadas são injetadas por 1 min a 100 μL/minuto e tempos de dissociação de até 2 horas são permitidos. As concentrações das proteínas Fab são determinadas por ELISA e/ou ele- troforese SDS-PAGE usando um Fab de concentração conhecida (con- forme determinado por análise de aminoácidos) como padrão. As taxas de associação cinética (kon) e as taxas de dissociação (koff) são obtidas simultaneamente ajustando os dados globalmente a um modelo de liga- ção Langmuir 1:1 (Karlsson, R. Roos, H. Fagerstam, L. Petersson, B., Methods Enzymology 6. 99-110, 1994) usando o programa BIAevalua- tion. Os valores da constante de dissociação de equilíbrio (KD) são cal- culados como koff/kon. Este protocolo é adequado para uso na determi- nação da afinidade de ligação de um anticorpo a qualquer GUCY2c, in- cluindo GUCY2c humano, GUCY2c de outro mamífero (como GUCY2c de camundongo, GUCY2c de rato, ou GUCY2c de primata), bem como diferentes formas de GUCY2c (por exemplo, GUCY2c glicosilado). A afi- nidade de ligação de um anticorpo é geralmente medida a 25°C, mas também pode ser medida a 37°C.
[00299] Os anticorpos aqui descritos podem ser produzidos por qual- quer método conhecido na técnica. Para a produção de linhagens de células de hibridoma, a via e cronograma de imunização do animal hos- pedeiro estão geralmente de acordo com as técnicas estabelecidas e convencionais para estimulação e produção de anticorpos, conforme descrito adicionalmente aqui. As técnicas gerais para a produção de an- ticorpos humanos e de camundongo são conhecidas na técnica e ou são aqui descritas.
[00300] É contemplado que qualquer indivíduo mamífero, incluindo humanos ou células produtoras de anticorpos dos mesmos, possa ser manipulado para servir como a base para a produção de linhagens de células mamíferas, incluindo humanas e de hibridoma. Tipicamente, o animal hospedeiro é inoculado intraperitonealmente, intramuscular- mente, oralmente, subcutaneamente, intraplantar e/ou intradermica- mente com uma quantidade de imunógeno, incluindo como aqui des- crito.
[00301] Os hibridomas podem ser preparados dos linfócitos e células de mieloma imortalizadas usando a técnica geral de hibridização de cé- lulas somáticas de Kohler, B. e Milstein, C., Nature 256: 495-497, 1975 ou como modificado por Buck, DW, et al., In vitro, 18: 377-381, 1982. As linhagens de mieloma disponíveis, incluindo mas não se limitando a X63-Ag8.653 e aquelas do Salk Institute, Cell Distribution Center, San Diego, Calif., EUA, podem ser utilizadas na hibridação. Geralmente, a técnica envolve a fusão de células de mieloma e células linfóides usando um fusogênio, tal como polietilenoglicol, ou por meios elétricos bem conhecidos pelos versados na técnica. Após a fusão, as células são separadas do meio de fusão e cultivadas em um meio de cresci- mento seletivo, como meio de hipoxantina-aminopterina-timidina (HAT), para eliminar as células parentais não hibridizadas. Qualquer um dos meios aqui descritos, suplementado com ou sem soro, pode ser usado para a cultura de hibridomas que secretam anticorpos monoclonais.
Como outra alternativa à técnica de fusão celular, células B imortaliza- das por EBV podem ser usadas para produzir os anticorpos monoclo- nais da presente invenção. Os hibridomas são expandidos e subclona- dos, se desejado, e os sobrenadantes são testados quanto à atividade anti-imunogênica por procedimentos de imunoensaio convencionais (por exemplo, radioimunoensaio, imunoensaio enzimático, ou imunoen- saio de fluorescência).
[00302] Os hibridomas que podem ser usados como fonte de anticor- pos abrangem todos os derivados, células descendentes dos hibrido- mas parentais que produzem anticorpos monoclonais específicos para GUCY2c, CD3 ou porções dos mesmos.
[00303] Os hibridomas que produzem tais anticorpos podem ser cul- tivados in vitro ou in vivo usando procedimentos conhecidos. Os anticor- pos monoclonais podem ser isolados do meio de cultura ou fluidos cor- porais, por procedimentos convencionais de purificação de imunoglobu- lina, como precipitação com sulfato de amônio, eletroforese em gel, di- álise, cromatografia e ultrafiltração, se desejado. A atividade indesejada, se presente, pode ser removida, por exemplo, executando a preparação sobre os adsorventes feitos do imunógeno ligado a uma fase sólida e eluindo ou liberando os anticorpos desejados do imunógeno. Imuniza- ção de um animal hospedeiro com um GUCY2c ou CD3 humano, ou um fragmento contendo a sequência de aminoácido alvo conjugado a uma proteína que é imunogênica na espécie a ser imunizada, por exemplo, hemocianina de lapa de buraco de fechadura, albumina sérica, tireoglo- bulina bovina, inibidor de tripsina de soja usando um agente bifuncional ou derivatizante, por exemplo, éster maleimidobenzoil sulfosuccinimida (conjugação através de resíduos de cisteína), N-hidroxissuccinimida (através de resíduos de lisina), glutaraldeído, anidrido succínico, SOCl2, ou R1N = C = NR, onde R e R1 são diferentes grupos alquil, podem produzir uma população de anticorpos (por exemplo, anticorpos mono- clonais).
[00304] Se desejado, o anticorpo (monoclonal ou policlonal) de inte- resse pode ser sequenciado e a sequência de polinucleotídeo pode en- tão ser clonada em um vetor para expressão ou propagação. A sequên- cia que codifica o anticorpo de interesse pode ser mantida em vetor em uma célula hospedeira e a célula hospedeira pode então ser expandida e congelada para uso futuro. A produção de anticorpos monoclonais re- combinantes em cultura de células pode ser realizada através da clona- gem de genes de anticorpos a partir de células B por meios conhecidos na técnica. Veja, por exemplo, Tiller et al., J. Immunol. Methods, 329, 112, 2008; Patente Norte-americana No. 7.314.622.
[00305] Em alternativa, a sequência de polinucleotídeos pode ser uti- lizada para manipulação genética para humanizar o anticorpo ou para melhorar a afinidade, ou outras características do anticorpo. Por exem- plo, a região constante pode ser modificada para se assemelhar mais às regiões constantes humanas para evitar a resposta imune se o anti- corpo for usado em ensaios clínicos e tratamentos em humanos. Pode ser desejável manipular geneticamente a sequência de anticorpos para obter maior afinidade para GUCY2c ou CD3 e maior eficácia na inibição de GUCY2c.
[00306] Existem quatro etapas gerais para humanizar um anticorpo monoclonal. São elas: (1) determinar o nucleotídeo e a sequência de aminoácidos prevista das regiões variáveis leves e pesadas do anti- corpo inicial (2) designar o anticorpo humanizado, isto é, decidir qual região da estrutura do anticorpo usar durante o processo de humaniza- ção (3) as técnnicas/metodologias de humanização real (4) a transfec- ção e expressão do anticorpo humanizado. Veja, por exemplo, Patentes Norte-americanas Nos. 4.816.567; 5.807.715; 5.866.692; 6.331.415;
5.530.101; 5.693.761; 5.693.762; 5.585.089; e 6.180.370.
[00307] Várias moléculas de anticorpo humanizado compreendendo um local de ligação ao antígeno derivado de uma imunoglobulina não humana foram descritas, incluindo anticorpos quiméricos com regiões V de roedores ou de roedores modificados e seus CDRs associados fun- didos a regiões constantes humanas. Veja, por exemplo, Winter et al. Nature 349: 293-299, 1991, Lobuglio et al. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 86: 4220-4224, 1989, Shaw et al. J Immunol. 138: 4534-4538, 1987 e Brown et al. Cancer Res. 47: 3577-3583, 1987. Outras referências des- crevem CDRs de roedores enxertados em uma região estrutural de su- porte humano (FR) antes da fusão com uma região constante de anti- corpo humano apropriada. Veja, por exemplo, Riechmann et al. Nature 332: 323-327, 1988, Verhoeyen et al. Science 239: 1534-1536, 1988 e Jones et al. Nature 321: 522-525, 1986. Outra referência descreve CDRs de roedores suportados por regiões estruturais de roedores mo- dificadas de forma recombinante. Veja, por exemplo, Publicação Euro- peia No. EP0519596. Essas moléculas "humanizadas" são designadas para minimizar a resposta imunológica indesejada em relação às molé- culas de anticorpos anti-humanos de roedores, o que limita a duração e a eficácia das aplicações terapêuticas dessas porções em receptores humanos. Por exemplo, a região constante do anticorpo pode ser modi- ficada de modo que seja imunologicamente inerte (por exemplo, não desencadeia a lise do complemento). Veja, por exemplo, Pedido PCT Nº PCT/GB99/01441; Pedido de UK No. 9809951.8. Outros métodos de humanização de anticorpos que também podem ser utilizados são di- vulgados por Daugherty et al., Nucl. Acids Res. 19: 2471-2476, 1991, e nas Patentes Norte-americanas Nos. 6.180.377; 6.054.297; 5.997.867;
5.866.692; 6.210.671; e 6.350.861; e na Publicação PCT Nº WO 01/27160.
[00308] Os princípios gerais relacionados aos anticorpos humaniza-
dos descritos acima são também aplicáveis à personalização de anti- corpos para uso, por exemplo, em cães, gatos, primatas, equinos e bo- vinos. Além disso, um ou mais aspectos de humanização de um anti- corpo aqui descrito podem ser combinados, por exemplo, enxerto de CDR, mutação de estrutura e mutação de CDR.
[00309] Em uma variação, anticorpos totalmente humanos podem ser obtidos usando camundongos disponíveis comercialmente que fo- ram modificados para expressar proteínas de imunoglobulina humana específicas. Animais transgênicos que são designados para produzir uma resposta imune mais desejável (por exemplo, anticorpos totalmente humanos) ou mais robusta também podem ser usados para geração de anticorpos humanizados ou humanos. Exemplos de tal tecnologia são Xenomouse™ da Abgenix, Inc. (Fremont, CA) e HuMAb-Mouse® e TC Mouse™ de Medarex, Inc. (Princeton, NJ).
[00310] Em uma alternativa, os anticorpos podem ser produzidos de forma recombinante e expressos utilizando qualquer método conhecido na técnica. Em outra alternativa, os anticorpos podem ser produzidos de forma recombinante por tecnologia de exibição de fago. Veja, por exemplo, Patentes Norte-americanas Nos. 5.565.332; 5.580.717; 5,733,743; e 6.265.150; e Winter et al., Annu. Rev. Immunol. 12: 433- 455, 1994. Alternativamente, a tecnologia de exibição de fago (McCaf- ferty et al., Nature 348: 552-553, 1990) pode ser usada para produzir anticorpos humanos e fragmentos de anticorpos in vitro, a partir de re- pertórios de gene de domínio variável (V) de imunoglobulina de doado- res não imunizados. De acordo com esta técnica, os genes do domínio V do anticorpo são clonados em estrutura qualquer de um gene de pro- teína de revestimento maior ou menor de um bacteriofago filamentoso, como M13 ou fd, e exibidos como fragmentos de anticorpos funcionais na superfície da partícula de fago. Uma vez que a partícula filamentosa contém uma cópia de DNA de fita simples do genoma de fago, as sele- ções com base nas propriedades funcionais do anticorpo também resul- tam na seleção do gene que codifica o anticorpo que exibe essas pro- priedades.
Desse modo, o fago imita algumas das propriedades da cé- lula B.
A exibição de fago pode ser executada em uma variedade de formatos; para revisão veja, por exemplo, Johnson, Kevin S. e Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3: 564-571, 1993. Várias fontes de segmentos de gene V podem ser usadas para exibição de fago.
Clackson et al., Nature 352: 624-628, 1991, isolaram uma série diversa de anticorpos anti-oxazolona de uma pequena biblioteca combi- natória aleatória de genes V derivados de baços de camundongos imu- nizados.
Um repertório de genes V de doadores humanos não imuniza- dos pode ser construído e anticorpos para uma variedade de antígenos (incluindo autoantígenos) podem ser isolados essencialmente seguindo as técnicas descritas por Mark et al., J.
Mol.
Biol. 222: 581-597, 1991, ou Griffith et al., EMBO J. 12: 725-734, 1993. Numa resposta imunitária natural, os genes do anticorpo acumulam mutações a uma taxa elevada (hipermutação somática). Algumas das alterações introduzidas irão con- ferir maior afinidade, e as células B exibindo imunoglobulina de superfí- cie de alta afinidade são preferencialmente replicadas e diferenciadas durante o desafio subsequente com antígeno.
Este processo natural pode ser imitado empregando-se a técnica conhecida como "baralha- mento de cadeia" (Marks et al., Bio/Technol. 10: 779-783, 1992). Neste método, a afinidade de anticorpos humanos "primários" obtidos por exi- bição de fago pode ser melhorada substituindo sequencialmente os ge- nes da região V da cadeia pesada e leve por repertórios de variantes de ocorrência natural (repertórios) de genes do domínio V obtidos de doa- dores não imunizados.
Esta técnica permite a produção de anticorpos e fragmentos de anticorpos com afinidades na faixa de pM-nM.
Uma es-
tratégia para fazer repertórios de anticorpos de fago muito grandes (tam- bém conhecidos como "as bibliotecas mãe-de-todas") foi descrita por Waterhouse et al., Nucl. Acids Res. 21: 2265-2266, 1993. O baralha- mento de genes também pode ser usado para derivar anticorpos huma- nos de anticorpos de roedores, onde o anticorpo humano tem afinidades e especificidades semelhantes ao anticorpo de roedor de partida. De acordo com este método, também conhecido como “impressão de epi- topo”, o gene do domínio V da cadeia pesada ou leve de anticorpos de roedores obtido pela técnica de exibição de fago é substituído por um repertório de genes do domínio V humano, criando quimeras roedor- humano. A seleção no antígeno resulta no isolamento de regiões variá- veis humanas capazes de restaurar um sítio de ligação do antígeno fun- cional, isto é, o epitopo governa (imprime) a escolha de parceiro. Quando o processo é repetido para substituir o domínio V de roedor remanescente, um anticorpo humano é obtido (veja a Publicação PCT Nº WO 93/06213). Ao contrário da humanização tradicional de anticor- pos de roedores por enxerto de CDR, esta técnica fornece anticorpos totalmente humanos, que não possuem nenhuma estrutura ou resíduos de CDR de origem de roedor.
[00311] Os anticorpos podem ser produzidos de forma recombinante isolando primeiro os anticorpos e células produtoras de anticorpos de animais hospedeiros, obtendo a sequência de gene, e usando a sequên- cia de gene para expressar o anticorpo de forma recombinante em cé- lulas hospedeiras (por exemplo, células CHO). Outro método que pode ser empregado é expressar a sequência de anticorpos em plantas (por exemplo, tabaco) ou leite transgênico. Métodos para expressar anticor- pos de forma recombinante em plantas ou leite foram descritos. Veja, por exemplo, Peeters, et al. Vaccine 19: 2756, 2001; Lonberg, N. e D. Huszar Int. Rev. Immunol 13:65, 1995; e Pollock, et al., J Immunol Me- thods 231: 147, 1999. Os métodos para preparação de derivados de anticorpos, por exemplo, humanizados, de cadeia única, etc., são co- nhecidos na técnica.
[00312] Imunoensaios e técnicas de classificação de citometria de fluxo, tal como classificação de células ativadas por fluorescência (FACS), também podem ser empregados para isolar anticorpos que são específicos para GUCY2c, CD3, ou antígenos de interesse.
[00313] Os anticorpos aqui descritos podem ser ligados a muitos di- ferentes suportes ou transportadores de fase sólida. Tais suportes po- dem ser ativos e/ou inertes. Os suportes bem conhecidos incluem poli- propileno, poliestireno, polietileno, dextrano, nylon, amilases, vidro, ce- luloses naturais e modificadas, poliacrilamidas, agaroses e magnetita. A natureza do suporte pode ser solúvel ou insolúvel para os propósitos da invenção. Aqueles versados na técnica conhecerão outros suportes adequados para ligação de anticorpos, ou serão capazes de verificá-los, usando experimentação de rotina. Em algumas modalidades, o suporte compreende uma porção que tem como alvo o miocárdio.
[00314] O DNA que codifica os anticorpos monoclonais é pronta- mente isolado e sequenciado usando procedimentos convencionais (por exemplo, usando sondas oligonucleotídicas que são capazes de se ligar especificamente a genes que codificam as cadeias pesada e leve dos anticorpos monoclonais). As células de hibridoma servem como fonte preferida de tal DNA. Uma vez isolado, o DNA pode ser colocado em vetores de expressão (tais como vetores de expressão descritos na Pu- blicação PCT No. WO 87/04462), que são então transfectados em célu- las hospedeiras, tais como células de E. coli, células COS de símio, cé- lulas CHO ou células de mieloma que de outra forma não produzem a proteína imunoglobulina, para obter a síntese de anticorpos monoclo- nais nas células hospedeiras recombinantes. Veja, por exemplo, Publi- cação PCT Nº WO 87/04462. O DNA também pode ser modificado, por exemplo, substituindo a sequência de codificação para as regiões cons- tantes de cadeia pesada e leve humana em lugar das sequências muri- nas homólogas, Morrison et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 81: 6851, 1984, ou por ligação covalente à sequência de codificação da imunoglobulina de toda ou parte da sequência de codificação para um polipeptídeo não imunoglobulina. Desse modo, anticorpos "quiméricos" ou "híbridos" são preparados que têm a especificidade de ligação de um anticorpo mono- clonal aqui.
[00315] O GUCY2c, CD3, ou outros anticorpos de antígeno como aqui descritos podem ser identificados ou caracterizados usando méto- dos conhecidos na técnica, caracterizado pelo fato de que a redução de GUCY2c, CD3 ou outros níveis de expressão de antígeno são detecta- dos e/ou medidos. Em algumas modalidades, um anticorpo GUCY2c é identificado incubando um agente candidato com GUCY2c e monito- rando a ligação e/ou redução associada dos níveis de expressão de GUCY2c. O ensaio de ligação pode ser realizado com polipeptídeo(s) GUCY2c purificado, ou com células que expressam naturalmente, ou transfectadas para expressar, polipeptídeo(s) GUCY2c. Em uma moda- lidade, o ensaio de ligação é um ensaio de ligação competitivo, onde a capacidade de um anticorpo candidato para competir com um anticorpo GUCY2c conhecido para ligação de GUCY2c é avaliada. O ensaio pode ser realizado em vários formatos, incluindo o formato ELISA.
[00316] Após a identificação inicial, a atividade de um candidato GUCY2c, CD3 ou outro anticorpo antígeno pode ser posteriormente confirmada e refinada por bioensaios, conhecidos para testar as ativida- des biológicas direcionadas. Alternativamente, bioensaios podem ser usados para selecionar candidatos diretamente. Alguns dos métodos para identificar e caracterizar anticorpos são descritos em detalhes nos Exemplos.
[00317] GUCY2c, CD3 ou outros anticorpos de antígeno podem ser caracterizados usando métodos bem conhecidos na técnica. Por exem- plo, um método é identificar o epitopo ao qual se liga, ou mapeamento do epitopo. Existem muitos métodos conhecidos na técnica para mapear e caracterizar a localização de epitopos em proteínas, incluindo resolver a estrutura cristalina de um complexo anticorpo-antígeno, ensaios de competição, ensaios de expressão de fragmentos de genes e ensaios com base em peptídeos sintéticos, conforme descrito, por exemplo, no Capítulo 11 de Harlow e Lane, Using Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nova York,
1999. Em um exemplo adicional, o mapeamento de epitopo pode ser usado para determinar a sequência à qual um anticorpo liga-se. O ma- peamento de epitopos está disponível comercialmente em várias fontes, por exemplo, Pepscan Systems (Edelhertweg 15, 8219 PH Lelystad, Ho- landa). O epitopo pode ser um epitopo linear, isto é, contido em um único trecho de aminoácidos, ou um epitopo conformacional formado por uma interação tridimensional de aminoácidos que podem não estar necessa- riamente contidos em um único trecho. Peptídeos de comprimentos va- riados (por exemplo, pelo menos 4-6 aminoácidos de comprimento) po- dem ser isolados ou sintetizados (por exemplo, de forma recombinante) e usados para ensaios de ligação com um GUCY2c, CD3 ou outro anti- corpo antígeno. Em outro exemplo, o epitopo ao qual o GUCY2c, CD3 ou outro anticorpo antígeno se liga pode ser determinado em uma tria- gem sistemática usando peptídeos sobrepostos derivados de GUCY2c, CD3, ou outra sequência de antígeno e determinando a ligação por GUCY2c, CD3, ou outro anticorpo antígeno. De acordo com os ensaios de expressão de fragmentos gênicos, o quadro de leitura aberta que codifica GUCY2c, CD3 ou outro antígeno é fragmentado aleatoriamente ou por construções genéticas específicas e a reatividade dos fragmen- tos expressos de GUCY2c, CD3 ou outro antígeno com o anticorpo a ser testado são determinados. Os fragmentos de genes podem, por exemplo, ser produzidos por PCR e depois transcritos e traduzidos em proteína in vitro, na presença de aminoácidos radioativos. A ligação do anticorpo ao GUCY2c, CD3 ou outros fragmentos de antígeno marcados radioativamente é então determinada por imunoprecipitação e eletrofo- rese em gel. Certos epitopos também podem ser identificados usando grandes bibliotecas de sequências peptídicas aleatórias exibidas na su- perfície de partículas de fago (bibliotecas de fago). Alternativamente, uma biblioteca definida de fragmentos de peptídeos sobrepostos pode ser testada para ligação ao anticorpo de teste em ensaios de ligação simples. Em um exemplo adicional, a mutagênese de um domínio de ligação ao antígeno, experimentos de troca de domínio e mutagênese de varredura de alanina podem ser realizados para identificar os resí- duos necessários, suficientes, e/ou necessários para a ligação ao epi- topo. Por exemplo, experimentos de troca de domínio podem ser reali- zados usando um mutante GUCY2c, CD3, ou outro antígeno no qual vários fragmentos da GUCY2c, CD3, ou outra proteína de antígeno fo- ram substituídos (trocados) por sequências de GUCY2c de outra espé- cie (por exemplo, rato), ou uma proteína intimamente relacionada, mas antigenicamente distinta (por exemplo, Trop-1). Ao avaliar a ligação do anticorpo ao mutante GUCY2c, CD3 ou outro antígeno, pode ser avali- ada a importância do GUCY2c, CD3 ou outro fragmento de antígeno específico para a ligação do anticorpo.
[00318] Ainda outro método que pode ser usado para caracterizar um GUCY2c, CD3 ou outro anticorpo antígeno é usando ensaios de com- petição com outros anticorpos conhecidos por se ligarem ao mesmo an- tígeno, isto é, vários fragmentos em GUCY2c, CD3, ou outro antígeno, para determinar se o GUCY2c, CD3 ou outro anticorpo antígeno se liga ao mesmo epitopo que outros anticorpos, respectivamente. Os ensaios de competição são bem conhecidos dos especialistas na técnica.
[00319] Um vetor de expressão pode ser usado para direcionar a ex- pressão de um GUCY2c, CD3 ou outro anticorpo antígeno. Um especi- alista na técnica está familiarizado com a administração de vetores de expressão para obter a expressão de uma proteína exógena in vivo. Veja, por exemplo, Patentes Norte-americanas Nos. 6.436.908;
6.413.942; e 6.376.471. A administração de vetores de expressão inclui administração sítio ou sistêmica, incluindo injeção, administração oral, pistola de partículas ou administração cateterizada e administração tó- pica. Em outra modalidade, o vetor de expressão é administrado direta- mente ao tronco simpático ou gânglio, ou em uma artéria coronária, átrio, ventrículo ou pericárdio.
[00320] A distribuição direcionada de composições terapêuticas con- tendo um vetor de expressão ou polinucleotídeos subgenômicos tam- bém pode ser usada. As técnicas de liberação de DNA mediada por re- ceptor são descritas em, por exemplo, Findeis et al., Trends Biotechnol., 11: 202, 1993; Chiou et al., Gene Therapeutics: Methods And Applica- tions Of Direct Gene Transfer, J.A. WO lff, ed., 1994; Wu et al., J. Biol. Chem .. 263: 621, 1988; Wu et al., J. Biol. Chem .. 269: 542, 1994; Zenke et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 3655,1990; e Wu et al., J. Biol. Chem., 266: 338, 1991. Composições terapêuticas contendo um polinu- cleotídeo são administradas em uma faixa de cerca de 100 ng a cerca de 200 mg de DNA para administração em sítio em um protocolo de terapia genética. As faixas de concentração de cerca de 500 ng a cerca de 50 mg, cerca de 1 μg a cerca de 2 mg, cerca de 5 μg a cerca de 500 μg e cerca de 20 μg a cerca de 100 μg de DNA também podem ser usadas durante uma terapia genética protocolo. Os polinucleotídeos e polipeptídeos terapêuticos podem ser liberados usando veículos de li- beração de genes. O veículo de liberação de genes pode ser de origem viral ou não viral (ver geralmente, Jolly, Cancer Gene Therapy, 1: 51, 1994; Kimura, Human Gene Therapy, 5: 845, 1994; Connelly, Human
Gene Therapy, 1: 185, 1995; e Kaplitt, Nature Genetics, 6: 148, 1994). A expressão de tais sequências codificantes pode ser induzida usando promotores mamíferos endógenos ou heterólogos. A expressão da se- quência de codificação pode ser constitutiva ou regulada.
[00321] Os vetores virais de base para liberação de um polinucleotí- deo desejado e expressão em uma célula desejada são bem conhecidos na técnica. Os veículos com base em vírus exemplificativos incluem, mas não estão limitados a, retrovírus recombinantes (Veja, por exemplo, Publicação PCT Nos. WO 90/07936; WO 94/03622; WO 93/25698; WO 93/25234; WO 93/11230; WO 93/10218; WO 91/02805; Patentes US Nos. 5.219.740 e 4.777.127; Patente GB No. 2.200.651; e Pat. EP No. EP0 345 242), vetores baseados em alfavírus (por exemplo, vetores de vírus Sindbis, vírus da floresta Semliki (ATCC VR-67 ; ATCC VR-1247), vírus Ross River (ATCC VR-373; ATCC VR-1246) e vírus da encefalite equina venezuelana (ATCC VR-923; ATCC VR-1250; ATCC VR 1249; ATCC VR-532)) e adeno vectores de vus associados (AAV) (Veja, por exemplo, Publicações PCT Nos. WO 94/12649, WO 93/03769; WO 93/19191; WO 94/28938; WO 95/11984 e WO 95/00655). Administração de DNA ligado a adenovírus morto conforme descrito em Curiel, Hum. Gene Ther., 3: 147, 1992 também pode ser utilizada.
[00322] Veículos não virais de liberação e métodos podem também ser utilizados, incluindo, mas não se limitando a, DNA policatiônico con- densado ligado ou não ligado a adenovírus morto sozinho (Veja, por exemplo, Curiel, Hum. Gene Ther., 3: 147, 1992); DNA ligado ao ligando (Veja, por exemplo, Wu, J. Biol. Chem., 264: 16985, 1989); células de veículos de liberação de células eucarióticas (Veja, por exemplo, Pa- tente Norte-americana 5.814.482; Publicações PCT Nos. WO 95/07994; WO 96/17072; WO 95/30763; e WO 97/42338) e neutralização de carga nucleica ou fusão com membranas celulares. DNA nu também pode ser empregado. Métodos exemplificativos de introdução de DNA nu são descritos na Publicação PCT Nº WO 90/11092 e Patente Norte-ameri- cana No. 5.580.859. Os lipossomas que podem atuar como veículos de liberação de genes são descritos na Patente 5.422.120; Publicações PCT Nos. WO 95/13796; WO 94/23697; WO 91/14445; e Publicação Europeia EP 0524968. Métodos adicionais são descritos em Philip, Mol. Cell Biol., 14: 2411, 1994 e em WOffendin, Proc. Natl. Acad. Sci., 91: 1581,1994.
[00323] Em algumas modalidades, a invenção abrange composi- ções, incluindo composições farmacêuticas compreendendo anticorpos da invenção como aqui descritos ou feitos pelos métodos e tendo as características aqui descritas. Como aqui usado, as composições far- macêuticas podem compreender um ou mais anticorpos que se ligam a GUCY2c, um ou mais anticorpos biespecíficos que se ligam a CD3 e um antígeno tumoral GUCY2c, e/ou um ou mais polinucleotídeos compre- endendo sequências que codificam um ou mais desses anticorpos. Es- tas composições podem compreender ainda excipientes adequados, tais como excipientes farmaceuticamente aceitáveis incluindo tampões, que são bem conhecidos na técnica.
[00324] A invenção também fornece métodos de produção de qual- quer um desses anticorpos. Os anticorpos desta invenção podem ser produzidos por procedimentos conhecidos na técnica. Os polipeptídeos podem ser produzidos por degradação proteolítica ou outra dos anticor- pos, por métodos recombinantes (isto é, polipeptídeos simples ou de fusão) como descrito acima ou por síntese química. Os polipéptidos dos anticorpos, especialmente polipéptidos mais curtos até cerca de 50 ami- noácidos, são convenientemente produzidos por síntese química. Os métodos de síntese química são conhecidos na técnica e estão dispo- níveis comercialmente. Por exemplo, um anticorpo pode ser produzido por um sintetizador de polipeptídeo automatizado empregando o mé- todo de fase sólida. Ver também, Patentes Norte-americanas Nos.
5.807.715; 4.816.567; e 6.331.415.
[00325] Os anticorpos heteroconjugados, compreendendo dois anti- corpos unidos covalentemente, também estão dentro do escopo da in- venção. Tais anticorpos têm sido usados para direcionar células do sis- tema imunológico para células indesejadas (Patente Norte-americana No. 4.676.980) e para o tratamento de infecção por HIV (Publicação PCTP Nos. WO 91/00360 e WO 92/200373; e Publicação de Patente Europeia EP03089). Os anticorpos heteroconjugados podem ser produ- zidos usando quaisquer métodos de reticulação convenientes. Os agen- tes e técnicas de reticulação adequados são bem conhecidos na técnica e são descritos na Patente Norte-americana Nº. 4.676.980.
[00326] Os anticorpos quiméricos ou híbridos também podem ser preparados in vitro usando métodos conhecidos de química de proteí- nas sintéticas, incluindo aqueles envolvendo agentes de reticulação. Por exemplo, as imunotoxinas podem ser construídas usando uma rea- ção de troca dissulfeto ou formando uma ligação tioéter. Exemplos de reagentes adequados para este propósito incluem iminotiolato e metil- 4-mercaptobutirimidato.
[00327] Nos anticorpos humanizados recombinantes, a porção Fcγ pode ser modificada para evitar a interação com o receptor Fcγ e o com- plemento e os sistemas imunológicos. As técnicas para a preparação de tais anticorpos são descritas na Publicação PCT WO 99/58572. Por exemplo, a região constante pode ser modificada para se assemelhar mais às regiões constantes humanas para evitar a resposta imune se o anticorpo for usado em ensaios clínicos e tratamentos em humanos. Veja, por exemplo, Patentes Norte-americanas Nos. 5.997.867 e
5.866.692.
[00328] Os anticorpos GUCY2c e anticorpos biespecíficos CD3- GUCY2c, conforme descrito neste documento, podem compreender uma ou mais substituições de aminoácidos, inserções e/ou deleções na estrutura e/ou regiões CDR dos domínios variáveis de cadeia pesada e leve em comparação com as sequências de linhagem germinativa cor- respondentes dos quais os anticorpos foram derivados.
Essas mutações podem ser facilmente verificadas comparando as sequências de amino- ácidos aqui descritas com as sequências da linhagem germinativa dis- poníveis, por exemplo, bases de dados públicas de sequência de anti- corpos.
A presente invenção inclui anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, que são derivados de qualquer uma das se- quências de aminoácidos aqui descritas, caracterizado pelo fato de que um ou mais aminoácidos dentro de uma ou mais regiões de estrutura e/ou CDR são mutadas para o resíduo correspondente( s) da sequência de linhagem germinativa da qual o anticorpo foi derivado, ou para o(s) resíduo(s) correspondente(s) de outra sequência de linhagem germina- tiva humana, ou para uma substituição conservativa de aminoácidos do(s) resíduo(s) de linhagem germinativa correspondente (tais altera- ções de sequência são aqui referidas coletivamente como "mutações de linhagem germinativa"). Uma pessoa versada na técnica, começando com as sequências de região variável de cadeia pesada e leve aqui des- critas, podem facilmente produzir numerosos anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno que compreendem uma ou mais mutações indi- viduais da linhagem germinativa ou combinações das mesmas.
Em cer- tas modalidades, todos os resíduos de estrutura e/ou CDR dentro dos domínios VH e/ou VL são novamente mutados para os resíduos encon- trados na sequência de linhagem germinativa original da qual o anti- corpo foi derivado.
Em outras modalidades, apenas alguns resíduos são novamente mutados para a linhagem germinativa original, por exemplo, apenas os resíduos mutados encontrados nos primeiros 8 aminoácidos de FR1 ou nos últimos 8 aminoácidos de FR4, ou apenas os resíduos mutados encontrados em CDR1, CDR2 ou CDR3. Em outras modalida- des, um ou mais dentre estrutura e/ou resíduo(s) de CDR são mutados para o(s) resíduo(s) correspondente(s) de uma linhagem germinativa di- ferente sequência (isto é, uma sequência germinativa diferente da se- quência germinativa da qual o anticorpo foi originalmente derivado).
[00329] Além disso, os anticorpos da presente invenção podem con- ter qualquer combinação de duas ou mais mutações da linhagem ger- minativa dentro da estrutura e/ou regiões CDR, por exemplo, em que certos resíduos individuais são mutados para o resíduo correspondente de uma sequência particular da linhagem germinativa enquanto certos outros resíduos que diferem da sequência da linhagem germinativa ori- ginal são mantidos ou são mutados para o resíduo correspondente de uma sequência da linhagem germinativa diferente. Uma vez obtidos, os anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno que contêm uma ou mais mutações da linhagem germinativa podem ser facilmente testados quanto a uma ou mais propriedades desejadas, tais como especifici- dade de ligação melhorada, afinidade de ligação aumentada, proprieda- des biológicas agonísticas ou antagonistas melhoradas ou aumentadas (conforme o caso ser), imunogenicidade reduzida, etc. Os anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno obtidos desta maneira geral estão incluídos na presente invenção.
[00330] A presente invenção também inclui anticorpos GUCY2c e an- ticorpos CD3-GUCY2c biespecíficos compreendendo variantes de qual- quer uma das sequências de aminoácidos HC VR, LC VR e/ou CDR descritas neste documento tendo uma ou mais substituições conserva- doras. Por exemplo, a presente invenção inclui anticorpos GUCY2c e anticorpos CD3-GUCY2c biespecíficos com sequências de aminoácidos HC VR, LC VR e/ou CDR com, por exemplo, 10 ou menos, 8 ou menos, 6 ou menos, 4 ou menos, etc. substituições de aminoácidos conserva- doras em relação a qualquer uma das sequências de aminoácidos de HC VR, LC VR e/ou CDR, como aqui descrito.
[00331] Consequentemente, a invenção abrange modificações aos anticorpos e polipeptídeos das variantes da invenção como aqui des- crito, incluindo anticorpos funcionalmente equivalentes que não afetam significativamente suas propriedades e variantes que aumentaram ou diminuíram a atividade e/ou afinidade. Por exemplo, a sequência de aminoácidos pode ser mutada para obter um anticorpo com a afinidade de ligação desejada para GUCY2c e/ou CD3. A modificação de polipep- tídeos é prática de rotina na técnica e não precisa ser descrita em deta- lhes neste documento. Exemplos de polipeptídeos modificados incluem polipeptídeos com substituições conservadoras de resíduos de aminoá- cidos, uma ou mais deleções ou adições de aminoácidos que não alte- ram significativamente a atividade funcional de forma deletéria, ou que amadurecem (realçam) a afinidade do polipeptídeo para o seu ligante, ou usam de análogos químicos.
[00332] As inserções de sequência de aminoácidos incluem fusões de terminal amino e/ou carboxila variando em comprimento de um resí- duo a polipeptídeos contendo cem ou mais resíduos, bem como inser- ções intra-sequência de resíduos de aminoácidos únicos ou múltiplos. Exemplos de inserções terminais incluem um anticorpo com um resíduo de metionila de N-terminal ou o anticorpo fundido a um marcador de epitopo. Outras variantes de inserção da molécula de anticorpo incluem a fusão ao N-terminal ou C do anticorpo de uma enzima ou polipeptídeo que aumenta a meia-vida do anticorpo na circulação sanguínea.
[00333] As variantes de substituição têm pelo menos um resíduo de aminoácido removido na molécula de anticorpo e um resíduo diferente inserido em seu lugar. Os sítios de maior interesse para mutagênese substitucional incluem as regiões hipervariáveis, mas as alterações de FR também são consideradas. As substituições conservadoras são mostradas na Tabela 8 sob o título de "substituições conservadoras". Se tais substituições resultarem em uma mudança na atividade bioló- gica, então mudanças mais substanciais, denominadas "substituições exemplares" na Tabela 8, ou conforme descrito abaixo em referência às classes de aminoácidos, podem ser introduzidas e os produtos rastrea- dos. Tabela 8 Resíduo Original (aminoácido de ocorrência natural) Substituições Conservadoras Substituições Exemplares Ala (A) Val Val; Leu; Ile Arg (R) Lys Lys; Gln; Asn Asn (N) Gln Gln; His; Asp, Lys; Arg Asp (D) Glu Glu; Asn Cys (C) Ser Ser; Ala Gln (Q) Asn Asn; Glu Glu (E) Asp Asp; Gln Gly (G) Ala Ala His (H) Arg Asn; Gln; Lys; Arg Ile (I) Leu Leu; Val; Met; Ala; Phe; Norleucina Leu (L) Ile Norleucina; Ile; Val; Met; Ala; Phe Lys (K) Arg Arg; Gln; Asn Met (M) Leu Leu; Phe; Ile Phe (F) Tyr Leu; Val; Ile; Ala; Tyr Pro (P) Ala Ala Ser (S) Thr Thr Thr (T) Ser Ser Trp (W) Tyr Tyr; Phe Tyr (Y) Phe Trp; Phe; Thr; Ser Val (V) Leu Ile; Leu; Met; Phe; Ala; Norleucina
[00334] Modificações substanciais nas propriedades biológicas do anticorpo são realizadas selecionando substituições que diferem signifi- cativamente em seu efeito na manutenção (a) da estrutura da cadeia principal do polipeptídeo na área da substituição, por exemplo, como uma folha ou conformação helicoidal, (b) a carga ou hidrofobicidade da molécula no sítio alvo, ou (c) o volume da cadeia lateral. Os resíduos de aminoácidos de ocorrência natural são divididos em grupos com base nas propriedades comuns da cadeia lateral: (1) Não polar: Norleucina, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) Polar sem carga: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln; (3) Ácido (carga negativa): Asp, Glu; (4) Básico (carga positiva): Lys, Arg; (5) Resíduos que influenciam a orientação da cadeia: Gly, Pro; e (6) Aromático: Trp, Tyr, Phe, His.
[00335] As substituições não conservadoras são feitas trocando um membro de uma dessas classes por outra classe.
[00336] Qualquer resíduo de cisteína não envolvido na manutenção da conformação adequada do anticorpo também pode ser substituído, geralmente por serina, para melhorar a estabilidade oxidativa da molé- cula e prevenir a reticulação aberrante. Por outro lado, ligação (ões) de cisteína pode(m) ser adicionada(s) ao anticorpo para melhorar sua es- tabilidade, particularmente quando o anticorpo é um fragmento de anti- corpo, tal como um fragmento Fv.
[00337] As modificações de aminoácidos podem variar de alterar ou modificar um ou mais aminoácidos até o redesenho completo de uma região, como a região variável. Mudanças na região variável podem al- terar a afinidade de ligação e/ou especificidade. Em algumas modalida- des, não mais do que uma a cinco substituições conservadoras de ami- noácidos são feitas dentro de um domínio CDR. Em outras modalida- des, não mais do que uma a três substituições conservadoras de ami- noácidos são feitas dentro de um domínio CDR. Em ainda outras moda- lidades, o domínio CDR é CDR3 VH e/ou CDR3 VL.
[00338] As modificações também incluem polipeptídeos glicosilados e não glicosilados, bem como polipeptídeos com outras modificações pós-translacionais, como, por exemplo, glicosilação com diferentes açú- cares, acetilação e fosforilação. Os anticorpos são glicosilados em po- sições conservadas em suas regiões constantes (Jefferis e Lund, Chem. Immunol. 65: 111-128, 1997; Wright e Morrison, TibTECH 15: 26-32,
1997). As cadeias laterais de oligossacarídeo das imunoglobulinas afe- tam a função da proteína (Boyd et al., Mol. Immunol. 32: 1311-1318, 1996; Wittwe e Howard, Biochem. 29: 4175-4180, 1990) e a interação intramolecular entre porções de a glicoproteína, que pode afetar a con- formação e apresentar superfície tridimensional da glicoproteína (Jeffe- ris e Lund, supra; Wyss e Wagner, Current Opin. Biotech. 7: 409-416, 1996). Os oligossacarídeos também podem servir para direcionar uma dada glicoproteína para certas moléculas com base em estruturas de reconhecimento específicas. A glicosilação de anticorpos também foi re- latada como afetando a citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC). Em particular, as células de CHO com expressão regulada por tetraciclina de β(1,4)-N-acetilglucosaminiltransferase III (GnTIII), uma glicosiltransferase que catalisa a formação de GlcNAc bissectante, foi relatado como tendo atividade de ADCC melhorada (Umana et al., Ma- ture Biotech. 17: 176-180, 1999).
[00339] A glicosilação de anticorpos é tipicamente ligada a N ou li- gada a O. Ligado a N refere-se à ligação da porção de carboidrato à cadeia lateral de um resíduo de asparagina. As sequências tripeptídicas asparagina-X-serina, asparagina-X-treonina e asparagina-X-cisteína, em que X é qualquer aminoácido, exceto prolina, são as sequências de reconhecimento para ligação enzimática da fração de carboidrato à ca- deia lateral da asparagina. Assim, a presença de qualquer uma dessas sequências tripeptídicas em um polipeptídeo cria um sítio de glicosila- ção potencial. A glicosilação ligada a O refere-se à ligação de um dos açúcares N-acetilgalactosamina, galactose ou xilose a um hidroxiami- noácido, mais comumente serina ou treonina, embora 5-hidroxiprolina ou 5-hidroxilisina também possam ser usados.
[00340] A adição de sítios de glicosilação ao anticorpo é convenien- temente realizada alterando a sequência de aminoácidos de modo que contenha uma ou mais das sequências tripeptídicas descritas acima
(para sítios de glicosilação ligados a N). A alteração também pode ser feita pela adição de, ou substituição por, um ou mais resíduos de serina ou treonina à sequência do anticorpo original (para sítios de glicosilação ligados a O).
[00341] O padrão de glicosilação de anticorpos também pode ser al- terado sem alterar a sequência de nucleotídeos subjacente. A glicosila- ção depende muito da célula hospedeira usada para expressar o anti- corpo. Uma vez que o tipo de célula usado para a expressão de glico- proteínas recombinantes, por exemplo, anticorpos, como potencial tera- pêutico raramente é a célula nativa, variações no padrão de glicosilação dos anticorpos podem ser esperadas (veja, por exemplo, Hse et al., J. Biol. Chem. 272: 9062-9070, 1997).
[00342] Além da escolha das células hospedeiras, os fatores que afe- tam a glicosilação durante a produção de anticorpos recombinantes in- cluem o modo de crescimento, formulação de meios, densidade de cul- tura, oxigenação, pH, esquemas de purificação e semelhantes. Vários métodos foram propostos para alterar o padrão de glicosilação alcan- çado em um organismo hospedeiro particular, incluindo a introdução ou superexpressão de certas enzimas envolvidas na produção de oligos- sacarídeos (Patentes Norte-americanas Nos. 5.047.335; 5.510.261 e
5.278.299). A glicosilação, ou certos tipos de glicosilação, podem ser removidos enzimaticamente da glicoproteína, por exemplo, usando en- doglicosidase H (Endo H), N-glicosidase F, endoglicosidase F1, endo- glicosidase F2, endoglicosidase F3. Além disso, a célula hospedeira re- combinante pode ser geneticamente modificada para ser defeituosa no processamento de certos tipos de polissacarídeos. Estas e outras téc- nicas semelhantes são bem conhecidas na técnica.
[00343] Outros métodos de modificação incluem o uso de técnicas de acoplamento conhecidas na técnica, incluindo, mas não se limitando a, meios enzimáticos, substituição oxidativa e quelação. As modifica- ções podem ser usadas, por exemplo, para anexar marcadores para imunoensaio. Os polipeptídeos modificados são feitos usando procedi- mentos estabelecidos na técnica e podem ser rastreados usando en- saios padrão conhecidos na técnica, alguns dos quais são descritos abaixo e nos Exemplos.
[00344] Em algumas modalidades da invenção, o anticorpo compre- ende uma região constante modificada, tal como uma região constante que tem afinidade aumentada para um receptor Fc gama humano, é imunologicamente inerte ou parcialmente inerte, por exemplo, não de- sencadeia lise mediada por complemento, não estimula citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos (ADCC), ou não ativa macrófagos; ou tem atividades reduzidas (em comparação com o anti- corpo não modificado) em qualquer um ou mais dos seguintes: desen- cadear a lise mediada pelo complemento, estimular a citotoxicidade me- diada por células dependente de anticorpos (ADCC) ou ativar a micro- glia. Diferentes modificações da região constante podem ser usadas para atingir um nível ideal e/ou combinação de funções efetoras. Veja, por exemplo, Morgan et al., Immunology 86: 319-324, 1995; Lund et al., J. Immunology 157: 4963-9 157: 4963-4969, 1996; Idusogie et al., J. Immunology 164: 4178-4184, 2000; Tao et al., J. Immunology 143: 2595-2601, 1989; e Jefferis et al., Immunological Reviews 163: 59-76,
1998. Em algumas formas de realização, a região constante é modifi- cada como descrito em Eur. J. Immunol., 29: 2613-2624, 1999; Pedido PCT No. PCT/GB99/01441; e/ou Pedido de UK No. 9809951.8. Em ainda outras modalidades, a região constante é aglicosilada para glico- silação ligada a N. Em algumas modalidades, a região constante é agli- cosilada para glicosilação ligada a N por mutação do resíduo de amino- ácido glicosilado ou resíduos de flanqueamento que fazem parte da se- quência de reconhecimento de N-glicosilação na região constante. Por exemplo, o sítio de N-glicosilação N297 pode ser mutado para A, Q, K ou H. Veja, Tao et al., J. Immunology 143: 2595-2601, 1989; e Jefferis et al., Immunological Reviews 163: 59-76, 1998. Em algumas modalida- des, a região constante é aglicosilada para glicosilação ligada a N. A região constante pode ser aglicosilada para glicosilação ligada a N en- zimaticamente (tal como a remoção de carboidratos pela enzima PNGase), ou por expressão em uma célula hospedeira deficiente em glicosilação.
[00345] Outras modificações de anticorpos incluem anticorpos que foram modificados como descrito na Publicação PCT Nº WO99/58572. Estes anticorpos compreendem, além de um domínio de ligação direci- onado à molécula alvo, um domínio efetor tendo uma sequência de ami- noácidos substancialmente homóloga a toda ou parte de uma região constante de uma cadeia pesada de imunoglobulina humana. Estes an- ticorpos são capazes de se ligar à molécula alvo sem desencadear uma lise dependente do complemento significativa ou destruição mediada por células do alvo. Em algumas modalidades, o domínio efetor é capaz de se ligar especificamente a FcRn e/ou FcγRIIb. Estes são tipicamente baseados em domínios quiméricos derivados de dois ou mais domínios CH2 de cadeia pesada de imunoglobulina humana. Os anticorpos mo- dificados desta maneira são particularmente adequados para uso em terapia crônica de anticorpos, para evitar reações inflamatórias e outras reações adversas à terapia convencional de anticorpos.
[00346] A invenção inclui modalidades de afinidade maturada. Por exemplo, anticorpos maturados por afinidade podem ser produzidos por procedimentos conhecidos na técnica (Marks et al., Bio/Technology, 10: 779-783, 1992; Barbas et al., Proc Nat. Acad. Sci, USA 91: 3809- 3813, 1994; Schier et al., Gene, 169: 147-155, 1995; Yelton et al., J. Immunol., 155: 1994-2004, 1995; Jackson et al., J. Immunol., 154 (7): 3310-9, 1995, Hawkins et al., J. Mol. Biol., 226: 889-896, 1992; e Publicação
PCT Nº WO04/058184).
[00347] Os seguintes métodos podem ser usados para ajustar a afi- nidade de um anticorpo e para caracterizar uma CDR. Uma forma de caracterizar uma CDR de um anticorpo e/ou alterar (tal como melhorar) a afinidade de ligação de um polipeptídeo, tal como um anticorpo, de- nominado "mutagênese de varredura de biblioteca". Geralmente, a mu- tagênese de varredura de biblioteca funciona da seguinte maneira. Uma ou mais posições de aminoácidos na CDR são substituídas por dois ou mais (tais como 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20) aminoácidos usando métodos reconhecidos pela técnica. Isso gera pequenas bibliotecas de clones (em algumas modalidades, uma para cada posição de aminoácido analisada), cada uma com uma com- plexidade de dois ou mais membros (se dois ou mais aminoácidos forem substituídos em cada posição). Geralmente, a biblioteca também inclui um clone compreendendo o aminoácido nativo (não substituído). Um pequeno número de clones, por exemplo, cerca de 20-80 clones (de- pendendo da complexidade da biblioteca), de cada biblioteca são ras- treados quanto à afinidade de ligação ao polipeptídeo alvo (ou outro alvo de ligação) e candidatos com aumento, o mesmo, diminuído, ou ne- nhuma ligação é identificada. Os métodos para determinar a afinidade de ligação são bem conhecidos na técnica. A afinidade de ligação pode ser determinada usando a análise por ressonância de plasmônio super- ficial BIACORE™, que detecta diferenças na afinidade de ligação de cerca de 2 vezes ou mais. BIACORE™ é particularmente útil quando o anticorpo de partida já se liga com uma afinidade relativamente alta, por exemplo, uma KD de cerca de 10 nM ou inferior. O rastreamento usando ressonância de plasmônio superficial BIACORE™ é descrito nos Exem- plos, neste documento.
[00348] A afinidade de ligação pode ser determinada usando Kinexa Biocensor, ensaios de proximidade de cintilação, ELISA, imunoensaio
ORIGEN (IGEN), extinção de fluorescência, transferência de fluores- cência e/ou exibição de levedura. A afinidade de ligação também pode ser rastreada usando um bioensaio adequado.
[00349] Em algumas modalidades, cada posição de aminoácido em uma CDR é substituída (em algumas modalidades, um de cada vez) por todos os 20 aminoácidos naturais usando métodos de mutagênese re- conhecidos pela técnica (alguns dos quais são descritos neste docu- mento). Isso gera pequenas bibliotecas de clones (em algumas modali- dades, uma para cada posição de aminoácido que é analisada), cada uma com uma complexidade de 20 membros (se todos os 20 aminoáci- dos forem substituídos em todas as posições).
[00350] Em algumas modalidades, a biblioteca a ser rastreada com- preende substituições em duas ou mais posições, que podem estar na mesma CDR ou em duas ou mais CDRs. Assim, a biblioteca pode com- preender substituições em duas ou mais posições em uma CDR. A bi- blioteca pode compreender a substituição em duas ou mais posições em duas ou mais CDRs. A biblioteca pode compreender a substituição em 3, 4, 5 ou mais posições, as referidas posições encontradas em dois, três, quatro, cinco ou seis CDRs. A substituição pode ser preparada usando códons de baixa redundância. Veja, por exemplo, Tabela 2 de Balint et al., Gene 137 (1): 109-18, 1993.
[00351] Os candidatos com ligação melhorada podem ser sequenci- ados, identificando assim um mutante de substituição de CDR que re- sulta em afinidade melhorada (também denominada uma substituição "melhorada"). Os candidatos que se ligam também podem ser sequen- ciados, identificando assim uma substituição de CDR que retém a liga- ção.
[00352] Podem ser realizados vários ciclos de rastreamento. Por exemplo, os candidatos (cada um compreendendo uma substituição de aminoácido em uma ou mais posições de um ou mais CDR) com ligação melhorada também são úteis para o projeto de uma segunda biblioteca contendo pelo menos o aminoácido original e substituído em cada posi- ção CDR melhorada (isto é, a posição do aminoácido na CDR em que um mutante de substituição mostrou ligação melhorada). A preparação e rastreamento ou seleção desta biblioteca são discutidas mais adiante.
[00353] A mutagênese de varredura de biblioteca também fornece um meio para caracterizar uma CDR, na medida em que a frequência de clones com ligação melhorada, a mesma ligação, ligação diminuída ou nenhuma ligação também fornece informações relacionadas à im- portância de cada posição de aminoácido para a estabilidade do com- plexo anticorpo-antígeno. Por exemplo, se uma posição da CDR retém a ligação quando alterada para todos os 20 aminoácidos, essa posição é identificada como uma posição que é improvável de ser necessária para a ligação ao antígeno. Por outro lado, se uma posição de CDR retém a ligação em apenas uma pequena porcentagem de substitui- ções, essa posição é identificada como uma posição que é importante para a função de CDR. Assim, os métodos de mutagênese de varredura da biblioteca geram informações sobre as posições nas CDRs que po- dem ser alteradas para muitos aminoácidos diferentes (incluindo todos os 20 aminoácidos) e as posições nas CDRs que não podem ser altera- das ou que só podem ser alteradas para alguns aminoácidos.
[00354] Os candidatos com afinidade melhorada podem ser combi- nados em uma segunda biblioteca, que inclui o aminoácido melhorado, o aminoácido original naquela posição, e podem ainda incluir substitui- ções adicionais naquela posição, dependendo da complexidade da bi- blioteca que é desejada ou permitida usando o método de rastreamento ou seleção desejado. Além disso, se desejado, a posição do aminoácido adjacente pode ser randomizada para pelo menos dois ou mais amino- ácidos. A randomização de aminoácidos adjacentes pode permitir flexi- bilidade conformacional adicional na CDR mutante, que pode, por sua vez, permitir ou facilitar a introdução de um número maior de mutações de melhoria. A biblioteca também pode compreender a substituição em posições que não mostraram afinidade melhorada no primeiro ciclo de rastreamento.
[00355] A segunda biblioteca é rastreada ou selecionada para mem- bros da biblioteca com afinidade de ligação melhorada e/ou alterada usando qualquer método conhecido na técnica, incluindo rastreamento usando análise por ressonância de plasmônio superficial BIACORE™ e seleção usando qualquer método conhecido na técnica para seleção, incluindo exibição de fago, exibição de fermento e exibição de ribos- soma.
[00356] Esta invenção também fornece composições compreen- dendo anticorpos conjugados (por exemplo, ligados) a um agente que facilita o acoplamento a um suporte sólido (como biotina ou avidina). Para simplicidade, será feita referência geralmente a anticorpos com o entendimento de que esses métodos se aplicam a qualquer uma das modalidades de anticorpo GUCY2c aqui descritas. Conjugação geral- mente refere-se à ligação desses componentes conforme descrito neste documento. A ligação (que geralmente fixa esses componentes em as- sociação próxima pelo menos para administração) pode ser realizada de várias maneiras. Por exemplo, uma reação direta entre um agente e um anticorpo é possível quando cada um possui um substituinte capaz de reagir com o outro. Por exemplo, um grupo nucleofílico, tal como um grupo amino ou sulfidrila, em um pode ser capaz de reagir com um grupo contendo carbonila, tal como um anidrido ou um haleto de ácido, ou com um grupo alquila contendo um bom grupo de saída (por exemplo, um haleto) sobre o outro.
[00357] Em certas modalidades, como uma primeira etapa, o pri- meiro e o segundo polipeptídeo (e quaisquer polipeptídeos adicionais que formam o anticorpo biespecífico) são selecionados. Normalmente,
o ácido nucleico que codifica esses polipeptídeos precisa ser isolado de modo que possa ser alterado para codificar a protuberância ou buraco, ou ambos, como aqui definido. No entanto, as mutações podem ser in- troduzidas usando meios sintéticos, por exemplo, usando um sintetiza- dor de peptídeos. Além disso, no caso em que o resíduo substituído é um resíduo de ocorrência não natural, o método de Noren et al., Supra está disponível para preparar polipeptídeos com tais substituições. Além disso, parte do anticorpo biespecífico é adequadamente feito de forma recombinante em cultura de células e outra (s) parte (s) da molécula são feitas por aquelas técnicas mencionadas acima.
[00358] Seguem técnicas para isolar anticorpos e preparar anticor- pos biespecíficos. No entanto, será apreciado que os anticorpos bies- pecíficos podem ser formados a partir de, ou incorporar, outros polipep- tídeos usando técnicas que são conhecidas na técnica. Por exemplo, o ácido nucleico que codifica um polipeptídeo de interesse (por exemplo, um ligante, receptor ou enzima) pode ser isolado de uma biblioteca de cDNA preparada a partir de tecido que se acredita possuir o mRNA do polipeptídeo e expressá-lo em um nível detectável. As bibliotecas são rastreadas com sondas (tais como anticorpos ou oligonucleotídeos de cerca de 20-80 bases) projetadas para identificar o gene de interesse ou a proteína por ele codificada. O rastreamento do cDNA ou da biblio- teca genômica com a sonda selecionada pode ser conduzido utilizando procedimentos padrão como descrito nos capítulos 10-12 de Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Nova Iorque: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989).
[00359] Como afirmado anteriormente, o anticorpo biespecífico re- fere-se a um complexo de duas ou mais cadeias polipeptídicas, cada uma compreendendo pelo menos uma região de VL do anticorpo e uma região de VH do anticorpo ou fragmento do mesmo, em que as regiões de VL e VH em cada cadeia polipeptídica são de anticorpos diferentes.
Em aspectos específicos, o anticorpo biespecífico inclui dímeros ou te- trâmeros de cadeias polipeptídicas contendo uma região de VL e VH. As cadeias polipeptídicas individuais que compreendem as proteínas multiméricas podem ser covalentemente unidas a pelo menos um outro peptídeo do multímero por ligações dissulfeto intercadeias.
[00360] Os anticorpos biespecíficos da presente invenção visam si- multaneamente células T (CD3) e células tumorais (GUCY2c) e dirigem e ativam com sucesso a citotoxicidade das células T em células tumo- rais que expressam GUCY2c.
[00361] Cada cadeia polipeptídica do anticorpo biespecifico compre- ende uma região de VL e uma região de VH, que pode ser covalente- mente ligada por um ligante em que o ligante é uma ligação de glicina- serina que compreende glicina e resíduos de serina, de modo que os domínios de ligação de anticorpo são restringidos de automontagem. Em uma modalidade particular, o ligante de glicina-serina é o Ligante 1 compreendendo uma sequência de SEQ ID NO: 190. Além disso, cada cadeia polipeptídica compreende um domínio de heterodimerização, que promove a heterodimerização e/ou estabilização das múltiplas ca- deias polipeptídicas e reduz a probabilidade de homodimerização das diferentes cadeias polipeptídicas. O domínio de heterodimerização pode estar localizado no N-terminal da cadeia polipeptídica ou no C-terminal. O domínio de heterodimerização pode compreender um ligante de cis- teína (Ligante 2) que tem 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou mais resíduos de aminoáci- dos de comprimento. A interação de duas das cadeias polipeptídicas pode produzir dois emparelhamentos VL/VH, formando dois domínios de ligação de epitopo, ou seja, uma molécula bivalente. Nem a região de VH ou VL é restrita a qualquer posição dentro da cadeia polipeptí- dica, isto é, restrita ao terminal amino ou ao terminal carbóxi, nem são as regiões restritas em suas posições relativas umas às outras, isto é, a região de VL pode ser de N-terminal da região de VH e vice-versa. A única restrição é que uma cadeia polipeptídica complementar esteja dis- ponível para formar um anticorpo biespecífico funcional. Quando as re- giões de VL e VH são derivadas de anticorpos específicos para diferen- tes antígenos, a formação de um anticorpo biespecifico funcional requer a interação de duas cadeias polipeptídicas diferentes, isto é, a formação de um heterodímero. Em contraste, onde duas cadeias polipeptídicas diferentes estão livres para interagir, por exemplo, em um sistema de expressão recombinante, uma compreendendo uma VLA e uma VHB (A, sendo um primeiro epitopo e B, sendo um segundo epitopo) e a outra compreendendo uma VLB e uma VHA, dois sítios de ligação diferentes podem formar: VLA-VHA e VLB-VHB. Para todos os pares de cadeias polipeptídicas de anticorpos biespecíficos, o desalinhamento ou ligação incorreta das duas cadeias é uma possibilidade, por exemplo, a intera- ção das regiões de VL-VL ou VH-VH. No entanto, a purificação de anti- corpos biespecíficos funcionais é facilmente gerenciada com base na imunoespecificidade do sítio de ligação adequadamente dimerizado usando qualquer método baseado em afinidade conhecido na técnica ou exemplificado aqui, por exemplo, cromatografia de afinidade.
[00362] Em uma modalidade, as cadeias polipeptídicas do anticorpo biespecífico podem compreender vários ligantes e peptídeos. Os ligan- tes e peptídeos podem ser 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou mais aminoácidos. Em algumas modalidades, o GUCY2c VL e o CD3 VH são ligados pelo Ligante 1 ou Ligante 2; e o CD3 VL e o GUCY2c VH estão ligados pelo Ligante 1 ou Ligante 2. Em algumas de tais modalidades, o Ligante 1 compreende uma sequência da SEQ ID NO: 190. Em outras modalida- des, o Ligante 2 compreende uma sequência da SEQ ID NO: 191.
[00363] Em algumas modalidades, o Domínio 1 é covalentemente li- gado ao primeiro domínio de promoção de heterodímero por meio de um ligante de cisteína e o Domínio 2 é covalentemente ligado ao se- gundo domínio de promoção de heterodímero por meio de um ligante de cisteína. Cada um dos ligantes de cisteína inclui pelo menos um re- síduo de cisteína para permitir a ligação dissulfeto intramolecular. Em outras modalidades de cada um dos anteriores, o ligante de cisteína compreende pelo menos cinco aminoácidos. Em algumas de tais moda- lidades, o ligante de cisteína é o Ligante 3 que compreende uma se- quência de SEQ ID NO: 192.
[00364] Em algumas modalidades, a primeira cadeia polipeptídica é covalentemente ligada à segunda cadeia polipeptídica por pelo menos uma ligação dissulfeto. Em algumas de tais modalidades, pelo menos uma ligação dissulfeto se forma entre o Ligante 3 da primeira cadeia polipeptídica e o Ligante 3 da segunda cadeia polipeptídica. Em outra tal modalidade, pelo menos uma ligação dissulfeto é formada entre o primeiro domínio de promoção de heterodímero e o segundo domínio de promoção de heterodímero. Em modalidades específicas, cada liga- ção dissulfeto é formada ligando dois resíduos de cisteína.
[00365] Os anticorpos biespecíficos da invenção podem ligar simul- taneamente dois epitopos separados e distintos. Em certas modalida- des, pelo menos um sítio de ligação de epitopo é específico para o de- terminante CD3 expresso em uma célula imune efetora, por exemplo, expresso em linfócitos T. Em uma modalidade, a molécula de anticorpo biespecífico se liga ao determinante da célula efetora e também ativa a célula efetora.
[00366] Em modalidades particulares, o anticorpo biespecífico da presente invenção (a) se liga ao domínio extracelular de GUCY2c hu- mano, (b) demonstra um soro prolongado e meia-vida tumoral de entre 30 min a 100 dias; e/ou (c) demonstra um valor de EC 50 inferior entre 0,0001 nM e 100 nM na presença de níveis de expressão de GUCY2c aumentados ou níveis de densidade de receptor aumentados.
[00367] Em uma modalidade, o domínio de ligação ao epitopo é ca-
paz de se ligar ao antígeno associado ao tumor GUCY2c que está as- sociado à mama, ovário, tireoide, próstata, cervical, pulmão (incluindo, mas não se limitando a câncer de pulmão de células não pequenas e câncer de pulmão de células pequenas), câncer de bexiga, endométrio, cabeça e pescoço, testicular e glioblastoma. Em certas modalidades, o câncer é o câncer do sistema digestivo selecionado do grupo que con- siste em esôfago, estômago, intestino delgado, cólon, reto, ânus, fígado, vesícula biliar, apêndice, dutos biliares e pâncreas. Em modalidades es- pecíficas, a terapia ativa uma resposta de células T citolíticas.
[00368] Os anticorpos biespecíficos da presente invenção compre- endem domínios de ligação ao antígeno geralmente derivados de imu- noglobulinas ou anticorpos. Os anticorpos a partir dos quais os domínios de ligação usados nos métodos da invenção são derivados podem ser de qualquer origem animal, incluindo pássaros e mamíferos (por exem- plo, humano, primata não humano, murino, burro, ovelha, coelho, cabra, porquinho-da-índia, camelo, cavalo ou galinha). De preferência, os anti- corpos são anticorpos monoclonais humanos ou humanizados.
[00369] Os anticorpos biespecíficos da presente invenção podem ser caracterizados de várias maneiras. Em particular, as moléculas da in- venção podem ser testadas quanto à capacidade de se ligar imunoes- pecificamente a um antígeno. As moléculas que foram identificadas para se ligar imunoespecificamente a um antígeno podem então ser analisa- dos quanto a sua especificidade e afinidade pelo antígeno.
[00370] O anticorpo biespecífico da presente invenção pode ser pro- duzido usando uma variedade de métodos bem conhecidos na técnica, incluindo síntese de proteínas de novo e expressão recombinante de ácidos nucleicos que codificam as proteínas de ligação. As sequências de ácido nucleico desejadas podem ser produzidas por métodos recom- binantes (por exemplo, mutagênese de PCR de uma variante preparada anteriormente do polinucleotídeo desejado) ou por síntese de DNA em fase sólida. Normalmente são usados métodos de expressão recombi- nante. Em um aspecto, a invenção fornece um polinucleotídeo que com- preende uma sequência que codifica um CD3 VH e/ou VL; em outro aspecto, a invenção fornece um polinucleotídeo que compreende uma sequência que codifica um GUCY2c VH e/ou VL. Devido à degeneres- cência do código genético, uma variedade de sequências de ácido nu- cleico codifica cada sequência de aminoácidos de imunoglobulina e a presente invenção inclui todos os ácidos nucleicos que codificam as pro- teínas de ligação aqui descritas.
[00371] O anticorpo biespecífico da presente invenção pode compre- ender dois domínios scFv que se ligam a um antígeno alvo e CD3, que é fundido a um domínio Fc de IgG. Em uma modalidade da invenção, o anticorpo biespecífico compreende dois domínios scFv que se ligam o GUCY2c e CD3 épsilon, que é fundido a um domínio Fc de IgG1. Em particular, as Figuras 1A, 1B, 1C e 1D mostram quatro representações alternativas de anticorpos CD3-GUCY2c biespecíficos. O anticorpo bi- específico compreende um primeiro domínio de promoção de heterodí- mero e um segundo domínio de promoção de heterodímero. Cada pri- meiro domínio de promoção de heterodímero e segundo domínio de pro- moção de heterodímero podem compreender um domínio CH2 e/ou um domínio CH3 de uma região Fc de imunoglobulina, em que o domínio CH2 e/ou domínio CH3 foram alterados para compreender uma saliên- cia (protuberância) ou um buraco (cavidade). As modificações na porção Fc do anticorpo biespecífico são descritas abaixo.
[00372] Em um aspecto da presente invenção, um anticorpo biespe- cífico, como mostrado nas Figuras 1A, 1B, 1C e 1D, compreende uma primeira cadeia polipeptídica e uma segunda cadeia polipeptídica.
[00373] Em um aspecto, a invenção fornece um anticorpo biespecí- fico conforme descrito adicionalmente aqui, em que: (a) a primeira ca-
deia polipeptídica compreende, na direção do N-terminal para o C-ter- minal: (i) um Domínio 1, compreendendo uma VL de um anticorpo GUCY2c (GUCY2c VL), e uma VH de um anticorpo CD3 (CD3 VH), e (ii) um primeiro domínio de promoção de heterodímero; e (b) a segunda cadeia polipeptídica compreende, na direção de N-terminal para de C- terminal: (i) um Domínio 2, compreendendo uma VL de um anticorpo CD3 (CD3 VL), e uma VH de um anticorpo GUCY2c (GUCY2c VH), e (ii) um segundo domínio de promoção de heterodímero.
[00374] Em outro aspecto, a invenção fornece um anticorpo biespe- cífico como aqui descrito, em que: (a) a primeira cadeia polipeptídica compreende, na direção do N-terminal para o C-terminal: (i) um Domínio 1, compreendendo um CD3 VL, e um GUCY2c VH, e (ii) um primeiro domínio de promoção de heterodímero; e (b) a segunda cadeia polipep- tídica compreende, na direção do N-terminal para o C-terminal: (i) um Domínio 2 compreendendo um GUCY2c VL e um CD3 VH, e (ii) um segundo domínio de promoção de heterodímero.
[00375] Em ainda outro aspecto, a invenção fornece um anticorpo bi- específico como aqui descrito, em que: (a) a primeira cadeia polipeptí- dica compreende, na direção do N-terminal para o C-terminal: (i) um Domínio 1, compreendendo um GUCY2c VH, e um CD3 VL, e (ii) um primeiro domínio de promoção de heterodímero; e (b) a segunda cadeia polipeptídica compreende, na direção do N-terminal para o C-terminal: (i) um Domínio 2, compreendendo um CD3 VH e um GUCY2c VL, e (ii) um segundo domínio de promoção de heterodímero.
[00376] Em outro aspecto, a invenção fornece um anticorpo biespe- cífico como aqui descrito, em que: (a) a primeira cadeia polipeptídica compreende, na direção do N-terminal para o C-terminal: (i) um Domínio 1, compreendendo uma VH de CD3, e um GUCY2c VL, e (ii) um primeiro domínio de promoção de heterodímero; e (b) a segunda cadeia polipep- tídica compreende, na direção de N-terminal para de C-terminal: (i) um
Domínio 2, compreendendo um GUCY2c VH e um CD3 VL, e (ii) um segundo domínio promotor de heterodímero.
[00377] Em algumas modalidades dos anteriores, GUCY2c VL e GUCY2c VH formam um domínio que se liga especificamente o GUCY2c; e o CD3 VL e o CD3 VH formam um domínio que se liga es- pecificamente ao CD3.
[00378] Em outras modalidades de qualquer um dos anteriores, o an- ticorpo biespecífico da presente invenção compreende (a) uma CDR1 de GUCY2c VH compreendendo uma sequência de SEQ ID NO: 12, 20, 27, 34, 42, 74, 257, 258, 259, 260 ou 261; (b) uma CDR2 de GUCY2c VH compreendendo uma sequência de SEQ ID NO: 13, 21, 28, 35, 43, 53, 66, 68, 70, 72, 75, 262, 263, 264, 265, 266 ou 267; (c) uma CDR3 de GUCY2c VH compreendendo uma sequência de SEQ ID NO: 14, 22, 29, 36 ou 44; (d) uma CDR1 de GUCY2c VL compreendendo uma se- quência de SEQ ID NO: 93, 101, 105, 107, 113, 120, 148, 153, 163 ou 167; (e) uma CDR2 de GUCY2c VL compreendendo uma sequência de SEQ ID NO: 78, 94, 102, 108, 114, 141, 144, 146, 149, 151, 157, 159, 161, 164 ou 168; e (f) uma CDR3 de GUCY2c VL compreendendo uma sequência de SEQ ID NO: 95, 109, 115, 121, 142, 154, 165 ou 169.
[00379] Em uma modalidade particular, o anticorpo biespecífico da presente invenção compreende (a) uma CDR1 de GUCY2c VH compre- endendo uma sequência de SEQ ID NO: 74; (b) uma CDR2 de GUCY2c VH compreendendo uma sequência de SEQ ID NO: 75; (c) uma CDR3 de GUCY2c VH compreendendo uma sequência de SEQ ID NO: 29; (d) uma CDR1 de GUCY2c VL compreendendo uma sequência de SEQ ID NO: 148; (e) uma CDR2 de GUCY2c VL compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 149; e (f) uma CDR3 de GUCY2c VL compreendendo uma sequência de SEQ ID NO: 142.
[00380] Em modalidades específicas, o anticorpo biespecífico com- preende: (a) uma região GUCY2c VH compreendendo uma sequência de SEQ ID NO: 73; e (b) uma região GUCY2c VL compreendendo a sequência mostrada na SEQ ID NO: 147.
[00381] Em modalidades adicionais, a invenção fornece anticorpos biespecíficos compreendendo (a) uma CDR1 de CD3 VH compreen- dendo uma sequência de SEQ ID NO: 2; (b) uma CDR2 de CD3 VH compreendendo uma sequência de SEQ ID NO: 3 ou 10; (c) uma CDR3 de CD3 VH compreendendo uma sequência de SEQ ID NO: 4; (d) uma CDR1 de CD3 VL compreendendo uma sequência da SEQ ID NO: 77, 85 ou 91; (e) uma CDR2 de CD3 VL compreendendo a SEQ ID NO: 78; e (f) uma CDR3 de CD3 VL compreendendo uma sequência de SEQ ID NO: 79.
[00382] Em uma modalidade particular, a invenção fornece um anti- corpo biespecífico compreendendo (a) uma CDR1 de CD3 VH compre- endendo a sequência SEQ ID NO: 2; (b) uma CDR2 de CD3 VH com- preendendo a sequência de SEQ ID NO: 10; (c) uma CDR3 de CD3 VH compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 4; (d) uma CDR1 de CD3 VL compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 91; (e) uma CDR2 de CD3 VL compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 78; e (f) uma CDR3 de CD3 VL compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 79.
[00383] Em uma modalidade, a invenção fornece um anticorpo bies- pecífico compreendendo: (a) uma região de CD3 VH compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 1, 9 ou 273; e (b) uma região de CD3 VL compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 76, 84, 90, 274, 275 ou
276. Em uma modalidade particular, o anticorpo biespecífico da pre- sente invenção compreende: (a) uma região de CD3 VH compreen- dendo a sequência de SEQ ID NO: 9; e (b) uma região de CD3 VL com- preendendo a sequência de SEQ ID NO: 90.
[00384] Em outro aspecto da invenção, o ligante 3 pode compreen- der uma hingeregion inferior de IgG1 humana truncada possuindo a se- quência GCPPCP (SEQ ID NO: 192) com pelo menos um resíduo de glicina precedendo a região de articulação inferior.
[00385] Em um aspecto, o primeiro domínio de promoção de hetero- dímero pode compreender uma cadeia Fc com um domínio CH2 e/ou CH3 alterado para compreender uma cadeia Fc de saliência (protube- rância) compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 188, 196, 199, 202, 205, 210, 216 ou 248, 282, 284 ou 286; ou uma cadeia Fc de buraco (cavidade) compreendendo uma sequência de SEQ ID NO: 189, 197, 200, 203, 206, 211, 217, 220, 249, 283, 285 ou 287. Em outro aspecto, o segundo domínio promotor de heterodímero pode compreender uma cadeia Fc tendo um domínio CH2 e/ou CH3 alterado para compreender uma cadeia Fc de saliência (protuberância) compreendendo uma se- quência de SEQ ID NO: 188, 196, 199, 202, 205, 210, 216, or248, 282, 284 ou 286, se essa primeira região de heterodímero compreender uma cadeia Fc de buraco (cavidade) ou uma cadeia Fc de buraco (cavidade) compreendendo uma sequência de SEQ ID NO: 189, 197, 200, 203, 206, 211, 217, 220, 249, 283, 285 ou 287, se essa primeira região de heterodímero compreender uma cadeia Fc de saliêcia (protuberância) (Tabela 7).
[00386] A Tabela 9 fornece as sequências de ácido nucleico para a primeira cadeia polipeptídica e a segunda cadeia polipeptídica dos anti- corpos biespecíficos com os vários anticorpos GUCY2c e CD3 aqui des- critos. SEQ ID NOs: 246 e 247 fornecem as sequências de nucleotídeos correspondentes, conforme usado aqui. Tabela 9 GUCY2C-1608 primeira gacatccagctgacccagtctccatcctccctgtctgcatctgtaggagacagagtcaccat- cadeia de polipeptídeo cacttgcagagccagtgaaagtgttgattattatggcagtagtttattgcagtggtatcagcagaaaccagggaaagcccctaagctcctgatctatgctgcatccaaactag cttctggggtcccatcaaggttcagtggcagtggatctgggacagatttcactctcaccat- (SEQ ID NO: 246) cagcagtctgcaacctgaagattttgcaacttactactgtcagcaaactcggaaagcgtatacgtttggccaggggaccaagctggagatcaaaggtggaggtagcggg ggcggcggggaagttcaactcgttgagtctggcgggggattggttcaacccggtggaagcct- tagattgtcatgtgccgcctccggctttacatttagcgactattacatgacctgggtgagacaagctccaggcaaaggacttgaatgggtggcctttatcagaaatcaggccc gcggctacacaagcgaccataatccctccgtgaaaggaagatttaccatcagccgggacaa- tgctaaaaattcactttaccttcaaatgaactctcttagagccgaggacaccgccgtatactactgcgcaagagatagaccaagttattacgtcctggattactggggccagg gaacaaccgtcaccgtgtcttctggatgcccaccgtgcccagcacctgaagccgctgggg- caccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtc aagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggagga- gcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagc ccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtgcac- cctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgtggtgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggca gccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctc- tatagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccc tgtcccccggaaag gacatccagatgacccagtccccctcttctctgtctgcctctgtgggcgacagagtgaccat- cacctgcacaagctcacagtcactgtttaatgtccgcagccagaaaaactatcttgcgtggtatcagcagaagcctggcaaggctcccaagctgctgatctactgggccag tacacgagaatccggcgtgccttccagattctccggctctggctctggcaccgatttcac- cctgaccatctcctccctccagcctgaggatttcgccacctactactgcaaacagtcttacgaccttttcacttttggcggcggaacaaaggtggagatcaagggcggaggt ggatctggcggcggaggcgaggtgcagctggtggagtctgggggaggcttggtccag- cctggggggtccctgagactctcctgtgcagcctctggcttcaccttcagcagctactggatgcactgggtccgccaggctccagggaaggggctggagtggattggagag GUCY2C-1608 se- attaaacctagcaacgaacttactaacgtccatgaaaagttcaaggaccgattcac- gunda cadeia de polipep- catctccgtggacaaggccaagaactcagcctatctgcaaatgaacagcctgagagccgaggacacggctgtgtattactgtacaagaacgattacgacgacggaggg tídeo atactggttcttcgatgtctggggccaagggacactggtcaccgtctcttcaggatgtccac- cgtgcccagcacctgaagccgctggggcaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtg (SEQ ID NO: 247) gacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgca- taatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagt gcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaaggg- cagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatgccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgtcctgcgcggtcaaaggcttctatcccagcgacat cgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtg- ctggactccgacggctccttcttcctcgttagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaac cactacacgcagaagagcctctccctgtcccccggaaag Mutações efetoras nulas em CH2-CH3 de IgG1 humana
[00387] A cadeia Fc de IgG1 humana foi modificada para introduzir mutações L234A, L235A e G237A (SEQ ID NO: 187, numeração de acordo com o índice EU) usando mutagênese de PCR dirigida por inici- ador padrão para função efetora oblata devido à ligação a FcγRIII for- necendo um efetor fenótipo de função nula (Canfield et al., J. Exp. Med (1991) 173: 1483-1491; Shields et al., J. Biol. Chem. (2001) 276: 6591- 604). Mutações de protuberâncias em buracos em CH2-CH3 de IgG1 humana
[00388] Protuberâncias em buracos é uma estratégia de projeto efi- caz conhecida na técnica para a modificação de homodímeros de ca- deia pesada de anticorpos para heterodimerização. Nesta abordagem, uma variante 'protuberância' foi obtida pela substituição de um pequeno aminoácido por um maior em uma cadeia da cadeia Fc de IgG1, por exemplo, Y349C e T366W, (numeração de acordo com o índice EU). A 'protuberância' foi projetada para inserir em um 'buraco' no domínio CH3 da cadeia complementar da cadeia Fc criada pela substituição de um grande resíduo por um menor, por exemplo, S354C, T366S, L368A e Y407V, (numeração de acordo com índice EU).
[00389] Em algumas modalidades, mutações complementares foram introduzidas para derivar heterodimerização das cadeias Fc resultantes,
de modo que cada cadeia Fc carregaria um conjunto de mutações, Y349C e T366W para a cadeia Fc de saliência (ou protuberância) (SEQ ID NO: 188), ou S354C, T366S, L368A e Y407V para a cadeia Fc do buraco (ou cavidade) (SEQ ID NO: 189), conforme fornecido na Tabela
10. Quando cotransfectado em um hospedeiro mamífero adequado, o DNA que codifica as sequências de aminoácidos, por exemplo de SEQ ID NOs: 246 e 247 produzem um domínio Fc que é predominantemente um anticorpo biespecífico possuindo uma cadeia Fc de saliência (ou protuberância) associada a uma cadeia Fc de um buraco (ou cavidade). Tabela 10 Mutações de cadeia Fc de protube- APEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTK- rância PREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSREEMTKNQ VSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN- (SEQ ID NO: 188) VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG Mutações de cadeia Fc de buraco APEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTK-
PREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCREEMTKNQ (SEQ ID NO: 189) VSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGN-
VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
[00390] Os anticorpos CD3-GUCY2c biespecíficos da presente in- venção são estáveis contra agregação em estudos de estabilidade tér- mica e potentes fusões anticorpo biespecífico-Fc direcionados o CD3 humano e GUCY2c. O domínio Fc de protuberância em buraco permite expressão melhorada em células de CHO e purificação melhorada re- sultando em alta pureza do heterodímero desejado. As mutações proje- tadas dentro do domínio Fc anulam a ligação FcƴR, evitando, assim, potencialmente a depleção de células T mediada por ADCC. Além disso, a incorporação do domínio Fc a um anticorpo biespecífico aumenta a estabilidade das moléculas mostradas por calorimetria de varredura di- ferencial (DSC).
[00391] O anticorpo biespecífico pode ser projetado para compreen- der pelo menos um resíduo de cisteína que pode interagir com um resí- duo de cisteína de contrapartida em outra cadeia polipeptídica da inven- ção para formar uma ligação dissulfeto intercadeias. As ligações dissul- feto intercadeia podem servir para estabilizar o anticorpo biespecífico, melhorando a expressão e recuperação em sistemas recombinantes,
resultando em uma formulação estável e consistente, bem como, me- lhorando a estabilidade do produto isolado e/ou purificado in vivo. O re- síduo ou resíduos de cisteína podem ser introduzidos como um único aminoácido ou como parte de uma sequência de aminoácidos maior, por exemplo, região de articulação, em qualquer porção da cadeia poli- peptídica. Em um aspecto específico, pelo menos um resíduo de ciste- ína é projetado para ocorrer no C-terminal da cadeia polipeptídica.
[00392] Em um aspecto, a invenção fornece um anticorpo biespecí- fico que se liga especificamente o GUCY2c e compete pela ligação com o anticorpo biespecífico conforme descrito aqui. Em algumas dessas modalidades, o anticorpo biespecífico se liga especificamente a um epi- topo de GUCY2c.
[00393] Em um aspecto, a invenção fornece um anticorpo biespecí- fico que se liga especificamente o GUCY2c e CD3, em que o anticorpo biespecífico compreende uma primeira cadeia de polipeptídeo e uma segunda cadeia de polipeptídeo, e em que: (a) a primeira cadeia de po- lipeptídeo compreende as seguintes regiões na seguinte ordem em uma direção de N-terminal para de C-terminal: uma VL de um anticorpo anti- GUCY2c (GUCY2c VL) (SEQ ID NO: 147)- Ligante 1 (SEQ ID NO: 190)- uma VH de um anticorpo anti-CD3 (CD3 VH) (SEQ ID NO: 9)- Ligante 3 (SEQ ID NO: 192)- um primeiro domínio de promoção de heterodímero (SEQ ID NO: 188); e (b) a segunda cadeia polipeptídica compreende as seguintes regiões na seguinte ordem em uma direção de N-terminal para de C-terminal: uma VL de um anticorpo anti-CD3 (CD3 VL) (SEQ ID NO: 90)- Ligante 2 (SEQ ID NO: 191)- uma VH de um anticorpo anti- GUCY2c (GUCY2c VH) (SEQ ID NO: 73)- Ligante 3 (SEQ ID NO: 192)- um segundo domínio de promoção de heterodímero (SEQ ID NO: 189) .
[00394] Em outro aspecto, a invenção fornece um anticorpo biespe- cífico que se liga especificamente o GUCY2c e CD3, em que o anticorpo biespecífico compreende uma primeira cadeia de polipeptídeo e uma segunda cadeia de polipeptídeo, e em que: (a) a primeira cadeia de po- lipeptídeo compreende as seguintes regiões na seguinte ordem em uma direção de N-terminal para de C-terminal: uma VL de um anticorpo anti- GUCY2c (GUCY2c VL) (SEQ ID NO: 147)- Ligante 1 (SEQ ID NO: 190)- uma VH de um anticorpo anti-CD3 (CD3 VH) (SEQ ID NO: 9)- Ligante 3 (SEQ ID NO: 192)- um primeiro domínio de promoção de heterodímero (SEQ ID NO: 188); e (b) a segunda cadeia polipeptídica compreende as seguintes regiões na seguinte ordem em uma direção de N-terminal para de C-terminal: uma VL de um anticorpo anti-CD3 (CD3 VL) (SEQ ID NO: 90)- Ligante 2 (SEQ ID NO: 191)- uma VH de um anticorpo anti- GUCY2c (GUCY2c VH) (SEQ ID NO: 73)- Ligante 3 (SEQ ID NO: 192)- um segundo domínio de promoção de heterodímero (SEQ ID NO: 189) ; em que GUCY2c VL e GUCY2c VH formam um domínio que se liga especificamente o GUCY2c; e o CD3 VL e o CD3 VH formam um domí- nio que se liga especificamente ao CD3; em que o ligante 3 da primeira cadeia polipeptídica e o ligante 3 da segunda cadeia polipeptídica estão covalentemente ligados um ao outro por duas ligações dissulfeto; em que o primeiro domínio de promoção de heterodímero e o segundo do- mínio de promoção de heterodímero cada um compreende um domínio CH2 e um domínio CH3; em que o domínio CH3 do primeiro domínio de promoção de heterodímero forma um protuberância e o domínio CH3 do segundo domínio de promoção de heterodímero forma um buraco; em que pelo menos uma ligação dissulfeto é formada entre o domínio CH3 do primeiro domínio de promoção de heterodímero e o domínio CH3 do segundo domínio de promoção de heterodímero.
[00395] Em algumas dessas modalidades, a invenção fornece um anticorpo biespecífico que se liga especificamente a um epitopo de GUCY2c e um epitopo de CD3.
[00396] Em algumas modalidades, a invenção fornece um anticorpo biespecífico que compreende ainda uma estrutura VH humana ou hu- manizada e uma estrutura VL humana ou humanizada. Em algumas dessas modalidades, o anticorpo biespecífico é um anticorpo humani- zado. Em modalidades específicas, a estrutura VH compreende uma sequência de SEQ ID NO: 5, 6, 7, 8, 15, 16, 17, 18, 23, 24, 25, 30, 31, 32, 37, 38, 39, 40, 45, 46, 47, 49, 50, 51, 54, 55, 56, 58, 59, 61 ou 63; e/ou a estrutura VL compreende uma sequência de SEQ ID NO: 80, 81, 82, 83, 86, 87, 88, 89, 96, 97, 98, 99, 103, 110, 111, 116, 117, 118, 122, 122, 123, 124, 126, 127, 128, 130, 131, 132, 133, 135, 139 ou 155.
[00397] Em um aspecto, o anticorpo biespecífico da presente inven- ção se liga especificamente o GUCY2c e CD3, em que o anticorpo bi- específico compreende uma primeira cadeia de polipeptídeo e uma se- gunda cadeia de polipeptídeo; em que a primeira cadeia polipeptídica é produzida pelo vetor de expressão com o Nº de Acesso ATCC PTA- 124944; e a segunda cadeia polipeptídica é produzida pelo vetor de ex- pressão com o Nº de Acesso ATCC PTA-124943.
[00398] Em um aspecto, a invenção fornece um anticorpo biespecí- fico capaz de ligação específica o GUCY2c e o CD3 compreendendo uma primeira cadeia polipeptídica e uma segunda cadeia polipeptídica, em que a primeira cadeia polipeptídica compreende uma sequência de SEQ ID NO: 216 e a segunda cadeia polipeptídica compreende uma sequência de SEQ ID NO: 220.
[00399] Em algumas de tais modalidades, a invenção fornece um an- ticorpo biespecífico, em que a primeira e a segunda cadeias polipeptídi- cas estão covalentemente ligadas uma à outra por pelo menos uma li- gação dissulfeto.
[00400] A presente invenção fornece ainda uma composição farma- cêutica que compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo ou um anticorpo biespecífico aqui descrito, e um transpor- tador farmaceuticamente aceitável.
[00401] A invenção abrange métodos e composições para trata- mento, prevenção ou gerenciamento de câncer em um indivíduo, com- preendendo a administração ao indivíduo de uma quantidade terapeuti- camente eficaz de um anticorpo ou anticorpos biespecíficos projetados de acordo com a invenção, cuja molécula se liga ainda a um antígeno de câncer. As moléculas da invenção podem ser particularmente úteis para a prevenção, inibição, redução do crescimento e/ou regressão de tumores primários e metástases de células cancerosas. Embora não pretenda estar ligada a um mecanismo de ação particular, as moléculas da invenção podem mediar a função efetora que pode resultar na elimi- nação do tumor, redução do tumor ou uma combinação das mesmas.
[00402] Os anticorpos (por exemplo, GUCY2c ou CD3-GUCY2c bi- específico) da presente invenção são úteis em várias aplicações, inclu- indo, mas não estão limitados a, métodos de tratamento terapêutico e métodos de tratamento de diagnóstico.
[00403] Em um aspecto, a invenção fornece um método para tratar uma condição associada à expressão de GUCY2c em um indivíduo. Em algumas modalidades, o método de tratamento de uma condição asso- ciada à expressão de GUCY2c em um indivíduo compreende a admi- nistração ao indivíduo em necessidade de uma quantidade eficaz de uma composição (por exemplo, composição farmacêutica) compreen- dendo os anticorpos GUCY2c ou os anticorpos biespecíficos GUCY2c, como aqui descrito. As condições associadas à expressão de GUCY2c incluem, mas não estão limitadas a, expressão de GUCY2c anormal, expressão de GUCY2c alterada ou aberrante, células malignas que ex- pressam GUCY2c e um distúrbio proliferativo (por exemplo, câncer).
[00404] Consequentemente, a invenção fornece métodos de trata- mento de câncer caracterizado por um antígeno GUCY2c por modifica- ção do anticorpo biespecífico para reconhecer imunoespecificamente o antígeno GUCY2c e um antígeno CD3 nas células T. Os anticorpos bi- específicos que foram projetados de acordo com a invenção são úteis para a prevenção ou tratamento do câncer, uma vez que eles têm uma atividade citotóxica por células T exterminadoras ativadas induzidas por anti CD3.
[00405] Em uma modalidade particular, a presente invenção fornece um método de tratamento de um distúrbio associado ao GUCY2c em um paciente em necessidade, compreendendo a administração ao pa- ciente de um anticorpo GUCY2 conforme descrito neste documento. A presente invenção também fornece um método de tratamento de um distúrbio associado ao GUCY2c em um paciente em necessidade, com- preendendo a administração ao paciente de um anticorpo biespecífico da presente invenção.
[00406] A presente invenção fornece ainda um método de tratamento de um distúrbio associado ao GUCY2c em um paciente em necessi- dade, compreendendo a administração ao paciente de uma composição farmacêutica que compreende um anticorpo GUCY2c ou um anticorpo biespecífico descrito neste documento. Em algumas dessas modalida- des, o distúrbio associado ao GUCY2c é o câncer. Em modalidades es- pecíficas, o câncer é de mama, ovário, tireoide, próstata, cervical, pul- mão (incluindo, mas não se limitando a câncer de pulmão de células não pequenas e câncer de células pequenas), bexiga, endométrio, cabeça e pescoço, testicular ou câncer de glioblastoma. Em certas modalida- des, o câncer é o câncer do sistema digestivo selecionado do grupo que consiste em esôfago, estômago, intestino delgado, cólon, reto, ânus, fí- gado, vesícula biliar, apêndice, dutos biliares e pâncreas. Em modalida- des específicas, a terapia ativa uma resposta de células T citolíticas.
[00407] Em um aspecto, a presente invenção fornece um anticorpo, um anticorpo biespecífico ou uma composição farmacêutica conforme descrito neste documento para uso em terapia. Em uma modalidade particular, a invenção também fornece um anticorpo GUCY2c ou anti- corpo CD3-GUCY2c biespecífico para uso no método de tratamento de câncer aqui definido.
[00408] A presente invenção fornece ainda um anticorpo, ou um an- ticorpo biespecífico, conforme descrito aqui, para uso na fabricação de um medicamento para uso em terapia. Em algumas modalidades, a te- rapia é um tratamento de um distúrbio associado ao GUCY2c. Em mo- dalidades específicas, o distúrbio associado ao GUCY2c é o câncer. Em algumas modalidades, o câncer é selecionado a partir do grupo que consiste em mama, ovário, tireoide, próstata, cervical, pulmão (inclu- indo, mas não se limitando a câncer de pulmão de células não pequenas e câncer de células pequenas), bexiga, endométrio, cabeça e pescoço, testicular e câncer de glioblastoma. Em certas modalidades, o câncer é o câncer do sistema digestivo selecionado do grupo que consiste em esôfago, estômago, intestino delgado, cólon, reto, ânus, fígado, vesícula biliar, apêndice, dutos biliares e pâncreas. Em modalidades específicas, a terapia ativa uma resposta de células T citolíticas.
[00409] Em um aspecto, a presente invenção fornece um polinucleo- tídeo que codifica um anticorpo ou um anticorpo biespecífico como aqui descrito. Em outra modalidade, a invenção fornece um vetor que com- preende polinucleotídeos como aqui descrito. Em ainda outra modali- dade, a invenção fornece uma célula hospedeira transformada ou trans- fectada com os vetores conforme descrito neste documento. Em algu- mas de tais modalidades, a célula hospedeira produz de forma recom- binante o anticorpo ou o anticorpo biespecífico conforme descrito neste documento. Em modalidades específicas, a célula hospedeira é seleci- onada a partir do grupo que consiste em linhagens de células bacteria- nas, linhagens de células de mamíferos, linhagens de células de inseto e linhagens de células de levedura. Em uma modalidade particular, a linhagem de células de mamífero é uma linhagem de células de CHO.
Em uma modalidade, o anticorpo ou o anticorpo biespecífico é produ- zido usando um sistema de síntese de proteínas in vitro sem células.
[00410] Em um aspecto, é fornecido um método de tratamento de um câncer em um indivíduo em necessidade, compreendendo a) fornecer o anticorpo biespecífico conforme descrito neste documento, e b) admi- nistrar o referido anticorpo biespecífico ao referido paciente. Em algu- mas modalidades, é fornecido um método de tratamento de uma condi- ção associada a células malignas que expressam um antígeno tumoral em um indivíduo que compreende a) fornecer o anticorpo conforme des- crito neste documento, e b) administrar ao indivíduo em necessidade uma quantidade eficaz de uma composição farmacêutica compreen- dendo um anticorpo como aqui descrito. Exemplos do câncer a ser tra- tado incluem, mas não estão limitados a, câncer de esôfago, câncer de estômago, câncer de intestino delgado, câncer de cólon, câncer de reto, câncer de ânus, câncer de fígado, câncer de vesícula biliar, câncer de apêndice, câncer de ductos biliares e câncer de pâncreas. Consequen- temente, as composições e métodos aqui descritos podem ser usados para tratar, detectar imagens, detectar e vacinar contra os cânceres pri- mários e metastáticos listados acima.
[00411] Em algumas modalidades, é fornecido um método de inibir o crescimento ou progressão tumoral em um indivíduo que tem células malignas que expressam GUCY2c, compreendendo a administração ao indivíduo em necessidade de uma quantidade eficaz de uma composi- ção compreendendo os anticorpos GUCY2c ou anticorpos CD3- GUCY2c biespecíficos, conforme descrito aqui. Em outras modalidades, é fornecido um método de inibição de células de metástase que expres- sam GUCY2c em um indivíduo, compreendendo a administração ao in- divíduo em necessidade de uma quantidade eficaz de uma composição compreendendo os anticorpos GUCY2c ou anticorpos CD3-GUCY2c bi- específicos, como aqui descrito. Em outras modalidades, é fornecido um método para induzir a regressão tumoral em células malignas em um indivíduo, compreendendo a administração ao indivíduo em necessi- dade de uma quantidade eficaz de uma composição compreendendo os anticorpos GUCY2c ou anticorpos específicos CD3-GUCY2cb, como aqui descrito.
[00412] Em um aspecto específico, os anticorpos GUCY2c ou o an- ticorpo CD3-GUCY2c bispecífico da invenção inibem ou reduzem o crescimento de células cancerosas em pelo menos 99%, pelo menos 95%, pelo menos 90%, pelo menos 85%, pelo menos 80%, em pelo menos 75%, pelo menos 70%, pelo menos 60%, pelo menos 50%, pelo menos 45%, pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 35%, pelo menos 30%, pelo menos 25%, em pelo menos 20%, ou pelo menos 10% em relação ao crescimento de células cancerosas na ausência do anti- corpo ou de um anticorpo biespecífico da invenção.
[00413] Em um aspecto específico, os anticorpos GUCY2c ou CD3- GUCY2c biespecific matam células ou inibem ou reduzem o cresci- mento de células cancerosas em pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 35%, pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou pelo menos 100% melhor do que na ausência do anticorpo ou de anticorpos biespecíficos da invenção.
[00414] Em uma modalidade, é fornecido um método de tratamento de um distúrbio autoimune em um indivíduo, compreendendo a admi- nistração ao indivíduo em necessidade de uma quantidade eficaz de uma composição compreendendo os anticorpos GUCY2c ou anticorpos CD3-GUCY2c biespecíficos, conforme descrito neste documento.
[00415] Quando aqui usados, os distúrbios autoimunes incluem, mas não estão limitados a, doença inflamatória intestinal, lúpus eritematoso sistêmico, diabetes (Tipo I), doença celíaca, agamaglobulinemia, ente- ropatia autoimune, hepatite autoimune, doença de Crohn, penfigoide gastrointestinal, polimiosite, mielite transversa, colite ulcerosa e vascu- lite.
[00416] Em um aspecto, a invenção fornece uma quantidade eficaz de uma composição (por exemplo, composição farmacêutica) compre- endendo os anticorpos (por exemplo, anticorpos GUCY2c ou anticorpos CD3-GUCY2c biespecíficos), conforme descrito neste documento para o tratamento de uma condição (por exemplo, câncer) associada à ex- pressão de GUCY2c em um indivíduo em necessidade. Em uma moda- lidade, é fornecida uma quantidade eficaz de uma composição (por exemplo, composição farmacêutica) que compreende os anticorpos (por exemplo, anticorpos GUCY2c ou anticorpos CD3-GUCY2c biespecífi- cos), conforme descrito neste documento para inibir o crescimento ou progressão tumoral em um indivíduo que tem células malignas expres- sando GUCY2c. Em algumas modalidades, é fornecida uma quantidade eficaz de uma composição (por exemplo, composição farmacêutica) compreendendo os anticorpos (por exemplo, anticorpos GUCY2c ou an- ticorpos CD3-GUCY2c biespecíficos), conforme descrito neste docu- mento para inibir a metástase de células malignas que expressam GUCY2c em um indivíduo em necessidade. Em algumas modalidades, é fornecida uma quantidade eficaz de uma composição (por exemplo, composição farmacêutica) compreendendo os anticorpos (por exemplo, anticorpos GUCY2c ou anticorpos CD3-GUCY2c biespecíficos), con- forme descrito neste documento.
[00417] Em outro aspecto, a invenção fornece os anticorpos (por exemplo, anticorpos GUCY2c ou CD3-GUCY2c), conforme descrito neste documento para uso no tratamento de uma condição (por exem- plo, câncer) associada à expressão de GUCY2c em um indivíduo em necessidade. Em algumas modalidades, são fornecidos os anticorpos
(por exemplo, anticorpos GUCY2c ou anticorpos específicos CD3- GUCY2c), conforme descrito neste documento para inibir o crescimento ou progressão tumoral em um indivíduo que tem células malignas que expressam GUCY2c. Em algumas modalidades, são fornecidos os anti- corpos (por exemplo, anticorpos GUCY2c ou anticorpos CD3-GUCY2c biespecíficos), conforme descrito neste documento para inibir a metás- tase de células malignas que expressam GUCY2c em um indivíduo em necessidade. Em algumas modalidades, são fornecidos os anticorpos (por exemplo, anticorpos GUCY2c ou anticorpos específicos CD3- GUCY2c), conforme descrito neste documento para induzir a regressão do tumor em um indivíduo que tem células malignas que expressam GUCY2c.
[00418] Em outro aspecto, a invenção fornece um uso dos anticorpos (por exemplo, anticorpos GUCY2c ou anticorpos CD3-GUCY2c biespe- cíficos), conforme descrito neste documento na fabricação de um medi- camento para o tratamento de uma condição (por exemplo, câncer) as- sociada à expressão de GUCY2c. Em algumas modalidades, é forne- cido um uso dos anticorpos (por exemplo, anticorpos GUCY2c ou anti- corpos CD3-GUCY2c biespecíficos), conforme descrito neste docu- mento na fabricação de um medicamento para inibir o crescimento ou progressão tumoral. Em algumas modalidades, é fornecido um uso dos anticorpos (por exemplo, anticorpos GUCY2c ou anticorpos CD3- GUCY2c biespecíficos), conforme descrito neste documento na fabrica- ção de um medicamento para inibir a metástase de células malignas que expressam GUCY2c. Em algumas modalidades, é fornecido um uso dos anticorpos (por exemplo, anticorpos GUCY2c ou anticorpos CD3- GUCY2c biespecíficos), conforme descrito neste documento na fabrica- ção de um medicamento para induzir a regressão tumoral.
[00419] Em outro aspecto, é fornecido um método para detectar, di- agnosticar e/ou monitorar uma condição associada à expressão de
GUCY2c. Por exemplo, os anticorpos (por exemplo, anticorpos GUCY2c ou anticorpos CD3-GUCY2c biespecíficos), conforme descrito neste do- cumento, podem ser marcados com uma porção detectável, como um agente de imagem e um marcador de enzima-substrato. Os anticorpos como aqui descritos também podem ser usados para ensaios de diag- nóstico in vivo, tais como imagens in vivo (por exemplo, PET ou SPECT) ou um reagente de manchamento.
[00420] Consequentemente, além de redirecionar células T para an- tígenos específicos de tumor, os anticorpos CD3-GUCY2c biespecíficos da presente invenção podem ser usados para transportar outros agen- tes de diagnóstico ou terapêuticos para células que expressam um tu- mor em sua superfície. Assim, um anticorpo biespecífico pode ser ligado direta ou indiretamente, por exemplo, por meio de um ligante, a um fár- maco de modo que ele seja liberado diretamente às células portadoras de um tumor. Os agentes terapêuticos incluem, mas não estão limitados a, ácidos nucleicos, proteínas, peptídeos, aminoácidos ou derivados, glicoproteínas, radioisótopos, lipídeos, carboidratos ou vírus recombi- nantes. Agentes de diagnóstico de ácido nucleico ou terapêuticos in- cluem, mas não estão limitados a, ácidos nucleicos antissenso, oligonu- cleotídeos derivados para reticulação covalente com DNA simples ou duplex e oligonucleotídeos formadores de triplex.
[00421] Alternativamente, os agentes diagnósticos ou terapêuticos li- gados aos anticorpos biespecíficos da presente invenção podem ser um sistema de encapsulação, como um lipossoma ou micela que contém um agente terapêutico, tal como um fármaco, um ácido nucleico (por exemplo, um ácido nucleico antissenso) ou outro agente terapêutico que é preferencialmente protegido da exposição direta ao sistema circulató- rio. Os meios de preparação de lipossomas ligados a anticorpos são bem conhecidos daqueles versados na técnica. Veja, por exemplo, Pa- tente Norte-americana No. 4.957.735; e Connor, et al., Pharm. Ther. 28:
341-365 (1985).
[00422] Em algumas modalidades, os métodos descritos neste do- cumento compreendem ainda uma etapa de tratamento de um indivíduo com uma forma adicional de terapia. Em algumas modalidades, a forma adicional de terapia é uma terapia anticâncer adicional, incluindo, mas não se limitando a, quimioterapia, radiação, cirurgia, terapia hormonal e/ou imunoterapia adicional.
[00423] A invenção abrange ainda a administração das moléculas da invenção em combinação com outras terapias conhecidas pelos versa- dos na técnica para o tratamento ou prevenção do câncer, incluindo, mas não se limitando a, padrão atual e quimioterapias experimentais, terapias biológicas, imunoterapias, radioterapias ou cirurgia. Em alguns aspectos, as moléculas da invenção podem ser administradas em com- binação com uma quantidade terapeuticamente ou profilaticamente efi- caz de um ou mais agentes, anticorpos terapêuticos ou outros agentes conhecidos pelos versados na técnica para o tratamento e/ou prevenção de câncer.
[00424] Consequentemente, os métodos para o tratamento do cân- cer incluem a administração a um indivíduo em necessidade de uma quantidade eficaz de um anticorpo ou anticorpo biespecífico da presente invenção em combinação com um agente quimioterápico. Tal trata- mento de combinação pode ser administrado separadamente, sequen- cialmente ou simultaneamente. Os agentes quimioterápicos adequados incluem, mas não estão limitados a, pelo menos um agente adicional, como bevacizumabe, cetuximbe, sirolimo, panitumumabe, 5-fluorouracil (5-FU), capecitabina, tivozanibe, irinotecano, oxaliplatina, cisplatina, tri- fluridina, tipiracil, leucovori, gencitabina e/ou cloridrato de erlotinibe.
[00425] As quantidades de dosagem e frequências de administração fornecidas neste documento são abrangidas pelos termos terapeutica- mente eficaz e profilaticamente eficaz. A dosagem e frequência podem ainda variar de acordo com fatores específicos para cada paciente, de- pendendo dos agentes terapêuticos ou profiláticos específicos adminis- trados, a gravidade e o tipo de câncer, a via de administração, bem como a idade, peso corporal, resposta e histórico médico história do pa- ciente. Os regimes adequados podem ser selecionados por alguém ver- sado na técnica considerando tais fatores e seguindo, por exemplo, do- sagens relatadas na literatura e recomendadas no Physician's Desk Re- ference (56ª ed., 2002).
[00426] Os anticorpos ou os anticorpos biespecíficos da presente in- venção podem estar na forma de uma composição farmacêutica para administração que são formuladas para serem apropriadas para o modo de administração selecionado e diluente ou excipientes farmaceutica- mente aceitáveis, tais como tampões, tensoativos, conservantes, agen- tes solubilizantes, agentes de isotonicidade, agentes estabilizadores, transportadores e semelhantes. Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton Pa., 18ª ed., 1995, fornece um compêndio de técnicas de formulação como são geralmente conhecidas pelos mé- dicos.
[00427] Estas composições farmacêuticas podem ser administradas por qualquer meio conhecido na técnica que atinja o propósito geral pre- tendido para tratar o câncer. A via de administração pode ser parenteral, definida neste documento como se referindo aos modos de administra- ção que incluem, mas não se limitam a injeção e infusão transesofágica, intratumoral, transcolonoscopicamente, transcutânea, intravenosa, in- tramuscular, intraperitoneal, subcutânea e intra-articular. O modo de ad- ministração e dosagem das moléculas de acordo com a invenção (por exemplo, anticorpos GUCY2c, anticorpo CD3-GUCY2c biespecífico, composição farmacêutica) dependem do tipo de doença a ser comba- tida, quando apropriado o estágio da mesma, o antígeno a ser contro-
lado, o tipo de tratamento simultâneo, se houver, frequência do trata- mento, a natureza do efeito desejado e também o peso corporal, a idade, a saúde, a dieta e o sexo do paciente. Assim, o regime de dosa- gem realmente empregado pode variar amplamente e, portanto, pode se desviar dos regimes de dosagem aqui estabelecidos.
[00428] Várias formulações dos anticorpos da presente invenção (por exemplo, anticorpos GUCY2c ou anticorpos CD3-GUCY2c biespe- cíficos) podem ser usadas para administração. Em algumas modalida- des, os anticorpos (por exemplo, anticorpos GUCY2c ou anticorpo CD3- GUCY2c biespecífico) podem ser administrados puros. Em algumas modalidades, o anticorpo (por exemplo, anticorpo GUCY2c ou anticorpo CD3-GUCY2c biespecífico) e um excipiente farmaceuticamente aceitá- vel podem estar em várias formulações. Excipientes farmaceuticamente aceitáveis são conhecidos na técnica e são substâncias relativamente inertes que facilitam a administração de uma substância farmacologica- mente eficaz. Por exemplo, um excipiente pode dar forma ou consistên- cia, ou atuar como um diluente. Excipientes adequados incluem, mas não estão limitados a agentes estabilizadores, agentes umectantes e emulsificantes, sais para variar a osmolaridade, agentes encapsulantes, tampões e realçadores de penetração na pele. Excipientes, bem como formulações para administração parentérica e não parentérica de fár- macos, são apresentados em Remington, The Science and Practice of Pharmacy 21ª. Ed. Mack Publishing, 2005.
[00429] Em algumas modalidades, esses agentes são formulados para administração por injeção (por exemplo, intraperitonealmente, in- travenosamente, subcutaneamente, intramuscularmente, etc.). Conse- quentemente, esses agentes podem ser combinados com veículos far- maceuticamente aceitáveis, como solução salina, solução de Ringer, solução de dextrose e semelhantes. O regime de dosagem específico, ou seja, dose, tempo e repetição, dependerá do indivíduo específico e do histórico médico desse indivíduo.
[00430] Os anticorpos (por exemplo, anticorpos GUCY2c ou anticor- pos CD3-GUCY2c biespecíficos), conforme descritos neste documento, podem ser administrados usando qualquer método adequado, incluindo por injeção (por exemplo, intraperitonealmente, intravenosamente, sub- cutaneamente, intramuscularmente, etc.). O anticorpo, por exemplo, an- ticorpo monoclonal ou anticorpo biespecífico, também pode ser admi- nistrado por inalação, como aqui descrito. Geralmente, para a adminis- tração do anticorpo da presente invenção (por exemplo, anticorpo GUCY2c ou anticorpo CD3-GUCY2c biespecífico), a dosagem depende do hospedeiro tratado e do modo particular de administração. Em uma modalidade, a faixa de dose do anticorpo da presente invenção será de cerca de 0,001 µg/kg de peso corporal a cerca de 20.000 µg/kg de peso corporal. O termo "peso corporal" é aplicável quando um paciente está sendo tratado. Quando as células isoladas estão sendo tratadas, "peso corporal", quando aqui usado, refere-se a um "peso corporal total da célula". O termo "peso corporal total" pode ser usado para se aplicar tanto à célula isolada quanto ao tratamento do paciente. Todas as con- centrações e níveis de tratamento são expressos como "peso corporal" ou simplesmente "kg" neste pedido também são considerados para co- brir as concentrações análogas de "peso corporal total da célula" e "peso corporal total". No entanto, aqueles versados na técnica reconhe- cerão a utilidade de um variedade de faixa de dosagem, por exemplo, 0,01 µg/kg de peso corporal a 20,000 µg/kg de peso corporal, 0,02 µg/kg de peso corporal a 15,000 µg/kg de peso corporal, 0,03 µg/kg de peso corporal a 10,000 µg/kg de peso corporal, 0,04 µg/kg de peso corporal a 5,000 µg/kg de peso corporal, 0,05 µg/kg de peso corporal a 2,500 µg/kg de peso corporal, 0,06 µg/kg de peso corporal a 1,000 µg/kg de peso corporal, 0,07 µg/kg de peso corporal a 500 µg/kg de peso corpo- ral, 0,08 µg/kg de peso corporal a 400 µg/kg de peso corporal, 0,09 µg/kg de peso corporal a 200 µg/kg de peso corporal ou 0,1 µg/kg de peso corporal a 100 µg/kg de peso corporal. Além disso, aqueles versa- dos na técnica reconhecerão que uma variedade de diferentes níveis de dosagem serão úteis, por exemplo, 0,0001 µg/kg, 0,0002 µg/kg, 0,0003 µg/kg, 0,0004 µg/kg, 0,005 µg/kg, 0,0007 µg/kg, 0,001 µg/kg, 0,1 µg/kg, 1,0 µg/kg, 1,5 µg/kg, 2,0 µg/kg, 5,0 µg/kg, 10,0 µg/kg, 15,0 µg/kg, 30,0 µg/kg, 50 µg/kg, 75 µg/kg, 80 µg/kg, 90 µg/kg, 100 µg/kg, 120 µg/kg, 140 µg/kg, 150 µg/kg, 160 µg/kg, 180 µg/kg, 200 µg/kg, 225 µg/kg, 250 µg/kg, 275 µg/kg, 300 µg/kg, 325 µg/kg, 350 µg/kg, 375 µg/kg, 400 µg/kg, 450 µg/kg, 500 µg/kg, 550 µg/kg, 600 µg/kg, 700 µg/kg, 750 µg/kg, 800 µg/kg, 900 µg/kg, 1 µg/kg, 5 µg/kg, 10 µg/kg, 12 µg/kg, 15 mg/kg, 20 mg/kg e/ou 30 mg/kg. Todas estas dosagens são exemplares, e qualquer dosagem entre estes pontos também deve ser útil na inven- ção. Qualquer um dos intervalos de dosagem ou níveis de dosagem acima pode ser empregado para um anticorpo da presente invenção. Para administrações repetidas ao longo de vários dias ou mais, depen- dendo da condição, o tratamento é mantido até que ocorra uma supres- são desejada dos sintomas ou até que níveis terapêuticos suficientes sejam alcançados, por exemplo, para inibir ou atrasar o cresci- mento/progressão tumoral ou metástase de células cancerosas.
[00431] Outros regimes de dosagem também podem ser úteis, de- pendendo do padrão de degradação farmacocinética que o médico de- seja atingir. Em uma modalidade, o anticorpo da presente invenção é administrado em uma dose de iniciação inicial seguida por uma dosa- gem mais elevada e/ou contínua substancialmente constante. Em algu- mas modalidades, a dosagem de uma a quatro vezes por semana é considerada. Em outras modalidades, a dosagem uma vez por mês ou uma vez a cada dois meses ou a cada três meses é considerada. O progresso desta terapia é facilmente monitorado por técnicas e ensaios convencionais. O regime de dosagem (incluindo o anticorpo (por exem- plo, anticorpo GUCY2c ou anticorpo CD3-GUCY2c biespecífico) pode variar ao longo do tempo.
[00432] Para o propósito da presente invenção, a dosagem apropri- ada de um anticorpo (por exemplo, anticorpo GUCY2c ou anticorpo CD3-GUCY2c biespecífico) dependerá do anticorpo (por exemplo, anti- corpo GUCY2c ou anticorpo CD3-GUCY2c biespecífico) ou composi- ções dos mesmos empregadas, o tipo e gravidade dos sintomas a se- rem tratados, se o agente é administrado para fins terapêuticos, terapia anterior, história clínica do paciente e resposta ao agente, taxa de libe- ração do paciente para o agente administrado e a critério do médico assistente. Normalmente, o médico administrará um anticorpo (por exemplo, anticorpo GUCY2c ou anticorpo CD3-GUCY2c biespecífico) até que uma dosagem seja alcançada que atinja o resultado desejado. A dose e/ou frequência podem variar ao longo do tratamento. Conside- rações empíricas, como a meia-vida, geralmente contribuirão para a de- terminação da dosagem. Por exemplo, anticorpos que são compatíveis com o sistema imunológico humano, como anticorpos humanizados ou anticorpos totalmente humanos, podem ser usados para prolongar a meia-vida do anticorpo e para evitar que o anticorpo seja atacado pelo sistema imunológico do hospedeiro. A frequência de administração pode ser determinada e ajustada ao longo do curso da terapia e é ge- ralmente, mas não necessariamente, com base no tratamento e/ou su- pressão e/ou melhoria e/ou retardo dos sintomas, por exemplo, inibição ou retardo do crescimento do tumor, etc. Alternativamente, formulações de liberação contínua prolongada de anticorpos (por exemplo, anticor- pos GUCY2c ou anticorpo CD3-GUCY2c biespecífico) podem ser apro- priadas. Várias formulações e dispositivos para alcançar a liberação pro- longada são conhecidos na técnica.
[00433] Em uma modalidade, as dosagens para um anticorpo (por exemplo, anticorpo GUCY2c ou anticorpo CD3-GUCY2c biespecífico) podem ser determinadas empiricamente em indivíduos que receberam uma ou mais administrações do anticorpo (por exemplo, anticorpo GUCY2c ou anticorpo CD3-GUCY2c biespecífico). Os indivíduos rece- bem dosagens incrementais de um anticorpo (por exemplo, anticorpo GUCY2c ou anticorpo CD3-GUCY2c biespecífico). Para avaliar a eficá- cia, um indicador da doença pode ser seguido.
[00434] Em certas modalidades, a administração de um anticorpo (por exemplo, anticorpo GUCY2c ou anticorpo CD3-GUCY2c biespecí- fico) leva a pelo menos um efeito selecionado do grupo que consiste em inibição do crescimento do tumor, regressão do tumor, redução no ta- manho de um tumor, redução no número de células tumorais, retardo no crescimento do tumor, efeito abscopal, inibição da metástase tumo- ral, redução nas lesões metastáticas ao longo do tempo, uso reduzido de agentes quimioterápicos ou citotóxicos, redução na carga tumoral, aumento na sobrevida livre de progressão, aumento na sobrevida geral, resposta completa, resposta parcial e doença estável.
[00435] A administração de um anticorpo (por exemplo, anticorpo GUCY2c ou anticorpo CD3-GUCY2c biespecífico) de acordo com o mé- todo na presente invenção pode ser contínua ou intermitente, depen- dendo, por exemplo, da condição fisiológica do receptor, se o propósito da administração é terapêutico ou profilático, e outros fatores conheci- dos por profissionais qualificados. A administração de um anticorpo (por exemplo, anticorpo GUCY2c ou anticorpo CD3-GUCY2c biespecífico) pode ser essencialmente contínua ao longo de um período de tempo pré-selecionado ou pode ser em uma série de doses espaçadas.
[00436] Em algumas modalidades, mais de um anticorpo (por exem- plo, anticorpo GUCY2c ou anticorpo CD3-GUCY2c biespecífico) pode estar presente. Pelo menos um, pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco anticorpos diferentes ou mais (por exemplo, anticorpos GUCY2c ou anticorpos CD3-GUCY2c biespecífi- cos) podem estar presentes. Geralmente, aqueles (por exemplo, anti- corpos GUCY2c ou anticorpos CD3-GUCY2c biespecíficos) podem ter atividades complementares que não afetam adversamente umas às ou- tras. Por exemplo, um ou mais dos seguinte anticorpo pode ser usado: um primeiro anticorpo GUCY2c ou CD3 dirigido a um epitopo em GUCY2c ou CD3 e um segundo anticorpo GUCY2c ou CD3 dirigido a um epitopo diferente em GUCY2c ou CD3.
[00437] As formulações terapêuticas do anticorpo (por exemplo, an- ticorpo GUCY2c ou anticorpo CD3-GUCY2c biespecífico) usadas de acordo com a presente invenção são preparadas para armazenamento por mistura de um anticorpo com o grau de pureza desejado com trans- portadores, excipientes ou estabilizadores farmaceuticamente aceitá- veis opcionais (Remington, The Science and Practice of Pharmacy 21ª. Ed. Mack Publishing, 2005), na forma de formulações liofilizadas ou so- luções aquosas. Os transportadores, excipientes ou estabilizadores aceitáveis não são tóxicos para os destinatários nas dosagens e con- centrações utilizadas e podem compreender tampões, tais como fosfato, citrato e outros ácidos orgânicos; sais como cloreto de sódio; antioxi- dantes incluindo ácido ascórbico e metionina; conservantes (tais como cloreto de octadecildimetilbenzilamônio; cloreto de hexametônio; cloreto de benzalcônio, cloreto de benzetônio; fenol, álcool butílico ou benzílico; alquilparabenos, tais como metil ou propilparabeno; catecol; resorcinol; ciclo-hexanol; 3-pentanol; e m-cresol); polipeptídeos de baixo peso mo- lecular (menos de cerca de 10 resíduos); proteínas, tais como albumina sérica, gelatina ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos como polivi- nilpirrolidona; aminoácidos, tais como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina ou lisina; monossacarídeos, dissacarídeos e outros carboidratos, incluindo glicose, manose ou dextrinas; agentes quelantes como EDTA; açúcares como sacarose, manitol, trealose ou sorbitol;
contraíons formadores de sal, tais como sódio; complexos de metal (por exemplo, complexos Zn-proteína); e/ou tensoativos não iônicos, tais como TWEENTM, PLURONICSTM ou polietilenoglicol (PEG).
[00438] Os lipossomas contendo o anticorpo (por exemplo, anticorpo GUCY2c ou anticorpo CD3-GUCY2c biespecífico) são preparados por métodos conhecidos na técnica, tais como descritos em Epstein, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 3688,1985; Hwang, et al, Proc. Natl Acad. Sci. USA 77: 4030, 1980; e Patente Norte-americana 4.485.045 e
4.544.545. Lipossomas com tempo de circulação realçado são descritos na Pat. No. 5.013.556. Lipossomas particularmente úteis podem ser ge- rados pelo método de evaporação de fase reversa com uma composi- ção lipídica compreendendo fosfatidilcolina, colesterol e fosfatidiletano- lamina derivada com PEG (PEG-PE). Os lipossomas são extrusados através de filtros de tamanho de poro definido para produzir lipossomas com o diâmetro desejado.
[00439] Os ingredientes ativos também podem ser aprisionados em microcápsulas preparadas, por exemplo, por técnicas de coacervação ou por polimerização interfacial, por exemplo, microcápsulas de hidroxi- metilcelulose ou gelatina e microcápsulas de poli- (metilmetacrilato), respectivamente, em sistemas de distribuição de fármacos coloidais (por exemplo, lipossomas, microesferas de albumina, microemulsões, nanopartículas e nanocápsulas) ou em macroemulsões. Tais técnicas são descritas em Remington, The Science and Practice of Pharmacy 21ª. Ed. Mack Publishing, 2005.
[00440] Podem ser preparadas preparações de liberação prolon- gada. Exemplos adequados de preparações de liberação prolongada in- cluem matrizes semipermeáveis de polímeros hidrofóbicos sólidos con- tendo o anticorpo, matrizes essas que estão na forma de artigos molda- dos, por exemplo, filmes ou microcápsulas. Exemplos de matrizes de liberação prolongada incluem poliésteres, hidrogéis (por exemplo, poli
(2-hidroxietil-metacrilato), ou 'álcool poli (vinílico)), polilactídeos (Pa- tente Norte-americana 3.773.919), copolímeros de ácido L-glutâmico e 7 etil-L-glutamato, etileno-acetato de vinila não degradável, copolímeros degradáveis de ácido lático-ácido glicólico, como o LUPRON DEPOTTM (microesferas injetáveis compostas de copolímero de ácido lático-ácido glicólico e acetato de leuprolida), isobutirato de acetato de sacarose e ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico.
[00441] As formulações a serem usadas para administração in vivo devem ser estéreis. Isso é facilmente realizado, por exemplo, por filtra- ção através de membranas de filtração estéreis. Composições de anti- corpo terapêutico (por exemplo, anticorpo GUCY2c ou anticorpo CD3- GUCY2c biespecífico) são geralmente colocadas em um recipiente com uma porta de acesso estéril, por exemplo, um saco ou frasco de solução intravenosa com um tampão perfurável por uma agulha de injeção hipo- dérmica.
[00442] As composições de acordo com a presente invenção podem estar em formas de dosagem unitária, tais como comprimidos, pílulas, cápsulas, pós, grânulos, soluções ou suspensões ou supositórios, para administração oral, parenteral ou retal, ou administração por inalação ou insuflação.
[00443] Para preparar composições sólidas, como comprimidos, o in- grediente ativo principal é misturado com um transportador farmacêu- tico, por exemplo, ingredientes convencionais para comprimidos, tal como amido de milho, lactose, sacarose, sorbitol, talco, ácido esteárico, estearato de magnésio, fosfato dicálcico ou gomas e outros diluentes farmacêuticos, por exemplo, água, para formar uma composição de pré- formulação sólida contendo uma mistura homogênea de um composto da presente invenção, ou um sal não tóxico farmaceuticamente aceitá- vel do mesmo. Quando se refere a essas composições de pré-formula-
ção como homogêneas, significa que o ingrediente ativo é disperso uni- formemente por toda a composição de modo que a composição possa ser facilmente subdividida em formas de dosagem unitária igualmente eficazes, tais como comprimidos, pílulas e cápsulas. Esta composição de pré-formulação sólida é, então, subdividida em formas de dosagem unitária do tipo descrito acima, contendo de 0,1 a cerca de 500 mg do ingrediente ativo da presente invenção. Os comprimidos ou pílulas da nova composição podem ser revestidos ou de outro modo compostos para fornecer uma forma de dosagem que proporcione a vantagem da ação prolongada. Por exemplo, o comprimido ou pílula pode compreen- der uma dosagem interna e um componente de dosagem externa, sendo o último na forma de um envelope sobre o primeiro. Os dois com- ponentes podem ser separados por uma camada entérica que serve para resistir à desintegração no estômago e permite que o componente interno passe intacto para o duodeno ou seja retardado na liberação. Uma variedade de materiais pode ser usada para tais camadas ou re- vestimentos entéricos, tais materiais incluindo uma série de ácidos poli- méricos e misturas de ácidos poliméricos com materiais tais como goma-laca, álcool cetílico e acetato de celulose.
[00444] Os agentes tensoativos adequados incluem, em particular, agentes não iônicos, tais como polioxietilenossorbitanos (por exemplo, TweenTM 20, 40, 60, 80 ou 85) e outros sorbitanos (por exemplo, SpanTM 20, 40, 60, 80 ou 85). As composições com um agente tensoativo com- preenderão convenientemente entre 0,05 e 5% do agente tensoativo e podem estar entre 0,1 e 2,5%. Será apreciado que outros ingredientes podem ser adicionados, por exemplo, manitol ou outros veículos farma- ceuticamente aceitáveis, se necessário.
[00445] Emulsões adequadas podem ser preparadas usando emul- sões de gordura comercialmente disponíveis, tais como IntralipidTM, Li- posynTM, InfonutrolTM, LipofundinTM e LipiphysanTM. O ingrediente ativo pode ser dissolvido em uma composição de emulsão pré-misturada ou alternativamente pode ser dissolvido em um óleo (por exemplo, óleo de soja, óleo de cártamo, óleo de caroço de algodão, óleo de gergelim, óleo de milho ou óleo de amêndoa) e uma emulsão formada após a mistura com um fosfolipídio (por exemplo, fosfolipídios de ovo, fosfolipídios de soja ou lecitina de soja) e água. Será apreciado que outros ingredientes podem ser adicionados, por exemplo, glicerol ou glicose, para ajustar a tonicidade da emulsão. Emulsões adequadas conterão tipicamente até 20% de óleo, por exemplo, entre 5 e 20%. A emulsão de gordura pode compreender gotículas de gordura entre 0,1 e 1,0 μm, particularmente 0,1 e 0,5 μm, e ter um pH na faixa de 5,5 a 8,0.
[00446] As composições de emulsão podem ser aquelas preparadas pela mistura de um anticorpo (por exemplo, anticorpo GUCY2c ou anti- corpo CD3-GUCY2c biespecífico) com IntralipidTM ou seus componen- tes (óleo de soja, fosfolipídios de ovo, glicerol e água).
[00447] As composições para inalação ou insuflação incluem solu- ções e suspensões em solventes aquosos ou orgânicos farmaceutica- mente aceitáveis, ou suas misturas e pós. As composições líquidas ou sólidas podem conter excipientes farmaceuticamente aceitáveis ade- quados conforme estabelecido acima. Em algumas modalidades, as composições são administradas pela via respiratória oral ou nasal para efeito local ou sistêmico. As composições em solventes farmaceutica- mente aceitáveis preferivelmente estéreis podem ser nebulizadas pelo uso de gases. As soluções nebulizadas podem ser respiradas direta- mente do dispositivo de nebulização ou o dispositivo de nebulização pode ser conectado a uma máscara facial, tenda ou máquina de respi- ração de pressão positiva intermitente. As composições em solução, suspensão ou pó podem ser administradas, preferivelmente por via oral ou nasal, a partir de dispositivos que liberam a formulação de uma ma- neira apropriada.
[00448] As composições dentro do escopo da invenção incluem to- das as composições em que um anticorpo (anticorpo GUCY2c ou anti- corpo CD3-GUCY2c biespecífico) está presente em uma quantidade que é eficaz para atingir o efeito médico desejado para o tratamento do câncer. Embora as necessidades individuais possam variar de um paci- ente para outro, a determinação dos intervalos ideais de quantidades eficazes de todos os componentes está dentro da capacidade do mé- dico de experiência ordinária.
[00449] Exemplos de tais composições, bem como, como formular, também são descritos em uma seção anterior e abaixo. Em algumas modalidades, a composição compreende um ou mais anticorpos (por exemplo, anticorpo GUCY2c ou anticorpo CD3-GUCY2c biespecífico). Em algumas modalidades, o anticorpo GUCY2c ou anticorpo CD3- GUCY2c biespecífico é um anticorpo humano, um anticorpo humani- zado ou um anticorpo quimérico. Em algumas modalidades, o anticorpo GUCY2c ou anticorpo CD3-GUCY2c biespecífico compreende uma re- gião constante que é capaz de desencadear uma resposta imune dese- jada, tal como lise mediada por anticorpo ou ADCC. Em outras modali- dades, o anticorpo GUCY2c ou anticorpo CD3-GUCY2c biespecífico compreende uma região constante que não desencadeia uma resposta imune indesejada ou indesejável, tal como lise mediada por anticorpos ou ADCC.
[00450] Entende-se que as composições podem compreender mais de um anticorpo (por exemplo, anticorpo GUCY2c ou anticorpo CD3- GUCY2c biespecífico), tal como uma mistura de anticorpos GUCY2c ou anticorpos biespecíficos CD3-GUCY2c que reconhecem diferentes epi- topos de GUCY2c ou CD3 e GUCY2c). Outras composições exemplares compreendem mais de um anticorpo GUCY2c ou anticorpo CD3- GUCY2c biespecífico, que reconhece o(s) mesmo(s) epitopo(s) ou dife- rentes espécies de anticorpos GUCY2c, anticorpos biespecíficos CD3-
GUCY2c ou que se ligam a diferentes epitopos de GUCY2c (por exem- plo, GUCY2cA humano ) ou CD3 e GUCY2c (CD3 e GUCY2c huma- nos).
[00451] Em algumas modalidades, o anticorpo GUCY2c ou anticorpo CD3-GUCY2c biespecífico pode ser administrado em combinação com a administração de um ou mais agentes terapêuticos adicionais. Estes incluem, porém, não estão limitados à administração de um agente bio- terapêutico e/ou um agente quimioterapêutico, tal como, porém, não li- mitado a, uma vacina, uma terapia baseada em células CAR-T, radiote- rapia, uma terapia com citocinas, um anticorpo CD3 biespecífico, um inibidor de outras vias imunossupressoras, um inibidor da angiogênese, um ativador de células T, um inibidor de uma via metabólica, um inibidor de mTOR, um inibidor de uma via de adenosina, um inibidor de tirosina cinase incluindo, porém, não se limitando a Inlyta, inibidores de ALK e sunitinibe, um inibidor de BRAF, um modificador epigenético, um inibidor de IDO1, um inibidor de JAK, um inibidor de STAT, um inibidor de cinase dependente de ciclina, um agente bioterapêutico (incluindo, porém, não se limitando a anticorpos para VEGF, VEGFR, EGFR, Her2/neu, outros receptores do fator de crescimento, CD40, CD-40L, CTLA-4, OX-40, 4- 1BB, TIGIT e ICOS), um agente imunogênico (por exemplo, células can- cerosas atenuadas, antígenos tumorais, células apresentadoras de an- tígenos, tais como células dendríticas pulsadas com antígeno derivado de tumor ou ácidos nucleicos, citocinas imunoestimuladoras (por exem- plo, IL-2, IFNα2, GM-CSF) e células transfectadas com genes que codi- ficam citocinas imunoestimuladoras, tal como, porém, não se limitando a GM-CSF).
[00452] Exemplos de agentes bioterapêuticos incluem anticorpos te- rapêuticos, agentes moduladores imunes e células imunes terapêuticas.
[00453] Os anticorpos terapêuticos podem ter especificidade contra uma variedade de diferentes antígenos.
Por exemplo, os anticorpos te- rapêuticos podem ser direcionados a um antígeno associado a tumor, de modo que a ligação do anticorpo ao antígeno promova a morte da célula que expressa o antígeno.
Em outro exemplo, os anticorpos tera- pêuticos podem ser direcionados a um antígeno (por exemplo, PD-1) em uma célula imune, de modo que a ligação do anticorpo evite a sub- regulação da atividade da célula que expressa o antígeno (e, assim, promove a atividade da célula que expressa o antígeno). Em algumas situações, um anticorpo terapêutico pode funcionar por meio de vários mecanismos diferentes (por exemplo, pode tanto i) promover a morte da célula que expressa o antígeno quanto ii) evitar que o antígeno cause a subregulação da atividade das células imunes em contato com a célula que expressa o antígeno). Os anticorpos terapêuticos podem ser direcionados, por exemplo, aos antígenos listados a seguir.
Para alguns antígenos, anti- corpos exemplares direcionados ao antígeno também estão incluídos abaixo (entre colchetes/parênteses após o antígeno). Os antígenos a seguir também podem ser referidos como "antígenos alvo" ou seme- lhantes aqui.
Os antígenos alvo para anticorpos terapêuticos aqui in- cluem, por exemplo: 4-1BB (por exemplo, utomilumabe); 5T4; A33; re- ceptor 1 de alfa-folato (por exemplo, mirvetuximabe soravtansina); Alk- 1; BCMA [por exemplo, PF-06863135 (veja, US9969809)]; BTN1A1 (por exemplo, veja, WO2018222689); CA-125 (por exemplo, abagovomabe); Carboanidrase IX; CCR2; CCR4 (por exemplo, mogamulizumabe); CCR5 (por exemplo, leronlimabe); CCR8; CD3 [por exemplo, blinatu- momabe (CD3/CD19 biespecífico), PF-06671008 (CD3/P-caderina bi- específico), PF-06863135 (CD3/BCMA biespecífico), CD19 (por exem- plo, blinatumomabe, MOR208); CD20 (por exemplo, ibritumomabe, tiu- xetano, obinutuzumabe, ofatumumabe, rituximabe, ublituximabe); CD22 (inotuzumabe ozogamicina, moxetumomabe pasudotox); CD25; CD28;
CD30 (por exemplo, brentuximabe vedotina); CD33 (por exemplo, gen- tuzumabe ozogamicina); CD38 (por exemplo, daratumumabe, isatuxi- mabe), CD40; CD-40L; CD44v6; CD47; CD52 (por exemplo, alemtuzu- mabe); CD63; CD79 (por exemplo, polatuzumabe vedotina); CD80; CD123; CD276/B7-H3 (por exemplo, omburtamabe); CDH17; CEA; ClhCG; CTLA-4 (por exemplo, ipilimumabe, tremelimumabe), CXCR4; desmogleína 4; DLL3 (por exemplo, rovalpituzumabe tesirina); DLL4; E- caderina; EDA; EDB; EFNA4; EGFR (por exemplo, cetuximabe, despa- tuxizumabe mafodotina, necitumumabe, panitumumabe); EGFRvIII; En- dosialina; EpCAM (por exemplo, oportuzumabe monatox); FAP; Recep- tor de Acetilcolina Fetal; FLT3 (por exemplo, veja WO2018/220584); GD2 (por exemplo, dinutuximabe, 3F8); GD3; GITR; GloboH; GM1; GM2; GUCY2C (por exemplo, PF-07062119); HER2/neu [por exemplo margetuximabe, pertuzumabe, trastuzumabe; ado-trastuzumabe entan- sina, trastuzumabe duocarmazina, PF-06804103 (veja, US8828401)]; HER3; HER4; ICOS; IL-10; ITG-AvB6; LAG-3 (por exemplo, relatli- mabe); Lewis-Y; LG; Ly-6; M-CSF [por exemplo, PD-0360324 (veja, US7326414)]; MCSP; mesotelina; MUC1; MUC2; MUC3; MUC4; MUC5AC; MUC5B; MUC7; MUC16; Notch1; Notch3; Nectina-4 (por exemplo, enfortumabe vedotina); OX40 [por exemplo, PF-04518600 (veja, US7960515)]; P-Cadereína [por exemplo, PF-06671008 (veja, WO2016/001810)]; PCDHB2; PD-1 [por exemplo, BCD-100, camrelizu- mabe, cemiplimabe, genolimzumabe (CBT-501), MEDI0680, nivolu- mabe, pembrolizumabe, RN888 (veja, WO2016/092419), sintilimabe, espartalizumabe, STI-A1110, tislelizumabe, TSR-042]; PD-L1 (por exemplo, atezolizumabe, durvalumabe, BMS-936559 (MDX-1105) ou LY3300054); PDGFRA (por exemplo, olaratumabe); Antígeno de Célu- las Plasmáticas; PolySA; PSCA; PSMA; PTK7 [por exemplo, PF- 06647020 (veja, US9409995)]; Ror1; SAS; SCRx6; SLAMF7 (por exem- plo, elotuzumabe); SHH; SIRPa (por exemplo, ED9, Effi-DEM); STEAP;
TGF-beta; TIGIT; TIM-3; TMPRSS3; precursor de TNF-alfa; TROP-2 (por exemplo, sacituzumabe govitecano); TSPAN8; VEGF (por exem- plo, bevacizumabe, brolucizumabe); VEGFR1 (por exemplo, ranibizu- mabe); VEGFR2 (por exemplo, ramucirumabe, ranibizumabe); Wue-1.
[00454] Os anticorpos terapêuticos podem ter qualquer formato ade- quado. Por exemplo, os anticorpos terapêuticos podem ter qualquer for- mato conforme descrito em outro lugar aqui. Em algumas modalidades, um anticorpo terapêutico pode ser um anticorpo nu. Em algumas moda- lidades, um anticorpo terapêutico pode ser ligado a um fármaco/agente (também conhecido como um "conjugado anticorpo-fármaco" (ADC)). Em algumas modalidades, um anticorpo terapêutico contra um antígeno particular pode ser incorporado em um anticorpo multiespecífico (por exemplo, um anticorpo biespecífico).
[00455] Em algumas modalidades, um anticorpo direcionado a um antígeno pode ser conjugado para um fármaco/agente. As moléculas de anticorpo-fármaco ligadas também são chamadas de “conjugados anti- corpo-fármaco” (ADCs). Fármacos/agentes podem ser ligados a um an- ticorpo direta ou indiretamente por meio de um ligante. Mais comu- mente, os fármacos tóxicos estão ligados a um anticorpo, de modo que a ligação do ADC ao respectivo antígeno promove a morte de células que expressam o antígeno. Por exemplo, ADCs que estão ligados a fár- macos tóxicos são particularmente úteis para direcionar antígenos as- sociados a tumor, a fim de promover a morte de células tumorais que expressam os antígenos associados ao tumor. Em outras modalidades, os agentes que podem estar ligados a um anticorpo podem ser, por exemplo, um agente imunomodulador (por exemplo, para modular a ati- vidade de células imunes na vizinhança do ADC), um agente de image- amento (por exemplo, para facilitar a imagem do ADC em um indivíduo ou uma amostra biológica do indivíduo), ou um agente para aumentar a meia-vida sérica ou bioatividade do anticorpo.
[00456] Os métodos para conjugar o agente citotóxico ou outros agentes terapêuticos a anticorpos foram descritos em várias publica- ções. Por exemplo, a modificação química pode ser feita nos anticorpos através de aminas da cadeia lateral de lisina ou através de grupos sulfi- drila de cisteína ativados pela redução de ligações dissulfeto interca- deias para que a reação de conjugação ocorra. Veja, por exemplo, Ta- naka et al., FEBS Letters 579: 2092-2096, 2005, e Gentle et al., Biocon- jugate Chem. 15:658-663, 2004. Resíduos de cisteína reativos modifi- cados em sítios específicos de anticorpos para conjugação de fármaco específico com estequiometria definida também foram descritos. Veja, por exemplo, Junutula et al., Nature Biotechnology, 26:925-932, 2008. Conjugação usando um marcador contendo glutamina doadora de acila ou uma glutamina endógena tornada reativa (isto é, a capacidade de formar uma ligação covalente como um doador de acila) por modificação polipeptídica na presença de transglutaminase e uma amina (por exem- plo, um agente citotóxico compreendendo ou ligado a uma amina rea- tiva) também é descrito nos pedidos internacionais WO2012/059882 e WO2015015448. Em algumas modalidades, um ADC pode ter qualquer um dos aspectos ou características dos ADCs fornecidos em WO2016166629, que é incorporado por meio deste por referência para todos os fins.
[00457] Fármacos/agentes que podem ser ligados a um anticorpo no formato de ADC podem incluir, por exemplo, agentes citotóxicos, agen- tes imunomoduladores, agentes de imageamento, proteínas terapêuti- cas, biopolímeros ou oligonucleotídeos.
[00458] Os agentes citotóxicos exemplares que podem ser incorpo- rados em um ADC incluem uma antraciclina, uma auristatina, uma do- lastatina, uma combretastatina, uma duocarmicina, um dímero de pirro- lobenzodiazepina, um dímero de indolino-benzodiazepina, uma enedi- ina, uma geldanamicina, uma maitansina, uma puromicina, um taxano,
um vinca alcaloide, uma camptotecina, uma tubulisina, uma hemiaster- lina, uma espliceostatina, uma pladienolida e estereoisômeros, isóste- ros, análogos ou seus derivados.
[00459] Agentes imunomoduladores exemplares que podem ser in- corporados em um ADC incluem ganciclovier, etanercepte, tacrolimus, sirolimus, voclosporina, ciclosporina, rapamicina, ciclofosfamida, azati- oprina, micofenolato mofetila, metotrextrato, glicocorticóides e seus análogos, citocinas, fatores de crescimento de células tronco, linfotoxi- nas, fator de necrose tumoral (TNF), fatores hematopoéticos, interleuci- nas (por exemplo, interleucina-1 (IL-1), IL-2, IL-3, IL-6, IL-10, IL-12, IL- 18 e IL-21), fatores estimuladores de colônias (por exemplo, fator esti- mulador de colônias de granulócitos (G-CSF) e fator estimulador de co- lônias de granulócitos e macrófagos (GM-CSF)), interferons (por exem- plo, interferons-.alfa., -.beta. e -.gamma.), o fator de crescimento de cé- lulas tronco designado "fator S 1", eritropoietina e trombopoietina, ou uma combinação dos mesmos.
[00460] Agentes de imageamento exemplares que podem ser incluí- dos em um ADC incluem fluoresceína, rodamina, fósforos de lantaní- deos e seus derivados, ou um radioisótopo ligado a um quelador. Exem- plos de fluoróforos incluem, porém, não estão limitados a, isotiocianato de fluoresceína (FITC) (por exemplo, 5-FITC), amidita de fluoresceína (FAM) (por exemplo, 5-FAM), eosina, carboxifluoresceína, eritrosina, Alexa Fluor.RTM. (por exemplo, Alexa 350, 405, 430, 488, 500, 514, 532, 546, 555, 568, 594, 610, 633, 647, 660, 680, 700 ou 750), carboxi- tetrametilrodamina (TAMRA) (por exemplo, 5,-TAMRA), tetrametilroda- mina (TMR) e sulforrodamina (SR) (por exemplo, SR101). Exemplos de quelantes incluem, porém, não estão limitados a, ácido 1,4,7,10-tetra- azaciclododecano-N,N',N'',N'''-tetra-acético (DOTA) ácido, 1,4,7-triaza- ciclononano-1,4,7-triacético (NOTA), 1,4,7-triazaciclononano, ácido 1-
glutárico-ácido 4,7-acético (deferoxamina), ácido dietilenotriamino- penta-acético (DTPA) e ácido 1,2-bis (o-aminofenóxi)etano-N,N,N',N'- tetra-acético) (BAPTA).
[00461] Proteínas terapêuticas exemplares que podem ser incluídas em um ADC incluem uma toxina, um hormônio, uma enzima e um fator de crescimento.
[00462] Polímeros biocompatíveis exemplares que podem ser incor- porados em um ADC incluem polímeros solúveis em água, tais como polietilenoglicol (PEG) ou seus derivados e polímeros biocompatíveis contendo zwitterion (por exemplo, um polímero contendo fosforilcolina).
[00463] Polímeros biocompatíveis exemplares que podem ser incor- porados em um ADC incluem oligonucleotídeos antissenso.
[00464] Em algumas modalidades, um anticorpo direcionado a um antígeno fornecido aqui pode ser incorporado em uma molécula de an- ticorpo biespecífico. Anticorpos biespecíficos são anticorpos monoclo- nais que têm especificidade de ligação para pelo menos dois antígenos diferentes.
[00465] Os agentes imunomoduladores incluem uma variedade de diferentes tipos de moléculas que podem estimular uma resposta imune em um indivíduo, tais como agonistas do receptor de reconhecimento padrão (PRR), citocinas imunoestimuladoras e vacinas contra o câncer.
[00466] Receptores de reconhecimento padrão (PRRs) são recepto- res que são expressos por células do sistema imunológico e que reco- nhecem uma variedade de moléculas associadas a patógenos e/ou da- nos ou morte celular. Os PRRs estão envolvidos tanto na resposta imune inata quanto na resposta imune adaptativa. Os agonistas de PRR podem ser usados para estimular a resposta imune em um indivíduo. Existem várias classes de moléculas PRR, incluindo receptores do tipo Toll (TLRs), receptores do tipo RIG-I (RLRs), receptores do tipo domínio de oligomerização de ligação ao nucleotídeo (NOD) (NLRs), receptores de lectina do tipo C (CLRs) e Estimulator da proteína dos Genes de In- terferon (STING).
[00467] Os termos "TLR" e "receptor do tipo Toll" referem-se a qual- quer receptor do tipo Toll. Receptores do tipo Toll são receptores envol- vidos na ativação de respostas imunes. Os TLRs reconhecem, por exemplo, padrões moleculares associados a patógenos (PAMPs) ex- pressos em micróbios, bem como padrões moleculares associados a danos endógenos (DAMPs), que são liberados de células mortas ou em vias de morte.
[00468] As moléculas que ativam os TLRs (e, assim, ativam as res- postas imunes) são referidas aqui como "agonistas de TLR". Os agonis- tas de TLR podem incluir, por exemplo, moléculas pequenas (por exem- plo, molécula orgânica tendo um peso molecular sob cerca de 1000 Dal- tons), bem como moléculas grandes (por exemplo, oligonucleotídeos e proteínas). Alguns agonistas de TLR são específicos para um único tipo de TLR (por exemplo, TLR3 ou TLR9), enquanto alguns agonistas de TLR ativam dois ou mais tipos de TLR (por exemplo, ambos TLR7 e TLR8).
[00469] Agonistas de TLR exemplares fornecidos aqui incluem ago- nistas de TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8 e TLR9.
[00470] Agonistas de TLR de molécula pequena exemplares incluem aqueles descritos em, por exemplo, Patente Norte-americana Nos.
4.689.338; 4.929.624; 5.266.575; 5.268.376; 5.346.905; 5.352.784;
5.389.640; 5.446.153; 5.482.936; 5.756.747; 6.110.929; 6.194.425;
6.331.539; 6.376.669; 6.451.810; 6.525.064; 6.541.485; 6.545.016;
6.545.017; 6.573.273; 6.656.938; 6.660.735; 6.660.747; 6.664.260;
6.664.264; 6.664.265; 6.667.312; 6.670.372; 6.677.347; 6.677.348;
6.677.349; 6.683.088; 6.756.382; 6.797.718; 6.818.650; e 7.7091.214; Publicação da Patente Norte-americana Nos. 2004/0091491, 2004/0176367, e 2006/0100229; e Publicação Internacional Nos. WO
2005/18551, WO 2005/18556, WO 2005/20999, WO 2005/032484, WO 2005/048933, WO 2005/048945, WO 2005/051317, WO 2005/051324, WO 2005/066169, WO 2005/066170, WO 2005/066172, WO 2005/076783, WO 2005/079195, WO 2005/094531, WO 2005/123079, WO 2005/123080, WO 2006/009826, WO 2006/009832, WO 2006/026760, WO 2006/028451, WO 2006/028545, WO 2006/028962, WO 2006/029115, WO 2006/038923, WO 2006/065280, WO 2006/074003, WO 2006/083440, WO 2006/086449, WO 2006/091394, WO 2006/086633, WO 2006/086634, WO 2006/091567, WO 2006/091568, WO 2006/091647, WO 2006/093514, e WO 2006/098852.
[00471] Exemplos adicionais de agonistas de TLR de molécula pe- quena incluem certos derivados de purina (tais como aqueles descritos nas Patentes Norte-americana 6.376.501 e 6.028.076), certos derivados de imidazoquinolina amida (tais como aqueles descritos na Patente Norte-americana 6.069.149), certos derivados de imidazopiridina (tais como aqueles descritos na Patente Norte-americana 6.518.265), certos derivados de benzimidazol (tais como aqueles descritos na Patente Norte-americana 6.387.938), certos derivados de uma 4-aminopirimi- dina fundida a um anel heterocíclico contendo nitrogênio de cinco mem- bros (tais como derivados de adenina descritos na Patente Norte-ame- ricana Nos. 6.376.501; 6.028.076 e 6.329.381; e em WO 02/08905) e certos derivados de 3-.beta.-D-ribofuranosiltiazolo [4,5-d]pirimidina (tais como aqueles descritos na Publicação Norte-americana No. 2003/0199461), e certos compostos imunopotencializadores de molécu- las pequenas, tais como aqueles descritos, por exemplo, na Publicação de Patente Norte-americana No. 2005/0136065.
[00472] Agonistas de TLR de molécula grande exemplares incluem como sequências de oligonucleotídeos. Algumas sequências de oligo-
nucleotídeos do agonista de TLR contêm dinucleotídeos citosina-gua- nina (CpG) e são descritas, por exemplo, na Patente Norte-americana Nos. 6.194.388; 6.207.646; 6.239.116; 6.339.068; e 6.406.705. Alguns oligonucleotídeos contendo CpG podem incluir motivos estruturais imu- nomoduladores sintéticos, tais como aqueles descritos, por exemplo, na Patente Norte-americana Nos. 6.426.334 e 6.476.000. Outras sequên- cias de nucleotídeos do agonista de TLR não têm sequências de CpG e são descritas, por exemplo, na Publicação de Patente Internacional No. WO 00/75304. Ainda outras sequências de nucleotídeos do agonista de TLR incluem RNA de fita simples rico em guanosina e uridina (ssRNA), tais como aqueles descritos, por exemplo, em Heil et al, Science, vol. 303, pp. 1526-1529, Mar. 5, 2004.
[00473] Outros agonistas de TLR incluem moléculas biológicas, tais como fosfatos de aminoalquil glicosaminida (AGPs) e são descritos, por exemplo, nas Patente Norte-americana Nos. 6.113.918; 6.303.347;
6.525.028; e 6.649.172.
[00474] Os agonistas de TLR também incluem patógenos inativados ou suas frações, que podem ativar vários tipos diferentes de receptor de TLR. Agonistas de TLR derivados de patógenos exemplares incluem BCG, extrato de mycobacterium obuense, Talimogene laherparepvec (T-Vec) (derivado de HSV-1) e Pexa-Vec (derivado do vírus de vacina).
[00475] Em algumas modalidades, um agonista de TLR pode ser um anticorpo agonista que se liga especificamente ao TLR.
[00476] A seguir, são fornecidas breves descrições de vários TLRs, bem como de agonistas de TLR. A listagem de um agonista de TLR abaixo para TLR particular não deve ser interpretada para indicar que um determinado agonista de TLR necessariamente apenas ativa esse TLR (por exemplo, certas moléculas podem ativar vários tipos de TLR, ou mesmo várias classes de PRR). Por exemplo, algumas moléculas fornecidas abaixo como um agonista de TLR4 exemplar também podem ser um agonista de TLR5.
[00477] Os termos "TLR1" e "receptor 1 do tipo Toll" referem-se a qualquer forma do receptor TLR1, bem como variantes, isoformas e es- pécies homólogas que mantêm pelo menos uma parte da atividade de TLR1. A menos que indicado de forma diferente, tal como por referência específica ao TLR1 humano, TLR1 inclui todas as espécies mammaila de TLR1 de sequência nativa, por exemplo, humano, macaco e camun- dongo. Um TLR1 humano exemplar é fornecido sob UniProt Entry No. Q15399.
[00478] "Agonista de TLR1", quando aqui usado, significa qualquer molécula, que ao se ligar ao TLR1, (1) estimula ou ativa TLR1, (2) re- alça, aumenta, promove, induz ou prolonga uma atividade, função ou presença de TLR1, ou (3) realça, aumenta, promove ou induz a expres- são de TLR1. Os agonistas de TLR1 úteis em qualquer um dos métodos de tratamento, medicamentos e usos da presente invenção incluem, por exemplo, lipoproteínas bacterianas e seus derivados que se ligam ao TLR1.
[00479] Exemplos de agonistas de TLR1 que são úteis nos métodos de tratamento, medicamentos e usos da presente invenção incluem, por exemplo, lipoproteínas bacterianas e seus derivados, tais como SPM- 105 (derivado de micobactérias autoclavadas), OM-174 (derivado de li- pídeo A) , OmpS1 (porina de Salmonella typhi), OmpS1 (porina de Sal- monella typhi), OspA (de Borrelia burgdorferi), MALP-2 (lipopeptídeo ati- vador de macrófago micoplasmático-2kD), STF (fator de tuberculose so- lúvel), CU-T12-9, Diprovocim e lipopeptídeos derivados de componen- tes da parede celular, tais como PAM2CSK4, PAM3CSK4 e PAM3Cys.
[00480] TLR1 pode formar um heterodímero com TLR2 e, conse- quentemente, muitos agonistas de TLR1 também são agonistas de TLR2.
[00481] Os termos "TLR2" e "receptor 2 do tipo Toll" referem-se a qualquer forma do receptor TLR2, bem como variantes, isoformas e es- pécies homólogas que mantêm pelo menos uma parte da atividade de TLR2. A menos que indicado de forma diferente, tal como por referência específica ao TLR2 humano, TLR2 inclui todas as espécies mammaila de TLR2 de sequência nativa, por exemplo, humano, macaco e camun- dongo. Um TLR2 humano exemplar é fornecido sob UniProt Entry No. O60603.
[00482] "Agonista de TLR2", quando aqui usado, significa qualquer molécula que, ao se ligar ao TLR2, (1) estimula ou ativa TLR2, (2) re- alça, aumenta, promove, induz ou prolonga uma atividade, função ou presença de TLR2, ou (3) realça, aumenta, promove ou induz a expres- são de TLR2. Agonistas de TLR2 úteis em qualquer um dos métodos de tratamento, medicamentos e usos da presente invenção incluem, por exemplo, lipoproteínas bacterianas e seus derivados que se ligam ao TLR2.
[00483] Exemplos de agonistas de TLR2 que são úteis nos métodos de tratamento, medicamentos e usos da presente invenção incluem, por exemplo, lipoproteínas bacterianas (por exemplo, lipoproteínas diacila- das) e seus derivados, tais como SPM-105 (derivado de micobactérias autoclavadas), OM-174 (derivado de lipídeo A), OmpS1 (porina de Sal- monella typhi), OmpS1 (porina de Salmonella typhi), OspA (de Borrelia burgdorferi), MALP-2 (lipopeptídeo ativador de macrófago micoplasmá- tico-2kD), STF (fator de tuberculose solúvel), CU-T12-9, Diprovocim, Amplivante e lipopeptídeos derivados de componentes da parede celu- lar tais como PAM2CSK4, PAM3CSK4 e PAM3Cys.
[00484] TLR2 pode formar um heterodímero com TLR1 ou TLR6 e, consequentemente, muitos agonistas de TLR2 também são agonistas de TLR1 ou TLR6.
[00485] Os termos "TLR3" e "receptor do tipo Toll 3" referem-se a qualquer forma do receptor TLR3, bem como variantes, isoformas e ho- mólogos de espécies que mantêm pelo menos uma parte da atividade de TLR3. A menos que indicado de forma diferente, tal como por refe- rência específica ao TLR3 humano, TLR3 inclui todas as espécies mam- maila de TLR3 de sequência nativa, por exemplo, humano, macaco e camundongo. Um TLR3 humano exemplar é fornecido sob UniProt Entry No. O15455.
[00486] "Agonista de TLR3", quando aqui usado, significa qualquer molécula que, ao se ligar ao TLR3, (1) estimula ou ativa TLR3, (2) re- alça, aumenta, promove, induz ou prolonga uma atividade, função ou presença de TLR3, ou (3) realça, aumenta, promove ou induz a expres- são de TLR3. Os agonistas de TLR3 úteis em qualquer um dos métodos de tratamento, medicamentos e usos da presente invenção incluem, por exemplo, ligantes de ácido nucleico que se ligam ao TLR3.
[00487] Exemplos de agonistas de TLR3 que são úteis nos métodos de tratamento, medicamentos e usos da presente invenção incluem li- gantes de TLR3, tais como dsRNA sintético, ácido polinossínico-policiti- dílico ["poli(I:C)"] (disponível de, por exemplo, InvivoGen em prepara- ções de alto peso molecular (HMW) e de baixo peso molecular (LMW)), ácido poliadenílico-poliuridílico ["poli (A:U)"] (disponível em, por exem- plo, InvivoGen), poliICLC (veja, Levy et al., Journal of Infectious Disea- ses, vol. 132, no. 4, pp. 434-439, 1975), Ampligen (veja, Jasani et al., Vaccine, vol. 27, no. 25-26, pp. 3401-3404, 2009), Hiltonol, Rintatoli- mode, e RGC100 (veja, Naumann et al., Clinical and Developmental Immunology, vol. 2013, artigo ID 283649).
[00488] Os termos "TLR4" e "receptor do tipo Toll 4" referem-se a qualquer forma do receptor TLR4, bem como variantes, isoformas e ho- mólogos de espécies que mantêm pelo menos uma parte da atividade de TLR4. A menos que indicado de forma diferente, tal como por refe-
rência específica ao TLR4 humano, TLR4 inclui todas as espécies mam- maila de TLR4 de sequência nativa, por exemplo, humano, macaco e camundongo. Um TLR4 humano exemplar é fornecido sob UniProt Entry No. O00206.
[00489] "Agonista de TLR4", quando aqui usado, significa qualquer molécula que, ao se ligar ao TLR4, (1) estimula ou ativa TLR4, (2) re- alça, aumenta, promove, induz ou prolonga uma atividade, função ou presença de TLR4, ou (3) realça, aumenta, promove ou induz a expres- são de TLR4. Os agonistas de TLR4 úteis em qualquer um dos métodos de tratamento, medicamentos e usos da presente invenção incluem, por exemplo, lipopolissacarídeos bacterianos (LPS) e seus derivados que se ligam ao TLR4.
[00490] Exemplos de agonistas de TLR4 que são úteis nos métodos de tratamento, medicamentos e usos da presente invenção incluem, por exemplo, lipopolissacarídeos bacterianos (LPS) e seus derivados, tais como B:0111 (Sigma), monofosforil lipídio A (MPLA), 3DMPL (MPL 3- O-desacilado), GLA-AQ, G100, AS15, ASO2, GSK1572932A (GlaxoS- mithKline, UK).
[00491] Os termos "TLR5" e "receptor do tipo Toll 5" referem-se a qualquer forma do receptor TLR5, bem como variantes, isoformas e ho- mólogos de espécies que mantêm pelo menos uma parte da atividade de TLR5. A menos que indicado de forma diferente, tal como por refe- rência específica ao TLR5 humano, TLR5 inclui todas as espécies mam- maila de TLR5 de sequência nativa, por exemplo, humano, macaco e camundongo. Um TLR5 humano exemplar é fornecido sob UniProt Entry No. O60602.
[00492] "Agonista de TLR5", quando aqui usado, significa qualquer molécula que, ao se ligar ao TLR5, (1) estimula ou ativa TLR5, (2) re- alça, aumenta, promove, induz ou prolonga uma atividade, função ou presença de TLR5, ou (3) realça, aumenta, promove ou induz a expres- são de TLR5. Agonistas de TLR5 úteis em qualquer um dos métodos de tratamento, medicamentos e usos da presente invenção incluem, por exemplo, flagelinas bacterianas e seus derivados que se ligam ao TLR5.
[00493] Exemplos de agonistas de TLR5 que são úteis nos métodos de tratamento, medicamentos e usos da presente invenção incluem, por exemplo, flagelina bacteriana purificada de B. subtilis, flagelina purifi- cada de P. aeruginosa, flagelina purificada de S. typhimurium e flagelina recombinante (todos disponíveis de InvivoGen), entolimode (CBLB502; um derivado de flagelina otimizado farmacologicamente).
[00494] Os termos "TLR6" e "receptor do tipo Toll 6" referem-se a qualquer forma do receptor TLR6, bem como variantes, isoformas e es- pécies homólogas que mantêm pelo menos uma parte da atividade de TLR6. A menos que indicado de forma diferente, tal como por referência específica ao TLR6 humano, TLR6 inclui todas as espécies mammaila de TLR6 de sequência nativa, por exemplo, humano, macaco e camun- dongo. Um TLR6 humano exemplar é fornecido sob UniProt Entry No. Q9Y2C9.
[00495] "Agonista de TLR6", quando aqui usado, significa qualquer molécula que, ao se ligar ao TLR6, (1) estimula ou ativa TLR6, (2) re- alça, aumenta, promove, induz ou prolonga uma atividade, função ou presença de TLR6, ou (3) realça, aumenta, promove ou induz a expres- são de TLR6. Os agonistas de TLR6 úteis em qualquer um dos métodos de tratamento, medicamentos e usos da presente invenção incluem, por exemplo, lipopeptídeos bacterianos e seus derivados que se ligam ao TLR6.
[00496] Exemplos de agonistas de TLR6 que são úteis nos métodos de tratamento, medicamentos e usos da presente invenção incluem, por exemplo, muitos dos agonistas de TLR2 fornecidos acima, uma vez que
TLR2 e TLR6 podem formar um heterodímero. TLR6 também pode for- mar um heterodímero com TLR4 e os agonistas de TLR6 podem incluir vários agonistas de TLR4 fornecidos acima.
[00497] Os termos "TLR7" e "receptor do tipo Toll 7" referem-se a qualquer forma do receptor TLR7, bem como variantes, isoformas e es- pécies homólogas que mantêm pelo menos uma parte da atividade de TLR7. A menos que indicado de forma diferente, tal como por referência específica ao TLR7 humano, TLR7 inclui todas as espécies mammaila de TLR7 de sequência nativa, por exemplo, humano, macaco e camun- dongo. Um TLR7 humano exemplar é fornecido sob UniProt Entry No. Q9NYK1.
[00498] "Agonista de TLR7", quando aqui usado, significa qualquer molécula que, ao se ligar ao TLR7, (1) estimula ou ativa TLR7, (2) re- alça, aumenta, promove, induz ou prolonga uma atividade, função ou presença de TLR7, ou (3) realça, aumenta, promove ou induz a expres- são de TLR7. Os agonistas de TLR7 úteis em qualquer um dos métodos de tratamento, medicamentos e usos da presente invenção incluem, por exemplo, ligantes de ácido nucleico que se ligam ao TLR7.
[00499] Exemplos de agonistas de TLR7 que são úteis nos métodos de tratamento, medicamentos e usos da presente invenção incluem ("ss")RNA de fita simples recombinante, compostos de imidazoquino- lina, tais como imiquimode (R837), gardiquimode e resiquimode (R848); Loxoribina (7-alil-7,8-di-hidro-8-oxo-guanosina) e compostos relaciona- dos; 7-Tia-8-oxoguanosina, 7-deazaguanosina e análogos de guano- sina relacionados; ANA975 (Anadys Pharmaceuticals) e compostos re- lacionados; SM-360320 (Sumimoto); 3M-01, 3M-03, 3M-852 e 3M-S- 34240 (3M Pharmaceuticals); GSK2245035 (GlaxoSmithKline; uma mo- lécula de 8-oxoadenina), AZD8848 (AstraZeneca; uma molécula de 8- oxoadenina), MEDI9197 (Medimmune; anteriormente 3M-052),
ssRNA40 e análogos de adenosina tal como UC-1V150 (Jin et al., Bio- organic Chem Lett (2006) 16:4559-4563, composto 4). Muitos agonistas de TLR7 também são agonistas de TLR8.
[00500] Os termos "TLR8" e "receptor do tipo Toll 8" referem-se a qualquer forma do receptor TLR8, bem como variantes, isoformas e es- pécies homólogas que mantêm pelo menos uma parte da atividade de TLR8. A menos que indicado de forma diferente, tal como por referência específica ao TLR8 humano, TLR8 inclui todas as espécies mammaila de TLR8 de sequência nativa, por exemplo, humano, macaco e camun- dongo. Um exemplo de TLR8 humano é fornecido sob UniProt Entry No. Q9NR97.
[00501] "Agonista de TLR8", quando aqui usado, significa qualquer molécula, que ao se ligar ao TLR8, (1) estimula ou ativa TLR8, (2) re- alça, aumenta, promove, induz ou prolonga uma atividade, função ou presença de TLR8, ou (3) realça, aumenta, promove ou induz a expres- são de TLR8. Os agonistas de TLR8 úteis em qualquer um dos métodos de tratamento, medicamentos e usos da presente invenção incluem, por exemplo, ligantes de ácido nucleico que se ligam ao TLR8.
[00502] Exemplos de agonistas de TLR8 que são úteis nos métodos de tratamento, medicamentos e usos da presente invenção incluem ssRNA de fita simples recombinante, imiquimode (R837), gardiquimode, resiquimode (R848), 3M-01, 3M-03, 3M-852 e 3M-S-34240 (3M Phar- maceuticals); GSK2245035 (GlaxoSmithKline; uma molécula de 8-oxo- adenina), AZD8848 (AstraZeneca; uma molécula de 8-oxoadenina), MEDI9197 (Medimmune; anteriormente 3M-052), Poly-G10, Motoli- mode e vários agonistas de TLR7 fornecidos acima (como mencionado anteriormente, muitos agonistas de TLR7 também são agonistas de TLR8).
[00503] Os termos "TLR9" e "receptor do tipo Toll 9" referem-se a qualquer forma do receptor TLR9, bem como variantes, isoformas e es- pécies homólogas que mantêm pelo menos uma parte da atividade de TLR9. A menos que indicado de forma diferente, tal como por referência específica ao TLR9 humano, TLR9 inclui todas as espécies mammaila de TLR9 de sequência nativa, por exemplo, humano, macaco e camun- dongo. Um TLR9 humano exemplar é fornecido sob UniProt Entry No. Q9NR96.
[00504] "Agonista de TLR9", quando aqui usado, significa, qualquer molécula, que após a ligação ao TLR9, (1) estimula ou ativa TLR9, (2) realça, aumenta, promove, induz, ou prolonga uma atividade, função ou presença de TLR9, ou (3) realça, aumenta, promove ou induz a expres- são de TLR9. Os agonistas de TLR9 úteis em qualquer um dos métodos de tratamento, medicamentos e usos da presente invenção incluem, por exemplo, ligantes de ácido nucleico que se ligam ao TLR9.
[00505] Exemplos de agonistas de TLR9 que são úteis nos métodos de tratamento, medicamentos e usos da presente invenção incluem DNA contendo CpG não metilado, oligodesoxinucleotídeos imunoesti- muladores (ODN), tal como ODN contendo CpG, tais como CpG24555, CpG10103, CpG7909 (PF-3512676/agatolimode), CpG1018, AZD1419, ODN2216, MGN1703, SD-101, 1018ISS e CMP-001. Os agonistas de TLR9 também incluem sequências de nucleotídeos contendo um dinu- cleotídeo de citosina-fosfato-2'-desóxi-7-deazaguanosina sintético (CpR) (Hybridon, Inc.), dSLIM-30L1 e complexos de imunoglobulina- DNA. Agonistas de TLR9 exemplares são descritos em WO2003/015711, WO2004/016805, WO2009/022215, PCT/US95/01570, PCT/US97/19791 e Patente Norte-americana Nos. 8552165, 6194388 e 6239116, que são cada qual aqui incorporada por referência para todos os fins.
[00506] Os RLRs incluem vários PRRs citosólicos que detectam, por exemplo, dsRNAs. Exemplos de RLRs incluem, por exemplo, gene I in- dutível por ácido retinoico (RIG-I), gene 5 associado à diferenciação de melanoma (MDA-5) e Laboratory of Genetics and Physiology 2 (LGP2).
[00507] "Agonista de RLR", quando aqui usado, significa qualquer molécula que, ao se ligar a um RLR, (1) estimula ou ativa o RLR, (2) realça, aumenta, promove, induz ou prolonga uma atividade, função ou presença do RLR, ou (3) realça, aumenta, promove ou induz a expres- são de RLR. Os agonistas de RLR úteis em qualquer um dos métodos de tratamento, medicamentos e usos da presente invenção incluem, por exemplo, ácidos nucleicos e seus derivados que se ligam aos RLRs e anticorpos monoclonais agonísticos (mAb) que se ligam especifica- mente aos RLRs.
[00508] Exemplos de agonistas de RLRs que são úteis nos métodos de tratamento, medicamentos e usos da presente invenção incluem, por exemplo, RNA de fita dupla curto com 5 'trifosfato não coberto (agonista de RIG-I); poli I:C (agonista de MDA-5) e BO-112 (agonista de MDA-A).
[00509] Os NLRs incluem vários PRRs que detectam, por exemplo, moléculas de padrão molecular associado a dano (DAMP). Os NLRs incluem as subfamílias NLRA-A, NLRB-B, NLRC-C e NLRP-P. Exem- plos de NLRs incluem, por exemplo, NOD1, NOD2, NAIP, NLRC4 e NLRP3.
[00510] "Agonista de NLR", quando aqui usado, significa qualquer molécula que, ao se ligar a um NLR, (1) estimula ou ativa o NLR, (2) realça, aumenta, promove, induz ou prolonga uma atividade, função ou presença do NLR, ou (3) realça, aumenta, promove ou induz a expres- são de NLR. Os agonistas de NLR úteis em qualquer um dos métodos de tratamento, medicamentos e usos da presente invenção incluem, por exemplo, DAMPs e seus derivados que se ligam aos NLRs e anticorpos monoclonais agonísticos (mAb) que se ligam especificamente aos NLRs.
[00511] Exemplos de agonistas de NLR que são úteis nos métodos de tratamento, medicamentos e usos da presente invenção incluem, por exemplo, muramil tripeptídeo/mifamurtida lipossômico (agonista de NOD2).
[00512] CLRs incluem vários PRRs que detectam, por exemplo, car- boidratos e glicoproteínas. CLRs incluem igualmente CLRs de trans- membrana e CLRs secretados. Exemplos de CLRs incluem, por exem- plo, DEC-205/CD205, receptor de manose de macrófago (MMR), Dec- tina-1, Dectina-2, mincle, DC-SIGN, DNGR-1 e lectina de ligação à ma- nose (MBL).
[00513] "Agonista de CLR", quando aqui usado, significa qualquer molécula que, ao se ligar a um CLR, (1) estimula ou ativa CLR, (2) re- alça, aumenta, promove, induz ou prolonga uma atividade, função ou presença de CLR, ou (3) realça, aumenta, promove ou induz a expres- são do CLR. Os agonistas do CLR úteis em qualquer um dos métodos de tratamento, medicamentos e usos da presente invenção incluem, por exemplo, carboidratos e seus derivados que se ligam a CLRs e anticor- pos monoclonais agonísticos (mAb) que se ligam especificamente aos CLRs.
[00514] Exemplos de agonistas do CLR que são úteis nos métodos de tratamento, medicamentos e usos da presente invenção incluem, por exemplo, fração de MD (um extrato de beta-glicano solúvel purificado de Grifola frondosa) e imprimem PGG (um beta 1,3/1,6-glicano PAMP derivado de levedura).
[00515] A proteína STING funciona como um sensor de DNA citosó- lico e uma proteína adaptadora na sinalização do interferon Tipo 1. Os termos "STING" e "estimulador de genes de interferon" referem-se a qualquer forma da proteína STING, bem como variantes, isoformas e homólogos de espécies que mantêm pelo menos uma parte da atividade de STING. A menos que indicado de forma diferente, tal como por refe- rência específica à STING humana, STING inclui todas as espécies mammaila de STING de sequência nativa, por exemplo, humano, ma- caco e camundongo. Um TLR9 humano exemplar é fornecido sob Uni- Prot Entry No. Q86WV6. STING também é conhecido como TMEM173.
[00516] “Agonista de STING” quando aqui usado significa, qualquer molécula, que, ao se ligar ao TLR9, (1) estimula ou ativa STING, (2) realça, aumenta, promove, induz, ou prolonga uma atividade, função ou presença de STING, ou (3) realça, aumenta, promove ou induz a ex- pressão de STING. Os agonistas de STING úteis em qualquer um dos métodos de tratamento, medicamentos e usos da presente invenção in- cluem, por exemplo, ligantes de ácido nucleico que se ligam a STING.
[00517] Exemplos de agonistas de STING que são úteis nos métodos de tratamento, medicamentos e usos da presente invenção incluem vá- rios ácidos nucleicos imunoestimuladores, tais como DNA de fita dupla sintético, di-GMP cíclico, GMP-AMP cíclico (cGAMP), dinucleotídeos cí- clicos sintéticos (CDN), tais como MK-1454 e ADU-S100 (MIW815), e pequenas moléculas, tal como P0-424.
[00518] Outros PRRs incluem, por exemplo, Ativador dependente de DNA de fatores reguladores de IFN (DAI) e Ausente no Melanoma 2 (AIM2).
[00519] As citocinas imunoestimuladoras incluem várias proteínas de sinalização que estimulam a resposta imune, tais como interferons, in- terleucinas e fatores de crescimento hematopoéticos.
[00520] Citocinas imunoestimuladoras exemplares incluem GM- CSF, G-CSF, IFN-alfa, IFN-gama; IL-2 (por exemplo, denileucina difi- tox), IL-6, IL-7, IL-11, IL-12, IL-15, IL-18, IL-21 e TNF-alfa.
[00521] As citocinas imunoestimuladoras podem ter qualquer for- mato adequado. Em algumas modalidades, uma citocina imunoestimu-
ladora pode ser uma versão recombinante de uma citocina tipo selva- gem. Em algumas modalidades, uma citocina imunoestimuladora pode ser uma muteína que tem uma ou mais alterações de aminoácidos em comparação com a citocina tipo selvagem correspondente. Em algumas modalidades, uma citocina imunoestimuladora pode ser incorporada em uma proteína quimérica contendo a citocina e pelo menos uma outra proteína funcional (por exemplo, um anticorpo). Em algumas modalida- des, uma citocina imunoestimuladora pode ser ligada covalentemente a um fármaco/agente (por exemplo, qualquer fármaco/agente conforme descrito em outro lugar aqui como um possível componente de ADC).
[00522] As vacinas contra o câncer incluem várias composições que contêm antígenos associados ao tumor (ou que podem ser usadas para gerar o antígeno associado ao tumor no indivíduo) e, portanto, podem ser usadas para provocar uma resposta imune em um indivíduo que será direcionada às células tumorais que contêm o antígeno associado ao tumor.
[00523] Os materiais de exemplo que podem ser incluídos em uma vacina contra o câncer incluem, células cancerosas atenuadas, antíge- nos tumorais, células apresentadoras de antígeno, tais como células dendríticas pulsadas com antígeno derivado de tumor ou ácidos nuclei- cos que codificam antígenos associados a tumor. Em algumas modali- dades, uma vacina contra o câncer pode ser preparada com células cancerosas do próprio paciente. Em algumas modalidades, uma vacina contra o câncer pode ser preparada com material biológico que não é das próprias células cancerosas do paciente.
[00524] As vacinas contra o câncer incluem, por exemplo, sipuleucel- T e talimogene laherparepvec (T-VEC).
[00525] A terapia com células imunes envolve o tratamento de um paciente com células imunes que são capazes de direcionar as células cancerosas. A terapia de células imunes inclui, por exemplo, linfócitos infiltrantes de tumor (TILs) e células T receptoras de antígeno quiméri- cas (células CAR-T).
[00526] Exemplos de agentes quimioterapêuticos incluem agentes de alquilação, tais como tiotepa e ciclosfosfamida; aquil sulfonatos, tais como bussulfano, improssulfano e pipossulfano; aziridinas tais como benzodopa, carboquona, meturedopa e uredopa; etileniminas e metila- melaminas incluindo altretamina, trietilenomelamina, trietilenofosfora- mida, trietilenotiofosforamida e trimetilolomelamina; acetogeninas (es- pecialmente bulatacina e bulatacinona); uma camptotecina (incluindo o análogo sintético topotecana); briostatina; calistatina; CC-1065 (inclu- indo seus análogos sintéticos adozelesina, carzelesina e bizelesina); criptoficinas (particularmente criptoficina 1 e criptoficina 8); dolastatina; duocarmicina (incluindo os análogos sintéticos, KW-2189 e CBI-TMI); eleuterobina; pancratistatina; uma sarcodictina; espongistatina; mostar- das de nitrogênio, tais como clorambucila, clornafazina, colofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, cloridrato de óxido de meclo- retamina, melfalana, novembiquina, fenesterina, prednimustina, trofos- famida, mostarda de uracila; nitrosureias, tais como carmustina, cloro- zotocina, fotemustina, lomustina, nimustina, ranimustina; antibióticos, tais como os antibióticos enediina (por exemplo, caliqueamicina, espe- cialmente caliqueamicina gama1I e caliqueamicina phiI1, veja, por exemplo, Agnew, Chem. Intl. Ed. Engl., 33:183-186 (1994); dinemicina, incluindo dinemicina A; bisfosfonatos, tal como clodronato; uma espera- micina; bem como cromóforo de neocarzinostatina e antibióticos de cro- moproteína enediina relacionados, cromomóforos), aclacinomisinas, ac- tinomicina, autramicina, azasserina, bleomicinas, cactinomicina, carabi- cina, caminomicina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunor- rubicina, detorrubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorrubicina (inclu- indo morfolino-doxorrubicina, cianomorfolino-doxorrubicina, 2-pirrolino-
doxorrubicina e desoxidoxorrubicina), doxorrubicina lipossômica pegui- lada, epirrubicina, esorrubicina, idarrubicina, marcelomicina, mitomici- nas, tais como mitomicina C, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomi- cinas, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorrubi- cina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinosta- tina, zorrubicina; antimetabólitos, tais como metotrexato e 5-fluoroura- cila (5-FU); análogos de ácido fólico, tais como denopterina, metotre- xato, pteropterina, trimetrexato; análogos de purina, tais como fludara- bina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidina, tais como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, di- desoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina; andrógenos, tais como calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepiti- ostano, testolactona; antiadrenais, tais como aminoglutetimida, mito- tano, trilostano; reforçador de ácido fólico, tal como ácido frolínico; ace- glatona; aldofosfamida glicosídeo; ácido aminolevulínico; eniluracila; an- sacrina; bestrabucila; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diaziquona; elformitina; acetato de eliptínio; uma epotilona; etoglucida; nitrato de gálio; hidroxiureia; lentinam; lonidamina; maitansinoides, tais como maitansina e ansamitocinas; mitoguazona; mitoxantrona; mopida- mol; nitracrina; pentostatina; fenamete; pirarrubicina; losoxantrona; ácido podofilínico; 2-etil-hidrazida; procarbazina; razoxano; rizoxina; si- zofurano; espirogermânio; ácido tenuazônico; triaziquona; 2,2’,2” -triclo- rotrietilamina; tricotecenos (especialmente toxina T-2, verracurina A, ro- ridina A e anguidina); uretano; vindesina; dacarbazina; manomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobromano; gacitosina; arabinosídeo (“Ara- C”); ciclofosfamida; tiotepa; taxoides, por exemplo, paclitaxel e doxeta- xel; clorambucila; gencitabina; 6-tioguanina; mercaptopurina; metotre- xato; análogos de platina, tais como cisplatina e carboplatina; vimblas- tina; platina; etoposídeo (VP-16); ifosfamida; mitoxantrona; vincristina;
vinorelbina; novantrona; teniposídeo; edatrexato; daunomicina; aminop- terina; xeloda; ibandronato; CPT-11; inibidor da topoisomerase RFS 2000; difluorometilornitina (DMFO); retinoides, tais como ácido retinoico; capecitabina; e sais, ácidos ou derivados farmaceuticamente aceitáveis de qualquer um dos anteriores.
Além disso, estão incluídos os agentes anti-hormonais que atuam para regular ou inibir a ação hormonal em tumores, tais como antiestrogênios e moduladores do receptor de estro- gênio seletivos (SERMs), incluindo, por exemplo, tamoxifeno, raloxi- feno, droloxifeno, 4-hidroxitamoxifeno, trioxifeno, keoxifeno LY117018, onapristona e toremifeno (Fareston); inibidores da aromatase que ini- bem a enzima aromatase, que regula a produção de estrogênio nas glândulas adrenais, tais como, por exemplo, 4(5)-imidazóis, aminoglute- timida, acetato de megestrol, exemestano, formestano, fadrozol, voro- zol, letrozol e anastrozol; e antiandrógenos, tais como flutamida, niluta- mida, bicalutamida, leuprolida e gosserrelina; inibidores de KRAS; inibi- dores de MCT4; inibidores de MAT2a; inibidores da tirosina cinase, tais como sunitinibe, axitinibe; inibidores de alk/c-Met/ROS, tais como crizo- tinibe, lorlatinibe; inibidores de mTOR, tais como tensirolimus, gedatoli- sibe; inibidores src/abl tal como bossutinibe; inibidores da cinase depen- dente de ciclina (CDK), tais como palbociclibe, PF-06873600; inibidores de erb tal como dacomitinibe; inibidores de PARP tal como talazoparibe; inibidores de SMO, tais como glasdegibe, PF-5274857; Inibidores de EGFR T790M, tal como PF-06747775; inibidores de EZH2, tal como PF- 06821497; inibidores de PRMT5 tal como PF-06939999; inibidores de TGFRβr1 tais como PF-06952229; e sais, ácidos ou derivados farma- ceuticamente aceitáveis de qualquer um dos anteriores.
Em modalida- des específicas, esse agente terapêutico adicional é bevacizumabe, ce- tuximabe, sirolimus, panitumumabe, 5-fluorouracila (5-FU), capecita- bina, tivozanibe, irinotecana, oxaliplatina, cisplatina, trifluridina, tipiracil, leucovorina, gencitabina, regorafinibe ou cloridrato de erlotinibe.
[00527] Em algumas modalidades, um anticorpo GUCY2c ou anti- corpo CD3-GUCY2c biespecífico é usado em conjunto com um ou mais outros agentes terapêuticos direcionados a um modulador de ponto de checagem imune ou agente coestimulador, tal como, por exemplo, sem limitação, um agente direcionado a CTLA-4, LAG-3, B7-H3, B7-H4, B7- DC (PD-L2), B7-H5, B7-H6, B7-H8, B7-H2, B7-1, B7-2, ICOS, ICOS-L, TIGIT, CD2, CD47, CD80, CD86, CD48, CD58, CD226, CD155, CD112, LAIR1, 2B4, BTLA, CD160, TIM1, TIM-3, TIM4, VISTA (PD-H1), OX40, OX40L, GITR, GITRL , CD70, CD27 , 4-1BB, 4-BBL, DR3, TL1A, CD40, CD40L, CD30, CD30L, LIGHT, HVEM, SLAM (SLAMF1, CD150), SLAMF2 (CD48), SLAMF3 (CD229), SLAMF4 (2B4, CD244), SLAMF5 (CD84), SLAMF6 (NTB-A), SLAMCF7 (CS1), SLAMF8 (BLAME), SLAMF9 (CD2F), CD28, CEACAM1(CD66a), CEACAM3, CEACAM4, CEACAM5, CEACAM6, CEACAM7, CEACAM8, CEACAM1-3AS CEA- CAM3C2, CEACAM1-15, PSG1-11, CEACAM1-4C1, CEACAM1-4S, CEACAM1-4L, IDO, TDO, CCR2, via de CD39–CD73–adenosina (A2AR), BTKs, TIKs, CXCR2, CXCR4, CCR4, CCR8, CCR5, CSF-1, ou um modulador de resposta imune inata.
[00528] Em algumas modalidades, um anticorpo GUCY2c ou anti- corpo CD3-GUCY2c biespecífico é usado em conjunto com, por exem- plo, um anticorpo antagonista anti-CTLA-4 tal como, por exemplo, ipi- limumabe; um anticorpo antagonista anti-LAG-3, tais como BMS- 986016 e IMP701; um anticorpo antagonista anti-TIM-3; um anticorpo antagonista anti-B7-H3, tal como por exemplo MGA271; um anticorpo antagonista anti-VISTA; um anticorpo antagonista anti-TIGIT; um anti- corpo anti-CD80; um anticorpo anti-CD86; um anticorpo antagonista anti-B7-H4; um anticorpo agonista anti-ICOS; um anticorpo agonista anti-CD28; um modulador de resposta imune inata (por exemplo, TLRs, KIR, NKG2A) e um inibidor de IDO.
[00529] Em algumas modalidades, um anticorpo GUCY2c ou anti- corpo CD3-GUCY2c biespecífico é usado em conjunto com um agonista OX40, tal como, por exemplo, um anticorpo agonista anti-OX-40. Em algumas modalidades, um anticorpo GUCY2c ou anticorpo CD3- GUCY2c biespecífico é usado em conjunto com um agonista GITR, tal como, por exemplo, um anticorpo agonista anti-GITR tal como, por exemplo, sem limitação, TRX518. Em algumas modalidades, um anti- corpo GUCY2c ou anticorpo CD3-GUCY2c biespecífico é usado em conjunto com um inibidor de IDO. Em algumas modalidades, um anti- corpo GUCY2c ou anticorpo CD3-GUCY2c biespecífico é usado em conjunto com uma terapia com citocinas tal como, por exemplo, sem limitação, IL-15, CSF-1, MCSF-1, etc.
[00530] Em algumas modalidades, um anticorpo GUCY2c ou anti- corpo CD3-GUCY2c biespecífico é usado em conjunto com um ou mais outros anticorpos terapêuticos, tal como, por exemplo, sem limitação, um anticorpo direcionado a CD19, CD22, CD40, CD52 ou CCR4.
[00531] Em certas modalidades, um anticorpo GUCY2c ou composi- ção de anticorpo CD3-GUCY2c biespecífico compreende pelo menos um agente adicional, tais como bevacizumabe, cetuximbe, sirolimus, pa- nitumumabe, 5-fluorouracila (5-FU), capecitabina, tivozanibe, irinote- cana, oxaliplatina, cisplatina, trifluridina, tipiracila, leucovorina, gencita- bina e cloridrato de erlotinibe.
[00532] Em algumas modalidades, o anticorpo GUCY2c ou terapia de anticorpo CD3-GUCY2c biespecífico pode ser coadministrado ou ad- ministrado sequencialmente antes ou após o tratamento com outro agente em intervalos que variam de minutos a semanas. Nas modalida- des em que os outros agentes e/ou proteínas ou polinucleotídeos são administrados separadamente, geralmente se garante que um período de tempo significativo não expire entre cada liberação, de modo que o agente e a composição da presente invenção ainda sejam capazes de exercer um efeito combinado vantajosamente sobre o indivíduo. Em tais casos, é contemplado que se pode administrar ambas as modalidades dentro de cerca de 12-24 h uma da outra e, mais preferivelmente, dentro de cerca de 6-12 h uma da outra. Em algumas situações, pode ser de- sejável estender o período de tempo para a administração significativa- mente, no entanto, onde vários dias (2, 3, 4, 5, 6 ou 7) a várias semanas (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8) falham entre as respectivas administrações.
[00533] Em algumas modalidades, um anticorpo GUCY2c ou compo- sição de anticorpo CD3-GUCY2c biespecífico é combinado com um re- gime de tratamento que compreende ainda uma terapia tradicional se- lecionada a partir do grupo que consiste em: cirurgia, radioterapia, qui- mioterapia, terapia direcionada, imunoterapia, terapia hormonal, inibi- ção da angiogênese e cuidado paliativo.
[00534] A composição utilizada na presente invenção pode compre- ender ainda transportadores, excipientes ou estabilizadores farmaceuti- camente aceitáveis (Remington: The Science and Practice of Pharmacy 21st Ed., 2005, Lippincott Williams e Wilkins, Ed. KE Hoover), na forma de formulações liofilizadas ou soluções aquosas. Os transportadores, excipientes ou estabilizadores aceitáveis não são tóxicos aos recipien- tes nas dosagens e concentrações e podem compreender tampões, tais como fosfato, citrato e outros ácidos orgânicos; antioxidantes incluindo ácido ascórbico e metionina; conservantes (tais como cloreto de octa- decildimetilbenzilamônio; cloreto de hexametônio; cloreto de benzalcô- nio, cloreto de benzetônio; fenol, butila ou álcool benzílico; alquil para- benos, tais como metil ou propil parabeno; catecol; resorcinol; ciclo-he- xanol; 3-pentanol; e m-cresol); polipeptídeos de baixo peso molecular (menos de cerca de 10 resíduos); proteínas, tal como albumina sérica, gelatina ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos tal como polivinilpir- rolidona; aminoácidos, tal como glicina, glutamina, asparagina, histidina,
arginina ou lisina; monossacarídeos, dissacarídeos e outros carboidra- tos, incluindo glicose, manose ou dextranos; agentes de quelação tal como EDTA; açúcares tal como sacarose, manitol, trealose ou sorbitol; contra-íons formadores de sal, tais como sódio; complexos de metal (por exemplo, complexos Zn-proteína); e/ou tensoativos não iônicos, tais como TWEEN™, PLURONICS™ ou polietileno glicol (PEG). Excipien- tes farmaceuticamente aceitáveis são descritos adicionalmente aqui.
[00535] Em um aspecto, a presente invenção fornece um método de produção de um anticorpo anti-GUCY2c ou um biespecífico conforme descrito aqui, compreendendo a cultura de uma célula hospedeira, sob condições que resultam na produção de anticorpo anti-GUCY2c ou um anticorpo biespecífico como aqui descrito, e purificação do anticorpo ou do anticorpo biespecífico da cultura.
[00536] Em outro aspecto, a presente invenção fornece o uso de um anticorpo anti-GUCY2c, um anticorpo biespecífico, uma composição far- macêutica, um polinucleotídeo, um sobrenadante, vetor ou uma célula hospedeira, como aqui descrito, na fabricação de um medicamento para detecção, diagnosticar e/ou tratar um distúrbio associado a GUCY2c.
[00537] Um outro aspecto da invenção é um kit compreendendo um anticorpo GUCY2c ou anticorpo CD3-GUCY2c biespecífico conforme descrito acima e instruções para uso de acordo com qualquer um dos métodos da invenção aqui descritos. Geralmente, estas instruções com- preendem uma descrição da administração do anticorpo GUCY2c ou anticorpo CD3-GUCY2c biespecífico para os tratamentos terapêuticos descritos acima. Este kit compreende qualquer composição farmacêu- tica aqui descrita. As composições farmacêuticas e outros reagentes podem estar presentes nos kits em qualquer forma conveniente, tal como, por exemplo, em uma solução ou em uma forma de pó.
[00538] Em outro aspecto, um kit compreende ainda um ou mais ou-
tros agentes profiláticos ou terapêuticos úteis para o tratamento de cân- cer, em um ou mais recipientes. Em uma modalidade, o outro agente profilático ou terapêutico é um quimioterápico. Em outros aspectos, o agente profilático ou terapêutico é um terapêutico biológico ou hormo- nal.
[00539] Vários aspectos das composições farmacêuticas, agentes profiláticos ou terapêuticos da invenção são preferivelmente testados in vitro, em um sistema de cultura de células e em um organismo modelo animal, tal como um sistema de modelo animal de roedor, quanto à ati- vidade terapêutica desejada antes do uso em humanos.
[00540] A toxicidade e eficácia dos protocolos profiláticos e/ou tera- pêuticos da presente invenção podem ser determinadas por procedi- mentos farmacêuticos padrão em culturas de células ou animais expe- rimentais, por exemplo, para determinar a LD50 (a dose letal para 50% da população) e a ED50 (a dose terapeuticamente eficaz em 50% da população). A relação da dose entre os efeitos tóxicos e terapêuticos é o índice terapêutico e pode ser expressa como a relação LD50/ED50. Os agentes profiláticos e/ou terapêuticos que exibem altos índices terapêu- ticos são preferidos.
[00541] Além disso, quaisquer ensaios conhecidos pelos versados na técnica podem ser usados para avaliar a utilidade profilática e/ou te- rapêutica das terapias ou terapias combinatórias aqui descritas para o tratamento ou prevenção do câncer.
[00542] As instruções relacionadas ao uso do anticorpo GUCY2c ou anticorpo CD3-GUCY2c biespecífico conforme descrito aqui geralmente incluem informações quanto à dosagem, cronograma de dosagem e ro- tina de administração para o tratamento pretendido. Os recipientes po- dem ser doses unitárias, embalagens a granel (por exemplo, embala- gens de múltiplas doses) ou doses de subunidade. As instruções forne- cidas nos kits da invenção são normalmente instruções escritas em um rótulo ou bula (por exemplo, uma folha de papel incluída no kit), porém, as instruções legíveis por máquina (por exemplo, instruções transporta- das em um disco de armazenamento magnético ou ótico) também são aceitáveis.
[00543] Os kits desta invenção estão em embalagens adequadas. A embalagem adequada inclui, porém, não está limitada a, frascos, am- polas, tubos, garrafas, frascos, embalagens flexíveis (por exemplo, Mylar selado ou sacos de plástico) e semelhantes para cada composi- ção farmacêutica e outros reagentes incluídos, por exemplo, tampões, soluções salinas balanceadas, etc., para uso na administração de com- posições farmacêuticas a indivíduos. Também são contempladas em- balagens para uso em combinação com um dispositivo específico, tal como um inalador, dispositivo de administração nasal (por exemplo, um atomizador) ou um dispositivo de infusão, tal como uma minibomba. Um kit pode ter uma porta de acesso estéril (por exemplo, o recipiente pode ser um saco de solução intravenosa ou um frasco tendo um tampão perfurável por uma agulha de injeção hipodérmica). O recipiente tam- bém pode ter uma porta de acesso estéril (por exemplo, o recipiente pode ser um saco de solução intravenosa ou um frasco tendo um tam- pão perfurável por uma agulha de injeção hipodérmica). Pelo menos um agente ativo na composição é um anticorpo GUCY2c ou anticorpo CD3- GUCY2c biespecífico. O recipiente pode ainda compreender um se- gundo agente farmaceuticamente ativo.
[00544] Normalmente, o kit compreende um recipiente e um rótulo ou bula(s) em ou associado ao recipiente. Depósitos Biológicos
[00545] Os materiais representativos da presente invenção foram de- positados na American Type Culture Collection, 10801 University Boule- vard, Manassas, Va. 20110-2209, USA, em 13 de fevereiro de 2018. Vector GUCY2C-1608 Cadeia A (VH-Buraco SEQ ID NO: 220) tendo o
No. de Acesso ATCC PTA-124943 compreende uma inserção de DNA (SEQ ID NO: 247) que codifica a cadeia VH-Buraco do anticorpo bies- pecífico GUCY2C-1608 e o vetor GUCY2C-1608 Cadeia B (VL-Protu- berância SEQ ID NO: 216) tendo o No. de Acesso ATCC PTA-124944 compreende uma inserção de DNA (SEQ ID NO: 246) que codifica a cadeia VL-Protuberância do anticorpo biespecífico GUCY2C-1608.
[00546] Os depósitos foram feitos sob as disposições do Budapest Treaty on the International Recognition of the Deposito f Microorganisms for the Purpose of Patent Procedure and Regulations abaixo (Budapest Treaty). Isso garante a manutenção de uma cultura viável do depósito por 30 anos a partir da data do depósito. O depósito será disponibilizado pela ATCC sob os termos do Budapest Treaty, e o indivíduo a um acordo entre a Pfizer Inc. e a ATCC, que garante a disponibilidade permanente e irrestrita da progênie da cultura do depósito ao público mediante a emissão da Patente Norte-americana pertinente ou na deposição aberta ao público de qualquer pedido de patente norte-americana ou estran- geira, o que ocorrer primeiro, e garante a disponibilidade da progênie para aquele determinado pelo U.S. Commissioner of Patents and Tra- demarks com direito a isso de acordo com 35 USC Seção 122 e as re- gras do Comissário em conformidade com a mesma (incluindo 37 C.F.R. Seção 1.14 com referência particular a 886 OG 638).
[00547] O cessionário do presente pedido concordou que se uma cul- tura dos materiais em depósito morrer ou ser perdida ou destruída quando cultivada em condições adequadas; os materiais serão pronta- mente substituídos mediante notificação por outro igual. A disponibili- dade do material depositado não deve ser interpretada como uma li- cença para praticar a invenção em violação dos direitos concedidos sob a autoridade de qualquer governo de acordo com suas leis de patentes.
[00548] Os seguintes exemplos de aspectos específicos para realizar a presente invenção são fornecidos apenas para fins ilustrativos e não se destinam a limitar o escopo da presente invenção de modo algum.
EXEMPLOS Exemplo 1: Imunização e Geração de Hibridoma de Anticorpos GUCY2c de Camundongo
[00549] O imunógeno da proteína GUCY2c humano recombinante ou células que superexpressam GUCY2c humana na superfície (SEQ ID NO: 224) foram injetadas em camundongos Balb/c para a geração de hibridomas. Camundongos Balb/c fêmeas com oito semanas de idade foram imunizados com a proteína huGUCY2c-mIgG2a solúvel ou uma linhagem celular 300.19 que expressa GUCY2c humano (SEQ ID 224/225). Para os camundongos imunizados com a proteína recombi- nante huGUCY2c, os animais foram dosados de acordo com o protocolo RIMMS (Kilpatrick, et al. Hybridoma. 1997. 16: 381-389). Resumida- mente, os camundongos foram imunizados com proteína de fusão de IgG2a Fc de camundongo de GUCY2c humana recombinante seis ve- zes (SEQ ID NO: 230) no curso de duas semanas através de injeção subcutânea. Os adjuvantes usados foram adjuvantes de Freund com- pletos e incompletos. Para a imunização baseada em células, camun- dongos Balb/c foram imunizados com 5x106 células 300.19 que supe- rexpressam GUCY2c humana duas vezes por semana durante um mês sem adjuvante por meio de injeção i.p.. Para determinar os títulos de anticorpo GUCY2c de camundongo, os sangramentos teste foram cole- tados de animais imunizados e os títulos específicos de GUCY2c foram examinados por ensaio imunossorvente ligado à enzima (ELISA) em GUCY2c mIgG2a-Fc humana recombinante (SEQ ID NO: 230) e GUCY2c-mIgG2a-Fc cinomolga (SEQ ID NO: 234). Os animais com os títulos GUCY2c mais elevados foram selecionados para a produção de hibridoma. Para os camundongos imunizados com proteína recombi- nante solúvel, linfócitos LN e esplenócitos foram usados para fusão, en-
quanto apenas esplenócitos foram usados para fusão para camundon- gos imunizados com 300.19/hGUCY2c.
Para a produção de hibridoma, esplenócitos e/ou linfócitos de nódulos linfáticos foram fundidos com mi- eloma P3X na proporção de 1:1 usando PEG.
As células fundidas foram selecionadas na presença de HAT durante sete dias, após os quais os hibridomas foram mantidos em meio contendo HT antes do rastrea- mento.
Para identificar hibridomas específicos de anti-huGUCY2c, os sobrenadantes de hibridoma foram selecionados para reatividade de IgG anti-huGUCY2c por ELISA.
Potenciais hibridomas anti-GUCY2c fo- ram então consolidados e analisados quanto à reatividade para a super- fície celular humana e GUCY2c cino em linhagens celulares 300.19 transfectadas e linhagens de tumor primário que expressam GUCY2c.
Resumidamente, linhagens celulares 300.19 que expressam várias pro- teínas GUCY2c (SEQ IDNOs: 224, 226 e 228) foram semeadas a 4 x 104 células/cavidade foram semeadas em placas de cultura de tecidos de 96 cavidades estéreis (Becton Dickinson) no Dia 1 e incubadas a 37°C/CO2 5 % por 1-2 dias até que uma monocamada confluente foi observada.
As células foram lavadas 4 vezes com PBS + Ca2+ e Mg2+ e bloqueadas durante 1 hora em temperatura ambiente com 3 % de leite/1 % de BSA/PBS + Ca2+ e Mg2+. As amostras diluídas em série (1:3 em tampão de bloqueio) foram aplicadas à placa.
As placas foram incuba- das em temperatura ambiente por 2 horas antes de serem lavadas com PBS + Ca2+ e Mg2+. O anticorpo secundário conjugado com HRP, IgG Fc de cabra anticamundongo (Thermo Scientific) diluído (1:4.000) em tampão de bloqueio foi então aplicado e incubado com as células por 1 hora.
As placas foram lavadas com PBS + Ca2+ e Mg2+ antes de ser desenvolvida a solução de substrato TMB por 10 minutos, então 0,18 M de H2SO4 para parar a reação.
A absorvência a O.D. 450 nM foi medida e os dados foram plotados e analisados com o software Microsoft Excel e Graphpad-Prism.
Os hibridomas que se ligam especificamente à
GUCY2c humana e à cinomolga foram identificados. Exemplo 2: Ligação de Anticorpos de Hibridoma Anti-GUCY2c em Citometria de Fluxo e Ensaios de Imuno-histoquímica
[00550] Os anticorpos de hibridoma anti-GUCY2c foram rastreados por citometria de fluxo quanto à ligação da superfície celular à GUCY2c humana em células tumorais T84 e HT55. Células HT29 foram usadas como controles negativos. As células foram dissociadas com tampão de dissociação celular (Sigma) e bloqueadas em gelo com PBS + BSA a 3 %. As células foram manchadas em gelo com anticorpo primário durante 1 hora e depois lavadas com PBS fria. 10 µg/ml de anticorpo secundário (secundário anticamundongo conjugado com PE, Jackson Immunorese- arch) foram adicionados em gelo durante uma hora. As células foram lavadas novamente com PBS fria e ressuspensas em PBS e manchadas com DAPI para discriminação de vivo/morto, e analisadas quanto à liga- ção de GUCY2c em um BD LSRII Fortessa. Vários clones foram identi- ficados para mostrar ligação específica a linhagens celulares que ex- pressam GUCY2c (T84 e HT55) e nenhuma ligação a células negativas para GUCY2c (HT29).
[00551] Os hibridomas de camundongos BALB/c imunizados contra GUCY2c foram testados quanto à imunorreatividade em péletes celula- res fixadas em formalina e embebidas em parafina. Os péletes celulares gerados para este rastreamento consistiam em 300.19 células paren- tais, 300.19 células que expressam GUCY2c de camundongo, de ma- caco cinomolgo ou humana, uma linhagem celular de câncer colorretal humano expressando altos níveis endógenos de GUCY2c (T84) e uma linhagem celular de câncer colorretal humano negativa para expressão de GUCY2c (HT29). As linhagens celulares foram fixadas por 24 h em formalina tamponada neutra a 10 % (Thermo Scientific) e centrifugadas a 300 x g por 4 minutos (m) em pélete. A formalina foi removida e os péletes celulares foram ressuspensos suavemente com Histogel a 50
ºC pré-aquecido (Thermo Scientific). Os péletes celulares incorporados em Histogel foram resfriados a 4ºC por 1 a 2 horas antes de serem pro- cessados durante a noite em um processador de tecido automatizado VIP (Tissue-Tek). Péletes celulares processados foram incluídos em pa- rafina. Seções de cinco mícrons do microarranjo celular foram cortadas, transferidas para um banho-maria e colocadas em lâminas de micros- cópio Superfrost Excell (Fisher). As lâminas foram deixadas secar du- rante a noite. Após a desparafinização e reidratação das seções de te- cido, a recuperação do epitopo induzida por calor foi realizada na panela de pressão Retriever 2100 (Eletron Microscopy Sciences) em tampão Borg Decloaker pH 9,5 (Biocare Medical) ou tampão citrato pH 6,0 (Thermo Scientific) seguido de resfriamento em temperatura ambiente (TA). A atividade da peroxidase endógena foi inativada com Peroxida- zed 1 (Biocare Medical) por 10 minutos. As interações não específicas de proteínas foram bloqueadas por 10 m com Background Punisher (Bi- ocare Medical). Cada hibridoma foi incubado sem diluição por 1 hora em ambas as condições de recuperação de epitopo induzida por calor. As seções foram enxaguadas em TBS e a ligação do hibridoma foi detec- tada com Envision+ Mouse HRP (DAKO) por 30 minutos. As lâminas foram enxaguadas em TBS e a imunorreatividade foi desenvolvida com o kit Betazoid DAB Chromogen (Biocare Medical) por 5 m, seguido de enxágues em água destilada. As seções imunocoradas foram breve- mente contrastadas com CAT Hematoxylin (Biocare Medical), lavadas em água da torneira, desidratadas em alcoóis graduados, depuradas em xileno e cobertas com uma lamela com meio de montagem Per- mount (FisherChemicals). As lâminas foram avaliadas por um patolo- gista veterinário para avaliar a imunorreatividade. Clones com imunor- reatividade para GUCY2c de humanos, macaco cinomolgo e camun- dongo foram identificados nesta tela.
[00552] Os resultados da ligação de anticorpos de hibridoma anti-
GUCY2c por citometria de fluxo e imuno-histoquímica (IHC) são mos- trados na Tabela 11. Tabela 11 Ligação de IHC Ligação por Citometria de Ligação de IHC Ligação de IHC Clone (GUCY2c de ca- Fluxo T84+ HT55+ HT29- (GUCY2c humana) (GUCY2c cino) mundongo) 1A7 + + + - 2D4 + 4F2 + 4F12 + 4G3 + 5G7 + 9H3 + + + + 20D11 + 3H6 + 18E10 + Exemplo 3: Quantificação dos níveis de expressão de GUCY2c em linhagens celulares
[00553] A densidade do receptor GUCY2c em linhagens celulares foi medida usando o clone GUCY2C-9H3 conjugado a uma relação de 1:1 para ficoeritrina (Thermo Scientific). 1x105 células foram manchadas com 10 ug/ml de mAb anti-GUCY2c marcado com PE para ligação de saturação. As células foram lavadas e ressuspensas em tampão FACS com DAPI e adquiridas usando BD LSRII Fortessa com software FACS Diva. Contas marcadas com PE QuantiBRITE (BD) foram usadas nas mesmas configurações de aquisição de voltagem PE para calcular o nú- mero de anticorpos marcados com PE por célula (ABC) com base na intensidade de fluorescência média geométrica de PE. As medições de densidade do receptor GUCY2c em linhagens celulares tumorais huma- nas são mostradas em Tabela 12. As linhagens celulares com densida- des de receptor para GUCY2c foram caracterizadas neste ensaio e fo- ram utilizadas em ensaios subsequentes (por exemplo, ensaios de cito- toxicidade) para avaliar a atividade funcional de anticorpos biespecíficos CD3-GUCY2c. Tabela 12
Linhagem Celular Capacidade de ligação ao anticorpo(ABC)/Célula T84 8066,6 LS1034 6007,7 SNU16 3029,3 HT55 2811,5 SW1116 2650,7 CACO-2 4214,6 JHH7 2290 LS174T 1666,8 ASPC-1 495,6 Exemplo 4: Clonagem e Sequenciamento de Anticorpos de Hibri- doma Anti-GUCY2c
[00554] Os sobrenadantes de hibridoma com atividade de ligação da superfície celular confirmada foram subclonados no formato de IgG1 de camundongo. O RNA foi extraído e as Sequências de DNA da região variável (V) dos anticorpos expressos foram obtidas por meio de clona- gem por reação em cadeia da polimerase de transcrição reversa (RT- PCR), conforme descrito a seguir.
[00555] Um a cinco milhões de células de hibridoma subclonadas fo- ram homogeneizadas para isolamento de RNA total com o kit QIAGEN RNAeasy Mini. A primeira cadeia de cDNA foi então produzida usando o kit SuperScript III RT (Invitro-gen). Os cDNAs de fita dupla para regi- ões variáveis de IgGs anti-GUCY2c foram subsequentemente gerados e amplificados por PCR usando iniciadores das regiões constantes de cadeia pesada de IgG de camundongo (IgG1, IgG2a, IgG2b) e de cadeia leve (Kappa ou lambda), conforme descrito abaixo. As condições dos ciclos de PCR foram 1 ciclo a 95 °C por 1 min; 25 ciclos a 95 °C por 1 min, 63 °C por 1 min e 72 °C por 1 min. Os produtos de RT-PCR resul- tantes foram clonados no vetor de clonagem TOPO-Blunt (Invitrogen) e foram sequênciados.
[00556] Os resíduos em um domínio variável foram numerados de acordo com Kabat, que é um sistema de numeração usado para domí- nios variáveis de cadeia pesada ou domínios variáveis de cadeia leve da compilação de anticorpos (Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ª. Ed. Public Health Service, National Insti- tutes of Health, Bethesda, MD). Usando este sistema de numeração, a sequência de aminoácidos linear real pode conter menos ou mais ami- noácidos correspondendo a um encurtamento ou inserção em uma FR ou CDR do domínio variável. Por exemplo, um domínio variável de ca- deia pesada pode incluir uma única inserção de aminoácido (resíduo 52a de acordo com Kabat) após o resíduo 52 de H2 e resíduos inseridos (por exemplo, resíduos 82a, 82b e 82c, de acordo com Kabat) após o resíduo 82 de Estrutura de cadeia pesada (FR). A numeração de Kabat de resíduos pode ser determinada para um determinado anticorpo por alinhamento em regiões de homologia da sequência do anticorpo com uma sequência numerada por Kabat “padrão”. Vários algoritmos para atribuição de numeração de Kabat estão disponíveis. O algoritmo imple- mentado no lançamento da versão 2.3.3 do Abysis (www.abysis.org) é usado aqui para atribuir a numeração de Kabat às regiões variáveis CDR1 de VL, CDR2 de VL, CDR3 de VL, CDR2 de VH e CDR3 VH. A definição AbM é usada para CDR1 VH. Os resíduos de FR são resíduos de domínio variável de anticorpo diferentes dos resíduos de CDR. Uma estrutura de domínio VH ou VL compreende quatro sub-regiões de es- trutura, FR1, FR2, FR3 e FR4, intercaladas com CDRs na seguinte es- trutura: FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4.
[00557] Proteínas biespecíficas de células T quiméricas com regiões V de camundongo e regiões constantes de IgG humana modificada (hIgG1) foram geradas da seguinte forma: cDNAs da região V de veto- res TOPO de camundongos parentais foram subclonados em vetores de expressão de mamíferos compreendidos por um primeiro e um se- gundo domínio promotor de heterodímero, cada um tendo um ligante de cisteína (Ligante 3), tal como GCPPCP (SEQ ID NO: 192) e uma cadeia Fc de "protuberância" (SEQ ID NO: 188) ou uma cadeia Fc de "buraco" (SEQ ID NO: 189 ) Neste caso, as regiões pesadas variáveis (VH) anti- GUCY2c de camundongo (SEQ ID NOs: 11, 19, 26, 33 e 41) foram fun- didas na estrutura com uma região leve variável (VL) anti-CD3 humana
(SEQ ID NO : 84), separada por um ligante, GGGSGGGG (SEQ ID NO: 190), e seguida por outro ligante GCPPCP (SEQ ID NO: 192), conec- tando-se à cadeia Fc de "buraco" (SEQ ID NO: 189). As regiões VL anti- GUCY2c de camundongo (SEQ IDNOs: 92, 100, 104, 106, 112 e 119) foram fundidas no quadro com um ligante, GGGSGGGG (SEQ ID NO: 190), uma região VH anti-CD3 humana (SEQ ID NO : 1), seguida por um ligante, GCPPCP (SEQ ID NO: 192) e uma cadeia Fc de "protube- rância" (SEQ ID NO: 188). Os fragmentos foram amplificados por PCR padrão com iniciadores incorporando saliências de 15-25 nucleotídeos que compartilham homologia com o vetor de destino para clonagem de montagem isotérmica (ITA). Os fragmentos foram recombinados nos ve- tores linearizados acima usando o kit de clonagem Infusion ITA (Clon- tech).
[00558] As ligações foram então transformadas em DH5α de E.coli competente (Life Technologies) e cultivadas durante a noite a 37 °C em placas de agarose contendo 100 µg/mL de carbenicilina. As colônias foram contadas, colhidas e cultivadas durante a noite em caldo YT + 100 µg/mL de carbenicilina e DNA isolado usando métodos padrão. To- das as construções de DNA foram então sequenciadas em ambas as fitas antes da expressão em células de mamíferos usando métodos con- vencionais de sequenciamento. Exemplo 5: Expressão e Purificação de Anticorpos Quiméricos CD3-GUCY2c Biespecíficos
[00559] Pares de construção complementar (12,5 µg de cada cadeia) foram cotransfectados em culturas de fase log de 25 mL contendo 1 milhão de células/mL de células HEK 293 usando o Kit ExpiFectamine™ 293 Transfection (Life Technologies). 24 horas após a transfecção, foi adicionado ExpiFectamine Transfection Enhancer e as células foram deixadas a crescer mais 4-5 dias antes da colheita. As culturas gastas foram então recolhidas, centrifugadas para remover os resíduos celula- res e depois passadas através de um filtro de 20 µm.
[00560] Os meios condicionados clarificados contendo anticorpos bi- específicos CD3-GUCY2c foram então purificados usando cromatogra- fia de afinidade de proteína A. As amostras foram carregadas em micro colunas de 0,45 mL (Repligen) pré-embaladas com resina de Proteína A MabSelect SuRe™ (GE Healthcare) usando um manipulador de líqui- dos (Tecan). A proteína ligada foi lavada com PBS pH 7,2, depois eluída com ácido cítrico a 20 mM, cloreto de sódio 150 mM, pH 3,5 e neutrali- zada com Tris a 2M, pH 8,0. As amostras foram então dessalinizadas em PBS pH 7,2 usando colunas de gotejamento Sephadex G25 (GE Healthcare) de acordo com os métodos do fabricante. As proteínas pu- rificadas foram analisadas quanto à pureza usando cromatografia de ex- clusão por tamanho analítica com uma coluna Mab HTP (Tosoh Biosci- ence) em um HPLC Aglient 1200 seguindo os protocolos do fabricante. As concentrações foram determinadas por medição a OD280 nm usando um microespectrofotômetro (Trinean). Exemplo 6: Análise de Ligação de Proteína Recombinante
[00561] As proteínas foram rastreadas quanto à ligação a proteínas recombinantes humanas, cino e de camundongo por ELISA. As proteí- nas purificadas humanas, cinomolga, murinas GUCY2c ECD ou CD3 épsilon-delta humanas foram revestidas em placas Nunc-Maxisorb de 384 cavidades ELISA a 1 µg/ml em 20 µl em PBS-CMF (livre de cálcio e magnésio) a 4C. As placas foram lavadas 3x com PBS + TWEEN20 0,05 % e bloqueadas com PBS + 3 % de leite durante 1 hora, agitando em temperatura ambiente. A solução de bloqueio foi removida e as amostras diluídas em série em bloco foram adicionadas e incubadas durante 1 hora de agitação em temperatura ambiente. As placas foram lavadas 3x como antes e um anticorpo secundário foi adicionado (Fc-
HRP de IgG anti-hu de cabra - Southern Biotech L2047-05, 1:5000; ca- bra Fc-HRP de IgG anticamundongo - Thermo Scientific, diluído 1:4.000; ou anti-penta-HIS-HRP de camundongo, Qiagen, 1:1000), seguido por agitação durante 1 hora em temperatura ambiente. As placas foram la- vadas como antes e o sinal foi desenvolvido usando TMB, a reação foi interrompida com H2SO4 e a absorvência lida a 450 nm em um leitor de placas Envision (Perkin Elmer). Um método de detecção alternativo tam- bém foi periodicamente empregado no lugar de TMB/H2SO4. Após a adição e lavagem do primário, 20 µl por cavidade de conjugado IgG anti- humano Europium (Perkin Elmer EU-N1) diluído 1:1000 em tampão de ensaio DELFIA (Perkin Elmer 1244-330) foram adicionados e incubados em temperatura ambiente por 1 hora. As placas foram então lavadas 3 vezes com Solução de Lavagem DELFIA 1x (Perkin Elmer 1244-114) e 20 µL por cavidade de solução de Realce (Perkin Elmer 1244-105) fo- ram adicionados e incubados por 30 minutos. A fluorescência resolvida com o tempo foi então medida a 320 e 615 nm usando um leitor de placa EnVision® (EnVision® Multilabel Plate Reader, Perkin Elmer) seguindo os métodos do fabricante.
[00562] Para testar a ligação biespecífica a GUCY2c e CD3, foi rea- lizado um ELISA em sanduíche. CD3 épsilon-delta humana (SEQ ID NO: 242) foi revestida em placas de ELISA de 384 cavidades Nunc-Ma- xisorb a 1 µg/ml em 20 µl em PBS-CMF (livre de cálcio e magnésio) a 4 °C. As placas foram lavadas 3x com PBS + TWEEN20 0,05 % e bloque- adas com PBS + 3 % de leite durante 1 hora, agitando em temperatura ambiente. A solução de bloqueio foi removida e as amostras diluídas em série em bloco foram adicionadas e incubadas durante 1 hora de agita- ção em temperatura ambiente. As placas foram lavadas 3x como antes e a proteína de fusão GUCY2c ECD-IgG2a Fc de camundongo purifi- cada humana, cinomolga ou murina foi adicionada à placa a 1 µg/ml e incubada em temperatura ambiente, agitando durante 1 h.
As placas fo- ram lavadas 3x como antes e um anticorpo secundário foi adicionado (IgG Fc-HRP anticamundongo de cabra - Thermo Scientific, diluído 1:4.000), seguido de agitação por 1 hora em temperatura ambiente.
As placas foram lavadas como antes, e o sinal foi desenvolvido usando TMB, a reação interrompida com H2SO4 e a absorvência lida a 450 nm em um leitor de placas EnVision® (Perkin Elmer). Um método de detec- ção alternativo também foi periodicamente empregado no lugar de TMB/H2SO4. Após a adição e lavagem da proteína de fusão GUCY2c ECD-IgG2a Fc de camundongo purificada humana, cinomolga ou mu- rina, 20 µl por cavidade de conjugado anti mu-IgG Europium (Perkin El- mer EU-N1) diluído 1:1000 em tampão de ensaio DELFIA (Perkin Elmer 1244 -330) foi adicionado e incubado em temperatura ambiente durante 1 hora.
As placas foram lavadas 3x com tampão de lavagem DELFIA e incubadas 30 minutos com 20 µl de solução de realce (Perkin Elmer 1244-105). A fluorescência resolvida com o tempo foi então medida a 3240 e 615 nm usando um leitor de placa EnVision® (Perkin Elmer) se- guindo os métodos do fabricante.
Os anticorpos biespecíficos CD3- GUCY2c quiméricos foram rastreados quanto à atividade de ligação contra GUCY2c humano recombinante e CD3 épsilon humana por ELISA.
Os 6 principais resultados demonstraram atividade de ligação dupla baixa ou sub nM (Tabela 13). Tabela 13 EC50 de GUCY2c humana EC50 de Ligação Biespecí- EC50 de Controle Nega- Clone EC50 de CD3 humana (nM) (nM) fica (nM) tivo (nM)
GUCY2C-0074 >100 1,128 4,051 NB
GUCY2C-0077 27,53 0,8873 7,504 NB
GUCY2C-0078 23,51 1,446 9,68 NB
GUCY2C-0098 60,19 7,244 185,6 NB
GUCY2C-0104 >100 0,4179 2,479 NB
GUCY2C-0105 79,76 0,3547 5,045 NB
Exemplo 7: Atividade de Célula T Mediada por Anticorpo Biespecí- fico
[00563] PBMCs humanas foram isoladas de sangue de doador sau- dável usando His-topaque-177 (Sigma). As células T virgens foram iso- ladas de PBMCs usando um kit de enriquecimento de células T da Stem Cell Technologies (seleção negativa de células T). Células tumorais hu- manas T84 de expressão de GUCY2c transfectadas com uma constru- ção de expressão de luciferase foram ressuspensas em meio R10 (RPMI, FBS 10 %, Pen/Estrep 1%, 3 ml de glicose 45%). As células T também foram ressuspensas em meio R10 e adicionadas a células T84 em uma relação de efetor para alvo (relação E:T) de 10:1 ou 5:1. As células foram tratadas com diluições em série de anticorpos GUCY2c biespecíficos ou um CD3 biespecífico de controle negativo, e incubadas a 37°C por 48 horas, seguido pela medição do sinal de luciferase usando o reagente de neólita (Perkin Elmer) usando um Victor (Perkin Elmer ) Os valores de EC50 foram calculados no Graphpad PRISM usando análise de regressão não linear de quatro parâmetros. Células HCT116 ou HT29 negativas alvo não mostraram qualquer citotoxicidade mediada por GUCY2c biespecífico. Os resultados dos ensaios de morte celular com anticorpos biespecíficos CD3-GUCY2c quiméricos (relação E:T = 10:1) são mostrados na Tabela 14. Todos os anticorpos biespecí- ficos CD3-GUCY2c mostraram morte celular dependente de célula T es- pecífica e potente de células positivas de GUCY2c. Tabela 14 Clone EC50 de célula tumoral T84 (nM) GUCY2C-0074 2,6 GUCY2C-0077 28,7 GUCY2C-0078 7,8 GUCY2C-0098 0,41 GUCY2C-0104 14,9 GUCY2C-0105 7,51
[00564] Os resultados dos ensaios de morte celular com anticorpos biespecíficos CD3-GUCY2c humanizados (relação E:T = 5:1) são mos-
trados na Tabela 15. Todos os anticorpos biespecíficos mostraram cito- toxicidade dependente de células T em células positivas para GUCY2c. Tabela 15 Clone EC50 de célula tumoral T84 (nM) GUCY2C-0240 0,53 GUCY2C-0247 0,07 GUCY2C-1186 0,22 GUCY2C-1467 0,2 GUCY2C-1476 0,07 GUCY2C-1478 0,24 GUCY2C-1481 1,57 GUCY2C-1512 0,57 GUCY2C-1518 0,37 GUCY2C-1526 0,13 GUCY2C-1538 0,05 GUCY2C-1554 12,6 GUCY2C-1555 1,13 GUCY2C-1556 5,04 GUCY2C-1557 0,22 GUCY2C-1590 11,07 GUCY2C-1592 2,6 GUCY2C-1608 0,19 Exemplo 8: Binning de epitopo por octeto
[00565] As proteínas biespecíficas GUCY2C-0074, -0077, -0104, - 0105 e -0098 foram avaliadas para ligação competitiva e não competi- tiva contra GUCY2c humano (SEQ ID NO: 224) usando um ensaio de binning em tandem com um OctetRED 384 (ForteBio). Os ensaios do octeto foram conduzidos em temperatura ambiente. GUCY2c humana biotinilada foi diluída até 10 µg/ml em solução salina tamponada com fosfato livre de cálcio e magnésio (PBS) e capturada em biossensores de estreptavidina (SA) (18-5020, ForteBio) de acordo com as instruções do fabricante. As proteínas biespecíficas foram diluídas até 300 nM em PBS. Os biossensores revestidos com GUCY2c foram mergulhados na primeira proteína biespecífica por 300 segundos, em seguida, mergu- lhados na segunda proteína biespecífica por 300 segundos. Cada um dos anticorpos biespecíficos foi testado desta maneira combinatória aos pares. Os anticorpos biespecíficos que competem pela mesma região de ligação em GUCY2c humana foram agrupados em um único com- partimento. O escaneamento de epítopos por octeto de anticorpos CD3-
GUCY2c biespecíficos quiméricos demonstra grupos de epítopos úni- cos reconhecidos por domínios de ligação anti-GUCY2c (Tabela 16). Os símbolos + indicam epítopos concorrentes; símbolos +/- indicam epíto- pos parcialmente sobrepostos; os símbolos - indicam epítopos não con- correntes; e NT indicam que a análise de comparação não foi testada. Tabela 16 Clone GUCY2C-0074 + GUCY2C-0077 NT + GUCY2C-0098 + +/- + GUCY2C-0104 NT + +/- + GUCY2C-0105 NT + - + + GUCY2C-0074 GUCY2C-0077 GUCY2C-0098 GUCY2C-0104 GUCY2C-0105 Clone Exemplo 9: Humanização de domínios de ligação de anticorpo GUCY2c de camundongo
[00566] A humanização das regiões variáveis de GUCY2c de camun- dongo foi realizada usando uma estratégia de enxerto de CDR. DNAs complementares (cDNA) contendo estrutura receptora humana, VH3-7 (SEQ ID NO: 176) para cadeia pesada e VK1-39 (SEQ ID NO: 180) para cadeia leve, com sequências doadoras de regiões determinantes de complementaridade (CDR) anti-GUCY2c foram sintetizados em vetores contendo a região constante de IgG1-3m humana ou o Kappa humano para a cadeia leve. O vetor de cadeia pesada era composto pela região CH1 (SEQ ID NO: 185), a região de articulação (SEQ ID NO: 186) e a região CH2-CH3 que inclui mutações da função efetora L234A, L235A e G237A (SEQ ID NO: 187; numeração de acordo com o índice EU). O vetor de cadeia leve era composto pelo domínio Kappa CL (SEQ ID NO: 184). Mutações reversas para sequência de camundongo nas regiões estruturais de ambas as regiões VH e VL foram introduzidas e avaliadas quanto à recuperação total da atividade de ligação. O alinhamento das regiões VH e VL da estrutura receptora humana, os clones parentais de camundongos e as variantes humanizadas totalmente ativas são mos- trados nas Tabelas 17A, 17B, 18A e 18B abaixo para o clone GUCY2C-
0098.
[00567] Mutações reversas para sequência de camundongo nas re- giões estruturais de ambas as regiões VH e VL foram introduzidas e avaliadas quanto à recuperação total da atividade de ligação. O alinha- mento das regiões VH e VL da estrutura receptora humana, os clones parentais de camundongo e a variante humanizada totalmente ativa GUCY2C-0241 são mostrados nas Tabelas 17A e 17B abaixo para o clone GUCY2C-0098. Tabela 17A Clone HFW1 VHCDR1 HFW2 huIGHV3-7 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS GFTFSSYWMS WVRQAPGKGLEWVA (SEQ ID NO: 5) (SEQ ID NO: 177) (ABM); (SEQ ID NO: 6) SYWMS(SEQ ID NO: 271) Kabat GUCY2C-0098 QVQLQQPGAELVKPGASVKLSCKAS GYTFTSYWMH(SEQ ID NO: 27) (ABM); WVKQRPGQGLEWIG (SEQ ID NO: 30) (SEQ ID NO: 16) SYWMH (SEQ ID NO: 259) (Kabat) GUCY2C-0241 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS GYTFTSYWMH WVRQAPGKGLEWIG (SEQ ID NO:5) (SEQ ID NO: 27) (ABM); (SEQ ID NO: 49) SYWMH (SEQ ID NO: 259) (Kabat) Tabela 17B Clone CDR2 de VH HFW3 CDR3 VH huIGHV3-7 NIKQDGSEKYYVDSVKG RFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR(SEQ Nenhum (SEQ ID NO: 178) (Kabat); ID NO: 7) KQDGSE (SEQ ID NO: 272) Chothia GUCY2C-0098 EIKPSNGLTNYIEKFKN(SEQ ID NO: KATLTVDKSATTAYMQLSSLTAEDSAVYYCTR(SEQ TITTTEGYWFFDV 28)(Kabat); ID NO: 31) (SEQ ID NO: 29)
KPSNGL (SEQ ID NO: 264) (Chothia) GUCY2C-0241 EIKPSNGLTNYIEKFKN(SEQ ID NO: RFTISVDKAKNSAYLQMNSLRAEDTAVYYCTR(SEQ TITTTEGYWFFDV 28) (Kabat); ID NO: 61) (SEQ ID NO: 29)
KPSNGL (SEQ ID NO: 264) (Chothia)
[00568] O alinhamento da região VL da estrutura receptora humana, o clone de camundongo parental e a variante totalmente humanizada são mostrados nas Tabelas 18A e 18B para o clone GUCY2C-0098. As CDRs baseadas na numeração de Kabat estão sublinhadas. O negrito representa os aminoácidos da linha germinativa não humana originais presentes no clone totalmente humanizado. Tabela 18A Clone LFW1 VLCDR1 LFW2 huIGKV1-39 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC RASQSISSYLN WYQQKPGKAPKLLIY (SEQ ID NO: 80) (SEQ ID NO: 181) (SEQ ID NO: 81) GICU2C-0098 DIVLTQSPASLAVSLGQRATISC RASESVDYYGTSLMQ WYQQKPGQPPKLLIY (SEQ ID NO: 96) (SEQ ID NO: 107) (SEQ ID NO: 110) GICU2C-0241 DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITC RASESVDYYGTSLMQ WYQQKPGKAPKLLIY (SEQ ID NO: 126) (SEQ ID NO: 107) (SEQ ID NO: 81) Tabela 18B Clone VLCDR2 LFW3 CDR3 de VL huIGKV1-39 AASSLQS GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC QQSYSTPYT (SEQ ID NO: 182) (SEQ ID NO:82) (SEQ ID NO: 183) GICU2C-0098 AASNVES GVPARFSGSGSGTDFSLNIHPVEEDDIAMYFC QQTRKVYT (SEQ ID NO: 108) (SEQ ID NO:111) (SEQ ID NO: 109) GICU2C-0241 AASNVES GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC QQTRKVYT (SEQ ID NO: 109) (SEQ ID NO: 108) (SEQ ID NO:82)
[00569] A Tabela 19 mostra que os domínios de ligação anti-GUCY2c humanizados como IgG1 humana demonstram ligação retida à proteína GUCY2c recombinante por ELISA. Tabela 19 Clone Ligação de huGUCY2C direta (nM) GUCY2C-0166 0,06935 GUCY2C-0179 5,143 GUCY2C-0193 0,2297 GUCY2C-0210 8,961 GUCY2C-0212 0,7694 GUCY2C-0241 0,1605
[00570] A Tabela 20 mostra que os domínios de ligação de GUCY2c humanizados como anticorpos biespecíficos de CD3 demonstram liga- ção retida a GUCY2c humano recombinante e proteínas CD3 humanas simultaneamente. GUCY2C-0240 é uma versão de anticorpo biespecí- fico CD3 humanizado de IgG de GUCY2C-0166. GUCY2C-0247 e GUCY2C-0250 são anticorpos biespecíficos CD3 humanizados de GUCY2C-0241 com diferentes regiões variáveis anti-CD3. Tabela 20 Clone ELISA sanduíche de huCD3-huGUCY2C (nM) GUCY2C-0240 0,07992 GUCY2C-0247 0,705 GUCY2C-0250 76,9
Exemplo 10: Outras humanização e otimização de domínios de li- gação GU-CY2C usando exibição de fago
[00571] Em certas modalidades, a substituição é a substituição da linha germinativa humana em que um resíduo de CDR é substituído pelo resíduo da linha germinativa humana correspondente, para aumentar o conteúdo de aminoácidos humanos e reduzir a potencial imunogenici- dade do anticorpo. Por exemplo, se a estrutura da linha germinativa hu- mana VH3-7 for usada e o anticorpo exemplar GUCY2C-0241, então o alinhamento da CDR1 VH do anticorpo GUCY2C-0241 (SEQ ID NO: 27) e da linha germinativa humana VH3-7 é a seguinte Tabela 21 (usando o sistema de numeração de Kabat com a definição AbM de CDR1 VH): Tabela 21 Posição 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 Linha Germinativa Hu- G F T F S S Y W M S mana VH3-7 GUGY2C-0241 G Y T F T S Y W M H
[00572] Para as posições 26, 28, 29, 31, 32, 33 e 34, o resíduo da linha germinativa humana e o resíduo GUCY2C-0241 correspondente são iguais e não é possível uma substituição da linha germinativa. Para as posições 27, 30 e 35 (negrito e sublinhado), o resíduo da linha ger- minativa humana e o resíduo GUCY2C-0241 correspondente são dife- rentes. Os resíduos de GUCY2C-0241 nestas posições podem ser substituídos pelo resíduo VH3-7 da linha germinativa humana corres- pondente para aumentar ainda mais o conteúdo de resíduo humano.
[00573] O anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, pode compreender uma estrutura VH compreendendo uma sequência estrutural VH de linha germinativa humana. A sequência de estrutura VH pode ser de uma linha germinativa VH3 humana, uma linha germi- nativa VH1, uma linha germinativa VH5 ou uma linha germinativa VH4. Estruturas de cadeia pesada de linha germinativa humana preferidas são estruturas derivadas da linha germinativa VH1, VH3 ou VH5. Por exemplo, estruturas VH das seguintes linhas germinativas podem ser usadas: IGHV3-23, IGHV3-7 ou IGHV1-69 (nomes de linha germinativa são baseados na definição de linha germinativa IMGT). Estruturas de cadeia leve de linha germinativa humana preferidas são estruturas deri- vadas de linhas germinativas V ou V. Por exemplo, estruturas VL das seguintes linhas germinativas podem ser usadas: IGKV1-39 ou IGKV3- 20 (os nomes das linhas germinativas são baseados na definição da linha germinativa IMGT). Alternativamente ou além disso, a sequência de estrutura pode ser uma estrutura de consenso de linha germinativa humana sequência, como a estrutura de sequência de consenso V1 humana, sequência de consenso V1, sequência de consenso V2, se- quência de consenso V3, sequência de consenso de linha germinativa VH3, germline con-sensus sequência VH1, sequência de consenso de linha germinativa VH5 ou sequência de consenso de linha germinativa VH4. As sequências de estruturas de linha germinativa humana estão disponíveis em vários bancos de dados públicos, como base V, IMGT, NCBI ou Abysis.
[00574] O anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, pode compreender uma estrutura VL compreendendo uma sequência estrutural VL de linha germinativa humana. A estrutura VL pode com- preender uma ou mais substituições, adições ou deleções de aminoáci- dos, embora ainda retenha semelhança funcional e estrutural com a li- nha germinativa da qual foi derivada. Em alguns aspectos, a estrutura VL é de pelo menos 90 %, pelo menos 91 %, pelo menos 92 %, pelo menos 93 %, pelo menos 94 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, pelo menos 99 % ou 100 % idêntico a uma sequência de estrutura VL da linha germinativa humana. Em al- guns aspectos, o anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, compreende uma estrutura VL que compreende 1, 2, 3, 4, 5, 6,
7, 8, 9, 10 substituições, adições ou deleções de aminoácidos em rela- ção à sequência de estrutura VL de linha germinativa humana.
[00575] A estrutura VL da linha germinativa humana pode ser a es- trutura de DPK9 (nome IMGT: IGKV1-39). A estrutura VL da linha ger- minativa humana pode ser a estrutura de DPK12 (nome IMGT: IGKV2D- 29). A estrutura VL da linha germinativa humana pode ser a estrutura de DPK18 (nome IMGT: IGKV2-30). A estrutura VL da linha germinativa humana pode ser a estrutura de DPK24 (nome IMGT: IGKV4-1). A es- trutura VL da linha germinativa humana pode ser a estrutura de HK102_V1 (nome IMGT: IGKV1-5). A estrutura VL da linha germinativa humana pode ser a estrutura de DPK1 (nome IMGT: IGKV1-33). A es- trutura VL da linha germinativa humana pode ser a estrutura de DPK8 (nome IMGT: IGKV1-9). A estrutura VL da linha germinativa humana pode ser a estrutura de DPK3 (nome IMGT: IGKV1-6). A estrutura VL da linha germinativa humana pode ser a estrutura de DPK21 (nome IMGT: IGKV3-15). A estrutura VL da linha germinativa humana pode ser a estrutura de Vg_38K (nome IMGT: IGKV3-11). A estrutura VL da linha germinativa humana pode ser a estrutura de DPK22 (nome IMGT: IGKV3-20). A estrutura VL da linha germinativa humana pode ser a es- trutura de DPK15 (nome IMGT: IGKV2-28). A estrutura VL da linha ger- minativa humana pode ser a estrutura de DPL16 (nome IMGT: IGLV3- 19). A estrutura VL da linha germinativa humana pode ser a estrutura de DPL8 (nome IMGT: IGLV1-40). A estrutura VL da linha germinativa humana pode ser a estrutura de V1-22 (nome IMGT: IGLV6-57). A es- trutura VL da linha germinativa humana pode ser a estrutura da sequên- cia de consenso V humana. A estrutura VL da linha germinativa hu- mana pode ser a estrutura da sequência de consenso V1 humana. A estrutura VL da linha germinativa humana pode ser a estrutura da se- quência de consenso V3 humana. A estrutura VL da linha germinativa humana pode ser a estrutura da sequência de consenso V humana. A estrutura VL da linha germinativa humana pode ser a estrutura da se- quência de consenso V1 humana. A estrutura VL da linha germinativa humana pode ser a estrutura da sequência de consenso V2 humana. A estrutura VL da linha germinativa humana pode ser a estrutura da se- quência de consenso V3 humana. Determinação de paratopo de anticorpos GUCY2c por substituição binária aumentada
[00576] Um método para determinar resíduos de CDR críticos foi descrito, pelo qual variantes de anticorpos funcionais são selecionadas de uma biblioteca contendo o resíduo da linha germinativa humana ou o resíduo de roedor correspondente em cada posição de CDR, exceto para CDR-H3 (Townsend et al., 2015, Proc .Natl. Acad. Sei. USA. 112 (50): 15354-15359). Uma biblioteca de fago scFv foi construída na qual todas as posições de CDR, exceto CDR3 VH de GUCY2C-0241 que diferia da linha germinativa humana (VH3-7/VK1-39) foram randomiza- das de modo que aproximadamente 50 % de os clones codificavam o aminoácido GUCY2C-0241 de camundongo e aproximadamente 50 % codificavam o aminoácido da linha germinativa humana naquela posi- ção (Tabelas 17A, 17B, 18A e 18B). As bibliotecas foram preparadas e submetidas a 3-4 ciclos de seleção em GUCY2c humana (SEQ ID NO: 232) conforme descrito abaixo. Os clones que retiveram a ligação a GUCY2c foram recuperados e suas sequências determinadas.
[00577] A partir deste experimento, as posições em que a sequência humana foi observada em menos de aproximadamente 20 % dos clones de ligação foram definidas como resíduos essenciais de camundongo. Resíduos de camundongo foram preferencialmente retidos em 25 posi- ções (resíduos da cadeia pesada H35, E50, P52a, S53, N54, G55, L56, T57, N58, I60, E61, K62, F63 e N65; resíduos da cadeia leve E27, V29, D30, L32 , M33, Q34, N53, E55, T91, R92 e K93 de acordo com o sis- tema de numeração de Kabat e a definição AbM é usada para CDR1
VH; sistema de numeração Chothia usado para CDR1 de VL) indicando que a substituição desses resíduos por resíduos da linha germinativa humana foi fortemente desfavorecida. Resíduos de camundongos e hu- manos foram encontrados com frequência semelhante (definida como mais de 20 % de conteúdo humano) nos resíduos da cadeia pesada 27 (F/Y) e 30 (S/T) e nos resíduos da cadeia leve 54 (L/V) e 94 (A/V; de acordo com o sistema de numeração de kabat; a definição AbM é usada para CDR1 VH), indicando que a sequência do camundongo nessas po- sições não é crítica.
[00578] Além disso, os resíduos de estrutura (FW) que anteriormente exigiam mutações reversas para os aminoácidos de camundongo (po- sições da cadeia pesada I48 e G49, de acordo com o sistema de nume- ração de Kabat) foram incluídos na estratégia de substituição binária aumentada. Após a seleção e rastreamento do fago, a sequência de aminoácidos humanos para a posição 48 da estrutura da cadeia pesada foi observada aproximadamente 10 % do tempo, sugerindo que a muta- ção reversa é preferida. A posição 49 da cadeia pesada continha o re- síduo de aminoácido de camundongo 100 % do tempo, sugerindo que essa mutação reversa é essencial. A frequência da sequência de ami- noácidos de camundongo ou humano nas posições de CDR ou FW após a substituição binária aumentada é mostrada na Tabela 22. A Tabela 22 demonstra a frequência de incorporação de aminoácidos humanos nas posições de CDR DE GUCY2C-0098 testadas por substituição binária aumentada (usando o sistema de numeração de Kabat e a definição AbM é usada para CDR1 VH; sistema de numeração Chothia usado para CDR1 de VL). Tabela 22 linha germinativa AA hu- Biblioteca de partida % clones de ligação % hu- Sítio GUCY2C-0098 camundongo AA mana humana manos H27 Y F 50 21 H30 T S 35 28 H35 H S 39 2 H50 E N 30 0 H52A P Q 46 0
H53 S D 33 0 H54 N G 37 0 H55 G S 41 1 H56 L E 39 0 H57 T K 46 0 H58 N Y 37 1 H60 I V 43 2 H61 E D 48 3 H62 K S 41 2 H63 F V 35 5 H65 N G 26 4 L27 E Q 48 12 L29 V I 46 4 L30 D S 28 2 L32 L Y 48 0 L33 M L 35 13 L34 Q N 20 6 L53 N S 20 2 L54 V L 50 26 L55 E Q 35 10 L91 T S 43 4 L92 R Y 57 2 L93 K S 48 10 L94 V T 46 24 V 26 10 H48 I H49 G A 48 0 Outra otimização de domínios de ligação anti-GUCY2c
[00579] Variantes de anti-GUCY2c com estabilidade melhorada fo- ram isoladas pelos seguintes procedimentos. As regiões VH e VL do clone humanizado GUCY2C-0241 (SEQ ID NOs: 60 e 137) foram sinte- tizadas como um fragmento variável de cadeia única (scFv) em um vetor de expressão de fago contendo marcadores C-terminais His6 e c-myc (Blue Heron). Mutações aleatórias foram introduzidas nos domínios CDR VH e VL por randomização suave NNK usando (métodos previa- mente descritos na Patente Norte-americana 9.884.921). Oligos desig- nados para mutar seletivamente um resíduo de CDR de cada vez foram sintetizados em um fornecedor (IDT) e, em seguida, usados para intro- duzir alterações no modelo de ácido nucleico usando métodos descritos anteriormente (Townsend et al., 2015, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 112 (50): 15354-15359). Uma mutação designada para eliminar um sítio po- tencial de modificação pós-tradução (G55E de cadeia pesada), que re- move um sítio de desamidação de asparagina NG potencial (Chelius et al., Anal. Chem. 77 (18): 6004-6011, 2005) também foi incorporada em o projeto oligo. Os clones mutados foram escolhidos e enviados para sequenciamento para avaliar a frequência de mutação. Estes vetores de expressão de fago contendo variantes de CDR de VH e VL mutageniza- das de GUCY2C-0241 (SEQ IDNOs: 60 e 137) foram então agrupados em pequenas sub-bibliotecas para exibição em fagos.
[00580] Proteínas GUCY2c humanas, cinomolgas e murinas recom- binantes foram utilizadas durante a seleção e etapas de rastreamento subsequentes (SEQ IDNOs: 230, 232, 234, 236, 238 e 240). Para sele- ções envolvendo proteínas biotiniladas, alíquotas de pools de fagos des- critos acima e contas magnéticas de estreptavidina (estreptavidina Dynabeads M-280) foram bloqueadas separadamente em 3 % de leite/PBS por 1 hora em temperatura ambiente, 60 °C ou 65 °C em um misturador rotativo (20 rpm). Após a incubação a diferentes temperatu- ras, os pools de fagos bloqueados foram centrifugados a 4000 RPM du- rante 10 minutos, os sobrenadantes foram transferidos para tubos novos e misturados com tampão de bloqueio a 6 %. Os fagos bloqueados fo- ram incubados com o excesso de concentrações molares dos reagentes de desseleção (isto é, grânulos de estreptavidina sem alvo, sDNA de fita dupla, insulina e/ou reagentes de extrato de membrana), incubados em temperatura ambiente por 1 hora em um agitador rotativo (20 rpm), mis- turado com contas magnéticas de estreptavidina bloqueadas e incuba- das por mais uma hora. A biblioteca não selecionada foi coletada pele- tizando os grânulos usando um separador magnético. Usando um ins- trumento de purificação magnética Kingfisher (ThermoFisher, Springfi- eld NJ, EUA), o antígeno de seleção biotinilado (em várias concentra- ções, conforme indicado na Tabela 23) foi incubado com a biblioteca de fagos não selecionada em uma placa de 96 cavidades profundas por 1 hora em temperatura ambiente com mistura periódica. As contas foram separadas usando um separador magnético no instrumento Kingfisher e lavadas 4 vezes com PBS/Tween 20 0,1 % e 3 vezes com PBS em placas separadas de 96 cavidades profundas. Os fagos ligados foram eluídos por incubação com 100 mM de trietilamina (TEA) durante 8 mi- nutos em uma placa de 96 cavidades nova seguida pela separação das contas magnéticas. Os fagos eluídos foram neutralizados com Tris-HCl 2 M pH 7,5. Exemplo de condições de seleção de fago para otimização do domínio de ligação anti-GUCY2c são mostrados na Tabela 23. A Ta- bela 23 também mostra as condições de seleção usadas para exibição de fago. Dslxn significa as condições de desseleção usadas. SA = es- treptavidina; D = DNA; I = insulina; M = proteínas de extrato de mem- brana. Térm. representa a incubação térmica realizada antes da incu- bação com o alvo. Tabela 23 Ciclo Condição Ramificação C1R1 Alvo huGUCY2C R1 Conc. do Alvo 10 nM Dslxn SA, D, I, M Térm. Nenhuma Ramificação C1R2A Alvo cyGUCY2C R2 Conc. do Alvo 1 nM Dslxn SA, D, I, M Térm. 60C Ramificação C1R3A1 Alvo huGUCY2C R3 Conc. do Alvo 0,1 nM Dslxn SA, D, I, M Térm. 65°C
[00581] O fago eluído foi usado para infectar 10 ml de uma cultura de E. coli ER2738 que havia crescido até a fase logarítmica média (corres- pondendo a uma OD600 de ~ 0,5). As bactérias foram infectadas com fago por 1 hora a 37°C com agitação a 150 rpm, concentradas após uma etapa de centrifugação e semeadas em placas de bioensaio de ágar YT 2X contendo 2% de glicose e 100 µg/ml de ampicilina (2X YTAG). Várias diluições de cultura de E. coli infectadas com fago de entrada ou saída também foram semeadas em ágar YTAG 2X para determinar os títulos de fago. Após o crescimento durante a noite a 30°C, 10 ml de meio 2X YTAG foram adicionados a cada placa de bioensaio e as células foram ressuspensas por raspagem do gramado bacteriana. Glicerol foi adicio- nado a esta suspensão de células para produzir uma concentração final de 17 % e armazenado em alíquotas a -80°C até uso posterior. A fim de resgatar o fago para a próxima ciclo de seleção, 100 µl desta suspensão de células foram usados para inocular 20 ml de meio 2X YTAG, que foi cultivado a 37°C (300 rpm) para uma OD600 de 0,3-0,5. As células foram então superinfetadas com 3,3 µl de fago auxiliar MK13K07 e incubadas a 37 °C (150 rpm) por 1 hora. As células foram então centrifugadas e o sedimento ressuspenso em meio contendo canamicina/sem glicose (2X YT com 50 µg/ml de canamicina e 100 µg/ml de ampicilina). Esta cultura foi cultivada durante a noite a 30°C (300 rpm). Os fagos foram colhidos no sobrenadante após a centrifugação e estavam prontos para uso no próximo ciclo de seleção, conforme descrito acima. Preparação de Material Periplasmático Cru para Uso em ELISAs
[00582] O ScFv pode ser expresso na superfície de uma partícula de fago ou em solução no espaço periplasmático bacteriano, dependendo das condições de crescimento utilizadas. Para induzir a liberação de scFv no periplasma, placas de 96 cavidades profundas contendo 2X meio YT com 0,1 % de glicose/100 µg/ml de ampicilina foram inoculadas a partir de estirpes de glicerol descongeladas (um clone por cavidade) usando o seletor de colônia QPix (Dispositivos moleculares) e cultivado a 37 °C (999 rpm) por ~ 4 horas. As culturas foram induzidas com IPTG a uma concentração final de 0,02 mM e cultivadas durante a noite a 30°C (999 rpm). O conteúdo do periplasma bacteriano (peripreps) foi liberado por choque osmótico. Resumidamente, as placas foram centri- fugadas e os péletes foram ressuspensos em 150 µl de tampão peri-
plasmático TES (Tris 50 mM, EDTA 1 mM, sacarose 20 %, pH 7,4), se- guido pela adição de 150 µl de 1:5 TES:água e incubados no gelo por 30 minutos. As placas foram centrifugadas durante 20 minutos a 4000 RPM e o sobrenadante contendo scFv foi colhido. ELISA de Competição
[00583] Placas de ELISA (NUNC-Maxisorb 460372) foram revestidas com 1 µg/mL do antígeno de interesse em tampão PBS durante a noite a 4 °C. A solução de revestimento foi descartada e as placas foram en- tão bloqueadas em temperatura ambiente por 2 horas com 70 µL de PBS - BSA 3 % por cavidade. A solução de bloqueio foi descartada e 20 µL de anticorpo primário era uma mistura de amostra desconhecida como peripreps ou proteína purificada (em diluição predeterminada, ti- picamente 1:5) e anticorpo parental puro na concentração desejada (ti- picamente em EC50- EC80). As placas foram incubadas durante 2 ho- ras em temperatura ambiente por agitação lenta. As placas foram lava- das 5 vezes com 100 µL por cavidade de tampão de lavagem (Perkin Elmer 1244-114) e incubadas por 1 hora com 20 µL de conjugado de Europium secundário diluído 1:1000 em tampão de ensaio Delfia (Perkin Elmer 1244-111) para estreptavidina-Eu ou IgG anti-humano, diluído 1:500 para IgG anticamundongo. As placas foram lavadas 5 vezes como antes e incubadas por 30 minutos com 20 µL de solução de realce (Per- kin Elmer 1244-105). A fluorescência resolvida com o tempo foi então medida a 320 e 615 nm usando um leitor de placa EnVision® (EnVi- sion® Multilabel Plate Reader, Perkin Elmer) seguindo os métodos do fabricante. Conversão de ScFv para scFv-Fc, IgG e Anticorpo Biespecífico
[00584] ScFv que demonstra o comportamento desejado foi selecio- nado para subclonagem em scFv-Fc, onde o domínio Fc de IgG1 hu- mano foi anexado à extremidade 3' do scFv. Resumidamente, os frag- mentos foram amplificados por reação em cadeia da polimerase padrão
(PCR) com os iniciadores BssHII para amplificação 5' e BclI para ampli- ficação 3'. Os fragmentos foram cortados com as enzimas de restrição correspondentes de acordo com as especificações do fabricante (New England Biolabs). Os amplicons scFv-Fc anti-GUCY2c foram purifica- dos em gel (Qiagen Gel Purification Kit) e ligados ao vetor de expressão de mamífero pré-cortado da Pfizer contendo o domínio Fc de IgG1 hu- mano. Os construtos ScFv-Fc foram transformados em E. coli e sequen- ciado como antes. Os vetores de expressão verificados pela sequência foram então usados para a expressão transiente de mamíferos em cé- lulas HEK 293, conforme descrito anteriormente. As amostras foram pu- rificadas usando captura de afinidade de Proteína A seguida por troca de tampão em PBS como descrito anteriormente. As amostras purifica- das foram então rastreadas quanto à atividade de ligação da proteína GUCY2c recombinante e quanto à estabilidade. Um exemplo de uma sequência de scFv-Fc é GU-CY2C-0405 (SEQ ID NO: 213). Este for- mato consiste em um scFv na orientação VH-VL conectado pelo Ligante 4, que é um ligante glicina-serina (SEQ ID NO: 193). A VH-VL é conec- tada a um domínio Fc de IgG1 humano modificado (SEQ ID NO: 187) usando duas sequências de ligante, Ligante 5 (SEQ ID NO: 194) e Li- gante 6 (SEQ ID NO: 195).
[00585] Os scFv otimizados também foram subclonados em formatos biespecíficos de células T e IgG1 humanas conforme descrito anterior- mente. Iniciadores específicos de gene de região variável foram desig- nados para clonagem de ITA como antes. Exemplo 11: Ressonância de Plasmônio Superficial de Anticorpos GUCY2c Otimizados
[00586] Os anticorpos GUCY2c otimizados foram avaliados quanto à eliminação por ressonância de plasmônio superficial usando um instru- mento BIACORE™ 8K (GE Healthcare). Usando um Fc anti-humano de Chip de Sensor CM5 (GE BR-1008-39) foi primeiro revestido seguindo o protocolo do fabricante. A IgG anti-GUCY2c humana foi operada no chip por 30 segundos a 0,5 ug/mL, 10 uL/min em solução salina tampo- nada de Hank (HBS) -EP+ pH = 7,4. Em seguida, a proteína GUCY2c humano (SEQ ID NO: 224) em concentrações de 450 nM, 150 nM e 50 nM foi permitida a se associar operando sobre o chip por 54 seg a 50 uL/min, então se dissociar por 300s. O chip foi regenerado entre cada ciclo com afinidade de ligação (nM KD) de MgCl2 3M 3X por 30 seg a 5 BIACORE™) para a proteína GUCY2c recombinante humana de domí- nios de ligação anti-GUCY2c otimizados em formato de IgG1 humana são mostrados na Tabela 24. Vários domínios de ligação GUCY2c oti- mizados tais como GUCY2C-0486 (SEQ ID Nos: 214 e 215) mostram afinidade de ligação melhorada em comparação com o domínio de liga- ção parental não otimizado (GUCY2C-0241). Tabela 24 Clone KD de huGUCY2C (nM) GUCY2C-0210 85,67±2,76 GUCY2C-0212 25,98±0,01 GUCY2C-0241 9,81 GUCY2C-0456 13,75 GUCY2C-0478 29,85±0,26 GUCY2C-0483 6,92±0,13 GUCY2C-0486 5,47±0,07 Exemplo 12: Ensaio de Ligação por Desafio Térmico
[00587] Para avaliar a estabilidade térmica melhorada das variantes otimizadas, preparações periplasmáticas de clones de fago otimizados (descritos acima) ou proteínas purificadas foram avaliadas quanto à ati- vidade de ligação após um desafio térmico a temperaturas elevadas em um bloco de PCR. Placas de ELISA brancas de 384 cavidades Greiner bio-one (781074) foram revestidas com 1 µg/ml de proteína alvo em tampão de revestimento (Na2CO3 25 mM, NaHCO3 75 mM pH 9,6) O/N a 4°C. As placas foram lavadas 3 vezes com PBS + TWEEN20 0,05 % e então bloqueadas por 1 hora em temperatura ambiente agitando com tampão de bloqueio (PBS + leite 3 %). Separadamente, placas de dilui- ção de preparações periplasmáticas ou proteína purificada foram pre- paradas em 1:10 de preparações pré-plasmáticas ou 1 µg/ml (EC80) de ligação de proteína recombinante em temperatura ambiente, em tampão de bloqueio e 100 µl foram transferidos para uma placa de PCR de 96 cavidades. A placa de PCR contendo 100 µl de amostra diluída foi então aquecida às temperaturas desejadas (geralmente entre 55°C e 75°C) durante 30 minutos. As placas foram deixadas resfriar por 15 minutos em temperatura ambiente e então centrifugadas a 4000 rpm por 10 mi- nutos. As placas de ELISA bloqueadas foram esvaziadas e 20 µL do sobrenadante da proteína desafiada termicamente foram adicionados por cavidade, depois incubados por 1 hora, agitando em temperatura ambiente. As placas foram lavadas 3 vezes como antes e 20 µl de um reagente anti-6xHIS-Europium (Perkin Elmer EU-N1) ou uma proteína reagente de conjugado IgG-Europium anti-humano (Perkin Elmer EU- N1) diluída 1:1000 em tampão de ensaio DELFIA (Perkin Elmer 1244- 330) foi adicionado por cavidade e incubado em temperatura ambiente por 1 hora com agitação. As placas foram lavadas 3 vezes com Solução de Lavagem DELFIA 1x (Perkin Elmer 1244-114) e 20 µL de solução de Realce (Perkin Elmer 1244-105) foram adicionados a cada cavidade e incubados durante 30 minutos. As placas foram lidas em um leitor de placas Envision para fluorescência resolvida com o tempo, primeiro em OD320 e depois em OD615 seguindo os métodos do fabricante. A tem- peratura em que 50 % da atividade é retida é relatada como T50. O ensaio de ligação térmica para domínios de ligação GUCY2c com esta- bilidade otimizada como scFv-Fc demonstrou estabilidade térmica me- lhorada após incubação a temperaturas elevadas em comparação com o clone parental não otimizado GUCY2C-0241 (aqui como GUCY2C- 0295 no formato scFv-Fc) (Tabelas 25A e 25B).
[00588] As Tabelas 25A e 25B mostram a fluorescência resolvida com o tempo (TRF) para domínios de ligação GUCY2c otimizados (como proteínas scFv-Fc) em temperatura crescente.
O valor T50 repre- senta a temperatura em que o clone retém 50 % da atividade de ligação.
Tabela 25A Clone 50°C 50,5°C 51,7°C 53,2°C 55,5°C 58,4°C 61,8°C
GUCY2C-0295 113537,5 68863 40896 27068 21936 21409,5 21197
GUCY2C-0389 497589,5 517068 495444,5 397372 464052 150312,5 78680
GUCY2C-0393 477566,5 511271 501945,5 480373,5 451437,5 77154,5 3630,5
GUCY2C-0401 506357,5 526131 535157,5 517779 523479 525247 469885,5
GUCY2C-0403 488139,5 544047,5 526733 536576 526171,5 522549,5 506987,5
GUCY2C-0411 471676,5 522040 542235 531706 539339 515333,5 425089
GUCY2C-0413 574068 598919 607913,5 603587,5 606227 590548 562273,5
GUCY2C-0418 547580 567189,5 526030,5 539879 526607 492907,5 407950
GUCY2C-0421 515013 487958,5 511088,5 510749 547231,5 529472 527035,5
GUCY2C-0423 411893,5 399052,5 462363,5 343803 464695,5 363302 8103
GUCY2C-0425 484807 479583 556277,5 510768 551751,5 548408 527384,5
GUCY2C-0427 512520 546980,5 547056 523887,5 537909,5 533628 498146
GUCY2C-0428 517436,5 541570,5 548392,5 536214,5 536255,5 523982,5 507148
GUCY2C-0435 487047,5 528185 517133,5 489329 490196,5 326153,5 42327
GUCY2C-0439 628296 568971 578626,5 576348,5 591356 585622 597929,5
GUCY2C-0445 536524 543057,5 522756 529305,5 529928 461742 36773,5
GUCY2C-0447 489262,5 499721 483027,5 484959 490929,5 470553,5 424560,5
GUCY2C-0448 565712,5 572475 566258 558343,5 560063 559518 547452
GUCY2C-0450 579746,5 595076,5 582737 578649,5 574037,5 563058,5 555110,5
GUCY2C-0451 564219,5 565212 541781 561199,5 534570 542623 528037
Tabela 25B Clone 64,6°C 66,8°C 68,1°C 69,6°C 70°C T50
GUCY2C-0295 9853,5 1922 594 642,5 464,5 50,41
GUCY2C-0389 51040,5 21131,5 5766 2710,5 640,5 57,98
GUCY2C-0393 1677 909,5 2306 532 745,5 57,65
GUCY2C-0401 26531 3014,5 3061,5 2215 1178,5 62,77
GUCY2C-0403 498400,5 448403,5 298626,5 158161,5 77527 68,01
GUCY2C-0411 52317 20580 5945,5 1917 1162 62,44
GUCY2C-0413 573518,5 541790,5 469893 256224 108873 68,65
GUCY2C-0418 231526 136359 41704 7131,5 2812,5 62,23
GUCY2C-0421 489965 156593 1903,5 1135 980,5 66,44
GUCY2C-0423 2270,5 1542,5 785,5 879,5 929,5 59,23
GUCY2C-0425 494844,5 160062,5 2404,5 944 804 66,45
GUCY2C-0427 486978 224510 2906,5 1084 902,5 66,67
GUCY2C-0428 476739 96235,5 2133,5 1663,5 1332,5 66,1
GUCY2C-0435 17360 2504,5 1119,5 820,5 1061,5 58,65
GUCY2C-0439 562458,5 469494 249716,5 35294 6786,5 67,88 GUCY2C-0445 9384,5 1404,5 372,5 318,5 416 59,21 GUCY2C-0447 241324,5 12424,5 1271 391,5 1092,5 64,6 GUCY2C-0448 510974,5 221540 2645 724,5 648 66,62 GUCY2C-0450 518052,5 131373 1147 468,5 593 66,26 GUCY2C-0451 496304,5 189156 1814,5 693,5 731,5 66,53
[00589] As sequências de aminoácidos para os clones de anticorpo GUCY2c mostrando estabilidade térmica melhorada foram comparadas com o clone parental GUCY2C-0241 (SEQ ID NO: 60 VH e SEQ ID NO: 137 VL). As alterações no conteúdo de aminoácidos em CDRs VH le- vando a estabilidade melhorada são mostradas na Tabela 26A. Mudan- ças nas posições 59, 60, 61 e 62 pareceram ter o maior impacto na estabilidade, correlacionando-se com as maiores mudanças na estabili- dade (de acordo com o sistema de numeração de Kabat, usando a de- finição AbM para CDR1 VH). Tabela 26A Posição Aminoácido Origem Aminoácido Otimizado 30 T G CDR1 VH 31 S N 32 Y D 59 Y V, I, L 60 I N, H, A, S, G CDR2 VH 61 E D, P 62 K Q, R, T 95 T L 96 I V 97 T L, M CDR3 VH 98 T K 99 T P, K, A, S, R
[00590] As alterações no conteúdo de aminoácidos em CDRs VL le- vando a estabilidade melhorada são mostradas na Tabela 26B (o sis- tema de numeração de Chothia foi usado para CDR1 VL e o sistema de numeração de Kabat foi usado para CDR2 e CDR3 VL. Alterações nas posições 53, 54, 55 em CDR2 VL e as posições 93 e 94 em CDR3 VL pareceram ter o maior impacto na estabilidade, correlacionando-se com as maiores mudanças na estabilidade.
Tabela 26B Posição Aminoácido Origem Aminoácido Otimizado 24 R T, K 30a Y W, A 30d T S, H, A, R, N CDR1 VH 33 M L 34 Q H 50 A G 51 A G 52 S T, H 53 N K, H 54 V L, R, I, G, K, T CDR2 VH 55 E A, Y, W, V 56 S P, T, A 89 Q M, L, N 91 T S, N 93 K R, N, Q, S CDR3 VH 94 V A, E, G, D, I, Q 97 T S Exemplo 13: Ligação de Proteína Recombinante de Anticorpos Bi- específicos CD3-GUCY2c Otimizados
[00591] Domínios de ligação anti-GUCY2c otimizados foram avalia- dos em formato biespecífico para ligação simultânea de proteína recom- binante a GUCY2c humano (SEQ ID NO: 224) e CD3 humana (SEQ ID NO: 242) em temperatura ambiente e 60 °C usando o método DELFIA descrito anteriormente. Anticorpos biespecíficos otimizados também fo- ram avaliados quanto à ligação direta a GUCY2c humano (SEQ ID NO: 232) e GUCY2c cinomolgo (SEQ ID NO: 236) em temperatura ambiente e 60 °C usando o método DELFIA descrito anteriormente. A ligação du- pla de anticorpos biespecíficos GUCY2c otimizados para GUCY2c hu- mano e CD3 humana é mostrada na Tabela 27. Anticorpos biespecíficos CD3-GUCY2c otimizados, como GUCY2C-1478 mostram forte ligação tanto em temperatura ambiente quanto a 60°C. Tabela 27 huCD3-huGUCY Sanduíche DEL- huCD3-huGUCY Sanduíche DELFIA Clone FIA T (@1ug/ml) 60C (@1ug/ml) GUCY2C-1186 536148 137679 GUCY2C-1467 830590 620774 GUCY2C-1476 860194,5 682977,5 GUCY2C-1478 833155,5 727935 GUCY2C-1481 790943,5 694815,5 GUCY2C-1512 800436 673743,5 GUCY2C-1518 430465 87434,5 GUCY2C-1526 568727,75 147975 GUCY2C-1527 405448,25 67409 GUCY2C-1538 617581 151603 GUCY2C-1554 138640 14584 GUCY2C-1555 353355,25 68362,25 GUCY2C-1556 217761,5 40731,75 GUCY2C-1557 473322 190626,25 GUCY2C-1590 165141 71515 GUCY2C-1591 422409,25 159723,25 GUCY2C-1592 262425,75 79415,75 GUCY2C-1608 523911,5 192704,5
[00592] Os resultados da ligação direta de anticorpos biespecíficos GUCY2c otimizados para GUCY2c humano e cinomolga são mostrados na Tabela 28. Anticorpos biespecíficos CD3-GUCY2C otimizados, como GUCY2C-1478 demonstram forte ligação em temperatura ambiente para GUCY2c humano e cino, enquanto mostram alguma perda de sinal de ligação após incubação a 60°C. Tabela 28 huGUCY2C TA EC50 CyGUCY2C TA EC50 huGUCY2C 60C EC50 CyGUCY2C 60C Clone (nM) (nM) (nM) EC50(nM) GUCY2C-1478 4,387 4,902 19,24 15,65 GUCY2C-1481 7,836 8,34 27,36 64,99 GUCY2C-1554 18,32 13,93 NB NB GUCY2C-1555 5,391 6,85 39,44 94,86 GUCY2C-1556 13,58 10,14 65,58 62,41 GUCY2C-1557 6,382 7,51 38,2 53,52 GUCY2C-1590 20,25 13,31 48,65 57,3 GUCY2C-1592 13,38 14,39 94,09 75,97 GUCY2C-1608 8,775 9,835 23,67 49,87 Controle Negativo NB NB NB NB Exemplo 14: Ligação de Células de Anticorpos Biespecíficos de CD3-GUCY2c por Citometria de Fluxo
[00593] Anticorpos biespecíficos CD3 otimizados foram titulados para ligação da superfície celular a GUCY2c em células T84 e a CD3 humano em células T humanas virgens purificadas a partir de células mononucleares de sangue periférico humano (PBMCs), usando os mé- todos de citometria de fluxo descritos anteriormente. Os clones de GUCY2c humanizados e otimizados GUCY2C-0247 e GUCY2C-1608 demonstraram afinidade de ligação baixa/sub nM para células T84 que expressam GUCY2c humana (Figuras 2A e 2B). Os anticorpos biespe- cíficos GUCY2c humanizados e otimizados também foram avaliados quanto à ligação à superfície das células CD3 por citometria de fluxo (Figuras 3A e 3B), e mostraram afinidade de ligação nM média baixa para células T humanas virgens. Exemplo 15: Redução de Risco de Imunogenicidade de Anticorpos Biespecíficos GUCY2c
[00594] Quando algumas proteínas terapêuticas são administradas a pacientes, as respostas imunes indesejadas, como a geração de anti- corpo antifármaco (ADA), afetaram a eficácia do fármaco e causaram problemas de segurança do paciente (Yin L., et al., Cell Immunol. Jun; 295 ( 2): 118-26, 2015). Os ADAs podem ser classificados em dois gru- pos: ADA neutralizante (NAb) ou ADA não neutralizante (não NAb), de- pendendo se eles inibem a atividade farmacológica da proteína terapêu- tica (Yin L., et al., Cell Immunol. Jun; 295 (2): 118-26, 2015). Existem dois mecanismos possíveis através dos quais o NAb e o não NAb po- dem contribuir para a redução da eficácia do fármaco. Em primeiro lu- gar, o NAb bloqueia diretamente a ligação da proteína terapêutica à sua molécula de direcionamento, reduzindo, portanto, sua eficácia terapêu- tica (Yin L., et al., Cell Immunol. Jun; 295 (2): 118-26, 2015). Em se- gundo lugar, o NAb e o não NAb podem contribuir para o aumento da depuração que afeta a farmacocinética (PK) do TPP, comprometendo, portanto, a eficácia do fármaco (Yin L., et al., Cell Immunol. Jun; 295 (2):
118-26, 2015). A imunogenicidade contra uma proteína terapêutica pode ser gerada em ambas as vias dependentes de células T e inde- pendentes de células T. Na via dependente de células T, as células T são ativadas através do reconhecimento de peptídeos antigênicos deri- vados de proteínas terapêuticas apresentados por moléculas de classe II do complexo principal de histocompatibilidade (MHC II) em células apresentadoras de antígenos. As células T ativadas, então, estimulam as células B para gerar ADA específico de proteína terapêutica (Yin L., et al., Cell Immunol. Jun; 295 (2): 118-26, 2015). Para minimizar o po- tencial de imunogenicidade decorrente de respostas dependentes de células T, esforços foram feitos para reduzir o potencial antigênico das sequências de anticorpo biespecífico CD3-GUCY2c usando métodos in silico descritos abaixo.
[00595] As sequências foram analisadas usando dois protocolos (de- talhados abaixo) para identificar potenciais epítopos de células T. Qual- quer sequência sinalizada pelas regras aqui descritas para qualquer um dos protocolos foi considerada um epitopo. O presente relatório descri- tivo examina sequências principalmente ao nível do aminoácido 9-mers.
[00596] Método 1: As sequências foram submetidas para análise Epi- Matrix no pacote de software ISPRI (ISPRI v 1.8.0, EpiVax Inc., Provi- dence, RI (2017); Schafer JRA, Jesdale BM, George JA, Kouttab NM, De Groot AS. Prediction of well-conserved HIV-1 ligands using a metrix- based algorithm, EpiMatrix. Vaccine 16 (19), 1880-84,1998). Os resulta- dos brutos fornecem classificações de probabilidade de ligação de cada fragmento de 9-mers de aminoácido contra 8 tipos de HLA diferentes. Assim, existem 8 previsões ("observações") para cada 9-mer. Os 9- mers são gerados a partir de cada posição de numeração linear indivi- dual da sequência (assim, é possível que o mesmo 9-mer ocorra mais de uma vez na mesma sequência). Se quaisquer 4 observações indica- rem que o 9-mer está entre os 5 % principais dos ligantes (o que significa que está previsto estar entre os 5 % principais dos ligantes para pelo menos 4 tipos de HLA), o 9-mer é considerado um epitopo previsto ( "epitopo"). Alternativamente, se qualquer 1 das 8 previsões indicar que o 9-mer está no 1 % superior dos ligantes, o 9-mer também é conside- rado um epitopo previsto.
[00597] Método 2: As sequências foram submetidas para análise usando o método de consenso de ligação de MHC-II (Wang P, Sidney J, Kim Y, Sette A, Lund O, Nielsen M, Peters B. Peptide binding predic- tions for HLA DR, DP and DQ molecules. BMC Bioinformatics 11:568, 2010; Wang P, Sidney J, Dow C, Mothé B, Sette A, Peters B. A system- atic assessment of MHC class II peptide binding predictions and evalu- ation of a consensus approach. PLoS Comput Biol. 4(4),e1000048, 2008in IEDB (Vita R, Overton JA, Greenbaum JA, Ponomarenko J, Clark JD, Cantrell JR, Wheeler DK, Gabbard JL, Hix D, Sette A, Peters B. The immune epitope database (IEDB) 3.0. Nucleic Acids Res. Jan 28 (43), D405-12, 2015; IEDB MHC-II Binding Predictions, http://www.iedb.org)
[00598] A saída do software organiza os resultados por 15-mer. Uma pontuação de consenso e uma classificação percentual são fornecidas para cada combinação de 15-mer e tipo HLA. Mas as pontuações indi- viduais das quais o consenso de cada 15-mer é derivado são classifica- ções de certos 9-mers encontrados no 15-mer: cada método usado para o consenso relata uma classificação percentil para um 9-mer dentro do 15-mer, e o consenso tomado como o valor para o 15-mer geral é a previsão para o 9-mer com a pontuação mediana. Classificamos um 9- mer como um epitopo se (a) for escolhido como o representante de con- senso para o 15-mer E (b) tiver uma classificação de percentil entre os 10 % principais de ligantes para o tipo de HLA sendo considerado, E se os critérios (a) e (b) ocorrem para três ou mais tipos distintos de HLA para o mesmo 9-mer (isto é, três observações). Os tipos de HLA consi- derados foram DRB1*01, 1*03, 1*04, 1*07, 1*08, 1*11, 1*13 e 1*15, que são os mesmos tipos de HLA em um relatório ISPRI/EpiMatrix padrão. Assim, embora a saída principal do método seja uma classificação de 15-mers, reinterpretamos os dados para obter uma lista de epítopos de 9-mers previstos, para facilitar a comparação com o Método 1.
[00599] Classificamos cada epitopo como uma linha germinativa ou epitopo não germinativo. Para os anticorpos, classificamos ainda mais cada epitopo com base em sua localização dentro do anticorpo (CDR ou não CDR). Filtramos sequências de domínios V humanos obtidos de IMGT (www.imgt.org) para remover linhas germinativas anotadas como pseudogenes ou estruturas de leitura abertas (ORFs). Qualquer epitopo 9-mer previsto encontrado nas sequências restantes foi considerado um epitopo da linha germinativa. Os epítopos encontrados nas regiões J ou C (incluindo IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4) ou as junções entre essas regiões também foram classificados como epítopos da linha germinativa. Caso contrário, um epitopo é classificado como um epitopo não germinativo. As definições de CDR foram baseadas no sistema de numeração de Kabat (Kabat EA, Wu TT, Perry HM, Gottesman KS, Foeller C. sequên- cias of Proteins of Immunological Interest, US Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242, 1991), onde as CDRs são definidas para incluir os seguintes resíduos: CDR1 VH (H26-H35 incluindo inserções, como H35A, até mas não incluindo H36), CDR2 VH (H50-H65 inclusive), CDR3 VH (H95-H102 inclusive) CDR1 VL (L24-L34 inclusive), CDR2 VL (L54-L56 inclusive), CDR3 VL (L89-L97, inclusive). Um epitopo 9-mer previsto é um epitopo de CDR se qualquer um dos seus aminoácidos fizer parte de uma região CDR. Observe que nossa posição inicial escolhida (H26) para CDR1 VH difere de algumas outras publicações que usam a anotação de Kabat.
[00600] Para uma cadeia individual ou para um emparelhamento de um domínio VH e VL de anticorpo, uma pontuação geral pode ser cal- culada somando sobre cada um dos 9-mers constituintes como segue.
Todas as combinações individuais de 9-mers e tipo HLA ("observa- ções") são examinadas, independentemente de o 9-mer ser um epitopo. Se uma observação particular indicar que o peptídeo está entre os 5 % superiores dos ligantes para o tipo de HLA em questão, a pontuação Z do EpiMatrix para essa observação é adicionada a um total de execução associado a toda a sequência de proteína. O número total de observa- ções examinadas também é registrado. A única exceção é que todas as observações em 9-mers identificados pelo ISPRI como "regítopos T" são assumidos como tendo pontuações EpiMatrix igual a zero. No total do ciclo, uma pontuação de linha de base de 0,05*2,2248 é subtraída de cada observação (incluindo regítopos T). A pontuação final é calcu- lada da seguinte forma:
[00601] Pontuação ajustada da T-reg = (total em execução) * 1000 / (Número de observações)
[00602] Pontuações mais baixas indicam menor potencial imunogê- nico previsto.
[00603] A pontuação inclui apenas previsões do ISPRI/EpiMatrix e não inclui informações do IEDB. Portanto, quaisquer ligantes HLA fortes previstos pelo IEDB, mas não pelo ISPRI, não contribuem para a pontu- ação. Em teoria, sequências podem conter muitos ligantes HLA previs- tos pelo IEDB e ainda ter uma pontuação ajustada de T-reg favorável se EpiMatrix também não prever as mesmas sequências como ligantes prováveis.
[00604] Alinhamento de regiões GUCY2c VH e VL não otimizadas e otimizadas com linha germinativa. Os resíduos em negrito representam pontos quentes do epitopo da célula T, conforme determinado usando os métodos in silico acima. Em certas modalidades, a substituição é a substituição da linha germinativa humana em que um resíduo de CDR é substituído pelo resíduo da linha germinativa humana correspondente,
para aumentar o conteúdo de aminoácidos humanos e reduzir a poten- cial imunogenicidade do anticorpo (como descrito anteriormente). Em outras modalidades, a substituição é outro aminoácido que reduz o po- tencial de imunogenicidade do anticorpo e que não perturba as proprie- dades de ligação do anticorpo.
[00605] Por exemplo, se a estrutura VH3-7 da linha germinativa hu- mana for usada com anticorpos exemplares GUCY2C-0241, então o ali- nhamento da CDR2 VH de GUCY2C-0241 (SEQ ID NO: 28) e da linha germinativa humana VH3-7 (SEQ ID NO: 178) é o seguinte na Tabela 29 abaixo (usando o sistema de numeração de Kabat): Tabela 29 Clone 50 51 52 52 A 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 VH3-7 N I K Q D G S E K Y Y V D S V K G GUGY2c-0241 E I K P S N G L T N Y I E K F K N
[00606] Para as posições 51, 52, 59 e 64, o resíduo da linha germi- nativa humana e o resíduo GUCY2C-0241 correspondente são iguais e não é possível uma substituição da linha germinativa. Para as posições 50, 52A, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 60, 61, 62, 63 e 65 (negrito), o resíduo da linha germinativa humana e o resíduo GUCY2C-0241 correspon- dente são diferentes. Quando a avaliação do epitopo de células T in silico é executada na sequência GUCY2C-0241, as sequências de pep- tídeos potenciais são identificadas (sublinhado). Estas são então anali- sadas adicionalmente quanto ao conteúdo de linha germinativa não hu- mana e resíduos com uma pontuação de epitopo de célula T > 10 e sendo linha germinativa não humana são direcionados para mutagê- nese (mostrado acima em negrito e sublinhado). Usando mutagênese de randomização suave (métodos previamente descritos na Patente Norte-americana 9.884.921), esses resíduos foram mutados e testados quanto à atividade de ligação retida e estabilidade retida. Exemplo 16: Atividade de Morte de Células Mediada por Células T de Anticorpos Biespecíficos CD3-GUCY2c Otimizados
[00607] Os anticorpos biespecíficos CD3-GUCY2c otimizados foram avaliados quanto à citotoxicidade mediada por células T de células tu- morais, conforme descrito anteriormente. Anticorpos biespecíficos GUCY2c otimizados demonstraram morte melhorada mediada por célu- las T eficientes de células T de células tumorais T84. Os resultados dos ensaios de morte celular com anticorpo biespecífico CD3-GUCY2c hu- manizado (relação E:T = 5:1) são mostrados na Tabela 30 e Figuras 4A a 4D. Tabela 30 Clone EC50 de célula tumoral T84 (nM) GUCY2C-0240 0,53 GUCY2C-0453 17,65 GUCY2C-0454 14,34 GUCY2C-0247 0,07 GUCY2C-0381 2,7 GUCY2C-1186 0,22 GUCY2C-1467 0,2 GUCY2C-1476 0,07 GUCY2C-1478 0,24 GUCY2C-1481 1,57 GUCY2C-1512 0,57 GUCY2C-1518 0,37 GUCY2C-1526 0,13 GUCY2C-1538 0,05 GUCY2C-1554 12,6 GUCY2C-1555 1,13 GUCY2C-1556 5,04 GUCY2C-1557 0,22 GUCY2C-1590 11,07 GUCY2C-1592 2,6 GUCY2C-1608 0,19 Exemplo 17: Análise de Calorimetria de Varredura Diferencial (DSC)
[00608] As proteínas foram diluídas em solução salina tamponada com fosfato (PBS) para 0,6 mg/ml em um volume de 400 µl. A PBS foi usada como um tampão em branco na célula de referência. A PBS con- tinha NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, Na2HPO4 8,1 mM e KH2PO4 1,47 mM, pH 7,2. As amostras foram dispensadas na bandeja de amostra de um MicroCal VP-Capillary DSC com Coletor de amostras automático (Malvern Instruments Ltd, Malvern, UK). As amostras foram equilibradas durante 5 minutos a 10°C e depois varridas até 110°C a uma taxa de 100°C por hora. Um período de filtragem de 16 segundos foi selecio- nado. Os dados brutos foram corrigidos na linha de base e a concentra-
ção de proteína foi normalizada. O Origin Software 7.0 (OriginLab Cor- poration, Northampton, MA) foi usado para ajustar os dados a um mo- delo MN2-State com um número apropriado de transições. Os resulta- dos da calorimetria de varredura diferencial dos domínios de ligação anti-GUCY2c otimizados no formato scFv-Fc são mostrados na Tabela
31. Os clones otimizados mostram temperatura melhorada de desdo- bramento (Tm1) em comparação com o clone parental não otimizado GUCY2C-0247 (aqui como GUCY2C -0295 no formato scFv-Fc). Tabela 31 Clone DSC Tm1 DSC Tm2 DSC Tm3 GUCY2C-0295 57,9 68,8 83,6 GUCY2C-0389 64,2 67,5 83,6 GUCY2C-0393 64,1 67,5 83,6 GUCY2C-0401 69,1 69,1 83,6 GUCY2C-0403 73,3 73,3 84,5 GUCY2C-0411 69,1 69,1 83,8 GUCY2C-0413 71,6 76,2 84,5 GUCY2C-0418 51 68,1 83,7 GUCY2C-0421 71,5 71,5 84 GUCY2C-0423 66,1 66,1 83,8 GUCY2C-0425 71,6 71,6 84 GUCY2C-0427 68,3 72,1 84 GUCY2C-0428 71,2 71,2 84,1 GUCY2C-0435 65,3 65,3 83,7 GUCY2C-0439 72,8 72,8 84,4 GUCY2C-0445 67 67 83,8 GUCY2C-0447 69,7 69,7 84,3 GUCY2C-0448 71,6 71,6 84,3 GUCY2C-0450 71,2 71,2 84,2 GUCY2C-0451 71,6 71,6 84,2 Exemplo 18: Análise de Ressonância de Plasmônio Superficial (SPR) de Anticorpos Específicos para CD3-GUCY2cB
[00609] As afinidades de ligação de anticorpos biespecíficos CD3- GUCY2c para GUCY2c humano (SEQ ID NO: 224), GUCY2c cino (SEQ ID NO: 236) e GUCY2C murina (SEQ ID NO: 240) foram determinadas usando um instrumento BIACORE™ T200 (GE Healthcare ) a 25 °C e 37 °C com uma taxa de coleta de 10 Hz. GUCY2c humana, GUCY2c cino e GUCY2c de camundongo foram imobilizados diretamente em três células de fluxo diferentes de uma superfície de sensor CM5 (BR100530, GE Healthcare) usando um kit de acoplamento de amina (BR100050, GE Healthcare) de acordo com o protocolo do fabricante.
Os níveis finais de imobilização de GUCY2c humana, cino e murino fo- ram 142 unidades de ressonância (RU), 61 RU e 201 RU respectiva- mente.
A célula de fluxo 1 foi usada como uma célula de fluxo de refe- rência.
Uma série de diluição de três vezes de anticorpos biespecíficos CD3-GUCY2c com concentrações variando de 450 nM a 5,56 nM foi injetada sobre a superfície do sensor por 52 segundos a uma taxa de fluxo de 50 µl/min.
A dissociação foi monitorada durante 400 segundos e a superfície foi regenerada com glicina 10 mM pH 2,1. O ciclo e o tampão de amostra foram HEPES 10 mM pH 7,4, NaCl 0,15 M, EDTA 3 mM, P-20 0,05 % (HBS-EP +). Os dados foram duplamente referencia- dos.
As afinidades de ligação e as constantes de taxa foram determina- das ajustando os dados do sensorgrama resultantes a um modelo Lang- muir 1:1 no software de avaliação BIACORE™ T200 versão 3.0 (GE Healthcare). As afinidades de ligação de anticorpos biespecíficos GUCY2c para CD3 humano (SEQ ID NO: 242) e CD3 cino (SEQ ID NO: 244) foram determinadas usando um instrumento BIACORE™ T200 (GE Healthcare) a 25 °C e 37 °C com uma taxa de coleta de 10 Hz.
CD3 humana e cino foram capturados em três células de fluxo diferentes de uma superfície do Chip Sensor CM5 (BR100050, GE Healthcare) usando o Kit de Captura His (28995056, GE Healthcare) de acordo com o protocolo do fabricante.
Os níveis de captura de CD3 humano (SEQ ID NO: 242) foram 8 unidades de ressonância (RU) e 16 RU nas células de fluxo 2 e 3, respectivamente, com 10 RUs de CD3 cino foi capturado na célula de fluxo 4. A célula de fluxo 1 foi usada como uma referência.
Uma série de diluição de três vezes da proteína biespecífica GUCy2c com concentrações variando de 100 nM a 3,7 nM foi injetada sobre a superfície do sensor por 55 segundos a uma taxa de fluxo de 50 µl/min. A dissociação foi monitorada durante 300 segundos e a superfície foi regenerada com glicina 10 mM pH 1,5. O tampão de ciclo e de amostra foi HEPES 10 mM pH 7,4, NaCl 0,15 M, EDTA 3 mM, P-20 0,05 % (HBS- EP+). Os dados foram duplamente referenciados. As afinidades de liga- ção e as constantes de taxa foram determinadas ajustando os dados do sensorgrama resultantes a um modelo Langmuir 1:1 no software de ava- liação BIACORE™ T200 versão 3.0 (GE Healthcare). Os resultados da análise de ligação BIACORE™ de anticorpos biespecíficos CD3- GUCY2c para GUCY2c humano, cino e de camundongo sob diferentes condições, incluindo orientação do ensaio e temperatura, são mostra- dos nas Tabelas 32A a 32J. Os domínios de ligação GUCY2C humani- zados e otimizados mostram ligação retida ou melhorada a GUCY2C e CD3 como anticorpos biespecíficos. Em alguns casos, temperatura ele- vada (37C), uma diminuição na afinidade de ligação foi observada.
[00610] A Tabela 32A mostra a cinética de ligação de anticorpos bi- específicos CD3-GUCY2c para GUCY2c humano. O método de captura usado foi a captura de IgG anti-humana a 25 °C. Tabela 32A Clone ka (1/Ms) kd (1/s) KD (nM) N GUCY2C-0074 4,41E + 4 + 2,17E + 3 2,00E-3 + 4,27E-5 45,40 + 2,90 4 GUCY2C-0098 1,36E + 5 ± 4,79E + 1 6,75E-4 ± 1,97E-6 4,96 ± 0,02 2 GUCY2C-0240 9,62E + 4 ± 4,76E + 3 3,64E-3 ± 1,22E-5 37,90 ± 1,75 2 GUCY2C-0247 9,82E + 4 ± 1,64E + 3 4,57E-4 ± 2,84E-6 4,65 ± 0,09 4 GUCY2C-1478 1,18E + 5 ± 7,24E + 2 4,34E-4 ± 3,05E-5 3,69 ± 0,28 2
[00611] A Tabela 32B mostra a cinética de ligação de anticorpos bi- específicos CD3-GUCY2c a GUCY2c humano. O método de captura usado foi imobilização direta a 25°C. Tabela 32B Clone ka (1/Ms) kd (1/s) KD (nM) N GUCY2C-0077 1,43E+5 + 1,7E+4 2,24E-2 + 1,00E-3 160,00 ± 25,00 2 GUCY2C-0098 1,45E+5 ± 2,41E+3 1,04E-3 ± 2,61E-5 7,19 ± 0,30 2 GUCY2C-0104 1,48E+5 + 1,00E+4 3,86E-3 + 2,00E-5 26,10 ± 1,90 2
GUCY2C-0240 9,62E+4 ± 4,76E+3 3,64E-3 ± 1,22E-5 37,90 ± 1,75 2 GUCY2C-0247 1,44E+5 ± 1,83E+3 4,33E-4 ± 2,88E-6 3,01 ± 0,02 2 GUCY2C-1608 1,01E+5 ± 2,19E+3 7,58E-4 ± 1,68E-6 7,47 ± 0,15 2
[00612] A Tabela 32C mostra a cinética de ligação de anticorpos bi- específicos CD3-GUCY2c a GUCY2c humano. O método de captura uti- lizado foi a imobilização direta a 37 °C. Tabela 32C Clone ka (1/Ms) kd (1/s) KD (nM) N GUCY2C-0098 2,51E+5 ± 4,65E+3 3,77E-3 ± 1,85E-5 15,02 ± 0,35 2 GUCY2C-1608 1,61E+5 ± 8,47E+3 2,17E-3 ± 6,58E-5 13,52 ± 1,12 2
[00613] A Tabela 32D mostra a cinética de ligação de anticorpos bi- específicos CD3-GUCY2c a GUCY2c cino. O método de captura usado foi a captura de IgG anti-humana a 25 °C. Tabela 32D Clone ka (1/Ms) kd (1/s) KD (nM) N GUCY2C-0074 4,73E+4 + 7,70E+3 2,84E-3 + 3,60E-4 60,35 + 2,15 2 GUCY2C-0098 1,34E+5 ± 1,63E+3 5,24E-4 ± 3,93E-5 3,93 ± 0,34 2 GUCY2C-0240 2,61E+4 + 7,10E+3 2,34E-3 + 5,24E-4 91,20 + 12,50 4 GUCY2C-0247 8,55E+4 ± 1,35E+4 3,69E-4 ± 4,35E-5 4,35 ± 0,24 4
[00614] A Tabela 32E mostra a cinética de ligação de anticorpos bi- específicos CD3-GUCY2c a GUCY2c cino. O método de captura usado foi imobilização direta a 25 °C. Tabela 32E Clone ka (1/Ms) kd (1/s) KD (nM) N GUCY2C-0098 2,06E+5 ± 1,17E+3 5,77E-4 ± 3,50E-6 2,80 ± 0,03 2 GUCY2C-1608 1,38E+5 ± 1,04E+3 4,17E-4 ± 7,61E-6 3,01 ± 0,03 2
[00615] A Tabela 32F mostra a cinética de ligação de anticorpos bi- específicos CD3-GUCY2c para GUCY2c cino. O método de captura usado foi imobilização direta a 37 °C. Tabela 32F Clone ka (1/Ms) kd (1/s) KD (nM) N GUCY2C-0098 3,10E+5 ± 7,75E+3 2,64E-3 ± 3,76E-5 8,52 ± 0,33 2 GUCY2C-1608 1,91E+5 ± 1,18E+4 1,66E-3 ± 4,67E-5 8,68 ± 0,29 2
[00616] A Tabela 32H mostra a cinética de ligação de anticorpos bi- específicos CD3-GUCY2c a GUCY2C murino. O método de captura usado foi a captura de IgG anti-humana a 25°C. Tabela 32H Clone ka (1/Ms) kd (1/s) KD (nM) N GUCY2C-0074 1,48E+4 ± 5,32E+1 2,82E-3 ± 1,08E-4 191,01 ± 6,60 2 GUCY2C-0098 3,75E+4 ± 1,31E+3 4,02E-3 ± 2,25E-5 107,19 ± 3,15 2 GUCY2C-0240 1,06E+4 ± 8,30E+1 3,36E-3 ± 6,89E-5 316,54 ± 8,95 2
[00617] A Tabela 32I mostra a cinética de ligação de anticorpos bies- pecíficos CD3-GUCY2c a GUCY2C murino. O método de captura usado foi imobilização direta a 25°C. Tabela 32I Clone ka (1/Ms) kd (1/s) KD (nM) N GUCY2C-0098 1,34E+5 ± 1,61E+3 2,68E-3 ± 1,55E-5 19,97 ± 0,36 2 GUCY2C-0240 1,22E+5 ± 3,83E+3 5,15E-3 ± 1,35E-5 42,34 ± 1,44 2 GUCY2C-0247 1,50E+5 ± 1,67E+3 1,83E-3 ± 9,99E-6 12,22 ± 0,07 2 GUCY2C-1608 9,12E+4 ± 1,13E+3 1,57E-3 ± 3,04E-6 17,27 ± 0,25 2
[00618] A Tabela 32J mostra a cinética de ligação de anticorpos bi- específicos CD3-GUCY2c para GUCY2C murino. O método de captura usado foi imobilização direta a 37°C. Tabela 32J Clone ka (1/Ms) kd (1/s) KD (nM) N GUCY2C-0098 1,96E+5 ± 1,25E+4 2,01E-2 ± 1,48E-3 102,66 ± 0,97 2 GUCY2C-1608 1,29E+5 ± 7,10E+3 1,16E-2 ± 1,61E-4 90,17 ± 3,71 2
[00619] As tabelas 33A a 33F mostram a análise de ligação a BIA- CORE™ de antibióticos biespecíficos CD3-GUCY2c para CD3 cino e humano sob diferentes condições, incluindo orientação de ensaio e tem- peratura.
[00620] A Tabela 33A mostra a cinética de ligação de anticorpos bi- específicos CD3-GUCY2c à proteína CD3 humano. O método de cap- tura usado foi a captura de IgG anti-humana a 25 °C. Tabela 33A Clone ka (1/Ms) kd (1/s) KD (nM) N GUCY2C-0074 4,71E+5 + 2,16E+5 8,61E-4 + 1,56E-5 2,17 + 0,99 4
GUCY2C-0098 2,97E+5 ± 1,28E+3 9,67E-4 ± 2,15E-5 3,26 ± 0,09 2 GUCY2C-0240 3,47E+5 + 8,83E+3 1,29E-3 + 4,5E-5 3,73 + 0,19 4 GUCY2C-0247 2,95E+5 ± 2,17E+3 9,85E-4 ± 6,34E-6 3,34 ± 0,04 4
[00621] A Tabela 33B mostra a cinética de ligação de anticorpos bi- específicos CD3-GUCY2c ao CD3 humano. O método de captura usado foi anti-His a 25°C. Tabela 33B Clone ka (1/Ms) kd (1/s) KD (nM) N GUCY2C-0098 1,10E+6 ± 2,14E+4 5,24E-3 ± 8,88E-5 4,75 ± 0,08 4 GUCY2C-1478 3,55E+5 ± 6,10E+3 9,56E-3 ± 1,37E-4 26,93 ± 0,76 3 GUCY2C-1608 4,18E+5 ± 2,78E+4 9,99E-3 ± 2,41E-4 23,97 ± 0,97 4
[00622] A Tabela 33C mostra a cinética de ligação de anticorpos bi- específicos CD3-GUCY2c ao CD3 humano. O método de captura usado foi anti-His a 25°C. Tabela 33C Clone ka (1/Ms) kd (1/s) KD (nM) N GUCY2C-0098 2,51E+6 ± 6,34E+5 5,05E-2 ± 1,43E-2 19,93 ± 0,72 4 GUCY2C-1608 7,44E+5 ± 2,31E+5 9,00E-2 ± 2,18E-2 123,77 ± 10,95 4
[00623] A Tabela 33D mostra a cinética de ligação de anticorpos bi- específicos CD3-GUCY2c para CD3 cino. O método de captura usado foi anti-His a 25°C. Tabela 33D Clone ka (1/Ms) kd (1/s) KD (nM) N GUCY2C-0074 4,25E+5 + 1,36E+4 1,12E-3 + 8,98E-5 2,64 + 0,28 4 GUCY2C-0098 2,84E+5 ± 9,80E+3 1,01E-3 ± 3,55E-5 3,56 ± 0,25 2 GUCY2C-0240 4,40E+5 + 5,00E+2 2,07E-3 + 8,00E-5 4,71 + 0,19 2 GUCY2C-0247 2,80E+5 ± 1,48E+4 1,00E-3 ± 6,76E-5 3,61 ± 0,43 4
[00624] A Tabela 33E mostra a cinética de ligação de anticorpos bi- específicos CD3-GUCY2c ao CD3 cyno. O método de captura usado foi anti-His a 25°C. Tabela 33E Clone ka (1/Ms) kd (1/s) KD (nM) N GUCY2C-0098 9,69E+5 ± 1,85E+4 4,78E-3 ± 1,03E-4 4,94 ± 0,01 2 GUCY2C-1608 3,81E+5 ± 2,33E+4 9,16E-3 ± 2,31E-4 24,12 ± 0,87 2
[00625] A Tabela 33F mostra a cinética de ligação de anticorpos bi- específicos CD3-GUCY2c para CD3 cino. O método de captura usado foi anti-His a 25°C. Tabela 33F Clone ka (1/Ms) kd (1/s) KD (nM) N GUCY2C-0098 2,28E+6 ± 3,59E+5 4,42E-2 ± 7,86E-3 19,34 ± 0,40 2 GUCY2C-1608 5,14E+5 ± 1,86E+4 6,65E-2 ± 1,46E-3 129,78 ± 7,53 2 Exemplo 19: Medições de Liberação de Citocinas in vitro de Anti- corpos Biespecíficos CD3-GUCY2c
[00626] As células T84 foram tratadas com células T (relação E:T de 5:1) e GUCY2C-1608 em diferentes doses. Os sobrenadantes foram co- letados em diferentes pontos de tempo (24h, 48h, 96h) e analisados usando um ensaio Lumninex multiplex de acordo com as diretrizes do fabricante e lidos em um Luminex 200 com software xPONENT. As ci- tocinas medidas foram IFN-gama humana, IL10, IL2, IL4, IL6, TNF-alfa. As Figuras 5A-5F ilustram os perfis de liberação de citocinas para GUCY2C-1608. Essas citocinas foram reguladas positivamente com tra- tamento com GUCY2C-1608 de células T84 na presença de células T, suportando um mecanismo de atividade de anticorpo CD3-GUCY2c bi- específico mediado por células T em células que expressam GUCY2c . Exemplo 20: Avaliação in vivo da Atividade Mediada pelo Anticorpo Biespecífico CD3-GUCY2c
[00627] PBMCs humanas foram descongeladas em meio (X-VIVO 15 (Lonza). Albumina de soro humano 5 % (Gemini # 100-318), Pen/Estrep 1 %, 2-mercaptoetanol 0,01 mM) em aproximadamente 5 milhões de células por ml. As células foram centrifugadas e ressuspensas em tam- pão Robosep (Stem Cell Technologies) a uma concentração de 50 mi- lhões de células por ml. As células T foram isoladas usando o kit de enriquecimento de células T humanas EasySep (Stem Cell Technolo- gies). As células T foram ativadas e expandidas usando um kit de ativa- ção/expansão de células T humanas (Miltenyi). No dia 2, as células T foram transferidas para um dispositivo de cultura de célula G-Rex para expansão e IL-2 (Stem Cell Technologies) foi adicionada ao meio e re- abastecido após 2 dias. As células T foram colhidas 1 semana após a ativação/expansão. No momento da colheita, os grânulos foram remo- vidos com um ímã, e as células foram ressuspensas em DPBS a 1x107 células/mL para inoculação in vivo.
[00628] Para estudos de xenoenxerto, camundongos NSG foram ino- culados com linhagens celulares tumorais colorretais (T84, H55, LS1034) ou fragmentos de xenoenxerto derivados de paciente (PDX- CRX-11201, PDX-CRX-12213, PDX-CRX-24225) subcutaneamente no flanco.
[00629] As medições do tumor foram coletadas usando um paquíme- tro digital Vernier, e os volumes foram calculados pelo uso da fórmula elipsoide modificada ½ × comprimento × largura2. Os camundongos fo- ram randomizados e testados em um tamanho de tumor de 150-200 mm3. Uma dose inicial de GUCY2c biespecífico, controle negativo bies- pecífico ou veículo foi administrada aos animais no dia 0, e 2 milhões de células T cultivadas foram inoculadas no dia seguinte. Os camundon- gos foram dosados em injeção de bolus de 0,2 mL semanalmente até 5 vezes, e todas as administrações de compostos e células T foram intra- venosas através da veia lateral da cauda de cada animal. As medições do tumor foram coletadas duas vezes por semana, juntamente com mo- nitoramento contínuo para sinais de uma resposta do enxerto contra o hospedeiro (Figuras 6-15). Todos os anticorpos CD3-GUCY2c biespe- cíficos mostraram atividade antitumoral mediada por células T depen- dente da dose em ambos os modelos de xenoenxerto de linhagem ce- lular e xenoenxerto derivado de paciente. Exemplo 21: Ensaio de Monofosfato de guanosina cíclico (cGMP) para caracterizar GUCY2c-CD3 biespecífico para potencial ativi- dade de modulação da via GUCY2c
[00630] Para testar a produção de monofosfato de guanosina cíclico (cGMP) por células T84 em resposta à estimulação da via GUCY2c, 2 x106 células T84 foram semeadas em uma placa de 24 cavidades du- rante a noite. As células foram lavadas com DMEM contendo HEPES 50 mM e tratadas com DMEM contendo HEPES 50 mM e 3-isobutil-1- metilxantina (IBMX) 1 mM durante 15 minutos. As células foram então tratadas com GUCY2C-1608 ou um controle negativo biespecífico em concentrações que variam de 0,1 a 99 µM. Como um controle positivo, foi adicionado agonista de GUCY2c, enterotoxina STp (BACHEM) (0,02 a 51 µM) por 45 minutos. As partículas foram removidas por centrifuga- ção e 200 µl do sobrenadante foram usados para testar a produção de cGMP usando o Kit cGMP Parameter Assay (R&D Systems) de acordo com as diretrizes do fabricante. Para avaliar a potencial atividade neu- tralizante de GUCY2C-1608, 0,2 µM de STp foi adicionado ao mesmo intervalo de GU-CY2C-1608 ou controle negativo biespecífico descrito acima para 45 minutos, e os sobrenadantes foram analisados de forma semelhante para níveis de cGMP.
[00631] A atividade da via GUCY2c foi avaliada em células T84 me- dindo a produção de cGMP. Enquanto a enterotoxina STp bacteriana de agonista da via GUCY2c aumentou o cGMP de uma maneira depen- dente da dose, a produção de cGMP não foi aumentada pela adição de concentrações crescentes de GUCY2C-1608. Além disso, GUCY2C- 1608 não afetou a produção de cGMP induzida por 0,2 µM de STp (Fi- gura 16). Essas descobertas indicam que GUCY2C-1608 não é um ago- nista da via GUCY2c e não neutraliza a função da via GUCY2c na pre- sença de ligante. Exemplo 22: ELISA de Poliespecificidade de DNA e insulina
[00632] A ligação não específica de anticorpos a moléculas diferen- tes de seus alvos foi proposta como um mecanismo de depuração rá- pida in vivo (Hötzel et al., 2010, MAbs 4 (6): 753-760). A evidência para tal ligação não alvo polirreativa pode ser obtida através da medição da ligação a preparações de membrana (Xu et al., Protein Eng. Des. Select. 26 (10): 663-70, 2013), partículas de baculovírus (Hötzel et al., mAbs 4, 753-760, (2012), ou substratos carregados negativamente, como DNA, insulina e heparina (Tiller et al., J. Immunol. Methods 329 (1-2): 112- 124, 2008). O ELISA para DNA e insulina usou um protocolo de baixo rigor originalmente desenvolvido para a detecção de autoanticorpos de baixa afinidade de pacientes com lúpus (Tiller et al., J. Immunol. Me- thods 329, 112, 2008; Patente Norte-americana No. 7.314.622).
[00633] Placas de ELISA de 384 cavidades (Nunc Maxisorp) foram revestidas durante a noite a 4 °C com DNA (10 µg/ml) e insulina (5 µg/ml) em PBS pH 7,5. O ELISA, adaptado de ensaios descritos em Tiller et al., J. Immunol. Methods 329, 112, 2008; Patente Norte-ameri- cana No. 7.314.622, foi realizado em um robô de manipulação de líqui- dos Perki-nElmer Janus. As cavidades foram lavadas com água, blo- queadas com 50 µl de tampão ELISA de polirreatividade (PEB; PBS contendo Tween-20 a 0,5 %, EDTA 1 mM) durante 1 hora em tempera- tura ambiente e enxaguadas três vezes com água. Os mAbs diluídos em série em 25 µl foram adicionados em quadruplicata a cavidades e incubados durante 1 h em temperatura ambiente. As placas foram lava- das 3 vezes com água, e 25 µl de IgG anti-humana de cabra 10 ng/ml, (específico para o fragmento Fcγ) conjugado com peroxidase de rábano silvestre (Jackson ImmunoResearch) foram adicionados a cada cavi- dade. As placas foram incubadas durante 1h em temperatura ambiente, lavadas 3 vezes com 80 µl de água e 25 µl de substrato TMB (Sigma Aldrich) adicionado a cada cavidade. As reações foram interrompidas após 6 minutos e 50 segundos adicionando 25 µl de ácido ortofosfórico 0,18 M a cada cavidade e a absorvência lida a 450 nm. As pontuações de ligação ao DNA e à insulina foram calculadas como a relação do sinal ELISA do anticorpo a 10 µg/ml para o sinal de uma cavidade contendo tampão. A Tabela 34 mostra a análise poliespecificamente de anticorpos CD3-GUCY2c biespecíficos usando o DNA e ELISA de ligação à insu- lina. Anticorpos biespecíficos otimizados mostram baixo potencial para ligação não específica. Tabela 34 Pontuação de Polirreati- Pontuação de Polirre- Clone vidade de DNA atividade de Insulina GUCY2C-0405 3 1 GUCY2C-0486 2 1 GUCY2C-1186 13 7 GUCY2C-1467 6 7 GUCY2C-1476 7 7 GUCY2C-1478 5 7 GUCY2C-1481 4 5 GUCY2C-1518 6 3 GUCY2C-1526 6 4 GUCY2C-1538 13 7 GUCY2C-1554 3 2 GUCY2C-1555 4 2 GUCY2C-1556 3 1 GUCY2C-1557 5 3 GUCY2C-1590 2 1 GUCY2C-1591 3 2 GUCY2C-1592 4 2 GUCY2C-1606 2 1 GUCY2C-1608 3 2 Exemplo 23: Espectroscopia de Nanopartículas de Autointeração de Captura de Afinidade (AC-SINS)
[00634] Anticorpos e proteínas semelhantes a anticorpos têm o po- tencial de interagir entre si, particularmente em concentrações elevadas. Esta auto-interação pode levar a desafios de viscosidade associados à formulação durante o desenvolvimento do fármaco, bem como aumento do risco de depuração (Avery et al., MAbs, 2018, Vol. 0, N0. 0, 1-12). O ensaio de espectroscopia de nanopartículas de autointeração de cap- tura de afinidade mede a auto-interação e é usado para ajudar a prever a alta viscosidade e o potencial para propriedades farmacocinéticas fra- cas.
[00635] O ensaio AC-SINS foi padronizado em um formato de 384 cavidades em um robô de manuseio de líquidos Perkin-Elmer Janus. Nanopartículas de ouro de 20 nm (Ted Pella, Inc., # 15705) foram re- vestidas com uma mistura de 80 % de Fc anti-humano de cabra (Jack- son ImmunoResearch Laboratories, Inc. # 109-005-098) e 20 % de an- ticorpos policlonais de cabra não específicos (Jackson ImmunoRese- arch Laboratories, Inc. # 005-000-003) que foram trocados de tampão por acetato de sódio 20 mM pH 4,3 e diluídos para 0,4 mg/ml. Após uma hora de incubação em temperatura ambiente, os sítios não ocupados nas nanopartículas de ouro foram bloqueados com polietilenoglicol tio- lado (2 kD). As nanopartículas revestidas foram então concentradas 10 vezes usando um filtro de seringa e 10 µl foram adicionados a 100 µl de mAb a 0,05 mg/ml em PBS pH 7,2. As nanopartículas revestidas foram incubadas com o anticorpo de interesse por 2 horas em uma placa de polipropileno de 96 cavidades e depois transferidas para uma placa de poliestireno de 384 cavidades e lidas em um espectrofotômetro Tecan M1000. A absorvência foi lida de 450-650 em incrementos de 2 nm, e uma macro do Microsoft Excel foi usada para identificar a absorvência máxima, suavizar os dados e ajustar os dados usando um polinômio de segunda ordem. A absorvência máxima suavizada do branco médio (tampão PBS sozinho) foi subtraída da absorvência máxima suavizada da amostra de anticorpo para determinar a pontuação AC-SINS do an- ticorpo. A Tabela 35 mostra um ensaio de não especificidade AC-SINS para anticorpos CD3-GUCY2c biespecíficos otimizados mostra baixo potencial para autointeração e não especificidade. Tabela 35
Clone AC-SINS GUCY2C-0405 4 GUCY2C-0486 7 GUCY2C-1186 2 GUCY2C-1467 2 GUCY2C-1476 2 GUCY2C-1478 2 GUCY2C-1481 2 GUCY2C-1518 1 GUCY2C-1526 2 GUCY2C-1538 2 GUCY2C-1554 1 GUCY2C-1555 1 GUCY2C-1556 0 GUCY2C-1557 1 GUCY2C-1590 0 GUCY2C-1591 1 GUCY2C-1592 1 GUCY2C-1608 1 Exemplo 24: Geração, Expressão e Purificação de Linhagem Celu- lar Estáveis do Anticorpo GUCY2c-1608 Biespecífico
[00636] As duas cadeias que codificam o anticorpo GUCY2C-1608 biespecífico foram clonadas no vetor de expressão de mamífero pRY19- GA-Q contendo um promotor duplo e sítio de recombinação para inte- gração de sítio único (SSI) (Zhang, L. et al. Biotechnology Progress., 31 : 1645-1656, 2015) no genoma da célula CHO. SSI depende da inserção do gene de interesse usando uma troca de cassete com base em re- combinase em uma localização cromossômica conhecida por sua alta expressão de gene estável. Os construtos GUCY2C-1608-Buraco e GUCY2C-1608-Protuberância foram clonados em nosso vetor de ex- pressão no cassete um e dois, respectivamente. O plasmídeo GUCY2C- 1608 resultante foi transfectado em células CHO-K1 SV 10E9 por meio de eletroporação com o vetor pRY19 contendo o gene de interesse se- guido por pressão de seleção positiva e negativa usando higromicina-B e ganciclovir.
Esses pools de CHO passaram por uma fase de recupe- ração de 3 semanas.
Quando as viabilidades observadas foram superi- ores a 90 %, bancos de células foram gerados para trabalhos futuros.
Os conjuntos de CHO estabelecidos foram então submetidos a um pro- cesso de expressão de plataforma de batelada alimentada de 12 dias em meios CD-CHO (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA). No final do processo de 12 dias, as células foram centrifugadas a 3000 x g durante 10 minutos, seguido por filtração estéril do meio condicionado usando um filtro superior de garrafa PES de 0,2 um (Corning, Oneonta, NY). Além disso, os pools de CHO estáveis foram dimensionados para um biorreator de agitação controlada de 10L (Finesse, Santa Clara, CA). Os pools de CHO foram cultivados em meio de propriedade da Pfizer em uma batelada alimentada de 12 dias que incluía alimentos quimica- mente definidos para manter a viabilidade da cultura.
Quando concluída, a cultura foi filtrada em profundidade usando uma série de filtro que con- siste em um Pall Profile II de 20" 5 um seguido por um Pall Supor de 10" 0,2 um (Pall Corporation, Port Washington, NY). Os títulos foram avali- ados por cromatografia de afinidade em proteína A.
A purificação de proteínas foi então realizada utilizando técnicas conhecidas na técnica, incluindo cromatografia de proteína A, cromatografia de interação hidro- fóbica e cromatografia de permuta iônica.
O título de expressão de pro- teína para GUCY2C-1608 de um conjunto de células CHO transfectadas de forma estável é mostrado na Tabela 36. Os títulos de expressão para conjuntos de clones GUCY2C-1608 exibiram níveis de expressão entre 0,48 e 0,84 gramas/litro.
Tabela 36 Pool de Clone Expressão g/L Pool A 0,842 Pool B 0,710 Pool C 0,480
Exemplo 25: Análise Espectrométrica de Massa do Anticorpo
GUCY2C-1608 Biespecífico
[00637] A análise LC/MS foi realizada para confirmar a geração do anticorpo biespecífico purificado GUCY2C-1608 emparelhado correta- mente. Os pesos moleculares da molécula biespecífica são definidos por suas sequências de aminoácidos exclusivas, e a determinação pre- cisa do peso molecular fornece evidências da presença de moléculas biespecíficas de GUCY2c corretamente pareadas. Resumidamente, a amostra de CD3-GUCY2c biespecífico foi analisada por análise por LC/MS em um HPLC Waters Acquity H-Class acoplado a um espectrô- metro de massa Bruker maXis II Q-ToF. Os analitos foram carregados em uma coluna SMT SAM C2 (2,1 mm X 100 mm, mantida a 80 °C) e eluídos usando um gradiente terciário de tampão B (80 % de 1-propanol, 20 % de acetonitrila, com 0,05 % de ácido trifluoroacético) e tampão C (100 % de acetonitrila com 0,05 % de ácido trifluoroacético) a uma taxa de fluxo de 300 µl/min (5 min de rampa para 19 % de B e 4 % de C, 20 min de rampa para 22 % de B e 16 % de C, 10 min de rampa para 0 % de B e 98 % de C. A detecção por espectrometria de massa foi realizada em modo positivo com voltagem capilar definida em 3,5 kV. A análise de dados foi realizada com deconvolução MaxEnt 1 em Compass Data- Analysis v4.2. A Figura 17 mostra alta pureza no peso molecular pre- visto do anticorpo biespecífico GUCY2C-1608 purificado final. Exemplo 26: Sequências
[00638] As Tabelas 37A e 37B fornecem um resumo do anticorpo ou fragmentos de anticorpo SEQ ID NOs como aqui descrito. A Tabela 37A usa o sistema de numeração ABM para sequências de CDR1s VH. A Tabela 37A usa o sistema de numeração de Kabat para todas as outras sequências, incluindo CDR2s VH. Tabela 37A
Sequence
CDR_H1
CDR_H2
CDR_H3
CDR_L1
CDR_L2
CDR_L3
Linker 1
Linker 2 FW_H1 FW_H2 FW_H3 FW_H4
FW_L1
FW_L2
FW_L3
FW_L4 FV_H
FV_L
CD3-0001 2 3 4 77 78 79 1 76 5 6 7 8 80 81 82 83 NA NA CD3-0004 2 3 4 85 78 79 1 84 5 6 7 8 86 87 88 89 NA NA CD3-0006 2 10 4 91 78 79 9 90 5 6 7 8 80 81 82 83 NA NA GUCY2C-0074 12 13 14 93 94 95 11 92 15 16 17 18 96 97 98 99 190 NA GUCY2C-0077 20 21 22 101 102 95 19 100 23 24 25 18 96 97 103 99 190 NA GUCY2C-0078 20 21 22 105 102 95 19 104 23 24 25 18 96 97 103 99 190 NA GUCY2C-0098 27 28 29 107 108 109 26 106 30 16 31 32 96 110 111 99 190 NA GUCY2C-0104 34 35 36 113 114 115 33 112 37 38 39 40 116 110 117 118 190 NA GUCY2C-0105 42 43 44 120 78 121 41 119 45 46 47 32 122 123 124 99 190 NA GUCY2C-0240 12 13 14 93 94 95 48 125 5 49 50 51 126 127 82 128 190 NA GUCY2C-0315 12 53 14 93 94 95 52 129 54 55 56 51 130 131 132 133 NA NA 278/359
GUCY2C-0179 42 43 44 120 78 121 57 134 5 49 58 59 80 135 82 83 NA NA GUCY2C-0193 27 28 29 107 108 109 60 136 5 49 61 51 80 81 82 128 NA NA GUCY2C-0210 27 28 29 107 108 109 62 137 5 63 7 51 126 81 82 128 NA NA GUCY2C-0212 27 28 29 107 108 109 64 137 5 49 7 51 126 81 82 128 NA NA GUCY2C-0241 27 28 29 107 108 109 60 137 5 49 61 51 126 81 82 128 NA NA GUCY2C-0247 27 28 29 107 108 109 60 138 5 49 61 51 126 139 82 128 190 NA GUCY2C-1186 27 66 29 107 141 142 65 140 5 49 61 51 126 81 82 128 190 NA GUCY2C-1467 27 28 29 107 144 109 60 143 5 49 61 51 126 81 82 128 190 NA GUCY2C-1476 27 68 29 107 146 142 67 145 5 49 61 51 126 81 82 128 190 NA GUCY2C-1478 27 70 29 148 149 142 69 147 5 49 61 51 126 81 82 128 190 191 GUCY2C-1481 27 70 29 107 151 142 69 150 5 49 61 51 126 81 82 128 190 NA GUCY2C-1512 27 72 29 153 141 154 71 152 5 49 61 51 126 81 82 155 190 NA GUCY2C-1518 27 70 29 153 157 142 69 156 5 49 61 51 126 81 82 128 190 NA GUCY2C-1526 27 68 29 153 159 142 67 158 5 49 61 51 126 81 82 128 190 NA GUCY2C-1527 27 70 29 107 161 154 69 160 5 49 61 51 126 81 82 128 190 NA GUCY2C-1538 27 68 29 163 164 165 67 162 5 49 61 51 126 81 82 128 190 NA GUCY2C-1554 74 75 29 167 168 169 73 166 5 49 61 51 80 81 82 128 190 NA GUCY2C-1555 74 75 29 167 149 169 73 170 5 49 61 51 80 81 82 128 190 NA GUCY2C-1556 74 75 29 167 168 142 73 171 5 49 61 51 80 81 82 128 190 NA GUCY2C-1557 74 75 29 167 149 142 73 172 5 49 61 51 80 81 82 128 190 NA
Petição 870200139470, de 05/11/2020, pág. 327/983 GUCY2C-1590 74 75 29 148 168 169 73 173 5 49 61 51 126 81 82 128 190 NA GUCY2C-1591 74 75 29 148 149 169 73 174 5 49 61 51 126 81 82 128 190 NA GUCY2C-1592 74 75 29 148 168 142 73 175 5 49 61 51 126 81 82 128 190 NA GUCY2C-1608 74 75 29 148 149 142 73 147 5 49 61 51 126 81 82 128 190 191 huIGHV3-7 177 178 179 NA NA NA 176 NA 5 6 7 NA NA NA NA NA NA NA huIGKV1-39 NA NA NA 181 182 183 NA 180 NA NA NA NA 80 81 82 NA NA NA GUCY2C-0405 27 70 29 148 149 142 69 147 5 49 61 51 126 81 82 128 NA NA GUCY2C-0486 27 70 29 148 149 142 69 147 5 49 61 51 126 81 82 128 NA NA GUCY2C-1640 74 75 29 148 149 142 73 147 5 49 61 51 126 81 82 128 NA NA GUCY2C-0250 27 28 29 107 108 109 60 137 5 49 61 51 126 81 82 128 190 NA
Human IgG1 Fc (CH2-
Nucleotide of second Human IgG1 Hinge Human IgG1 CH1
Nucleotide of first polypeptide chain polypeptide chain Human IgG1 CL1
IgG Heavy Chain IgG Light Chain Knob Fc chain
Full Sequence Hole Fc chain Anti-CD3_CH
Anti-CD3_VL Sequence
VL-Knob
VH-Hole Linker 3
Linker 4
Linker 5
Linker 6
CH3) CD3-0001 NA NA NA NA NA NA NA NA 1 76 NA NA NA NA NA NA NA NA NA CD3-0004 NA NA NA NA NA NA NA NA 1 84 NA NA NA NA NA NA NA NA NA CD3-0006 NA NA NA NA NA NA NA NA 9 90 NA NA NA NA NA NA NA NA NA GUCY2C-0074 192 NA NA NA NA NA NA NA 1 84 188 189 NA NA 196 197 198 NA NA GUCY2C-0077 192 NA NA NA NA NA NA NA 1 84 188 189 NA NA NA NA NA NA NA GUCY2C-0078 192 NA NA NA NA NA NA NA 1 84 188 189 NA NA NA NA NA NA NA GUCY2C-0098 192 NA NA NA NA NA NA NA 1 84 188 189 NA NA 199 200 201 NA NA GUCY2C-0104 192 NA NA NA NA NA NA NA 1 84 188 189 NA NA NA NA NA NA NA GUCY2C-0105 192 NA NA NA NA NA NA NA 1 84 188 189 NA NA 202 203 204 NA NA 279/359
GUCY2C-0240 192 NA NA NA NA NA NA NA 1 84 188 189 NA NA 205 206 207 NA NA GUCY2C-0315 NA NA NA NA 184 185 186 187 NA NA NA NA 214 223 NA NA NA NA NA GUCY2C-0179 NA NA NA NA 184 185 186 187 NA NA NA NA 214 223 NA NA NA NA NA GUCY2C-0193 NA NA NA NA 184 185 186 187 NA NA NA NA 214 223 NA NA NA NA NA GUCY2C-0210 NA NA NA NA 184 185 186 187 NA NA NA NA 214 223 NA NA NA NA NA GUCY2C-0212 NA NA NA NA 184 185 186 187 NA NA NA NA 214 223 NA NA NA NA NA GUCY2C-0241 NA NA NA NA 184 185 186 187 NA NA NA NA 208 209 NA NA NA NA NA GUCY2C-0247 192 NA NA NA NA NA NA NA 1 84 188 189 NA NA 210 211 212 NA NA GUCY2C-1186 192 NA NA NA NA NA NA NA 1 84 188 189 NA NA NA NA NA NA NA GUCY2C-1467 192 NA NA NA NA NA NA NA 1 84 188 189 NA NA NA NA NA NA NA GUCY2C-1476 192 NA NA NA NA NA NA NA 1 84 188 189 NA NA NA NA NA NA NA GUCY2C-1478 192 NA NA NA NA NA NA NA 9 90 188 189 NA NA 216 217 218 NA NA GUCY2C-1481 192 NA NA NA NA NA NA NA 1 84 188 189 NA NA NA NA NA NA NA GUCY2C-1512 192 NA NA NA NA NA NA NA 1 84 188 189 NA NA NA NA NA NA NA GUCY2C-1518 192 NA NA NA NA NA NA NA 1 84 188 189 NA NA NA NA NA NA NA GUCY2C-1526 192 NA NA NA NA NA NA NA 1 84 188 189 NA NA NA NA NA NA NA GUCY2C-1527 192 NA NA NA NA NA NA NA 1 84 188 189 NA NA NA NA NA NA NA GUCY2C-1538 192 NA NA NA NA NA NA NA 1 84 188 189 NA NA NA NA NA NA NA GUCY2C-1554 192 NA NA NA NA NA NA NA 1 84 188 189 NA NA NA NA NA NA NA GUCY2C-1555 192 NA NA NA NA NA NA NA 1 84 188 189 NA NA NA NA NA NA NA GUCY2C-1556 192 NA NA NA NA NA NA NA 1 84 188 189 NA NA NA NA NA NA NA
Petição 870200139470, de 05/11/2020, pág. 328/983 GUCY2C-1557 192 NA NA NA NA NA NA NA 1 84 188 189 NA NA NA NA NA NA NA GUCY2C-1590 192 NA NA NA NA NA NA NA 1 84 188 189 NA NA NA NA NA NA NA GUCY2C-1591 192 NA NA NA NA NA NA NA 1 84 188 189 NA NA NA NA NA NA NA GUCY2C-1592 192 NA NA NA NA NA NA NA 1 84 188 189 NA NA NA NA NA NA NA GUCY2C-1608 192 NA NA NA NA NA NA NA 9 90 188 189 NA NA 216 220 221 246 247 huIGHV3-7 NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA huIGKV1-39 NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA GUCY2C-0405 NA 193 194 195 NA NA NA 187 NA NA NA NA NA NA NA NA 213 NA NA GUCY2C-0486 NA NA NA NA 184 185 186 187 NA NA NA NA 214 215 NA NA NA NA NA GUCY2C-1640 NA NA NA NA 184 185 186 187 NA NA NA NA 214 223 NA NA NA NA NA GUCY2C-0250 192 NA NA NA NA NA NA NA 1 76 188 189 NA NA 248 249 250 NA NA
Legenda da tabela acima: - Sequência - Ligante - CL1 de IgG1 humano - Articuclação de IgG1 humana - Fc de IgG1 humano (CH2-CH3) - Anti-CD3_CH - Anti-CD3_VL - Cadeia de Fc da protuberância - Cadeia de Fc do buraco - Cadeia Leve de IgG - Cadeia Pesada de IgG - Protuberância VL - Buraco VH - Sequência Completa - Nucleotídeo da primeira cadeia de polipeptídeo - Nucleotídeo da segunda cadeia de polipeptídeo
[00639] A Tabela 38 fornece as sequências aqui referidas. Tabela 38 SEQ ID NO: Descrição Sequência 1 CD3-0001_VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMTWVR- QAPGKGLEWVAFIRNRARGYTS-
DHNPSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRPSYYVL
DYWGQGTTVTVSS 2 CD3-0001_VH, GFTFSDYYMT 2B5-1038 VH, 2B5-1039 VH, 2B5-1040 VH, CDR1 (estendida/ABM) 3 CD3-0001_VH CDR2 FIRNRARGYTSDHNPSVKG 4 CD3-0001_VH, DRPSYYVLDY 2B5-1038 VH, 2B5-1039 VH, 2B5-1040 VH, CDR3 5 CD3-0001_VH FW_H1 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS 6 CD3-0001_VH FW_H2 WVRQAPGKGLEWVA 7 CD3-0001_VH FW_H3 RFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR 8 CD3-0001_VH FW_H4 WGQGTTVTVSS
9 CD3-0006_VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMTWVR- QAPGKGLEWVAFIRNQARGYTS-
DHNPSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRPSYYVL
DYWGQGTTVTVSS 10 CD3-0006_VH, FIRNQARGYTSDHNPSVKG 2B5-1038 VH, 2B5-1039 VH, 2B5-1040 VH, CDR2 (Kabat) 11 GUCY2C-0074_VH EVQLQQSGAELARPGASVNLSCKASGYTFTTYW- MQWVKQRPGQGLEWIGAIYPGDGMTTYT-
QKFKDKATLTADKSSSTAYMQLSSLASEDSAVYYCVRKGMDYWGQGT
SVTVSS 12 GUCY2C-0074_VH CDR1 GYTFTTYWMQ 13 GUCY2C-0074_VH CDR2 AIYPGDGMTTYTQKFKD 14 GUCY2C-0074_VH CDR3 KGMDY 15 GUCY2C-0074_VH FW_H1 EVQLQQSGAELARPGASVNLSCKAS 16 GUCY2C-0074_VH FW_H2 WVKQRPGQGLEWIG 17 GUCY2C-0074_VH FW_H3 KATLTADKSSSTAYMQLSSLASEDSAVYYCVR 18 GUCY2C-0074_VH FW_H4 WGQGTSVTVSS 19 GUCY2C-0077_VH EVQLQQSGAELARPGASVKLSCKASGYTFTKYWMQWIKQRPGQGLE- WIGAIYPGDGFTTYT-
QKFKGKATLTADKSSNTAYMQLSSLASEDSAVYYCARRNYGRTYGGD
YWGQGTSVTVSS 20 GUCY2C-0077_VH CDR1 GYTFTKYWMQ 21 GUCY2C-0077_VH CDR2 AIYPGDGFTTYTQKFKG 22 GUCY2C-0077_VH CDR3 RNYGRTYGGDY 23 GUCY2C-0077_VH FW_H1 EVQLQQSGAELARPGASVKLSCKAS 24 GUCY2C-0077_VH FW_H2 WIKQRPGQGLEWIG 25 GUCY2C-0077_VH FW_H3 KATLTADKSSNTAYMQLSSLASEDSAVYYCAR 26 GUCY2C-0098_VH QVQLQQPGAELVKPGASVKLSCKASGYTFTSYW- MHWVKQRPGQGLEWIGEIKPSN-
GLTNYIEKFKNKATLTVDKSATTAYMQLSSLTAEDSAVYYCTRTITTTEG
YWFFDVWGAGTTVTVSS 27 GUCY2C-0098_VH CDR1 GYTFTSYWMH 28 GUCY2C-0098_VH CDR2 EIKPSNGLTNYIEKFKN 29 GUCY2C-0098_VH CDR3 TITTTEGYWFFDV 30 GUCY2C-0098_VH FW_H1 QVQLQQPGAELVKPGASVKLSCKAS 31 GUCY2C-0098_VH FW_H3 KATLTVDKSATTAYMQLSSLTAEDSAVYYCTR 32 GUCY2C-0098_VH FW_H4 WGAGTTVTVSS 33 GUCY2C-0104_VH EVQLQQSGAELVKPGASVKLSCTASGFNIKDTYIHWVKQRPEQGLE- WIGRIDPANGNANYD-
PKFQGKATITADTSSNTAYLQLSSLTSEDTAVFYCSSLGTGTYWGQGT
TLTVSS 34 GUCY2C-0104_VH CDR1 GFNIKDTYIH 35 GUCY2C-0104_VH CDR2 RIDPANGNANYDPKFQG 36 GUCY2C-0104_VH CDR3 LGTGTY 37 GUCY2C-0104_VH FW_H1 EVQLQQSGAELVKPGASVKLSCTAS 38 GUCY2C-0104_VH FW_H2 WVKQRPEQGLEWIG 39 GUCY2C-0104_VH FW_H3 KATITADTSSNTAYLQLSSLTSEDTAVFYCSS 40 GUCY2C-0104_VH FW_H4 WGQGTTLTVSS
41 GUCY2C-0105_VH EVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYSFTDYIMLWVKQSHGKSLE- WIGNSNPYYGSTSYN-
LKFKGKATLTVDKSSSTAYMHLNSLTSEDSAVYYCARSGYYGSSPYW
YFDVWGAGTTVTVSS 42 GUCY2C-0105_VH CDR1 GYSFTDYIML 43 GUCY2C-0105_VH CDR2 NSNPYYGSTSYNLKFKG 44 GUCY2C-0105_VH CDR3 SGYYGSSPYWYFDV 45 GUCY2C-0105_VH FW_H1 EVQLQQSGPELVKPGASVKISCKAS 46 GUCY2C-0105_VH FW_H2 WVKQSHGKSLEWIG 47 GUCY2C-0105_VH FW_H3 KATLTVDKSSSTAYMHLNSLTSEDSAVYYCAR 48 GUCY2C-0240_VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTTYWMQWVR- QAPGKGLEWIGAIYPGDGMTTYT-
QKFKDRFTISADKAKNSAYLQMNSLRAEDTAVYYCVRKGMDYWGQGT
LVTVSS 49 GUCY2C-0240_VH FW_H2 WVRQAPGKGLEWIG 50 GUCY2C-0240_VH FW_H3 RFTISADKAKNSAYLQMNSLRAEDTAVYYCVR 51 GUCY2C-0240_VH FW_H4 WGQGTLVTVSS 52 GUCY2C-0315_VH QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTTYWMQWVR- QAPGQGLEWIGAIYPGDGMTTYT-
QKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCVRKGMDYWGQG
TLVTVSS 53 GUCY2C-0315_VH CDR2 AIYPGDGMTTYTQKFQG 54 GUCY2C-0315_VH FW_H1 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKAS 55 GUCY2C-0315_VH FW_H2 WVRQAPGQGLEWIG 56 GUCY2C-0315_VH FW_H3 RVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCVR 57 GUCY2C-0179_VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSFTDYIMLWVRQAPGKGLE- WIGNSNPYYGSTSYN-
LKFKGRFTISVDKAKNSAYLQMNSLRAEDTAVYYCARSGYYGSSPYW
YFDVWGQGTMVTVSS 58 GUCY2C-0179_VH FW_H3 RFTISVDKAKNSAYLQMNSLRAEDTAVYYCAR 59 GUCY2C-0179_VH FW_H4 WGQGTMVTVSS 60 GUCY2C-0193_VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYWMHWVR- QAPGKGLEWIGEIKPSN-
GLTNYIEKFKNRFTISVDKAKNSAYLQMNSLRAEDTAVYYCTRTITTTEG
YWFFDVWGQGTLVTVSS 61 GUCY2C-0193_VH FW_H3 RFTISVDKAKNSAYLQMNSLRAEDTAVYYCTR 62 GUCY2C-0210_VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYWMHWVR- QAPGKGLEWIAEIKPSN-
GLTNYIEKFKNRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARTITTTE
GYWFFDVWGQGTLVTVSS 63 GUCY2C-0210_VH FW_H2 WVRQAPGKGLEWIA 64 GUCY2C-0212_VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYWMHWVR- QAPGKGLEWIGEIKPSN-
GLTNYIEKFKNRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARTITTTE
GYWFFDVWGQGTLVTVSS 65 GUCY2C-1186_VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYWMHWVR- QAPGKGLEWIGEIKPSNGLTNI-
HPKFKNRFTISVDKAKNSAYLQMNSLRAEDTAVYYCTRTITTTEGYWFF
DVWGQGTLVTVSS 66 GUCY2C-1186_VH CDR2 EIKPSNGLTNIHPKFKN 67 GUCY2C-1476_VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYWMHWVR- QAPGKGLEWIGEIKPSN-
GLTNYNEKFKNRFTISVDKAKNSAYLQMNSLRAEDTAVYYCTRTITTTE
GYWFFDVWGQGTLVTVSS 68 GUCY2C-1476_VH CDR2 EIKPSNGLTNYNEKFKN
69 GUCY2C-1478_VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYWMHWVR- QAPGKGLEWIGEIKPSNGLTN-
VHEKFKNRFTISVDKAKNSAYLQMNSLRAEDTAVYYCTRTITTTEGYWF
FDVWGQGTLVTVSS 70 GUCY2C-1478_VH CDR2 EIKPSNGLTNVHEKFKN 71 GUCY2C-1512_VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYWMHWVR- QAPGKGLEWIGEIKPSN-
GLTNYAEQFKNRFTISVDKAKNSAYLQMNSLRAEDTAVYYCTRTITTTE
GYWFFDVWGQGTLVTVSS 7 GUCY2C-1512_VH CDR2 EIKPSNGLTNYAEQFKN 2 73 GUCY2C-1554_VH; EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMHWVR- GUCY2C-1608_VH QAPGKGLEWIGEIKPSNELTN-
VHEKFKDRFTISVDKAKNSAYLQMNSLRAEDTAVYYCTRTITTTEGYWF
FDVWGQGTLVTVSS 74 GUCY2C-1554_VH CDR1 GFTFSSYWMH 75 GUCY2C-1554_VH CDR2 EIKPSNELTNVHEKFKD 76 CD3-0001_VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCTSSQSLFNVRSRKNYLAWYQQK- PGKAPKLLIYWASTRES-
GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCKQSYDLFTFGGGTKVEI
K 77 CD3-0001_VL CDR1 TSSQSLFNVRSRKNYLA 78 CD3-0001_VL CDR2 WASTRES 79 CD3-0001_VL CDR3 KQSYDLFT 80 CD3-0001_VL FW_L1 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC 81 CD3-0001_VL FW_L2 WYQQKPGKAPKLLIY 82 CD3-0001_VL FW_L3 GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC 83 CD3-0001_VL FW_L4 FGGGTKVEIK 84 CD3-0004_VL DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLFNVRSRKNYLAWYQQK- PGQPPKLLISWASTRES-
GVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCKQSYDLFTFGSGTKLEI
K 85 CD3-0004_VL CDR1 KSSQSLFNVRSRKNYLA 86 CD3-0004_VL FW_L1 DIVMTQSPDSLAVSLGERATINC 87 CD3-0004_VL FW_L2 WYQQKPGQPPKLLIS 88 CD3-0004_VL FW_L3 GVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYC 89 CD3-0004_VL FW_L4 FGSGTKLEIK 90 CD3-0006_VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCTSSQSLFNVRSQKNYLAWYQQK- PGKAPKLLIYWASTRES-
GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCKQSYDLFTFGGGTKVEI
K 91 CD3-0006_VL CDR1 TSSQSLFNVRSQKNYLA 92 GUCY2C-0074_VL DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVDNYGISFMNWFQQK- PGQPPKLLIYAASNPGSGV-
PARFSGSGSGTDFSLNIHPLEEDDTAMFFCQQSKEVPYTFGGGTKLEI
K 93 GUCY2C-0074_VL CDR1 RASESVDNYGISFMN 94 GUCY2C-0074_VL CDR2 AASNPGS 95 GUCY2C-0074_VL CDR3 QQSKEVPYT 96 GUCY2C-0074_VL FW_L1 DIVLTQSPASLAVSLGQRATISC 97 GUCY2C-0074_VL FW_L2 WFQQKPGQPPKLLIY 98 GUCY2C-0074_VL FW_L3 GVPARFSGSGSGTDFSLNIHPLEEDDTAMFFC 99 GUCY2C-0074_VL FW_L4 FGGGTKLEIK
100 GUCY2C-0077_VL DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVDNFDISFMNWFQQK- PGQPPKLLIYAASNQGSGV-
PARFSGSGSGTDFSLNIHPMEEDDTAMYFCQQSKEVPYTFGGGTKLEI
K 101 GUCY2C-0077_VL CDR1 RASESVDNFDISFMN 102 GUCY2C-0077_VL CDR2 AASNQGS 103 GUCY2C-0077_VL FW_L3 GVPARFSGSGSGTDFSLNIHPMEEDDTAMYFC 104 GUCY2C-0078_VL DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRAGESVDNFDISFMNWFQQK- PGQPPKLLIYAASNQGSGV-
PARFSGSGSGTDFSLNIHPMEEDDTAMYFCQQSKEVPYTFGGGTKLEI
K 105 GUCY2C-0078_VL CDR1 RAGESVDNFDISFMN 106 GUCY2C-0098_VL DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVDYYGTSLMQWYQQK- PGQPPKLLIYAASNVESGV-
PARFSGSGSGTDFSLNIHPVEEDDIAMYFCQQTRKVYTFGGGTKLEIK 107 GUCY2C-0098_VL CDR1 RASESVDYYGTSLMQ 108 GUCY2C-0098_VL CDR2 AASNVES 109 GUCY2C-0098_VL CDR3 QQTRKVYT 110 GUCY2C-0098_VL FW_L2 WYQQKPGQPPKLLIY 111 GUCY2C-0098_VL FW_L3 GVPARFSGSGSGTDFSLNIHPVEEDDIAMYFC 112 GUCY2C-0104_VL DIVMTQSPASLAVSLGQRATISCRASKGVTTSGYSYMHWYQQK- PGQPPKLLIYLASNLESGV-
PARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQHSREFPLTFGAGTKLEL
K 113 GUCY2C-0104_VL CDR1 RASKGVTTSGYSYMH 114 GUCY2C-0104_VL CDR2 LASNLES 115 GUCY2C-0104_VL CDR3 QHSREFPLT 116 GUCY2C-0104_VL FW_L1 DIVMTQSPASLAVSLGQRATISC 117 GUCY2C-0104_VL FW_L3 GVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYC 118 GUCY2C-0104_VL FW_L4 FGAGTKLELK 119 GUCY2C-0105_VL DIVMTQSPSSLAVSVGEKVTVSCKSSQSLLYSSN- QKNYLAWYQQRPGQSPKLLIYWASTRES-
GVPDRFTGSGSGTDFTLSISSVKAEDLAVYYCQQYYSYPTFGGGTKLE
IK 120 GUCY2C-0105_VL CDR1 KSSQSLLYSSNQKNYLA 121 GUCY2C-0105_VL CDR3 QQYYSYPT 122 GUCY2C-0105_VL FW_L1 DIVMTQSPSSLAVSVGEKVTVSC 123 GUCY2C-0105_VL FW_L2 WYQQRPGQSPKLLIY 124 GUCY2C-0105_VL FW_L3 GVPDRFTGSGSGTDFTLSISSVKAEDLAVYYC 125 GUCY2C-0240_VL DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDNYGISFMNWFQQK- PGKAPKLLIYAASNPGSGV-
PSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSKEVPYTFGQGTKLEIK 126 GUCY2C-0240_VL FW_L1 DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITC 127 GUCY2C-0240_VL FW_L2 WFQQKPGKAPKLLIY 128 GUCY2C-0240_VL FW_L4 FGQGTKLEIK 129 GUCY2C-0315_VL EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASESVDNYGISFMNWYQQKPGQA- PRLLIYAASNPGSGI-
PARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSKEVPYTFGQGTKVEIK 130 GUCY2C-0315_VL FW_L1 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSC 131 GUCY2C-0315_VL FW_L2 WYQQKPGQAPRLLIY 132 GUCY2C-0315_VL FW_L3 GIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYC 133 GUCY2C-0315_VL FW_L4 FGQGTKVEIK
134 GUCY2C-0179_VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKSSQSLLYSSNQKNYLAWYQQK- PGKSPKLLIYWASTRES-
GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYSYPTFGGGTKVE
IK 135 GUCY2C-0179_VL FW_L2 WYQQKPGKSPKLLIY 136 GUCY2C-0193_VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDYYGTSLMQWYQQK- PGKAPKLLIYAASNVESGV-
PSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTRKVYTFGQGTKLEIK 137 GUCY2C-0210_VL DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDYYGTSLMQWYQQK- PGKAPKLLIYAASNVESGV-
PSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTRKVYTFGQGTKLEIK 138 GUCY2C-0247_VL DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDYYGTSLMQWYQQKPGK- PPKLLIYAASNVESGV-
PSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTRKVYTFGQGTKLEIK 139 GUCY2C-0247_VL FW_L2 WYQQKPGKPPKLLIY 140 GUCY2C-1186_VL DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDYYGTSLMQWYQQK- PGKAPKLLIYAASKRYSGV-
PSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTRKAYTFGQGTKLEIK 141 GUCY2C-1186_VL CDR2 AASKRYS 142 GUCY2C-1186_VL CDR3 QQTRKAYT 143 GUCY2C-1467_VL DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDYYGTSLMQWYQQK- PGKAPKLLIYAASKLWSGV-
PSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTRKVYTFGQGTKLEIK 144 GUCY2C-1467_VL CDR2 AASKLWS 145 GUCY2C-1476_VL DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDYYGTSLMQWYQQK- PGKAPKLLIYAASKVAPGV-
PSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTRKAYTFGQGTKLEIK 146 GUCY2C-1476_VL CDR2 AASKVAP 147 GUCY2C-1478_VL DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDYYGSSLLQWYQQK- PGKAPKLLIYAASKLASGV-
PSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTRKAYTFGQGTKLEIK 148 GUCY2C-1478_VL CDR1 RASESVDYYGSSLLQ 149 GUCY2C-1478_VL CDR2 AASKLAS 150 GUCY2C-1481_VL DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDYYGTSLMQWYQQK- PGKAPKLLIYAASNIAPGV-
PSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTRKAYTFGQGTKLEIK 151 GUCY2C-1481_VL CDR2 AASNIAP 152 GUCY2C-1512_VL DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDYYGSSLMQWYQQK- PGKAPKLLIYAASKRYSGV-
PSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTRKEYTFGQGTKLKIK 153 GUCY2C-1512_VL CDR1 RASESVDYYGSSLMQ 154 GUCY2C-1512_VL CDR3 QQTRKEYT 155 GUCY2C-1512_VL FW_L4 FGQGTKLKIK 156 GUCY2C-1518_VL DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDYYGSSLMQWYQQK- PGKAPKLLIYAASNVAPGV-
PSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTRKAYTFGQGTKLEIK 157 GUCY2C-1518_VL CDR2 AASNVAP 158 GUCY2C-1526_VL DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDYYGSSLMQWYQQK- PGKAPKLLIYAASHRASGV-
PSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTRKAYTFGQGTKLEIK 159 GUCY2C-1526_VL CDR2 AASHRAS 160 GUCY2C-1527_VL DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDYYGTSLMQWYQQK- PGKAPKLLIYAASNVASGV-
PSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTRKEYTFGQGTKLEIK 161 GUCY2C-1527_VL CDR2 AASNVAS 162 GUCY2C-1538_VL DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDYYGHSLMQWYQQK- PGKAPKLLIYAASNRYSGV-
PSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTRKAYSFGQGTKLEIK
163 GUCY2C-1538_VL CDR1 RASESVDYYGHSLMQ 164 GUCY2C-1538_VL CDR2 AASNRYS 165 GUCY2C-1538_VL CDR3 QQTRKAYS 166 GUCY2C-1554_VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVDYYGSSLLQWYQQK- PGKAPKLLIYDASKLASGV-
PSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQERKAYTFGQGTKLEIK 167 GUCY2C-1554_VL CDR1 RASQSVDYYGSSLLQ 168 GUCY2C-1554_VL CDR2 DASKLAS 169 GUCY2C-1554_VL CDR3 QQERKAYT 170 GUCY2C-1555_VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVDYYGSSLLQWYQQK- PGKAPKLLIYAASKLASGV-
PSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQERKAYTFGQGTKLEIK 171 GUCY2C-1556_VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVDYYGSSLLQWYQQK- PGKAPKLLIYDASKLASGV-
PSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTRKAYTFGQGTKLEIK 172 GUCY2C-1557_VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVDYYGSSLLQWYQQK- PGKAPKLLIYAASKLASGV-
PSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTRKAYTFGQGTKLEIK 173 GUCY2C-1590_VL DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDYYGSSLLQWYQQK- PGKAPKLLIYDASKLASGV-
PSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQERKAYTFGQGTKLEIK 174 GUCY2C-1591_VL DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDYYGSSLLQWYQQK- PGKAPKLLIYAASKLASGV-
PSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQERKAYTFGQGTKLEIK 175 GUCY2C-1592_VL DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDYYGSSLLQWYQQK- PGKAPKLLIYDASKLASGV-
PSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTRKAYTFGQGTKLEIK 176 huIGHV3-7_VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMSWVR- QAPGKGLEWVANIKQDGSEKYYV-
DSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARYYYYYGMDV 177 huIGHV3-7_VH CDR1 GFTFSSYWMS 178 huIGHV3-7_VH CDR2 NIKQDGSEKYYVDSVKG 179 huIGHV3-7_VH CDR3 YYYYYGMDV 180 huIGKV1-39_VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLI- YAASSLQSGVPS-
RFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPYTFGQGTKLEIK 181 huIGKV1-39_VL CDR1 RASQSISSYLN 182 huIGKV1-39_VL CDR2 AASSLQS 183 huIGKV1-39_VL CDR3 QQSYSTPYT 184 CL de IgG1 Humana RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNAL- QSGNSQESVTEQDSK-
DSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 185 CH1 de IgG1 Humana ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGAL- TSGVHTFPA-
VLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKV 186 Articulação de IgG1 Humana EPKSCDKTHTCPPCP 187 IgG1-3m Fc Humano (CH2-CH3) APEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWY- VDGVEVHNAKTK-
PREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA KGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESN- GQPENNYKTTPPVLDSD-
GSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 188 Cadeia Fc de protuberância APEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWY- VDGVEVHNAKTK-
PREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA KGQPREPQVCTLPPSREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESN- GQPENNYKTTPPVLDSD- GSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
189 Cadeia Fc de buraco APEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWY- VDGVEVHNAKTK-
PREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA KGQPREPQVYTLPPCREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESN- GQPENNYKTTPPVLDSD-
GSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 190 Ligante 1 GGGSGGGG 191 Ligante 2 GGGGSGGGG 192 Ligante 3 GCPPCP 193 Ligante 4 GGGGSGGGGSGGGGSG 194 Ligante 5 RTSDQ 195 Ligante 6 EPKSSDKTHTCPPCP 196 GUCY2C-0074_Protuberância DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVDNYGISFMNWFQQK- PGQPPKLLIYAASNPGSGV-
PARFSGSGSGTDFSLNIHPLEEDDTAMFFCQQSKEVPYTFGGGTKLEI KGGGSGGGGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYYM- TWVRQAPGKGLEWVAFIRN- RARGYTSDHNPSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR DRPSYYVLDYWGQGTTVTVSSGCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPK- DTLMISRTPEVTCVVV- DVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQ DWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSREEMT- KNQVSLWCLVKG- FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQ
QGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 197 GUCY2C-0074_Buraco DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLFNVRSRKNYLAWYQQK- PGQPPKLLISWASTRES-
GVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCKQSYDLFTFGSGTKLEI KGGGSGGGGEVQLQQSGAELARPGASVNLSCKASGYTFTTYW- MQWVKQRPGQGLEWIGAI- YPGDGMTTYTQKFKDKATLTADKSSSTAYMQLSSLASEDSAVYYCVR KGMDYWGQGTSVTVSSGCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMIS- RTPEVTCVVVDVSHED- PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGK EYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCREEMTKNQVS- LSCAVKGFYPSDIA- VEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFS
CSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 198 GUCY2C-0074_monômero DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVDNYGISFMNWFQQK- PGQPPKLLIYAASNPGSGV-
PARFSGSGSGTDFSLNIHPLEEDDTAMFFCQQSKEVPYTFGGGTKLEI KGGGSGGGGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYYM- TWVRQAPGKGLEWVAFIRN- RARGYTSDHNPSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR DRPSYYVLDYWGQGTTVTVSSGCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPK- DTLMISRTPEVTCVVV- DVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQ DWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSREEMT- KNQVSLWCLVKG- FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQ QGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGDIVMTQSPDSLAVSLGERA- TINCKSSQSLFNVRS- RKNYLAWYQQKPGQPPKLLISWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTIS SLQAEDVAVYYCKQSYDLFTFGSGTKLEIKGGGSGGGGEVQLQQS- GAELARPGASVN- LSCKASGYTFTTYWMQWVKQRPGQGLEWIGAIYPGDGMTTYTQKFK DKATLTADKSSSTAYMQLSSLASEDSAVYYCVRKGMDYWGQG- TSVTVSSGCPPCPAPEAAGA- PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVH NAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPI- EKTISKAKGQPRE- PQVYTLPPCREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYK TTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT-
QKSLSLSPG 199 GUCY2C-0098_Protuberância DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVDYYGTSLMQWYQQK- PGQPPKLLIYAASNVESGV-
PARFSGSGSGTDFSLNIHPVEEDDIAMYFCQQTRKVYTFGGGTKLEIK GGGSGGGGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYYM- TWVRQAPGKGLEWVAFIRN- RARGYTSDHNPSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR DRPSYYVLDYWGQGTTVTVSSGCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPK- DTLMISRTPEVTCVVV- DVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQ DWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSREEMT- KNQVSLWCLVKG- FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQ
QGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 200 GUCY2C-0098_Buraco DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLFNVRSRKNYLAWYQQK- PGQPPKLLISWASTRES-
GVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCKQSYDLFTFGSGTKLEI KGGGSGGGGQVQLQQPGAELVKPGASVKLSCKASGYTFTSYW- MHWVKQRPGQGLEWIGEIK- PSNGLTNYIEKFKNKATLTVDKSATTAYMQLSSLTAEDSAVYYCTRTITT TEGYWFFDVWGAGTTVTVSSGCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTL- MISRTPEVTCVVV- DVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQ DWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCREEMT- KNQVSLSCAVKG- FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQ
QGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 201 GUCY2C-0098_monômero DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVDYYGTSLMQWYQQK- PGQPPKLLIYAASNVESGV-
PARFSGSGSGTDFSLNIHPVEEDDIAMYFCQQTRKVYTFGGGTKLEIK GGGSGGGGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYYM- TWVRQAPGKGLEWVAFIRN- RARGYTSDHNPSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR DRPSYYVLDYWGQGTTVTVSSGCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPK- DTLMISRTPEVTCVVV- DVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQ DWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSREEMT- KNQVSLWCLVKG- FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQ QGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGDIVMTQSPDSLAVSLGERA- TINCKSSQSLFNVRS- RKNYLAWYQQKPGQPPKLLISWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTIS SLQAEDVAVYYCKQSYDLFTFGSGT- KLEIKGGGSGGGGQVQLQQPGAELVKPGAS- VKLSCKASGYTFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGEIKPSNGLTNYIEKFK NKATLTVDKSATTAYMQLSSLTAEDSAVYYCTRTITT- TEGYWFFDVWGAGTTVTVSSG- CPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEV KFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNS- TYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPI- EKTISKAKGQPREPQVYTLPPCREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVE WESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGN-
VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 202 GUCY2C-0105_Protuberância DIVMTQSPSSLAVSVGEKVTVSCKSSQSLLYSSN- QKNYLAWYQQRPGQSPKLLIYWASTRES-
GVPDRFTGSGSGTDFTLSISSVKAEDLAVYYCQQYYSYPTFGGGTKLE IKGGGSGGGGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYYM- TWVRQAPGKGLEWVA- FIRNRARGYTSDHNPSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYY CARDRPSYYVLDYWGQGTTVTVSSGCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPK- PKDTLMIS- RTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYR VVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPRE- PQVCTLPPSREEMTKN- QVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYS
KLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 203 GUCY2C-0105_Buraco DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLFNVRSRKNYLAWYQQK- PGQPPKLLISWASTRES-
GVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCKQSYDLFTFGSGTKLEI KGGGSGGGGEVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYS- FTDYIMLWVKQSHGKSLEWIGNSN- PYYGSTSYNLKFKGKATLTVDKSSSTAYMHLNSLTSEDSAVYYCARSG YYGSSPYWYFDVWGAGTTVTVSSGCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPK- PKDTLMIS- RTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYR VVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPRE- PQVYTLPPCREEMTKN- QVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSK
LTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 204 GUCY2C-0105_monômero DIVMTQSPSSLAVSVGEKVTVSCKSSQSLLYSSN- QKNYLAWYQQRPGQSPKLLIYWASTRES-
GVPDRFTGSGSGTDFTLSISSVKAEDLAVYYCQQYYSYPTFGGGTKLE IKGGGSGGGGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYYM- TWVRQAPGKGLEWVA- FIRNRARGYTSDHNPSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYY CARDRPSYYVLDYWGQGTTVTVSSGCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPK- PKDTLMIS- RTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYR VVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPRE- PQVCTLPPSREEMTKN- QVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYS KLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGDIVMTQSP- DSLAVSLGERATIN- CKSSQSLFNVRSRKNYLAWYQQKPGQPPKLLISWASTRESGVPDRFS GSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCKQSYDLFTFGSGT- KLEIKGGGSGGGGEVQLQQSG- PELVKPGASVKISCKASGYSFTDYIMLWVKQSHGKSLEWIGNSNPYYG STSYNLKFKGKATLTVDKSSSTAYMHLNSLTSE- DSAVYYCARSGYYGSSPYWYFDVWGAG- TTVTVSSGCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDV SHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNS- TYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKAL- PAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDI AVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGN-
VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 205 GUCY2C-0240_Protuberância DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDNYGISFMNWFQQK- PGKAPKLLIYAASNPGSGV-
PSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSKEVPYTFGQGTKLEIK GGGSGGGGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYYM- TWVRQAPGKGLEWVAFIRN- RARGYTSDHNPSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR DRPSYYVLDYWGQGTTVTVSSGCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPK- DTLMISRTPEVTCVVV- DVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQ DWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSREEMT- KNQVSLWCLVKG- FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQ
QGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 206 GUCY2C-0240_Buraco DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLFNVRSRKNYLAWYQQK- PGQPPKLLISWASTRES-
GVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCKQSYDLFTFGSGTKLEI KGGGSGGGGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTTYW- MQWVRQAPGKGLEWIGAI- YPGDGMTTYTQKFKDRFTISADKAKNSAYLQMNSLRAEDTAVYYCVRK GMDYWGQGTLVTVSSGCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMIS- RTPEVTCVVVDVSHED- PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGK EYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCREEMTKNQVS- LSCAVKGFYPSDIA- VEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFS
CSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 207 GUCY2C-0240_monômero DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDNYGISFMNWFQQK- PGKAPKLLIYAASNPGSGV-
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QKSLSLSPG 208 GUCY2C-0241_cadeia_leve DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDYYGTSLMQWYQQK- PGKAPKLLIYAASNVESGV-
PSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTRKVYTFGQGTKLEIKR TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNAL- QSGNSQESVTEQDSK-
DSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 209 GUCY2C-0241_cadeia_pesada EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYWMHWVR- QAPGKGLEWIGEIKPSN-
GLTNYIEKFKNRFTISVDKAKNSAYLQMNSLRAEDTAVYYCTRTITTTEG YWFFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVK- DYFPEPVTVSWNS- GALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNT KVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMIS- RTPEVTCVVVDVSHED- PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGK EYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVS- LTCLVKGFYPSDIA- VEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFS
CSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 210 GUCY2C-0247_Protuberância DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDYYGTSLMQWYQQKPGK- PPKLLIYAASNVESGV-
PSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTRKVYTFGQGTKLEIKG GGSGGGGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMTWVR- QAPGKGLEWVAFIRN- RARGYTSDHNPSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR DRPSYYVLDYWGQGTTVTVSSGCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPK- DTLMISRTPEVTCVVV- DVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQ DWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSREEMT- KNQVSLWCLVKG- FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQ
QGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 211 GUCY2C-0247_Buraco DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLFNVRSRKNYLAWYQQK- PGQPPKLLISWASTRES-
GVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCKQSYDLFTFGSGTKLEI KGGGSGGGGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYW- MHWVRQAPGKGLEWIGEIK- PSNGLTNYIEKFKNRFTISVDKAKNSAYLQMNSLRAEDTAVYYCTRTITT TEGYWFFDVWGQGTLVTVSSGCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTL- MISRTPEVTCVVV- DVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQ DWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCREEMT- KNQVSLSCAVKG- FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQ
QGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 212 GUCY2C-0247_monômero DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDYYGTSLMQWYQQKPGK- PPKLLIYAASNVESGV-
PSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTRKVYTFGQGTKLEIKG GGSGGGGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMTWVR- QAPGKGLEWVAFIRN- RARGYTSDHNPSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR DRPSYYVLDYWGQGTTVTVSSGCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPK- DTLMISRTPEVTCVVV- DVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQ DWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSREEMT- KNQVSLWCLVKG- FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQ QGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGDIVMTQSPDSLAVSLGERA- TINCKSSQSLFNVRS- RKNYLAWYQQKPGQPPKLLISWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTIS SLQAEDVAVYYCKQSYDLFTFGSGTKLEIKGGGSGGGGEVQLVES- GGGLVQPGGSLRLS- CAASGYTFTSYWMHWVRQAPGKGLEWIGEIKPSNGLTNYIEKFKNRFT ISVDKAKNSAYLQMNSLRAEDTAVYYCTRTITTTEGYWFFDVWGQG- TLVTVSSGCPPCPAPE- AAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDG VEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKAL- PAPIEKTISKA- KGQPREPQVYTLPPCREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQ PENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEA-
LHNHYTQKSLSLSPG 213 GUCY2C-0405_scFv-Fc EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYWMHWVR- QAPGKGLEWIGEIKPSNGLTN-
VHEKFKNRFTISVDKAKNSAYLQMNSLRAEDTAVYYCTRTITTTEGYWF FDVWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGDIQLTQSPSSLSAS- VGDRVTITCRASESV- DYYGSSLLQWYQQKPGKAPKLLIYAASKLASGVPSRFSGSGSGTDFTL TISSLQPEDFATYYCQQTRKAYTFGQGTKLEIKRTSDQEPKSSD- KTHTCPPCPAPEAAGAP- SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHN AKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPI- EKTISKAKGQPRE- PQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYK TTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT-
QKSLSLSP 214 GUCY2C-0486_cadeia_leve; GUCY2C- DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDYYGSSLLQWYQQK- 1640_cadeia_leve PGKAPKLLIYAASKLASGV-
PSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTRKAYTFGQGTKLEIKR TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNAL- QSGNSQESVTEQDSK-
DSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 215 GUCY2C-0486_cadeia_pesada EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYWMHWVR- QAPGKGLEWIGEIKPSNGLTN-
VHEKFKNRFTISVDKAKNSAYLQMNSLRAEDTAVYYCTRTITTTEGYWF FDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVK- DYFPEPVTVSWNSGAL- TSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKV DKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMIS- RTPEVTCVVVDVSHED- PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGK EYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVS- LTCLVKGFYPSDIA- VEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFS
CSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 216 GUCY2C-1478_Protuberância; DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDYYGSSLLQWYQQK- GUCY2C-1608_Protuberância PGKAPKLLIYAASKLASGV-
PSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTRKAYTFGQGTKLEIKG GGSGGGGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMTWVR- QAPGKGLEWVAFIRN- QARGYTSDHNPSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR DRPSYYVLDYWGQGTTVTVSSGCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPK- DTLMISRTPEVTCVVV- DVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQ DWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSREEMT- KNQVSLWCLVKG- FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQ
QGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 217 GUCY2C-1478_Buraco DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCTSSQSLFNVRSQKNYLAWYQQK- PGKAPKLLIYWASTRES-
GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCKQSYDLFTFGGGTKVEI KGGGGSGGGGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYW- MHWVRQAPGKGLEWIGEIK- PSNGLTNVHEKFKNRFTISVDKAKNSAYLQMNSLRAEDTAVYYCTRTIT TTEGYWFFDVWGQGTLVTVSSGCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPK- DTLMISRTPEVTCVVV- DVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQ DWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCREEMT- KNQVSLSCAVKG- FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQ
QGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 2218 GUCY2C-1478_monômero DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDYYGSSLLQWYQQK- PGKAPKLLIYAASKLASGV-
PSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTRKAYTFGQGTKLEIKG GGSGGGGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMTWVR- QAPGKGLEWVAFIRN- QARGYTSDHNPSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR DRPSYYVLDYWGQGTTVTVSSGCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPK- DTLMISRTPEVTCVVV- DVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQ DWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSREEMT- KNQVSLWCLVKG- FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQ QGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGDIQMTQSPSSLSAS- VGDRVTITCTSSQSLFN- VRSQKNYLAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRESGVPSRFSGSGSGTDFT LTISSLQPEDFATYYCKQSYDLFTFGGGTKVEIKGGGGSGGGGEVQL- VESGGGLVQPGGSLR- LSCAASGYTFTSYWMHWVRQAPGKGLEWIGEIKPSNGLTNVHEKFKN RFTISVDKAKNSAYLQMNSLRAEDTAVYYCTRTITT- TEGYWFFDVWGQGTLVTVSSG- CPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEV KFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNS- TYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPI- EKTISKAKGQPREPQVYTLPPCREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVE WESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGN-
VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 219 Articulação Superior de IgG1 Humana EPKSCDKTHT 220 GUCY2C-1608_Buraco DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCTSSQSLFNVRSQKNYLAWYQQK- PGKAPKLLIYWASTRES-
GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCKQSYDLFTFGGGTKVEI KGGGGSGGGGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYW- MHWVRQAPGKGLEWIGEIK- PSNELTNVHEKFKDRFTISVDKAKNSAYLQMNSLRAEDTAVYYCTRTIT TTEGYWFFDVWGQGTLVTVSSGCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPK- DTLMISRTPEVTCVVV- DVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQ DWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCREEMT- KNQVSLSCAVKG- FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQ
QGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 221 GUCY2C-1608_monômero DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDYYGSSLLQWYQQK- PGKAPKLLIYAASKLASGV-
PSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTRKAYTFGQGTKLEIKG GGSGGGGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMTWVR- QAPGKGLEWVAFIRN- QARGYTSDHNPSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR DRPSYYVLDYWGQGTTVTVSSGCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPK- DTLMISRTPEVTCVVV- DVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQ DWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSREEMT- KNQVSLWCLVKG- FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQ QGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGDIQMTQSPSSLSAS- VGDRVTITCTSSQSLFN- VRSQKNYLAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRESGVPSRFSGSGSGTDFT LTISSLQPEDFATYYCKQSYDLFTFGGGTKVEIKGGGGSGGGGEVQL- VESGGGLVQPGGSLR- LSCAASGFTFSSYWMHWVRQAPGKGLEWIGEIKPSNELTNVHEKFKD RFTISVDKAKNSAYLQMNSLRAEDTAVYYCTRTITT- TEGYWFFDVWGQGTLVTVSSG- CPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEV KFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNS- TYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPI- EKTISKAKGQPREPQVYTLPPCREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVE WESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGN-
VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 222 Região de Articulação Inferior de IgG1 Hu- CPPCP mana 223 GUCY2C-1640_cadeia_pesada EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMHWVR- QAPGKGLEWIGEIKPSNELTN-
VHEKFKDRFTISVDKAKNSAYLQMNSLRAEDTAVYYCTRTITTTEGYWF FDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVK- DYFPEPVTVSWNSGAL- TSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKV DKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMIS- RTPEVTCVVVDVSHED- PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGK EYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVS- LTCLVKGFYPSDIA- VEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFS
CSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 224 GUCY2C humana de tamanho natural SQVSQNCHNGSYEISVLMMGNSAFAEPLKNLEDAVNEGLEIVRGR- LQNAGLNVTVNATFMYS-
DGLIHNSGDCRSSTCEGLDLLRKISNAQRMGCVLIGPSCTYSTFQMYL DTELSYPMISAGSFGLSCDYKETLTRLMSPARKLMYFLVNFWKTNDL- PFKTYSWSTSY- VYKNGTETEDCFWYLNALEASVSYFSHELGFKVVLRQDKEFQDILMDH NRKSNVIIMCGGPEFLYKLKGDRAVAEDIVIILVDLFNDQYLEDNVTAP- DYMKN- VLVLTLSPGNSLLNSSFSRNLSPTKRDFALAYLNGILLFGHMLKIFLENG ENITTPKFAHAFRNLTFEGYDGPVTLDDWGDVDSTMVLLYTSVDTK- KYKVLLTYDTHVNKTYPVDMSPTFTWKNSKLPNDITGRGPQILMIAVFT LTGAVVLLLLVALLMLRKYRKDYELRQKKWSHIPPENIFPLETNET- NHVSLKIDDDKRRDTI- QRLRQCKYDKKRVILKDLKHNDGNFTEKQKIELNKLLQIDYYNLTKFYG TVKLDTMIFGVIEYCERGSLREVLNDTISYPDGTFMDWEFKISVLYDI- AKGMSYLHSSKTE- VHGRLKSTNCVVDSRMVVKITDFGCNSILPPKKDLWTAPEHLRQANIS QKGDVYSYGIIAQEIILRKETFYTLSCRDRNEKIFRVENSNGMKPFRP- DLFLETAEEKELE- VYLLVKNCWEEDPEKRPDFKKIETTLAKIFGLFHDQKNESYMDTLIRRL QLYSRNLEHLVEERTQLYKAERDRADRLNFMLLPRLVVKSLKEKGFVE- PELYEEVTIYFS- DIVGFTTICKYSTPMEVVDMLNDIYKSFDHIVDHHDVYKVETIGDAYMVA SGLPKRNGNRHAIDIAKMALEILSFMGTFELEHLPGLPIWIRIGVHSG- PCAAGVVGIKM- PRYCLFGDTVNTASRMESTGLPLRIHVSGSTIAILKRTECQFLYEVRGE TYLKGRGNETTYWLTGMKDQKFNLPTPPTVENQQRLQAEFSDMIANS- LQKRQAAGIRSQK- PRRVASYKKGTLEYLQLNTTDKESTYFTRTRPLEQKLISEEDLAANDILD
YKDDDDK 225 GUCY2C humana de tamanho natural TCCCAGGTGAGTCAGAACTGCCACAATGGCAGCTATGAAATCAG- CGTCCTGATGATGGG-
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AATGATATCCTGGATTACAAGGATGACGACGATAAG 226 de GUCY2C cinomolga de tamanho natural SQVSQNCHNGSYEISVLMMDNSAFAEPLENVEDAVNEGLEIVRGR- LQNAGLNVTVNASFMYS-
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KGTLEYLQLNTTDKESTYFTRTRPLEQKLISEEDLAANDILDYKDDDDK 227 GUCY2C cinomolga de tamanho natural tcacaggtgagtcagaactgccacaatggcagctatgaaatcagcgtcctgatgatgga- caactcagcctttgcagagcccctggaaaacgtggaagatgcggtgaatgaggggctggaaatag tgagaggacgtctgcaaaacgctggcctaaatgtgactgtgaatgcttctttcatgtattcg- gatggtctgattcataactccggcgactgccggagcagcacctgtgaaggccttgacctactcagga aaatttcaaatgcaaaacggatgggctgtgtcctcatggggccctcatgtacatactccac- cttccagatgtaccttgacacagaattgagctaccccatgatctcagctggaagttttggattgtcatgt gactataaagaaaccttaaccaggctgatgtctccagctagaaagttgacatacttcttggt- taacttttggaaaaccaatgatctacccttcaaaacttattcctggagcacttcgtatgtttacaagaatg gtacggagtccgaggactgtttctggtaccttaacgctctggaggccagtgtttcctattt- ctcccacgaactcagttttaagttggtgttaagacaagataaggagtttcaggatatcttaatggacca caacaggaaaagcaatgtgattgttatgtgtggtgatccaGagttcctctacaag- ttgaagggtgaccgagcagtggctgaagacattgtcattattctagtggatcttttcaatgaccagtact ttgaggacaatgtcacagcccctgactatatgaaaaatgtccttgttctgacgcag- tctcctggcaattccctcctaaatagctctttctccaggaatctatccccaacaaaacgagactttgctct tgcctatttgaatggaatcctgctctttggacatatgctaaagacatttcttgaaaatgga- gaaaatattaccacccccaaatttgctcatgctttcaggaatctcacttttgaagggtatgacggtcca gtgaccttggatgactggggggatgtggacagtaccatggtgcttctgtatacgtctgtgga- caccaagaaatacaaggttcttttgacctatgatacccacgtaaatcagaccaaccctgtggatatg agccccacattcacttggaagaactctaaacttcctaatgatattacagaccggggccctca- gatcctgatgattgcagtcttcaccctcaccggagctgtggtgctgctcctgcttgtcgctctcctgatgct cagaaaatataaaaaagattatgaacttcgtcagaaaaaatggtcccacattcctcctgaaa- atatctttcctctggagaccaatgagaccaatcacgttagcctgaagatcgatgatgacaaaagacg agatacaatccagagactacgacagtgcaaatacgacaaaaagcgagtgattctcaaaga- tctcaagcacaatgatggtaatttcactgaaaaacagaagatagaattgaacaagttgcttcagattg actattacaacctgaccaagttctatggcaccgtgaaacttgataccatgatcttcgggg- tgatagaatactgtgagagaggatccctccgggaagttttaaatgacacaatttcctaccctgatggc acattcatggattgggagtttaagatctctgtcctgtatgacattgctaagggaatgtcata- tctgcactccagtaagacagaagtccatggtcgtctgaaatctaccaactgcgtagtggacagtaga atggtggtgaagatcactgattttggctgcaattccattttacctccaaaaaaagacctgtg- gacagctccagagcacctccgccaagccaacgtctctcagaaaggagatgtgtacagctacggg atcatcgcacaggagatcatcctgcggaaagaaaccttctacacttcgagctgtcgagaccg- gaacgagaagattttcagagtggaaaattccaatggaatgaaacccttccgtccagatttattcttgg aaacggcagaggaaaaagagctagaagtgtacctacttgtaaaaagctgttgggaagaaga- tccagaaaagagaccagatttcaaaaaaattgagactacacttgccaagatatttggactttttcatg accaaaaaaatgaaagctatatggataccttgatccgacgtctacagctatattctcgaaac- ctggaacatctggtagaggaaaggacacagctatacaaggcagagagggacagggctgacag acttaactttatgttgcttccaaggctagtggtaaagtctctgaaggagaaaggctttg- tagagccggaactatatgaggaagttacaatctacttcagtgacattgtaggtttcactactatctgcaa atacagcacccccatggaagtggtggacatgcttaatgacatctataagagttttgaccaca- ttgttgatcatcatgatgtctacaaggtggaaaccattggtgatgcctacatggtggctagtggtttgcct aagagaaatggcaatcggcatgcaatagacattgccaagatggccttggaaatcctcagctt- catggggacctttgagctggagcatcttcctggcctcccaatatggattcgcattggcgttcactctggt ccctgcgctgctggagttgtgggaatcaagatgcctcgttattgtctatttggagatacagt- caacacagcctctaggatggaatccactggcctccctttgaggattcatgtgagtggctccaccatag ccattctgaagagaactgagtgccagttcctgtatgaagtgagaggagaaacgtact- taaagggaagaggaaatgagactacctactggctgaccgggatgaaggaccagaaattcaacct gccaacccctcctactgtggagaatcaacagcgtttgcaagcagaattttcagacatgattg- ccaactctttacagaaaagacaggcggcagggataagaagccaaaaacccagacgagtagcc agctataaaaaaggcactctggaatacttgcaactgaataccacggacaaggagagcaccta- ttttACGCGTACTCGGCCGCTCGAGCAGAAACTCATCTCAGAAGAGGA
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ACTACAAGGACGACGATGACAAA 232 GUCY2C ECD Humana Clivada SQVSQNCHNGSYEISVLMMGNSAFAEPLKNLEDAVNEGLEIVRGR- LQNAGLNVTVNATFMYS-
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NLYFQ 233 GUCY2C ECD Humana Clivada tcacaggtgagtcagaactgccacaatggcagctatgaaatcagcgtcctgatgatggg- caactcagcctttgcagagcccctgaaaaacttggaagatgcggtgaatgaggggctggaaatagt gagaggacgtctgcaaaatgctggcctaaatgtgactgtgaacgctactttcatgtattcg- gatggtctgattcataactcaggcgactgccggagtagcacctgtgaaggcctcgacctactcagga aaatttcaaatgcacaacggatgggctgtgtcctcatagggccctcatgtacatactccac- cttccagatgtaccttgacacagaattgagctaccccatgatctcagctggaagttttggattgtcatgt gactataaagaaaccttaaccaggctgatgtctccagctagaaagttgatgtacttcttggt- taacttttggaaaaccaacgatctgcccttcaaaacttattcctggagcacttcgtatgtttacaagaat ggtacagaaactgaggactgtttctggtaccttaatgctctggaggctagcgtttcctattt- ctcccacgaactcggctttaaggtggtgttaagacaagataaggagtttcaggatatcttaatggacc acaacaggaaaagcaatgtgattattatgtgtggtggtccagagttcctctacaag- ctgaagggtgaccgagcagtggctgaagacattgtcattattctagtggatcttttcaatgaccagtact ttgaggacaatgtcacagcccctgactatatgaaaaatgtccttgttctgacgctg- tctcctgggaattcccttctaaatagctctttctccaggaatctatcaccaacaaaacgagactttgctct tgcctatttgaatggaatcctgctctttggacatatgctgaagatatttcttgaaaatgga- gaaaatattaccacccccaaatttgctcatgctttcaggaatctcacttttgaagggtatgacggtcca gtgaccttggatgactggggggatgttgacagtaccatggtgcttctgtatacctctgtgga- caccaagaaatacaaggttcttttgacctatgatacccacgtaaataagacctatcctgtggatatga gccccacattcacttggaagaactctaaacttcctaatgatattacaggccggggccctca- gggaggcggaggttccGAGAATTTATACTTCCAG 234 GUCY2C ECD-muIG2a Cinomolga SQVSQNCHNGSYEISVLMMDNSAFAEPLENVEDAVNEGLEIVRGR-
LQNAGLNVTVNASFMYS- DGLIHNSGDCRSSTCEGLDLLRKISNAKRMGCVLMGPSCTYSTFQMYL DTELSYPMISAGSFGLSCDYKETLTRLMSPARKLTYFLVNFWKTNDL- PFKTYSWSTSY- VYKNGTESEDCFWYLNALEASVSYFSHELSFKLVLRQDKEFQDILMDH NRKSNVIVMCGDPEFLYKLKGDRAVAEDIVIILVDLFNDQYFEDNVTAP- DYMKNVLVLT- QSPGNSLLNSSFSRNLSPTKRDFALAYLNGILLFGHMLKTFLENGENIT TPKFAHAFRNLTFEGYDGPVTLDDWGDVDSTMVLLYTSVDTK- KYKVLLTYDTHVNQTNPVD- MSPTFTWKNSKLPNDITDRGPQGGGGSENLYFQGGGGSGGGGSEPR GPTIKPCPPCKCPAPNLEGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVV- DVSEDDP- DVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKA FACAVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTK- KQVTLTCMVTDFMPEDIY- VEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSC
SVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGGGPPDYKDDDDK 235 GUCY2C ECD-muIG2a Cinomolga tcacaggtgagtcagaactgccacaatggcagctatgaaatcagcgtcctgatgatgga- caactcagcctttgcagagcccctggaaaacgtggaagatgcggtgaatgaggggctggaaatag tgagaggacgtctgcaaaacgctggcctaaatgtgactgtgaatgcttctttcatgtattcg- gatggtctgattcataactccggcgactgccggagcagcacctgtgaaggccttgacctactcagga aaatttcaaatgcaaaacggatgggctgtgtcctcatggggccctcatgtacatactccac- cttccagatgtaccttgacacagaattgagctaccccatgatctcagctggaagttttggattgtcatgt gactataaagaaaccttaaccaggctgatgtctccagctagaaagttgacatacttcttggt- taacttttggaaaaccaatgatctacccttcaaaacttattcctggagcacttcgtatgtttacaagaatg gtacggagtccgaggactgtttctggtaccttaacgctctggaggccagtgtttcctattt- ctcccacgaactcagttttaagttggtgttaagacaagataaggagtttcaggatatcttaatggacca caacaggaaaagcaatgtgattgttatgtgtggtgatccaGagttcctctacaag- ttgaagggtgaccgagcagtggctgaagacattgtcattattctagtggatcttttcaatgaccagtact ttgaggacaatgtcacagcccctgactatatgaaaaatgtccttgttctgacgcag- tctcctgggaattccctcctaaatagctctttctccaggaatctatccccaacaaaacgagactttgctct tgcctatttgaatggaatcctgctctttggacatatgctaaagacatttcttgaaaatgga- gaaaatattaccacccccaaatttgctcatgctttcaggaatctcacttttgaagggtatgacggtcca gtgaccttggatgactggggggatgtggacagtaccatggtgcttctgtatacgtctgtgga- caccaagaaatacaaggttcttttgacctatgatacccacgtaaatcagaccaaccctgtggatatg agccccacattcacttggaagaactctaaacttcctaatgatattacagaccggggccctca- gggaggcggaggttccGAGAATTTATACTTCCAGGGCGGAGGCGGTTCCG GCGGCGGAGGAAGCgagccccgcggaccgacaatcaagccctgtcctccatgcaaa- tgccca- gcacctaacctcgagggtggaccatccgtcttcatcttccctccaaagatcaaggatgtactcatgat ctccctgagccccatagtcacatgtgtggtggtggatgtgagcgaggatgacccagatg- tccagatcagctggtttgtgaacaacgtggaagtacacacagctcagacacaaacccatagagag gattacaacagtactctccgggtggtcagtgccctccccatccagcaccaggactggatgag- tggcaaggctttcgcatgcgccgtcaacaacaaagacctcccagcgcccatcgagagaaccatct caaaacccaaagggtcagtaagagctccacaggtatatgtcttgcctccaccagaagaaga- gatgactaagaaacaggtcactctgacctgcatggtcacagacttcatgcctgaagacatttacgtg gagtggaccaacaacgggaaaacagagctaaactacaagaacactgaaccagtcctggac- tctgatggttcttacttcatgtacagcaagctgagagtggaaaagaagaactgggtggaaagaaata gctactcctgttcagtggtccacgagggtctgcacaatcaccacacgactaagagctt- ctcccggactccgggtGGCGGGCCACCCGACTACAAGGACGACGATGACA
AA 236 GUCY2C-ECD Cinomolga Clivada SQVSQNCHNGSYEISVLMMDNSAFAEPLENVEDAVNEGLEIVRGR- LQNAGLNVTVNASFMYS-
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MSPTFTWKNSKLPNDITDRGPQGGGGSENLYFQ 237 GUCY2C-ECD Cinomolga Clivada tcacaggtgagtcagaactgccacaatggcagctatgaaatcagcgtcctgatgatgga- caactcagcctttgcagagcccctggaaaacgtggaagatgcggtgaatgaggggctggaaatag tgagaggacgtctgcaaaacgctggcctaaatgtgactgtgaatgcttctttcatgtattcg- gatggtctgattcataactccggcgactgccggagcagcacctgtgaaggccttgacctactcagga aaatttcaaatgcaaaacggatgggctgtgtcctcatggggccctcatgtacatactccac- cttccagatgtaccttgacacagaattgagctaccccatgatctcagctggaagttttggattgtcatgt gactataaagaaaccttaaccaggctgatgtctccagctagaaagttgacatacttcttggt- taacttttggaaaaccaatgatctacccttcaaaacttattcctggagcacttcgtatgtttacaagaatg gtacggagtccgaggactgtttctggtaccttaacgctctggaggccagtgtttcctattt- ctcccacgaactcagttttaagttggtgttaagacaagataaggagtttcaggatatcttaatggacca caacaggaaaagcaatgtgattgttatgtgtggtgatccaGagttcctctacaag- ttgaagggtgaccgagcagtggctgaagacattgtcattattctagtggatcttttcaatgaccagtact ttgaggacaatgtcacagcccctgactatatgaaaaatgtccttgttctgacgcag- tctcctgggaattccctcctaaatagctctttctccaggaatctatccccaacaaaacgagactttgctct tgcctatttgaatggaatcctgctctttggacatatgctaaagacatttcttgaaaatgga- gaaaatattaccacccccaaatttgctcatgctttcaggaatctcacttttgaagggtatgacggtcca gtgaccttggatgactggggggatgtggacagtaccatggtgcttctgtatacgtctgtgga- caccaagaaatacaaggttcttttgacctatgatacccacgtaaatcagaccaaccctgtggatatg agccccacattcacttggaagaactctaaacttcctaatgatattacagaccggggccctca- gggaggcggaggttccGAGAATTTATACTTCCAG 238 GUCY2C ECD-muIgG2a Murina VFWASQVRQNCRNGSYEISVLMMDNSAYKEPMQNLREAVEEGLDI- VRKRLREADLNVTVNAT-
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SVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGHHHHHH 239 GUCY2C ECD-muIgG2a Murina gtgttctgggcctctcaggtgaggcagaactgccgcaatggcagctacgagatcagcg- tcctgatgatggacaactcagcctacaaagaacctatgcaaaacctgagggaggctgtggaggaa ggactggacatagtgcgaaagcgcctgcgtgaagccgacctaaatgtgactgtgaacgcgac- tttcatctactccgacggtctgattcataagtcaggtgactgccggagcagcacctgtgaaggccttga cctactcagggagattacaagagatcataagatgggctgcgccctcatggggccctcgtg- cacgtattccaccttccagatgtacctcgacacagagttgaactatcccatgatttccgctggaagttat ggattgtcctgtgactataaggaaaccctaaccaggattctgcctccagccaggaag- ctgatgtacttcttggtcgatttctggaaagtcaacaatgcatctttcaaacccttttcctggaactcttcgt atgtttacaagaatggatcggaacctgaagattgtttctggtacctcaatgctctggagg- ctggggtgtcctatttttctgaggtgctcaacttcaaggatgtactgagacgcagcgaacagttccagg aaatcttaacaggccataacagaaagagcaatgtgattgttatgtgtggcacgccagaaag- cttctatgatgtgaaaggtgacctccaagtggctgaagatactgttgtcatcctggtagatctgttcagta accattactttgaggagaacaccacagctcctgagtatatggacaatgtcctcgtcctgacg- ctgccgtctgaacagtccacctcaaacacctctgtcgccgagaggttttcatcggggagaagtgactt ttctctcgcttacttggagggaaccttgctatttggacacatgctgcagacgtttcttgaaa- atggagaaaatgtcacgggtcccaagtttgctcgtgcattcaggaatctcacttttcaaggctttgcag gacctgtgactctggatgacagtggggacattgacaacattatgtcccttctgtatgtg- tctctggataccaggaaatacaaggttcttatgaagtatgacacccacaaaaacaaaactattccgg tggctgagaaccccaacttcatctggaagaaccacaagctccccaatgacgttcctggg- ctgggccctcaaatcctgatgggaggcggaggttccGAGAATTTATACTTCCAGGGC GGAGGCGGTTCCGGCGGCGGAGGAAGCgagccccgcggaccgacaat- caagccctg- tcctccatgcaaatgcccagcacctaacctcgagggtggaccatccgtcttcatcttccctccaaaga tcaaggatgtactcatgatctccctgagccccatagtcacatgtgtggtggtggatgtgag- cgaggatgacccagatgtccagatcagctggtttgtgaacaacgtggaagtacacacagctcaga cacaaacccatagagaggattacaacagtactctccgggtggtcagtgccctccccatccag- caccaggactggatgagtggcaaggctttcgcatgcgccgtcaacaacaaagacctcccagcgc ccatcgagagaaccatctcaaaacccaaagggtcagtaagagctccacaggtatatgtcttg- cctccaccagaagaagagatgactaagaaacaggtcactctgacctgcatggtcacagacttcatg cctgaagacatttacgtggagtggaccaacaacgggaaaacagagctaaactacaagaacac- tgaaccagtcctggactctgatggttcttacttcatgtacagcaagctgagagtggaaaagaagaact gggtggaaagaaatagctactcctgttcagtggtccacgagggtctgcacaatcaccaca- cgactaagagcttctcccggactccgggtCACCATCACCATCACCAT 240 GUCY2C-ECD murina clivada VFWASQVRQNCRNGSYEISVLMMDNSAYKEPMQNLREAVEEGLDI- VRKRLREADLNVTVNAT-
FIYSDGLIHKSGDCRSSTCEGLDLLREITRDHKMGCALMGPSCTYSTFQ MYLDTELNYPMISAGSYGLSCDYKETLTRILPPARKLMYFLVDFWKVN- NASFKPFSWNSSY- VYKNGSEPEDCFWYLNALEAGVSYFSEVLNFKDVLRRSEQFQEILTGH NRKSNVIVMCGTPESFYDVKGDLQVAEDTVVILVDLFSNHYFEENTTA- PEYMDNVLVLTL- PSEQSTSNTSVAERFSSGRSDFSLAYLEGTLLFGHMLQTFLENGENVT GPKFARAFRNLTFQGFAGPVTLDDSGDIDNIMSLLYVS- LDTRKYKVLMKYDTHKNKTIPVA-
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KGTLEYLQLNTTDKESTYF 254 GUCY2C Cinomolga de Tamanho Natural TCACAGGTGAGTCAGAACTGCCACAATGGCAGCTATGAAATCAG- CGTCCTGATGATGGA-
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GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCKQSYDLFTFGGGTKVEI
K 277 2B5-1038 VH, GFTFSDY 2B5-1039 VH, 2B5-1040 VH, CDR1 (Chothia) 278 2B5-1038 VL TSDQSLFNVRSGKNYLA CDR1 279 2B5-1039 VL TSSESLFNVRSGKNYLA CDR1 280 2B5-1040 VL TSSQSLFNVRSGKNYLA CDR1 281 2B5-1038 VL, WASDRES 2B5-1039 VL, 2B5-1040 VL, CDR2 282 DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDYYGSSLLQWYQQK- PGKAPKLLIYAASKLASGV-
PSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTRKAYTFGQGTKLEIKG GGSGGGGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMTWVR- QAPGKGLEWVAFIRN-
QARGYTSDHNPSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR GUCY2C-1678_Protuberância DRPSYYVLDYWGQGTTVTVSSGCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPK- DTLMISRTPEVTCVVV-
DVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQ DWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSREEMT- KNQVSLWCLVKG- FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQ
QGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 283 GUCY2C-1678_Buraco DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCTSDQSLFNVRSGKNYLAWYQQK- PGKAPKLLIYWASDRES-
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284 DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDYYGSSLLQWYQQK- PGKAPKLLIYAASKLASGV-
PSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTRKAYTFGQGTKLEIKG GGSGGGGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMTWVR- QAPGKGLEWVAFIRN- GUCY2C-1679_Protuberância QARGYTSDHNPSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR DRPSYYVLDYWGQGTTVTVSSGCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPK- DTLMISRTPEVTCVVV-
DVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQ DWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSREEMT- KNQVSLWCLVKG- FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQ
QGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 285 GUCY2C-1679_Buraco DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCTSSQSLFNVRSGKNYLAWYQQK- PGKAPKLLIYWASDRES-
GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCKQSYDLFTFGGGTKVEI KGGGGSGGGGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYW- MHWVRQAPGKGLEWIGEIK- PSNELTNVHEKFKDRFTISVDKAKNSAYLQMNSLRAEDTAVYYCTRTIT TTEGYWFFDVWGQGTLVTVSSGCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPK- DTLMISRTPEVTCVVV- DVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQ DWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCREEMT- KNQVSLSCAVKG- FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQ
QGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 286 GUCY2C-1680_Protuberância DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDYYGSSLLQWYQQK- PGKAPKLLIYAASKLASGV-
PSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTRKAYTFGQGTKLEIKG GGSGGGGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMTWVR- QAPGKGLEWVAFIRN- QARGYTSDHNPSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR DRPSYYVLDYWGQGTTVTVSSGCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPK- DTLMISRTPEVTCVVV- DVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQ DWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSREEMT- KNQVSLWCLVKG- FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQ
QGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 287 GUCY2C-1680_Buraco DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCTSSESLFNVRSGKNYLAWYQQK- PGKAPKLLIYWASDRES-
GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCKQSYDLFTFGGGTKVEI KGGGGSGGGGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYW- MHWVRQAPGKGLEWIGEIK- PSNELTNVHEKFKDRFTISVDKAKNSAYLQMNSLRAEDTAVYYCTRTIT TTEGYWFFDVWGQGTLVTVSSGCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPK- DTLMISRTPEVTCVVV- DVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQ DWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCREEMT- KNQVSLSCAVKG- FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQ
QGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 288 2B5-1038_VL GACATCCAGATGACCCAGTCCCCCTCTTCTCTGTCTGCCTCTG- TGGGCGACAGAGTGACCAT-
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TACTGCAAACAGTCTTACGACCTTTTCACTTTTGGCGGCGGAACAAA GGTGGAGATCaag 289 2B5-1038_VH GAAGTGCAGCTTGTTGAATCTGGCGGCGGTTTGGTTCAGCCCGG- TGGATCACTGCGACTCAG-
TTGCGCAGCTAGCGGCTTCACCTTTTCTGATTACTACATGACATGG GTACGACAGGCGCCAGGCAAGGGTTTGGAATGGGTAGCATTCATA- CGCAATCAGGCACG- CGGGTACACTTCAGACCACAATCCCTCAGTAAAAGGAAGATTTACC ATCTCAAGAGACAATGCCAAAAATTCACTCTACCTGCAAATGAACT- CACTTCGCGCCGAGGA- TACCGCCGTGTATTACTGTGCCAGAGACAGACCATCTTATTACGTG
CTGGACTATTGGGGACAGGGCACTACAGTCACCGTCAGCTCT 290 2B5-1039_VL GACATCCAGATGACCCAGTCCCCCTCTTCTCTGTCTGCCTCTG- TGGGCGACAGAGTGACCAT-
CACCTGCACAAGCTCAGAGTCACTGTTTAATGTCCGCAGCGGCAAA AACTATCTTGCGTGGTATCAGCAGAAGCCTGGCAAGGCTCCCAAG- CTGCTGATCTACTGGG- CCAGTGACCGAGAATCCGGCGTGCCTTCCAGATTCTCCGGCTCTG GCTCTGGCACCGATTTCACCCTGACCATCTCCTCCCTCCAG- CCTGAGGATTTCGCCACCTAC- TACTGCAAACAGTCTTACGACCTTTTCACTTTTGGCGGCGGAACAAA
GGTGGAGATCAAG 291 2B5-1039_VH GAAGTGCAGCTTGTTGAATCTGGCGGCGGTTTGGTTCAGCCCGG- TGGATCACTGCGACTCAG-
TTGCGCAGCTAGCGGCTTCACCTTTTCTGATTACTACATGACATGG GTACGACAGGCGCCAGGCAAGGGTTTGGAATGGGTAGCATTCATA- CGCAATCAGGCACG- CGGGTACACTTCAGACCACAATCCCTCAGTAAAAGGAAGATTTACC ATCTCAAGAGACAATGCCAAAAATTCACTCTACCTGCAAATGAACT- CACTTCGCGCCGAGGA- TACCGCCGTGTATTACTGTGCCAGAGACAGACCATCTTATTACGTG
CTGGACTATTGGGGACAGGGCACTACAGTCACCGTCAGCTCT 292 2B5-1040_VL GACATCCAGATGACCCAGTCCCCCTCTTCTCTGTCTGCCTCTG- TGGGCGACAGAGTGACCAT-
CACCTGCACAAGCTCACAGTCACTGTTTAATGTCCGCAGCGGCAAA AACTATCTTGCGTGGTATCAGCAGAAGCCTGGCAAGGCTCCCAAG- CTGCTGATCTACTGGG- CCAGTGACCGAGAATCCGGCGTGCCTTCCAGATTCTCCGGCTCTG GCTCTGGCACCGATTTCACCCTGACCATCTCCTCCCTCCAG- CCTGAGGATTTCGCCACCTAC- TACTGCAAACAGTCTTACGACCTTTTCACTTTTGGCGGCGGAACAAA
GGTGGAGATCAAG 293 2B5-1040_VH GAAGTGCAGCTTGTTGAATCTGGCGGCGGTTTGGTTCAGCCCGG- TGGATCACTGCGACTCAG-
TTGCGCAGCTAGCGGCTTCACCTTTTCTGATTACTACATGACATGG GTACGACAGGCGCCAGGCAAGGGTTTGGAATGGGTAGCATTCATA- CGCAATCAGGCACG- CGGGTACACTTCAGACCACAATCCCTCAGTAAAAGGAAGATTTACC ATCTCAAGAGACAATGCCAAAAATTCACTCTACCTGCAAATGAACT- CACTTCGCGCCGAGGA- TACCGCCGTGTATTACTGTGCCAGAGACAGACCATCTTATTACGTG
CTGGACTATTGGGGACAGGGCACTACAGTCACCGTCAGCTCT 294 GUCY2C-1696_VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTRWMHWVR- QAPGKGLEWIGEIKPSNKLTN-
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FDVWGQGTLVTVSS 297 GUCY2C-1701_VL DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDYYGSSLMQWYQQK- PGKAPKLLIYAASKLASGV-
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VHEKFKDRFTISVDKAKNSAYLQMNSLRAEDTAVYYCTRTITTPLGYWF FDVWGQGTLVTVSS
299 GUCY2C-1702_VL DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDYYGSSLMQWYQQK- PGKAPKLLIYAASKLASGV-
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FDVWGQGTLVTVSS 303 GUCY2C-1705_VL DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDYYGSSLMQWYQQK- PGKAPKLLIYAASKLASGV-
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FDVWGQGTLVTVSS 307 GUCY2C-1708_VL DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDYYKHSLMQWYQQK- PGKAPKLLIYAASKLASGV-
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FFDVWGQGTLVTVSS 309 GUCY2C-1710_VL DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDYYRHSLMQWYQQK- PGKAPKLLIYAASKLASGV-
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FFDVWGQGTLVTVSS 313 GUCY2C-1714_VL DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVNWYGSSLMQWYQQK- PGKAPKLLIYAASKLASGV-
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FFDVWGQGTLVTVSS 315 GUCY2C-1715_VL DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVSIYGSSLMQWYQQK- PGKAPKLLIYAASKLASGV-
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TTEGYWFFDVWGQGTLVTVSSGGCGGHHHHHH 408 GUCY2C-1637_VL DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDYYGSSLLQWYQQK- PGKAPKLLIYAASKLASGV-
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TISSLQPEDFATYYCQQTRKAYTFGQGTKLEIKTGSENLYFQ 410 CID1814 MQLLRCFSIFSVIASVLAQEGKPIPNPLLGLDSTGGGSGGGA- QAAGAHSSQVSQN-
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CHNGSYEISVLMMGNSAFAEPLKNLEDAVNEGLEIVRGRLQNAGLNVT VNATFMYSDGLIHNSGDCRSSTCEGLDLLRKIFNAQRMGCVLIG- PSCTYST- FQMYLDTELSYPMISAGSFGLSCDYKETLTRLMSPARKLMYFLVNFWK TNDLPFKTYSWSTSYVYKNGTETEDCFWYLNALEASVSYFSHELGF- KVVLRQDKEFQDIL- MDHNRKSNVIIMCGGPEFLYKLKGDRAVAEDIVIILVDLFNDQYFEDNVT APDYMKNVLVLTLSPGNSLLNSSFSRNLSPTKRDFALAYLNGILLFGH- MLKIFLENGENI- TTPKFAHAFRNLTFEGYDGPVTLDDWGDVDSTMVLLYTSVDTKKYKVL LTYDTHVNKTYPVDMSPTFTWKNSKLPNDITGRGPQRTSDQASGAHH- HHHHGAYPYDVPDYA- GHGTSGGGGSGGTSTPSYTTSIISTETPSHSTPSSSTSITTTETPSHST PSYTSSVSTSETTSHSTPSETSSSRTTESTSYSSPSSTSSNTITE- TSSHSTPSTATSISSTE- TPSSSIPSVSSSITVTESSSHSTPGATSTLTSSETSTWSTPSSTSSIMSS SYTSADTPSETSVYTSSETPSSSSPTSTSLISSSKSTSTSTPSFTSSITS- TETSSYSAS- SYTPSVSSTASSSKNTTSSTASISSAETVSSSSSSVSSTIPSSQSTSYST PSFSSSATSSVTPLHSTPSLPSWVTTSKTTSHITPGLTSSMSS- SETYSHSTPGFTSSITS- TESTSESTPSLSSSTIYSTVSTSTTAITSHFTTSETAVTPTPVTPSSLSTD IPTTSLRTLTPSSVGTSTSLTTTTDFPSIPTDISTLPTRTHIISSSPSIQS- TETSSLVG- TTSPTMSTVRMTLRITENTPISSFSTSIVVIPETPTQTPPVLTSATGTQTS PAPTTVTFGSTDSSTSTLHKLQGDSGETIGKYIGAADSLGGSVLLLALA-
PLVLLSLL 439 CID1431 MQLLRCFSIFSVIASVLAQEGKPIPNPLLGLDSTGGGSGGGA- QAAGAHSRTSDQAS-
GAGAYPYDVPDYAGHGTSGGGGSGGTSTPSYTTSIISTETPSHSTPSS STSITTTETPSHSTPSYTSSVSTSETTSHSTPSETSSSRTTES- TSYSSPSSTSSNTITE- TSSHSTPSTATSISSTETPSSSIPSVSSSITVTESSSHSTPGATSTLTSSE TSTWSTPSSTSSIMSSSYTSADTPSETSVYTSSETPSSSSPTSTSLIS- SSKSTSTSTPSFTS- SITSTETSSYSASSYTPSVSSTASSSKNTTSSTASISSAETVSSSSSSVS STIPSSQSTSYSTPSFSSSATSSVTPLHSTPSL- PSWVTTSKTTSHITPGLTSSMSS- SETYSHSTPGFTSSITSTESTSESTPSLSSSTIYSTVSTSTTAITSHFTTS ETAVTPTPVTPSSLSTDIPTTSLRTLTPSSVGTSTSLTTTTDFPSIPTDIS- TLPTRTHIIS- SSPSIQSTETSSLVGTTSPTMSTVRMTLRITENTPISSFSTSIVVIPETPT QTPPVLTSATGTQTSPAPTTVTFGSTDSSTSTLHKLQGDSGETIGKYI-
GAADSLGGSVLLLALAPLVLLSLL 440 GUCY2C-0118_ DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVDYYGTSLMQWYQQK- Cadeia leve_ PGQPPKLLIYAASNVESGV- Versão de IgG de Coelho do clone 9H3 PARFSGSGSGTDFSLNIHPVEEDDIAMYFCQQTRKVYTFGGGTKLEIK GDPVAPTVLIFPPAADQVATGTVTIVCVANKYFPDVTVTWEVDGTT- QTTGIENSKTPQN-
SADCTYNLSSTLTLTSTQYNSHKEYTCRVTQGTTSVVQSFNRGDC 441 GUCY2C-0118_ QVQLQQPGAELVKPGASVKLSCKASGYTFTSYW- Cadeia pesada_ MHWVKQRPGQGLEWIGEIKPSN- Versão de IgG de Coelho do clone 9H3 GLTNYIEKFKNKATLTVDKSATTAYMQLSSLTAEDSAVYYCTRTITTTEG YWFFDVWGAGTTVTVSSGQPKAPSVFPLAPCCGDTPSSTVTLG- CLVKGYLPEPVTVTWNSG-
TLTNGVRTFPSVRQSSGLYSLSSVVSVTSSSQPVTCNVAHPATNTKVD KTVAPSTCSKPTCPPPELLGGPSVFIFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVV- DVSQDDPEVQF- TWYINNEQVRTARPPLREQQFNSTIRVVSTLPIAHQDWLRGKEFKCKV HNKALPAPIEKTISKARGQPLEPKVYTMGPPREELSSRSVSLTCMING- FYPSDISVE- WEKNGKAEDNYKTTPAVLDSDGSYFLYSKLSVPTSEWQRGDVFTCSV
MHEALHNHYTQKSISRSPGK 442 GUCY2C-0117_ DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVDYYGTSLMQWYQQK- Cadeia leve PGQPPKLLIYAASNVESGV- IgG1 de Camundongo do clone 9H3 PARFSGSGSGTDFSLNIHPVEEDDIAMYFCQQTRKVYTFGGGTKLEIK RTDAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSER- QNGVLNSWTDQDSK-
DSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC 443 GUCY2C-0117_ QVQLQQPGAELVKPGASVKLSCKASGYTFTSYW- Cadeia pesada MHWVKQRPGQGLEWIGEIKPSN- IgG1 de Camundongo do clone 9H3 GLTNYIEKFKNKATLTVDKSATTAYMQLSSLTAEDSAVYYCTRTITTTEG YWFFDVWGAGTTVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLG- CLVKGYFPEPVTVTWNSGS-
LSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKV DKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVV- DISKDD- PEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGK EFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVS- LTCMITDFFPEDI- TVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTF
TCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK 444 GUCY2C-0119_ DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVDYYGTSLMQWYQQK- Cadeia leve_ PGQPPKLLIYAASNVESGV- IgG1 3m hu quimérico 9H3 em pTT5 PARFSGSGSGTDFSLNIHPVEEDDIAMYFCQQTRKVYTFGGGTKLEIK RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNAL- QSGNSQESVTEQDSK-
DSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 445 GUCY2C-0119_ QVQLQQPGAELVKPGASVKLSCKASGYTFTSYW- Cadeia pesada MHWVKQRPGQGLEWIGEIKPSN- IgG1 3m hu quimérico 9H3 em pTT5 GLTNYIEKFKNKATLTVDKSATTAYMQLSSLTAEDSAVYYCTRTITTTEG YWFFDVWGAGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVK- DYFPEPVTVSWNS-
GALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNT KVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMIS- RTPEVTCVVVDVSHED- PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGK EYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVS- LTCLVKGFYPSDIA- VEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFS CSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
[00640] As sequências de anticorpos da presente invenção são nu- meradas usando o Abysis AbM. O sistema de numeração Abysis AbM atribui a numeração Kabat e determina o início e o fim de cada CDR de acordo com as regras de Kabat, exceto para CDR H1. A CDR H1 é de- terminada de acordo com a definição de AbM. Exemplo 27: Três variantes anti-CD3 mostram afinidade e citotoxi- cidade melhoradas em anticorpos GUCY2C-CD3 biespecíficos
[00641] Três variantes anti-CD3, 2B5-1038 (SEQ ID NOs: 273 e 274), 2B5-1039 (SEQ ID NOs: 273 e 275) e 2B5-1040 (SEQ ID NOs: 273 e 276) que são derivadas de 2B5v6, foram reformatadas em moléculas de diacorpo-Fc biespecíficas pareadas com a sequência de anticorpo GUCY2c antitumor em uma das configurações mostradas na Figura 1 usando técnicas de clonagem, expressão e purificação padrão descritas acima. Os anticorpos biespecíficos resultantes mostrados na Tabela 39 foram testados quanto à citotoxicidade in vitro usando um ensaio de re- direcionamento de células T e afinidade de ligação usando ensaio de ressonância plasmônica superficial (SPR) e não especificidade por AC- SINs. O risco de imunogenicidade foi avaliado pela Ferramenta Epivax para previsão in silico de epítopos de células T potenciais. Os dados de espectroscopia de massa intactos indicam que todos os biespecíficos têm pareamento correto e são 100 % heterodímeros. A Tabela 39 de- monstra que todos os três biespecíficos (1) são cerca de 2 vezes mais potentes em um ensaio de citotoxicidade in vitro em comparação com o GUCY2C-1608 biespecífico de controle que é pareado com anti-CD3 2B5v6 (Figura 18); (2) têm afinidade de ligação ao CD3 humano recom- binante por SPR que é consistente com a atividade de citotoxicidade; (3) têm pontuações de imunogenicidade que são melhoradas em rela- ção ao controle; e (4) pontuações AC-SINs mantidas as mesmas que o GUCY2C-1608 biespecífico controle. Tabela 39
Pontuação Epi- Variante de Espec. de Massa pontuação AC- Citotoxicidade Biespecífico vax (Ajustada KD (nM, SPR) CD3 (intacta) SINs In vitro (nM) por tReg) GUCY2C-1608 2B5-0542 -33,7 100 % heterodímero 3 0,772 127,88 + 1,63 GUCY2C-1678 2B5-1038 -52,61 100 % heterodímero 2 0,247 63,55 ± 0,49 GUCY2C-1679 2B5-1040 -47,58 100 % heterodímero 3 0,194 72,02 ± 0,36 GUCY2C-1680 2B5-1039 -53,51 100 % heterodímero 3 0,385 78,57 ± 0,9 Exemplo 28: Maturação de afinidade do domínio de ligação ao an- ticorpo anti-GUCY2c
[00642] Para aumentar a afinidade do domínio de ligação ao anti- corpo anti-GUCY2c para GUCY2c, foi adotado um método de exibição de fago. Quatro bibliotecas de exibição de fago foram projetadas e pro- duzidas usando métodos declarados anteriormente. As bibliotecas fo- ram geradas pela introdução de mutações nas CDRs H1, H2 e H3 e nas CDR L1 de anti-GUCY2C-1608 (SEQ ID 221). As bibliotecas de fagos foram resgatadas conforme descrito anteriormente e selecionadas usando uma estratégia de seleção competitiva descrita na Tabela 40. Para o ciclo 1, o fago foi incubado com esferas de estreptavidina com- plexadas com GUCY2c humano biotinilado (5 nM; SEQ ID NO. 232). Após 3 lavagens, antígeno não biotinilado 100 vezes em excesso (500 nM) foi adicionado à reação e a mistura foi girada durante a noite a 4oC. As contas foram lavadas no dia seguinte para remover o fago que se dissociou das contas e o fago ligado restante foi eluído usando TEA. Para o ciclo 2, a seleção foi repetida como acima contra o antígeno 0,5 nM sem qualquer competição. As colônias foram colhidas e preparações periplasmáticas foram geradas como descrito anteriormente. Os clones foram rastreados quanto à atividade de ligação melhorada usando o ELISA de competição descrito anteriormente. Os clones que mostram ligação melhorada em comparação com o de origem foram seleciona- dos para análise posterior. Após o rastreamento, o sequenciamento de
DNA foi realizado conforme descrito anteriormente nos clones superio- res para identificar mutações que contribuíram para a atividade de liga- ção ao GUCY2c melhorada.
[00643] Após as seleções iniciais da biblioteca de maturação de afi- nidade, as regiões CDR dos hits superiores foram combinadas em uma nova biblioteca e as seleções de exibição de fago adicionais foram rea- lizadas descritas na Tabela 41. A seleção do ciclo 1 foi feita conforme descrito acima para a seleção inicial da biblioteca de afinidade, exceto o antígeno biotinilado 0,5 nM foi usado. Para cada biblioteca, havia dois ramos de seleção de ciclo-2 nos quais o fago antes da seleção foi de- safiado ou não desafiado com incubação de 65 oC. Seguindo as sele- ções de fagos, as colônias foram colhidas e preparações periplasmáti- cas foram geradas como descrito anteriormente. Os clones foram ras- treados por ELISA de competição descrito anteriormente. Após o rastre- amento, o sequenciamento de DNA foi realizado nos clones superiores para identificar mutações que contribuíram para a atividade de ligação ao GUCY2c melhorada. As Tabelas 40 e 41 mostram a estratégia de seleção de exibição de fago usada para as bibliotecas de maturação de afinidade (C = biblioteca; R = ciclo; Dslxn = condição de desseleção; Térm. = condição térmica; SA = estreptavidina; D = DNA; I = insulina; M = extrato de membrana). Tabela 40 Ciclo Condição Ramificação C1R1 Alvo GUCY2C Humano R1 Conc. do Alvo 5 nM Dslxn SA, D, I, M Térm. Nenhum Competição 500 nM Ramificação C1R2 Alvo GUCY2C Humano R2 Conc. do Alvo 5 nM Dslxn SA, D, I, M Térm. Nenhum Competição Nenhum
Tabela 41 Ciclo Condição Ramificação C1R1 Alvo GUCY2C Humano R1 Conc. do Alvo 0,5 nM Dslxn SA, D, I, M Térm. Nenhum Competição 500 nM Ramificação C1R2A Alvo GUCY2C Humano R2A Conc. do Alvo 0,5 nM Dslxn SA, D, I, M Térm. Nenhum Competição 500 nM Ramificação C1R2B Alvo GUCY2C Humano R2B Conc. do Alvo 0,5 nM Dslxn SA, D, I, M Térm. 65C Competição 500 nM
[00644] As sequências de aminoácidos para os clones de anticorpo GUCY2c mostrando afinidade melhorada por ELISA de competição pe- riprep foram comparadas com o clone origem GUCY2C-1608 (VH SEQ ID NO: 73 e VL SEQ ID NO: 147). As alterações no conteúdo de amino- ácidos em CDRs VH levando a uma estabilidade melhorada são mostra- das na Tabela 42A. Alterações nas posições 54, 55, 56, 97 e 99 pareceram ter o maior impacto na afinidade, correlacionando-se com as maiores mu- danças na fluorescência resolvida no tempo (de acordo com o sistema de numeração de Kabat, usando a definição de AbM para VH CDR1).
Tabela 42A
V ( Posição Aminoácido Origem Aminoácido Otimizado Designação H1.31 31 S R, W, Y, A, H, P, Y, T, N, K, D, G, V H CDR1 H1.32 32 Y R, L, T, K, P, I, N, M, V, S H1) H2.52A 52A P T, V H2.53 53 S A, L, R VH CDR2 H2.54 (H2) 54 N T, R, H, K, M, S, A, Y, T, I H2.55 55 E R, K, N, Y, G, L, A, M, S, H, D, Q H2.56 56 L W, Y, F, V, I, N, H
V H2.57 57 T M, S, L, N, Q, V 93 T A H FW3 H3.96 96 I F, K H3.97 97 T V, L, I, M, F, Y, A H3.98 98 T N, R, G, L, I H3.99 99 T K, L, W, A, S, M, P, N, R H3.100 100 E G, A, H, S, D, T, R, Q, K, Y, L, M VH CDR3 (H3) H3.100B 100B Y H H3.100E 100E F L H3.101 101 D Y, E, S
[00645] As alterações no conteúdo de aminoácidos em VL CDRs le- vando à afinidade melhorada por ELISA de competição periprep são mostradas na Tabela 42B (o sistema de numeração de Chothia foi usado para VL CDR1. Alterações nas posições 30, 30a e 30d em VL CDR1 pareceram ter os maiores impactos na afinidade, correlacio- nando-se com as maiores mudanças na fluorescência resolvida no tempo.
Tabela 42B Designação Posição Aminoácido Origem Aminoácido Otimizado L1.30 30 D N, S L1.30a 30a Y W, I VL CDR1 L1.30d 30d T S, H (L1)
[00646] Após o rastreamento no formato scFv como preparações pe- riplasmáticas, as sequências VH e VL dos clones superiores foram clo- nadas no formato IgG1/kappa humano completo. Os genes VH e VL foram amplificados por PCR a partir do vetor de fago e subclonados no IgGI humano e nos vetores kappa humanos usando técnicas de biologia molecular previamente descritas. A versão de IgG1 humana destes clo- nes maturados por afinidade superiores foi, então, expressa transitoria- mente e purificada usando métodos também descritos anteriormente. As proteínas purificadas foram, então, analisadas por ressonância de plasmônio superficial como antes contra a proteína recombinante GUCY2c humana (SEQ ID NO. 232). A Tabela 43 mostra a índice de associação (ka), índice de dissociação (kd) e constante de equilíbrio (KD) para os clones amadurecidos por afinidade em comparação a GUCY2C-1608 origem na forma de IgG (GUCY2c-1640; SEQ ID NOs. 214 e 223). Várias variantes mostram afinidade melhorada em até 3,4 vezes em comparação com o anticorpo origem. A Tabela 44 mostra as sequências de aminoácidos VH e VL completas para essas versões ma- turadas por afinidade de GUCY2C-1608. Tabela 43. Ressonância de plasmônio superficial de IgG anti- GUCY2c amadurecida por afinidade contra a proteína do domínio extracelular GUCY2c humana (ECD). Ligante ka (1/Ms) kd (1/s) KD (nM) GUCY2C-1640 1,95E + 05 2,71E-03 13,87 ± 0,38 GUCY2C-1696 1,44E + 05 1,79E-03 12,42 ± 0,55 GUCY2C-1701 2,35E + 05 2,79E-03 11,85 ± 0,38
GUCY2C-1702 2,46E + 05 1,51E-03 6,16 ± 0,34 GUCY2C-1703 2,10E + 05 2,14E-03 10,32 ± 1,34 GUCY2C-1705 2,39E + 05 1,49E-03 6,25 ± 0,04 GUCY2C-1706 1,98E + 05 1,93E-03 9,75 ± 0,07 GUCY2C-1708 1,40E + 05 1,32E-03 9,44 ± 0,4 GUCY2C-1710 2,48E + 05 1,47E-03 5,94 ± 0,24 GUCY2C-1713 1,61E + 05 1,08E-03 6,71 ± 0,33 GUCY2C-1714 1,21E + 05 1,24E-03 10,27 ± 0,59 GUCY2C-1715 2,72E + 05 1,10E-03 4,07 ± 0,4 Tabela 44. Sequências de aminoácidos de regiões VH e VL amadu- recidas por afinidade SEQ ID NO. 294 GUCY2C-1696_VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTRWMHWVRQAPGKGLEWIGEIKPSNKLTN-
VHEKFKDRFTISVDKAKNSAYLQMNSLRAEDTAVYYCARTITTTEGYWFLSDWGQGTLVTVSS SEQ ID NO. 295 GUCY2C-1696_VL DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDYYGHSLMQWYQQKPGKAPKLLIYAASKLAS-
GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTRKAYTFGQGTKLEIK SEQ ID NO. 296 GUCY2C-1701_VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMHWVRQAPGKGLEWIGEIKPSNELT-
NVHEKFKDRFTISVDKAKNSAYLQMNSLRAEDTAVYYCTRTITTPLGYWFFDVWGQGTLVTVSS SEQ ID NO. 297 GUCY2C-1701_VL DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDYYGSSLMQWYQQKPGKAPKLLIYAASKLAS-
GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTRKAYTFGQGTKLEIK SEQ ID NO. 298 GUCY2C-1702_VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMHWVRQAPGKGLEWIGEIKPSNELT-
NVHEKFKDRFTISVDKAKNSAYLQMNSLRAEDTAVYYCTRTITTPLGYWFFDVWGQGTLVTVSS SEQ ID NO. 299 GUCY2C-1702_VL DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDYYGSSLMQWYQQKPGKAPKLLIYAASKLAS-
GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTRKAYTFGQGTKLEIK SEQ ID NO. 300 GUCY2C-1703_VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMHWVRQAPGKGLEWIGEIKP-
SNRWNNVHEKFKDRFTISVDKAKNSAYLQMNSLRAEDTAVYYCTRTITTTEGYWFFDVWGQGTLV
TVSS SEQ ID NO. 301 GUCY2C-1703_VL DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDYYGSSLMQWYQQKPGKAPKLLIYAASKLAS-
GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTRKAYTFGQGTKLEIK SEQ ID NO. 302 GUCY2C-1705_VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMHWVRQAPGKGLEWIGEIKPSRGFT-
NVHEKFKDRFTISVDKAKNSAYLQMNSLRAEDTAVYYCTRTITTTEGYWFFDVWGQGTLVTVSS SEQ ID NO. 303 GUCY2C-1705_VL DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDYYGSSLMQWYQQKPGKAPKLLIYAASKLAS-
GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTRKAYTFGQGTKLEIK SEQ ID NO. 304 GUCY2C-1706_VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSTWMHWVRQAPGKGLEWIGEIKPSNELT-
NVHEKFKDRFTISVDKAKNSAYLQMNSLRAEDTAVYYCTRTITTTEGYWFFDVWGQGTLVTVSS SEQ ID NO. 305 GUCY2C-1706_VL DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDYYGSSLMQWYQQKPGKAPKLLIYAASKLAS-
GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTRKAYTFGQGTKLEIK SEQ ID NO. 306 GUCY2C-1708_VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRPWMHWVR-
QAPGKGLEWIGEIKPSTGWTNVHEKFKDRFTISVDKAKNSAYLQMNSLRAEDTAVYYCTRTITTTT
GYWFFDVWGQGTLVTVSS SEQ ID NO. 307 GUCY2C-1708_VL DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDYYKHSLMQWYQQKPGKAPKLLIYAASKLAS-
GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTRKAYTFGQGTKLEIK SEQ ID NO. 308 GUCY2C-1710_VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMHWVR-
QAPGKGLEWIGEIKPSRGWTNVHEKFKDRFTISVDKAKNSAYLQMNSLRAEDTAVYYCARTITTTE
GYWFFDVWGQGTLVTVSS SEQ ID NO. 309 GUCY2C-1710_VL DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDYYRHSLMQWYQQKPGKAPKLLIYAASKLAS-
GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTRKAYTFGQGTKLEIK SEQ ID NO. 310 GUCY2C-1713_VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSHTWMHWVRQAPGKGLEWIGEIKPSRGFT-
NVHEKFKDRFTISVDKAKNSAYLQMNSLRAEDTAVYYCTRTITTTQGYWFFDVWGQGTLVTVSS SEQ ID NO. 311 GUCY2C-1713_VL DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVNWYGSSLMQWYQQKPGKAPKLLIYAASKLAS-
GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTRKAYTFGQGTKLEIK SEQ ID NO. 312 GUCY2C-1714_VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSHTWMHWVR-
QAPGKGLEWIGEIKPSTKYTNVHEKFKDRFTISVDKAKNSAYLQMNSLRAEDTAVYYCARTIFTREG
YWFFDVWGQGTLVTVSS SEQ ID NO. 313 GUCY2C-1714_VL DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVNWYGSSLMQWYQQKPGKAPKLLIYAASKLAS-
GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTRKAYTFGQGTKLEIK
SEQ ID NO. 314 GUCY2C-1715_VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMHWVR-
QAPGKGLEWIGEIKPSTKYTNVHEKFKDRFTISVDKAKNSAYLQMNSLRAEDTAVYYCTRTIFTNEG
YWFFDVWGQGTLVTVSS SEQ ID NO. 315 GUCY2C-1715_VL DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVSIYGSSLMQWYQQKPGKAPKLLIYAASKLAS-
GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTRKAYTFGQGTKLEIK Exemplo 29: Determinação de epitopo por mapeamento de peptí- deo do Domínio Extracelular GUCY2C
[00647] O mapeamento de peptídeos foi realizado para determinar o epitopo no domínio extracelular GU-CY2c (ECD) onde o anticorpo GUCY2c principal se liga. Para esta abordagem, foram gerados peptí- deos de 20-mer, com sobreposição de 15 aa, abrangendo todo o domí- nio extracelular no domínio de transmembrana de GUCY2c consistindo nos aminoácidos 1-440 (Tabela 45). Os peptídeos foram sintetizados e fornecidos como arranjos em formato liofilizado (New England Peptide, Gardner MA). Os arranjos foram reconstituídos com acetonitrila ema 100 µg/ml e foram posteriormente diluídos em 20 µg/ml com tampão de carbonato/bicarbonato de sódio. Anticorpos GUCY2c-CD3 purificados ou biespecíficos foram, então, testados por Delfia ELISA quanto à liga- ção a diferentes peptídeos usando os métodos Delfia ELISA previa- mente descritos, com peptídeos diluídos usados como o antígeno alvo. GUCY2C-1608 mostrou forte ligação aos peptídeos 19 e 20 (SEQ ID NOs: 334 e 335) conforme medido por fluorescência resolvida no tempo (TRF). Os dados de ligação por TRF para GUCY2C-1608 contra todos os peptídeos são mostrados na Tabela 45. A sequência, NSGDCRSSTCEGLDLLRKISNAQRM (SEQ ID NO: 405) é abrangida por estes peptídeos. Uma região de sobreposição entre os peptídeos é RSSTCEGLDLLRKIS (SEQ ID NO: 406) indicando um epitopo dentro da região. Tabela 45 Seq ID Peptídeo No. Peptídeo Sequência DELFIA TRF 316 1 MKTLLLDLALWSLLFQPGWL 166,25 317 2 LDLALWSLLFQPGWLSFSSQ 106,5 318 3 WSLLFQPGWLSFSSQVSQNC 97,75 319 4 QPGWLSFSSQVSQNCHNGSY 124,75
320 5 SFSSQVSQNCHNGSYEISVL 108,75
321 6 VSQNCHNGSYEISVLMMGNS 412,5
322 7 HNGSYEISVLMMGNSAFAEP 136
323 8 EISVLMMGNSAFAEPLKNLE 147,5
324 9 MMGNSAFAEPLKNLEDAVNE 145
325 10 AFAEPLKNLEDAVNEGLEIV 105,25
326 11 LKNLEDAVNEGLEIVRGRLQ 101,25
327 12 DAVNEGLEIVRGRLQNAGLN 258,75
328 13 GLEIVRGRLQNAGLNVTVNA 101,5
329 14 RGRLQNAGLNVTVNATFMYS 97
330 15 NAGLNVTVNATFMYSDGLIH 88,75
331 16 VTVNATFMYSDGLIHNSGDC 105,25
332 17 TFMYSDGLIHNSGDCRSSTC 112
333 18 DGLIHNSGDCRSSTCEGLDL 126
334 19 NSGDCRSSTCEGLDLLRKIS 19179,25
335 20 RSSTCEGLDLLRKISNAQRM 3208,75
336 21 EGLDLLRKISNAQRMGCVLI 81
337 22 LRKISNAQRMGCVLIGPSCT 93,5
338 23 NAQRMGCVLIGPSCTYSTFQ 96,25
339 24 GCVLIGPSCTYSTFQMYLDT 118,75
340 25 GPSCTYSTFQMYLDTELSYP 131
341 26 YSTFQMYLDTELSYPMISAG 104,25
342 27 MYLDTELSYPMISAGSFGLS 105
343 28 ELSYPMISAGSFGLSCDYKE 96,75
344 29 MISAGSFGLSCDYKETLTRL 101
345 30 SFGLSCDYKETLTRLMSPAR 125
346 31 CDYKETLTRLMSPARKLMYF 90,25
347 32 TLTRLMSPARKLMYFLVNFW 83,25
348 33 MSPARKLMYFLVNFWKTNDL 87,5
349 34 KLMYFLVNFWKTNDLPFKTY 99
350 35 LVNFWKTNDLPFKTYSWSTS 108
351 36 KTNDLPFKTYSWSTSYVYKN 111,5
352 37 PFKTYSWSTSYVYKNGTETE 106,75
353 38 SWSTSYVYKNGTETEDCFWY 109,5
354 39 YVYKNGTETEDCFWYLNALE 86,5
355 40 GTETEDCFWYLNALEASVSY 85,25
356 41 DCFWYLNALEASVSYFSHEL 161
357 42 LNALEASVSYFSHELGFKVV 96,5
358 43 ASVSYFSHELGFKVVLRQDK 104
359 44 FSHELGFKVVLRQDKEFQDI 90,5
360 45 GFKVVLRQDKEFQDILMDHN 107,5
361 46 LRQDKEFQDILMDHNRKSNV 105,75
362 47 EFQDILMDHNRKSNVIIMCG 103,75
363 48 LMDHNRKSNVIIMCGGPEFL 148
364 49 RKSNVIIMCGGPEFLYKLKG 129,25
365 50 IIMCGGPEFLYKLKGDRAVA 161
366 51 GPEFLYKLKGDRAVAEDIVI 96,75
367 52 YKLKGDRAVAEDIVIILVDL 103,75
368 53 DRAVAEDIVIILVDLFNDQY 87,75
369 54 EDIVIILVDLFNDQYLEDNV 112,25
370 55 ILVDLFNDQYLEDNVTAPDY 100,25
371 56 FNDQYLEDNVTAPDYMKNVL 81
372 57 LEDNVTAPDYMKNVLVLTLS 99,75
373 58 TAPDYMKNVLVLTLSPGNSL 98,5
374 59 MKNVLVLTLSPGNSLLNSSF 135,25
375 60 MKNVLVLTLSPGNSLLNSSF 150,25
376 61 VLTLSPGNSLLNSSFSRNLS 125,5
377 62 PGNSLLNSSFSRNLSPTKRD 91,25
378 63 LNSSFSRNLSPTKRDFALAY 109,5
379 64 SRNLSPTKRDFALAYLNGIL 116
380 65 PTKRDFALAYLNGILLFGHM 103
381 66 FALAYLNGILLFGHMLKIFL 114,25
382 67 LNGILLFGHMLKIFLENGEN 93,25
383 68 LFGHMLKIFLENGENITTPK 73,5
384 69 LKIFLENGENITTPKFAHAF 100,5
385 70 ENGENITTPKFAHAFRNLTF 91,75
386 71 ITTPKFAHAFRNLTFEGYDG 105
387 72 FAHAFRNLTFEGYDGPVTLD 116
388 73 RNLTFEGYDGPVTLDDWGDV 116,25
389 74 EGYDGPVTLDDWGDVDSTMV 100
390 75 PVTLDDWGDVDSTMVLLYTS 88,25
391 76 DWGDVDSTMVLLYTSVDTKK 102
392 77 DSTMVLLYTSVDTKKYKVLL 98,25
393 78 LLYTSVDTKKYKVLLTYDTH 97,75
394 79 VDTKKYKVLLTYDTHVNKTY 130
395 80 YKVLLTYDTHVNKTYPVDMS 1468,75
396 81 TYDTHVNKTYPVDMSPTFTW 109
397 82 VNKTYPVDMSPTFTWKNSKL 99,25
398 83 PVDMSPTFTWKNSKLPNDIT 85,75
399 84 PTFTWKNSKLPNDITGRGPQ 133
400 85 KNSKLPNDITGRGPQILMIA 163,25 401 86 PNDITGRGPQILMIAVFTLT 110,5 402 87 LRKISNAQRMGCVLIGPSCT 102 403 88 NAQRMGCVLIGPSCTYSTFQ 120,25 404 89 GCVLIGPSCTYSTFQMYLDT 115 405 NSGDCRSSTCEGLDLLRKISNAQRM 406 RSSTCEGLDLLRKIS
[00648] O peptídeo 19 GUCY2c (SEQ ID NO: 334) foi, então, com- petido com o domínio extracelular completo em um DELFIA ELISA de competição usando métodos descritos anteriormente e mostrou compe- tir efetivamente com o domínio extracelular completo (Figura 19). Isto sugere que o peptídeo 19 (SEQ ID NO 334) contém o epitopo específico onde GUCY2C-1608 se liga ao domínio extracelular GUCY2c completo. GUCY2C-1608 Liga Epitopo GUCY2c ECD Diferente do Anticorpo MS20
[00649] A ligação de GUCY2C-1608 ao domínio extracelular GUCY2c também foi comparada com anticorpos anti-GUCY2c conheci- dos. O anticorpo MS20 descrito em US2013/315923 não tinha um epi- topo relatado. Para comparar este anticorpo com GUCY2C-1608, um Delfia ELISA de competição foi realizado usando um método modificado do Delfia ELISA de competição descrito anteriormente. Aqui, a proteína GUCY2c humana (SEQ ID NO. 232) foi revestida na placa como antes. GUCY2C-1640 (versão IgG de GUCY2C-1608; SEQ ID NOs. 214 e 223) ou anticorpo MS20 foram diluídos em série começando em 20 µg/ml, em seguida, combinados com uma versão IgG quimérica de coelho de GUCY2C-0098 (SEQ ID NOs. 440 e 441, que consiste em SEQ ID NOs: 26 e 106 fundidas ao domínio constante de coelho) em 250 ng/ml (valor de EC50 determinado separadamente). As placas foram lavadas como antes e um anticorpo de európio anticoelho secundário (Perkin Elmer) diluído 1:1000 foi adicionado para detecção. O sinal de TRF foi detec- tado como antes. Uma diminuição no sinal de TRF indica ligação com- petitiva à medida que a versão quimérica de coelho de GUCY2C-0098 é deslocada da ligação a GUCY2c humana. Como esperado, GUCY2C- 1640 desloca a versão quimérica de coelho de GUCY2C-0098 enquanto MS20 não (Figura 20). Por conseguinte, GUCY2C-1608 liga-se a um epitopo de GUCY2c ECD diferente do Anticorpo MS20. Exemplo 30: GUCY2c-1608 Liga o Epitopo GUCY2c ECD Diferente do Anticorpo 5F9
[00650] Os anticorpos descritos em US2011/0110936 foram relata- dos para ligar-se a sequências de epítopos diferentes em GUCY2c ECD do peptídeo 19 (SEQ ID NO 334), conforme descrito abaixo.
[00651] 3x10e6 células que expressam GUCY2c humana, de rato e de galinha (CID1814, 1815 e 1818, respectivamente), mutantes pontu- ais CID1941-1950, mutantes "patch" CID1868-1873 (mutantes patch consistem em 2-5 resíduos de aminoácidos de GUCY2c humana subs- tituídos por resíduos de aminoácidos das posições equivalentes em GUCY2c de galinha) ou quimeras de GUCY2c humana e de galinha CID1874-1881 (> 5 aminoácidos de GUCY2c humana substituídos por resíduos de GUCY2c de galinha) ou quimeras reversas confirmatórias CID1939 & 1940 (> 5 aminoácidos de GUCY2c de galinha substituídos por resíduos de GUCY2c humana) ou controle negativo CID1431 (cons- truto de controle negativo não contendo sequência de GUCY2s, porém, com os mesmos marcadores de epitopo que outras construções expres- sas na superfície de levedura), foram adicionados por cavidade em uma placa de 96 cavidades. As células foram incubadas com anticorpo anti- V5 (Abcam 27671), anticorpos anti-GUCY2c monovalentes ou divalen- tes, anticorpo GUCY2C-1608 ou anticorpo 5F9 (anticorpo Millennium descrito em US2011/0110936) por 1 hora em temperatura ambiente. As células foram, então, lavadas três vezes com PBS + tampão BSA a 0,5 %. As células foram, então, incubadas com IgG anticamundongo conju- gado com PE ou IgG anti-humano conjugado com PE ou anticorpo anti- HA conjugado com PE (Miltenyi Biotec 130-092-257) por 30 minutos a
40°C em um local escuro. As células foram lavadas três vezes com PBS + tampão BSA a 0,5% e depois analisadas em um citômetro de fluxo.
[00652] A MFI (intensidade de fluorescência mediana) da ligação do anticorpo anti-GUCY2c às células foi normalizada para expressão na superfície celular medida por MFI de anticorpos antimarcador. Todas as células expressaram V5 e HA na superfície celular para normalização da expressão. A Tabela 46 mostra a ligação relativa normalizada de an- ticorpos anti-GUCY2c a cada construto GUCY2c. Quimeras (exceto CID1939 e CID1940), mutantes pontuais e mutantes patch que não se ligam ao Ab anti-GUCY2c indicam que os resíduos de GUCY2c altera- dos nessas construções são importantes para a ligação ao anticorpo. A restauração da ligação de GUCY2C-1608 e não do anticorpo 5F9 às quimeras reversas CID1939 e CID1940 confirma que o anticorpo GUCY2C-1608 liga os resíduos 68 a 87 em GUCY2c (SEQ ID NO: 224) e mostra que o sítio de ligação ao anticorpo 5F9 não se sobrepõe com o do anticorpo GUCY2C-1608. Tabela 46 Construto de GUCY2c Ab GUCY2Cc-1608 Ab 5F9 (SEQID) CID1814 + + (410) CID1815 + - (411) CID1818 - - (412) CID1868 - + (413) CID1869 + + (414) CID1870 + + (415) CID1871 + + (416)
CID1872 + + (417) CID1873 + + (418) CID1874 - + (419) CID1875 + + (420) CID1876 + + (421) CID1877 + + (422) CID1878 + + (423) CID1879 + + (424) CID1880 + + (425) CID1881 + + (426) CID1939 + - (427) CID1940 + - (428) CID1941 + + (429) CID1942 + + (430) CID1943 + + (431) CID1944 + + (432) CID1945 - + (433) CID1946 + + (434) CID1947 + + (435) CID1948 + +
(436) CID1949 + + (437) CID1950 + + (438) CID1431 - - (439) Exemplo 31: Cristalização e Determinação da Estrutura de scFv anti-GUCY2C-1608 mais o complexo GUCY2c-peptídeo
[00653] Para ensaios de cristalização, o complexo entre scFv de GUCY2C-1608 (SEQ ID NO 409) e número 19 do peptídeo GUCY2c- ECD 68NSGDCRSSTCEGLDLLRKIS87 (SEQ ID NO 334) foi formado na relação molar de 1:1,2 e foi concentrado em 8,8 mg/ml em uma solução de proteína contendo TBS em pH 7,5. Os cristais foram obtidos pelo método de difusão de vapor em gota suspensa a partir de uma condição contendo PEG 3350 a 20 %, Sulfato de Lítio 200 mM, bis-tris pH 5,5. Os cristais em forma de bastão tinham simetria consistente com o grupo espacial monoclínico = P212121 com parâmetros celulares a = 70,68 Å; b = 80,57Å; c = 90,7 Å e com duas cópias de complexos scFv-peptídeo GUCY2C-1608 na unidade assimétrica cristalográfica. Os cristais foram crioprotegidos usando a solução de reservatório contendo etileno glicol a 20 % e foram congelados rapidamente em nitrogênio líquido. Um con- junto de dados com uma resolução de 1,6 Å foi coletado de um único cristal congelado na linha de feixe de IMCA 17-ID no Argonne National Laboratory (APS). Os dados foram processados e escalonados usando autoPROC, e o conjunto de dados final estava 71,4 % completo.
[00654] A estrutura foi resolvida por substituição molecular com PHA- SER começando com o fragmento Fv de cadeia única obtido a partir da estrutura anti-GUCY2c CD3 biespecífica (Figura 22). A solução foi ob- tida procurando as duas cópias de scFv de GUCY2C-1608. Os mapas de densidade de elétrons resultantes calculados com as duas cópias de scFv de GUCY2C-1608 como um modelo mostraram inequivocamente densidades de elétrons extras para os dois peptídeos, cada um ligado à cópia correspondente de scFv de GUCY2C-1608.
[00655] Vários ciclos iterativos de ajuste manual e reconstrução mo- delo usando COOT e refinamento cristalográfico usando autoBUSTER produziram o modelo final de scFv de GUCY2C-1608 + peptídeo com um Rwork cristalográfico de 19,7 % e Rfree de 21,7 %, onde Rwork = || Fobs | - | Fcalc ||/| Fobs | e Rfree é equivalente a Rwork, porém, calculado para 5 % de reflexões escolhidas randomizadamente e omitidas do processo de refinamento. A. Descrição da estrutura do peptídeo scFv de GUCY2C-1608
[00656] O peptídeo GUCY2c de 17 resíduos no comprimento adota principalmente uma confirmação de α-helical na ligação às regiões CDR de scFv de GUCY2C-1608 (Figura 21). A α-hélice é a ligação dissulfeto SS restrita ao N-terminal do peptídeo. A área de interface de ligação total oculta sob interação é de ~ 1.320 Å2, que é surpreendentemente grande para um fragmento de apenas 17 resíduos de aminoácidos no comprimento. A interface de ligação é predominantemente hidrofóbica, com alguns contatos polares específicos em seu centro e contatos de ligação de hidrogênio em sua periferia (Figura 21).
[00657] Os contatos de epitopo de ligação que estão dentro de 3,8 Å com scFv de GUCY2C-1608 são definidos por resíduos sublinhados na 68 sequência de peptídeo: NSGDCRSSTCEGLDLLRKIS87 e estão lista- dos na Tabela 47. Os aminoácidos que contribuem com > 75 % de sua área de superfície para a interface de ligação são destacados em ne- grito. O parátopo de ligação de scFv de GUCY2C-1608 é definido por 5 regiões CDR: CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1 e CDR-L3. Os ami- noácidos de scFv de GUCY2C-1608 (parátopo) e GUCY2c-peptídeo (epitopo) que estão envolvidos no contato dentro de 3,8 Å estão listados na Tabela 48.
Tabela 47. Resíduos do epitopo GUCY2c Cadeia Tipo GUCY2c Posição % de BSA Interações Eletrostáticas ARG C 73 50,28431 H SER C 74 56,99118 SER C 75 93,22802 H THR C 76 85,61988 H GLU C 78 46,89699 H GLY C 79 86,96493 W LEU C 80 78,57378 LEU C 82 28,2139 LEU C 83 88,59774 ARG C 84 40,15275 ILE C 86 23,20466
Tabela 48. Aminoácidos que definem Parátopo (cadeias H + L) e Epitopo (cadeia C) Resíduos tendo átomos dentro de 3,80 Angstrom Resíduo de Anticorpo Cadeia de Antígeno Resídeo de Antígeno Cadeia de Anticorpo (Sequential) (Kabat)
C 73 H 33 33
C 73 H 57 56
C 73 H 58 57
C 73 H 59 58
C 74 H 33 33
C 74 H 50 50
C 74 H 59 58
C 75 H 33 33
C 75 H 50 50
C 75 L 99 96
C 76 L 96 92
C 76 L 98 94
C 78 H 33 33
C 79 H 107 100C
C 80 H 107 100C
C 80 L 31 27D
C 80 L 96 92
C 82 H 101 97
C 83 H 104 100
C 83 H 105 100A
C 83 L 36 32
C 84 L 31 27D
C 84 L 32 28
C 86 H 103 99
C 86 H 104 100
C 86 H 105 100A
B.
Cristalização e Determinação da Estrutura de Biespecífico de anti-GUCY2c CD3
[00658] Para ensaios de cristalização, uma versão modificada de GUCY2C-1608 foi gerada com um rótulo His6 ou um rótulo FLAG no C- terminal de cada cadeia de subunidade VL-VH para auxiliar na purifica- ção.
O anticorpo GUCY2c CD3 biespecífico para cristalografia foi ge- rado usando as sequências GU-CY2C-1637 VH (SEQ ID NO. 407) e GUCY2C-1637 VL (SEQ ID NO. 408). Os construtos foram transitoria- mente transfectados em células 293 HEK FreeStyle™ como descrito acima.
Após a colheita dos meios condicionados, 2,5 mL de resina Ni- NTA pré-equilibrada em TBS foram permitidos ligar-se por batelada à proteína por 1 hora a 4 °C em um misturador orbital.
A resina foi, então, coletada e colocada em uma coluna de Applied Biosystems (Life Technologies, Grand Island, NY, USA). A resina foi primeiro lavada até a linha de base com Tampão A (fosfato de sódio 50 mM, cloreto de sódio 300 mM pH 8,0), depois com cinco CVs de Tampão A suplementado com imidazol 20 mM e finalmente eluído com Tampão A + imidazol 250 mM.
As frações com a pureza mais elevada foram reunidas e dialisadas em PBS usando uma cassete de 30 ml com um MWCO de 10 kD du- rante 2 horas a 4°C.
A proteína dialisada foi, então, também purificada por cromatografia anti-FLAG.
Quarenta mL de resina anti-FLAG M2 (Sigma, St.
Louis, MO, USA) foi pré-equilibrada em TBS e permitidos ligar-se por batelada em 1,4 L de meio condicionado durante a noite a 4 °C.
A resina foi, então, coletada e embalada em uma coluna para cro- matografia anti-FLAG M2, lavada até a linha de base com TBS (20 CVs) e inicialmente eluída com tampão de peptídeo FLAG 0,1 M e finalmente eluída com glicina 0,1 M pH 3,0. A proteína eluída foi imediatamente neutralizada com Tris 1,0 M a 10 % pH 8,0. As frações com a pureza mais elevada foram, então, reunidas e posteriormente purificadas por cromatografia de exclusão por tamanho usando uma coluna Super- dex200 (GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA) e armazenadas em TBS.
[00659] Para os ensaios de cristalização, a versão His/FLAG purifi- cada de GUCY2C-1608 foi concentrada em 12 mg/ml em uma solução de proteína contendo TBS pH 7,5. Os cristais foram obtidos pelo método de difusão de vapor em gota suspensa a partir de uma condição con- tendo Malonato de Sódio 1M pH 6, polímero de etileno imina a 2%. Os cristais tinham simetria consistente com o grupo espacial hexagonal = P3221 com parâmetros celulares a = b = 119,55 Å e c = 121,85 Å e com uma cópia do diacorpo na unidade cristalográfica assimétrica. Os cris- tais foram crioprotegidos usando solução de reservatório contendo Ma- lonato de Sódio 2,8 M pH 6 e foram congelados rapidamente em nitro- gênio líquido. Um conjunto de dados com uma resolução de 2,03 Å foi coletado de um único cristal congelado na linha de feixe de IMCA 17-ID no Argonne National Laboratory (APS). Os dados foram processados e escalonados usando autoPROC, e o conjunto de dados final estava 49,3% completo.
[00660] A estrutura foi resolvida por substituição molecular com PHA- SER começando com os modelos de fragmento Fv de cadeia simples preparados a partir da entrada 1moe de PDB de Brookhaven. A solução foi obtida pesquisando cada uma das quatro subunidades da molécula de diacorpo separadamente. Vários ciclos iterativos de ajuste manual e reconstrução do modelo usando COOT e refinamento cristalográfico usando autoBUSTER produziram o modelo final do diacorpo com um Rwork cristalográfico de 19,1 % e Rfree de 20,8 %, onde Rwork = || Fobs | - | Fcalc ||/| Fobs | e Rfree é equivalente a Rwork, porém, calculado para 5 % de reflexões escolhidas randomizadamente e omitidas do processo de re- finamento. C. Descrição da estrutura de diacorpo anti-GUCY2C-CD3
[00661] Os dois sítios de ligação ao antígeno no anticorpo biespecí- fico GUCY2c CD3 são separados por cerca de 70 Å e estão localizados nos lados opostos da molécula, diretamente um em frente ao outro (Fi- gura 22). Ambas as regiões CDR anti-CD3 e CDR anti-GUCY2c estão posicionadas remotamente a partir da interface da subunidade. Exemplo 32: Avaliação in vivo de combinação de GUCY2c CD3 bi- específico com mAb anti-VEGF-A e axitinibe
[00662] PBMCs humanas foram descongeladas em meios (X-VIVO 15 (Lonza). Albumina de soro humano a 5% (Gemini #100-318), Pen/Es- trep a 1%, 2-mercaptoetanol 0,01 mM) em aproximadamente 5 milhões de células por ml. As células foram centrifugadas e ressuspensas em tampão Robosep (Stem Cell Technologies) em uma concentração de 50 milhões de células por ml. As células T foram isoladas usando o kit de enriquecimento de células T humanas EasySep (Stem cell Technolo- gies). As células T foram ativadas e expandidas usando um kit de ativa- ção/Expansão de células T Humanas (Miltenyi). No dia 2, as células T foram transferidas para um dispositivo de cultura de célula G-Rex para expansão e IL-2 (Stem Cell Technologies) foi adicionada aos meios e reabastecida após 2 dias. As células T foram colhidas 1 semana após a ativação/expansão. No momento da colheita, as contas foram removi- das com um ímã, e as células foram ressuspensas em DPBS em 1x107 células/mL para inoculação in vivo.
[00663] Camundongos NSG foram inoculados com fragmentos PDX- CRX-11201 de xenoenxerto derivados de paciente colorretal por meio subcutâneo no flanco. As medições do tumor foram coletadas usando um calibrador Vernier digital e os volumes foram calculados pelo uso da fórmula elipsoide modificada ½ × comprimento × largura2. Os camun- dongos foram randomizados e adaptados no tamanho de tumor de 150- 200 mm3. Uma dose inicial de GUCY2c biespecífico (GUCY2C-1608), controle negativo biespecífico ou veículo foi administrada em animais no dia 0, e 2 milhões de células T cultivadas foram inoculadas no dia se- guinte. Os camundongos foram dosados em injeção de bolus de 0,2 mL semanalmente até 3 vezes, e todas as administrações de compostos e células T foram intravenosas através da veia da cauda de cada animal. Os agentes de combinação foram administrados a partir do Dia 0. O mAb anti-VEGF (G6-31) foi administrado a cada 3 dias até 4 vezes por meio intravenoso através da veia da cauda. Axitinibe foi administrado duas vezes ao dia até 14 dias por gavagem oral. As medições do tumor foram coletadas duas vezes por semana, juntamente com monitora- mento contínuo para sinais de uma resposta do enxerto versus hospe- deiro.
[00664] O GUCY2c CD3 biespecífico administrado em 0,05 mg/kg teve uma resposta antitumoral parcial no modelo de transferência ado- tiva PDX-11201. O mAb anti-VEGF e o axitinibe também tiveram uma resposta antitumoral parcial neste modelo quando administrados sozi- nhos em 5 mg/kg e 15 mg/kg, respectivamente. A combinação de GUCY2c CD3 biespecífico com o mAb Anti-VEGF ou com axitinibe re- sultou em respostas antitumorais aditivas mostrando inibição do tumor completa.
[00665] GUCY2C-1608 mostra inibição de crescimento tumoral real- çada em combinação com um mAb anti-VEGF, bem como axitinibe em modelo de xenoenxerto derivado de paciente com carcinoma colorretal PDX-CRX-11201 com transferência de células T adotivas. Exemplo 33: Avaliação in vivo da combinação de GUCY2c CD3 bi- específico com anti-PD1
[00666] PBMCs humanas foram descongeladas em meios (X-VIVO 15 (Lonza). Albumina de soro humano a 5% (Gemini #100-318), Pen./Estrep. a 1%, 2-mercaptoetanol 0,01 mM) em aproximadamente 5 milhões de células por ml. As células foram centrifugadas e ressuspen- sas em tampão Robosep (Stem Cell Technologies) a uma concentração de 50 milhões de células por ml. As células T foram isoladas usando o kit de enriquecimento de células T humanas EasySep (Stem cell
Technologies). As células T foram ativadas e expandidas usando um kit de ativação/Expansão de células T Humanas (Miltenyi). No dia 2, as células T foram transferidas para um dispositivo de cultura de célula G- Rex para expansão, e IL-2 (Stem Cell Technologies) foi adicionada ao meio e reabastecida após 2 dias. As células T foram colhidas 1 semana após a ativação/expansão. No momento da colheita, as contas foram removidas com um ímã, e as células foram ressuspensas em DPBS em 1x107 células/mL para inoculação in vivo.
[00667] Os camundongos NSG foram inoculados com células LS1034 da linhagem celular de câncer colorretal por via subcutânea no flanco. As medições do tumor foram coletadas usando um calibrador Vernier digital e os volumes foram calculados pelo uso da fórmula elip- soide modificada ½ × comprimento × largura2. Os camundongos foram randomizados e adaptados no tamanho de tumor de 150-200 mm3. Uma dose inicial de GUCY2c biespecífico (GUCY2C-1608) em 0,03 mg/kg, controle negativo biespecífico em 0,1 mg/kg, Anti-PD1 (mutante da fun- ção efetora de D265A hIgG1a Fc biossimilar pembrolizumabe) em 5 mg/kg, ou veículo foi administrado a animais no dia 0, e 2 milhões de células T cultivadas foram inoculadas no dia seguinte. Os camundongos foram dosados em injeção de bolus de 0,2 mL semanalmente até 3 ve- zes, e todas as administrações de compostos e células T foram intrave- nosas através da veia da cauda lateral de cada animal. As medições do tumor foram coletadas duas vezes por semana, juntamente com moni- toramento contínuo para sinais de uma resposta do enxerto versus hos- pedeiro.
[00668] Biespecífico GUCY2c CD3 administrado em 0,03 mg/kg teve uma resposta antitumoral parcial no modelo de transferência adotiva LS1034. Anti-PD-1 não teve resposta antitumoral neste modelo quando administrado em 10 mg/kg. A combinação de GUCY2c CD3 biespecífico com anti-PD-1 resultou em uma resposta antitumoral aditiva (Figura 24).
[00669] GUCY2C-1608 mostra inibição do crescimento tumoral real- çada em combinação com um mAb anti-PD1 no modelo de xenoenxerto derivado da linhagem de células de carcinoma colorretal LS1034 com transferência de células T adotivas. Exemplo 34: Avaliação in vivo da combinação de GUCY2c CD3 biespecífico com anti-PDL1
[00670] PBMCs humanas foram descongeladas em meios (X-VIVO 15 (Lonza). Albumina de soro humano a 5% (Gemini #100-318), Pen./Estrep. a 1%, 2-mercaptoetanol 0,01 mM) em aproximadamente 5 milhões de células por ml. As células foram centrifugadas e ressuspen- sas em tampão Robosep (Stem Cell Technologies) a uma concentração de 50 milhões de células por ml. As células T foram isoladas usando o kit de enriquecimento de células T humanas EasySep (Stem cell techno- logies). As células T foram ativadas e expandidas usando um kit de ati- vação/Expansão de células T Humanas (Miltenyi). No dia 2, as células T foram transferidas para um dispositivo de cultura de célula G-Rex para expansão e IL-2 (Stem Cell Technologies) foi adicionado ao meio e re- abastecida após 2 dias. As células T foram colhidas 1 semana após a ativação/expansão. No momento da colheita, as contas foram removi- das com um ímã, e as células foram ressuspensas em DPBS a 1x107 células/mL para inoculação in vivo.
[00671] Os camundongos NSG foram inoculados com células LS1034 da linhagem celular de câncer colorretal por via subcutânea no flanco. As medições do tumor foram coletadas usando um calibrador Vernier digital e os volumes foram calculados pelo uso da fórmula elip- soide modificada ½ × comprimento × largura2. Os camundongos foram randomizados e adaptados no tamanho de tumor de 150-200 mm3. Uma dose inicial de GUCY2c biespecífico (GUCY2C-1608) em 0,03 mg/kg ou controle negativo biespecífico em 0,1 mg/kg, ou veículo foi administrada em animais no dia 0, e 2 milhões de células T cultivadas foram inocula- das no dia seguinte. Os camundongos foram dosados em injeção de bolus de 0,2 mL semanalmente até 3 vezes, e todas as administrações de compostos e células T foram intravenosas através da veia da cauda lateral de cada animal. O anti-PDL1 foi administrado por via intravenosa começando no dia 0 a cada 3 dias até 6 vezes. As medições do tumor foram coletadas duas vezes por semana, juntamente com monitora- mento contínuo para sinais de uma resposta do enxerto versus hospe- deiro.
[00672] GUCY2c CD3 biespecífico administrado em 0,03 mg/kg teve uma resposta antitumoral parcial no modelo de transferência adotiva LS1034. Anti-PD-L1 não teve resposta antitumoral neste modelo quando administrado em 10 mg/kg. A combinação de GUCY2c CD3 bi- específico com anti-PD-L1 resultou em uma resposta antitumoral aditiva (Figura 25).
[00673] GUCY2C-1608 mostra inibição do crescimento tumoral real- çada em combinação com um mAb anti-PD-L1 no modelo de xenoen- xerto derivado da linhagem de células de carcinoma colorretal LS1034 com transferência de células T adotivas. Exemplo 35: Um Estudo de Expansão e Escalonamento de Dose de Fase 1 Avaliando a Segurança, Tolerabilidade, Farma- cocinética, Farmacodinâmica e Atividade Antitumoral de Anticorpo GUCY2c-1608 Biespecífico em Pacientes com Tumores Gastroin- testinais Avançados
[00674] Este Exemplo apresenta um estudo de Fase 1, de rótulo aberto, multicêntrico, de múltiplas doses, de segurança, PK e PD do an- ticorpo GUCY2c-1608 biespecífico. O estudo contém duas partes, au- mento de dose como um agente único e descoberta de dose em combi- nação (anti-PD-1 ou anti-VEGF) (Partes 1A e 1B, respectivamente) se-
guido pela expansão da dose (Parte 2). Coortes sequenciais de pacien- tes com tumores gastrointestinais avançados/metastáticos, incluindo adenocarcinomas colorretais, gástricos e esofágicos, que não são can- didatos a regimes conhecidos por fornecerem benefícios clínicos, rece- berão doses crescentes de anticorpo GUCY2c-1608 biespecífico, na Parte 1A do estudo. Na Parte 1B, a avaliação de descoberta de dose do anticorpo GUCY2c-1608 biespecífico em combinação (anti-PD-1 ou anti-VEGF), ocorrerá em pacientes com adenocarcinomas colorretais, gástricos e esofágicos avançados/metastáticos. A Parte 2 (fase de ex- pansão da dose) avaliará a Dose de Fase 2 Recomendada (RP2D) se- lecionada da Parte 1 (fase de aumento de dose) como uma monoterapia ou em combinação (anti-PD-1 ou anti-VEGF) em pacientes com adeno- carcinomas colorretais previamente tratados. Coortes de biomarcadores que requerem biópsias tumorais pareadas nesses pacientes podem ocorrer nas Partes 1A e 1B visto que a Dose Tolerada Máxima (MTD) é abordada ou na RP2D/MTD e em subconjuntos dos braços de expansão de dose na Parte 2.
[00675] Doses crescentes de GUCY2c-1608 serão administradas como uma injeção subcutânea (SC) semanal em ciclos de 21 dias. A dose SC de partida proposta é de 0,6 µg/kg.
[00676] Ao determinar o GUCY2c-1608 RP2D/MTD como monotera- pia, as coortes de dose da Parte 1B serão iniciadas para explorar a se- gurança, tolerabilidade e atividade antitumoral preliminar deste nível de dose em combinação (anti-PD-1 ou anti-VEGF). A fase de expansão da dose (Parte 2) avaliará a RP2D de GUCY2c-1608 como monoterapia e com um agente de combinação (anti-PD-1 ou anti-VEGF) em pacientes com adenocarcinomas colorretais avançados/metastáticos.
[00677] Haverá também um intervalo mínimo de 72 horas entre a pri- meira dose administrada a cada um dos pacientes iniciais (isto é, paci- entes que contribuem para a avaliação da Toxicidade de Limitação de
Dose (DLT) inicial) inscritos em um novo nível de dose. Todos os paci- entes serão observados internamente por pelo menos 48 horas ou mais após a primeira dose SC no Dia 1 do Ciclo 1 (C1D1) para a Parte 1.
[00678] O tratamento com GUCY2c-1608 continuará até que ocorra a progressão da doença, a recusa do paciente ou a toxicidade inaceitá- vel, o que ocorrer primeiro, a menos que o investigador e o monitor mé- dico concordem com o tratamento além da progressão da doença com base nas avaliações individuais de benefício/risco. Regime de Dosagem Alternativo com Administração de Dose IV
[00679] Com base nos dados clínicos emergentes disponíveis (inclu- indo segurança/tolerabilidade, PK, PD e outros) das coortes de aumento de dose com administração SC, a administração intravenosa (IV) pode ser avaliada.
[00680] A avaliação de uma dose inicial para permitir a administração de dose de nível mais alto subsequente pode ser instituída neste estudo. Critérios para Aumento de Dose
[00681] Para coortes de administração, os níveis de dose inicial são fornecidos na Tabela 49; as doses intermediárias podem ser avaliadas com base nos achados clínicos. Para coortes de administração SC, du- rante os níveis iniciais de aumento da dose, os aumentos máximos da dose serão de até 250 %, porém, serão ajustados para não mais do que 100 % após a observação de um DLT. Tabela 49 Níveis de Aumento de Dose SC para Administração Nível de Dose Dose (µg/kg) DL1 0,6 (Dose de Partida) DL 2 2,0 DL 3 O aumento para continuar em MTD ou atividade e superior farmacológica desejada *As doses intermediárias podem ser avaliadas com base em achados clínicos
[00682] O aumento da dose interromperá quando os critérios de in- terrupção forem atendidos, conforme determinado por alguém versado na técnica.
[00683] A parte 1A do estudo visa determinar uma MTD para um re- gime de dose SC, no entanto, se o regime de dosagem for alterado para IV, então, a MTD será determinada para a administração de dose IV. Se a introdução da primeira dose for necessária para IV, então, a MTD será determinada para IV com o regime de dose inicial.
[00684] A Parte 1B terá como objetivo determinar a MTD de GUCY2c-1608 com um agente de combinação (anti-PD-1 ou anti- VEGF).
[00685] A RP2D é a dose escolhida para outro estudo com base nos resultados do estudo de Fase 1. Seleção de Paciente
[00686] Para o aumento da dose (Parte 1A e 1B): Diagnóstico histo- lógico ou citológico de adenocarcinoma colorretal, gástrico ou esofágico avançado/metastático que é resistente à terapia padrão ou para o qual nenhuma terapia padrão está disponível.
[00687] Para expansão da dose (Parte 2): Diagnóstico histológico ou citológico de adenocarcinoma colorretal tratado anteriormente com pelo menos uma lesão mensurável, não previamente irradiada, conforme de- finido por RECIST versão 1.1, que é resistente à terapia padrão ou para a qual nenhuma terapia padrão está disponível. Controle da Síndrome de Liberação de Citocinas
[00688] O controle da síndrome de liberação de citocinas (CRS) e um sistema de classificação de CRS revisado são adaptados de D.W.Lee, et al: Current Concepts in the Diagnosis and Management of Cytokine Release Syndrome. Blood 124 (2014) 188 195.
[00689] Administração anti-IL6: Considerar 4 mg/kg em 1 hora e ad- ministrar uma segunda dose se não houver melhora clínica em 24 a 48 horas.
[00690] A descrição de cada patente, pedido de patente e publicação aqui citada é aqui incorporada por referência em sua totalidade. Equivalente
[00691] Embora esta invenção tenha sido descrita com referência a modalidades específicas, é evidente que outras modalidades e varia- ções desta invenção podem ser concebidas por outros versados na téc- nica sem se afastar do real espírito e escopo da invenção. O assunto da invenção inclui todas as outras modalidades e variações, incluindo com- binações e subcombinações dos vários elementos, características, fun- ções e/ou propriedades aqui descritas. As seguintes reivindicações apontam particularmente certas combinações e subcombinações consi- deradas novas e não óbvias. A invenção incorporada em outras combi- nações e subcombinações de características, funções, elementos e/ou propriedades pode ser reivindicada neste pedido, em pedidos que rei- vindicam prioridade deste pedido, ou em pedidos relacionados. Tais rei- vindicações, sejam direcionadas a uma invenção diferente ou à mesma invenção, e sejam mais amplas, mais restritas, iguais ou diferentes no escopo em comparação com as reivindicações originais, também são consideradas como incluídas no assunto das invenções da presente descrição.

Claims (1)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Anticorpo que se liga especificamente a guanilil ciclase C (GUCY2c), caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende: a. uma região variável de cadeia pesada (VH) que com- preende uma região determinante de complementaridade VH um (VH CDR1), uma região determinante de complementaridade VH dois (VH CDR2) e uma região determinante de complementaridade VH três (VH CDR3) da sequência VH mostrada na SEQ ID NO: 11, 19, 26, 33, 41, 48, 52, 57, 60, 62, 64, 65, 67, 69, 71 ou 73; e / ou b. uma região variável de cadeia leve (VL) compreen- dendo uma região determinante de complementaridade VL um (VL CDR1), uma região determinante de complementaridade VL dois (VL CDR2) e uma região determinante de complementaridade VL três (VL CDR3) da sequência VL mostrada na SEQ ID NO: 92, 100, 104, 106, 112, 119, 125, 129, 134, 136, 137, 138, 140, 143, 145, 147, 150, 152, 156, 158, 160, 162, 166, 170, 171, 172, 173, 174 ou 175.
    2. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que : c. a região VH compreende (i) um VH CDR1 compreen- dendo uma sequência de SEQ ID NO: 12, 20, 27, 34, 42, 74, 257, 258, 259, 260 ou 261; (ii) um VH CDR2 compreendendo uma sequência de SEQ ID NO: 13, 21, 28, 35, 43, 53, 66, 68, 70, 72, 75, 262, 263, 264, 265, 266 ou 267; e (iii) um VH CDR3 compreendendo uma sequência de SEQ ID NO: 14, 22, 29, 36 ou 44; e / ou d. a região VL compreende (i) uma VL CDR1 compre- endendo uma sequência de SEQ ID NO: 93, 101, 105, 107, 113, 120, 148, 153, 163 ou 167; (ii) um VL CDR2 compreendendo uma sequência de SEQ ID NO: 78, 94, 102, 108, 114, 141, 144, 146, 149, 151, 157, 159, 161, 164 ou 168; e (iii) um VL CDR3 compreendendo uma sequên- cia de SEQ ID NO: 95, 109, 115, 121, 142, 154, 165 ou 169.
    3. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que: a. a região VH compreende (i) uma VH CDR1 compre- endendo a sequência da SEQ ID NO: 74 ou 259; (ii) um VH CDR2 com- preendendo a sequência de SEQ ID NO: 75 ou 267; e iii) um VH CDR3 compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 29; e / ou b. a região VL compreende (i) uma VL CDR1 compre- endendo a sequência da SEQ ID NO: 148; (ii) aVL CDR2 compreen- dendo a sequência de SEQ ID NO: 149; e (iii) um VL CDR3 compreen- dendo a sequência de SEQ ID NO: 142.
    4. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracte- rizado pelo fato de que: e. a região VH compreende uma sequência de SEQ ID NO: 11, 19, 26, 33, 41, 48, 52, 57, 60, 62, 64, 65, 67, 69, 71 ou 73; e / ou f. a região VL compreende uma sequência de SEQ ID NO: 92, 100, 104, 106, 112, 119, 125, 129, 134, 136, 137, 138, 140, 143, 145, 147, 150, 152, 156, 158 , 160, 162, 166, 170, 171, 172, 173, 174 ou 175.
    5. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a região VH compreende a sequência da SEQ ID NO: 73; e em que a região VL compreende a se- quência da SEQ ID NO: 147.
    6. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 5, caracterizado pelo fato de que a região VH compreende a sequência da SEQ ID NO: 73, ou uma variante desta com uma ou várias substituições conservadoras de aminoácidos em resíduos que não es- tão dentro de uma região CDR; e / ou em que a região VL compreende a sequência de SEQ ID NO: 147, ou uma variante desta com uma ou várias substituições conservativas de aminoácidos em aminoácidos que não estão dentro de uma região CDR.
    7. Anticorpo que se liga a GUCY2c, caracterizado pelo fato de que compreende: a. um GUCY2c VL CDR1 compreendendo aminoácidos com a sequência RASESV-XL1.30-XL1.30a-YG-XL1.30d-SLLQ; b. um GUCY2c VL CDR2 compreendendo aminoácidos tendo a sequência mencionada em SEQ ID NO: 149; c. um GUCY2c VL CDR3 compreendendo aminoácidos tendo a sequência mencionada em SEQ ID NO:142; d. um GUCY2c VH CDR1 compreendendo aminoácidos tendo a sequência GFTFS-XH1.31-XH1.32-WMH; e. um GUCY2c VH CDR2 compreendendo aminoácidos tendo a sequência EIK- XH2.52A-XH2.53-XH2.54-XH2.55-XH2.56-XH2.57-NVHEK- FKD; e f. um GUCY2c VH CDR3 compreendendo aminoácidos com a sequência T-XH3.96-XH3.97-XH3.98-XH3.99-XH3.100-G-XH3.100B-WF- XH3.100E-XH3.101-V.
    8. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que: a. XL1.30 é D, N ou S; b. XL1.30a é Y, W ou I; c. XL1.30d é T, S ou H; d. XH1.31 é S, R, W, Y, A, H, P, Y, T, N, K, D, G ou V; e. XH1.32 é Y, R, L, T, K, P, I, N, M, V ou S; f. XH2.52A é P, T ou V; g. XH2.53 é S, A, L ou R; h. XH2.54 é N, T, R, H, K, M, S, A, Y, T ou I; i. XH2.55 é E, R, K, N, Y, G, L, A, M, S, H, D ou Q; j. XH2.56 é L, W, Y, F, V, I, N ou H; k. XH2.57 é T, M, S, L, N, Q ou V;
    l. XH3.96 é I, F ou K; m. XH3.97 é T, V, L, I, M, F, Y ou A; n. XH3.98 é T, N, R, G, L ou I; o. XH3.99 é T, K, L, W, A, S, M, P, N ou R; p. XH3.100 é E, G, A, H, S, D, T, R, Q, K, Y, L ou M; q. XH3.100B é Y ou H; r. XH3.100E é F ou L; e s. XH3.101 é D, Y, E ou S.
    9. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é selecionado do grupo que consiste em um fragmento Fab, um fragmento Fab’, um fragmento F(ab')2, um fragmento Fd, um fragmento Fv, um fragmento Fv de cadeia única (scFv), um fragmento Fv de dissulfeto (dsFv) estabilizado , um fragmento de anticorpo de domínio único (dAb), um anticorpo monoclo- nal, um anticorpo quimérico, um anticorpo biespecífico, um anticorpo tri- específico, um anticorpo multiespecífico, um diacorpo heterodimérico bi- específico, um IgG heterodimérico biespecífico, um anticorpo policlonal, um anticorpo marcado, um anticorpo humanizado, um anticorpo hu- mano, e fragmentos do mesmo.
    10. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 9, caracterizado pelo fato de que ainda compreende uma es- trutura VH humana ou humanizada e uma estrutura VL humana ou hu- manizada.
    11. Anticorpo de acordo com a reivindicação 10, caracteri- zado pelo fato de que a estrutura VH compreende a sequência de SEQ ID NO: 5, 6, 7, 8, 15, 16, 17, 18, 23, 24, 25, 30, 31, 32, 37, 38, 39, 40, 45, 46, 47, 49, 50, 51, 54, 55, 56, 58, 59, 61, ou 63; e/ou a estrutura VL compreende a sequência de SEQ ID NO: 80, 81, 82, 83, 86, 87, 88, 89, 96, 97, 98, 99, 103, 110, 111, 116, 117, 118, 122, 123, 124, 126, 127, 128, 130, 131, 132, 133, 135, 139, ou 155.
    12. Anticorpo monoclonal humano isolado que se liga a um epitopo no domínio extracelular de GUCY2c, caracterizado pelo fato de que o epitopo compreende pelo menos um resíduo de aminoácido sele- cionado de resíduos de aminoácido R73, S74, S75, T76, E78, G79, L80, L82, L83, R84 ou I86 de SEQ ID NO: 406.
    13. Anticorpo monoclonal humano isolado de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o epitopo compreende pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis, pelo menos sete, pelo menos oito, pelo menos nove, ou pelo menos dez resíduos de aminoácido selecionados de resí- duos de aminoácido R73, S74, S75, T76, E78, G79, L80, L82, L83, R84 ou I86 de SEQ ID NO: 406.
    14. Anticorpo monoclonal humano isolado de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o epitopo compreende os resíduos de aminoácido R73, S74, S75, T76, E78, G79, L80, L82, L83, R84 ou I86 de SEQ ID NO: 406.
    15. Anticorpo monoclonal humano isolado de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o epitopo compreende aminoácidos tendo uma sequência como mencionado na SEQ ID NO:
    406.
    16. Anticorpo monoclonal humano isolado de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o epitopo é um epitopo funcional.
    17. Anticorpo monoclonal humano isolado de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o anticorpo humano isolado e os contatos de aminoácido de epitopo GUCY2c estão dentro de 3,8 Angstroms como determinado por cristalografia.
    18. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 17, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo biespecífico.
    19. Anticorpo biespecífico que especificamente se liga a GUCY2c e CD3, caracterizado pelo fato de que o anticorpo biespecífico compreende uma primeira cadeia de polipeptídeo e uma segunda ca- deia de polipeptídeo.
    20. Anticorpo biespecífico de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que: a. a primeira cadeia de polipeptídeo compreende, na di- reção de N-terminal para C-terminal: i. um domínio 1, compreendendo uma região VL de um anticorpo GUCY2c (GUCY2c VL), e uma região VH de um anticorpo CD3 (CD3 VH), e ii. um primeiro domínio de promoção de heterodí- mero; e b. a segunda cadeia de polipeptídeo compreende, na di- reção de N-terminal para C-terminal: i. um domínio 2, compreendendo uma região VL de um anticorpo CD3 (CD3 VL), e uma região VH de um anticorpo GUCY2c (GUCY2c VH), e ii. um segundo domínio de promoção de heterodí- mero; em que a VL de GUCY2c e a VH de GUCY2c formam um domínio que especificamente se liga a GUCY2c; e a VL de CD3 e a VH de CD3 formam um domínio que especificamente se liga a CD3.
    21. Anticorpo biespecífico de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que: a. a primeira cadeia de polipeptídeo compreende, na di- reção de N-terminal para C-terminal: i. um domínio 1, compreendendo a CD3 VL, e uma VH de GUCY2c, e ii. um primeiro domínio de promoção de heterodímero;
    e b. a segunda cadeia de polipeptídeo compreende, na di- reção de N-terminal para C-terminal: i. um domínio 2 compreendendo uma VL de GUCY2c, e uma VH de CD3, e ii. um segundo domínio de promoção de heterodímero; em que a VL de GUCY2c e a VH de GUCY2c formam um domínio que especificamente se liga a GUCY2c; e a VL de CD3 e a VH de CD3 formam um domínio que especificamente se liga a CD3.
    22. Anticorpo biespecífico de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que: a. a primeira cadeia de polipeptídeo compreende, na di- reção de N-terminal para C-terminal: i. um domínio 1, compreendendo a GUCY2c VH, e uma VL de CD3, e ii. um primeiro domínio de promoção de heterodí- mero; e b. a segunda cadeia de polipeptídeo compreende, na direção de N-terminal para C-terminal: i. um domínio 2, compreendendo uma VH de CD3, e uma VL de GUCY2c, e ii. um segundo domínio de promoção de heterodí- mero; em que a VL de GUCY2c e a VH de GUCY2c formam um domínio que especificamente se liga a GUCY2c; e a VL de CD3 e a VH de CD3 formam um domínio que especificamente se liga a CD3.
    23. Anticorpo biespecífico de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que: a. a primeira cadeia de polipeptídeo compreende, na di- reção de N-terminal para C-terminal:
    i. um domínio 1, compreendendo uma VH de CD3, e uma VL de GUCY2c, e ii. um primeiro domínio de promoção de heterodí- mero; e b. a segunda cadeia de polipeptídeo compreende, na dire- ção de N-terminal para C-terminal: i. um domínio 2, compreendendo a GUCY2c VH, e uma VL de CD3, e ii. um segundo domínio de promoção de heterodí- mero, em que a VL de GUCY2c e a VH de GUCY2c formam um domínio que especificamente se liga a GUCY2c; e a VL de CD3 e a VH de CD3 formam um domínio que especificamente se liga a CD3.
    24. Anticorpo biespecífico de acordo com qualquer uma das reivindicações 20 a 23, caracterizado pelo fato de que o primeiro domí- nio de promoção de heterodímero e o segundo domínio de promoção de heterodímero cada qual compreende uma região Fc compreendendo um domínio CH2 e um domínio de CH3, em que a sequência de amino- ácido de cada do domínio CH2 e/ou o CH3 compreende pelo menos uma modificação de aminoácido quando comparada à região Fc tipo selvagem, para formar uma protuberância ou a buraco.
    25. Anticorpo biespecífico de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que o primeiro domínio de promoção do he- terodímero e o segundo domínio de promoção do heterodímero não são ambos protuberâncias ou ambos buracos; e/ou em que o primeiro do- mínio de promoção do heterodímero e o segundo domínio de promoção do heterodímero formam uma região Fc de imunoglobulina de IgG.
    26. Anticorpo biespecífico de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que o domínio CH3 do primeiro domínio de promoção do heterodímero compreende mutações Y349C e/ou T366W,
    para formar uma protuberância; e o domínio CH3 do segundo domínio de promoção do heterodímero compreende mutações S354C, T366S, L368A, e/ou Y407V, para formar um buraco, (numeração de acordo com o índice EU).
    27. Anticorpo biespecífico de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que o domínio CH2 do primeiro domínio de promoção do heterodímero e o domínio CH2 do segundo domínio de promoção de heterodímero cada qual compreende mutações L234A, L235A e/ou G237A, (numeração de acordo com o índice EU).
    28. Anticorpo biespecífico de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que o primeiro domínio de promoção do he- terodímero compreende a sequência de SEQ ID NO: 188, para formar uma protuberância; e em que o segundo domínio de promoção do he- terodímero compreende a sequência de SEQ ID NO: 189, para formar um buraco.
    29. Anticorpo biespecífico de acordo com qualquer uma das reivindicações 20 a 28, caracterizado pelo fato de que a VL de GUCY2c e a VH de CD3 estão ligadas por um ligante de glicina-serina; e a VL de CD3 e a VH de GUCY2c estão ligadas por um ligante de glicina-serina.
    30. Anticorpo biespecífico de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fato de que o ligante de glicina-serina é Ligante 1 compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 190.
    31. Anticorpo biespecífico de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fato de que o ligante de glicina-serina é Ligante 2 compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 191.
    32. Anticorpo biespecífico de acordo com qualquer uma das reivindicações 20 a 31, caracterizado pelo fato de que o Domínio 1 é covalentemente ligado ao primeiro domínio de promoção do heterodí- mero por meio de um ligante de cisteína; e Domínio 2 é covalentemente ligado ao segundo domínio de promoção do heterodímero por meio de um ligante de cisteína; em que o ligante de cisteína compreende pelo menos cinco aminoácidos.
    33. Anticorpo biespecífico de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que o ligante de cisteína é Ligante 3 compre- endendo a sequência de SEQ ID NO: 192.
    34. Anticorpo biespecífico de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 a 33, caracterizado pelo fato de que a primeira cadeia de polipeptídeo é covalentemente ligada à segunda cadeia de polipep- tídeo por pelo menos uma ligação de dissulfeto.
    35. Anticorpo biespecífico de acordo com a reivindicação 34, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma ligação de dissulfeto forma-se entre o ligante 3 da primeira cadeia de polipeptídeoe o ligante 3 da segunda cadeia de polipeptídeo.
    36. Anticorpo biespecífico de acordo com a reivindicação 34 ou 35, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma ligação de dis- sulfeto é formada entre o primeiro domínio de promoção do heterodí- mero e o segundo domínio de promoção do heterodímero.
    37. Anticorpo biespecífico de acordo com a reivindicação 35 ou 36, caracterizado pelo fato de que cada ligação de dissulfeto é for- mada ligando dois resíduos de cisteína.
    38. Anticorpo biespecífico de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 37 caracterizado pelo fato de que: a. uma GUCY2c VL CDR1, uma GUCY2c VL CDR2, e uma GUCY2c VL CDR3 de uma VL de GUCY2c compreendendo a se- quência mostrada na SEQ ID NO: 92, 100, 104, 106, 112, 119, 125, 129, 134, 136, 137, 138, 140, 143, 145, 147, 150, 152, 156, 158, 160, 162, 166, 170, 171, 172, 173, 174, ou 175; b. uma CD3 VH CDR1, uma CD3 VH CDR2, e uma CD3 VH CDR3 de uma VH de CD3 compreendendo a sequência mostrada na SEQ ID NOS: 1, 9, ou 273;
    c. uma CD3 VL CDR1, uma CD3 VL CDR2, e uma VL de CD3 CDR3 de uma VL de CD3 compreendendo a sequência mos- trada na SEQ ID NO: 76, 84, 90, 274, 275, ou 276; e/ou d. uma GUCY2c VH CDR1, uma GUCY2c VH CDR2, e uma GUCY2c VH CDR3 de uma VH de GUCY2c compreendendo a se- quência mostrada na SEQ ID NO: 11, 19, 26, 33, 41, 48, 52, 57, 60, 62, 64, 65, 67, 69, 71, ou 73.
    39. Anticorpo biespecífico de acordo com a reivindicação 38, caracterizado pelo fato de que: a. a GUCY2c VL CDR1 compreende a sequência de SEQ ID NO: 93, 101, 105, 107, 113, 120, 148, 153, 163, ou 167; a VL de GUCY2c CDR2 compreende a sequência de SEQ ID NO: 78, 94, 102, 108, 114, 141, 144, 146, 149, 151, 157, 159, 161, 164, ou 168; e a GUCY2c VL CDR3 compreende a sequência de SEQ ID NO: 95, 109, 115, 121, 142, 154, 165, ou 169; b. a CD3 VH CDR1 compreende a sequência de SEQ ID NO: 2, 268, ou 277; a CD3 VH CDR2 compreende a sequência de SEQ ID NO: 3, 10, 269, ou 270; e a VH de CD3 CDR3 compreende a sequência de SEQ ID NO: 4; c. a CD3 VL CDR1 compreende a sequência de SEQ ID NO: 77, 85, 91, 278, 279, ou 280; a CD3 VL CDR2 compreende a se- quência de SEQ ID NO: 78 ou 281; e a VL de CD3 CDR3 compreende a sequência de SEQ ID NO: 79; e d. a GUCY2c VH CDR1 compreende a sequência de SEQ ID NO: 12, 20, 27, 34, 42, 74, 257, 258, 259, 260, ou 261; a GUCY2c VH CDR2 compreende a sequência de SEQ ID NO: 13, 21, 28, 35, 43, 53, 66, 68, 70, 72, 75, 262, 263, 264, 265, 266, ou 267; e a VH de GUCY2c CDR3 compreende a sequência de SEQ ID NO: 14, 22, 29, 36, ou 44.
    40. Anticorpo biespecífico de acordo com a reivindicação 39,
    caracterizado pelo fato de que: a. a GUCY2c VH CDR1 compreende a sequência de SEQ ID NO: 74 ou 259; b. a GUCY2c VH CDR2 compreende a sequência de SEQ ID NO: 75 ou 267; c. a GUCY2c VH CDR3 compreende a sequência de SEQ ID NO: 29; d. a GUCY2c VL CDR1 compreende a sequência de SEQ ID NO: 148; e. GUCY2c VL CDR2 compreende a sequência de SEQ ID NO: 149; e f. a GUCY2c VL CDR3 compreende a sequência de SEQ ID NO: 142.
    41. Anticorpo biespecífico de acordo com a reivindicação 39 ou 40, caracterizado pelo fato de que: a. a CD3 VH CDR1 compreende a sequência de SEQ ID NO: 2 ou 268; b. a CD3 VH CDR2 compreende a sequência de SEQ ID NO: 10 ou 270; c. a CD3 VH CDR3 compreende a sequência de SEQ ID NO: 4; d. a CD3 VL CDR1 compreende a sequência de SEQ ID NO: 91; e. a CD3 VL CDR2 compreende a sequência de SEQ ID NO: 78; e f. a CD3 VL CDR3 compreende a sequência de SEQ ID NO: 79.
    42. Anticorpo biespecífico de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 a 41, caracterizado pelo fato de que: a. a VL de GUCY2c compreende a sequência mostrada na SEQ ID NO: 92, 100, 104, 106, 112, 119, 125, 129, 134, 136, 137, 138, 140, 143, 145, 147, 150, 152, 156, 158, 160, 162, 166, 170, 171, 172, 173, 174, ou 175; b. a VH de CD3 compreende a sequência mostrada na SEQ ID NOS: 1 ou 9; c. a VL de CD3 compreende a sequência mostrada na SEQ ID NO: 76, 84 ou 90; e/ou d. a GUCY2c compreende a sequência mostrada na SEQ ID NO: 11, 19, 26, 33, 41, 48, 52, 57, 60, 62, 64, 65, 67, 69, 71, ou
    73.
    43. Anticorpo biespecífico de acordo com a reivindicação 42, caracterizado pelo fato de que: a. a região VH de GUCY2c compreende a sequência de SEQ ID NO: 73; e b. a região VL de GUCY2c VL compreende a sequência de SEQ ID NO: 147.
    44. Anticorpo biespecífico de acordo com a reivindicação 42, caracterizado pelo fato de que: a. a região VH de CD3 compreende a sequência de SEQ ID NO: 9; e b. a região VL de CD3 compreende a sequência de SEQ ID NO: 90.
    45. Anticorpo biespecífico de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 37 compreendendo: a. uma GUCY2c VL CDR1 compreendendo aminoáci- dos tendo a sequência RASESV-XL1.30-XL1.30a-YG-XL1.30d-SLLQ, b. uma GUCY2c VL CDR2 compreendendo aminoáci- dos tendo a sequência mencionada na SEQ ID NO: 149, c. uma GUCY2c VL CDR3 compreendendo aminoáci- dos tendo a sequência mencionada na SEQ ID NO: 142,
    d. uma GUCY2c VH CDR1 compreendendo aminoáci- dos tendo a sequência GFTFS-XH1.31-XH1.32-WMH, e. uma GUCY2c VH CDR2 compreendendo aminoáci- dos tendo a sequência EIK-XH2.52A-XH2.53-XH2.54-XH2.55-XH2.56-XH2.57- NVHEKFKD, e f. uma GUCY2c VH CDR3 compreendendo aminoáci- dos tendo a sequência T-XH3.96-XH3.97-XH3.98-XH3.99-XH3.100-G-XH3.100B- WF-XH3.100E-XH3.101-V.
    46. Anticorpo biespecífico de acordo com a reivindicação 45, caracterizado pelo fato de que: a. XL1.30 é D, N ou S, b. XL1.30a é Y, W ou I, c. XL1.30d é T, S ou H, d. XH1.31 é S, R, W, Y, A, H, P, Y, T, N, K, D, G ou V, e. XH1.32 é Y, R, L, T, K, P, I, N, M, V ou S, f. XH2.52A é P, T ou V, g. XH2.53 é S, A, L ou R, h. XH2.54 é N, T, R, H, K, M, S, A, Y, T ou I, i. XH2.55 é E, R, K, N, Y, G, L, A, M, S, H, D ou Q, j. XH2.56 é L, W, Y, F, V, I, N ou H, k. XH2.57 é T, M, S, L, N, Q ou V, l. XH3.96 é I, F ou K, m. XH3.97 é T, V, L, I, M, F, Y ou A, n. XH3.98 é T, N, R, G, L ou I, o. XH3.99 é T, K, L, W, A, S, M, P, N ou R, p. XH3.100 é E, G, A, H, S, D, T, R, Q, K, Y, L ou M, q. XH3.100B é Y ou H, r. XH3.100E é F ou L, e s. XH3.101 é D, Y, E ou S.
    47. Anticorpo biespecífico de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 37, 45 ou 46, caracterizado pelo fato de que o anti- corpo liga-se a um epitopo no domínio extracelular de GUCY2c, em que o epitopo compreende pelo menos um resíduo de aminoácido selecio- nado de resíduos de aminoácido R73, S74, S75, T76, E78, G79, L80, L82, L83, R84 ou I86 de SEQ ID NO: 406.
    48. Anticorpo monoclonal humano isolado de acordo com a reivindicação 47, caracterizado pelo fato de que o epitopo compreende pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis, pelo menos sete, pelo menos oito, pelo menos nove, ou pelo menos dez resíduos de aminoácido selecionados de resí- duos de aminoácido R73, S74, S75, T76, E78, G79, L80, L82, L83, R84 ou I86 de SEQ ID NO: 406.
    49. Anticorpo monoclonal humano isolado de acordo com a reivindicação 47, caracterizado pelo fato de que o epitopo compreende os resíduos de aminoácido R73, S74, S75, T76, E78, G79, L80, L82, L83, R84 ou I86 de SEQ ID NO: 406.
    50. Anticorpo monoclonal humano isolado de acordo com a reivindicação 47, caracterizado pelo fato de que o epitopo compreende aminoácidos tendo uma sequência como mencionado na SEQ ID NO:
    406.
    51. Anticorpo monoclonal humano isolado de acordo com a reivindicação 47, caracterizado pelo fato de que o epitopo é um epitopo funcional.
    52. Anticorpo monoclonal humano isolado de acordo com a reivindicação 47, caracterizado pelo fato de que o anticorpo humano isolado e os contatos de aminoácido de epitopo GUCY2c estão dentro de 3,8 Angstroms como determinado por cristalografia.
    53. Anticorpo biespecífico, caracterizado pelo fato de que es- pecificamente se liga a GUCY2c e compete para ligação com o anti- corpo biespecífico de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 52.
    54. Anticorpo biespecífico que especificamente se liga a GUCY2c e CD3, caracterizado pelo fato de que o anticorpo biespecífico compreende uma primeira cadeia de polipeptídeo e uma segunda ca- deia de polipeptídeo, e em que: a. a primeira cadeia de polipeptídeo compreende as se- guintes regiões na seguinte ordem em uma direção do N-terminal para o C-terminal: - uma VL de um anticorpo GUCY2c (GUCY2c VL) (SEQ ID NO: 147) – Ligante 1 (SEQ ID NO: 190) – uma VH de um anticorpo CD3 (CD3 VH) (SEQ ID NO: 9) – Ligante 3 (SEQ ID NO: 192) – um primeiro domínio de promoção do heterodímero (SEQ ID NO: 188); e b. a segunda cadeia de polipeptídeo compreende as se- guintes regiões na seguinte ordem em uma direção do N-terminal para o C-terminal: - uma VL de um anticorpo CD3 (CD3 VL) (SEQ ID NO: 90) – Ligante 2 (SEQ ID NO: 191) – uma VH de um anticorpo GUCY2c (GUCY2c VH) (SEQ ID NO: 73)- Ligante 3 (SEQ ID NO: 192) – um segundo domínio de promoção de heterodímero (SEQ ID NO: 189).
    55. Anticorpo biespecífico de acordo com a reivindicação 54, caracterizado pelo fato de que a VL de GUCY2c e a VH de GUCY2c formam um domínio que especificamente se liga a GUCY2c; e a VL de CD3 e a VH de CD3 formam um domínio que especificamente se liga a CD3; em que Ligante 3 da primeira cadeia de polipeptídeo e o ligante 3 da segunda cadeia de polipeptídeo são covalentemente ligados a um outro por duas ligações de dissulfeto; em que o primeiro domínio de promoção do heterodímero e o segundo domínio de promoção do hete- rodímero cada qual compreende um domínio CH2 e um domínio de
    CH3; em que o domínio CH3 do primeiro domínio de promoção do he- terodímero forma uma protuberância, e o domínio CH3 do segundo do- mínio de promoção do heterodímero forma um buraco; e em que pelo menos uma ligação de dissulfeto é formada entre o domínio CH3 do primeiro domínio de promoção do heterodímero e o domínio CH3 do segundo domínio de promoção do heterodímero.
    56. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 17, ou o anticorpo biespecífico de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 55, caracterizado pelo fato de que também com- preende uma estrutura VH humana ou humanizada, e uma estrutura VL humana ou humanizada.
    57. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 17, ou o anticorpo biespecífico de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 55, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou o anticorpo biespecífico é um anticorpo humanizado.
    58. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 55 a 57, caracterizado pelo fato de que a estrutura VH compreende a sequência de SEQ ID NO: 5, 6, 7, 8, 15, 16, 17, 18, 23, 24, 25, 30, 31, 32, 37, 38, 39, 40, 45, 46, 47, 49, 50, 51, 54, 55, 56, 58, 59, 61, ou 63; e/ou a estrutura VL compreende a sequência de SEQ ID NO: 80, 81, 82, 83, 86, 87, 88, 89, 96, 97, 98, 99, 103, 110, 111, 116, 117, 118, 122, 123, 124, 126, 127, 128, 130, 131, 132, 133, 135, 139, ou 155.
    59. Anticorpo biespecífico que especificamente se liga a GUCY2c e CD3, caracterizado pelo fato de que o anticorpo biespecífico compreende uma primeira cadeia de polipeptídeo e uma segunda ca- deia de polipeptídeo; em que a primeira cadeia de polipeptídeo é produ- zida pelo vetor de expressão com o Número de Acesso ATCC PTA- 124944; e a segunda cadeia de polipeptídeo é produzida pelo vetor de expressão com o Número de Acesso ATCC PTA-124943.
    60. Anticorpo biespecífico capaz de ligação específica a
    GUCY2c e a CD3 compreendendo uma primeira cadeia de polipeptídeo e uma segunda cadeia de polipeptídeo, caracterizado pelo fato de que a primeira cadeia de polipeptídeo compreende a sequência de SEQ ID NO: 216 e a segunda cadeia de polipeptídeo compreende a sequência de SEQ ID NO: 220.
    61. Anticorpo biespecífico de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 a 60, caracterizado pelo fato de que as primeira e se- gunda cadeias de polipeptídeo são covalentemente ligadas entre si por pelo menos uma ligação de dissulfeto.
    62. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 17, ou o anticorpo biespecífico de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 61, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou anticorpo biespecífico: a. se liga ao domínio extracelular de GUCY2c humano; b. demonstra uma meia vida de soro e de tumor extendida entre 30 minutos a 100 dias; e/ou c. demonstra um valor EC50 inferior entre 0,0001 nM e 100 nM na presença de níveis de expressão GUCY2c aumentados ou níveis de densidade de receptor aumentados.
    63. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 17, ou do anti- corpo biespecífico como definido em qualquer uma das reivindicações 18 a 62, e um transportador farmaceuticamente aceitável.
    64. Método de tratamento de um distúrbio associado com GUCY2c em um paciente em necessidade do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao paciente o anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 17, o anticorpo bies- pecífico como definido em qualquer uma das reivindicações 18 a 62, ou a composição farmacêutica como definida na reivindicação 63.
    65. Método de acordo com a reivindicação 64, caracterizado pelo fato de que o distúrbio associado com GUCY2c é câncer.
    66. Método de acordo com a reivindicação 65, caracterizado pelo fato de que o câncer é um câncer de sistema digestivo selecionado do grupo que consiste em esôfago, estômago, intestino delgado, cólon, reto, ânus, fígado, vesícula biliar, apêndice, dutos biliares, e pâncreas.
    67. Método de tratamento de um distúrbio associado com GUCY2c em um paciente em necessidade do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao paciente o anticorpo bies- pecífico como definido em qualquer uma das reivindicações 18 a 62, ou uma composição farmacêutica como definida na reivindicação 63, em que uma resposta de célula T citolítica é ativada.
    68. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 17, anticorpo biespecífico de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 62, ou composição farmacêutica como definida na reivindicação 63, caracterizado pelo fato de que se destina ao uso em terapia.
    69. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 17, ou anticorpo biespecífico de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 62, caracterizado pelo fato de que se destina à fa- bricação de um medicamento para uso em terapia.
    70. Anticorpo ou o anticorpo biespecífico de acordo com a reivindicação 69, caracterizado pelo fato de que a terapia compreende tratamento de um distúrbio associado a GUCY2c.
    71. Anticorpo ou o anticorpo biespecífico de acordo com a reivindicação 70, caracterizado pelo fato de que o distúrbio associado com GUCY2c é câncer.
    72. Anticorpo ou o anticorpo biespecífico de acordo com a reivindicação 71, caracterizado pelo fato de que o câncer é um câncer de sistema digestivo selecionado do grupo que consiste em esôfago,
    estômago, intestino delgado, cólon, reto, ânus, fígado, vesícula biliar, apêndice, dutos biliares, e pâncreas.
    73. Anticorpo biespecífico de acordo com qualquer uma das reivindicações 68 a 72, caracterizado pelo fato de que a terapia ativa uma resposta de célula T citolítica.
    74. Polinucleotídeo, caracterizado pelo fato de que compre- ende uma sequência de nucleotídeo codificando o anticorpo como defi- nido em qualquer uma das reivindicações 1 a 17, ou o anticorpo biespe- cífico como definido em qualquer uma das reivindicações 18 a 62.
    75. Vetor, caracterizado pelo fato de que compreende o po- linucleotídeo como definido na reivindicação 74.
    76. Célula hospedeira, caracterizada pelo fato de que com- preende o vetor como definido na reivindicação 75.
    77. Célula hospedeira de acordo com a reivindicação 76, ca- racterizada pelo fato de que recombinantemente produz o anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 17, ou o anti- corpo biespecífico como definido em qualquer uma das reivindicações 18 a 62.
    78. Célula hospedeira de acordo com a reivindicação 76 ou 77, caracterizada pelo fato de que a célula hospedeira é selecionada do grupo que consiste em linhagens de células bacterianas, linhagens de células mamíferas, linhagens de células de inseto, e linhagens de célu- las de levedura.
    79. Célula hospedeira de acordo com a reivindicação 78, ca- racterizada pelo fato de que a linhagem de célula mamífera é uma linha- gem de célula CHO.
    80. Método para a produção de um anticorpo ou um anti- corpo biespecífico, caracterizado pelo fato de que compreende cultivar a célula hospedeira como definida em qualquer uma das reivindicações 76 a 79, sob condições que resultem na produção do anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 17, ou o anticorpo bi- específico como definido em qualquer uma das reivindicações 18 a 62, e purificar o anticorpo ou o anticorpo biespecífico do sobrenadante de cultura.
    81. Uso do anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 17, o anticorpo biespecífico de como definido em qualquer uma das reivindicações 18 a 62, a composição farmacêutica como definida na reivindicação 63, o polinucleotídeo como definido na reivindicação 74, o vetor como definido na reivindicação 75, ou a célula hospedeira como definida em qualquer uma das reivindicações 76 a 79, caracterizado pelo fato de que é para fabricação de um medicamento para o tratamento de um distúrbio associado a GUCY2c.
    82. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 17, anticorpo biespecífico de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 62, ou composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 63, caracterizado pelo fato de que se destina ao uso no tratamento de um distúrbio associado a GUCY2c.
    83. Anticorpo, anticorpo biespecífico ou a composição farma- cêutica para uso de acordo com a reivindicação 82, caracterizado pelo fato de que o distúrbio associado com GUCY2c é câncer, opcionalmente em que o câncer é um câncer de sistema digestivo selecionado do grupo que consiste em esôfago, estômago, intestino delgado, cólon, reto, ânus, fígado, vesícula biliar, apêndice, dutos biliares, e pâncreas.
    84. Anticorpo, anticorpo biespecífico ou a composição farma- cêutica para uso de acordo com a reivindicação 82 ou 83, caracterizado pelo fato de que o tratamento ativa uma resposta de célula T citolítica.
    85. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 17, anticorpo biespecífico de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 62, composição farmacêutica de acordo com a rei- vindicação 63, polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 74, vetor de acordo com a reivindicação 75, ou célula hospedeira de acordo com qualquer uma das reivindicações 76 a 79, caracterizado pelo fato de que se destina ao uso no tratamento de um distúrbio associado a GUCY2c.
    86. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende o anticorpo biespecífico como definido em qualquer uma das reivindica- ções 18 a 62 e um segundo agente terapêutico.
    87. Método para o tratamento de um câncer em um indivíduo, caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao indivíduo uma terapia de combinação que compreende a composição como defi- nida na reivindicação 86.
    88. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende o anticorpo biespecífico como definido em qualquer uma das reivindica- ções 18 a 62 e um agente antidiarreico.
    89. Método para o tratamento de um câncer em um indivíduo, caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao indivíduo uma terapia de combinação que compreende a composição como defi- nida na reivindicação 88.
    90. Uso da composição como definida na reivindicação 86 ou 88, caracterizado pelo fato de que se destina à fabricação de um medicamento para o tratamento de um distúrbio associado a GUCY2c.
    91. Composição de acordo com a reivindicação 86 ou 88, caracterizada pelo fato de que se destina ao uso no tratamento de um distúrbio associado a GUCY2c.
    92. Composição para uso de acordo com a reivindicação 90 ou 91, caracterizada pelo fato de que o distúrbio associado com GUCY2c é câncer, opcionalmente em que o câncer é um câncer de sis- tema digestivo selecionado do grupo que consiste em esôfago, estô- mago, intestino delgado, cólon, reto, ânus, fígado, vesícula biliar, apên- dice, dutos biliares, e pâncreas.
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