CN1604795B

CN1604795B - 具有提高的活性的组合基序免疫刺激寡肽

Info

Publication number: CN1604795B
Application number: CN028182138A
Authority: CN
Inventors: 阿瑟·M·克里格; 乔格·沃尔默; 欧金·尤尔曼
Original assignee: Coley Pharmaceutical GmbH; University of Iowa Research Foundation UIRF
Current assignee: Coley Pharmaceutical GmbH; University of Iowa Research Foundation UIRF
Priority date: 2001-08-17
Filing date: 2002-08-19
Publication date: 2010-05-26
Anticipated expiration: 2022-08-19
Also published as: ATE411054T1; CA2457485C; JP2005502338A; SI1446162T1; KR100991644B1; SG177000A1; PT1446162E; WO2003015711A2; EA200400319A1; JP2009028051A; NZ552377A; CN1604795A; NZ531194A; WO2003015711A3; EP1446162B1; AU2002331643B2; WO2003015711A9; IL160157A0; IL160157A; DK1446162T3

Abstract

本发明提供了一类具有至少两个功能结构域的免疫刺激核苷酸。这一类组合基序免疫刺激核苷酸可以激活免疫反应，可用于治疗各种免疫相关的疾病，如癌症，传染病，变应性紊乱。该核苷酸也可以激活天然杀伤细胞，并刺激1型干扰素的产生。

Description

具有提高的活性的组合基序免疫刺激寡肽

发明领域

本发明涉及免疫刺激核苷酸，及其组合物，以及使用该免疫刺激核苷酸的方法。

发明背景

已知两类主要的免疫刺激序列，它们具有不同的免疫刺激活性机制。Krieg AM(2001)Trends Microbiol 9：249-52.其中包括所谓的B类CpG寡核苷酸(ODN)，它们是B细胞的强激活剂，以及A类CpG ODN，它们是天然杀伤(NK)细胞的强激活剂。除了这些免疫刺激序列以外，还有至少两类中和序列，包括其CG之前有一个C或者之后有一个G的CpG序列(Krieg AM et al.(1998)Proc Natl Acad Sci USA 95：12631-12636)，以及其中CG被甲基化的DNA序列。中和基序是指当存在其它非刺激性基序的时候具有某种程度的免疫刺激能力，但是当存在其它免疫刺激基序时又降低其它基序的免疫刺激能力的基序。

发明概述

本发明提供了一类新的免疫刺激核酸。在某些实例中这些核酸有一个富含CG的回文结构或者富含CG的中和基序。申请人已经描述过包含中和基序的寡核苷酸(ODN)，该中和基序由CG重复序列例如CGCGCG或一个前面有一个C(即CCG)和/或后面有一个G(即CGG，CCGG)的CG二核苷酸构成。这些中和基序被认为可以减弱含有CpG的ODN对多重识别的刺激效果，例如IL-6，IL-12，IFN-γ，TNΦ-α的分泌以及抗原特异性免疫反应的诱导。Krieg AM et al.(1998)Proc Natl Acad Sci USA95：12631-6。

本发明部分基于申请人发现了包含刺激基序和中和基序的组合的特定ODN具有高的免疫刺激性。本发明还部分基于申请人发现了具有特定的富含CG的回文序列的ODN具有高的免疫刺激性，其中所述回文序列包括含有中和基序的回文序列。因此具有高免疫刺激性的回文序列可能但不必需含有中和基序。

而且，本发明的免疫刺激ODN的免疫刺激效果与两类不同的CpG ODN都相关，其中一类激活B细胞(B类CpG ODN)，另一类激活NK细胞，并诱导干扰素(IFN)-α产生(A类CpGODN)。本发明的新的免疫刺激ODN还具有与A类CpG ODN或B类CpG ODN都不同的广谱免疫刺激效果。本发明的新的免疫刺激ODN被称作C类CpG ODN。更详细的描述如下，在特定的实施方案中，本发明的ODN包括基序组合，其中一个基序是富含CG的回文结构或是中和基序，另一个基序是刺激基序，例如CpG基序或TCGTCG序列。

本发明提供了一种14-100个核苷酸长的免疫刺激核酸。该核酸具有下列通式：5’X₁DCGHX₂ 3’。X₁和X₂独立地是任意0-10个核苷酸长的序列。D是非C的核苷酸。C是胞嘧啶。G是鸟嘌呤。H是非G的核苷酸。该核酸序列还包括选自P和N的核酸序列，所述P和N紧邻X₁的5’端或紧邻X₂的3’端。N是一种起始为CGG三核苷酸并且至少有10个核苷酸长的B细胞中和序列。P是一种包含至少10个核苷酸长的序列的富含GC的回文结构。

在某些实施方案中，该免疫刺激核酸是5’NX₁DCGHX₂ 3’，5’X₁DCGHX₂N 3’，5’PX₁DCGHX₂ 3’，5’X₁DCGHX₂P 3’，5’X₁DCGHX₂PX₃ 3’，5’X₁DCGHPX₃ 3’，5’DCGHX₂PX₃ 3’，5’TCGHX₂PX₃ 3’，或5’DCGHPX₃ 3’。X₃是任意0-10个核苷酸长的序列。在其它一些实施方案中，该免疫刺激核酸是5’DCGHP 3’。

可选择地，D和/或H是胸腺嘧啶(T)。

在其它一些实施方案中H是T，X₂是CG，CGT，CGTT，CGTTT，或CGTTTT。

在其它一些实施方案中H是T，X₂是CG或CGTTTT

在其它一些实施方案中C未被甲基化。

在某些实施方案中N包括至少4个CG二核苷酸和不超过2个CCG三核苷酸。

可选择地，P包括至少一个次黄嘌呤。

该核酸还包括在5’末端或3’末端的poly-T序列。

本发明还提供了具有13-100个核苷酸的免疫刺激核酸。该核酸通式为：5’N₁PyGN₂P 3’。G是鸟嘌呤。

N₁是任意1-6个核苷酸长的序列。在某些实施方案中，N₁至少50％是嘧啶，优选至少50％是T。在其它一些实施方案中，N₁包括至少一个CG基序，至少一个TCG基序，至少一个CI基序，至少一个TCI基序，至少一个IG基序，或者至少一个TIG基序。在其它一些实施方案中N₁是TCGG或TCGH。H是非G的核苷酸。

Py是嘧啶。在某些实施方案中Py是未甲基化的C。

N₂是任意0-30个核苷酸长的序列。在某些实施方案中N₂至少50％是嘧啶或至少50％是T。在其它一些实施方案中N₂不包括任何polyG或polyA基序。

P是富含GC的回文结构，包含至少10个核苷酸长的序列。在某些实施方案中，P完全是回文结构。在其它一些实施方案中，P是有1到3个连续插入核苷酸的回文结构。可选择地，该插入核苷酸可以是TG。在其它一些实施方案中P包括至少3，4或5个C，至少3，4或5个G。在其它一些实施方案中P包括至少一个次黄嘌呤。

在一个实施方案中，富含GC的回文结构的碱基组成中至少有2/3是G和C。在另一个实施方案中，富含GC的回文结构的碱基组成中至少有81％是G和C。在一些实施方案中，富含GC的回文结构有至少12个核苷酸。富含GC的回文结构可以完全由C和G组成。在一些实施方案中，富含GC的回文结构包括至少一个非C也非G的核苷酸。

在一些实施方案中，富含GC的回文结构包括至少一个CGG三聚体，至少一个CCG三聚体，或者至少一个CGCG四聚体。在一些实施方案中，富含GC的回文结构包含至少四个CG二核苷酸。在优选的实施方案中，富含GC的回文结构有一个中心CG二核苷酸。

在一些实施方案中，富含GC的回文结构是CGGCGCGCGCCG(SEQ ID NO：23)，CGGCGGCCGCCG(SEQ ID NO：28)，CGACGATCGTCG(SEQ ID NO：68)或者CGACGTACGTCG(SEQID NO：69)。

在一些实施方案中，富含GC的回文结构不是CGCGCGCGCGCG(SEQ ID NO：29)，GCGCGCGCGCGC(SEQ ID NO：30)，CCCCCCGGGGGG(SEQ ID NO：31)，GGGGGGCCCCCC(SEQID NO：32)，CCCCCGGGGG(SEQ ID NO：33)或GGGGGCCCCC(SEQ ID NO：34)。

在一些实施方案中N₁PyGN₂是选自下组的序列：TTTTTCG，TCG，TTCG，TTTCG，TTTTCG，TCGT，TTCGT，TTTCGT和TCGTCGT。

本发明还提供了13-100个核苷酸长的免疫刺激核酸。所述核酸具有下列通式：5’N₁PyG/IN₂P 3’。G/I指单个核苷酸，其是G或I。G是鸟嘌呤，I是次黄嘌呤。

N₁是任意1-6个核苷酸长的核酸。Py是嘧啶。N₂是任意0-30个核苷酸长的核酸。

P是包含至少10个核苷酸长的序列的回文结构。在一些实施方案中，P是富含GC的回文结构。在另一些实施方案中，P是富含IC的回文结构。

在某些实施方案中N₁PyIN₂是TCITCITTTT(SEQ ID NO：47).

所述的核酸分子可以具有任何类型的骨架组合物。在一些实施方案中该免疫刺激核酸具有完全抗核酸酶的骨架。所述抗核酸酶骨架可以由硫代磷酸酯键组成。在其它一些实施方案中该免疫刺激核酸具有一个完全是磷酸二酯的骨架。在另一些实施方案中，该免疫刺激核酸具有嵌合骨架。在一个实施方案中，所述免疫刺激核酸在CG，CI或IG基序之间至少有一个磷酸二酯键。除此之外，本发明的ODN可以制成微粒，乳剂，或其它能够避免在体内被快速分解的制剂。

所述免疫刺激核酸具有不同的长度。在一些实施方案中，所述免疫刺激核酸是13-100，13-40，13-30，14-100，14-40，或者14-30或者是在其之间的任意整数个核苷酸长。

本发明还包括具有下述序列的免疫刺激核酸：

TCGTCGTTTTCGGCGCGCGCCG(SEQ ID NO：1)，

TCGTCGTTTTCGGCGGCCGCCG(SEQ ID NO：4)，

TCGTCGTTTTCGGCGCGCCGCG(SEQ ID NO：5)，

TCGTCGTTTTCGGCGCCGGCCG(SEQ ID NO：6)，

TCGTCGTTTTCGGCCCGCGCGG(SEQ ID NO：7)，

TCGTCGTTTTCGGCGCGCGCCGTTTTT(SEQ ID NO：12)，

TCCTGACGTTCGGCGCGCGCCG(SEQ ID NO：13)，

TZGTZGTTTTZGGZGZGZGZZG(SEQ ID NO：14)，其中Z是5-甲基胞嘧啶，TCCTGACGTTCGGCGCGCGCCC(SEQ ID NO：19)，

TCGGCGCGCGCCGTCGTCGTTT(SEQ ID NO：11)，

TCCTGACGTTCGGCGCGCGCCC(ODN 2136，SEQ ID NO：19)，

TCGTCGTTTTCGGCGGCCGACG(ODN 5513，SEQ ID NO：64)，

TCGTCGTTTTCGTCGGCCGCCG(ODN 5514，SEQ ID NO：65)，

TCGTCGTTTTCGACGGCCGCCG(ODN 5515，SEQ ID NO：66)，

和TCGTCGTTTTCGGCGGCCGTCG(ODN 5516，SEQ ID NO：67)。

在另一个实施方案中，本发明的免疫刺激核酸具有下述序列：

TCGTCGTTTTCGGCGCGCGCCG(ODN 2395)，

TCGTCGTTTTCGGCGGCCGCCG(ODN 2429)，

TCGTCGTTTTCGGCGCGCCGCG(ODN 2430)，

TCGTCGTTTTCGGCGCCGGCCG(ODN 2431)，

TCGTCGTTTTCGGCCCGCGCGG(ODN 2432)，

TCGTCGTTTTCGGCGCGCGCCGTTTTT(ODN 2452)，

TCCTGACGTTCGGCGCGCGCCG(ODN 5315)，

TZGTZGTTTTZGGZGZGZGZZG(ODN 5327，其中Z是5-甲基胞嘧啶)，TCCTGACGTTCGGCGCGCGCCC(ODN 2136)，

TCGTCGTTTTCGGCGGCCGACG(ODN 5513)，

TCGTCGTTTTCGTCGGCCGCCG(ODN 5514)，

TCGTCGTTTTCGACGGCCGCCG(ODN 5515)，

TCGTCGTTTTCGGCGGCCGTCG(ODN 5516)，

TCGTCGTTTTCGGCGCGCGCCG(ODN 2395)，

TCGTCGTTTTCGGCGGCCGCCG(ODN 2429)，

TCGTCGTTTTCGGCGCGCCGCG(ODN 2430)，

TCGTCGTTTTCGGCGCCGGCCG(ODN 2431)，

TCGTCGTTTTCGGCCCGCGCGG(ODN 2432)，

TCGTCGTTTTCGGCGCGCGCCGTTTTT(ODN 2452)，

TCCTGACGTTCGGCGCGCGCCG(ODN 5315)，

TCGTCGTTTTCGGCGGCCGACG(ODN 5513)，

TCGTCGTTTTCGTCGGCCGCCG(ODN 5514)，

TCGTCGTTTTCGACGGCCGCCG(ODN 5515)，

TCGTCGTTTTCGGCGGCCGTCG(ODN 5516)，

TCGGCGCGCGCCGTCGTCGTTT(ODN 2451)，

TCGTCGTTTCGACGGCCGTCG(ODN 20173，SEQ ID NO：71)，

TCGTCGTTTCGACGATCGTCG(ODN 20176，SEQ ID NO：72)，

TCGTCGTTTCGACGTACGTCG(ODN 20177，SEQ ID NO：73)，

TCGTCGCGACGGCCGTCG(ODN 20178，SEQ ID NO：74)，

TCGTCGCGACGATCGTCG(ODN 20179，SEQ ID NO：75)，

TCGTCGCGACGTACGTCG(ODN 20180，SEQ ID NO：76)，

TCGTTTTTTTCGACGGCCGTCG(ODN 20184，SEQ ID NO：77)，

TCGTTTTTTTCGACGATCGTCG(ODN 20185，SEQ ID NO：78)，和

TCGTTTTTTTCGACGTACGTCG(ODN 20186，SEQ ID NO：79)。

在一些实施方案中，所述免疫刺激核酸包括序列TCGGCGCGCGCCGTCGTCGTTT(ODN 2451，SEQ ID NO：11)。在一些特定的实施方案中所述免疫刺激核酸是TCGGCGCGCGCCGTCGTCGTTT(ODN 2451)。

本发明还包括含有所述免疫刺激核酸和药学可接受的载体的药物组合物。

本发明还包括诱导1型干扰素(IFN)表达的方法。所述方法包括使能表达1型IFN的细胞与有效量的免疫刺激核酸接触以诱导1型IFN的表达。

本发明还包括激活天然杀伤(NK)细胞的方法。所述方法包括使NK细胞与有效量的免疫刺激核酸接触以激活NK细胞。

本发明还包括通过给已感染或有感染危险的患者施用有效量的所述免疫刺激核酸以治疗或预防感染的方法。在一些实施方案中，所述的感染是病毒、细菌、真菌或寄生虫感染。

在一些实施方案中，所述方法包括单独施用本发明的免疫刺激核酸以治疗或预防感染。在某些实施方案中，本发明的方法进一步还包括给患者施用抗生素，所述抗生素可以是抗细菌剂，抗病毒剂，抗真菌剂或抗寄生虫剂。

本发明还包括通过给已发生变态反应或有发生变态反应危险的患者施用有效量的所述免疫刺激核酸以治疗或预防变态反应的方法。在一些实施方案中，所述变态反应是变应性哮喘。在一个实施方案中，所述变态反应是哮喘。在一些实施方案中所述方法包括单独施用本发明的免疫刺激核酸以治疗或预防变态反应。本发明的方法进一步还包括给患者施用哮喘/变态反应药物，例如甾族化合物，抗组胺剂，和前列腺素诱导剂。

本发明还提供了治疗癌症的方法。所述方法包括通过给已患癌症或有患癌症危险的患者施用有效量的所述免疫刺激核酸以治疗或预防癌症的方法。在一些实施方案中，所述癌症选自基底细胞癌，胆道癌；膀胱癌；骨癌；脑癌和CNS癌；乳腺癌；宫颈癌；恶性合体细胞瘤；结肠癌和直肠癌；结缔组织癌；消化系统癌症；子宫内膜癌；食道癌；眼癌；头部和颈部癌症；胃癌；内皮肿瘤；肾癌；喉癌；白血病；肝癌；肺癌(如小细胞肺癌和非小细胞肺癌)；淋巴瘤包括何杰金氏和非何杰金氏淋巴瘤；黑色素瘤；骨髓瘤；成神经细胞瘤；口腔癌(如嘴唇，舌，口和咽)；卵巢癌；胰癌；前列腺癌；成视网膜细胞瘤；横纹肌肉瘤；直肠癌；肾癌；呼吸系统癌症；肉瘤；皮肤癌；胃癌；睾丸癌；甲状腺癌；子宫癌；泌尿系统癌症，以及其它癌和肉瘤。

在一些实施方案中，所述方法包括单独施用本发明的免疫刺激核酸以治疗或预防癌症。在某些实施方案中，本发明的方法进一步还包括给患者施用抗癌药物或治疗，例如使用化疗剂和放射疗法。

本发明的每一个限定都包含不同的实施方案。也就是说本发明包含任一个元素或其组合限定的方案。

附图描述

下述附图仅用于对发明目的进行解释说明，而并非理解和实施本发明所必需的。

图1是人PBMC单独培养，用IL-2或者加入指定量的指定ODN培养24小时以后诱导的IFN-α(pg/ml)的量的柱状图。

图2是人PBMC单独培养，用IL-2或者加入指定量的指定ODN培养24小时以后诱导的MCP-1(pg/ml)的量的柱状图。

图3是人PBMC单独培养，用IL-2或者加入指定量的指定ODN培养24小时以后诱导的IP-10(pg/ml)的量的柱状图。

图4人PBMC是单独培养(N/A)或者加入指定量的指定ODN培养48小时以后诱导的IFN-α(pg/ml)的量的柱状图。

图5是单独培养(N/A)或加入0.25μg/ml(A)或

(B)的指定ODN培养48小时后B细胞表面染色显示的CD86(MFI)的柱状图。

图6是单独培养(N/A)或加入0.25μg/ml(A)或1.0μg/ml(B)的指定ODN培养的72小时B细胞增殖检测(cpm ³H-胸腺嘧啶标记)结果的柱状图。

图7是人PBMC单独培养(N/A)或加入0.25μg/ml(A)或1.0μg/ml(B)的指定ODN培养诱导产生的IL-10(pg/ml)的量的柱状图。

图8是来自两个供体的PBMC(D127，实心柱，D124，空心柱)单独培养(w/o)或加入指定浓度(1或6μg/ml)的指定ODN培养24小时后诱导产生的IFN-α(pg/ml)的量的柱状图。

图9是人PBMC单独培养(w/o)或加入指定浓度(0.4，1.0或10.0μg/ml)的指定ODN培养24小时后以CD86阳性细胞百分比表征的B细胞激活的柱状图。

图10是来自两个供体的PBMC(D141，空心柱，D142，实心柱)单独培养(w/o)或加入指定浓度(1或6μg/ml)的指定ODN培养24小时后诱导产生的IFN-α(pg/ml)的量的柱状图。

图11是来自两个供体的PBMC(D141，空心柱，D142，实心柱)单独培养(w/o)或加入指定浓度(1或6μg/ml)的指定ODN培养24小时后分泌产生的IFN-α(pg/ml)的量的柱状图。

图12是来自两个供体的PBMC(D141，阴影柱，D142，空心柱)单独培养(w/o)或加入6μg/ml的指定ODN培养24小时后分泌产生的IFN-α(pg/ml)的量的柱状图。

图13是PBMC单独培养(w/o)或加入指定浓度(1，3或10μg/ml，分别在A，B，C中表示)的指定ODN培养24小时后分泌产生的IFN-γ(pg/ml)的量的三个柱状图。

图14是单独培养(NA)或加入指定ODN培养48小时后CD3+细胞染色阳性百分率表征的IFN-γ的柱状图。

图15是单独培养(NA)或加入指定ODN培养48小时后T细胞IFN-γ染色的平均荧光密度(MFI)的柱状图。

图16是人PBMC单独培养(N/A)或加入1.0μg/ml的指定ODN培养24小时后分泌产生的IFN-α(pg/ml)的量的柱状图。

图17是人PBMC单独培养(w/o)或加入指定浓度(1或6μg/ml)的指定ODN培养24小时后分泌产生的IFN-α(pg/ml)的量的柱状图。A是两个供体组合的PBMC的结果。B是分别来自两个供体(D141和D142)的PBMC的结果。

图18是单独培养(w/o)或加入指定浓度(0.4或1.0μg/ml)的指定ODN培养24小时后CD86阳性的B细胞百分数的柱状图。

图19是人PBMC单独培养(w/o)，用LPS或用指定浓度(0.2到1.0μg/ml)的指定ODN培养6个小时(A)，24个小时(B)，或48个小时(C)以后的培养上清液中的IFN-γ(pg/ml)浓度的柱状图。

图20是两元混合淋巴细胞反应(MLR)产生的IFN-γ(pg/ml)量的柱状图，其中来自两个供体的淋巴细胞单独培养(w/o)或加入6μg/ml的指定ODN培养24小时后混合。

图21是人PBMC单独培养(w/o)，用LPS或用指定浓度(0.2到1.0μg/ml)的指定ODN培养6个小时(A)，24个小时(B)，或48个小时(C)以后的培养上清液中的IL-10(pg/ml)浓度的柱状图。

图22是PBMC单独培养(n/a)，或加入0.6μg/ml(空心柱)或3.0μg/ml(实心柱)的对照(IL-2，ODN 1585(GGGGTCAACGTTGAGGGGGG，SEQ ID NO：35)和ODN 2118(GGGGTCAAGCTTGAGGGGGG，SEQ ID NO：36))或不同指定ODN培养24小时后上清液中的IP-10(pg/ml)的量的柱状图。

图23是PBMC单独培养(n/a)，或加入0.6μg/ml(A)或3.0μg/ml(B)的对照(IL-2，ODN 1585和ODN 2118)或不同指定ODN培养24小时后上清液中的IFN-α(pg/ml)的量的柱状图。

图24是PBMC单独培养(n/a)，或加入0.6μg/ml(空心柱)或3.0μg/ml(填充柱)的对照(IL-2，ODN 1585和ODN 2118)或不同指定ODN培养24小时后上清液中的IFN-γ(pg/ml)的量的柱状图。

图25是PBMC单独培养(n/a)，或加入0.6μg/ml(空心柱)或3.0μg/ml(填充柱)的对照(IL-2，ODN 1585和ODN 2118)或不同指定ODN培养24小时后上清液中的IL-6(pg/ml)的量的柱状图。

图26是PBMC单独培养(w/o)或加入指定浓度(3.0或6.0μg/ml)的指定ODN培养24小时后分泌的IFN-α(pg/ml)的量的柱状图。

发明详述

现已发现特定的包含至少两个不同基序的寡核苷酸(ODN)具有独特的对免疫系统细胞的刺激作用。其中一些ODN同时具有一个传统的“刺激”CpG序列和一个“富含GC的”或“B细胞中和”基序。这些组合基序核酸具有免疫刺激效果，其效果在两种免疫刺激核酸相关的效果之间，其中一种免疫刺激核酸是能强烈诱导B细胞激活和树突细胞(DC)激活的传统的“B类”CpG ODN，另一种是较晚发现的能强烈诱导IFN-和天然杀伤(NK)细胞的激活，但是诱导B细胞和DC激活的能力较弱的一类免疫刺激核酸(“A类”CpG ODN)。Krieg AM et al.(1995)Nature 374：546-9；Ballas ZK et al.(1996)J Immunol 157：1840-5；Yamamoto S et al.(1992)J Immunol 148：4072-6.优选的B类CpGODN通常具有硫代磷酸酯骨架，优选的A类CpG ODN通常具有混合或嵌合骨架，新的这类组合基序免疫刺激核酸可以具有任何一种稳定的骨架，如硫代磷酸酯，嵌合，或磷酸二酯骨架。

本发明提供了属于这类新的组合基序免疫刺激核酸的免疫刺激核酸。B细胞刺激域由下述通式表示：5’X₁DCGHX₂ 3’。D是非C的核苷酸，C是胞嘧啶。G是鸟嘌呤。H是非G的核苷酸。

X₁和X₂是任意0-10个核苷酸长的核酸。X₁可以包括一个CG，其中优选CG前紧邻着一个T。在一些实施方案中DCG是TCG。X₁优选是0-6个核苷酸长的核酸。在一些实施方案中，X₂不包含任何polyG或polyA基序。在其它一些实施方案中，该免疫刺激核酸的5’端或3’端具有polyT序列。这里所说的“polyA”或“polyT”分别指四个或更多个连续的A或T，如5’AAAA 3’或5’TTTT 3’。

这里所说的“polyG端”指四个或更多个连续的G，如5’GGGG 3’，一般位于核酸的5’端或3’端。这里所说的“polyG核酸”指具有结构式5’X₁X₂GGGX₃X₄ 3’的核酸，其中X₁，X₂，X₃，X₄是核苷酸，优选X₃和X₄中至少有一个是G。

根据此结构式，B细胞刺激域的一些优选方案包括TTTTTCG，TCG，TTCG，TTTCG，TTTTCG，TCGT，TTCGT，TTTCGT，TCGTCGT。

该核酸的第二个基序是P或N，并且紧邻X₁的5’端或X₂的3’端。

N是B细胞中和序列，起始是CGG三核苷酸，并且至少有10个核苷酸长。B细胞中和基序包括至少一个CpG序列，其中CG之前有一个C或者之后有一个G(Krieg AM et al.(1998)ProcNatl Acad Sci USA 95：12631-12636)或者CG包含其中CG的C被甲基化的DNA序列。这里所说的“CpG”指5’胞嘧啶(C)后面有一个3’鸟嘌呤(G)，并且二者以磷酸键相连。至少5’CG 3’中的C是未被甲基化的。中和基序是指当存在其它非刺激性基序的时候具有某种程度的免疫刺激能力，但是当存在其它免疫刺激基序时又降低其它基序的免疫刺激能力的基序。

P是富含GC的回文结构，其包含至少10个核苷酸长的序列。这里所说的“回文结构”等同于“回文序列”，是指一种反向重复序列，即一种类似ABCDEE’D’C’B’A’的序列，其中A和A’，B和B’等都是能够形成通常的Watson-Crick碱基对的碱基。

这里所说的“富含GC的回文结构”指碱基组成中至少有2/3是G和C的回文结构。在一些实施方案中富含GC的结构域优选在“B细胞刺激域”的3’端。在一个10碱基长的富含GC的回文结构中，该回文结构至少含有8个G和C。在一个12碱基长的富含GC的回文结构中，该回文结构也至少含有8个G和C。在一个14碱基长的富含GC的回文结构中，该回文结构至少有10个碱基是G和C。在一些实施方案中，富含GC的回文结构完全由G和C组成。

在一些实施方案中，富含GC的回文结构的碱基组成中至少有81％的G和C。在这样一个10碱基长的富含GC的回文结构中，该回文结构完全由G和C组成。在这样一个12碱基长的富含GC的回文结构中，优选至少有10个碱基(83％)是G和C。在一些优选的实施方案中，一个12碱基长的富含GC的回文结构完全由G和C组成。在一个14碱基的富含GC的回文结构中，至少有12个碱基(86％)是G和C。在一些优选的实施方案中，14碱基长的富含GC的回文结构完全由G和C组成。富含GC的回文结构中的C可以是未甲基化的也可以是甲基化的。

通常这个结构域有至少3个C和G，更优选的是两者都有4个，最优选的是两者都有5个或更多。此结构域中C和G的数目不必相同。优选C和G的分布使得它们能够形成自互补的双链，或者回文结构，例如CCGCGCGG。这种结构可以通过插入A或T而被破坏，但是优选至少保持部分自互补结构，例如基序CGACGTTCGTCG(SEQ ID NO：80)或CGGCGCCGTGCCG(SEQID NO：8)。当不能保持互补的时候，优选非互补碱基是TG。在一个优选的实施方案中，不包括在回文结构中的不超过3个连续碱基，优选不超过2个，最优选只有1个。在一些实施方案中富含GC的回文结构包含至少一个CGG三聚体，至少一个CCG三聚体，或者至少一个CGCG四聚体。在另一个实施方案中，富含GC的回文结构不是CCCCCCGGGGGG(SEQ ID NO：31)或GGGGGGCCCCCC(SEQ ID NO：32)，CCCCCGGGGG(SEQ IDNO：33)或GGGGGCCCCC(SEQ ID NO：34)。

富含GC的区域中至少有一个G可以被次黄嘌呤(I)取代。在一些实施方案中，P包括不止一个I。

在特定的实施方案中，所述免疫刺激核酸具有下述通式：5’NX₁DCGHX₂ 3’，5’X₁DCGHX₂N 3’，5’PX₁DCGHX₂ 3’，5’X₁DCGHX₂P 3’，5’X₁DCGHX₂PX₃ 3’，5’X₁DCGHPX₃ 3’，5’DCGHX₂PX₃ 3’，5’TCGHX₂PX₃ 3’，5’DCGHPX₃ 3’，或者5’DCGHP 3’。

本发明的免疫刺激核酸还可以由下述通式表示：5’N₁PyGN₂P3’。N₁是任意1到6个核苷酸长的序列。Py是嘧啶。G是鸟嘌呤。N₂是任意0到30个核苷酸长的序列。P是富含GC的回文结构，包含至少10个核苷酸长的序列。

N₁和N₂可以包含多于50％的嘧啶，更优选包含多于50％的T。N₁可以包含一个CG，其中优选T在CG之前并紧邻CG。在一些实施方案中N₁PyG是TCG(例如ODN 5376，其中5’端是TCGG)，更优选是TCGN₂，其中N₂不是G。

N₁PyGN₂P可以包含一个或多个次黄嘌呤(I)核苷酸。N1中的C或G可以被次黄嘌呤替换，但是相对于IpG来说更优选CpI。被次黄嘌呤替换后，例如IpG，可以用“半柔性”或嵌合骨架使之达到其最大活性，其中IG或CI之间通过磷酸二酯连接。N₁可以包括至少一个CI，TCI，IG或TIG基序。

在特定的实施方案中，N₁PyGN₂是选自下组的序列：TTTTTCG，TCG，TTCG，TTTCG，TTTTCG，TCGT，TTCGT，TTTCGT和TCGTCGT。

本发明的免疫刺激核酸还可以由下述通式表示：5’N₁PyG/IN₂P 3’。N₁是任意1到6个核苷酸长的序列。Py是嘧啶，G/I是单个核苷酸，可以是G或I。G是鸟嘌呤，I是次黄嘌呤。N₂是任意0到30个核苷酸长的序列。P是富含GC或IC的回文结构，包含至少10个核苷酸长的序列。在一些实施方案中，N₁PyIN₂是TCITCITTTT(SEQ ID NO：47)。

具有上述通式的组合基序免疫刺激核酸的一些非限制性的实例的结构式如下：TCGTCGTTTTCGGCGCGCGCCG(ODN2395)，TCGTCGTTTTCGGCGGCCGCCG(ODN 2429)，

TCGTCGTTTTCGGCGCGCCGCG(ODN 2430)，

TCGTCGTTTTCGGCGCCGGCCG(ODN 2431)，

TCGTCGTTTTCGGCCCGCGCGG(ODN 2432)，

TCGTCGTTTTCGGCGCGCGCCGTTTTT(ODN 2452)，

TCCTGACGTTCGGCGCGCGCCG(ODN 5315)，

TCGTCGTTTTCGGCGGCCGACG(ODN 5513)，

TCGTCGTTTTCGTCGGCCGCCG(ODN 5514)，

TCGTCGTTTTCGACGGCCGCCG(ODN 5515)，

TCGTCGTTTTCGGCGGCCGTCG(ODN 5516)，

TCGGCGCGCGCCGTCGTCGTTT(ODN 2451)，

TCGTCGTTTCGACGGCCGTCG(ODN 20173)，

TCGTCGTTTCGACGATCGTCG(ODN 20176)，

TCGTCGTTTCGACGTACGTCG(ODN 20177)，

TCGTCGCGACGGCCGTCG(ODN 20178)，

TCGTCGCGACGATCGTCG(ODN 20179)，

TCGTCGCGACGTACGTCG(ODN 20180)，

TCGTTTTTTTCGACGGCCGTCG(ODN 20184)，

TCGTTTTTTTCGACGATCGTCG(ODN 20185)，和

TCGTTTTTTTCGACGTACGTCG(ODN 20186)，

TIGTIGTTTTCGGCGGCCGCCG(ODN 5569，SEQ ID NO：63)，和

TCITCITTTTCGGCGGCCGCCG(ODN 5570，SEQ ID NO：70)。

这里所说的“核酸”等同于“寡核苷酸”，都表示与磷酸基团和可互换的有机碱相连的多核苷酸(即由一个糖(如核糖和脱氧核糖)与一个磷酸基团和一个可替换的有机碱相连组成的分子，其中有机碱是取代的嘧啶(如胞嘧啶(C)，胸腺嘧啶(T)，或者尿嘧啶(U))或者取代的嘌呤(如腺嘌呤(A)或鸟嘌呤(G)))。该术语不但表示寡核糖核酸，也表示寡脱氧核糖核酸(ODN)。此术语还包括多核苷(即多核苷酸去掉磷酸)以及任何其它包含聚合物的有机碱。核酸分子可以从现有的核酸来源获得(例如基因组或cDNA)，但优选通过合成(例如通过核酸合成)获得。

术语核酸和寡核苷酸也包括那些有取代和修饰的核酸或者寡核苷酸，例如在碱基和/或糖上进行取代和修饰。例如，核酸的骨架糖在3’端与低分子量的非羟基的有机基团共价结合，在5’端与非磷酸基团的有机基团共价结合。修饰的核酸可以包含2’-O-烷基化核糖基团。除此之外，修饰的核酸还可以用阿拉伯糖替换核糖。因此核酸的骨架组分可以是异质的，其中可以包含任何可能的彼此相连的聚合物单位的组合，例如肽-核酸(具有氨基酸骨架和核酸碱基)。在一些实施方案中，核酸的骨架组分是同质的。核酸还可以包含取代的嘌呤和嘧啶，例如C-5丙炔取代的碱基。Wagner R W et al.(1996)Nat Biotechnol 14：840-4。嘌呤和嘧啶包括但不限于腺嘌呤，胞嘧啶，鸟嘌呤，胸腺嘧啶，5-甲基胞嘧啶，2-氨基嘌呤，2-氨基-6-氯嘌呤，2，6-二氨基嘌呤，次黄嘌呤，以及其它天然和非天然的核酸碱基，取代或未取代的芳香族分子。其它类似修饰是本领域技术人员所熟知的。

与天然RNA和DNA相比，本发明的免疫刺激寡核苷酸含有不同的化学修饰和取代，包括核苷间的磷酸二酯连接，β-D-核糖单位和/或天然核苷碱基(腺嘌呤，鸟嘌呤，胞嘧啶，胸腺嘧啶，尿嘧啶)。化学修饰是本领域技术人员所熟知的，在Uhlmann E etal.(1990)Chem Rev 90：543；“Protocols for Oligonucleotides andAnalogs”Synthesis and Properties&Synthesis and AnalyticalTechniques，S.Agrawal，Ed，Humana Press，Totowa，USA 1993；Crooke ST et al.(1996)Annu Rev Pharmacol Toxicol 36：107-129；和Hunziker J et al.(1995)Mod Synth Methods 7：331-417.中也有描述。与具有同样序列的由天然DNA和RNA组成的寡核苷酸相比，本发明的寡核苷酸可以有一个或多个修饰，每个修饰都在特定的核苷间的磷酸二酯连接和/或特定的β-Δ-核糖单位和/或特定的天然核苷碱基上。

例如，本发明的寡核苷酸可以包含一个或多个修饰，其中每个修饰都独立地选自：

a)将糖磷酸骨架上的糖磷酸单位用其它单位取代，

b)将β-Δ-核糖单位用修饰的糖单位取代，

c)将天然核苷碱基用修饰的核苷碱基取代。

下面是具体的化学修饰的寡核苷酸的示例。

糖磷酸骨架上的糖磷酸单位(即β-Δ-核糖和核苷间的磷酸二酯连接一起形成的糖磷酸单位)(糖磷酸骨架由糖磷酸单位组成)可以被其它单位取代，其中所述的其它单位可以是适于构建“吗啉代衍生物”寡聚物(例如在Stirchak EP et al.(1989)NucleicAcids Res 17：6129-41所描述的)，也就是说，用吗啉代衍生物单位取代；或者适于构建聚酰胺核酸(“PNA”；如在Nielsen PE et al.(1994)Bioconjug Chem 5：3-7中所述的)，也就是说用PNA骨架单位取代，例如用2-氨基乙基甘氨酸取代。

β-核糖单位或β-D-2’-脱氧核糖单位可以用修饰的糖单位取代，其中修饰的糖单位选自β-D-核糖，α-D-2’-脱氧核糖，L-2’-脱氧核糖，2’-F-2’-脱氧核糖，2’-O-(C₁-C₆)烷基-核糖，优选的2’-O-(C₁-C₆)烷基-核糖是2’-O-甲基核糖，2’-O-(C₂-C₆)烯基-核糖，2’-[O-(C₁-C₆)烷基]-O-(C₁-C₆)烷基]-核酸，2’-NH₂-2’-脱氧核糖，β-D-木-呋喃糖，α-阿拉伯呋喃糖，2，4-二脱氧-β-D-赤-己-吡喃糖，和碳环(如Froehler J(1992)Am Chem Soc 114：8320中所述)和/或开链糖类似物(如Vandendriessche et al.(1993)Tetrahedron49：7223)和/或两环糖类似物(如Tarkov M et al.(1993)Helv ChimActa 76：481中所述)。

天然核苷碱基可以被修饰的核苷碱基取代，其中修饰的核苷碱基选自次黄嘌呤，尿嘧啶，二氢尿嘧啶，假尿嘧啶，2-硫尿嘧啶，4-硫尿嘧啶，5-氨基尿嘧啶，5-(C₁-C₆)-烷基尿嘧啶，5-(C₂-C₆)-烯基尿嘧啶，5-(C₂-C₆)-炔基尿嘧啶，5-(羟甲基)尿嘧啶，5-氯尿嘧啶，5-氟尿嘧啶，5-溴尿嘧啶，5-(C₁-C₆)-烷基胞嘧啶，5-(C₂-C₆)-烯基胞嘧啶，5-(C₂-C₆)-炔基胞嘧啶，5-氯胞嘧啶，5-氟胞嘧啶，5-溴胞嘧啶，N²-二甲基鸟嘌呤，2，4-二氨基-嘌呤，8-氮杂嘌呤，取代的7-去氮杂嘌呤，优选7-去氮杂-7-取代的和/或7-去氮杂-8取代的嘌呤或者其它天然核苷碱基的修饰。上述列举只是举例说明而并非限制本发明。

这里所说的“免疫刺激核酸”指核糖核酸或脱氧核糖核酸分子，其衍生物或类似物，它们能够诱导免疫系统的细胞发挥作用。所述免疫系统细胞的作用包括细胞因子和趋化因子的产生，细胞表面标记的表达，抗体的分泌，增殖，或其它对抗原的应答活性或者直接针对抗原或带有抗原的膜结合的靶的活性。

本发明中所用的核酸可以用任何现有技术中熟知的方法合成，例如，β-氰乙基亚磷酰胺方法(Beaucage SL and Caruthers MH(1981)Tetrahedron Lett 22：1859)；和核苷H-膦酸盐方法(Garegget al.(1986)Tetrahedron Lett 27：4051-4；Froehler et al.(1986)NuclAcid Res 14：5399-407；Garegg et al.(1986)Tetrahedron Lett27：4055-8；Gaffney et al.(1988)Tetrahedron Lett 29：2619-22)。这些化学方法可以通过市场上有的各种自动核酸合成仪实现。这些核酸称为合成核酸。除此之外，本发明的核酸还可以用质粒进行大规模生产，(见Sambrook T et al.，”Molecular Cloning：ALaboratory Manual”，Cold Spring Harbor Laboratory Press，NewYork，1989)然后分成小量或整体使用。核酸可以用现有的核酸序列(例如基因组或cDNA)用已知的方法制备，例如用限制性内切酶，核酸外切酶或核酸内切酶。用此方法制备的核酸是分离的核酸。分离的核酸一般是指与其天然状态下相连的物质分开的核酸。例如，分离的核酸可以是从细胞，从细胞核，从线粒体或从染色质中分离出来的。本发明的组合基序核酸包括合成和分离的组合基序核酸。

要能在体内使用，所述组合基序核酸可选择地是相对抗降解的(即是稳定的)。“稳定的核酸分子”指一个核酸分子在体内相对地能抵抗降解(例如核酸外切酶和核酸内切酶的降解)。核酸稳定性可以通过磷酸骨架的修饰实现。优选本发明的稳定核酸具有修饰的骨架。已经证明核酸骨架的修饰可以增强组合基序免疫刺激核酸体内给药时的活性。一些具有硫代磷酸酯键的组合基序免疫刺激核酸具有最大活性，并能保护核酸免受细胞内的核酸外切酶和核酸内切酶的降解。其它一些修饰的核酸包括修饰的磷酸二酯核酸，磷酸二酯和硫代磷酸酯核酸的组合(即嵌合)，甲基膦酸盐，甲基硫代磷酸酯，二硫代磷酸酯，p-乙氧基，及其组合。

修饰的骨架，例如硫代磷酸酯可以用亚磷酰胺或H-膦酸盐方法的自动技术合成。可以制备芳基膦酸盐和烷基膦酸盐，例如如美国专利No.4469863中所述；烷基磷酸三酯(其中带电的氧基团被烷基化，如美国专利No.5,023,243和欧洲专利No.092574中所述)可以利用商业可获得的试剂用自动固相合成方法制备。其它DNA骨架修饰和取代的方法在现有技术中也有描述。UhlmannE and Peyman A(1990)Chem Rev 90：544；Goodchild J(1990)Bioconjugate Chem 1：165。

其它稳定的核酸包括：非离子DNA类似物，例如烷基膦酸盐和芳基膦酸盐(其中带电的膦酸盐中的氧被烷基或芳基取代)，磷酸二酯和烷基磷酸三酯，其中带电的氧基团被烷基化。核酸可以含有二醇，例如三水缩四乙二醇或三水缩六乙二醇，其末端均可以抵抗核酸酶的降解。

在其它一些实施方案中免疫刺激核酸可以具有磷酸二酯或嵌合，例如柔性或半柔性骨架。嵌合骨架包括磷酸二酯键和修饰的骨架连接的组合。嵌合寡核苷酸可以是柔性寡核苷酸或者半柔性寡核苷酸。

柔性寡核苷酸是指具有部分稳定骨架的免疫刺激寡核苷酸，其中磷酸二酯键或者核苷间的类磷酸二酯键只是在至少一个内部嘧啶核苷-鸟嘌呤(YG)二核苷酸的内部或其邻位。所述至少一个内部YG二核苷酸本身有一个磷酸二酯或核苷间的类磷酸二酯键。紧邻着至少一个内部YG二核苷酸的磷酸二酯键或核苷间的类磷酸二酯键可以是在所述至少一个内部YG二核苷酸的5’，3’，或者5’和3’端。优选紧邻着至少一个内部YG二核苷酸的磷酸二酯键或核苷间类磷酸二酯键本身就是内部核苷间连接。因此对于N₁YGN₂序列，YG二核苷酸具有磷酸二酯键或核苷间的类磷酸二酯键，其中N₁和N₂分别彼此独立地是任意的单个核苷酸，除此之外(a)当N₁是内部核苷酸时，N₁和Y通过磷酸二酯键或核苷间的类磷酸二酯键连接，(b)当N₂是内部核苷酸时，G和N₂通过磷酸二酯键或核苷间的类磷酸二酯键连接，或(c)当N₁是内部核苷酸时，N₁和Y通过磷酸二酯键或核苷间的类磷酸二酯键连接，当N₂是内部核苷酸时，G和N₂通过磷酸二酯键或核苷间的类磷酸二酯键连接。

半柔性寡核苷酸是指具有部分稳定骨架的免疫刺激寡核苷酸，其中磷酸二酯键或者核苷间的类磷酸二酯键只是在至少一个内部嘧啶核苷-鸟嘌呤(YG)二核苷酸内。半柔性寡核苷酸比具有完全稳定骨架的免疫刺激寡核苷酸具有更多的优点。例如，半柔性寡核苷酸比相应的完全稳定的免疫刺激寡核苷酸的免疫刺激能力更强。

免疫刺激核酸可以用于诱导患者的免疫反应，或者治疗免疫相关疾病，例如传染病，癌症，和变应性紊乱。这里所说的“患者”是指人或脊椎动物，脊椎动物包括但不限于狗，猫，马，牛，猪，绵羊，山羊，鸡，猴，兔，大鼠，小鼠等。

这里所用的术语“治疗”是指能增强患者对疾病的抵抗力的预防性治疗，或者，换句话说，是减少患者患病可能性或减缓疾病发展的治疗，也指在患者已患病后进行抵抗疾病的治疗，例如，减轻或完全消除疾病或者防止疾病恶化。例如，当治疗传染病时，该术语指能增强患者对于微生物的抵抗力，或者换句话说，降低患者感染微生物传染疾病的可能性的治疗，同样也是指在患者已被感染以后进行抵抗该传染病的治疗，例如减轻或完全消除传染病或者防止传染病恶化。当治疗癌症的时候，该术语指防止或延缓癌症的发展，减轻癌症的症状，和/或抑制或减缓已发生的癌症的发展。

因此，所述核酸可有效发挥预防性作用，诱导有被传染性微生物感染危险的患者或者有患变应性紊乱或癌症危险的患者的免疫能力。这里所说的“有患病危险的患者”指那些有暴露在能引发感染的传染病病原中的危险，暴露在变态反应原中的危险或者发生癌症的危险的患者。例如，有患病危险的患者可以是一个到某地区旅行的患者，所述地区有特定类型的传染物或者变态反应原，也可以是一个由于其生活方式或者医疗程序而和含有传染性微生物的体液相接触的患者，或者任何生活在具有传染源或变态反应原的地区并直接暴露在传染物和变态反应原中的患者。还可能是面临细菌战危险的患者，例如军事人员或者生活在有恐怖袭击的地方的人。有感染危险的患者还包括医疗机构推荐接种特定传染源抗体的一般人群。如果抗原是变态反应原，患者对该抗原有变态反应，并且患者暴露于该抗原中，例如在花粉传播季节，那么该患者就处在暴露于该抗原的危险中。有患癌症危险的患者包括那些具有遗传性的易患病体质的，或者曾经接受过癌症治疗的，以及那些接触致癌物质，例如烟草，石棉，和其它化学毒素或者过量日照以及其它类型的辐射的。所述核酸还可有效用作治疗剂，治疗传染病，癌症和变应性紊乱。

“已感染患者”是指暴露于传染病原，并且体内具有可检出量的急性或慢性的感染病原的患者。该核酸可以单独使用，或者和其它治疗剂例如抗原或抗菌药物联合使用以诱发免疫反应，减少或消除传染病原。方法是给已感染或有感染危险的患者施用本发明的有效量的组合基序免疫刺激核酸以治疗感染。该方法可以用于治疗人或非人脊椎动物患者的病毒，细菌，真菌和寄生虫感染。

这里所用的“感染”与“传染病”同意，指由于患者体内存在外源微生物而引起的疾病。外源微生物可以是病毒，细菌，真菌或者寄生虫。

传染病的实例包括：逆转录病毒科(例如人免疫缺陷病毒，如HIV-1(也称为HTLV-III，LAV或HTLV-III/LAV，或HIV-III；和其它分离物，例如HIV-LP；小核糖核酸病毒科(例如脊髓灰质炎病毒，甲型肝炎病毒；肠道病毒；人柯萨奇病毒，鼻病毒，人肠道孤病毒)；杯状病毒科(例如能引起胃肠炎的病毒)；披膜病毒科(例如马脑炎病毒，风疹病毒)；黄病毒科(例如登革热病毒，脑炎病毒，黄热病病毒)；冠状病毒科(例如冠状病毒)；弹状病毒科(例如水泡性口膜炎病毒，狂犬病病毒)；丝状病毒科(例如埃博拉病毒)；副粘病毒科(例如副流感病毒；腮腺炎病毒，麻疹病毒，呼吸道合胞病毒)；正粘病毒科(例如流感病毒)；布尼亚病毒科(汉坦病毒，布尼亚病毒，静脉病毒和内罗病毒)；沙粒病毒科(出血热病毒)；呼肠孤病毒科(例如呼肠孤病毒，环状病毒和轮状病毒)；双RNA病毒科；嗜肝病毒科(乙型肝炎病毒)；细小病毒科(细小病毒)；乳多空病毒科(乳头瘤病毒，多瘤病毒)；腺病毒科(大部分腺病毒)；疱疹病毒科(单纯疱疹病毒(HSV)1和2，水痘带状疱疹病毒，巨细胞病毒(CMV)，疱疹病毒)；痘病毒科(天花病毒，牛痘病毒，痘病毒)；和虹彩病毒科(例如非洲猪瘟病毒)；和未分类的病毒(例如海绵状脑病的病原体，丁型肝炎的病原体(认为是乙型肝炎病毒的缺陷性卫星病毒)，非甲非乙型肝炎的病原体(分类1是遗传；分类2是外部传染(即丙型肝炎)；诺沃克因子及相关病毒，和星状病毒)。

传染性细菌的实例包括：以色列放线菌，炭疽杆菌，拟杆菌，伯氏疏螺旋菌，沙眼衣原体，产气荚膜梭菌，破伤风梭菌，白喉棒状杆菌，棒状杆菌，产气肠杆菌，肠球菌，猪丹毒丝菌，具核梭杆菌，流感嗜血杆菌，幽门螺杆菌，肺炎克雷伯氏菌，侵肺军团菌，钩端螺旋体，单核细胞增多性李氏菌，分枝杆菌(例如结核分枝杆菌，鸟分枝杆菌，胞内分枝杆菌，堪萨斯分枝杆菌，戈氏分枝杆菌)，淋病耐瑟氏球菌，脑膜炎耐瑟氏球菌，多杀性巴氏杆菌，病原性弯曲杆菌，金黄色葡萄球菌，念珠状链杆菌，链球菌(厌氧性)，链球菌(微小菌落)，无乳链球菌(B族链球菌)，牛链球菌，粪链球菌，肺炎链球菌，化脓链球菌(A族链球菌)，苍白密螺旋体，和纤细密螺旋体。

传染性真菌包括：白假丝酵母，新型串酵母，荚膜组织胞浆菌，粗球孢子菌，和皮炎芽生菌。

其它传染性生物(原生生物)包括疟原虫例如恶性疟原虫，三日疟原虫，卵形疟原虫，和间日疟原虫，和鼠弓形体。血液和/或组织寄生物包括疟原虫，田鼠巴贝虫，分歧巴贝虫，热带利什曼虫，利什曼虫，巴西利什曼虫，杜氏利什曼虫，冈比亚锥虫和罗氏锥虫(非洲昏睡病)，克氏锥虫(恰加斯氏病)，和鼠弓形体。

应当理解，上述病毒，细菌，真菌和其它传染性微生物都是举例而并非限制本发明。其它商业可获得的相关微生物在许多文献中都有描述，例如，参见C.G.A Thomas，Medical Microbiology，Bailliere Tindall，Great Britain 1983，在此引入其全文作为参考。

虽然上述许多微生物都是和人的疾病相关的，但是本发明也可用于治疗非人的脊椎动物。非人的脊椎动物也可以用本发明的免疫刺激核酸来预防和治疗疾病。例如，除了治疗人的传染性疾病以外，本发明的方法还可用于治疗动物的传染病。

人和非人的脊椎动物的传染性病毒包括逆转录酶病毒，RNA病毒和DNA病毒。逆转录酶病毒包括简单逆转录酶病毒和复杂逆转录酶病毒。简单逆转录酶病毒还包括B型逆转录酶病毒，C型逆转录酶病毒，D型逆转录酶病毒的亚组。B型逆转录酶病毒的实例包括鼠乳腺瘤病毒(MMTV)。C型逆转录酶病毒包括亚组C型A组(包括劳氏肉瘤病毒(RSV)，禽白血病病毒(ALV)，和禽类成髓细胞瘤病毒(AMV))和C型B组(包括猫白血病毒(FeLV)，长臂猿白血病毒(GALV)，脾坏死病毒(SNV)，网状内皮组织增生病毒(RV)和猴肉瘤病毒(SSV))。D型逆转录酶病毒包括Mason-Pfizer猴病毒(MPMV)和猿逆转录酶病毒1型(SRV-1)。复杂逆转录酶病毒包括慢病毒，T细胞白血病毒和泡沫病毒的亚组。慢病毒包括HIV-1，也包括HIV-2，SIV，绵羊髓鞘脱落病毒，猫免疫缺陷病毒(FIV)和马传染性贫血病毒(EIAV)。T细胞白血病毒包括HTLV-1，HTLV-II，猿T细胞白血病毒(STLV)，和牛白血病毒(BLV)。泡沫病毒包括人泡沫病毒(HFV)，猿泡沫病毒(SFV)和牛泡沫病毒(BFV)。

其它脊椎动物传染物中的RNA病毒的实例包括但不限于呼肠孤病毒科家族的成员，包括呼肠孤病毒属(哺乳动物和禽逆转录酶病毒的多血清型)，环状病毒属(蓝舌病病毒，eugenangee病毒，克米罗沃病毒，非洲马疫病毒和科罗拉多蜱热病毒)，轮状病毒属(人轮状病毒，内布拉斯加小牛痢疾病毒，猿轮状病毒，牛或羊轮状病毒，禽轮状病毒)；小核糖核酸病毒家族，包括肠病毒属(脊髓灰质炎病毒，柯萨奇病毒A和B，肠细胞病变的人孤生(ECHO)病毒，甲型肝炎病毒，猿肠病毒，鼠脑脊髓炎(ME)病毒，鼠脊髓灰质炎病毒，牛肠病毒，猪肠病毒，心病毒属(脑心肌炎病毒(EMC)，门戈病毒)，鼻病毒属(人鼻病毒，其包含至少113个亚型；其它鼻病毒)，口疮病毒属(口蹄疫病毒(FMDV)；杯状病毒科家族，包括猪水泡疹病毒，san miguel sealion病毒，猫小核糖核酸病毒和诺沃克病毒；披膜病毒科家族，包括病毒属(东方马脑炎病毒，塞姆利基森林病毒，辛德毕斯病毒，基孔肯亚病毒，O′nyong nyong病毒，罗斯河病毒，委内瑞拉马脑炎病毒，西部马脑炎病毒)，黄病毒属(蚊传播的黄热病病毒，登革热病毒，日本脑炎病毒，圣路易斯脑炎病毒，墨累谷脑炎病毒，西尼罗河病毒，kunjin病毒，中欧蜱传播病毒，远东蜱传播病毒，科萨努尔森林病毒，跳跃病病毒，玻瓦桑病毒，鄂木斯克出血热病毒)，风疹病毒属(风疹病毒)，瘟疫病毒属(粘膜病病毒，猪霍乱病毒，边界病病毒)；布尼亚病毒科家族，包括布尼亚病毒属(布尼奥罗及相关病毒，加利福尼亚脑炎族病毒)，静脉病毒属(白蛉热西西里岛病毒，立谷热病毒)，内罗病毒属(克里米亚-刚果出血热病毒，奈洛比绵羊症病毒)，和uukuvirus属(uukuniemi及相关病毒)；正粘病毒科家族，包括流感病毒属(流感病毒A型，有许多种人亚型)；猪流感病毒和禽和马流感病毒；流感B型(有许多种人亚型)，和流感C型(也可能是独立的属)；副粘病毒科家族，包括副粘病毒属(副流感病毒1型，仙台病毒，血细胞吸附病毒，副流感病毒2至5型，新城鸡瘟病毒，腮腺炎病毒)，麻疹病毒(麻疹病毒，亚急性硬化性全脑炎病毒，大瘟热病毒，牛瘟病毒)，肺病毒(呼吸道合胞体病毒(RSV)，牛呼吸道合胞体病毒和肺炎病毒)；弹状病毒科家族，包括水疱病毒属(VSV)，钱迪普拉病毒，flander-shart park病毒)，狂犬病病毒属(狂犬病病毒)，鱼棒状病毒，和两种可能的棒状病毒(马尔堡病毒和埃博拉病毒)；沙粒状病毒科家族，包括淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCM)，tacaribe病毒复合物，和拉沙病毒；冠状病毒科家族，包括传染性支气管炎病毒(IBV)，肝炎病毒，人肠冠状病毒，和猫传染性腹膜炎(猫冠状病毒)。

其它脊椎动物传染物中的DNA病毒的实例包括但不限于痘病毒科家族，包括正痘病毒属(重型天花，类天花，猴痘，牛痘，水牛痘，兔痘，鼠痘)，leporipoxvirus属(粘液瘤，纤维瘤)，禽痘病毒属(禽痘病毒，其它禽痘病毒)，羊痘病毒属(绵羊痘，山羊痘)，猪痘病毒属(猪痘)，副痘病毒属(传染性脓疱皮炎病毒，伪牛痘，丘疹口腔病毒)；虹彩病毒科家族(非洲猪瘟病毒，蛙病毒2和3，鱼淋巴囊肿病毒)；疱疹病毒科家族，包括-疱疹病毒(单纯疱疹1型和2型，水痘带状疱疹，马流产病毒，马疱疹病毒2和3，假狂犬病毒，传染性牛角膜结膜炎病毒，传染性牛鼻气管炎病毒，猫鼻气管炎病毒，传染性喉气管炎病毒)，-疱疹病毒(人细胞巨化病毒和猪猴细胞巨化病毒)；-疱疹病毒(epstein-barr病毒(EBV)，马立克病病毒；疱疹松鼠猴属，疱疹病毒蛛猴属，疱疹病毒棉尾兔属，豚鼠疱疹病毒，lucke tumor病毒)；腺病毒科家族，包括巨大腺病毒属(人A，B，C，D，E亚组和未分组；猿腺病毒(至少23种血清型)，传染性狗肝炎，和牛，猪，羊，蛙以及其它物种的腺病毒，禽腺病毒属(禽腺病毒)；和不可培养的腺病毒；papoviridae家族，包括乳头瘤病毒家族(人乳头瘤病毒，牛乳头瘤病毒，shope兔乳头瘤病毒，和不同物种的不同病原的乳头瘤病毒)，多瘤病毒属(多瘤病毒，猿猴空泡病毒(SV-40)，兔空泡病毒(RKV)，K病毒，BK病毒，JC病毒和其它灵长类多瘤病毒例如淋巴乳头瘤病毒)；细小病毒科家族，包括腺病毒群，细小病毒属(猫瘟病毒，牛细小病毒，犬细小病毒，阿留申貂病病毒等)。最后，DNA病毒还包括不在上述家族内的病毒，例如库鲁病和库贾氏症病毒和慢性传染性神经病病毒(CHINA病毒)。

所述核酸可以和抗菌剂一同给药。这里所说的抗菌剂指天然的，合成的或半合成的，能够杀死或抑制传染性微生物的化合物。本发明的有效的抗菌剂的类型取决于患者感染或可能感染的微生物的类型。抗菌剂包括但不限于抗细菌剂，抗病毒剂，抗真菌剂和抗寄生虫剂。词语“抗传染剂”，“抗细菌剂”，“抗病毒剂”，“抗真菌剂”，“抗寄生虫剂”和“杀寄生虫药”是本领域普通技术人员所熟知的，在标准的医学教科书中也有定义。简单来讲，抗细菌剂可以杀死或抑制细菌，包括抗生素和其它具有相似功能的合成的或天然的化合物。抗生素是低分子量的物质，是细胞如微生物所产生的二级代谢物。通常，抗生物可以扰乱一种或多种细菌特有而宿主细胞没有的功能或结构。抗病毒剂可以从天然来源中分离，也可以合成，它可以有效杀死或抑制病毒。抗真菌剂可用于治疗表皮的真菌感染，也可以治疗机会性和初级系统性真菌感染。抗寄生虫剂可以杀死或抑制寄生虫。

抗细菌剂可以杀死细菌或抑制细菌的生长或功能。抗细菌剂有一大类是抗生素。可有效杀死或抑制多种细菌的抗生素被称为广谱抗生素。其他类型的抗生素的效果主要是针对革兰氏阳性和革兰氏阴性菌。这些抗生素被称为窄谱抗生素。其它针对某一种微生物或疾病，而对其它细菌均没有效果的抗生物被称为限谱抗生素。抗细菌剂有时候也根据它们的基本作用方式进行分类。通常抗细菌剂可是细胞壁的合成抑制剂，细胞膜抑制剂，蛋白质合成抑制剂，核酸合成或功能抑制剂以及综合性抑制剂。

抗病毒剂是可以防止细胞被病毒感染或者防止病毒在细胞内复制的化合物。抗病毒药物比抗细菌药物少的多，这是因为病毒复制的过程与宿主细胞内的DNA复制密切相关，因此非特异性的抗病毒剂一般对宿主都具有毒性。在病毒感染的过程中有几个阶段是抗病毒剂可以阻断或抑制的。这些阶段包括病毒与宿主细胞的连接(免疫球蛋白或连接多肽)，病毒的脱壳(例如金刚胺)，病毒mRNA的合成或翻译(例如干扰素)，病毒RNA或DNA的复制(例如核苷类似物)，新病毒蛋白的成熟(例如蛋白酶抑制剂)，病毒的出芽和释放。

核苷酸类似物是与核苷酸类似的合成化合物，它具有不完全或非正常的脱氧核糖或核糖基团。一旦核苷酸类似物进入到细胞中，它们就会被磷酸化，产生三磷酸形式，与正常核苷酸竞争地与病毒DNA和RNA结合。一旦核苷酸类似物的三磷酸形式插入到发展中的核酸链中，它就会引发与病毒聚合酶的不可逆的结合，从而使核酸链终止。核苷酸类似物包括但不限于无环鸟苷(用于治疗单纯疱疹病毒和水痘带状疱疹病毒)，丙氧鸟苷(用于治疗细胞巨化病毒)，碘苷，三氮唑核苷(用于治疗呼吸道合胞病毒)，双脱氧次黄苷，双脱氧胞苷和齐多夫定(叠氮胸苷)。

抗真菌剂可用于治疗和预防真菌感染。抗真菌剂有时是根据其作用原理分类的。一些抗真菌剂起细胞壁抑制剂的作用，抑制葡萄糖合酶。这样的抗真菌剂包括但不限于basiungin/ECB。其它一些抗真菌剂可破坏膜的完整性。这样的抗真菌剂包括但不限于immidazoles，例如克霉唑，sertaconzole，氟康唑，伊曲康唑，酮康唑，霉康唑，和voriconacole，还有FK463，两性霉素B，BAY38-9502，MK991，帕地霉素，UK292，布替萘酚，和特比萘芬。其它一些抗真菌剂可分解几丁质(例如几丁质酶)或者进行免疫抑制(501乳剂)。

所述免疫刺激核酸可以单独使用也可以与抗癌治疗联合使用以治疗癌症。方法包括给患有癌症或有患癌症危险的患者施用有效量的本发明的组合基序免疫刺激核酸以治疗癌症。

“患有癌症的患者”指体内有可检出的癌症细胞的患者。所述癌症可以是恶性的或是非恶性的癌症。癌症或肿瘤包括但不限于胆道癌；脑癌；乳腺癌；宫颈癌；恶性合体细胞瘤；结肠癌；子宫内膜癌；食道癌；胃癌；上皮内新生瘤；淋巴瘤；肝癌；肺癌(例如小细胞和非小细胞的)；黑色素瘤；成神经细胞瘤；口腔癌；卵巢癌；胰腺癌；前列腺癌；直肠癌；肉瘤；皮肤癌；睾丸癌；甲状腺癌；和肾癌，还包括其它癌症和肿瘤。在一个实施方案中，所述癌症是毛细胞白血病，慢性骨髓性白血病，皮肤T细胞白血病，多发性骨髓瘤，滤泡性淋巴瘤，恶性黑色素瘤，鳞状细胞癌，肾细胞癌，前列腺癌，膀胱状细胞癌或结肠癌。

在群居动物(即猫和狗)中癌症是引起死亡的主要原因之一。一般在狗和猫中诊断出的恶性病症包括但不限于淋巴肉瘤，骨肉瘤，乳房肿瘤，肥大细胞瘤，脑肿瘤，黑色素瘤，腺鳞状上皮癌，良性肺肿瘤，支气管腺体瘤，支气管腺癌，纤维瘤，粘液软骨瘤，肺肉瘤，神经肉瘤，骨瘤，乳头瘤，成视网膜细胞瘤，尤因氏肉瘤，维尔姆斯氏瘤，伯基特氏淋巴瘤，小神经胶质细胞瘤，成神经细胞瘤，破骨细胞瘤，口腔瘤，纤维肉瘤，骨肉瘤和横纹肌肉瘤。其它狗中发生的肿瘤包括生殖鳞状细胞癌，可遗传的性病肿瘤，睾丸肿瘤，精原细胞瘤，塞尔托利细胞瘤，血管外皮细胞瘤，组织细胞瘤，绿色瘤(粒细胞瘤)，角膜乳头瘤，角膜鳞状细胞癌，血管肉瘤，胸膜间皮瘤，基底细胞瘤，胸腺瘤，胃瘤，肾上腺癌，口腔乳头瘤，血管内皮瘤和囊腺瘤。其它猫中发生的肿瘤包括滤泡性淋巴瘤，肠淋巴肉瘤，纤维肉瘤和肺鳞状细胞癌。已知雪貂，一种更普遍的家养宠物可能患胰岛瘤，淋巴瘤，肉瘤，神经瘤，胰岛细胞瘤，胃MALT淋巴瘤和胃腺癌。

所述免疫刺激核酸还可以联合抗癌治疗进行给药。抗癌治疗包括癌症药物，放射疗法和手术疗法。这里所说的“癌症药物”指为治疗癌症的目的给予患者的药物。在此将介绍治疗癌症的不同类型的药物。为方便描述，癌症药物被分为化疗剂，免疫治疗剂，癌疫苗，激素治疗和生物反应调节剂。

将免疫刺激核酸和免疫治疗剂例如单克隆抗体联合使用可以通过多种机制延长生命，这些机制包括抗体依赖的细胞毒性(ADCC)的显著增强，NK细胞的激活和IFN-α水平的提高。ADCC可以通过将免疫刺激核酸与靶细胞特异性抗体联合使用来实现，例如癌细胞特异性抗体。当免疫刺激核酸与抗体联合给药时，可以诱导患者的免疫系统杀死肿瘤细胞。在ADCC过程中有效的抗体包括可与体内细胞相互作用的抗体。许多这种细胞特异性抗体都是本领域已知的，其中一些是商业可获得的。所述核酸与单克隆抗体联合给药时可以减少抗体的用量还达到同样的生物学效果。

本发明中可以使用的其它化疗剂包括氨鲁米特，天冬酰胺酶，白消安，卡波铂，苯丁酸氮芥，盐酸阿糖胞苷，放线菌素，盐酸红比霉素，雌氮芥磷酸钠，依托泊甙(VP16-213)，氟尿苷，氟尿嘧啶(5-FU)，氟他米特，羟基脲(羟基尿素)，异环磷酰胺，干扰素α-2a，α-2b，醋酸亮丙瑞林(LHRH-释放因子类似物)，环己亚硝脲(CCNU)，二氯甲基二乙胺盐酸(氮芥)，巯基嘌呤，巯乙磺酸钠，邻氯苯对氯苯二氯乙烷(o.p’-DDD)，盐酸米托蒽醌，奥曲肽，普卡霉素，盐酸甲基苄肼，链脲霉素，苯氧胺枸橼酸，硫鸟嘌呤，噻替派，硫酸长春碱，安吖啶(mAMSA)，阿扎胞苷，促红细胞生成素，六甲密胺(HMM)，白介素2，丙脒腙(甲基-GAG；甲基乙二醛二脒基腙；MGBG，戊糖苷(2’脱氧柯福霉素)，甲基环己亚硝脲(甲基-CCNU)，替尼泊甙(VM-26)和硫酸长春碱酰胺。

癌疫苗是可以刺激自身免疫系统对癌细胞的反应的药物。现有的疫苗主要是刺激体液免疫系统(即抗体依赖的免疫反应)。其它正在研发的疫苗主要目的是激活细胞调节的免疫系统，包括可以杀死肿瘤细胞的细胞毒性T淋巴细胞。癌疫苗一般可增强癌抗原向抗原呈递细胞(例如巨噬细胞和树突细胞)和/或其它免疫细胞如T细胞，B细胞和NK细胞的呈递。在一些实例中，癌疫苗可以单独使用或和如上面所述的佐剂一起使用。

一些癌细胞是抗原性的，因此能被免疫系统靶定。免疫刺激核酸和癌症药物联合给药，特别是和那些癌症免疫治疗剂，可有效刺激对癌抗原的特异性免疫反应。这里所说的术语“癌抗原”和“肿瘤抗原”可以互换使用，意指肿瘤细胞差异表达的抗原，可以用于靶定癌细胞。癌抗原是可以明显刺激肿瘤特异性免疫反应的抗原。正常细胞中也编码一些这样的抗原，虽然不一定表达。这些抗原可以分为在正常细胞中保持沉默的(即不表达)，只在分化的特定阶段表达的和那些暂时性表达的例如在胚胎期和胎儿期表达的抗原。其它癌抗原由突变的细胞基因编码，例如致癌基因(例如激活的ras致癌基因)，抑制基因(例如突变p53)，由于内部缺失或染色体移动造成的融合蛋白。还有其它一些癌抗原是由病毒基因，例如RNA和DNA肿瘤病毒上携带的基因编码的。“肿瘤相关”抗原在肿瘤细胞和正常细胞中都存在，但是在肿瘤细胞中其数量和形式都不同。这样的抗原的实例包括胚抗原(例如癌胚抗原)，分化抗原(例如T和Tn抗原)和致癌基因产物(例如HER/neu)。

癌抗原，例如那些用于癌疫苗的或者那些用于制备癌症免疫药物的，可以从癌细胞的粗提物中制备，如Cohen PA et al.(1994)Cancer Res 54：1055-8中所述，或者用重组技术部分纯化该抗原，或者根据已知的抗原从头合成。癌抗原可以使用特定抗原的免疫原性部分，或者在一些实例中，整个细胞或肿瘤体也可以作为抗原使用。这样的抗原可以分离得到或者用重组技术制备，或者用本领域已知的其它方法制备。

其它一些疫苗采用在体外直接暴露于癌抗原中的树突细胞的形式，对抗原进行处理，并在存在MHC分子的时候在细胞表面表达癌抗原，并有效地将抗原呈递给其它免疫系统细胞。树突细胞通过抗原呈递，并通过表达模式识别受体在天然和获得性免疫系统之间形成连接，其中所述模式识别受体可以在局部环境中检测如LPS的微生物分子。

组合基序免疫刺激核酸可用于治疗变态反应，包括哮喘。组合基序免疫刺激核酸可以单独使用或者和变态反应/哮喘药物联合使用以治疗变态反应。方法包括给发生变态反应或着有变态反应或哮喘危险的的患者施用有效量的本发明的组合基序免疫刺激核酸以治疗变态反应或哮喘。

这里所说的“变态反应”指获得性的对物质(变态反应原)的超敏性。变态反应包括湿疹，过敏性鼻炎或鼻伤风，枯草热，支气管哮喘，风疹(荨麻疹)和食物过敏，以及其它的遗传性过敏。“发生变态反应的患者”指因对变态反应原的应答而发生变态反应或者具有发生变态反应危险的患者。“变态反应原”是指可以导致易感患者发生变态反应或者哮喘的物质。变态反应原非常多，包括花粉，昆虫毒素，动物鳞屑，灰尘，真菌孢子和药物(例如青霉素)。

天然动物和植物变态反应原包括对下列物种特异性的蛋白：犬(家犬)；表皮螨属(例如粉尘螨)；猫属(家猫)；豚草属(ambrosiaartemiisfolia；黑麦草属(例如多年生黑麦草或多花黑麦草)；柳杉属(日本柳杉)；链格孢属(细链格孢)；桤木属；赤杨属(alnusgultinosa)；桦属(疣枝桦)；栎属(白橡树)；木犀榄属(油橄榄)；艾属(野艾)；车前属(例如鹿角车前)；墙草属(例如parietariaofficinalis或parietaria judaica)；小蠊属(例如德国小蠊)；蜜蜂属(例如apis multiflorum)；柏木属(例如意大利柏木，cupressusarizonica和大果柏)；刺柏属(例如juniperus sabinoides，juniperusvirginiana，欧洲刺柏和雪松)；金钟柏(例如thuya orientalis)；扁柏属(例如日本扁柏)；大蠊属(例如美洲大蠊)；冰草属(例如匍匐冰草)；黑麦属(例如黑麦)；小麦属(例如普通小麦)；鸭茅属(例如鸭茅)；羊茅属(例如牛尾草)；早熟禾属(例如草地早熟禾或加拿大早熟禾)；燕麦属(例如皮燕麦)；holcus(例如白毛茅)；黄花茅属(例如黄花茅)；燕麦草属(例如燕麦草)；剪股颖属(例如小糠草)；梯牧草属(例如梯牧草)；草芦属(例如草芦)；雀稗属(例如百喜草)；高梁属(例如假高梁)和雀麦属(例如无芒雀麦)。

这里所说的“哮喘”指呼吸系统的失调，症状是发炎，呼吸道变窄以及呼吸道对吸入物的反应性增强。哮喘常常但不是只与遗传性过敏或变态反应症状有关。

这里所说的“哮喘/变态反应药物”指可以减轻症状，抑制哮喘或变态反应，或者预防变态反应或哮喘的发生的组合物。治疗哮喘和变态反应的不同类型的药物在Guidelines For TheDiagnosis and Management of Asthma，Expert Panel Report 2，NIHPublication No.97/4051，July 19，1997中有描述，在此引入其全文作为参考。下面将对NIH出版物中描述的药物概要做一介绍。

在大多数实施方案中，哮喘/变态反应药物在某种程度上可有效用于治疗哮喘和变态反应。一些哮喘/变态反应药物优选与免疫刺激核酸联合使用以治疗哮喘。这被称为哮喘药物。哮喘药物包括但不限于PDE-4抑制剂，支气管扩张剂/β-2激动剂，K+通道开启剂，VLA-4拮抗剂，神经激肽拮抗剂，TXA2合成抑制剂，xanthanines，花生四烯酸拮抗剂，5脂肪氧化酶抑制剂，血栓素A2受体拮抗剂，凝血恶烷A2拮抗剂，5-脂肪氧化酶激活蛋白抑制剂，和蛋白酶抑制剂。

其它哮喘/变态反应药物优选与免疫刺激核酸联合使用以治疗变态反应。这被称为变态反应药物。变态反应药物包括但不限于抗组胺，甾族化合物，免疫调节剂，和前列腺素诱导物。抗组胺是可以抵抗肥大细胞或嗜碱细胞释放的组胺的化合物。这些化合物是本领域熟知的，也已普遍应用于变态反应的治疗中。抗组胺包括但不限于氯雷他定，西替利嗪，氯苯丁嗪，ceterizine类似物，非索非那定，特非那定，地洛他定，去甲阿司咪唑，依匹斯汀，依巴斯汀，阿司咪唑，左卡巴斯汀，氮卓斯汀，曲尼司特，特非那定，咪唑斯汀，betatastine，CS560，和HSR609。前列腺素诱导物是可以诱导前列腺活性的化合物。前列腺素通过调节平滑肌的放松发挥作用。前列腺素诱导物包括但不限于S-5751。

甾族化合物包括但不限于倍氯米松，氟替卡松，曲安缩松，布地缩松，皮质类固醇激素和布地缩松。免疫刺激核酸和甾族化合物联合给药特别适于治疗年轻患者(例如儿童)。但至今甾族化合物在儿童中的使用还是收到限制的，这是因为观察到某些甾族化合物的治疗与生长迟缓有关。因此，根据本发明，免疫刺激核酸可以和导致生长迟缓的甾族化合物联合使用，可以达到“少量使用甾族化合物的作用”。这两种药物联合使用可以降低甾族化合物的需要剂量。

免疫调节剂包括但不限于抗炎症药物，白细胞三烯拮抗剂，IL-4突变型，可溶IL-4受体，免疫抑制剂(例如耐受多肽疫苗)，抗IL-4抗体，IL-4拮抗剂，抗IL-5抗体，可溶IL-13受体Fc融合蛋白，抗IL-9抗体，CCR3拮抗剂，CCR5拮抗剂，VLA-4抑制剂，和IgE下调剂。

本发明的免疫刺激核酸可用于诱导1型IFN，即IFN-α和IFN-β。方法是用有效量的本发明的组合基序免疫刺激核酸与能表达1型IFN的细胞接触以诱导1型IFN的表达。目前主要用于生产人IFN-α的细胞是类浆细胞的树突细胞(pDC)。这种细胞在PBMC中的发生率非常少(0.2-0.4％)，其表型是lin阴性(没有CD3，CD14，CD19或CD56)和CD11c阴性，但是是CD4，CD123(IL-3Rα)，和II类主要组织相容性复合物(II类MHC)阳性。Grouard G et al.(1997)J Exp Med 185：1101-11；Rissoan M-C etal.(1999)Science 283：1183-6；Siegal FP et al.(1999)Science284：1835-7；Cella M et al.(1999)Nat Med 5：919-23。测量1型IFN的方法是本领域技术人员所熟知的，包括酶连免疫吸附检测(ELISA)，生物检测，和荧光激活细胞分类术(FACS)。这些检测都可以使用商业可获得的试剂和试剂盒完成。

本发明的免疫刺激核酸可用于激活NK细胞。方法是用有效量的本发明的组合基序免疫刺激核酸与NK细胞接触以激活NK细胞。NK细胞的激活可以是直接激活或是间接激活。间接激活指诱导能继续激活NK细胞的细胞因子和其它因子。NK细胞的激活可以用多种方法来测定，包括溶胞活性的测定，激活标记例如CD69的诱导的测定，以及特定细胞因子的诱导的测定。除了能够自发地杀死特定的肿瘤目标以外，NK细胞还参与ADCC，是产生IFN-γ，IFN-α，GM-CSF和IL-3的细胞。

鼠NK细胞靶定的原型NK敏感细胞是酵母人造染色体(YAC)-1，一种源于莫洛尼氏病毒感染的A株鼠的胸腺瘤。对于人NK细胞，标准的靶细胞是K562，一种来自红白血病血统的细胞系。在微量滴定板中，恒定数目的放射标记的靶细胞(例如⁵¹Cr-标记的K562)单独培育(自发性的)，或者和去垢剂一起培育(最大量的)，或者和可变数目的效应物细胞一起培育(试验组)。效应物对靶细胞的比值称为E∶T比值。通常富集的激活的NK细胞在E∶T比值低于10∶1时有效，而未分离的PBMC或者脾细胞都要求E∶T比值是100∶1或更高。

免疫刺激核酸也可有效作为系统和/或粘膜免疫反应的佐剂。本发明的组合基序免疫刺激核酸可以递送给暴露于抗原中的患者，以增强患者对于该抗原的免疫反应。例如组合基序免疫刺激核酸可有效用作疫苗佐剂。

免疫刺激核酸可以和非核酸佐剂联合给药。非核酸佐剂可以是任何分子或化合物，除了在此所述的可以刺激体液和/或细胞免疫反应的免疫刺激核酸。非核酸佐剂包括有储存效应的佐剂，免疫刺激佐剂，以及具有储存效应并能刺激免疫系统的佐剂。这里所说的非核酸粘膜佐剂是一种非免疫刺激核酸的佐剂，所述免疫刺激核酸当接触与抗原连接的粘膜表面的时候可以在患者中诱导粘膜免疫反应。

本发明的免疫刺激核酸可以与药学可接受的载体一起组成药物组合物。免疫刺激核酸可以直接给予患者，也可以通过核酸递送复合物给药。核酸递送复合物指与一种靶定物(例如一种与靶细胞(例如B细胞表面)有高亲和力和/或能增加靶细胞吸收的分子)相结合(例如离子或共价结合；或者包在胶囊中)的核酸。核酸递送复合物的实例包括与甾醇(例如胆固醇)，脂质(例如阳离子脂质，病毒颗粒或脂质体)，或者靶细胞特异性结合试剂(例如一种能被靶细胞特异性受体识别的键)相结合。优选的复合物应该在体内足够稳定，不会在进入靶细胞之前发生显著的解偶联。但是，该复合物在细胞内在适当条件下应是可解离的，这样使得所述核酸可以以其功能型被释放。

免疫刺激核酸和/或抗原和/或其它治疗剂都可以单独给药(例如它们的盐或用缓冲液)，或者用任意本领域已知的递送载体给药。例如下述的递送载体：Cochleates(Gould-Fogerite et al.，1994，1996)；emulsomes(Vancott et al.，1998，Lowell et al.，1997)；ISCOM(Mowat et al.，1993，Carlsson et al.，1991，Hu et.，1998，Morein et al.，1999)；脂质体(Childers et al.，1999，Michalek et al.，1989，1992，de Haan 1995a，1995b)；微球(Gupta et al.，1998，Joneset al.，1996，Maloy et al.，1994，Moore et al.，1995，O’Hagan et al.，1994，Eldridge et al.，1989)；聚合物(例如羧甲纤维素，壳聚糖)(Hamajima et al.，1998，Jabbal-Gill et al.，1998)；聚合环形物(Wyatt et al.，1998)；蛋白体(Vancott et al.，1998，Lowell et al.，1988，1996，1997)；病毒颗粒(Gluck et al.，1992，Mengiardi et al.，1995，Cryz et al.，1998)；病毒样颗粒(Jianng et al.，1999，Leibi etal.，1998)。其它递送载体是本领域已知的。

粘膜或局部递送的化合物剂量是每次给药大约0.1μg到10mg，具体剂量取决于是每日，每周，每月还是以其它任意的时间间隔给药。更典型的粘膜或局部给药剂量是每次给药大约10μg到5mg，最典型的是大约100μg到1mg，每2-4次给药后之间间隔几天或几周。更典型的，免疫刺激物的剂量是每次给药1μg到10mg，最典型地是10μg到1mg，每天或每周给药。为了诱导抗原特异性免疫反应而进行的胃肠外化合物给药的剂量通常是疫苗佐剂或免疫刺激物的粘膜用有效量的5到10,000倍，更典型的是10到1000倍，最典型的是20到100倍，其中所述化合物与抗原而非治疗剂一起递送。当所述免疫刺激核酸与其它治疗剂或者特殊的递送载体一起给药的时候，为了诱导自发的免疫反应或者增加ADCC或者诱导抗原特异性免疫反应，胃肠外给药所用的化合物剂量通常是每次给药大约0.1μg到10mg，具体的剂量取决于是每日，每周，每月还是以其它任意的时间间隔给药。更典型的胃肠外给药剂量是每次给药大约10μg到5mg，最典型的是大约100μg到1mg，每2-4次给药之间间隔几天或几周。在一些实施方案中，胃肠外给药的剂量是上述典型剂量的5-10,000倍。

这里所述的“有效量”指足以达到其生物学功能所必需的量。例如，治疗感染的有效量的免疫刺激核酸是指治疗感染所必需的量。通过选择不同的活性化合物和加权系数例如药力，相对生物利用率，患者体重，不良副作用的严重程度以及优选的给药方式，可以设计出不引起过量毒性还能够有效治疗特定患者的有效预防或治疗的给药方案。对任何特定的治疗方案来说，有效量都随各种因素例如要治疗的疾病，施用的特定的免疫刺激核酸，抗原，患者体积，或者疾病的严重程度而不同。本领域普通技术人员不需要过度的实验就可以根据经验决定特定免疫刺激核酸和/或抗原和/或其它治疗剂的有效量。

这里所述的任何化合物的治疗有效量都可以根据动物模型来确定。治疗有效量还可以根据CpG寡核苷酸在人中测试(人的临床试验)得到的试验数据，具有类似药物活性的化合物，例如其它粘膜佐剂如LT和其它疫苗抗原的人试验数据，以及粘膜或局部给药的人试验数据确定。胃肠外给药需要更大的剂量。使用的剂量可以根据相对所用化合物的相对生物利用率和药效进行调整。根据上面介绍过的方法和其它本领域熟知的方法调整剂量以达到最大药效是本领域普通技术人员容易做到的。

本发明的组合物可以药学可接受的溶液的方式给药，所述溶液包括药学可接受浓度的盐，缓冲液，防腐剂，相容载体，佐剂，以及可选择地其它治疗成分。

用于治疗的时候有效量的免疫刺激核酸可以以任何可以将核酸输送到期望表面的方式给药，例如粘膜表面，全身组织表面。本发明的药物组合物可以以任何本领域技术人员已知的方法给药。优选的给药方式包括但不限于口服，胃肠外，肌肉内，鼻内，气管内，吸入，眼部，舌下，阴道，和直肠。

进行口服给药时，所述化合物(即免疫刺激核酸，抗原和其它治疗剂)可以通过将活性化合物与本领域熟知的药学可接受的载体混合来配制。这些载体使得本发明的化合物可以制成片剂，丸剂，糖衣丸，胶囊，液体，凝胶，糖浆，淤浆，悬液等，使被治疗的患者可以口服。口服的药物制剂可以加入固体赋形剂，可选择地研磨得到混合物，，处理混合物颗粒，加入适当的助剂，最后制成片剂或糖衣丸芯。适当的赋形剂特别可以是充填物例如糖，包括乳糖，蔗糖，甘露醇，山梨醇；纤维素制剂如玉米淀粉，小麦淀粉，米淀粉，马铃薯淀粉，明胶，黄耆胶，甲基纤维素，羟丙基甲基纤维素，羧甲基纤维素钠，和/或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。如果需要还可以添加分离试剂，例如交连聚乙烯吡咯烷酮，琼脂，或褐藻酸或其盐例如褐藻酸钠。可选择地口服制剂还可以制成盐或者使用缓冲液以中和其酸性，或者也可以不加入任何载体给药。

糖衣丸芯可加上合适的包衣。可以使用浓缩糖溶液，其中可选择地含有阿拉伯树胶，滑石粉，聚乙烯吡咯烷酮，聚羰乙烯凝胶，聚乙二醇，和/或二氧化钛，漆溶液以及适合的有机溶剂或溶剂混合物。片剂或糖衣丸的包衣中可以加入染料或色素以标志不同活性组合物剂量的组合。

可口服的药物制剂包括由明胶制成的推入配合的胶囊，以及由明胶和增塑剂例如甘露醇和山梨醇制成的软密封胶囊。推入配合的胶囊可包含活性成分与充填物例如乳糖，粘合剂例如淀粉，和/或润滑剂例如滑石粉或硬脂酸镁，以及可选择地还包含稳定剂的混合物。在软胶囊中，活性化合物可以溶解或悬于适当的液体例如脂肪油，液体石蜡，或液体聚乙二醇中。另外还可以添加稳定剂。口服给药也可以使用微球。微球在本领域中的意义是明确的。所有口服给药的配方都以各自的适当剂量送服。

在口腔给药中，组合物可以作成传统的片剂或锭剂。

吸入给药时，本发明的化合物可以用气溶胶罐或喷雾器以气溶胶喷射的形式递送，并使用合适的推进剂，例如二氧二氟甲烷，三氯氟甲烷，二氯四氟乙烷，二氧化碳或其它合适的气体。使用压力气溶胶时其使用剂量是通过阀门进行调配。吸入器或吹药器中的胶囊和明胶药桶可含有所述化合物的粉末混合物以及适当的粉末基质例如乳糖或淀粉。

当需要进行全身给药时，所述化合物可以通过注射进行胃肠外给药，例如，快速浓注或连续输注。制剂以单位剂量形式注射，例如，安瓿或多剂量容器，并添加防腐剂。组合物的形式可以是悬液，溶液或油乳剂或水乳剂，还可以含有配方试剂，例如悬浮剂，稳定剂和/或分散剂。

胃肠外给药的药物制剂包括活性化合物的水溶液，除此之外，活性组合物悬液也可制成适当的油质注射悬液。适当的亲脂性溶剂或载体包括脂肪油，例如芝麻油，或合成脂肪酸酯，例如油酸乙酯，或者甘油三酯，或脂质体。注射用水悬液可以含有能增加悬液粘度的物质，例如羧甲基纤维素钠，山梨醇或葡聚糖。可选择地，悬液还可以含有适当的稳定剂或者能增加化合物溶解度的试剂，以制备高浓度的溶液。

另外，活性化合物还可以以粉末形式与适当的载体例如无菌无热源的水混合。

所述化合物也可以制成直肠或阴道用组合物，例如含有传统拴剂主剂如可可脂或其它甘油酯的拴剂或保留灌肠剂。

除了上述制剂以外，所述化合物还可以制成长效制剂。这种长期作用的制剂可以用适当的聚合或疏水材料(例如油乳化剂)或者离子交换树脂配制，或者制成可溶性衍生物如可溶性盐。

所述的药物组合物还可以包含适当的固体或凝胶状载体或赋形剂。这种载体或赋形剂的实例包括但不限于碳酸钙，磷酸钙，各种糖，淀粉，纤维素衍生物，明胶，和聚合物如聚乙二醇。

适当的液体或固体药物制剂可以是可吸入的水溶液或盐溶液，微胶囊，encochleated，包在微金颗粒外，包在脂质体内，喷雾，气溶胶，植入皮肤的药丸，或者干燥凝固在尖锐物体表面并划入皮肤。所述药物组合物还包括颗粒，粉末，片剂，包衣片剂，(微)胶囊，拴剂，淤浆，乳剂，悬液，乳膏，滴剂或缓释活性物质制备物，在制备过程中照例还可以如上所述地加入赋形剂和添加剂和/或助剂，例如崩解剂，粘合剂，涂层剂，溶胀剂，润滑剂，调味剂，甜味剂或增溶剂。所述药物组合物适用于多种药物递送系统。关于药物递送方法的介绍见Langer(1990)Science249：1527-33，通过在此引述将其全文引入本文。

免疫刺激核酸和任选的其它治疗剂和/或抗原可以以其自身(不掺杂质)或其药学可接受的盐给药。当在药物中使用时所述的盐必须是药学可接受的，但是非药学可接受的盐也可以用于制备药学可接受的盐。这样的盐包括但不限于用下列酸制备的盐：盐酸，溴化氢，含硫的酸，含氮的酸，含磷的酸，马来酸，乙酸，水杨酸，p-甲苯磺酸，酒石酸，柠檬酸，甲基磺酸，蚁酸，丙二酸，琥珀酸，萘-2-磺酸，和苯磺酸。这些盐也可制成碱金属或碱土金属的盐，例如羧酸基团的钠，钾或钙盐。

适合的缓冲液包括：乙酸盐缓冲液(1-2％w/v)；柠檬酸盐缓冲液(1-3％w/v)；硼酸盐缓冲液(0.5-2.5％w/v)；和磷酸盐缓冲液(0.8-2％w/v)。适当的防腐剂包括氯下烷铵(0.003-0.03％w/v)；氯丁醇(0.3-0.9％w/v)；对羟基苯甲酸酯类(0.01-0.25％w/v)和硫柳汞(0.004-0.02％w/v)。

本发明的药物组合物包含有效量的免疫刺激核酸和任选的抗原和/或其它治疗剂，并且任选地包括药学可接受的载体。术语“药学可接受的载体”指一种或多种适于给人或其它脊椎动物施用的可配伍的固体或液体充填物，稀释剂或胶囊封装物质。术语“载体”表示天然的或合成的有机或无机成分，活性物质与其混合后会更便于使用。所述药物组合物的成分也可以和本发明的化合物以不发生相互作用的方式相互混合。

患者的治疗取决于化合物的活性，给药的方式，免疫的目的(即预防性的还是治疗性的)，疾病的性质和严重程度，患者的年龄和体重，因此使用的剂量各不相同。给定剂量的给药可以一次性全剂量给药或者多次小剂量给药。特定时间间隔的多次给药方式通常用于促进抗原特异性反应。

其它递送系统包括长效缓释，延时释放或持续释放递送系统。这种系统避免了反复进行化合物给药，对于患者和医师来说都更为便利。许多类型的释放递送系统对本领域技术人员来说都是熟知的并且是容易获得的。包括聚合物基质系统例如聚(丙交酯-乙交酯)，共聚草酸酯，聚巳酸内酯，聚酰胺酯，聚原酸酯，聚羟基丁酸，和聚酐。在美国专利5,075,109中描述了含有药物的前述聚合物的微胶囊。递送系统还可以包括非聚合物系统：脂质，包括甾醇如胆固醇，胆固醇酯和脂肪酸，或中性脂如单，二和三甘油酯；水凝胶释放系统；硅橡胶系统；基于肽的系统；蜡包衣；用传统粘合剂和赋形剂制作的压缩片剂；半融合的植入物等。其实例包括但不限于：(a)侵蚀系统，其中本发明的试剂被包于基质中，如美国专利No.4,452,775，4,675,189和5,736,152中所述；(b)扩散系统，其中活性组分以控制的速度从聚合物中扩散，如美国专利No.3,854,480，5,133,974和5,407,686中所述。除此之外，也可以使用泵送的递送系统，某些这种系统适于植入。

本发明进一步通过实施例进行举例说明，实施例不应被视为对本发明的进一步限定。本申请中所有引用的文献(包括参考文献书目，公布的专利，公开的专利申请，以及共同未决的专利申请)的全文都通过在此引述而合并于本文。

实施例

实施例1.ODN2395是NK细胞和IFN-α 生成的强烈激活剂

我们已经描述了包含中和基序的寡脱氧核苷酸(ODN)，其中所述的中和基序由CG重复序列组成例如CGCGCG或者CG之前有个C和/或CG之后有个G。这些中和基序可以减少ODN对多重识别，例如IL-6，IL-12，IFN-γ，IFN-α的分泌，和对抗原特异性免疫反应的诱导的刺激效果。Krieg AM et al.(1998)ProcNatl Acad Sci USA 95：12631-6。

在许多情况下，寡核苷酸中中和基序和刺激基序的同时存在可预防免疫激活。一种同时包含刺激和中和基序的ODN是ODN2136，其序列是TCCTGACGTTCGGCGCGCGCCC(SEQ IDNO：19)。该ODN的3’端包括一个相对典型的中和基序，CGGCGCGCGCCC(SEQ ID NO：37)，其源于抑制ODN 2010的3’端(GCGGCGGGCGGCGCGCGCCC，SEQ ID NO：38)。令人惊讶的是，ODN 2136具有强烈的诱导NK细胞裂解活性(裂解单位，L.U.)的活性。如表1所示，3g/ml的ODN 2136的活性比标准的B细胞和NK细胞刺激硫代磷酸酯ODN 2006(TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT，SEQ ID NO：39)诱导L.U.的作用还要强烈。更令人惊奇地是，ODN 2006诱导的IFN-α的产量是2396pg/ml，ODN 2136诱导的产量是14278pg/ml(图1)。这说明并不需要避免此中和序列的存在。

表1.人PBL与不同的ODN培育过夜

表1中的ODN序列

1585 GGGGTCAACGTTGAGGGGGG (SEQ ID NO：35)

1758 TCTCCCAGCGTGCGCCAT (SEQ ID NO：40)

1760 ATAATCGACGTTCAAGCAAG (SEQ ID NO：41)

2006 TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT(SEQ ID NO：39)

2118 GGGGTCAAGCTTGAGGGGGG (SEQ ID NO：36)

2136 TCCTGACGTTCGGCGCGCGCCC (SEQ ID NO：19)

2169 TCTATCGACGTTCAAGCAAG (SEQ ID NO：42)

2395 TCGTCGTTTTCGGCGCGCGCCG (SEQ ID NO：1)

2396 TCGTCGTTTTTGTCGTTTTTGTCGTT(SEQ ID NO：43)

2397 TCGTCGTTTTGTCGTTTTTGTCGTTT(SEQ ID NO：44)

2398 TTCGTGTTTTCGTGTTTTCGTCGT (SEQ ID NO：45)

然而，在对此现象的研究过程中，却由ODN 2136的3’端和ODN 2006的5’端组合形成了一种更强的NK激活剂和IFN-α诱导剂。偶然发现可将得到的ODN 2395(TCGTCGTTTTCGGCGCGCGCCG，SEQ ID NO：1)的3’末端的最后一个碱基C变为G。这种单个碱基的变化在ODN 2395的3’末端产生了一个完美的12碱基长的回文结构，在ODN 2136中这个回文结构只有10个碱基长。

表2显示了另一个例子，其中ODN 2395比大部分其它全是硫代磷酸酯骨架的ODN更能诱导NK细胞L.U.。其中ODN 2395比正对照ODN 1585的作用稍弱，其中ODN 1585具有嵌合硫代磷酸酯/磷酸二酯(SOS)骨架。ODN 1585(ggGGTCAACGTTGAgggggG，SEQ ID NO：35)在已公开的PCT申请WO01/22990中已有描述。在本实验中，在0.6μg/ml的低浓度下，ODN 2136并没有诱导L.U.，其无ODN对照的背景是0.03。图2和图3显示了表2中各NK细胞培养物上清中的单核细胞趋化蛋白(MCP)-1和IFN-诱导蛋白(IP)-10的含量。MCP-1是一种连接CCR2并与Th1和Th2型免疫反应相关的趋化因子。IP-10是一种连接CXCR3并与Th1反应相关的CXC趋化因子。Loetscher P et al.(2001)J Biol Chem 276：2986-91。这些数据表明ODN 2395对IP-10生成的诱导能力较强，而诱导MCP-1只是平均水平。

表2.人PBL与不同的ODN培育过夜

表2中的ODN序列

1585 GGGGTCAACGTTGAGGGGGG (SEQ ID NO：35)

2006 TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT (SEQ ID NO：39)

2007 TCGTCGTTGTCGTTTTGTCGTT (SEQ ID NO：46)

2013 TGTCGTTGTCGTTGTCGTTGTCGTT(SEQ ID NO：48)

2102 TCGTCGTTTTGACGTTTTGTCGTT (SEQ ID NO：49)

2103 TCGTCGTTTTGACGTTTTGACGTT (SEQ ID NO：50)

2117 TZGTZGTTTTGTZGTTTTGTZGTT (SEQ ID NO：51)

2118 GGGGTCAAGCTTGAGGGGGG (SEQ ID NO：36)

2133 TCGTCGTTGGTTGTCGTTTTGGTT (SEQ ID NO：17)

2135 ACCATGGACGAGCTGTTTCCCCTC (SEQ ID NO：18)

2136 TCCTGACGTTCGGCGCGCGCCC (SEQ ID NO：19)

2137 TGCTGCTTTTGTGCTTTTGTGCTT (SEQ ID NO：20)

2139 TCGTCGTTTCGTCGTTTTGACGTT (SEQ ID NO：21)

2142 TCGCGTGCGTTTTGTCGTTTTGACGTT (SEQ ID NO：22)

2180 TCGTCGTTTTTTGTCGTTTTTTGTCGTT(SEQ ID NO：52)

2183 TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT (SEQ ID NO：53)

2186 TCGTCGCTGTCTCCGCTTCTTCTTGCC (SEQ ID NO：54)

2395 TCGTCGTTTTCGGCGCGCGCCG (SEQ ID NO：1)

2396 TCGTCGTTTTTGTCGTTTTTGTCGTT (SEQ ID NO：43)

2397 TCGTCGTTTTGTCGTTTTTGTCGTTT (SEQ ID NO：44)

2398 TTCGTGTTTTCGTGTTTTCGTCGT (SEQ ID NO：45)

基于这些数据，我们推测ODN 2395序列是NK细胞和IFN-α生成的强激活剂。

实施例2.与ODN 2395相关的ODN也是 NK细胞和IFN-α生成的强激活剂

设计并合成了ODN 2427-2433(SEQ ID NO：2-8)，用于检测ODN 2395的3’末端的回文结构对于其免疫刺激活性的重要性。表3比较了这些不同ODN激活NK L.U.的能力。从这些数据明显可以看出，浓度为1μg/ml时作用最强的是ODN 2429(TCGTCGTTTTCGGCGGCCGCCG，SEQ ID NO：4)，其诱导NK活性为2.85L.U.。ODN 2006的作用非常小，除了不含CG的对照ODN 2118(GGGGTCAAGCTTGAGGGGGG，SEQ ID NO：36)以外，其它寡核苷酸的作用都比2006强。ODN 2429的效果非常明显，因为它是仅有的具有12个碱基回文序列的ODN，虽然它的回文序列与2395中的回文序列不同。ODN 2430(TCGTCGTTTTCGGCGCGCCGCG，SEQ ID NO：5)与ODN2429类似，是浓度为1μg/ml时作用第二强烈的；但是它的回文序列稍短，有10个碱基长。其余的ODN没有回文序列或者含有的回文序列比较短，其诱导的NK活性也较低。

表3.人PBL与不同的ODN培育过夜

表3中的ODN序列

1585 GGGGTCAACGTTGAGGGGGG (SEQ ID NO：35)

2006 TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT (SEQ ID NO：39)

2118 GGGGTCAAGCTTGAGGGGGG (SEQ ID NO：36)

2395 TCGTCGTTTTCGGCGCGCGCCG (SEQ ID NO：1)

2427 TCGTCGTTTTCGTCGCGCGCCG (SEQ ID NO：2)

2428 TCGTCGTTTTCGTCGCGCGGCG (SEQ ID NO：3)

2429 TCGTCGTTTTCGGCGGCCGCCG (SEQ ID NO：4)

2430 TCGTCGTTTTCGGCGCGCCGCG (SEQ ID NO：5)

2431 TCGTCGTTTTCGGCGCCGGCCG (SEQ ID NO：6)

2432 TCGTCGTTTTCGGCCCGCGCGG (SEQ ID NO：7)

2433 TCGTCGTTTTCCGCCGCCGGGG (SEQ ID NO：8)

图4显示了这些寡核苷酸与正对照SOS ODN 2216(GGGGGACGATCGTCGGGGG，SEQ ID NO：55)，2334(GGGGTCGACGTCGACGTCGAGGGGGGG，SEQ ID NO：56)和2336(GGGGACGACGTCGTGGGGGGG，SEQ ID NO：57)相比诱导IFN-α生成的能力。所有2395相关的ODN诱导IFN-α产生的水平都比ODN 2006高，虽然其诱导水平还在嵌合SOS ODN的诱导水平之下。其诱导IFN-α表达的次序大概与NK L.U.相同，ODN 2395和2429作用最强。

实施例3.对NK细胞和IFN-α表达的强刺激效果与B细胞的效果不相符

如图5A所示，ODN 2395及其相关ODN在浓度为Q.25μg/ml时，在48小时后诱导B细胞表达CD86的能力显著比ODN 2006及其相关的2397差。正如我们之前所观察到的，ODN浓度越高，比如1μg/ml，不同ODN之间的差异越小(图5B)。在同样的实验中，我们还用增殖检测(³H-胸腺嘧啶掺入)测定了B细胞的激活(图6)。而且，在浓度为0.25μg/ml时，ODN 2006和ODN2397(SEQ ID NO：44)的作用是最强的(图6A)。但是当浓度更高时，2395相关的ODN的效果都很相似(图6B)。

实施例4.ODN 2395及其相关ODN诱导 IL-10的能力较弱

我们前面的研究已经表明大部分由CpG诱导的IL-10的产生都来自于B细胞。如图7所示，IL-10表达与B细胞增殖的相关性非常好。而且ODN 2006及其相关ODN 2397在0.25μg/ml的低浓度时作用最强。在这个浓度下，ODN 2395及其相关ODN诱导IL-10生成则较少。

实施例5.免疫刺激效果的浓度依赖性

这里我们使用的寡核苷酸及其衍生物包括ODN 2427-2433(SEQ ID NO：2-8)。这些ODN的数据如图8所示。这再一次证明ODN 2006在浓度为1或6μg/ml时诱导IFN-α生成的能力较弱。但是ODN 2395诱导IFN-α生成的量较多，特别是在浓度为1μg/ml时。我们有时候会观察到ODN在高浓度，例如6μg/ml时，其免疫刺激活性与浓度为1μg/ml时相比有所下降。在图8所示的实验中，ODN 2395在低浓度比高浓度的作用更强，而ODN2429在高浓度的作用更强。与通常的硫代磷酸酯ODN的反向剂量-反应曲线相反，嵌合ODN例如ODN 2336在高浓度时免疫刺激作用增强。图8所示的ODN 2432的免疫刺激效果表明此ODN并没有有效的回文结构。此系统还具有相对较弱的B细胞刺激活性，如图5和图6所示。

实施例6.B细胞刺激和NK刺激和IFN-α 分泌之间的互反关系

图9显示了另一个实验，其中ODN 2395在0.4μg/ml的低浓度下诱导B细胞表达CD86的能力显著比ODN 2006差。其它2395的相关ODN对B细胞的刺激能力稍强一些。有趣的是，B细胞刺激能力降低的次序与前面所观察到的NK刺激的次序相同：ODN 2429，然后是ODN 2430，最弱的B细胞激活剂是2395相关ODN。这表明很有可能2395样ODN的B细胞刺激活性的降低与NK刺激活性和IFN-α分泌活性的获得密切相关。图10和图11显示了ODN 2395和ODN 2429以及ODN 2430对IFN-α的诱导。表4和图12分别是独立的实验，都显示出了ODN 2395和ODN 2429在两个不同的人供体(D141和D142)中对IFN-α分泌的强诱导能力。

表4.ODN 2395变体的IFN-α分泌¹

¹单位是pg/ml，以平均值±标准差的形式表示

表4中的ODN序列

2006 TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT (SEQ ID NO：39)

2336 GGGGACGACGTCGTGGGGGGG (SEQ ID NO：57)

2395 TCGTCGTTTTCGGCGCGCGCCG (SEQ ID NO：1)

2429 TCGTCGTTTTCGGCGGCCGCCG (SEQ ID NO：4)

5293 TCGTCGTTTTCGGCGGCCGCC (SEQ ID NO：58)

5294 TCGTCGTTTTCGGCCGCCGCC (SEQ ID NO：59)

5295 TCGTCGTTTTCGGCCGCCGCCG (SEQ ID NO：60)

5296 TCGTCGTTTTCGCCGCCGCCG (SEQ ID NO：61)

5297 TGCTGCTTTTCGGCGGCCGCCG (SEQ ID NO：62)

实施例7.富含GC区域的特性

令人惊讶地是，ODN 5293-5297都没有强免疫刺激反应。ODN5293包含一个10个碱基的回文结构，但是此回文结构与2395中的不同，将其中心的CG变为GC。但是，这个改变本身并不能解释这种活性的丧失，因为ODN 2429也有这样一个变化。而且，通常12个碱基的回文结构都会有比较高的活性，除非在该回文结构中心有一个CG。然而，ODN 2430也是只有一个10碱基的回文结构，并且其中心是GC二核苷酸。ODN 2430的免疫刺激活性的增加是由于它3’末端含有5个CpG，而ODN 5293只有3个。

ODN 5294只有一个6碱基的回文结构，这可能与其活性较低有关系。ODN 5295同样也没有有效的回文结构。ODN 5296的低活性表明简单的CCG重复不足以获得ODN 2395的免疫刺激效果。ODN 2397在3’端具有完美的12碱基的回文结构，但是5’末端没有CpG基序。由于ODN 5297的12碱基回文结构与ODN2429的相同，可以推断ODN 2429的5’端TCGTCG基序对于其免疫刺激活性是非常重要的。这就是说，如果一个寡核苷酸的一端存在ODN 2429的中和回文结构，那么即使另一端缺少至少一个刺激基序，也足以提供免疫刺激活性。

实施例8.对IFN-γ生成的作用

为了更好地研究这类新的免疫刺激核酸的免疫刺激效果，另外还进行了几组检测。图13显示了这些ODN对于人PBMC上清中IFN-γ生成的作用。这些细胞与表3的实验中所用的细胞相同，不同的是培养物的上清液用于检测IFN-γ水平。图13的C显示了SOS CpG ODN例如ODN 1585可诱导IFN-γ生成，但是没有CpG基序的ODN(例如对照ODN 2118)却不能。图13的A和B显示了ODN 2006诱导IFN-γ生成的能力相对较弱，而ODN2395及其相关ODN的能力较强。

另一组研究是检查这些不同的ODN对于树突细胞的效果。类浆细胞DC(pDC)是ODN 2395及其相关ODN诱导的IFN-α的来源。不同ODN对于骨髓DC(mDC)的效果相对比较类似，所有的ODN都能够诱导部分纯化的mDC激活CD4⁺T细胞产生IFN-γ(图14和图15)。骨髓DC是从白细胞层分离出来的，与GM-CSF(4.4ng/ml)和不同的ODN共培育2天。然后从不同的供体中分离CD4⁺天然T细胞，以选定的效应物对靶细胞(E∶T)比值与DC混合，然后培育6天或更长时间。然后进行细胞染色并用荧光激活细胞分类术(FACS)进行分析。结果用IFN-γ染色阳性细胞的百分比表示，图15显示了这些T细胞中IFN-γ染色的平均荧光密度(MFI)。

实施例9.不是所有的富含GC的回文结构都是有效的

为了更好地研究这种新的ODN的结构需求，我们合成了另外一些ODN。由于我们认为能有效进行免疫刺激的ODN具有富含GC的回文结构，因此合成了ODN 2449(TCGTCGTTTTCGGGGGGCCCCC，SEQ ID NO：9)和2450(TCGTCGTTTTCCCCCCGGGGGG，SEQ ID NO：10)，它们具有富含GC的回文结构，该回文结构是连续的G后面跟连续的C，或者连续的C后面跟连续的G。如图16所示，这些ODN都无法诱导IFN-γ生成。

实施例10.免疫刺激序列和中和基序的取向的效果

我们合成了ODN 2451(TCGGCGCGCGCCGTCGTCGTTT，SEQ ID NO：11)用于检测“刺激”TCGTCG基序和“中和”CGGCGCGCGCCG(SEQ ID NO：23)回文结构的5’和3’方向是否可以逆转，同时也不失去其免疫刺激活性。ODN 2451确实具有很高的刺激性(图16)。我们合成了ODN 2452(TCGTCGTTTTCGGCGCGCGCCGTTTTT，SEQ ID NO：12)用于确定是否能在CGGCGCGCGCCG(SEQ ID NO：23)回文结构的3’端加入其它序列而不减弱其免疫刺激活性，在其5’端具有刺激TCGTCG基序。该ODN也具有高的免疫刺激性(图16)。

实施例11.ODN 2395的变体及其对IFN-α的诱导。

为了研究这种新的ODN诱导IFN-α分泌的结构需求，我们合成了ODN 2395的变体并验证其免疫刺激活性。表5总结了IFN-α诱导实验的数据。

表5.ODN 2395的变体及其对IFN-α的诱导^1，2

ODN	SEQ IDNO：	序列	回文结构	描述	IFN-α诱导
ODN	SEQ IDNO：	序列	回文结构	描述	IFN-α诱导	2006	39	tcgtcgttttgtcgttttgtcgtt	/	B类ODN	-
2336	57	ggGGACGACGTCCTGgggggG	+	A类ODN	+++++	2006	39	tcgtcgttttgtcgttttgtcgtt	/	B类ODN	-
2336	57	ggGGACGACGTCCTGgggggG	+	A类ODN	+++++	2395	1	tcgtcgttttcggcgcgcgccg	+	2006-2136	++
2427	2	tcgtcgttttcgtcgcgcgccg	-		-	2395	1	tcgtcgttttcggcgcgcgccg	+	2006-2136	++
2427	2	tcgtcgttttcgtcgcgcgccg	-		-	2428	3	tcgtcgttttcgtcgcgcggcg	-		-
2429	4	tcgtcgttttcggcg<u>gc</u>cgccg	+	保留回文结构但将cg变为gc	+++	2428	3	tcgtcgttttcgtcgcgcggcg	-		-
2429	4	tcgtcgttttcggcg<u>gc</u>cgccg	+	保留回文结构但将cg变为gc	+++	2430	5	tcgtcgttttcggcgcgc<u>cg</u>cg	-		+
2431	6	tcgtcgttttcggcgcgcc<u>gc</u>g	-		+/-	2430	5	tcgtcgttttcggcgcgc<u>cg</u>cg	-		+
2431	6	tcgtcgttttcggcgcgcc<u>gc</u>g	-		+/-	2432	7	tcgtcgttttcggcccg<u>cg</u>cgg	-		+
2433	8	tcgtcgttttccgc<u>cg</u>cc<u>ggg</u>g	-		-	2432	7	tcgtcgttttcggcccg<u>cg</u>cgg	-		+
2433	8	tcgtcgttttccgc<u>cg</u>cc<u>ggg</u>g	-		-	5293	58	tcgtcgttttcggcg<u>gc</u>cgcc	(+)	2429 w/o3’g	-
5294	59	tcgtcgttttcggccgccgcc	-	3xgcc w/o3’g	-	5293	58	tcgtcgttttcggcg<u>gc</u>cgcc	(+)	2429 w/o3’g	-
5294	59	tcgtcgttttcggccgccgcc	-	3xgcc w/o3’g	-	5295	60	tcgtcgttttcggccgc<u>cgc</u>cg	-	5295w/3’g	-

ODN	SEQ IDNO：	序列	回文结构	描述	IFN-α诱导
ODN	SEQ IDNO：	序列	回文结构	描述	IFN-α诱导	5296	61	tcgtcgttttcgccgc<u>cgc</u>cg	-		-
5297	62	tgct<u>gc</u>ttttcggcg<u>gc</u>cgccg	+	2429中的gc	-	5296	61	tcgtcgttttcgccgc<u>cgc</u>cg	-		-
5297	62	tgct<u>gc</u>ttttcggcg<u>gc</u>cgccg	+	2429中的gc	-	5327	14	tgctzgttttzggzgzgzgzzg	+	2395 w/甲基c(z)	+
5328	15	tgctgcttttcggcgcgcgccg	+	2395的gc		5327	14	tgctzgttttzggzgzgzgzzg	+	2395 w/甲基c(z)	+
5328	15	tgctgcttttcggcgcgcgccg	+	2395的gc		2136	19	tcctgacgttcggcgcgcgccc	(+)		+/-
5315	13	tcctgacgttcggcgcgcgccg	+	2136 w/3’g更长的回文结构	+？	2136	19	tcctgacgttcggcgcgcgccc	(+)		+/-
5315	13	tcctgacgttcggcgcgcgccg	+	2136 w/3’g更长的回文结构	+？	5329	16	tcgtcgttttcgcgcgcgcgcg	+	2006+1631	(-)

¹下划线是不同于2395的核苷酸；回文结构以斜体表示。

²除了ODN 2336具有嵌合骨架(大写字母表示磷酸二酯键，小写字母表示硫代磷酸酯键)之外，所有的ODN都完全是硫代磷酸酯骨架。

从用硫代磷酸酯ODN 2395和2427-2433进行的第一组实验可以看出，ODN的3’端的回文序列在诱导树突细胞分泌IFN-α上起着重要的作用，其中树突细胞是IFN-α的主要生产者(见2395和2429)，虽然一些在3’端没有回文结构的ODN(例如ODN2430和ODN 2432)有时候在较低浓度下也能诱导IFN-α(见图17A)。ODN 2395和ODN 2429诱导IFN-的量最多，而2006(B类ODN)不诱导或者诱导量最少，ODN 2336(A类ODN)诱导的量较多。大部分实验都证明ODN 2429诱导这种细胞因子的量更多(图17B)。引入TCG基序(例如ODN 2427和ODN 2428)对IFN-α的分泌具有负效果。根据这些数据和对ODN 2186的其它研究，3’末端的gcc似乎也可能起到某种作用。

因此，我们检验了另一组都在3’端具有GCC的ODN。这些ODN均不能诱导IFN-α。因此在回文结构中只有GCC似乎并不足以产生预期效果。

除此之外，5’末端具有TGC的ODN 5297也不能诱导IFN-α，尽管它具有回文结构的3’序列。这结果表明对于这些ODN的活性来说，不只是3’回文序列而且5’的TCG基序也起重要的作用。

用ODN 5328(2395加上5’端的TGC基序)也证明了这一点。与A类ODN的甲基化相比，至少5’基序的甲基化减少了，但没有完全破坏IFN-的分泌。这个发现与B类ODN的结果一致。尽管如此，具有部分3’端回文结构但是5’端序列只有一个CpG二核苷酸(ODN 2136)的ODN也能诱导IFN-α。在先前对此ODN和具有完全3’回文结构的ODN(ODN 5315)的研究结果中，ODN 5315比ODN 2136的活性强，但是不如ODN 2395。

ODN 5329虽然在3’端具有完全的CG回文结构，但是却不能诱导IFN-α或者诱导量很低，这表明对IFN-α活性来说存在优选的特定回文序列。

实施例12.B细胞激活和IFN-α诱导之间的互反关系

在实施例11中还用一些ODN做了B细胞激活实验(图18)。结果表明ODN诱导IFN-α的活性越高，激活B细胞的活性就越低(特别比较了ODN 2006，2336，2395和2429)。然而也证明所有这些ODN在刺激B细胞方面都比2336(A类ODN)活性高。

实施例13.对IFN-γ分泌的效果

我们还将不同浓度的ODN与PBMC共培育不同的时间以检测IFN-γ分泌(图19A-C)。这些ODN诱导IFN-γ分泌的次序是2336＞2395，2429＞2006。但是在以IFN-α做为示值时这些ODN之间的差异并不明显。

实施例14.对MLR中IFN-γ的效果

我们还检测了在混合淋巴细胞反应(MLR)中这些ODN诱导IFN-γ的效果。在这组实验中，来自一个供体的淋巴细胞可对来自另一个供体的细胞表达的抗原发生反应。结果证明ODN2006，2336和2395在这样一个抗原特异性反应中都能够增强IFN-γ分泌(图20)。这表明所有这些ODN都能增强对特定抗原的反应性。

实施例15.ODN 2395比ODN 2006诱导的IL-10少

另一组实验是检测促炎细胞因子IL-10的诱导。与前面IFN-的实验一样，PBMC与不同浓度的ODN共培育不同的时间(图21A-C)。结果表明，ODN 2006诱导的IL-10量较多，相比之下ODN 2336诱导的量最少或较低。而ODN 2395和ODN 2429比ODN 2336诱导IL-10的量多，但是比ODN 2006的少。这再一次证明了这一类新的免疫刺激ODN具有免疫刺激活性，这种活性介于A类和B类ODN之间。

实施例16.ODN 2395比ODN 2006诱导TNF-α的量少，但是比ODN 8954多

人PBMC与1.6μg/ml ODN 2006，8954，2395，2429，或LPS共培育6小时，然后收集上清，用特异性ELISA检测TNF-α。结果如表6所示。

表6.不同类的代表性ODN对TNF-α的诱导

ODN	TNF-α，pg/ml
ODN	TNF-α，pg/ml	(LPS)	＞120
2006	40	(LPS)	＞120
2006	40	2429	35
2395	21	2429	35
2395	21	8954	14
无	16	8954	14

实验表明在PBMC与这些ODN共培育的实验组中检测不出细胞因子IL-5和IL-15。

实施例17.IP-10的诱导

人PBMC单独培养，或者加入IL-2，或者加入10μg/ml的对照ODN 1585或对照ODN 2118，或者加入0.6或

的各种ODN培养。24小时后收集上清，用特异酶联免疫吸附检测(ELISA)测定IP-10。结果如图22所示。的ODN 2395，2429，2430，2432和2451，的ODN 2452都能够诱导大量IP-10。

实施例18.IFN-α的诱导

人PBMC单独培养，或者加入IL-2，或者加入10μg/ml的对照ODN 1585或对照ODN 2118，或者加入0.6或的各种ODN培养。24小时后收集上清，用特异ELISA测定IFN-α。结果如图23A(ODN浓度为)和图23B(ODN浓度为3.0μg/ml)所示。

的ODN 2395，2427，2429，2430，2431，2432和2451，

的ODN 2452都能够诱导大量IFN-α。

实施例19.IFN-γ的诱导

的各种ODN培养。24小时后收集上清，用特异ELISA测定IFN-γ。结果如图24所示。的ODN 2395，2427，2429，2430，2431，2432，2451和2452，的ODN 2352都能够诱导大量IFN-γ。

实施例20.IL-6的诱导

人PBMC单独培养，或者加入IL-2，或者加入10μg/ml的对照ODN 1585或对照ODN 2118，或者加入0.6或3.0μg/ml的各种ODN培养。24小时后收集上清，用特异ELISA测定IL-6。结果如图25所示。0.6μg/ml的ODN 2395，2430，2432，2433，2136，2449，2450，2451和2452，3.0μg/ml的ODN 2449和ODN2451都能够诱导大量IL-6。

实施例21.IFN-α的诱导

人PBMC单独培养，或者加入3.0或

的各种ODN培养。ODN包括2006，8954，2395，2449，2450，2451，2452，5373(CGGCGCGCGCCG，SEQ ID NO：23)，5374(CGGCGCGCGCCGCGGCGCGCGCCG，SEQ ID NO：24)，5375(CGGCGCGCGCCGTCGTCGTTT，SEQ ID NO：25)，5376(TCGGCGCGCGCCGTGCTGCTTT，SEQ ID NO：26)和5377(CCGCCGTTTTCGGCGCGCGCCG，SEQ ID NO：27)。24小时后收集上清，用特异ELISA测定IFN-α。结果如图26所示。ODN 2395，2451，2452和5376都能够诱导IFN-α。

实施例22.ODN 5515和ODN 5516对IFN-α的诱导

得自两个供体(D346和D240)的人PBMC单独培养，或加入0.8，2.4或6.0μg/ml的ODN 2006，ODN 5515或ODN 5516培养。24小时后收集上清，用特异ELISA测定IFN-α。结果如表7所示。ODN 5515和ODN 5516比ODN 2006更能有效诱导IFN-α，特别是在ODN浓度为2.4和6.0μg/ml的时候。

实施例23.ODN 20184，20185和20186对IFN-α的诱导

得自三个供体(D445，D446和D448)的人PBMC单独培养，或加入0.05，0.1，0.2，0.5或的ODN 2006，ODN 20184，ODN 20185或ODN 20186培养。24小时后收集上清，用特异ELISA测定IFN-α。结果如表8所示。ODN 20184，ODN 20185或ODN 20186比ODN 2006更能有效诱导IFN-α，特别是在浓度为0.2-0.5μg/ml的时候。

表7.ODN 5515和ODN 5516对IFN-α的诱导(pg/ml)

ODN	浓度μg/ml	D346平均值±标准差	D240平均值±标准差
ODN	浓度μg/ml	D346平均值±标准差	D240平均值±标准差	2006	0.82.46	18.5±13.80±02.7±0	36±3.319.7±6.42.8±0
5515	0.82.46	34.1±6.936.6±2.139.2±26.5	16.5±2.8106.7±17.3127.3±7.7	2006	0.82.46	18.5±13.80±02.7±0	36±3.319.7±6.42.8±0
5515	0.82.46	34.1±6.936.6±2.139.2±26.5	16.5±2.8106.7±17.3127.3±7.7	5516	0.82.46	4.3±031.9±026.6±19	22.3±0.1172.5±82.390.4±15.4
无		0±0	20.9±6.5	5516	0.82.46	4.3±031.9±026.6±19	22.3±0.1172.5±82.390.4±15.4

表8.ODN 20184，20185和20186对IFN-α的诱导(pg/ml)

ODN	浓度μg/ml	D445平均值±标准差	D446平均值±标准差	D448平均值±标准差
ODN	浓度μg/ml	D445平均值±标准差	D446平均值±标准差	D448平均值±标准差	2006	0.050.10.20.51.0	5.2±0.027.7±14.454.9±17.661.1±14.626.4±15.5	58.8±1.9283.5±16.1503.7±9.7227.8±12.7142.6±23.1	0.9±0.023.5±3.839.1±5.049.8±0.448.7±29.8
20184	0.050.10.20.51.0	25.6±2.132.9±7.3256.2±8.2757.2±5.7194.3±5.7	88.0±12.2691.2±32.32155.1±35.12171.8±95.91181.9±15.1	0.0±0.0129.1±24.8314.0±22.2268.7±15.95.8±3.4	2006	0.050.10.20.51.0	5.2±0.027.7±14.454.9±17.661.1±14.626.4±15.5	58.8±1.9283.5±16.1503.7±9.7227.8±12.7142.6±23.1	0.9±0.023.5±3.839.1±5.049.8±0.448.7±29.8
20184	0.050.10.20.51.0	25.6±2.132.9±7.3256.2±8.2757.2±5.7194.3±5.7	88.0±12.2691.2±32.32155.1±35.12171.8±95.91181.9±15.1	0.0±0.0129.1±24.8314.0±22.2268.7±15.95.8±3.4	20185	0.050.10.20.51.0	65.0±10.863.6±1.379.3±2.4281.3±0.2176.9±12.5	217.9±28.4467.4±23.71420.5±83.71965.7±72.31710.3±19.7	54.3±14.2150.9±5.9160.2±5.5162.4±3.8181.1±0.1
20186	0.050.10.20.51.0	21.9±1.758.3±7.6153.6±1.5267.7±7.9153.0±0.3	223.1±1.2812.2±28.11302.5±56.21744.1±54.71113.6±6.4	79.8±1.6111.3±6.8193.5±10.5227.4±6.913.7±15.4	20185	0.050.10.20.51.0	65.0±10.863.6±1.379.3±2.4281.3±0.2176.9±12.5	217.9±28.4467.4±23.71420.5±83.71965.7±72.31710.3±19.7	54.3±14.2150.9±5.9160.2±5.5162.4±3.8181.1±0.1
20186	0.050.10.20.51.0	21.9±1.758.3±7.6153.6±1.5267.7±7.9153.0±0.3	223.1±1.2812.2±28.11302.5±56.21744.1±54.71113.6±6.4	79.8±1.6111.3±6.8193.5±10.5227.4±6.913.7±15.4	培养基	----	0.0±0.00.0±0.0	12.8±2.045.3±12.9	64.8±32.736.4±2.6

实施例24.ODN 8954，5569，和5570对IFN-α的诱导

得自三个供体(D521，D525和D526)的人PBMC单独培养，或加入0.03，0.06，0.125，0.25或的ODN 2006(SEQ IDNO：39)，ODN 8954，ODN 5569(TIGTIGTTTTCGGCGGCCGCCGSEQ ID NO：63)或ODN 5570(TCITCITTTTCGGCGGCCGCCGSEQ ID NO：70)培养。24小时后收集上清，用特异ELISA测定IFN-α和IL-10。结果如表9和表10所示。

表9.ODN 8954，5569，和5570对IFN-α的诱导(pg/ml)

ODN	浓度μg/ml	D521平均值±标准差	D525平均值±标准差	D526平均值±标准差
ODN	浓度μg/ml	D521平均值±标准差	D525平均值±标准差	D526平均值±标准差	2006	0.030.060.1250.251.0	238.6742405.633826.532248.94362.74	239.286385.161549.612532.67161.892	216.393126.51686.17374.49357.087
8954	0.030.060.1250.251.0	305.6266039.517322.457651.137078.59	309.5812028.524669.314641.14679.59	599.9714707.015340.215324.555474.94	2006	0.030.060.1250.251.0	238.6742405.633826.532248.94362.74	239.286385.161549.612532.67161.892	216.393126.51686.17374.49357.087
8954	0.030.060.1250.251.0	305.6266039.517322.457651.137078.59	309.5812028.524669.314641.14679.59	599.9714707.015340.215324.555474.94	5569	0.030.060.1250.251.0	112.784110.723104.547111.7552247.97	121.42265.75349.36562.383115.77	87.75147.88841.04643.2161101.58
5570	0.030.060.1250.251.0	822.6481858.163470.675612.536798.3	427.5351021.181657.33369.993501.59	250.196218.201477.938669.7062560.93	5569	0.030.060.1250.251.0	112.784110.723104.547111.7552247.97	121.42265.75349.36562.383115.77	87.75147.88841.04643.2161101.58
5570	0.030.060.1250.251.0	822.6481858.163470.675612.536798.3	427.5351021.181657.33369.993501.59	250.196218.201477.938669.7062560.93	培养基	----	145.436245.121	214.212218.622	66.8530

表10.ODN 8954，10101-2，5569，和5570对IL-10的诱导(pg/ml)

ODN	浓度μg/ml	D521平均值±标准差	D525平均值±标准差	D526平均值±标准差
ODN	浓度μg/ml	D521平均值±标准差	D525平均值±标准差	D526平均值±标准差	2006	0.030.060.1250.251.0	151.976384.377404.352357.657255.344	112.414218.651242.289247.405162.444	485.823898.299991.6141150.941171.72
8954	0.030.060.1250.251.0	7.4565.3410.72315.30848.904	6.6175.7212.98613.05630.892	6.91919.78735.89267.18230.725	2006	0.030.060.1250.251.0	151.976384.377404.352357.657255.344	112.414218.651242.289247.405162.444	485.823898.299991.6141150.941171.72
8954	0.030.060.1250.251.0	7.4565.3410.72315.30848.904	6.6175.7212.98613.05630.892	6.91919.78735.89267.18230.725	5569	0.030.060.1250.251.0	0018.815105.32256.785	1.2870.1273.61530.094136.833	1.3484.59262.963350.5291156.07
5570	0.030.060.1250.251.0	06.59998.553259.812312.189	0.317.02738.528107.164206.126	5.86729.879455.1451169.461595.63	5569	0.030.060.1250.251.0	0018.815105.32256.785	1.2870.1273.61530.094136.833	1.3484.59262.963350.5291156.07
5570	0.030.060.1250.251.0	06.59998.553259.812312.189	0.317.02738.528107.164206.126	5.86729.879455.1451169.461595.63	培养基	----	1.7550.29	10.54311.192	00

前述的书面描述足以使本领域技术人员能够实施本发明。本发明并不限于实施例的范围，由于实施例只是对本发明的各个方面进行举例说明，其它功能上等同的实施方案也在本发明的范围之内。根据前面的描述，对本发明做适当修改对本领域技术人员来说是显而易见的，也落在权利要求的保护范围之内。每一个实施方案并不需要完全囊括本发明的优点和目的。

本申请中所有引用的参考文献，专利和专利出版物都通过在此引述而合并于本文。

序列表

<110>科勒制药集团有限公司

科勒制药股份公司

衣阿华大学研究基金会

<120>具有提高的活性的组合基序免疫刺激寡肽

<130>C01039/70063WO(HCL/AWS)

<150>US 60/313,273

<151>2001-08-17

<150>US 60/393,952

<151>2002-07-03

<160>81

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成寡核苷酸

<400>1

tcgtcgtttt cggcgcgcgc cg 22

<210>2

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成寡核苷酸

<400>2

tcgtcgtttt cgtcgcgcgc cg 22

<210>3

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成寡核苷酸

<400>3

tcgtcgtttt cgtcgcgcgg cg 22

<210>4

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成寡核苷酸

<400>4

tcgtcgtttt cggcggccgc cg 22

<210>5

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成寡核苷酸

<400>5

tcgtcgtttt cggcgcgccg cg 22

<210>6

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成寡核苷酸

<400>6

tcgtcgtttt cggcgccggc cg 22

<210>7

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成寡核苷酸

<400>7

tcgtcgtttt cggcccgcgc gg 22

<210>8

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成寡核苷酸

<400>8

tcgtcgtttt ccgccgccgg gg 22

<210>9

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成寡核苷酸

<400>9

tcgtcgtttt cggggggccc cc 22

<210>10

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成寡核苷酸

<400>10

tcgtcgtttt ccccccgggg gg 22

<210>11

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成寡核苷酸

<400>11

tcggcgcgcg ccgtcgtcgt tt 22

<210>12

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成寡核苷酸

<400>12

tcgtcgtttt cggcgcgcgc cgttttt 27

<210>13

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成寡核苷酸

<400>13

tcctgacgtt cggcgcgcgc cg 22

<210>14

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成寡核苷酸

<220>

<221>混合特征

<222>(2)..(2)

<223>n为5-甲基胞嘧啶

<220>

<221>混合特征

<222>(5)..(5)

<223>n为5-甲基胞嘧啶

<220>

<221>混合特征

<222>(11)..(11)

<223>n为5-甲基胞嘧啶

<220>

<221>混合特征

<222>(14)..(14)

<223>n为5-甲基胞嘧啶

<220>

<221>混合特征

<222>(16)..(16)

<223>n为5-甲基胞嘧啶

<220>

<221>混合特征

<222>(18)..(18)

<223>n为5-甲基胞嘧啶

<220>

<221>混合特征

<222>(20)..(21)

<223>n为5-甲基胞嘧啶

<400>14

tngtngtttt nggngngngn ng 22

<210>15

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成寡核苷酸

<400>15

tgctgctttt cggcgcgcgc cg 22

<210>16

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成寡核苷酸

<400>16

tcgtcgtttt cgcgcgcgcg cg 22

<210>17

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成寡核苷酸

<400>17

tcgtcgttgg ttgtcgtttt ggtt 24

<210>18

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成寡核苷酸

<400>18

accatggacg agctgtttcc cctc 24

<210>19

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成寡核苷酸

<400>19

tcctgacgtt cggcgcgcgc cc 22

<210>20

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成寡核苷酸

<400>20

tgctgctttt gtgcttttgt gctt 24

<210>21

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成寡核苷酸

<400>21

tcgtcgtttc gtcgttttga cgtt 24

<210>22

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成寡核苷酸

<400>22

tcgcgtgcgt tttgtcgttt tgacgtt 27

<210>23

<211>12

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成寡核苷酸

<400>23

cggcgcgcgc cg 12

<210>24

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成寡核苷酸

<400>24

cggcgcgcgc cgcggcgcgc gccg 24

<210>25

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成寡核苷酸

<400>25

cggcgcgcgc cgtcgtcgtt t 21

<210>26

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成寡核苷酸

<400>26

tcggcgcgcg ccgtgctgct tt 22

<210>27

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成寡核苷酸

<400>27

ccgccgtttt cggcgcgcgc cg 22

<210>28

<211>12

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成寡核苷酸

<400>28

cggcggccgc cg 12

<210>29

<211>12

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成寡核苷酸

<400>29

cgcgcgcgcg cg 12

<210>30

<211>12

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成寡核苷酸

<400>30

gcgcgcgcgc gc 12

<210>31

<211>12

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成寡核苷酸

<400>31

ccccccgggg gg 12

<210>32

<211>12

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成寡核苷酸

<400>32

ggggggcccc cc 12

<210>33

<211>10

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成寡核苷酸

<400>33

cccccggggg 10

<210>34

<211>10

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成寡核苷酸

<400>34

gggggccccc 10

<210>35

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成寡核苷酸

<400>35

ggggtcaacg ttgagggggg 20

<210>36

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成寡核苷酸

<400>36

ggggtcaagc ttgagggggg 20

<210>37

<211>12

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成寡核苷酸

<400>37

cggcgcgcgc cc 12

<210>38

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成寡核苷酸

<400>38

gcggcgggcg gcgcgcgccc 20

<210>39

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成寡核苷酸

<400>39

tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24

<210>40

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成寡核苷酸

<400>40

tctcccagcg tgcgccat 18

<210>41

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成寡核苷酸

<400>41

ataatcgacg ttcaagcaag 20

<210>42

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成寡核苷酸

<400>42

tctatcgacg ttcaagcaag 20

<210>43

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成寡核苷酸

<400>43

tcgtcgtttt tgtcgttttt gtcgtt 26

<210>44

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成寡核苷酸

<400>44

tcgtcgtttt gtcgtttttg tcgttt 26

<210>45

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成寡核苷酸

<400>45

ttcgtgtttt cgtgttttcg tcgt 24

<210>46

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成寡核苷酸

<400>46

tcgtcgttgt cgttttgtcgtt 22

<210>47

<211>10

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成寡核苷酸

<220>

<221>混合特征

<222>(3)..(3)

<223>n为次黄嘌呤

<220>

<221>混合特征

<222>(6)..(6)

<223>n为次黄嘌呤

<400>47

tcntcntttt 10

<210>48

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成寡核苷酸

<400>48

tgtcgttgtc gttgtcgttg tcgtt 25

<210>49

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成寡核苷酸

<400>49

tcgtcgtttt gacgttttgt cgtt 24

<210>50

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成寡核苷酸

<400>50

tcgtcgtttt gacgttttga cgtt 24

<210>51

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成寡核苷酸

<220>

<221>混合特征

<222>(2)..(2)

<223>n为5-甲基胞嘧啶

<220>

<221>混合特征

<222>(5)..(5)

<223>n为5-甲基胞嘧啶

<220>

<221>混合特征

<222>(13)..(13)

<223>n为5-甲基胞嘧啶

<220>

<221>混合特征

<222>(21)..(21)

<223>n为5-甲基胞嘧啶

<400>51

tngtngtttt gtngttttgt ngtt 24

<210>52

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成寡核苷酸

<400>52

tcgtcgtttt ttgtcgtttt ttgtcgtt 28

<210>53

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成寡核苷酸

<400>53

tttttttttt tttttttttt tttt 24

<210>54

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成寡核苷酸

<400>54

tcgtcgctgt ctccgcttct tcttgcc 27

<210>55

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成寡核苷酸

<400>55

gggggacgat cgtcggggg 19

<210>56

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成寡核苷酸

<400>56

ggggtcgacg tcgacgtcga ggggggg 27

<210>57

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成寡核苷酸

<400>57

ggggacgacg tcctgggggg g 21

<210>58

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成寡核苷酸

<400>58

tcgtcgtttt cggcggccgc c 21

<210>59

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成寡核苷酸

<400>59

tcgtcgtttt cggccgccgc c 21

<210>60

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成寡核苷酸

<400>60

tcgtcgtttt cggccgccgc cg 22

<210>61

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成寡核苷酸

<400>61

tcgtcgtttt cgccgccgcc g 21

<210>62

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成寡核苷酸

<400>62

tgctgctttt cggcggccgc cg 22

<210>63

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成寡核苷酸

<220>

<221>混合特征

<222>(2)..(2)

<223>n为次黄嘌呤

<220>

<221>混合特征

<222>(5)..(5)

<223>n为次黄嘌呤

<400>63

tngtngtttt cggcggccgc cg 22

<210>64

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成寡核苷酸

<400>64

tcgtcgtttt cggcggccga cg 22

<210>65

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成寡核苷酸

<400>65

tcgtcgtttt cgtcggccgc cg 22

<210>66

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成寡核苷酸

<400>66

tcgtcgtttt cgacggccgc cg 22

<210>67

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成寡核苷酸

<400>67

tcgtcgtttt cggcggccgt cg 22

<210>68

<211>12

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成寡核苷酸

<400>68

cgacgatcgt cg 12

<210>69

<211>12

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成寡核苷酸

<400>69

cgacgtacgt cg 12

<210>70

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成寡核苷酸

<220>

<221>混合特征

<222>(3)..(3)

<223>n为次黄嘌呤

<220>

<221>混合特征

<222>(6)..(6)

<223>n为次黄嘌呤

<400>70

tcntcntttt cggcggccgc cg 22

<210>71

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成寡核苷酸

<400>71

tcgtcgtttc gacggccgtc g 21

<210>72

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成寡核苷酸

<400>72

tcgtcgtttc gacgatcgtc g 21

Claims

1.一种14-40个核苷酸长的免疫刺激核酸，其包含碱基序列，

碱基序列包括下述结构：

5’PX₁DCGHX₂3’或5’X₁DCGHX₂P 3’

其中X₁和X₂独立地是任意0-10个碱基长的序列，D是非C的碱基，C是胞嘧啶，G是鸟嘌呤，H是非G的碱基，P是至少10个碱基长的富含GC的回文结构，其中

a)H是胸腺嘧啶(T)并且X₂是CGTTT或CGTTTT；

b)P是完整的回文结构，H是T，并且X₂选自由CG，CGT，CGTT，CGTTT，和CGTTTT所组成的组，并且/或者

c)P包括至少一个次黄嘌呤(I)。

2.权利要求1的免疫刺激核酸，其中所述碱基序列包括：

a)5’X₁DCGHX₂PX₃3’，其中X₃是任意0-10个碱基长的序列；

b)5’X₁DCGHPX₃3’，其中X₃是任意0-10个碱基长的序列；

c)5’DCGHX₂PX₃3’，其中X₃是任意0-10个碱基长的序列；

d)5’TCGHX₂PX₃3’，其中X₃是任意0-10个碱基长的序列；

e)5’DCGHPX₃3’，其中X₃是任意0-10个碱基长的序列；

f)5’DCGHP3’。

3.一种14-40个核苷酸长的免疫刺激核酸，其包含碱基序列，碱基序列包括下述结构：

5’NX₁DCGHX₂3’或5’X₁DCGHX₂N3’

其中X₁和X₂独立地是任意0-10个碱基长的序列，D是非C的碱基，C是胞嘧啶，G是鸟嘌呤，H是非G的碱基，N是B细胞中和序列，起始为CGG并且至少有10个碱基长，其中

1)对于5’NX₁DCGHX₂3’：

a)H是胸腺嘧啶(T)，并且/或者

b)H是T，并且X₂选自由CG，CGT，CGTT，CGTTT，和CGTTTT所组成的组，并且

2)对于5’X₁DCGHX₂N3’：

a)H是T，并且X₂是CGTTTT。

4.权利要求1的免疫刺激核酸，其中在所述结构5’PX₁DCGHX₂3’和5’X₁DCGHX₂P3’中，C是非甲基化的。

5.权利要求3的免疫刺激核酸，其中在所述结构5’NX₁DCGHX₂3’和5’X₁DCGHX₂N3’中，C是非甲基化的。

6.权利要求1-5中任何一项所述的免疫刺激核酸，其中所述免疫刺激核酸：

a)具有抗核酸酶骨架；

b)具有硫代磷酸酯骨架；和/或

c)具有嵌合的骨架。

7.权利要求1-6中任何一项所述的免疫刺激核酸，其中所述免疫刺激核酸的长度为14至30个核苷酸。

8.权利要求1-7中任何一项所述的免疫刺激核酸，所述碱基序列进一步在5’端和/或在3’端包括一个polyT序列。

9.一种药物组合物，包含权利要求1-8任一项的免疫刺激核酸，和一种药学可接受的载体。

10.权利要求9的药物组合物，进一步包括抗原，所述抗原任选地为肿瘤抗原。

11.一种在体外诱导1型干扰素(IFN)表达的方法，包括在体外将能表达1型IFN的细胞与有效量的权利要求1-8任一项的免疫刺激核酸接触。

12.一种在体外激活天然杀伤(NK)细胞的方法，包括将NK细胞与有效量的权利要求1-8任一项的免疫刺激核酸接触。

13.权利要求1-8中任何一项所述的免疫核酸在制备用于治疗的药物中的应用，其中

所述免疫刺激核酸用于与能表达1型干扰素IFN的细胞接触，以诱导1型IFN的表达。

14.权利要求1-8中任何一项所述的免疫核酸在制备用于治疗的药物中的应用，其中

所述免疫刺激核酸用于与NK细胞接触，以激活NK细胞。

15.权利要求1-8中任何一项所述的免疫核酸在制备用于治疗的药物中的应用，所述药物用于在已感染或有感染危险的患者中治疗或预防所述感染。

16.权利要求15的应用，其中患者的感染或具有的感染危险是选自病毒，细菌，真菌和寄生虫的感染。

17.权利要求1-8中任何一项所述的免疫核酸在制备用于治疗的药物中的应用，所述药物用于在已有过敏性病症或有过敏性病症危险的患者中治疗或预防该过敏性病症。

18.权利要求17的应用，其中所述过敏性病症是过敏性哮喘。

19.权利要求1-8中任何一项所述的免疫核酸在制备用于治疗的药物中的应用，所述药物用于在已患癌症或有患癌症危险的患者中治疗或预防所述癌症。

20.权利要求19的应用，其中所述癌症选自基底细胞癌，胆道癌；膀胱癌；骨癌；脑癌和CNS癌；乳腺癌；宫颈癌；恶性合体细胞瘤；结肠癌和直肠癌；结缔组织癌；消化系统癌症；子宫内膜癌；食道癌；眼癌；头部和颈部癌症；胃癌；内皮肿瘤；肾癌；喉癌；白血病；肝癌；肺癌；淋巴瘤包括何杰金氏和非何杰金氏淋巴瘤；黑色素瘤；骨髓瘤；成神经细胞瘤；口腔癌；卵巢癌；胰癌；前列腺癌；成视网膜细胞瘤；横纹肌肉瘤；直肠癌；肾癌；呼吸系统癌症；肉瘤；皮肤癌；胃癌；睾丸癌；甲状腺癌；子宫癌；泌尿系统癌症，以及其它癌和肉瘤。

21.一种免疫刺激核酸，包含选自下组的碱基序列：

TCGTCGTTTTCGGCGCGCGCCG(SEQ ID NO：1)，

TCGTCGTTTTCGGCGGCCGCCG(SEQ ID NO：4)，

TCGTCGTTTTCGGCGCGCCGCG(SEQ ID NO：5)，

TCGTCGTTTTCGGCGCCGGCCG(SEQ ID NO：6)，

TCGTCGTTTTCGGCCCGCGCGG(SEQ ID NO：7)，

TCGTCGTTTTCGGCGCGCGCCGTTTTT(SEQ IDNO：12)，

TCCTGACGTTCGGCGCGCGCCG(SEQ ID NO：13)，

TZGTZGTTTTZGGZGZGZGZZG(SEQ ID NO：14)，其中Z是5-甲基胞嘧啶，或

TCGGCGCGCGCCGTCGTCGTTT(SEQ ID NO：11)。