CN101160401A - 免疫刺激寡核苷酸 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一类可用于刺激免疫应答的短CpG免疫刺激寡核苷酸。这些短寡核苷酸优选为软或者半软的寡核苷酸。
Description
发明领域
本发明一般涉及短的免疫刺激寡核苷酸,以及具有降低的肾脏炎性作用的免疫刺激寡核苷酸、其组合物和使用这种免疫刺激寡核苷酸的方法。
发明背景
细菌DNA具有免疫刺激作用,能激活B细胞和自然杀伤细胞,但是脊椎动物DNA则不能(Tokunaga,T.,等人,1988.Jpn.J Cancer Res.79:682-686;Tokunaga,T.,等人,1984,JNCI72:955-962;Messina,J.P.,等人,1991,J.Immunol.147:1759-1764;并且综述于Krieg,1998,AppliedOligonucleotide Technology,C.A.Stein和A.M.Krieg,(编辑.),JohnWiley和Sons,Inc.,纽约,N.Y.,431-448页)。现在知道细菌DNA的这些免疫刺激作用是由在特定的碱基环境中存在未甲基化的CpG二核苷酸(CpG基序)引起的,这种CpG基序在细菌DNA中是普遍存在的,但是在脊椎动物DNA中是发生甲基化并且代表不足的(Krieg等人,1995Nature374:546-549;Krieg,1999Biochim.Biophys.Acta 93321:1-10)。细菌DNA的免疫刺激作用可以用合成的包含这些CpG基序的寡脱氧核苷酸(ODN)来模仿。这种CpG ODN对人和鼠白细胞具有高度刺激作用,诱导B细胞增殖、细胞因子和免疫球蛋白分泌、自然杀伤(NK)细胞溶解活性和IFN-γ分泌,以及激活树突细胞(DCs)和其它抗原呈递细胞表达共刺激分子和分泌细胞因子,尤其是在促进Th1样T细胞应答发育中起重要作用的Th1样细胞因子。天然磷酸二酯骨架CpG ODN的这些免疫刺激作用是高度CpG特异性的,因为如果CpG基序被甲基化,变为GpC,或者被消除或改变,这种作用会急剧降低(Krieg等人,1995Nature 374:546-549;Hartmann等人,1999Proc.Natl.Acad.Sci USA 96:9305-10)。
在早期研究中,人们认为具有免疫刺激性CpG基序遵循公式嘌呤-嘌呤-CpG-嘧啶-嘧啶(Krieg等人,1995Nature 374:546-549;Pisetsky,1996J.Immunol.156:421-423;Hacker等人,1998EMBO J.17:6230-6240;Lipford等人,1998Trends in Microbiol.6:496-500)。但是,现在清楚小鼠淋巴细胞对不遵循这种“公式”的磷酸二酯CpG基序也有很好的应答(Yi等人,1998J.Immunol.160:5898-5906),并且这同样适用于人B细胞和树突细胞(Hartmann等人,1999Proc.Natl.Acad.Sci USA 96:9305-10;Liang,1996J.Clin.Invest.98:1119-1129)。
已经描述过几种不同类的CpG核酸。其中一类可以有效激活B细胞,但是在诱导IFN-α和NK细胞激活方面相对来说较弱,这一类被称为B类。B类CpG核酸一般是完全稳定的,并且在某些首选的碱基环境中包含未甲基化的CpG二核苷酸。例如,参见美国专利号6,194,388;6,207,646;6,214,806;6,218,371;6,239,116;和6,339,068。另一类CpG核酸激活B细胞和NK细胞,并诱导IFN-α,这一类被称为C类。如最初所表征的,C类CpG核酸一般是完全稳定的,包括B类型的序列和富含GC的回文序列或近似回文序列。这一类在共同待决的提交于2001年8月17日的美国临时专利申请60/313,273和提交于2002年8月19日的US 10/224,523和相关的PCT专利申请PCT/US02/26468(以国际公布号WO 03/015711公布)中描述。
发明概述
令人惊奇地发现通过在某些核苷酸之间选择性的包括一个或多个不稳定的键,可以维持甚至提高B类和C类CpG寡核苷酸以及其它稳定的免疫刺激寡核苷酸的免疫刺激性质。所述不稳定键优选天然的键,即磷酸二酯键或磷酸二酯样键。不稳定键一般(但是不必)对于核酸酶消化是相对敏感的。本发明的免疫刺激寡核苷酸包括位于包含嘧啶(Y)碱基(优选C)的5’核苷酸与邻近的包含嘌呤(Z)碱基(优选鸟嘌呤(G))的3’核苷酸之间的至少一个不稳定键,其中5’Y和3’Z都是内部核苷酸。另外还发现较短长度的寡核苷酸可有效地促进免疫应答。
在某些方面,本发明是长度为3到24个核苷酸的寡核苷酸,它包含至少一个具有磷酸二酯或磷酸二酯样核苷酸间键的YZ二核苷酸,以及至少4个胸腺嘧啶(T)核苷酸。Y是包含嘧啶或经修饰嘧啶碱基的核苷酸。Z是包含鸟嘌呤或经修饰鸟嘌呤的核苷酸。此寡核苷酸还包括至少一个稳定化的核苷酸间键。在一个实施方案中,此寡核苷酸包括TTTT基序。
在其它实施方案中,所述的寡核苷酸仅有一个YZ二核苷酸。任选地,此寡核苷酸是G*T*C_G*T*T*T*T*G*A*C(SEQ ID NO.:16)或G*T*T*T*T*G*A*C_G*T*T*T*T*G*T*C(SEQ ID NO.:11)。*是指存在稳定化的核苷酸间键。_是指存在磷酸二酯核苷酸间键。
在其它实施方案中,所述的寡核苷酸仅有两个YZ二核苷酸。任选地,此寡核苷酸是T*C_G*T*T*T*T*G*A*C_G*T*T(SEQ ID NO.:3),T*C_G*T*C_G*T*T*T*T*G*A*C(SEQ ID NO.:10),G*T*T*T*T*G*A*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T*T(SEQ ID NO.:12),G*T*C_G*T*T*T*T*G*A*C_G*T*T(SEQ ID NO.:13),T*C_G*T*T*T*T*G*A*C_G*T*T*T*T*G*T*C(SEQ ID NO.:14),或G*T*C_G*T*T*T*T*G*A*C_G*T*T*T*T*G*T*C(SEQ ID NO.:15)。*是指存在稳定化的核苷酸间键。是指存在磷酸二酯核苷酸间键。
在另一些实施方案中,所述的寡核苷酸仅有三个YZ二核苷酸。此寡核苷酸可以是T*C_G*T*T*T*T*G*A*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T*T(SEQ ID NO.:2),G*T*C_G*T*T*T*T*G*A*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T*T(SEQ ID NO.:8),T*C_G*T*C_G*T*T*T*T*G*A*C_G*T*T*T*T*G*T*C(SEQ ID NO.:9),或T*C_G*T*C_G*T*T*T*T*G*A*C(SEQ ID NO.:10)。*是指存在稳定化的核苷酸间键。是指存在磷酸二酯核苷酸间键。
根据其它实施方案,所述的寡核苷酸仅有四个YZ二核苷酸。此寡核苷酸可以是T*C_G*T*C_G*T*T*T_T*G*A*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T*T(SEQID NO.:4),T*C_G*T*C_G*T*T*T_T*G*A*C_G*T*T*T_T*G*T*C_G*T*T(SEQID NO.:5),T*C_G*T*C_G*T_T*T_T*G_A*C_G*T_T*T_T*G_T*C_G*T*T(SEQID NO.:6),C_G*T*C_G*T*T*T*T*G*A*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T*T(SEQ IDNO.:17),T*C_I*T*C_I*T*T*T*T*G*A*C_I*T*T*T*T*G*T*C_I*T*T(SEQ ID NO.:18),T*MeC_G*T*MeC_G*T*T*T*T*G*A*MeC_G*T*T*T*T*G*T*MeC_G*T*T(SEQ ID NO.:19),T*H_G*T*H_G*T*T*T*T*G*A*H_G*T*T*T*T*G*T*H_G*T*T(SEQID NO.:20),T*C_7*T*C_7*T*T*T*T*G*A*C_7*T*T*T*T*G*T*C_7*T*T(SEQ IDNO.:21),或U*C_G*U*C_G*U*U*U*U*G*A*C_G*U*U*U*U*G*U*C_G*U*U(SEQID NO.:22)。*是指存在稳定化的核苷酸间键。_是指存在磷酸二酯核苷酸间键。I是包含次黄嘌呤碱基的次黄苷;MeC是5’-甲基-胞嘧啶,H是5-羟基-胞嘧啶,7是7-脱氮-鸟嘌呤,U是尿嘧啶。
在一些实施方案中,每个YZ二核苷酸都具有磷酸二酯或磷酸二酯样核苷酸间键。在一些实施方案中,磷酸二酯样键是硼代膦酸酯(boranophosphonate)或者非对映纯的Rp硫代磷酸酯。
稳定化的核苷酸间键可以是硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、甲基硫代磷酸酯、磷酸乙酯或者它们的任意组合。
在优选的实施方案中,Y是包含未甲基化胞嘧啶的核苷酸并且/或者Z是包含鸟嘌呤的核苷酸。Y任选可以为包含胞嘧啶或经修饰胞嘧啶碱基如5-甲基胞嘧啶、5-甲基异胞嘧啶(5-methyl-isocytosine)、5-羟基胞嘧啶、5-卤代胞嘧啶、尿嘧啶、N4-乙基胞嘧啶、5-氟尿嘧啶或者氢的核苷酸。
Z可以任选为包含鸟嘌呤或经修饰鸟嘌呤碱基如7-脱氮-鸟嘌呤,7-脱氮-7-取代的鸟嘌呤(如7-脱氮-7-(C2-C6)炔基鸟嘌呤),7-脱氮-8-取代的鸟嘌呤,次黄嘌呤,2,6-二氨基嘌呤,2-氨基嘌呤,嘌呤,8-取代的鸟嘌呤(如8-羟基鸟嘌呤),以及6-硫鸟嘌呤,2-氨基嘌呤或者氢的核苷酸。
在一些实施方案中,该寡核苷酸具有3’-3’键,具有一个或两个可接近的5’末端。在其它实施方案中,该寡核苷酸具有两个可接近的5’末端,每一个都是5’TCG。
按照本发明的其它方面,本发明提供了长度为2到7个核苷酸的寡核苷酸。此寡核苷酸具有至少一个具有磷酸二酯或磷酸二酯样核苷酸间键的YZ二核苷酸,并且此寡核苷酸还包括至少一个稳定化的核苷酸间键。Y是包含嘧啶或经修饰嘧啶碱基的核苷酸。Z是包含鸟嘌呤或经修饰鸟嘌呤的核苷酸。
在一些实施方案中,所述的寡核苷酸仅有一个YZ二核苷酸。此寡核苷酸可以是T*G*T*C*G*T*T(SEQ ID NO.:23),T*G*T*C_G*T*T(SEQID NO.:24),G*T*C*G*T*T(SEQ ID NO.:25),G*T*C_G*T*T(SEQ IDNO.:26),G*T*C*G*T(SEQ ID NO.:27),G*T*C_G*T(SEQ ID NO.:28),T*C*G*T*T(SEQ ID NO.:29),T*C_G*T*T(SEQ ID NO.:30),或C_G(SEQ ID NO.:31)。*是指存在稳定化的核苷酸间键。_是指存在磷酸二酯核苷酸间键。稳定化的核苷酸间键可以是硫代磷酸酯。
在一些实施方案中,Y是包含选自5-甲基胞嘧啶,5-甲基异胞嘧啶,5-羟基胞嘧啶,5-卤代胞嘧啶,尿嘧啶,N4-乙基胞嘧啶,5-氟尿嘧啶的未甲基化胞嘧啶或经修饰胞嘧啶碱基的核苷酸或者氢。在其它实施方案中,Z是选自7-脱氮-鸟嘌呤,7-脱氮-7-取代的鸟嘌呤(如7-脱氮-7-(C2-C6)炔基鸟嘌呤),7-脱氮-8-取代的鸟嘌呤,次黄嘌呤,2,6-二氨基嘌呤,2-氨基嘌呤,嘌呤,8-取代的鸟嘌呤(如8-羟基鸟嘌呤),以及6-硫鸟嘌呤,2-氨基嘌呤的或者氢鸟嘌呤或经修饰鸟嘌呤碱基。
在一些实施方案中,该寡核苷酸具有3’-3’键,具有一个或两个可接近的5’末端。在其它实施方案中,该寡核苷酸具有两个可接近的5’末端,每一个都是5’TCG。
在其它实施方案中,此寡核苷酸具有3’-氨基己基。在其它实施方案中,此寡核苷酸具有5’-氨基己基。在其它实施方案中,此寡核苷酸具有3’-氨基己基和5’-氨基己基。
在一些实施方案中,此寡核苷酸具有通过间隔基相连接的两个YZ二核苷酸。在一些实施方案中,此间隔基由通过二键体(doubler)相连接的两个六乙二醇基团组成。在一些实施方案中,此二键体是亚磷酰胺。在一些实施方案中,此亚酰胺是对称二键体亚磷酰胺(Glen ResearchCat#10-1920-90)。在一些实施方案中,此亚酰胺具有连接的丁酸基。此寡核苷酸可以是(C-G-L)-2doub-but(SEQ ID NO.:43)。
在其它方面,本发明是长度为7个核苷酸的寡核苷酸。该寡核苷酸具有至少一个CG二核苷酸并且包括至少一个稳定化的核苷酸间键。在一些实施方案中,所有的核苷酸间键是硫代磷酸酯键。
按照本发明的其它方面,本发明提供了长度为5到7个核苷酸的寡核苷酸。此寡核苷酸具有GTCGT或TCGTT,并且包括至少一个稳定化的核苷酸间键。任选地,所有的核苷酸间键是硫代磷酸酯键。
像完全稳定的免疫刺激寡核苷酸一样,本发明的免疫刺激寡核苷酸可用于诱导Th1样免疫应答。因此,本发明的免疫刺激寡核苷酸可用作接种的的佐剂,并且可用于治疗疾病(包括癌症,传染病,变态反应和哮喘)。人们认为它们尤其为任何目的在任何需要延长或重复施用免疫刺激寡核苷酸的条件下是有用的。
在另一方面,本发明是治疗变态反应的方法。通过对具有变态反应或有变态反应危险的受试者以治疗变态反应有效量施用此处所描述的免疫刺激CpG寡核苷酸来进行此方法。
在另一方面,本发明是治疗哮喘的方法。通过对具有哮喘或有哮喘危险的受试者以治疗哮喘有效量施用此处所描述的免疫刺激CpG寡核苷酸来进行此方法。
在一个实施方案中,将寡核苷酸施用到粘膜表面。在其它实施方案中,以气雾剂制剂施用寡核苷酸。任选地,鼻内施用寡核苷酸。
在另一方面,本发明是此处所描述的CpG免疫刺激寡核苷酸与抗原或其它治疗化合物(例如抗微生物剂)相组合的组合物。例如,这种抗微生物剂可以是抗病毒剂,抗寄生虫剂,抗细菌剂或者抗真菌剂。
按照本发明的另一方面,本发明提供了包括此处所描述的CpG免疫刺激寡核苷酸的缓释装置的组合物。
此组合物可以任选包括药物载体和/或配制到递送装置中。在一些实施方案中,此递送装置选自阳离子脂质,细胞通透蛋白和缓释装置。在一个实施方案中,该缓释装置是生物可降解的聚合物或者微粒。
按照本发明的另一方面,本发明提供了刺激免疫应答的方法。此方法包括对受试者按照可以有效诱导受试者免疫应答的量施用CpG免疫刺激寡核苷酸。该CpG免疫刺激寡核苷酸优选口服施用,局部施用,以缓释装置施用,经粘膜施用,全身施用,肠胃外施用,或者肌内施用。当CpG免疫刺激寡核苷酸施用到粘膜表面时,它可以以有效诱导粘膜免疫应答或者系统免疫应答的量递送。在优选的实施方案中,粘膜表面选自口、鼻、直肠、阴道和眼表面。
在一些实施方案中,此方法包括使受试者接触抗原,其中免疫应答是抗原特异性免疫应答。在一些实施方案中,抗原选自肿瘤抗原、病毒抗原、细菌抗原、寄生虫抗原和肽抗原。
CpG免疫刺激寡核苷酸能够刺激广谱免疫应答。例如,这些CpG免疫刺激寡核苷酸可以用于将TH2重定向到Th1免疫应答。CpG免疫刺激寡核苷酸还可以用于激活免疫细胞,如淋巴细胞(如B和T细胞),树突细胞和NK细胞。此激活可以在体内(in vivo)、体外(in vitro)或离体(ex vivo)进行,即通过从受试者分离免疫细胞,使免疫细胞与激活它们的有效量CpG免疫刺激寡核苷酸相接触,并对受试者重新施用此激活的免疫细胞。在一些实施方案中,树突细胞呈递癌抗原。这些树突细胞可以与癌抗原离体接触。
在另一个实施方案中,这种CpG免疫刺激寡核苷酸可用于治疗癌症。按照本发明的其它方面,这种CpG免疫刺激寡核苷酸也可用于预防具有患癌症风险的受试者的癌症(例如,降低发展为癌症的风险)。癌症选自胆管癌、乳腺癌、宫颈癌、绒毛膜癌、结肠癌、子宫内膜癌、胃癌、上皮内肿瘤、淋巴瘤、肝癌、肺癌(如小细胞和非小细胞)、黑素瘤、成神经细胞瘤、口腔癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、直肠癌、肉瘤、甲状腺癌和肾癌,以及其它的癌和肉瘤。在一些重要的实施方案中,癌症选自骨癌、脑和中枢神经系统癌、结缔组织癌、食道癌、眼癌、霍奇金淋巴瘤、喉癌、口腔癌、皮肤癌和睾丸癌。
任选地,当CpG免疫刺激寡核苷酸与抗癌治疗联合施用时,CpG免疫刺激寡核苷酸还可以用于增加癌细胞对癌症治疗(如抗癌治疗)的响应。抗癌治疗可以是化学疗法、疫苗(如体外已接触抗原的树突细胞疫苗或癌抗原疫苗)或者基于抗体的治疗。后一种治疗还可以包括施用细胞(例如,癌细胞)表面抗原特异性的抗体,其中免疫应答导致依赖于抗体的细胞毒性(ADCC)。在一个实施方案中,抗体可以选自Ributaxin、Herceptin、Quadramet、Panorex、IDEC-Y2B8、BEC2、C225、Oncolym、SMART M195、ATRAGEN、Ovarex、Bexxar、LDP-03、ior t6、MDX-210、MDX-11、MDX-22、OV103、3622W94、anti-VEGF、Zenapax、MDX-220、MDX-447、MELIMMUNE-2、MELIMMUNE-1、CEACIDE、Pretarget、NovoMAb-G2、TNT、Gliomab-H、GNI-250、EMD-72000、LymphoCide、CMA 676、Monopharm-C、4B5、ior egf.r3、ior c5、BABS、anti-FLK-2、MDX-260、ANA Ab、SMART 1D10Ab、SMART ABL 364 Ab和ImmuRAIT-CEA。
因此,按照本发明的一些方面,对患有癌症或者有癌症风险的受试者施用CpG免疫刺激寡核苷酸和抗癌治疗。在一些实施方案中,抗癌治疗选自化学治疗剂、免疫治疗剂和癌症疫苗。
在其它方面,本发明是诱导先天性免疫应答的方法,通过对受试者施用有效量的CpG免疫刺激寡核苷酸,从而激活先天性免疫应答。
按照本发明的另一方面,本发明提供了治疗病毒或逆转录病毒感染的方法。此方法包括对患有病毒或逆转录病毒感染或者有其风险的受试者施用治疗病毒或逆转录病毒感染有效量的任一种本发明的组合物。在一些实施方案中,这种病毒是肝炎病毒,如乙型肝炎,丙型肝炎,HIV,疱疹病毒或乳头瘤病毒。
按照本发明的另一方面,提供了治疗细菌感染的方法。此方法包括对患有细菌感染或者有其危险的受试者施用治疗细菌感染有效量的任一种本发明的组合物。在一个实施方案中,细菌感染是由细胞内细菌引起的。
在另一方面,本发明是通过对患有寄生虫感染或者有其危险的受试者施用治疗寄生虫感染有效量的任一种本发明的组合物,治疗寄生虫感染的方法。在一个实施方案中,寄生虫感染是由细胞内寄生虫引起的。在另一个实施方案中,寄生虫感染是由非蠕虫寄生虫引起的。
在一些实施方案中,受试者是人,在其它实施方案中,受试者是非人脊椎动物,如狗,猫,马,奶牛,猪,火鸡,山羊,鱼,猴,鸡,大鼠,小鼠或绵羊。
在另一方面,本发明涉及通过对患有自身免疫病或者有其危险的受试者施用治疗或预防自身免疫病有效量的任一种本发明的组合物,治疗自身免疫病的方法。
在其它实施方案中,递送有效量的寡核苷酸到受试者,从而诱导细胞因子表达。任选地,细胞因子选自IL-6,TNFα,IFNα,IFNγ和IP-10。在其它实施方案中,递送有效量的寡核苷酸到受试者,从而将免疫应答由TH2偏倚的应答转向到Th1偏倚的应答,或者抑制TH2偏倚的应答的发展。
在一些方面,本发明是治疗气道重塑的方法,包括:对受试者以治疗受试者中气道重塑有效量施用此处所描述的寡核苷酸。在一个实施方案中,受试者患有哮喘、慢性阻塞性肺疾病或者是吸烟者。在其它实施方案中,受试者无哮喘症状。
本发明的另一方面还提供了本发明的寡核苷酸刺激免疫应答的用途。
本发明还提供了本发明寡核苷酸制造用于刺激免疫应答的药物的方法。
按照本发明的其它方面,本发明还提供了包含上述寡核苷酸和可药用载体的药物。
在本发明的其它方面,提供了前述寡核苷酸在制造用于治疗或预防受试者的病毒、真菌、细菌或寄生虫感染、癌症或哮喘或变态反应的方法中的药物的用途。
在一个实施方案中,病毒感染是由乙型肝炎病毒引起的。在另一个实施方案中,病毒感染是由丙型肝炎病毒引起的。
还提供了此处所描述的寡核苷酸在制造药物中的用途,所述药物在免疫治疗/化学治疗之前、与之一起或之后施用。
本发明的每一个限制可以包括本发明的多种实施方案。因此,可以预期包括任何一个要素或者其组合的本发明的每一个限制可以包括在本发明的每一个方面中。
附图简述
图1是一组图,描绘了当人PBMC与沿图上方X轴以编号列出的寡核苷酸相接触后,从这些细胞中分泌出来的α干扰素的水平(pg/ml)。图1所示的测试寡核苷酸包括1A=SEQ ID NO:1,1B=SEQ ID NO:2,1C=SEQ ID NO:3,1D=SEQ ID NO:4,1E=SEQ ID NO:5,1F=SEQ ID NO:6,1G=SEQ ID NO:7,1H=SEQ ID NO:8,1I=SEQ ID NO:9,1J=SEQ IDNO:10,1K=SEQ ID NO:11,1L=SEQ ID NO:12,1M=SEQ ID NO:13,1N=SEQ ID NO:14,1O=SEQ ID NO:15,1P=SEQ ID NO:16,1Q=SEQID NO:17,1R=SEQ ID NO.18,1S=SEQ ID NO:19,1T=SEQ ID NO:20,1U=SEQ ID NO:21,和1V=SEQ ID NO.:22。沿X轴描绘用于产生特定数据点的寡核苷酸浓度(μM)。所显示的数据代表4到6个供体的平均值。因为使用来自不同供体的PBMC,它们彼此间具有差异性,所以不能直接以pg/ml比较绝对水平。
图2是一组图,描绘了不同浓度的半软和全硬化的短CpG ODN对于IFN-α诱导的比较。SEQ ID NO.:23和24显示于图2A。SEQ ID NO.:25、26、27、28、29、30和31显示于图2B。
图3是一组图,显示了不同浓度的5种不同ODNs:SEQ ID NO:25(圆形),SEQ ID NO:26(倒三角形),SEQ ID NO:36(正方形),SEQ ID NO:37(菱形),SEQ ID NO:38(三角形)和DOTAP(六边形))对TLR9的诱导。将稳定表达人TLR9的HEK293细胞和NFκB-萤光素酶报告基因构建体与指示的ODN浓度孵育16小时。裂解细胞并且通过测定萤光素酶活性来确定TLR9的激活。每个数据点一式三份进行。图3B描绘了用DOTAP(N-[1-(2,3-二油酰基氧基)丙基]-N,N,N-甲基硫酸三乙基铵)预络合的ODNs的实验,而图3A显示没有DOTAP的实验。
图4是一组图,描绘了当人PBMC与具有不同的稳定核苷酸间键的ODNs:SEQ ID NO:38(圆形),SEQ ID NO:25(倒三角形),SEQ ID NO:26(正方形),SEQ ID NO:36(菱形)和SEQ ID NO:37(三角形)相接触后,从这些细胞中分泌出的细胞因子水平。图4A显示IFN-γ分泌的诱导,而图4B-4D分别描绘IL-10,IL-6和IFN-γ的分泌。沿X轴描绘用于产生特定数据点的寡核苷酸的浓度(μM)。所显示的数据代表3个供体的平均值。
图5是一组图,描绘了当人PBMC与具有不同的稳定核苷酸间键的ODN二核苷酸:SEQ ID NO:38(圆形),SEQ ID NO:40(倒三角形),SEQID NO:41(正方形),SEQ ID NO:42(菱形),SEQ ID NO:39(三角形)和SEQ ID NO:31(六边形)相接触后,从这些细胞中分泌的细胞因子水平。图5A显示IFN-α分泌的诱导,而图5B和5C分别显示IL-10和IL-6的分泌。沿X轴描绘用于产生特定数据点的寡核苷酸的浓度(μM)。所显示的数据代表3个供体的平均值。
图6是一组图,描绘了当人PBMC与ODN(C-G-L)-2doub-but(SEQID NO:43;亮圆形),阳性对照ODN(SEQ ID NO:38;倒三角形)或者仅DOTAP(暗圆形)相接触后,从这些细胞中分泌的细胞因子水平。图6A显示IFN-α分泌的诱导,而图6B和6C分别显示IL-10和IL-6的分泌。沿X轴描绘用于产生特定数据点的寡核苷酸的浓度(μM)。所显示的数据代表3个供体的平均值。
详述
按照本发明提供了软和半软的免疫刺激寡核苷酸。在一些实施方案中,此处所描述发明的免疫刺激寡核苷酸具有改进的性质,包括类似或增强的效力,与肾脏、肝脏和脾脏的减少的系统接触,以及可以在注射位点具有减少的反应原性。尽管申请人不受机理限制,可以相信这些改进的性质与磷酸二酯或磷酸二酯样“核苷酸间键”在免疫刺激寡核苷酸内的策略放置有关。此处所用的术语“核苷酸间键”是指在寡核苷酸分子内连接两个邻近核苷酸的共价骨架键。共价骨架键一般是经修饰的或未修饰的磷酸酯键,但是其它修饰也是可能的。因此长度为n个核苷酸的线性寡核苷酸共具有n-1个核苷酸间键。按照本发明的教导,这些共价骨架键在免疫刺激寡核苷酸中可以是经修饰的或未修饰的。
尽管先前已经认识到长度少于20个核苷酸的完全稳定的免疫刺激寡核苷酸与更长的(例如,长度为24个核苷酸)完全稳定寡核苷酸相比可以具有较低的免疫刺激活性,但是已经发现长度短至16个核苷酸的半软寡核苷酸具有至少等同于长度超过20个核苷酸的完全稳定的寡核苷酸的免疫刺激活性。例如SEQ ID NO:32和33(都是与SEQ ID NO:34具有部分序列相似性的16-mers)展示出比得上SEQ ID NO:34(24-mer)的免疫刺激活性。这些ODN具有如下序列:
T*C_G*T*C_G*T*T*T*C_G*T*C_G*T*T(SEQ ID NO:32),
T*C_G*T*C_G*T*T*T*T_G*T*C_G*T*T(SEQ ID NO:33)和
T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T(SEQ ID NO:34)。
在某些情况中,5-mer硫代磷酸酯寡核苷酸似乎缺乏免疫刺激活性,即使用一个磷酸二酯内部YZ核苷酸间键替代硫代磷酸酯键,也可以发现产生相应的具有免疫刺激活性的5-mer(表3和图2中比较SEQ ID NO:27对28)。在更高浓度的情况下,在某些实例中甚至2-3-mer(i.e SEQ ID NO:31)也会显示出活性。在其它实例中,已经鉴定出具有软、半软或者全硬化的骨架,并且长度在5到7个核苷酸之间的最优寡核苷酸。例如参见SEQID NO.:27和29。在这种尺寸范围内的具有全硬化骨架的寡核苷酸在更高浓度时尤其具有活性。
特别地,磷酸二酯或者磷酸二酯样核苷酸间键包括“内部二核苷酸”。内部二核苷酸一般是指通过核苷酸间键所连接的任何一对的邻近核苷酸,其中这对核苷酸中的任何一个核苷酸都不是终止核苷酸,即这对核苷酸中的任何一个核苷酸都不是定义寡核苷酸5’或3’末端的核苷酸。因此,长度为n个核苷酸的线性寡核苷酸共有n-1个二核苷酸和只有n-3个内部二核苷酸。内部二核苷酸中的每个核苷酸间键是内部核苷酸间键。因此,长度为n个核苷酸的线性寡核苷酸共有n-1个核苷酸间键和只有n-3个内部二核苷酸间键。因此,策略放置的磷酸二酯或磷酸二酯样核苷酸间键是指位于核酸序列中任何一对核苷酸之间的磷酸二酯或磷酸二酯样核苷酸间键。在一些实施方案中,磷酸二酯或磷酸二酯样核苷酸间键不位于最靠近5’或3’末端的任何一对核苷酸之间。
本发明至少在一些方面是基于如下令人惊奇的发现,即此处所描述的软和半软寡核苷酸与相应的具有相同核苷酸序列的完全稳定的免疫刺激寡核苷酸相比,具有至少相同或者在很多情况下更高的免疫刺激活性。进一步发现更短的核苷酸(例如长度为2-24个核苷酸)即使在CpG基序的核苷酸间放置“软化”键,也可保持免疫刺激性质。这是意料之外的,因为人们通常认为硫代磷酸酯寡核苷酸通常比不稳定寡核苷酸更具有免疫刺激性。结果是令人惊奇的,因为在预料中,如果“软化”键放置到关键免疫刺激基序(即CG)之间,那么寡核苷酸可能活性降低,因为该寡核苷酸在体内很容易被分解形成不含CG的片段。
软寡核苷酸是具有部分稳定骨架的免疫刺激寡核苷酸,其中只在至少一个包含嘧啶-嘌呤碱基(YZ)的内部二核苷酸内部和紧邻至少一个包含嘧啶-嘌呤碱基(YZ)的内部二核苷酸出现磷酸二酯或磷酸二酯样核苷酸间键。YZ优选为YG,即包含嘧啶-鸟嘌呤碱基(YG)的二核苷酸。至少一个内部YZ二核苷酸自身具有磷酸二酯或磷酸二酯样核苷酸间键。紧邻至少一个内部YZ二核苷酸出现的磷酸二酯或磷酸二酯样核苷酸间键可以是至少一个内部YZ二核苷酸的5’、3’、或者5’和3’。优选地,紧邻至少一个内部YZ二核苷酸出现的磷酸二酯或磷酸二酯样核苷酸间键自身是内部核苷酸间键。因此,对于序列N1YZN2(其中N1和N2是相互独立的任何单核苷酸),该YZ二核苷酸具有磷酸二酯或磷酸二酯样核苷酸间键,另外,(a)当N1是内部核苷酸时,N1和Y通过磷酸二酯或磷酸二酯样核苷酸间键相连,(b)当N2是内部核苷酸时,Z和N2通过磷酸二酯或磷酸二酯样核苷酸间键相连,或者(c)当N1是内部核苷酸时,N1和Y通过磷酸二酯或磷酸二酯样核苷酸间键相连,并且当N2是内部核苷酸时,Z和N2通过磷酸二酯或磷酸二酯样核苷酸间键相连。
半软寡核苷酸是具有部分稳定骨架的免疫刺激寡核苷酸,其中只在至少一个包括嘧啶-嘌呤碱基(YZ)的内部二核苷酸内部出现磷酸二酯或磷酸二酯样核苷酸间键。相对于相应的完全稳定免疫刺激寡核苷酸来说,半软寡核苷酸通常具有增加的免疫刺激效力。例如,半软SEQ ID NO:35的免疫刺激效力是全硫代磷酸酯SEQ ID NO:34的2-5倍,这两个寡核苷酸具有相同的核苷酸序列,只是关于内部YZ核苷酸间键具有如下不同,其中*指示硫代磷酸酯,_指示磷酸二酯:
T*C_G*T*C_G*T*T*T*T_G*T*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T*T(SEQ ID NO:35)和
T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T(SEQ ID NO:34)。
SEQ ID NO:35掺入包括CG和TG(都是YZ)二核苷酸的内部磷酸二酯核苷酸间键。由于半软寡核苷酸的增强的效力,在很多实例中,半软寡核苷酸可以在较低的有效浓度使用,并且比常规的完全稳定的免疫刺激寡核苷酸具有较低的有效剂量以达到希望的生物效应。
除了在优选的内部位置的磷酸二酯或磷酸二酯样核苷酸间键外,本发明的寡核苷酸一般还包括抵抗降解的5’和3’末端。这种抵抗降解的末端可以包括任何适当修饰,其比相应未修饰末端产生对核酸外切酶消化的增强的抗性。例如,可以通过包括骨架的至少一个磷酸酯修饰使5’和3’末端稳定化。在一个优选的实施方案中,骨架在每个末端的至少一个磷酸酯修饰独立地是硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、磷酸乙酯或者甲基硫代磷酸酯核苷酸间键。在另一个实施方案中,抵抗降解的末端包括在3’末端通过肽或酰胺键连接的一个或多个核苷酸单元。包括但不限于下文所描述的其它稳定末端将会包括在本发明中。
如上文所描述,本发明的寡核苷酸包括在内部YZ二核苷酸内和任选地邻近内部YZ二核苷酸的磷酸二酯或磷酸二酯样键。这种YZ二核苷酸常常是免疫刺激基序的部分。然而,寡核苷酸有必要在每个免疫刺激基序内部包含磷酸二酯或磷酸二酯样键。
磷酸二酯核苷酸间键是自然界中发现的寡核苷酸特有的键类型。磷酸二酯核苷酸间键包括在侧面为两个桥连的氧原子,并且还与另外两个氧原子(一个是带电的,另一个是不带电的)相连的磷原子。当它在降低寡核苷酸的组织半衰期起重要作用时,尤其优选磷酸二酯核苷酸间键。
磷酸二酯样核苷酸间键是包含磷的桥连基,它在化学上和/或非对映异构类似于磷酸二酯。与磷酸二酯的相似性测量包括对核酸酶消化的敏感性和激活RNAse H的能力。因此,例如磷酸二酯(而不是硫代磷酸酯)寡核苷酸是对核酸酶消化敏感的,而磷酸二酯和硫代磷酸酯寡核苷酸都激活RNAse H。在一个优选的实施方案中,磷酸二酯样核苷酸间键是硼代膦酸酯(boranophosphate)(或者等同地硼代膦酸酯(boranophosphonate))键。美国专利号5,177,198;美国专利号5,859,231;美国专利号6,160,109;美国专利号6,207,819;Sergueev等人,(1998)J Am Chem Soc 120:9417-27。在另一个优选的实施方案中,磷酸二酯样核苷酸间键是非对映纯的Rp硫代磷酸酯。可以相信,与混合的或者非对映纯的Sp硫代磷酸酯相比,非对映纯的Rp硫代磷酸酯对核酸酶消化更敏感,并且能更好地激活RNAse H。应当注意,对于本发明的目的,术语“磷酸二酯样核苷酸间键”明确排除硫代磷酸酯和甲基膦酸酯核苷酸间键。
本发明的免疫刺激寡核苷酸分子可以具有嵌合骨架。对于本发明的目的,嵌合骨架是指部分稳定的骨架,其中至少一个核苷酸间键是磷酸二酯或磷酸二酯样的,并且其中至少一个核苷酸间键是稳定化的核苷酸间键,其中至少一个磷酸二酯或磷酸二酯样键和至少一个稳定化的键是不同的。由于已经报导硼代膦酸酯键相对于磷酸二酯键是稳定的,为了骨架的嵌合特性的目的,硼代膦酸酯键依赖于具体情况可以归类为磷酸二酯样或稳定化的。例如,按照本发明的嵌合骨架在一个实施方案中可以包括至少一个磷酸二酯(磷酸二酯或磷酸二酯样)键以及至少一个硼代膦酸酯(稳定化的)键。在另一个实施方案中,本发明的嵌合骨架可以包括硼代膦酸酯(磷酸二酯或磷酸二酯样)和硫代磷酸酯(稳定化的)键。“稳定化的核苷酸间键”是指与磷酸二酯核苷酸间键相比,更能抵抗体内降解(例如,通过外切或内切核酸酶)的核苷酸间键。优选的稳定化的核苷酸间键包括(但不限于)硫代磷酸酯,二硫代磷酸酯,甲基膦酸酯,磷酸乙酯和甲基硫代磷酸酯。其它的稳定化的核苷酸间键包括(但不限于):肽,烷基,脱磷酸和上文所描述的其它稳定化的核苷酸间键。
使用利用氨基磷酸酯或H-膦酸酯化学的自动化技术可以合成经修饰的骨架(如硫代磷酸酯)。可以按照如美国专利号4,469,863中所描述来制备芳基和烷基膦酸酯;可以使用可商购试剂通过自动化固相合成来制备烷基磷酸三酯(其中带电的氧部分按照美国专利号5,023,243和欧洲专利号092,574中所描述烷基化)。已经描述了进行其它DNA骨架修饰和替代的方法。Uhlmann E等人(1990)Chem Rev 90:544;Goodchild J(1990)Bioconjugate Chem 1∶165。制备嵌合寡核苷酸的方法也是已知的。例如,Uhlmann等人的专利描述了这种技术。
可以使用可商购的DNA合成仪和标准亚磷酰胺化学合成混合的骨架修饰的ODN。(F.E.Eckstein,″Oligonucleotides and Analogues-APractical Approach″IRL Press,Oxford,UK,1991,和M.D.Matteucci andM.H.Caruthers,Tetrahedron Lett. 21,719(1980))。在偶联之后,通过使用Beaucage试剂(R.P.Iyer,W.Egan,J.B.Regan and S.L.Beaucage,J. Am.Chem.Soc. 112,1253(1990))(乙腈中0.075M)或苯基乙酰基二硫化物(PADS)硫化,然后使用乙酸酐、2,6-二甲基吡啶在四氢呋喃中(1∶1∶8;v∶v∶v)和N-甲基咪唑(四氢呋喃中16%)帽化,从而引入PS键。在硫化反应之后进行这种帽化步骤以减少在硫代磷酸酯键的位置形成不需要的磷酸二酯(PO)键。在引入磷酸二酯键的情况下,例如在CpG二核苷酸处,通过用在水/吡啶中的碘溶液处理使中间产物三价磷氧化。在从固相支持体上剪切并通过用浓氨处理(在50℃处理15小时)最终脱保护之后,通过在Gen-PakFax柱(Millipore-Waters)上以NaCl梯度(例如乙腈/水中缓冲液A:10mMNaH2PO4=1∶4/v∶v pH 6.8;乙腈/水中缓冲液B:10mM NaH2PO4,1.5MNaCl=1∶4/v∶v;在30分钟内以流速1ml/min完成梯度5-60%B)通过HPLC或者毛细管凝胶电泳分析ODN。可以通过HPLC或者FPLC在Source High Performance柱(Amersham Pharmacia)上纯化ODN。合并HPLC同质级分,并通过C18柱或超滤脱盐。用MALDI-TOF质谱分析ODN以证实计算的质量。
本发明的寡核苷酸还可以包括其它修饰。这些修饰包括非离子DNA类似物,例如烷基-和芳基-磷酸酯(其中带电的膦酸酯氧被烷基或芳基取代),磷酸二酯和烷基磷酸三酯(其中带电的氧部分被烷基化)。在任一或两个末端包含二元醇(如四乙二醇或六乙二醇)的寡核苷酸还显示出充分抵抗核酸酶降解。
本发明的寡核苷酸是包含发现引起免疫应答的特异序列的核酸。引起免疫应答的这些特异序列被称作“免疫刺激基序”,包含免疫刺激基序的寡核苷酸被称作“免疫刺激核酸分子”和等同地“免疫刺激核酸”或“免疫刺激寡核苷酸”。因此本发明的免疫刺激寡核苷酸包括至少一个免疫刺激基序。在一个优选的实施方案中,免疫刺激基序是“内部免疫刺激基序”。术语“内部免疫刺激基序”是指基序序列在更长的寡核苷酸序列内的位置,所述寡核苷酸序列比基序序列长度至少长一个核苷酸,其与免疫刺激基序序列的5’和3’末端相连。
在本发明的一些实施方案中,免疫刺激寡核苷酸包括免疫刺激基序,其是“CpG二核苷酸”。CpG二核苷酸可以被甲基化或未甲基化。包含至少一个未甲基化CpG二核苷酸的免疫刺激寡核苷酸是包含未甲基化的胞嘧啶-鸟嘌呤二核苷酸序列(即,未甲基化5’胞嘧啶核苷接着与3’鸟嘌呤核苷通过磷酸酯键相连)并且激活免疫系统的寡核苷酸分子;这种免疫刺激寡核苷酸是CpG寡核苷酸。CpG寡核苷酸在很多公布的专利、公布的专利申请和其它出版物中有所描述,包括美国专利号6,194,388;6,207,646;6,214,806;6,218,371;6,239,116;和6,339,068。包含至少一个甲基化CpG二核苷酸的免疫刺激寡核苷酸是包含甲基化的胞嘧啶-鸟嘌呤二核苷酸序列(即,甲基化5’胞嘧啶核苷接着与3’鸟嘌呤核苷通过磷酸酯键相连)并且激活免疫系统的寡核苷酸。在其它实施方案中,免疫刺激寡核苷酸没有CpG二核苷酸。没有CpG二核苷酸的这些寡核苷酸被称作非CpG寡核苷酸,它们具有非CpG免疫刺激基序。因此,本发明还包括具有其它类型免疫刺激基序(可以被甲基化或未甲基化)的寡核苷酸。本发明的免疫刺激寡核苷酸还可以包括任何甲基化和未甲基化CpG和非CpG免疫刺激基序的任一组合。
关于CpG寡核苷酸,最近描述有不同类的CpG寡核苷酸。一类可以有效激活B细胞,但是在诱导IFN-α和NK细胞激活方面较弱;这一类被称作B类。B类CpG核酸一般是完全稳定的,并且在一些优选碱基环境中包括未甲基化CpG二核苷酸。参见,例如,美国专利号6,194,388;6,207,646;6,214,806;6,218,371;6,239,116;和6,339,068。另一类可有效诱导IFN-α和NK细胞激活,但是在激活B细胞方面较弱;这一类被称作A类。A类CpG核酸一般在5’和3’末端具有稳定化的poly-G序列和包含回文磷酸二酯CpG二核苷酸的至少6个核苷酸的序列。参见,例如,公布的专利申请PCT/US00/26527(WO 01/22990)。另一类CpG核酸激活B细胞和NK细胞,并诱导IFN-α,这一类被称为C类。如最初所表征的,C类CpG核酸一般是完全稳定的,包含B类型的序列和富含GC的回文序列或近似回文序列。这一类在共同待决的提交于2002年8月19日的美国专利申请US10/224,523中有所描述,此处引入全部内容作为参考。
因此,本发明在一个方面包括如下发现,即具有嵌合骨架的CpG免疫刺激寡核苷酸的特定亚类高效介导免疫刺激效应。这些CpG核酸可治疗和预防性用于刺激免疫系统,从而治疗癌症、感染性疾病、变态反应、哮喘、自身免疫病和其它病症,并帮助保护癌症化学治疗后的机会感染。这种来自CpG刺激的强烈而平衡的细胞和体液免疫应答反映了机体自身的抵抗入侵病原体和癌细胞的自然防御系统。
在一方面,本发明包括如下发现,即一亚类CpG免疫刺激寡核苷酸具有改良的免疫刺激性质和降低的肾脏炎性作用。在某些实例中,在已经施用完全硫代磷酸酯寡核苷酸的受试者中观察到肾脏炎症。认为此处所描述的嵌合寡核苷酸比完全硫代磷酸酯寡核苷酸引起更少的肾脏炎症。此外这些寡核苷酸可以高效刺激免疫应答。因此,分子的磷酸二酯区不会减少它的有效性。
提及寡核苷酸的核苷酸间键时所用的符号*是指存在稳定化的核苷酸间键。只要寡核苷酸包括至少2-3个磷酸二酯核苷酸间键,没有用*标记的核苷酸间键就可以是稳定的或不稳定的。在一些实施方案中,寡核苷酸优选包括3-6个磷酸二酯键。在某些实例中CG基序间的键是磷酸二酯,在其它实例中,它们是硫代磷酸酯或其它稳定的键。
提及寡核苷酸的核苷酸间键时所用的符号是指存在磷酸二酯核苷酸间键。
术语“核酸”和“寡核苷酸”还包括具有取代或修饰(如在碱基和/或糖中)的核酸或寡核苷酸。例如,它们包括具有在2’位共价结合到低分子量有机基团而不是羟基和在5’位不是磷酸基或羟基的骨架糖的寡核苷酸。因此经修饰寡核苷酸可以包括2’-O-烷基化核糖基团。此外,经修饰寡核苷酸可以包括诸如阿拉伯糖或2’-氟阿拉伯糖而不是核糖的糖。从而在骨架组成上寡核苷酸可以是异质的,从而含有结合在一起的聚合体单元的任何可能组合,如肽-核酸(具有具核酸碱基的氨基酸骨架)。
寡核苷酸还包括取代的嘌呤和嘧啶,如C-5丙炔嘧啶和7-脱氮-7-取代的嘌呤修饰的碱基。Wagner R W等人(1996)Nat Biotechnol 14:840-4。嘌呤和嘧啶包括(但不限于)腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-羟基胞嘧啶、5-氟胞嘧啶、2-氨基嘌呤、2-氨基-6-氯嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、次黄嘌呤,以及其它具有取代和非取代的芳香部分的天然和非天然发生的核碱基。其它的这种修饰对于本领域的技术人员来说是众所周知的,下文描述了很多这种修饰。
与天然的RNA和DNA相比,本发明的免疫刺激寡核苷酸可以包括多种化学修饰和取代,包括磷酸二酯核苷酸间桥、β-D-核糖单元和/或非天然核苷酸碱基(腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶)。化学修饰的实例对于本领域的技术人员来说是众所周知的,并且描述于Uhlmann E etal.(1990)Chem Rev 90:543;“Protocols for Oligonucleotides and Analogs”Synthesis and Properties&Synthesis and Analytical Techniques,S.Agrawal,Ed,Humana Press,Totowa,USA 1993;Crooke ST et al.(1996)Annu Rev Pharmacol Toxicol 36:107-129;和Hunziker J et al.(1995)ModSynth Methods 7:331-417。按照本发明的寡核苷酸可以具有一种或多种修饰,其中与由天然DNA或RNA所组成的相同序列的寡核苷酸相比,每种修饰位于特定的磷酸二酯核苷酸间桥和/或位于特定的β-D-核糖单元和/或位于特定的天然核苷酸碱基位置。
例如,本发明涉及可以包含一种或多种修饰的寡核苷酸,其中每种修饰独立地选自:
a)用修饰的核苷酸间桥取代位于核苷酸3’和/或5’末端的磷酸二酯核苷酸间桥,
b)用脱磷酸桥取代位于核苷酸3’和/或5’末端的磷酸二酯桥,
c)用另一个单元取代糖磷酸骨架中的糖磷酸单元,
d)用经修饰的糖单元取代β-D-核糖单元,
e)用经修饰的核苷酸碱基取代天然核苷酸碱基。
寡核苷酸化学修饰的更详细的实例如下。
可以用经修饰的核苷酸间桥取代位于核苷酸3’和/或5’末端的磷酸二酯核苷酸间桥,其中经修饰核苷酸间桥选自诸如硫代磷酸酯、磷酸乙酯、二硫代磷酸酯、NR1R2-氨基磷酸酯、硼代膦酸酯、α-羟基苄基膦酸酯、磷酸-(C1-C21)-O-烷基酯、磷酸-[(C6-C12)芳基-(C1-C21)-O-烷基]酯、(C1-C8)烷基膦酸酯和/或(C6-C12)芳基膦酸酯桥、(C7-C12)-α-羟基甲基-芳基(例如,公开于WO 95/01363),其中(C6-C12)芳基、(C6-C20)芳基和(C6-C14)芳基可被卤素、烷基、烷氧基、硝基、氰基任选取代,并且R1和R2互相独立地是氢、(C1-C8)烷基、(C6-C20)-芳基、(C6-C14)-芳基-(C1-C8)-烷基,优选氢、(C1-C8)烷基,优选(C1-C4)-烷基和/或甲氧基乙基,或者R1和R2与携带它们的氮原子一起形成5-6元杂环,其可以进一步包含选自基团O,S,和N的额外杂原子。
用脱磷酸桥(例如,脱磷酸桥描述于Uhlmann E和Peyman A,″Methods in Molecular Biology″,Vol.20,″Protocols for Oligonucleotidesand Analogs″,S.Agrawal,编辑,Humana出版社,Totowa 1993,第16章,pp.355 ff)取代位于核苷酸3’和/或5’末端的磷酸二酯桥,其中脱磷酸桥例如选自脱磷酸桥甲缩醛(formacetal)、3’-硫代甲缩醛(3′-thioformacetal)、甲基羟胺、肟、亚甲基二甲基-1,2-亚肼基、二亚甲基砜和/或甲硅烷基。
可以用另一个单元取代糖磷酸骨架(即,糖磷酸骨架由糖磷酸单元组成)中的糖磷酸单元(即,β-D-核糖和磷酸二酯核苷酸间桥共同形成糖磷酸单元),其中另一个单元(例如)适合建立″吗啉代衍生物″寡聚体(如StirchakEP等人(1989)Nucleic Acids Res 17:6129-41中所描述的),即,用吗啉代衍生物单元取代;或者增加聚酰胺核酸(″PNA″;如Nielsen PE等人(1994)Bioconjug Chem 5:3-7中所描述的),即,用PCA骨架单元(如2-氨基乙基甘氨酸)取代。
可以用经修饰的糖单元取代β-核糖单元或者β-D-2’-脱氧核糖单元,其中经修饰的糖单元诸如选自β-D-核糖、α-D-2’-脱氧核糖、L-2’-脱氧核糖、2’-F-2’-脱氧核糖、2’-F-阿拉伯糖、2’-O-(C1-C6)烷基-核糖,2’-O-(C1-C6)烷基-核糖优选为2’-O-甲基核糖、2’-O-(C2-C6)链烯基-核糖、2’-[O-(C1-C6)烷基-O-(C1-C6)烷基]-核糖、2’-NH2-2’-脱氧核糖、β-D-呋喃木糖,α-阿拉伯呋喃糖,2,4-二脱氧-β-D-赤型-吡喃己糖和碳环的(如Froehler J(1992)AmChem Soc 114:8320中所描述的)和/或开链糖类似物(如Vandendriessche等人,(1993)Tetrahedron 49:7223中所描述的)和/或二环糖类似物(如Tarkov M等人,(1993)Helv Chim Acta 76:481中所描述的)。
在一些实施方案中,糖为2’-O-甲基核糖,尤其是由磷酸二酯或磷酸二酯样核苷酸间键所连接的一个或两个核苷酸。
寡核苷酸还包括取代的嘌呤和嘧啶,例如C-5丙炔嘧啶和7-脱氮-7-取代的嘌呤修饰的碱基。Wagner R W等人(1996)Nat Biotechnol14:840-4。嘌呤和嘧啶包括(但不限于)腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤和胸腺嘧啶,以及其它具有取代和非取代的芳香部分的天然和非天然发生的核碱基。
经修饰的碱基为化学上不同于一般在DNA和RNA中发现的天然存在的如T、C、G、A和U碱基的任意碱基,但其具有这些天然存在的碱基的基本化学结构。经修饰的核苷酸碱基为选自于如次黄嘌呤、尿嘧啶、二氢尿嘧啶、假尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-氨基尿嘧啶、5-(C1-C6)-烷基尿嘧啶、5-(C2-C6)-烯基尿嘧啶、5-(C2-C6)-炔基尿嘧啶、5-(羟甲基)尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羟基胞嘧啶、5-(C1-C6)-烷基胞嘧啶、5-(C2-C6)-烯基胞嘧啶、5-(C2-C6)-炔基胞嘧啶、5-氯胞嘧啶、5-氟胞嘧啶、5-溴胞嘧啶、N2-二甲基鸟嘌呤、2,4-二氨基嘌呤、8-杂氮嘌呤、经取代的7-脱氮嘌呤,优选地为7-脱氮-7-取代和/或7-脱氮-8-取代的嘌呤、5-羟甲基胞嘧啶、如N4-乙基胞嘧啶的N4-烷基胞嘧啶、5-羟基脱氧胞苷、5-羟甲基脱氧胞苷、如N4-乙基脱氧胞苷的N4-烷基脱氧胞苷、6-硫代脱氧鸟苷和硝基吡咯的脱氧核糖核苷酸、C5-丙炔嘧啶,和如2,6-二氨基嘌呤的二氨基嘌呤、次黄苷、5-甲基胞嘧啶、2-氨基嘌呤、2-氨基-6-氯嘌呤、次黄嘌呤或其它天然核苷酸碱基的修饰。该列表仅作示例,并不是解释为限制。
在此处所描述的特定的公式中定义了一组经修饰的碱基。例如使用字母Y来表示包含胞嘧啶或经修饰的胞嘧啶的核苷酸。此处所用的经修饰胞嘧啶是胞嘧啶的自然产生或非自然产生的嘧啶碱基类似物,它可取代该碱基而不损害寡核苷酸的免疫刺激活性。经修饰的胞嘧啶包括但不限于5-取代的胞嘧啶(例如5-甲基胞嘧啶、5-氟胞嘧啶、5-氯胞嘧啶、5-溴胞嘧啶、5-碘胞嘧啶、5-羟基胞嘧啶、5-羟甲基胞嘧啶、5-二氟甲基胞嘧啶和未取代或取代的5-炔基胞嘧啶)、6-取代的胞嘧啶、N4-取代的胞嘧啶(如N4-乙基胞嘧啶)、5-氮杂胞嘧啶、2-巯基胞嘧啶、异胞嘧啶(isocytosine)、假异胞嘧啶、具有稠环系统的胞嘧啶类似物(如N,N’-丙烯胞嘧啶或吩噁嗪),以及尿嘧啶和它的衍生物(如5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-溴乙烯基尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-羟基尿嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶)。某些优选的胞嘧啶包括5-甲基胞嘧啶、5-氟胞嘧啶、5-羟基胞嘧啶、5-羟甲基胞嘧啶和N4-乙基-胞嘧啶。在本发明的另一个实施方案中,用通用碱基(如3-硝基吡咯、P-base)、芳环系统(如氟代苯或二氟代苯)或氢原子(dSpacer)取代胞嘧啶碱基。
所用的字母Z是指鸟嘌呤或经修饰的鸟嘌呤碱基。此处所用的经修饰的鸟嘌呤是鸟嘌呤的自然产生或非自然产生的嘌呤碱基类似物,它可以取代该碱基而不损害寡核苷酸的免疫刺激活性。经修饰的鸟嘌呤包括(但不限于)7-脱氮鸟嘌呤、7-脱氮-7-取代的鸟嘌呤(如7-脱氮-7-(C2-C6)炔基鸟嘌呤)、7-脱氮-8-取代的嘌呤、次黄嘌呤、N2-取代的鸟嘌呤(如N2-甲基-鸟嘌呤)、5-氨基-3-甲基-3H,6H-噻唑并[4,5-d]嘧啶-2,7-二酮、2,6-二氨基嘌呤、2-氨基嘌呤、嘌呤、吲哚、腺嘌呤、取代的腺嘌呤(如N6-甲基腺嘌呤、8-氧代腺嘌呤)、8-取代的鸟嘌呤(如8-羟基鸟嘌呤和8-溴鸟嘌呤)和6-硫鸟嘌呤。在本发明的另一个实施方案中,用通用碱基(如4-甲基吲哚、5-硝基吲哚和K-base)、芳环系统(如苯并咪唑或二氯苯并咪唑、1-甲基-1H-[1,2,4]三唑-3-羧酸酰胺)或氢原子(dSpacer)取代鸟嘌呤碱基。
寡核苷酸可以具有一个或多个易接近的5’末端。可以产生具有两个这种5’末端的经修饰的寡核苷酸。例如,这可以通过3’-3’键连接两个寡核苷酸以产生具有一个或两个易接近的5’末端的寡核苷酸实现。3’-3′键可为磷酸二酯、硫代磷酸酯或其它经修饰的核苷酸间键。领域内公知实现这种键的方法。例如,在Seliger,H.;等人,作为病毒基因表达的反义抑制剂的具有3′-3′-和5′-5′-末端的核苷酸间键的寡核苷酸类似物(Oligonucleotideanalogs with terminal 3′-3′-and 5′-5′-internucleotidic linkages as antisenseinhibitors of viral gene expression),Nucleotides&Nucleotides(1991),10(1-3),469-77和Jiang,等人,假环寡核苷酸:体外与体内特性(Pseudo-cyclic oligonucleotides:in vitro and in vivo properties),生物有机化学与药物化学(Bioorganic&Medicinal Chemistry),1999,7(12),2727-2735中已描述了这种键。
还可以用氨基取代这种寡核苷酸的易接近5’和3’末端。氨基包括(但不限于)氨基己基残基。
此外,在3′末端核苷酸之间的键不是磷酸二酯、硫代磷酸酯或其它经修饰的键时,可使用其它间隔基如三或四-乙二醇磷酸酯制备3’3’-连接的寡核苷酸,(Durand,M.等人,由包含通过两个六乙二醇链桥接的一个(dA)12和两个(dT)12序列的寡核苷酸形成的三螺旋(Triple-helix formation by anoligonucleotide containing one(dA)12and two(dT)12sequences bridgedby two hexaethylene glycol chains),生物化学(Biochemistry),1992,31(38),9197-204,美国专利号5658738和美国专利号5668265)。可选地,应用标准亚磷酸氨化学法,非核苷酸键可源自于乙二醇、丙二醇或源自于无碱基脱氧核糖(dSpacer)单元(Fontanel,Marie Laurence等人,由T4多聚核苷酸激酶在空间上识别连接到寡核苷酸5′端上的非核苷酸部分(Stericalrecognition by T4polynucleotide kinase of non-nucleosidic moieties 5′-attached to oligonucleotides),核酸研究(Nucleic Acids Research),1994,22(11),2022-7)。可掺入非核苷酸接头一次或多次,或相互结合,以允许待连接的两个ODN的3′末端间的任意期望长度。
对于在本发明中的应用,可使用领域内公知的众多方法中的任意一个方法从头合成本发明的寡核苷酸。例如,b-氰乙基亚磷酰胺法(Beaucage,S.L.和Caruthers,M.H.,Tet.Let.22:1859,1981);和核苷酸H-膦酸酯法(Garegg等人,Tet.Let.27:4051-4054,1986;Froehler等人,Nucl.Acid.Res.14:5399-5407,1986;Garegg等人,Tet.Let.27:4055-4058,1986;Gaffney等人,Tet.Let.29:2619-2622,1988)。通过市场上可获得的多种自动化核酸合成仪进行这些化学法。将这些寡核苷酸称为合成的寡核苷酸。分离的寡核苷酸通常指从那些在自然界中通常与其结合的组合物中分离的寡核苷酸。例如,分离的寡核苷酸可以是从细胞、细胞核、线粒体或染色体中分离出来的寡核苷酸。
根据本发明,已经发现了本文所述的CpG免疫刺激性寡核苷酸子集对人细胞,如NK细胞,具有显著的免疫刺激效应,表明这些CpG免疫刺激性寡核苷酸对人接种疫苗、癌免疫治疗、哮喘免疫治疗、免疫功能的全面提高、放疗或化疗后造血恢复的提高、自身免疫病和其它免疫调节应用为有效的治疗剂。
因此,在本发明的一些方面,这种CpG免疫刺激寡核苷酸可用作治疗如下受试者的疫苗,这些受试者有发展为变态反应或哮喘、被感染性生物感染或者已鉴定到特异性癌症抗原的癌症的风险。在没有防止感染性疾病、变态反应或癌症的抗原或变应原的情况下也可以给予CpG免疫刺激寡核苷酸,在这种情况下,重复剂量可以允许更长时间的保护。此处所用的在危险中的受试者是指具有任何接触引发感染的病原体或癌症或变应原或患癌症风险的受试者。例如,在危险中的受试者可以是计划到发现具有特定类型感染物的区域旅行的受试者,或者通过生活方式或医疗程序接触到包含感染性生物体的体液或者直接接触到生物体的受试者,或者甚至是生活在已经鉴定到感染性生物体或变应原的区域的任何受试者。处于发生感染风险的受试者还包括医疗机构推荐用特定感染性生物体抗原接种的一般群体。如果抗原是变应原,并且受试者对那种特定抗原产生变态反应,并且受试者可能接触到抗原(如在花粉季节),那么受试者处于接触到抗原的风险。处于发生变态反应或哮喘风险的受试者包括已经鉴定到具有变态反应或哮喘但是在CpG免疫刺激寡核苷酸治疗过程中没有活动性疾病的那些受试者,以及由于遗传或环境因素从而认为具有发生这些疾病风险的受试者。
具有患癌症风险的受试者是指具有患癌症的高概率的受试者。这些受试者包括,例如,具有遗传异常的受试者,遗传异常的的存在已证实与高概率地患癌症相关,以及接触到引发癌症物质(如烟草、石棉或者其它化学毒素)的受试者,或者先前进行癌症治疗并且明显缓解的受试者。当用对受试者具有威胁的癌症类型特异性抗原和CpG免疫刺激寡核苷酸治疗具有发生癌症风险的受试者时,受试者可以在癌细胞发展的过程中杀死它们。如果在受试者中开始形成肿瘤,那么受试者将会对肿瘤抗原产生特异性免疫应答。
除了CpG免疫刺激寡核苷酸在预防性治疗中的用途,本发明还包括CpG免疫刺激寡核苷酸在治疗具有感染、变态反应、哮喘或癌症的受试者中的用途。
具有感染的受试者是指已经接触到感染性病原并且在体内具有急性或慢性可检测水平的病原体的受试者。CpG免疫刺激寡核苷酸可以与抗原或者不与抗原一起使用,从而引起抗原特异性全身或粘膜免疫应答,从而能够降低感染性病原体的水平或者根除感染性病原体。此处所用的感染性疾病是由于在体内存在外源性微生物所引起的的疾病。开发有效的疫苗策略和治疗以保护身体的粘膜表面(它是病原进入的主要部位)是尤为重要的。
患有变态反应的受试者为对变应原具有或处于变态反应危险的受试者。变态反应指对物质的获得性超敏(如对变应原)。变态反应包括但不限于湿疹、过敏性鼻炎或伤风、枯草热、结膜炎、支气管哮喘、风疹(麻疹)和食物变态反应,以及其它遗传性变态反应。
变态反应通常是由IgE抗体产生的对抗无害变应原而引起。由全身或粘膜施用CpG免疫刺激性寡核苷酸而诱导出的细胞因子主要是称为Th1类的细胞因子(实例为IL-12、IP-10、IFN-α和IFN-γ),且这些细胞因子诱导体液和细胞免疫反应。免疫反应的其它主要类型,其与IL-4和IL-5细胞因子的产生有关,称为Th2免疫反应。通常变应性疾病似乎是由Th2型免疫反应介导的。基于CpG免疫刺激性寡核苷酸在受试者体内将主要为Th2的免疫反应(其与IgE抗体和变态反应的产生有关)转换成平衡的Th2/Th1反应(其保护抗变态反应)的能力,可对受试者施用诱导免疫反应的有效剂量的CpG免疫刺激性寡核苷酸,以治疗或预防哮喘和变态反应。
因此,CpG免疫刺激性寡核苷酸对治疗如哮喘的变态和非变态反应具有显著的治疗作用。在患哮喘症患者呼吸道中,Th2细胞因子,特别是IL-4和IL-5增多。这些细胞因子促进哮喘炎性反应的重要方面,包括IgE同种型转换、嗜酸性粒细胞趋化性和活化作用以及肥大细胞生长。Th1细胞因子,特别是IFN-γ和IL-12,可以抑制Th2克隆的形成以及Th2细胞因子的产生。哮喘指呼吸系统紊乱,其特征在于发炎、呼吸道紧缩以及呼吸道对吸入剂增强的反应。哮喘通常,尽管不是专有的,与遗传性变态反应或变态反应有关。
患癌受试者为具有可检测到的癌细胞的受试者。癌可为恶性或非恶性癌。癌或肿瘤包括但不限于胆管癌;脑癌;乳癌;宫颈癌;绒毛膜癌;结肠癌;子宫内膜癌;食道癌;胃癌;上皮内瘤;淋巴瘤;肝癌;肺癌(即小细胞和非小细胞);黑素瘤;成神经细胞瘤;口腔癌;卵巢癌;胰腺癌;前列腺癌;直肠癌;肉瘤;皮肤癌;睾丸癌;甲状腺癌;和肾脏癌症,以及其它癌和肉瘤。在一个实施方案中,癌症为毛细胞白血病、慢性骨髓瘤白血病、皮肤T细胞白血病、多发性骨髓瘤、囊泡淋巴瘤、恶性黑素瘤、扁平上皮癌、肾脏细胞癌、前列腺癌、膀胱细胞癌或者结肠癌。
受试者为人或脊椎动物,包括但不限于狗、猫、马、牛、猪、绵羊、山羊、火鸡、鸡、如猴子的灵长类动物和如鲑鱼的鱼(水产养殖种类)。因此,本发明也可应用于治疗非人受试者的癌和肿瘤、传染病,和变态反应/哮喘。癌症为伴侣动物(即猫和狗)的主要致死原因之一。
此处所用的术语治疗,当与疾病,如传染病、癌、变态反应或哮喘相关时,是指预防性治疗,其增强了受试者对产生疾病的抵抗(如抵抗病原体感染),或者换句话说,降低受试者体内出现疾病的可能性(如变成病原体感染),以及指在受试者已患疾病后为战胜疾病(如降低或消除感染)或避免疾病恶化而进行的治疗。
当CpG寡核苷酸与抗原施用时,受试者就可能暴露于抗原。此处所用的术语暴露于是指在体内用抗原主动接触受试者的步骤或使受试者被动暴露于抗原。领域内熟知使受试者主动暴露于抗原的方法。一般而言,通过如静脉内、肌内、口、皮肤、粘膜、鼻内、气管内或皮下给药的手段直接施用抗原给受试者。可全身或局部地施用抗原。下面更详细地描述施用抗原和CpG免疫刺激性寡核苷酸的方法。若抗原在体内变得暴露于免疫细胞,则受体为被动暴露于抗原。例如,通过外源病原体进入体内或通过肿瘤细胞在其表面表达外源抗原的发展,则受试者可被动暴露于抗原。
受试者被动暴露于抗原的方法特别地取决于施用CpG免疫刺激性寡核苷酸的时间安排。例如,处于患癌或传染病或变态反应或哮喘反应危险的受试者中,在危险最大时,即在变态反应季节或暴露于致癌药之后,可周期地给受试者施用CpG免疫刺激性寡核苷酸。此外,在旅行者去处于暴露于感染源的危险的外地旅行前,对其施用CpG免疫刺激性寡核苷酸。同样地,可对处于暴露于生化战争的士兵或平民施用CpG免疫刺激性寡核苷酸,当且如果受试者暴露于抗原,以诱导系统或粘膜对抗原的免疫反应。
此处所用的抗原为能激发免疫反应的分子。抗原包括但不限于细胞、细胞提取物、蛋白质、多肽、肽、多糖、多糖缀合物、多糖与其它分子的肽和非肽模拟物、小分子、脂、糖脂、糖、病毒与病毒提取物和多细胞生物体,如寄生虫和变应原。术语抗原广泛地包括任意类型的能由宿主免疫系统识别成外源物的分子。抗原包括但不限于癌抗原、微生物抗原和变应原。
此处所用的癌抗原为一种与肿瘤或癌细胞表面相关的并与MHC分子在抗原呈递细胞表面表达时能激发免疫反应的化合物,如肽或蛋白质。可通过如在Cohen等人,1994,癌症研究(Cancer Research),54:1055中所描述制备癌细胞的粗提取物、通过部分地纯化抗原、通过重组技术或通过从头合成已知抗原,从癌细胞制备癌抗原。癌抗原包括但不限于那些重组表达的、免疫原部分的或整个肿瘤或癌的抗原。可通过重组或任意其它领域内已知手段分离或制备这些抗原。
此处所用的微生物抗原为微生物的抗原,且包括但不限于病毒、细菌、寄生虫和真菌。这些抗原包括完整的微生物以及自然分离株和其片段或衍生物,且也包括与天然微生物抗原相同或相似的并诱导对该微生物特异的免疫反应的合成化合物。若化合物诱导响应天然微生物抗原的免疫(体液的和/或细胞的),则该化合物与天然微生物抗原相似。本领域常用这些抗原,且本领域技术人员熟知这些抗原。
人体中发现的病毒实例包含(但不限于):逆录病毒科(Retroviridae)(例如,人类免疫缺陷病毒,如HIV-1(也称作HDTV-III,LAVE或HTLV-III/LAV,或HIV-III;和其它分离株,例如HIV-LP)、小RNA病毒科(Picornaviridae)(例如脊髓灰质炎病毒、甲型肝炎病毒、肠道病毒、人柯萨奇病毒、鼻病毒、艾柯病毒)、Calciviridae(例如引起肠胃炎的株)、披膜病毒科(Togaviridae)(例如马脑炎病毒、风疹病毒)、黄病毒科(Flaviridae)(例如登革热病毒、脑炎病毒、黄热病毒)、冠状病毒科(Coronoviridae)(例如冠状病毒)、弹状病毒科(Rhabdoviradae)(例如疱疹性口炎病毒、狂犬病毒)、纤丝病毒科(Filoviridae)(例如埃博拉病毒)、副粘液病毒科(Paramyxoviridae)(例如副流感病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒、呼吸道合胞病毒)、正粘液病毒科(Orthomyxoviridae)(例如流感病毒)、布尼亚病毒科(Bungaviridae)(例如汉滩病毒、bunga病毒、白蛉病毒和内罗病毒)、沙粒病毒科(Arena viridae)(例如出血热病毒)、呼肠孤病毒科(Reoviridae)(例如呼肠病毒、环状病毒、轮状病毒)、双RNA病毒科、肝DNA病毒科(乙型肝炎病毒)、细小病毒科(Parvovirida)(例如细小病毒)、乳多空病毒科(Papovaviridae)(乳头瘤病毒、多瘤病毒)、腺病毒科(Adenoviridae)(大多数腺病毒)、疱疹病毒科(Herpesviridae)(例如单纯性疱疹病毒(HSV)1和2、水痘-带状疱疹病毒、细胞巨化病毒(CMV)、疱疹病毒、痘病毒科(Poxviridae)(类天花病毒、痘苗病毒、痘病毒)、虹彩病毒科(Iridoviridae)(例如非洲猪瘟病毒)和未分类的病毒(例如丁型肝炎病毒因子(被认为是乙型肝炎病毒的缺陷卫星)、非甲肝、非乙肝因子(类1=内传播;类2=肠胃外传播(即丙型肝炎)、Norwalk及相关病毒和星状病毒)。
革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌在脊椎动物中作为抗原。这种革兰氏阳性细菌包括(但不限于)巴斯德菌属、葡萄球菌属和链球菌属的种。革兰氏阴性细菌包括(但不限于)大肠杆菌、假单胞菌属和沙门氏菌属。感染性细菌的特定实例包括(但不限于)幽门螺旋杆菌、Borelia burgdorferi、嗜肺军团菌、分枝杆菌(例如肺结核分枝杆菌、鸟分枝杆菌、胞内分枝杆菌、M.kansaii、戈登分枝杆菌)、金黄色葡萄球菌、淋病奈瑟菌、脑膜炎奈瑟菌、单核细胞增生利斯特菌、化脓性链球菌(A组链球菌属)、无乳链球菌(B组链球菌属)、链球菌(草绿色链球菌属)、粪链球菌、牛链球菌、链球菌(厌氧链球菌属)、肺炎链球菌、病原弯曲杆菌属、肠球菌属、流感嗜血杆菌、炭疽芽孢杆菌、白喉杆菌、棒杆菌属、猪红斑丹毒丝菌、Clostridiumperfringers、破伤风梭菌、产气肠杆菌、肺炎克雷伯杆菌、多杀性巴氏杆菌、类杆菌属、具核梭杆菌、念珠状链杆菌、苍白密螺旋体、细弱密螺旋体、钩端螺旋体、立克次氏体和Actinomyces israelli。
真菌的实例包括新型隐球酵母(Cryptococcus neoformans)、荚膜组织胞浆菌(Histoplasma capsulatum)、粗球孢子菌(Coccidioides immitis)、皮炎芽生菌(Blastomyces dermatitidis)、沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)和白色念珠菌(Candida albicans)。
其它感染性生物体(例如原生生物)包括疟原虫,例如恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)、三日疟原虫(Plasmodium malariae)、卵形疟原虫(Plasmodium ovale)、间日疟原虫(Plasmodium vivax)和鼠弓形体(Toxoplasma gondii)。血生和/或组织寄生虫包括疟原虫、果氏巴贝虫(Babesia microti)、分歧巴贝虫(Babesia divergens)、热带利什曼原虫(Leishmania tropica)、利什曼原虫、巴西利什曼原虫(Leishmaniabraziliensis)、杜氏利什曼原虫(Leishmania donovani)、冈比亚锥虫(Trypanosoma gambiense)和罗德西亚锥虫(Trypanosoma rhodesiense)(非洲昏睡病)、克氏锥虫(查加斯病)和鼠弓形体。
其他医药相关的微生物体在文献中已被广泛报道,例如,参见C.G.AThomas,Medical Microbiology,Bailliere Tindall,Great Britain 1983,在此处引入其全部内容作为参考。
变应原指在易感患者体内诱导变态反应或哮喘反应的物质(抗原)。变应原数量庞大并可包括花粉、昆虫毒素、动物皮屑、真菌孢子和药物(如青霉素)。天然动物和植物变应原的例子包括但不限于对下列特种特异的蛋白质:犬属(Canine)(犬(Canisfamiliaris));螨(Dermatophagoides)(如粉尘螨(Dermatophagoides farinae));猫(Felis)(家猫(Felis domesticus));豚草属(Ambrosia)(美洲豚草(Ambrosia artemiisfolia));黑麦草属(Lolium)(如黑麦草(Lolium perenne)或多花黑麦草(Lolium multiflorum));柳杉(Cryptomeria)(日本柳杉(Cryptomeria japonica));链格孢属(Alternaria)(链格孢菌(Alternaria alternata));Alder;Alnus(Alnus gultinoasa);桦木属(Betula)(瘤桦(Betula verrucosa));栎属(Quercus)(白橡(Quercus alba));木犀榄属(Olea)(橄榄树(Olea europa));Artemisia(Artemisia vulgaris);车前属(Plantago)(如长叶车前(Plantago lanceolata));墙草属(Parietaria)(如弱墙草(Parietaria officinalis)或Parietaria judaica);Blattella(如Blattellagermanicd);Apis(如Apis multiflorum);柏木属(Cupressus)(如地中海柏(Cupressus sempervirens)、绿干柏(Cupressus arizonica)和大果柏(Cupressus macrocarpa));刺柏属(Juniperus)(如Juniperus sabinoides,弗吉尼亚桧(Juniperus virginiana)、欧洲刺柏(Juniperus communis)和Juniperus ashei);金钟柏(Thuya)(如侧柏(Thuya orientalis));扁柏属(Chamaecyparis)(如日本扁柏(Chamaecyparis obtusa));大蠊属(Periplaneta)(如美国大蠊(Periplaneta americana));冰草属(Agropyron)(如冰草(Agropyron repens));黑麦属(Secale)(如黑麦(Secale cereale));小麦属(Triticum)(如小麦(Triticum aestivum));鸭茅属(Dactylis)(如鸭茅(Dactylisglomerata));狐茅属(Festuca)(如高狐茅(Festuca elatior));早熟禾属(Poa)(如早熟禾(Poa pratensis)或加拿大早熟禾(Poa compressa));燕麦属(Avena)(如燕麦(Avena sativa));绒毛草属(Holcus)(如绒毛草(Holcuslanatus));黄花茅属(Anthoxanthum)(如日本黄花茅(Anthoxanthumodoratum));燕麦草属(Arrhenatherum)(如燕麦草(Arrhenatherumelatius));剪股颍属(Agrostis)(如小糠草(Agrostis alba));猫尾草属(Phleum)(如梯牧草(Phleum pratense));萌草属(Phalaris)(如草芦(Phalarisarundinacea));雀稗属(Paspalum)(如百喜草(Paspalum notatum));高粱属(Sorghum)(如假高粱(Sorghum halepensis));和雀麦属(Bronms)(如无芒雀麦(Bromus inermis)。
此处所用的术语基本上纯化指基本上从其它蛋白质、脂、糖或其它物质分离出与其天然相关联的多肽。本领域内技术人员应用蛋白质纯化的标准技术能纯化病毒或细菌多肽。基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上通常只有一条主要条带。在部分糖基化的多肽或那些具有几个起始密码子的多肽的情况下,在非还原聚丙烯酰胺凝胶上可能有几条带,但这些带会形成与多肽的带明显不同的模式。也可通过氨基末端氨基酸序列分析法检测病毒或细菌的多肽的纯度。本发明包括其它类型的不由核酸载体编码的抗原,如多糖、小分子、模拟物等。
本发明的寡核苷酸可与抗微生物剂一起施用于受试者。此处所用的抗微生物剂指天然存在的或合成的能杀死或抑制感染性微生物的化合物。根据本发明,有益的抗微生物剂类型依赖于受试者感染的或处于感染危险的微生物类型。抗微生物剂包括但不限于抗细菌剂、抗病毒剂、抗真菌剂和抗寄生剂。本领域内技术人员已充分确定了如“抗感染药”、“抗细菌剂”、“抗病毒剂”、“抗真菌剂”、“抗寄生虫剂”和“驱虫剂”短语的含义,并在标准医学教科书中进行了定义。简而言之,抗细菌剂杀死或抑制细菌,且包括抗生素和其它合成的或天然的具有相似功能的化合物。抗生素为由细胞如微生物在次级代谢时产生的低分子量分子。通常,抗生素干扰一个或多个对微生物特异的而在宿主细胞内不存在的细菌功能或结构。抗病毒剂可从天然原料中分离或合成,并可用于杀死或抑制病毒。抗真菌剂用于治疗浅表真菌感染,以及条件致病性的和原发性系统真菌感染。抗寄生虫剂杀死或抑制寄生虫。
抗寄生虫剂,对人施用的也称为驱虫剂,包括但不限于阿苯达唑、两性霉素B、苄硝唑、硫双二氯酚、盐酸氯喹、磷酸氯喹、氯林肯霉素、去氢吐根碱、乙胺嗪、二氯尼特糠酸酯、依氟鸟氨酸、furazolidaone、糖皮质激素、卤泛群、双碘喹啉、伊维菌素、甲苯咪唑、甲氟喹、葡甲胺锑酸盐、美拉胂醇、美曲磷酯、甲硝哒唑、氯硝柳胺、硝呋莫司、奥沙尼喹、巴龙霉素、异硫代羟酸五脒、哌嗪、吡喹酮、磷酸普奈马奎、双羟萘酸噻嘧啶、乙胺嘧啶磺酰胺类(pyrimethanmine-sulfonamides)、乙胺嘧啶-磺胺多辛、盐酸奎纳克林,硫酸奎宁、葡萄糖酸奎尼丁、螺旋霉素、锑酰葡糖酸钠(葡糖酸钠锑)、苏拉明、四环素、强力霉素、涕必灵、替硝唑、三甲氧苄氨嘧啶-磺胺甲基噁唑(trimethroprim-sulfamethoxazole)和锥虫胂胺,这些药物可单独使用或与其它药物联用。
抗细菌剂杀死或抑制细菌的生长或功能。一大类抗微生物剂为抗生素。有效杀死或抑制大范围细菌的抗生素指广谱抗生素。抗生素的其它类型主要有效地抗革兰氏阳性或革兰氏阴性类细菌。这些类型的抗生素称为窄谱抗生素。有效抗单一生物或疾病且不抗其它类型细菌的其它抗生素,称为受限谱抗生素。有时根据抗细菌剂的主要作用模式而对其分类。通常,抗细菌剂为细胞壁合成抑制剂、细胞膜抑制剂、蛋白质合成抑制剂、核酸合成或功能抑制剂、和竞争性抑制剂。
抗病毒剂为预防病毒感染细胞或病毒在细胞内复制的化合物。抗病毒剂比抗细菌剂要少许多,因为在宿主细胞内病毒复制的过程与DNA复制如此相近,以至于非特异抗病毒剂对宿主常常有毒。在病毒感染过程中有几个步骤可由抗病毒剂阻断或抑制。这些步骤包括:病毒贴附宿主细胞(免疫球蛋白或结合肽)、病毒脱壳(如金刚烷胺)、病毒mRNA的合成或翻译(如干扰素)、病毒RNA或DNA的复制(如蛋白酶抑制剂)和病毒的出芽与释放。
核苷酸类似物为与核苷酸相似的、但有不完整或异常脱氧核糖或核糖基团的合成化合物。一旦核苷酸类似物进入细胞,就进行磷酸化,产生三磷酸酯而与正常核苷酸竞争对病毒DNA或RNA的掺入。核苷酸类似物的三磷酸酯形式一旦掺入到生长的核酸链,就导致与病毒聚合酶不可逆结合并因而终止链。核苷酸类似物包括但不限于无环鸟苷(用于单纯疱疹病毒和水痘带状疹子病毒的治疗)、丙氧鸟苷(用于治疗巨细胞病毒)、疱疹净、病毒唑(用于治疗呼吸道合胞病毒)、双脱氧次黄苷、双脱氧胞苷、齐多夫定(叠氮胸苷)、咪喹莫特和resimiquimod。
干扰素为病毒感染的细胞及免疫细胞分泌的细胞因子。干扰素通过结合到与感染细胞邻近的细胞上的特异受体,导致细胞发生变化,使其免于病毒感染而起作用。α-干扰素和β-干扰素也诱导MHC I类和II类分子在感染细胞表面表达,导致增加的抗原呈递用于宿主免疫细胞识别。可获得重组形式的α-干扰素和β-干扰素,并已经用于治疗慢性乙型肝炎和丙型肝炎感染。在对抗病毒治疗有效剂量情况下,干扰素具有严重的副作用,如发烧、不适和体重下降。
本发明应用的抗病毒剂包括但不限于免疫球蛋白、金刚烷胺、干扰素、核苷酸类似物和蛋白酶抑制剂。抗病毒剂特异实例包括但不限于乙酰化甘露聚糖;无环鸟苷;无环鸟苷钠盐;阿德福韦;阿洛夫定;阿韦舒托;金刚烷胺盐酸盐;阿拉诺丁;阿立酮;阿替韦啶甲磺酸盐;阿夫立定;西多福韦;西潘茶碱;阿糖胞苷盐酸盐;地拉韦啶甲磺酸盐;地昔洛韦;去羟肌苷;二噁沙利;依度尿苷;Enviradene;恩韦肟;泛昔洛韦;法莫汀盐酸盐;非西他滨;非阿尿苷;磷利酯;膦甲酸钠;膦乙醇钠;更昔洛韦;更昔洛韦钠;碘苷;Kethoxal;拉米夫定;洛布卡韦;美莫汀盐酸盐;美替沙腙;奈韦拉平;喷昔洛韦;吡罗达韦;病毒唑;金刚乙胺盐酸盐;沙奎那韦甲磺酸盐;索金刚胺盐酸盐;索立夫定;维司托隆;司他夫定;替洛隆盐酸盐;三氟尿苷;丙氧鸟苷盐酸盐;阿糖腺苷;阿糖腺苷磷酸盐;阿糖腺苷磷酸钠;韦罗肟;扎西他滨;齐多夫定和净韦肟。
抗真菌剂用于治疗和预防感染性真菌。有时通过抗真菌剂的作用机理对其分类。一些抗真菌剂作为细胞壁抑制剂通过抑制葡萄糖合成酶起作用。这些包括但不限于basiungin/ECB。其它抗真菌剂通过破坏膜完整性而起作用。这些包括但不限于咪唑,如克霉唑、sertaconzole、氟康唑、伊曲康唑、酮康唑、咪康唑和voriconacole,以及FK 463、两性霉素B、BAY 38-9502、MK 991、pradimicin、UK 292、布替萘芬和特比萘芬。其它抗真菌剂通过分解几丁质(如几丁质酶)或抑制免疫反应(501膏)而起作用。
CpG免疫刺激性寡核苷酸可组合其它治疗剂,如佐剂,以增强免疫反应。可同时或顺序施用CpG免疫刺激性寡核苷酸与其它治疗剂。当同时施用其它治疗剂时,它们可以同一制剂或分别的制剂施用,但要同时施用。当顺序施用其它治疗剂与CpG免疫刺激性寡核苷酸时,需要暂时分别地施用其它治疗剂和CpG免疫刺激性寡核苷酸。施用这些化合物的顺序时间可为几分钟,或时间更长。其它治疗剂包括但不限于佐剂、细胞因子、抗体、抗原等。
本发明的组合物也可与非核酸佐剂一起施用。非核酸佐剂为除了此处所述的CpG免疫刺激性寡核苷酸以外的能刺激体液免疫反应和/或细胞免疫反应的任意分子或化合物。例如,非核酸佐剂包括引起depo作用的佐剂、免疫刺激佐剂,和引起depo作用并激活免疫系统的佐剂。
CpG免疫刺激性寡核苷酸也可用作粘膜佐剂。以前已经讨论过自粘膜递送CpG寡核苷酸诱导全身免疫和粘膜免疫。因此,寡核苷酸可组合其它粘膜佐剂施用。
通过细胞因子(Bueler&Mulligan,1996;Chow等人,1997;Geissler等人,1997;Iwasaki等人,1997;Kim等人,1997)或B-7共刺激分子(Iwasaki等人,1997;Tsuji等人,1997)与CpG免疫刺激性寡核苷酸的共同施用或共线性(co-linear)表达也可诱导或增加免疫反应。术语细胞因子为多种可溶性的、在10-9到10-12摩尔浓度下起体液调节剂作用、并在正常或病理条件下调节个体细胞和组织的功能活性的蛋白质和多肽的总称。这些蛋白质直接地介导细胞间的相互作用,并调节发生在细胞外环境的过程。细胞因子的实例包括但不限于IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-18、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、干扰素-γ(γ-IFN)、IFN-α、肿瘤坏死因子(TNF)、TGF-β、FLT-3配体和CD40配体。
寡核苷酸也可应用于将免疫反应从Th2免疫反应重定向到Th1免疫反应。其致使产生相对平衡的Th1/Th2环境。从Th2到Th1免疫反应的重定向可通过测量响应寡核苷酸产生的细胞因子的水平进行评估(如通过诱导单核细胞和其它细胞产生Th1细胞因子,包括IL-12、IFN-γ和GM-CSF)。从Th2到Th1免疫反应的重定向或平衡特别适用于治疗或预防哮喘。例如,治疗哮喘的有效剂量为对于使与哮喘有关的Th2型免疫反应重定向到Th1型反应或平衡的Th1/Th2环境有效的量。在患哮喘症患者呼吸道中,Th2细胞因子,特别是IL-4和IL-5增多。本发明的CpG免疫刺激性寡核苷酸致使增加Th1细胞因子,以利于平衡免疫系统、预防或降低与主要为Th2免疫反应有关的副作用。
寡核苷酸也用于提高树突细胞的成活、分化、激活和成熟。CpG免疫刺激性寡核苷酸对增强树突细胞的细胞成活、分化、激活和成熟具有独特能力。
CpG免疫刺激性寡核苷酸也提高天然杀伤细胞的裂解活性和抗体依赖细胞介导的细胞毒作用(ADCC)。通过将CpG免疫刺激性寡核苷酸与如癌细胞的靶细胞特异的抗体组合进行ADCC。当抗体与CpG免疫刺激性寡核苷酸一起施用于受试者时,可诱导受试者免疫系统杀死癌细胞。应用于ADCC过程中的抗体包括体内与细胞相互作用的抗体。领域内已对许多这种对靶细胞特异的抗体进行了描述,且许多抗体有售。
也可结合抗癌治疗来施用CpG免疫刺激性寡核苷酸。抗癌治疗包括癌药、放疗和外科手术。此处所用的“癌药”指为了治疗癌而施用给受试者的药剂。此处所用的“治疗癌”包括阻断癌发展、降低癌的症状,和/或抑制已经形成的癌的生长。在其它方面,为降低患癌危险而对处于患癌危险的受试者施用癌药。此处描述了多种治疗癌的药物。对本说明书而言,将癌药分为化疗剂、免疫治疗剂、癌疫苗、激素治疗和生物反应调节剂。
此外,在本发明的方法中,与CpG免疫刺激性寡核苷酸一起使用的癌药不只一种。例如,根据需要,将CpG免疫刺激性寡核苷酸与化疗剂和免疫治疗剂一起施用。可选地,为了对患癌或处于患癌危险的受试者进行治疗,可对其施用包含免疫治疗剂与癌疫苗,或化疗剂与癌疫苗,或化疗剂、免疫治疗剂与癌疫苗的癌药。
化疗剂可选自于氨甲蝶呤、长春新碱、亚德里亚霉素、顺氯氨铂、含氯乙基亚硝基脲的非糖物质、5-氟尿嘧啶、丝裂霉素C、博来霉素、阿霉素、氮烯唑胺、紫杉醇、fragyline、葡甲铵GLA、戊柔比星、carmustaine和poliferposan、MMI270、BAY 12-9566、RAS法尼西基转移酶抑制剂、法尼西基转移酶抑制剂、MMP、MTA/LY231514、L Y264618/Lometexol、Glamolec、CI-994、TNP-470、托泊替康/拓扑替康、PKC412、伐司朴达/PSC833、盐酸米托蒽醌/Mitroxantrone、Metaret/苏拉明、图巴马司他、E7070、BCH-4556、CS-682、9-AC、AG3340、AG3433、Incel/VX-710、VX-853、ZDOlOl、ISI641、ODN 698、TA 2516/Marmistat、BB2516/Marmistat、CDP 845、D2163、PD183805、DX8951f、Lemonal DP2202、FK 317、Picibanil/OK-432、AD 32/Valrubicin、Metastron/strontiumderivative、替莫唑胺/Temozolomide、Evacet/阿霉素脂质体、Yewtaxan/紫杉醇、Taxol/紫杉醇、Xeload/卡培他滨、氟铁龙/Doxifluridine、Cyclopax/口服紫杉醇、Oral Taxoid、SPU-077/顺氯氨铂、HMR 1275/Flavopiridol、CP-358(774)/EGFR、CP-609(754)/RAS致癌基因抑制剂、BMS-182751/口服铂类、UFT(喃氟啶/尿嘧啶)、Ergamisol/左旋四咪唑、二氢嘧啶脱氢酶灭活剂/776C85/5FU增强剂、抗癌妥/左旋咪唑、Camptosar/Irinotecan、Tumodex/Ralitrexed、Leustatin/克拉屈滨、Paxex/Paclitaxel、Doxil/脂质体阿霉素、Caelyx/脂质体阿霉素、Fludara/氟阿糖腺苷、Pharmarubicin/表比星、脂质体阿糖胞苷、ZDl 839、LU 79553/Bis-Naphtalimide、LU103793/海兔毒素、Caetyx/脂质体阿霉素、Gemzar/Gemcitabine、ZD0473/Anormed、YM 116、Iodine seeds、CDK4和CDK2抑制剂、PARP抑制剂、D4809/Dexifosamide、Ifes/Mesnex/Ifosamide、Vumon/替尼泊苷、伯尔定/Carboplatin、Plantinol/顺氯氨铂、Vepeside/依托泊苷、ZD 9331、多烯紫杉醇/紫杉萜、鸟嘌呤阿拉伯糖苷药物前体、Taxane类似物、亚硝基脲、烷化剂如melphelan和环磷酰胺、氨基导眠能、天冬酰胺酶、白消安、卡波铂、Chlorombucil、盐酸阿糖胞苷、放线菌素D、盐酸道诺红菌素、雌氮芥磷酸钠、足叶乙甙(VP 16-213)、5氟脱氧尿苷、氟尿嘧啶(5-FU)、氟他米特、羟基尿(羟基尿素)、异环磷酰胺、干扰素α-2a、α-2b、醋酸亮丙瑞林(LHRH释放因子类似物)、环已亚硝脲(CCNU)、盐酸二氯甲基二乙胺(氮芥)、颈基嘌呤、巯乙磺酸钠、邻氯苯对氯苯二氯乙烷(o.p′-DDD)、盐酸米托蒽醌、奥曲肽、Plicamycin、盐酸甲基苄肼、链脲霉素,枸橼酸他莫昔芬、硫鸟嘌呤、硫化三环氮丙基磷,硫酸长春花碱、安吖啶(m-AMSA)、阿扎胞苷、红细胞生成素、六甲密胺(HMM)、白介素2、米托胍腙(甲基-GAG;甲基乙醛基二脒基腙;MGBG)、喷司他丁(2′deoxycoformycin)、司莫司汀(甲基-CCNU)、替尼泊苷(VM-26)和硫酸长春地辛,但不限于此。
免疫治疗剂可选自:Ributaxin、Herceptin、Quadramet、Panorex、IDEC-Y2B8、BEC2、C225、Oncolym、SMART M195、ATRAGEN、Ovarex、Bexxar、LDP-03、ior t6、MDX-210、MDX-11、MDX-22、OV103、3622W94、抗-VEGF、Zenapax、MDX-220、MDX-447、MELIMMUNE-2、MELIMMUNE-I、CEACIDE、Pretarget、NovoMAb-G2、TNT、Gliomab-H、GNI-250、EMD-72000、LymphoCide、CMA 676、Monopharm-C、4B5、ior egf.r3、ior c5、BABS、抗-FLK-2、MDX-260、ANA Ab、SMART IDlOAb、SMART ABL 364Ab和ImmuRAIT-CEA,但不限于此。
癌症疫苗可以选自EGF、抗独特型癌症疫苗、Gp75抗原、GMK黑素瘤疫苗、MGV神经节苷脂缀合疫苗、Her2/neu、Ovarex、M-Vax、O-Vax、L-Vax、STn-KHL theratope、BLP25(MUC-1)、脂质体独特型疫苗、黑素瘤治疗疫苗、肽抗原疫苗、毒素/抗原疫苗、基于MVA的疫苗、PACIS、BCG疫苗、TA-HPV、TA-CIN、DISC病毒和ImmuCyst/TheraCys,但不仅限于这些。
将CpG免疫刺激性寡核苷酸与如单克隆抗体的免疫治疗剂联用能通过许多机制包括ADCC的增强(如上所述)、天然杀伤(NK)细胞的激活和IFN-α水平的增加,来增加长期存活率。当寡核苷酸与单克隆抗体联合施用时,寡核苷酸用于降低为获得生物学作用所需的单克隆抗体的剂量。
此处所用的术语“癌抗原”和“肿瘤抗原”可交替使用,以指通过癌细胞进行差异表达并因此进行用以靶向癌细胞的抗原。癌抗原为能潜在地刺激明显肿瘤特异的免疫反应的抗原。部分这类抗原虽然不必表达,但可由正常细胞编码。这些抗原特征为:在正常细胞中为沉默的(即不表达);仅在一些分化阶段中表达;和暂时表达,如胚胎抗原。其它癌抗原由突变细胞基因编码,如致癌基因(如活化的ras致癌基因)、抑制基因(如p53突变体)、由内部缺失或染色体易位产生的融合蛋白质。还有其它癌抗原由病毒基因编码,如RNA和DNA肿瘤病毒携带的病毒基因。
CpG免疫刺激性寡核苷酸也用于治疗和预防自身免疫病。自身免疫病为受试者自身抗体与宿主组织反应或免疫效应T细胞与内部自体肽自动反应并破坏组织的一类疾病。因此,引起的免疫反应抗称为自身抗原的受试者自身抗原。自身免疫病包括但不限于风湿性关节炎、Crohn病、多发性硬化、系统性红斑狼疮(SLE)、自身免疫脑脊髓炎、重症肌无力(MG)、桥本甲状腺炎、古德帕斯丘综合征、天疱疮(如寻常天疱疮)、Grave病、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性血小板减少性紫癜、抗胶原质抗原硬皮症、混合性结缔组织病、多肌炎、恶性贫血、先天阿狄森病、自身免疫相关不孕、肾小球肾炎(如新月体肾小球肾炎、增生性肾小球肾炎)、大疱性类天疱疮、干燥综合症,胰岛素抵抗力和自身免疫性糖尿病。
此处所用的“自身抗原”指正常宿主组织抗原。正常宿主组织不包括癌细胞。因此,在自身免疫病上下文中,引起的抗自身抗原的免疫反应为不期望的免疫反应,且破坏并损伤正常组织,而引起的抗癌抗原的免疫反应为期望的免疫反应,且破坏肿瘤或癌。因此,在本发明的治疗自身免疫性紊乱的一些方面中,不推荐将CpG免疫刺激性寡核苷酸与自身抗原特别是那些自身免疫病的靶抗原一起施用。
在其它例子中,CpG免疫刺激性寡核苷酸可与低剂量自身抗原一起递送。许多动物研究已经表明对粘膜施用低剂量抗原可导致免疫低反应或“耐受”状态。作用机制似乎是细胞因子介导的从Th1转向Th2和Th3主导的(即TGF-β主导的)反应的免疫偏离。低剂量抗原的主动抑制也抑制无关的免疫反应(旁观者抑制),其在治疗如风湿性关节炎和SLE的自身免疫病方面是令人感兴趣的。旁观者抑制涉及在以抗原特异的或抗原非特异的方式释放促炎性细胞因子和Th1细胞因子的局部环境中,分泌Th1反调节的抑制子细胞因子。此处所用的“耐受”用于指这种现象。实际上,经口耐受已经有效地治疗动物的许多自身免疫病,包括实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)、实验性自身免疫性重症肌无力、胶原诱导性关节炎(CIA)和胰岛素依赖型糖尿病。在这些模型中,自身免疫病的预防和抑制与抗原特异的体液和细胞反应从Th1到Th2/Th3反应的转换相关。
本发明也包括使用CpG免疫刺激性寡核苷酸诱导抗原非特异的先天免疫激活(innate immune activation)和广谱抵抗感染攻击的方法。此处所用的术语抗原非特异的先天免疫激活指非B细胞的免疫细胞的激活,例如包括NK细胞、T细胞或其它可以抗原非依赖性方式反应的免疫细胞或这些细胞的一些组合的激活。诱导广谱抵抗感染攻击,因为免疫细胞为活化形式,并且针对入侵的化合物或微生物反应。免疫细胞不必特定于针对特定抗原。这对生物战和其它前面所述的情况如旅行者特别有用。
可直接对受试者施用CpG免疫刺激性寡核苷酸或可与核酸递送复合体一起施用。核酸递送复合体为结合(如离子键或共价键结合;或包囊入)靶向工具(如产生高亲和性结合靶细胞的分子)的核酸分子。核酸递送复合体的例子包括结合固醇(如胆固醇)、脂(如阳离子脂类、病毒颗粒或脂质体)或靶细胞特异结合剂(如靶细胞特异受体识别的配体)的核酸。优选的复合体为在体内足够稳定,从而防止在被靶细胞内化前的明显解偶联。但复合体在细胞内适当条件下可被切割以释放出功能形式的寡核苷酸。
术语CpG免疫刺激性寡核苷酸的有效剂量指实现期望的生物作用的必要的或充分的剂量。例如,与抗原一起施用的用于诱导粘膜免疫的CpG免疫刺激性寡核苷酸的有效剂量为在暴露于抗原后,与抗原反应而引起IgA产生所必需的剂量,而用于诱导全身免疫所需的剂量为在暴露于抗原后,与抗原反应而引起IgG产生所必需的剂量。结合此处提供的教导,通过在多种活性化合物和如潜能、相对生物利用率、患者体重、有害副作用程度及优选的施用方式的权重因素中进行选择,可以进行有效的预防或治疗方案,其不引起实质的毒性,但却十分有效地治疗特定受试者。根据一些因素,如需要治疗的疾病或症状、施用的特定CpG免疫刺激性寡核苷酸、受试者体型、或疾病或症状的严重性,可以改变用于任意特定施用的有效剂量。领域内普通的一位技术人员可凭经验而无需过多的实验即可确定特定的CpG免疫刺激性寡核苷酸和/或抗原和/或其它治疗剂的有效剂量。
对受试者进行粘膜或局部递送此处所述化合物的剂量,根据施用时间为每日、每周、每月或任意其它时间量,一般为每次施用约0.1μg至50mg。更一般的粘膜或局部施用剂量范围为每次约10μg至10mg,且最一般地为约100μg至1mg,以隔开的天或周施用2-4次。更一般地,免疫刺激剂量范围为每次1μg至10mg,且最一般地为l0μg至1mg,每日或每周施用。为诱导抗原特异的免疫反应对受试者进行肠胃外施用此处所描述的化合物的剂量,一般比疫苗佐剂或免疫刺激施用的有效粘膜剂量高5至10,000倍,且更一般地高10至1,000倍,且最一般地高20至100倍,其中化合物是与抗原而不是其它治疗剂一起递送。为诱导先天免疫反应或增加ADCC或诱导抗原特异的免疫反应而肠胃外施用此处所描述的化合物的剂量,根据施用的时间顺序是日、周、月或任意其它时间顺序,一般每次施用范围为0.1μg至10mg,其中CpG免疫刺激性寡核苷酸与其它治疗剂组合或装于专门递送载体中进行递送。为达到这些目的,更一般的肠胃外施用剂量范围为每次约10μg至5mg,且最一般地为约100μg至1mg,以隔开的天或周施用2-4次。然而在一些实施方案中,为达到这些目的而肠胃外施用剂量范围比上面所描述的一般剂量高5至10,000倍。
对于此处所描述的任意化合物,治疗有效量可自动物模型最初加以确定。治疗有效量也可由在人体内试验的(已经开始人临床试验)CpG寡核苷酸或化合物的数据确定,所述化合物已知其表现出相似的药理活性,如其它佐剂,如LT和用作疫苗的其它抗原。对于肠胃外施用可能需要更高的剂量。可根据施用的化合物的相对生物利用度和潜能进行调整施用的剂量。根据上面描述的方法以及领域内众所周知的方法,普通技术人员能很好地调整施用剂量以获得最大化功效。
本发明的制剂可于可药用溶液中施用,所述可药用溶液一般包含可药用浓度的盐、缓冲剂、防腐剂、相容性载体、佐剂和任选地其它治疗成分。
对于治疗上的应用,可通过任意将寡核苷酸递送到目的表面如粘膜表面和系统表面的方式施用有效剂量的CpG免疫刺激性寡核苷酸。本发明的药物组合物可通过任意的技术人员熟知的手段进行施用。优选的施用方式包括但不限于经口、肠胃外、肌内、鼻内、舌下、气管内、吸入、眼睛、阴道和直肠。
对于口腔施用,通过领域内众所周知的可药用载体与活性化合物的组合,可容易地制剂化合物(即CpG免疫刺激性寡核苷酸、抗原和其它治疗剂)。这些载体可使本发明的化合物制成用于接受治疗的受试者口腔摄取的片、丸、糖衣丸、胶囊、流体、凝胶、糖浆、浆、悬浮液等剂型。经口药可加入固体赋形剂,可选地,加入适当的助剂后,研磨所得的混合物,并处理混合物颗粒,若期望的话,可制剂为片剂或糖锭剂。特别地,适当的赋形剂为填充剂,如包括乳糖、蔗糖、甘露糖或山梨糖的糖;纤维素制品,如玉米淀粉、小麦淀粉、米淀粉、马铃薯淀粉、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。若期望的话,可加入崩解剂,如交联的聚乙烯吡咯烷酮、琼脂或褐藻酸或如海藻酸钠的盐。任选地,经口制剂也可制剂于盐水或缓冲液中,即EDTA用于中和内部酸性环境,或不使用任何载体而施用。
特别考虑了上述一种或多种组分(component)的经口剂型。可对一种或多种组分进行化学修饰以使经口递送的衍生物是有效的。通常考虑的化学修饰为将至少一个部分(moiety)连接到组分分子上,所述部分允许(a)抑制蛋白质裂解;和(b)从胃或肠中进行血液。也期望增加一种或多种组分的总体稳定性并增加在体内的循环时间。这种部分的例子包括:聚乙二醇、乙二醇和丙二醇的共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮和聚脯氨酸。Abuchowski和Davis,1981,″Soluble Polymer-EnzymeAdducts″,Enzymes as Drugs,Hocenberg和Roberts编,Wiley-Interscience,New York,NY,pp.367-383;Newmark等人,1982,J.Appl.Biochem.4:185-189。其它可用聚合物为聚-1,3-二氧戊烷(dioxolane)和聚-l,3,6-tioxocane。对于药物应用,如上所述,优选地为聚乙二醇部分。
组分(或衍生物)的释放位置可为胃、小肠(十二指肠、空肠或回肠)或大肠。领域内的技术人员可获得不在胃内溶解,但却可在十二指肠或肠内其它位置释放的制剂。优选地,通过保护寡核苷酸(或衍生物)或不在胃环境中如在肠中释放生物活性物质,将使释放免于胃环境的有害作用。
为确保完全抵抗胃环境,有必要包衣使其在至少pH5.0时不渗透。更常见的用作肠溶衣的惰性成分的例子为偏苯三酸醋酸纤维素(CAT)、邻苯二甲酸羟丙基甲基纤维素(HPMCP)、HPMCP 50、HPMCP 55、邻苯二甲酸聚乙酸乙烯酯(PVAP)、Eudragit L30D、Aquateric、邻苯二甲酸醋酸纤维素(CAP)、Eudragit L、Eudragit S和紫胶。这些包衣可用作混合的膜。
不是用作抵抗胃而起保护作用的包衣或包衣混合物也可用于片剂上。其包括糖衣,或使片剂易于吞服的包衣。胶囊剂可由用于递送干治疗剂,即粉末的硬壳(如明胶)组成;对于流体形式,可使用软明胶。扁囊剂的壳物质为粗淀粉或其它可食纸。对于丸剂、锭剂、塑片剂或药片粉末,可使用潮湿结块技术。
剂型中的治疗剂可包含细小的大量颗粒,粒径为约1mm的细粒或球状粒子。用于胶囊施用的材料剂型也可为粉末、轻微压缩的栓、甚或片剂。可通过压缩制备治疗剂。
也可包括着色剂与调味剂。例如,可配制寡核苷酸(或衍生物)(如通过脂质体或微球包封),然后进一步将其加入到可食产品中,如包含着色剂和调味剂的冷冻饮料。
可用惰性材料稀释或增加治疗剂的体积。这些稀释剂包括糖,特别地为甘露醇、a-乳糖、无水乳糖、纤维素、蔗糖、经修饰的葡聚糖和淀粉。一些无机盐也可用作填充剂,包括三磷酸钙、碳酸镁和氯化钠。一些商业可获得的稀释剂为Fast-Flo、Emdex、STA-Rx 1500、Emcompress和Avicell。
在将治疗剂制剂为固体剂型时可包括崩解剂。用作崩解剂的材料包括但不限于淀粉(包括基于淀粉的商业崩解剂)、Explotab。也可使用羟基乙酸淀粉钠、安伯来特、羧甲基纤维素钠、ultramylopectin、藻酸钠、明胶、橙皮、酸性羧甲基纤维素、天然海绵和皂土。另一种形式的崩解剂为不溶性阳离子交换树脂。粉末化的胶可用作崩解剂和粘合剂,且其包括如琼脂、刺梧桐或黄蓍胶的粉末化胶。褐藻酸及其钠盐也可用作崩解剂。
粘合剂可使治疗剂聚集成为硬片剂,且包括源自于天然产物材料,如阿拉伯树胶、黄蓍胶、淀粉和凝胶。其它包括甲基纤维素(MC)、乙基纤维素(EC)和羧甲基纤维素(CMC)。聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和羟丙基甲基纤维素(HPMC)都可在醇溶液中使用以使治疗剂成为颗粒。
治疗剂剂型中包括抗磨擦剂,以预防在配制加工过程的粘结。在治疗剂与模壁间为一层润滑剂,且其包括但不限于硬脂酸(包括硬脂酸镁盐与钙盐)、聚四氟乙烯(PTFE)、液体石蜡、植物油和蜡。也可使用可溶润滑剂,如月桂基硫酸钠、月桂基硫酸镁、多种分子量的聚乙二醇、Carbowax醇4000和6000。
可加入助流剂,其在配制过程中增加药物的流动特性以促进压缩过程中的重排。助流剂可包括淀粉、滑石、氧化硅和水合硅铝酸。
为促进治疗剂溶于液体环境中,可加入表面活性剂作为润湿剂。表面活性剂可包括阴离子去污剂,如月桂基硫酸钠、丁二酸二辛酯磺酸钠和二辛酯磺酸钠。可使用阳离子去污剂,包括苯扎氯铵(benzalkonium chloride)或苯索氯铵。剂型中用作表面活性剂的潜在的非离子型去污剂包括聚桂醇400、硬脂酸聚烃氧40、聚氧乙烯蓖麻油10、50及60、单硬脂酸甘油酯、聚山梨醇40、60、65及80、蔗糖脂肪酸酯、甲基纤维素和羧甲基纤维素。这些表面活性剂可单独或以不同比率的混合物形式存在于寡核苷酸或衍生物制剂中。
可经口使用的药物制品包括由明胶制成的推入配合胶囊(push-fitcapsules),以及由明胶与增塑剂如甘油或山梨醇制成的软的密封胶囊。推入配合胶囊包含与填充剂如乳糖、粘合剂如淀粉、和/或润滑剂如滑石或硬脂酸镁和任选地稳定剂混合的活性成分。在软胶囊中,活性化合物可溶于或悬浮于适当的液体中,如脂肪油、液体石蜡或液态聚乙二醇。此外,可加入稳定剂。也可使用制成经口用的微球体。现有技术已充分定义了这种微球体。用于经口施用的全部剂型都应为适合这种施用的剂量。
对于经颊施用,组合物应以常规方式制成片剂或锭剂。
对于通过吸入施用,根据本发明,使用的化合物一般地从加压包装或雾化器中利用适当的推进剂,如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它适当气体,以喷雾方式递送。在加压气雾剂的情况时,单位剂量可通过使用阀来递送规定的量。可制备用于吸入器或吹入器的明胶胶囊与药筒,其包含化合物和适当的如乳糖或淀粉的粉末基质的粉末混合物。
此处也考虑了寡核苷酸(或其衍生物)的肺部递送。当吸入寡核苷酸(或其衍生物)时,寡核苷酸被递送入哺乳动物肺部并穿过肺粘膜上皮进入血液。吸入分子的其它报告包括Adjei等人,1990,药物研究(PharmaceuticalResearch),7:565-569;Adjei等人,1990,国际制药学杂志(InternationalJournal of Pharmaceutics),63:135-144(醋酸亮丙瑞林);Braquet等人,1989,心血管药理学杂志(Journal of Cardiovascular Pharmacology),13(suppl.5):143-146(内皮缩血管肽-1);Hubbard等人,1989,内科医学年报(Annals of Internal Medicine),Vol.III,206-212(al-抗胰蛋白酶);Smith等人,1989,J.Clin.Invest.84:1145-1146(a-1-蛋白酶);Oswein等人,1990,“蛋白质雾化(Aerosolization of Proteins)”,Proceedings of Symposium onRespiratory Drug Delivery II,Keystone,Colorado,March,(recombinanthuman growth hormone);Debs等人,1988,J.Immunol.140:3482-3488(干扰素-g与肿瘤坏死因子α)和Platz等人,美国专利号5,284,656(粒细胞集落刺激因子)。1995年9月19日授予Wong等人的美国专利号5,451,569中描述了肺部递送药物的用于系统反应的方法与化合物。
为在本发明的实施中使用,考虑了为在肺部递送治疗剂产品而设计的大范围的机械装置,包括但不限于雾化器、计量吸入器和粉末吸入器,领域内的技术人员熟知所有这些装置。
一些具体的商业可获得的适合本发明实施的装置的例子,包括Mallinckrodt,Inc.,St.Louis,Missouri制造的Ultravent雾化器、MarquestMedical Products,Englewood,Colorado制造的Acorn II雾化器、Glaxo Inc.,Research Triangle Park,North Carolina制造的Ventolin定量剂量吸入器和Fisons Corp.,Bedford,Massachusetts制造的Spinhaler粉末吸入器。
所有这些装置要求使用适于分散寡核苷酸(或衍生物)的剂型。一般地,每种剂型专一使用一种装置类型,并且包括使用除了在治疗中使用的常用的稀释剂、佐剂和/或载体以外的适当的推进剂物质。也考虑使用脂质体、微胶囊或微球体、包合络合物或其它类型的载体。根据化学修饰的类型或使用的装置类型,也可在不同剂型中制备化学修饰的寡核苷酸。
适用于喷射或超声波雾化器的剂型,一般包括溶于水的寡核苷酸(或衍生物),浓度为每毫升溶液含0.1到25mg生物活性寡核苷酸。剂型也可包括缓冲液或简单糖(如用于稳定寡核苷酸和调节渗透压)。喷雾剂型也可包含表面活性剂,以减少或预防由溶液在形成气雾过程中雾化造成的寡核苷酸表面聚集。
用于定量剂量吸入装置的剂型,一般包含在表面活性剂帮助下悬浮于推进剂中的充分分散的寡核苷酸(或衍生物)粉末。推进剂可为用于该目的的任何常规材料,如氯氟碳、氢氯氟碳、氢氟碳、或烃,包括三氯氟甲烷、二氯二氟甲烷、二氯四氟乙醇和1,1,1,2-四氟乙烷或其组合物。适当的表面活性剂包括失水山梨醇三油酸酯和大豆卵磷脂。油酸也可用作表面活性剂。
用于从粉末吸入器装置中分散的剂型包含充分分散的干燥的含有寡核苷酸(或衍生物)的粉末,且也可包括填充剂,如乳糖、山梨醇、蔗糖或甘露醇,用量为使粉末从装置中易于分散的量,如占剂型重量的50%至90%。对于最有效地递送至远端肺,寡核苷酸(或衍生物)应最有利地制成平均粒径不到10mm(或微米)的粒子,最优选地为0.5至5mm。
也考虑了本发明的药物组合物的鼻递送。在鼻部施用治疗剂后,鼻递送使本发明的药物组合物直接进入血液而不必在肺沉积药物。鼻递送的剂型也包括含有葡聚糖或环糊精的药物。
对于鼻施用,使用的装置为连接定量剂量喷射器的小硬瓶。在一个实施方案中,通过将本发明的药物组合物溶液吸入到限定体积小室递送定量剂量,该小室具有在压缩小室内的液体时喷射气雾剂的小孔。压缩小室施用本发明的药物组合物。在特定实施方案中,小室为活塞装置。可以购买到该装置。
可选地,塑料挤瓶具有在受到挤压时喷射气雾剂的小孔或开孔。开孔通常在瓶子上部,且上部一般为渐缩形,对于有效施用气雾剂而言,可以在一定程度上适合鼻通道。优选地,对于施用定量剂量药物而言,鼻吸入器提供定量的气雾剂。
当期望将化合物用于全身递送时,可以制成通过注射方式的肠胃外施药,如通过大丸剂注射或持续输注。具有附加防腐剂的注射剂型可以单位剂量形式存在,如存在于安瓿或多剂量容器中。组合物可采取存在于油或水介质的悬浮液、溶液或乳液的形式,且可包含如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂的配制试剂。
用于肠胃外施药的药物剂型包括水溶性形式的活性化合物的水溶液。此外,活性化合物的悬浮液可制剂为适当的油溶性注射悬浮液。适当的脂溶剂或运载体包括如麻油的脂肪油、或如油酸乙酯或甘油三酸酯的人造脂肪酸酯、或脂质体。水溶性注射悬浮液包含增加悬浮液的粘性的物质,如羧甲基纤维素钠、山梨醇或葡聚糖。任选地,悬浮液也可包含适当的稳定剂或增加化合物溶解性的试剂以允许制备高浓缩溶液。
备选地,活性化合物可为粉末形式,用于在使用之前,使用合适的运载体如如无热原灭菌水构建。
化合物也可配制成直肠或阴道用组合物,如栓剂或滞留灌肠剂,例如含有常规栓剂基质,如可可黄油或其它甘油酯。
除了前面所描述的剂型以外,化合物也可制剂为储库制品。可用适当的聚合物或疏水材料(例如适当的油中的乳液)或离子交换树脂制备这种长期活性剂型,或作为微溶衍生物,如微溶盐。
药物组合物也可包含适当的固体相或胶体相载体或赋形剂。这种载体或赋形剂的例子包括但不限于碳酸钙、磷酸钙、多种糖、淀粉、纤维素衍生物、明胶和如聚乙二醇的聚合物。
适当的液态或固态药物制品形式为,例如,用于吸入的水或盐水溶液、微胶囊化、螺旋化、包衣在微小金粒上、包于脂质体中、雾化、气雾化、用于植入皮肤的小球、或在锋利物体上干燥以刺入皮肤。药物组合物也包括颗粒剂、粉末剂、片剂、包衣片剂、(微)胶囊剂、栓剂、糖浆剂、乳剂、悬浮液、霜剂、滴剂或具有延迟释放活性化合物的制剂,在这些制剂中,如上所述,通常使用赋形剂和添加剂和/或助剂,如崩解剂、粘合剂、包衣剂、溶胀剂、润滑剂、调味剂、甜味剂或增溶剂。药物组合物适用于多种药物递送系统。用作药物递送方法的简述参见Langer,Science249:1527-1533,1990,此处引用作为参考。
CpG免疫刺激性寡核苷酸和任选地其它治疗剂和/或抗原,可以其本身(净的)或以可药用盐形式施用。当用于药物时,盐应为可药用的,但非可药用的盐一般可用于制备可药用盐。这些盐包括但不限于使用以下酸制备的盐:盐酸、溴化氢、硫酸、硝酸、磷酸、马来酸、醋酸、水杨酸、对甲苯磺酸、酒石酸、柠檬酸、甲磺酸、蚁酸、丙二酸、琥珀酸、萘-2-磺酸和苯磺酸。这些盐也可制剂为碱金属盐或碱土金属盐,如羧酸基的钠盐、钾盐或钙盐。
适当的缓冲剂包括:乙酸和盐(1-2%w/v);柠檬酸和盐(1-3%w/v);硼酸和盐(0.5-2.5%w/v);以及磷酸和盐(0.8-2%w/v)。适当的防腐剂包括苯扎氯铵(0.003-0.03%w/v);氯代丁醇(0.3-0.9%w/v);对羟基苯甲酸酯(0.01-0.25%w/v)和乙基汞硫代水杨酸钠(0.004-0.02%w/v)。
本发明的药物组合物包含有效剂量的CpG免疫刺激性寡核苷酸,且任选地包含抗原和/或任选地包括在可药用载体中的其它治疗剂。术语可药用载体意指一种或多种相容的适于施用至人或其它脊椎动物的固体或液体填充剂、稀释剂或包封剂。术语载体指与活性成分结合以利于施用的有机或无机的天然的或合成的成分。药物组合物的组分也能与本发明的化合物混合,且相互之间以基本上不削弱所期望药效的相互作用的方式混合。
据近期报道CpG免疫刺激寡核苷酸可以通过与Toll样受体9(TLR9)作用发挥其免疫刺激功能。Hemmi H等人(2000)Nature 408:740-5.因此TLR9对CpG寡核苷酸或其它免疫刺激寡核苷酸的应答信号活性可以通过测量NF-κB,NF-κB-相关信号,和NF-κB上游的适当事件或中间体获得。
通过以下实施例进一步阐述本发明,但决不是作为进一步限制。该申请所引用的所有参考文献(包括参考文献、已发行的专利、公开的专利申请和共同待决的专利申请)的全部内容,此处特别地引用作为参考。
实施例
材料与方法:
寡核苷酸(ODNs)和试剂
所有的ODN都购自Biospring(Frankfurt,德国)或者由ColeyPharmaceutical GmbH(Langenfeld,德国)提供,由Coley PharmaceuticalGmbH控制其身份和纯度,由Limulus assay(BioWhittaker,Verviers,Belgium)测量没有检测到内毒素水平(<0.1EU/ml)。ODN悬浮于无菌的不含内毒素的Tris-EDTA(Sigma,Deisenhofen,德国)中,并且在无菌条件下储存和处理,以防止微生物和内毒素的污染。使用不含内毒素的Tris-EDTA进行所有的稀释。
TLR测定
通过电穿孔使用表达人TLR9和6xNF-κB萤光素酶报告基因质粒的载体转染HEK293细胞。稳定转染子(3×104细胞/孔)与ODN在湿润的培养箱中37℃培育16小时。每个数据点一式三份进行。裂解细胞并测定萤光素酶基因活性(使用Perkin-Elmer,Zaventem,Belgium的BriteLite试剂盒)。参照在不加入ODN时培养基的报告基因活性计算刺激指数。
细胞纯化
从University of Düsseldorf(德国)的血库获得来自健康人供体的外周血血沉棕黄层,通过在菲可帕克(Sigma)上离心纯化PBMC。在湿润的培养箱中37℃培养细胞,培养基为补加5%(v/v)热灭活的人AB血清(BioWhittaker)或10%(v/v)热灭活FCS、2mM L-谷氨酰胺、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素(均来自Sigma)的RPMI 1640培养基。
细胞因子检测和流式细胞检测分析
重悬浮PBMC并加入到96孔圆底板中。PBMC与多种ODN浓度孵育,并且在指示时间点后收集培养上清液(SN)。如果不立刻使用,那么SN储存在-20℃,直到需要为止。
使用用于IFN-γ、IL-6和IL-10的商购ELISA试剂盒(Diaclone,Besangon,France),或者使用商购抗体(PBL,New Brunswick,N.J.,USA)自制的用于IFN-α的ELISA估计在SN中细胞因子的量。
实施例1:短的半软CpG ODN诱导IFN-α从人PBMC表达IFN-α的
能力
在人PBMC与此处所描述的CpG寡核苷酸接触后,从这些细胞中分泌的α干扰素(IFN-α)的水平如附图1所示。所检验的受试寡核苷酸在图中用SEQ ID NO表示。沿X轴描绘用于产生特定数据点的寡核苷酸浓度(μM)。
如图1所示,在测定中所检验的每一种寡核苷酸都能产生显著的IFN-α分泌。完全磷酸二酯ODN(SEQ ID NO.7)只能引起产生IFN-α的背景水平。
本研究中所使用的ODN描述于下表中(表1)。
实施例2:短半软CpG ODN激活TLR9的能力
如材料与方法中所描述,用TLR9报告基因系统测定实施例1中所检验的相同ODN。
在TLR9报告基因测定中检验不同浓度的ODN。使用Sigma Plot(SigmaPlot 2002for Windows Version 8.0)计算EC50。最大刺激指数(maxSI)计算为任何ODN的所有检测浓度的最大值与培养基对照的商。此值是两个独立实验的平均值,每个数据点以一式三份测定。数据显示于表2。
表2.短半软ODN对表达TLR9的细胞的刺激指数
SEQ ID | EC50[nM] | MAXSI |
1 | 240 | 49 |
2 | 955 | 17 |
3 | 5750 | 10 |
4 | 1245 | 15 |
5 | 3450 | 18 |
6 | 6200 | 12 |
7 | n/a | 1 |
8 | 945 | 18 |
9 | 1450 | 15 |
10 | 4800 | 10 |
11 | 3700 | 11 |
12 | 720 | 32 |
13 | 2150 | 43 |
14 | 625 | 50 |
15 | 480 | 46 |
16 | 4900/>5000 | 19 |
17 | 185 | 44 |
18 | 1550 | 18 |
19 | 935 | 10 |
20 | 1175 | 4 |
21 | 2050 | 3 |
22 | 6125 | 19 |
实施例3.半软和全硬化短ODN在不同浓度下展示TLR9活性
HEK293细胞稳定表达人TLR9,并且在存在DOTAP(N-[1-(2,3-二油酰基氧基)丙基]-N,N,N-甲基硫酸三乙铵)的情况下,将NFκB-萤光素酶报告基因构建体与指示的ODN浓度孵育16小时。裂解细胞并且通过测定萤光素酶活性来确定TLR9的激活。模拟指数(SI)代表关于未刺激细胞活性的TLR9激活倍数。认为低于1.5的SI是背景。检验的ODN和数据列于表3中。
表3
SEQ ID NO 序列5’3’ 长度 [μM] SI TLR9
23 T*G*T*C*G*T*T 7 10 12.0±1.2
23 T*G*T*C*G*T*T 7 25 17.6±2.7
24 T*G*T*C_G*T*T 7 10 8.3±1.1
24 T*G*T*C_G*T*T 7 25 18.4±1.2
25 G*T*C*G*T*T 6 10 2.0±0.1
25 G*T*C*G*T*T 6 25 8.4±1.1
26 G*T*C_G*T*T 6 10 9.1±1.4
26 G*T*C_G*T*T 6 25 25.7±2.2
27 G*T*C*G*T 5 10 1.4±0.1
27 G*T*C*G*T 5 25 2.1±0.1
28 G*T*C_G*T 5 10 3.8±0.6
28 G*T*C_G*T 5 25 4.8±0.3
29 T*C*G*T*T 5 10 1.4±0.06
29 T*C*G*T*T 5 25 2.1±0.1
30 T*C_G*T*T 5 10 5.6±0.2
30 T*C_G*T*T 5 25 6.2±0.5
31 C_G 2 10 1.5±0.1
31 C_G 2 25 1.6±0.1
实施例4.短的半软和全硬化的ODN在不同浓度下展示IFN-α的诱导
如图2A和2B所示,在存在DOTAP的情况下,包含CpG的半软ODN26(7mer)和24(6mer)展示出强的IFN-α诱导。这种诱导比相应的全硬化CpG ODN 25和23(这些ODN序列相同,但是在C和G间缺乏磷酸二酯键)更强。更短的ODN 28和30(包含磷酸二酯键)与硬化的ODN 27和29相比较时检测到相同的效果。对于ODN31也观察到高于背景的IFN-α的诱导。
实施例5:具有经修饰的接头的短ODN激活TLR-9的能力
研究了经修饰的接头激活TLR-9受体的能力。检验了具有相同序列但是在中心C-G碱基对之间具有不同接头的四种ODN(ODN序列参见表4)。将稳定表达人TLR9的HEK293细胞和NFκB-萤光素酶报告基因构建体与不同的ODN培育16小时。裂解细胞并且通过测定萤光素酶活性来确定TLR9的激活。如从图3A可看出,没有短寡核苷酸能激活TLR。用作阳性对照的ODN 38不显示出TLR9的诱导。
为了研究脂质体转染剂对TLR诱导的影响,预混和ODN和DOTAP(N-[1-(2,3-二油酰基氧基)丙基]-N,N,N-甲基硫酸三乙铵)后重复此实验。ODN与DOTAP的比率恒定保持在1μM ODN对10μg/ml DOTAP。图3B显示,与DOTAP络合之后,半软ODN(SEQ ID NO:26)能够激活TLR。
实施例6:具有经修饰的接头的短ODN诱导人PBMC中细胞因子表
达的能力
检验与实施例5中相同的ODN诱导PBMC中细胞因子表达的能力。在加入细胞中之前,ODN预先与DOTAP络合。ODN与DOTAP的比率恒定保持在1μM ODN对10μg/ml DOTAP。如图4A所示,ODN显示出不同的诱导IFN-α分泌的活性。半软ODN(SEQ ID NO:26)和具有未修饰接头的ODN显示出最强的诱导图谱。对照ODN(SEQ ID NO:38)甚至在非常低的浓度下也能够诱导强的IFN-α分泌。对于IL-10,对照ODN也会在所有的检验浓度下诱导细胞因子的分泌。检验ODN都不显示出IL-10分泌的强诱导(图4B)。
当监视IL-6的分泌时,可以观察到不同的图谱。用具有甲基膦酸酯和磷酸乙酯接头(SEQ ID NO:36和SEQ ID NO:37)的ODN看到强诱导,而未修饰接头显示出较低的应答。硫代磷酸酯ODN(SEQ ID NO:25)显示出较低低的诱导,半软ODN(SEQ ID NO:26)的诱导水平接近对照ODN(SEQ ID NO:38)(图4C)。IFN-γ细胞因子的分泌再次显示出不同的图谱。通过接触半软或未修饰ODN容易地实现分泌。具有甲基膦酸酯和磷酸乙酯接头的ODN仅仅显示出中等诱导,而对照ODN(SEQ ID NO:38)则不能诱导IFN-γ的分泌(图4D)。
实施例7:具有经修饰的接头的寡二核苷酸诱导在人PBMC中细胞因
子表达的能力
检验5种具有不同接头的GC二核苷酸诱导在PBMC中细胞因子分泌的能力。在加入细胞中之前,ODN预先与DOTAP以在1μM ODN对10μg/ml DOTAP的比率络合。ODN二核苷酸在高浓度下能够诱导IFN-α的分泌(图5A)。如在实施例6中所观察到的,对照ODN(SEQ ID NO:38)在所有的检验浓度下都能够诱导IFN-α分泌。细胞因子IL-10的分泌显示出相似的诱导图谱。ODN(SEQ ID NO:38)在所有的检验浓度下都能够诱导IL-10。3’氨基己基修饰的ODN(SEQ ID NO:40)不展示出诱导IL-10分泌的能力(图5B)。当监视IL-6细胞因子的分泌时,出现不同的图谱。对照ODN(SEQ ID NO:38)在每种检验浓度下都能够诱导中等水平的IL-6分泌。所有的二核苷酸ODN都能够比对照ODN(SEQ ID NO:38)诱导更高水平的IL-6,但是仅限于在更高的浓度下(图5C)。
实施例8:双二核苷酸(C-G-L)-2doub-but诱导在人PBMC中IFN-α
分泌的能力
图6A显示在人PBMC接触ODN(C-G-L)-2doub-but(SEQ ID NO:43)和阳性对照ODN(SEQ ID NO:38)后从这些细胞中分泌的IFN-α的水平。沿X轴描绘ODN的浓度(μM)。ODN与DOTAP的比率恒定保持在4μMODN对10μg/ml DOTAP。将ODN预先与DOTAP络合后将络合物加入到PBMC。两种ODN都能够诱导IFN-α的分泌,尽管ODN(SEQ ID NO:38)在更低的浓度下有活性。
如图6B所示,(C-G-L)-2doub-but ODN不诱导IL-10的分泌(与对照ODN相比)。对于IL-6细胞因子,(C-G-L)-2doub-but在更高的浓度下诱导其分泌,但是只使用DOTAP的阴性对照实验显示出类似的诱导(图6C)。
表4:ODN序列
新SeqID | ODN序列 | 长度 | 注释 |
1 | T*C_G*T*C_G*T*T*T*T*G*A*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T*T | 24 | |
2 | T*C_G*T*T*T*T*G*A*C_G*T*T*T*T*G*T*CG*T*T | 21 | 5′N-3 |
3 | T*C_G*T*T*T*T*G*A*C_G*T*T | 13 | 5′N-3,3′N-8 |
4 | T*C_G*T*C_G*T*T*T_T*G*A*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T*T | 24 | |
5 | T*C_G*T*C_G*T*T*T_T*G*A*C_G*T*T*T_T*G*T*C_G*T*T | 24 | |
6 | T*C_G*T*C_G*T_T*T_T*G_A*C_G*T_T*T_T*G_T*C_G*T*T | 24 | |
7 | T_C_G_T_C_G_T_T_T_T_G_A_C_G_T_T_T_T_G_T_C_G_T_T | 24 | |
8 | G*T*C_G*T*T*T*T*G*A*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T*T | 22 | 5′N-2 |
9 | T*C_G*T*C_G*T*T*T*T*G*A*C_G*T*T*T*T*G*T*C | 21 | 3′N-3 |
10 | T*C_G*T*C_G*T*T*T*T*G*A*C | 13 | 3′N-11 |
11 | G*T*T*T*T*G*A*C_G*T*T*T*T*G*T*C | 16 | 5′N-5,3′N-3 |
12 | G*T*T*T*T*G*A*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T*T | 19 | 5′N-5 |
13 | G*T*C_G*T*T*T*T*G*A*C_G*T*T | 14 | 5′N-2,3′N-8 |
14 | T*C_G*T*T*T*T*G*A*C_G*T*T*T*T*G*T*C | 18 | 5′N-3,3′N-3 |
15 | G*T*C_G*T*T*T*T*G*A*C_G*T*T*T*T*G*T*C | 19 | 5′N-2,3′N-3 |
16 | G*T*C_G*T*T*T*T*G*A*C | 11 | 5′N-2,3′N-11 |
17 | C_G*T*C_G*T*T*T*T*G*A*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T*T | 23 | 5′N-1 |
18 | T*C_I*T*C_I*T*T*T*T*G*A*C_I*T*T*T*T*G*T*C_I*T*T | 24 | CpG-CpI:次黄苷(I) |
19 | T*MeC_G*T*MeC_G*T*T*T*T*G*A*MeC_G*T*T*T*T*G*T*MeC_G*T*T | 24 | CpG-MeCpG:5′-甲基-胞嘧啶(MeC) |
20 | T*H_G*T*H_G*T*T*T*T*G*A*H_G*T*T*T*T*G*T*H_G*T*T | 24 | CpG-HpG:5-羟基-胞嘧啶(H) |
21 | T*C_7*T*C_7*T*T*T*T*G*A*C_7*T*T*T*T*G*T*C_7*T*T | 24 | CpG-Cp7:7-脱氮 |
-鸟苷(7) | |||
22 | U*C_G*U*C_G*U*U*U*U*G*A*C_G*U*U*U*U*G*U*C_G*U*U | 24 | T-U:Uracile(U) |
23 | T*G*T*C*G*T*T | 7 | |
24 | T*G*T*C_G*T*T | 7 | |
25 | G*T*C*G*T*T | 6 | |
26 | G*T*C_G*T*T | 6 | |
27 | G*T*C*G*T | 5 | |
28 | G*T*C_G*T | 5 | |
29 | T*C*G*T*T | 5 | |
30 | T*C_G*T*T | 5 | |
31 | C_G | 2 | |
32 | T*C_G*T*C_G*T*T*T*C_G*T*C_G*T*T | 16 | |
33 | T*C_G*T*C_G*T*T*T*T_G*T*C_G*T*T | 16 | |
34 | T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T | 24 | |
35 | T*C_G*T*C_G*T*T*T*T_G*T*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T*T | 24 | |
36 | G*T*C§G*T*T | 6 | 甲基膦酸酯 |
37 | G*T*C+G*T*T | 6 | 磷酸乙酯 |
38 | T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*T*C*G*G*T*C*G*T*T*T*T | 21 | |
39 | C*G | 2 | |
40 | C-G-iami-6 | 2 | 3’氨基己基 |
41 | ami6-C-G | 2 | 5’氨基己基 |
42 | ami6-C-G-iami6 | 2 | 3’5’二氨基己基 |
43 | (C-G-L-)2doub-but | 2x2 | 六乙二醇化接头二键体亚磷酰胺丁酸酯 |
认为前面所写的说明书足以使本领域的技术人员实施本发明。本发明不限于所提供的实施例限制的范围,因为实施例是作为本发明一个方面的单一例证,其它功能等同的实施方案也在本发明的范围内。除了此处所显示和描述的之外,从前面的描述中,本发明的多种修饰对于本领域的技术人员来说是显而易见的,并且落入所附权利要求范围内。本发明的优点和目标不一定包括在本发明的每一个实施方案中。
序列表
<110>科勒制药集团公司
<120>免疫刺激寡核苷酸
<130>C1037.70060WO00
<140>还未分配
<141>2006-02-24
<150>US 60/655,931
<151>2005-02-26
<160>43
<170>PatentIn版本3.3
<210>1
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>1
tcgtcgtttt gacgttttgt cgtt 24
<210>2
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>2
tcgttttgac gttttgtcgt t 21
<210>3
<211>13
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>3
tcgttttgac gtt 13
<210>4
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>4
tcgtcgtttt gacgttttgt cgtt 24
<210>5
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>5
tcgtcgtttt gacgttttgt cgtt 24
<210>6
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>6
tcgtcgtttt gacgttttgt cgtt 24
<210>7
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>7
tcgtcgtttt gacgttttgt cgtt 24
<210>8
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>8
gtcgttttga cgttttgtcg tt 22
<210>9
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>9
tcgtcgtttt gacgttttgt c 21
<210>10
<211>13
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>10
tcgtcgtttt gac 13
<210>11
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>11
gttttgacgt tttgtc 16
<210>12
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>12
gttttgacgt tttgtcgtt 19
<210>13
<211>14
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>13
gtcgttttga cgtt 14
<210>14
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>14
tcgttttgac gttttgtc 18
<210>15
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>15
gtcgttttga cgttttgtc 19
<210>16
<211>11
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>16
gtcgttttga c 11
<210>17
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>17
cgtcgttttg acgttttgtc gtt 23
<210>18
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(3)..(3)
<223>次黄苷
<220>
<221>misc_feature
<222>(6)..(6)
<223>次黄苷
<220>
<221>misc_feature
<222>(14)..(14)
<223>次黄苷
<220>
<221>misc_feature
<222>(22)..(22)
<223>次黄苷
<400>18
tcntcntttt gacnttttgt cntt 24
<210>19
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(2)..(2)
<223>甲基胞嘧啶
<220>
<221>misc_feature
<222>(5)..(5)
<223>甲基胞嘧啶
<220>
<221>misc_feature
<222>(13)..(13)
<223>甲基胞嘧啶
<220>
<221>misc_feature
<222>(21)..(21)
<223>甲基胞嘧啶
<400>19
tcgtcgtttt gacgttttgt cgtt 24
<210>20
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(2)..(2)
<223>羟基胞嘧啶
<220>
<221>misc_feature
<222>(5)..(5)
<223>羟基胞嘧啶
<220>
<221>misc_feature
<222>(13)..(13)
<223>羟基胞嘧啶
<220>
<221>misc_feature
<222>(21)..(21)
<223>羟基胞嘧啶
<400>20
tngtngtttt gangttttgt ngtt 24
<210>21
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(3)..(3)
<223>7-脱氮鸟苷
<220>
<221>misc_feature
<222>(6)..(6)
<223>7-脱氮鸟苷
<220>
<221>misc_feature
<222>(14)..(14)
<223>7-脱氮鸟苷
<220>
<221>misc_feature
<222>(22)..(22)
<223>7-脱氮鸟苷
<400>21
tcntcntttt gacnttttgt cntt 24
<210>22
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1)
<223>尿嘧啶
<220>
<221>misc_feature
<222>(4)..(4)
<223>尿嘧啶
<220>
<221>misc_feature
<222>(7)..(10)
<223>尿嘧啶
<220>
<221>misc_feature
<222>(15)..(18)
<223>尿嘧啶
<220>
<221>misc_feature
<222>(20)..(20)
<223>尿嘧啶
<220>
<221>misc_feature
<222>(23)..(24)
<223>尿嘧啶
<400>22
ncgncgnnnn gacgnnnngn cgnn 24
<210>23
<211>7
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>23
tgtcgtt 7
<210>24
<211>7
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>24
tgtcgtt 7
<210>25
<211>6
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>25
gtcgtt 6
<210>26
<211>6
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>26
gtcgtt 6
<210>27
<211>5
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>27
gtcgt 5
<210>28
<211>5
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>28
gtcgt 5
<210>29
<211>5
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>29
tcgtt 5
<210>30
<211>5
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>30
tcgtt 5
<210>31
<211>2
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>31
cg 2
<210>32
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>32
tcgtcgtttc gtcgtt 16
<210>33
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>33
tcgtcgtttt gtcgtt 16
<210>34
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>34
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210>35
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>35
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210>36
<211>6
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(2)..(3)
<223>甲基膦酸酯接头
<400>36
gtcgtt 6
<210>37
<211>6
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(2)..(3)
<223>磷酸乙酯接头
<400>37
gtcgtt 6
<210>38
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>38
tcgtcgtttt tcggtcgttt t 21
<210>39
<211>2
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>39
cg 2
<210>40
<211>2
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(2)..(2)
<223>3’-氨基己基
<400>40
cg 2
<210>41
<211>2
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1)
<223>5’-氨基己基
<400>41
cg 2
<210>42
<211>2
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1)
<223>3’-氨基己基
<220>
<221>misc_feature
<222>(2)..(2)
<223>5’-氨基己基
<400>42
cg 2
<210>43
<211>4
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(2)..(3)
<223>六乙二醇接头
<400>43
cggc 4
Claims (52)
1.长度为3到24个核苷酸的寡核苷酸,其包含至少一个具有磷酸二酯或磷酸二酯样核苷酸间键的YZ二核苷酸和至少4T核苷酸,其中Y是包含嘧啶或经修饰的嘧啶碱基的核苷酸,Z是包含鸟嘌呤或经修饰的鸟嘌呤的核苷酸,并且其中该寡核苷酸包括至少一个稳定化的核苷酸间键。
2.权利要求1的寡核苷酸,其中该寡核苷酸包括TTTT基序。
3.权利要求2的寡核苷酸,其中该寡核苷酸只有一个YZ二核苷酸。
4.权利要求3的寡核苷酸,其中该寡核苷酸是G*T*C_G*T*T*T*T*G*A*C(SEQ ID NO.:16)或G*T*T*T*T*G*A*C_G*T*T*T*T*G*T*C(SEQ ID NO.:11),其中*是指存在稳定化的核苷酸间键,是指存在磷酸二酯核苷酸间键。
5.权利要求2的寡核苷酸,其中该寡核苷酸只有两个YZ二核苷酸。
6.权利要求5的寡核苷酸,其中该寡核苷酸选自T*C_G*T*T*T*T*G*A*C_G*T*T(SEQ ID NO.:3)、T*C_G*T*C_G*T*T*T*T*G*A*C(SEQ ID NO.:10)、G*T*T*T*T*G*A*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T*T(SEQ ID NO.:12)、G*T*C_G*T*T*T*T*G*A*C_G*T*T(SEQ ID NO.:13)、T*C_G*T*T*T*T*G*A*C_G*T*T*T*T*G*T*C(SEQ ID NO.:14)和G*T*C_G*T*T*T*T*G*A*C_G*T*T*T*T*G*T*C(SEQ ID NO.:15),其中*是指存在稳定化的核苷酸间键,是指存在磷酸二酯核苷酸间键。
7.权利要求2的寡核苷酸,其中该寡核苷酸只有三个YZ二核苷酸。
8.权利要求7的寡核苷酸,其中该寡核苷酸选自T*C_G*T*T*T*T*G*A*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T*T(SEQ ID NO.:2)、G*T*C_G*T*T*T*T*G*A*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T*T(SEQID NO.:8)、T*C_G*T*C_G*T*T*T*T*G*A*C_G*T*T*T*T*G*T*C(SEQ ID NO.:9)和T*C_G*T*C_G*T*T*T*T*G*A*C(SEQ ID NO.:10),其中*是指存在稳定化的核苷酸间键,是指存在磷酸二酯核苷酸间键。
9.权利要求2的寡核苷酸,其中该寡核苷酸只有四个YZ二核苷酸。
10.权利要求9的寡核苷酸,其中该寡核苷酸选自T*C_G*T*C_G*T*T*T_T*G*A*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T*T(SEQ ID NO.:4)、T*C_G*T*C_G*T*T*T_T*G*A*C_G*T*T*T_T*G*T*C_G*T*T(SEQ ID NO.:5)、T*C_G*T*C_G*T_T*T_T*G_A*C_G*T_T*T_T*G_T*C_G*T*T(SEQ ID NO.:6)、C_G*T*C_G*T*T*T*T*G*A*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T*T(SEQID NO.:17)、T*C_I*T*C_I*T*T*T*T*G*A*C_I*T*T*T*T*G*T*C_I*T*T(SEQ IDNO.:18)、T*MeC_G*T*MeC_G*T*T*T*T*G*A*MeC_G*T*T*T*T*G*T*MeC_G*T*T(SEQ ID NO.:19)、T*H_G*T*H_G*T*T*T*T*G*A*H_G*T*T*T*T*G*T*H_G*T*T(SEQ ID NO.:20)、T*C_7*T*C_7*T*T*T*T*G*A*C_7*T*T*T*T*G*T*C_7*T*T(SEQID NO.:21)和U*C_G*U*C_G*U*U*U*U*G*A*C_G*U*U*U*U*G*U*C_G*U*U(SEQ ID NO.:22),其中*是指存在稳定化的核苷酸间键,_是指存在磷酸二酯核苷酸间键,其中I是指包含次黄嘌呤碱基的次黄苷;MeC是5’-甲基-胞嘧啶,H是5-羟基-胞嘧啶,7是7-脱氮-鸟嘌呤,U是尿嘧啶。
11.权利要求1的寡核苷酸,其中每个YZ二核苷酸具有磷酸二酯或磷酸二酯样核苷酸间键。
12.权利要求1的寡核苷酸,其中Y是包含未甲基化胞嘧啶的核苷酸。
13.权利要求1的寡核苷酸,其中Z是包含鸟嘌呤的核苷酸.
14.权利要求1的寡核苷酸,其中磷酸二酯样键是硼代膦酸酯或者非对映纯的Rp硫代磷酸酯。
15.权利要求1的寡核苷酸,其中稳定化的核苷酸间键选自硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、甲基硫代磷酸酯和其任一组合。
16.权利要求1的寡核苷酸,其中Y是包含选自5-甲基胞嘧啶、5-甲基异胞嘧啶、5-羟基胞嘧啶、5-卤代胞嘧啶、尿嘧啶、N4-乙基胞嘧啶、5-氟尿嘧啶和氢的胞嘧啶或经修饰的胞嘧啶碱基的核苷酸。
17.权利要求1的寡核苷酸,其中Z是包含选自7-脱氮鸟嘌呤、7-脱氮-7-取代的鸟嘌呤,如7-脱氮-7-(C2-C6)炔基鸟嘌呤,7-脱氮-8-取代的鸟嘌呤、次黄嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、2-氨基嘌呤、嘌呤、8-取代的鸟嘌呤,如8-羟基鸟嘌呤,以及6-硫鸟嘌呤、2-氨基嘌呤和氢的鸟嘌呤或经修饰的鸟嘌呤碱基的核苷酸。
18.权利要求1的寡核苷酸,其中该寡核苷酸具有3’-3’键,其具有一个或两个可接近的5’末端。
19.权利要求1的寡核苷酸,其中该寡核苷酸具有两个可接近的5’末端,每一个都是5’TCG。
20.长度为2到7个核苷酸的寡核苷酸,其中该寡核苷酸具有至少一个YZ二核苷酸,该YZ二核苷酸具有磷酸二酯或磷酸二酯样核苷酸间键,其中Y是包含嘧啶或经修饰的嘧啶碱基的核苷酸,其中Z是包含鸟嘌呤或经修饰的鸟嘌呤的核苷酸,并且其中该寡核苷酸包括至少一个稳定化的核苷酸间键。
21.权利要求20的寡核苷酸,其中该寡核苷酸只有一个YZ二核苷酸。
22.权利要求20的寡核苷酸,其中该寡核苷酸选自T*G*T*C*G*T*T(SEQ ID NO.:23)、T*G*T*C_G*T*T(SEQ ID NO.:24)、G*T*C*G*T*T(SEQ ID NO.:25)、G*T*C_G*T*T(SEQ ID NO.:26)、G*T*C*G*T(SEQ ID NO.:27)、G*T*C_G*T(SEQ ID NO.:28)、T*C*G*T*T(SEQ ID NO.:29)、T*C_G*T*T(SEQ ID NO.:30)和C_G(SEQ ID NO.:31),其中*是指存在稳定化的核苷酸间键,_是指存在磷酸二酯核苷酸间键。
23.权利要求20的寡核苷酸,其中Y是未甲基化的C。
24.权利要求20的寡核苷酸,其中Z是包含鸟嘌呤的核苷酸.
25.权利要求20的寡核苷酸,其中所述稳定化的核苷酸间键是硫代磷酸酯。
26.权利要求20的寡核苷酸,其中Y是包含选自5-甲基胞嘧啶、5-甲基异胞嘧啶、5-羟基胞嘧啶、5-卤代胞嘧啶、尿嘧啶、N4-乙基胞嘧啶、5-氟尿嘧啶和氢的胞嘧啶或经修饰的胞嘧啶碱基的核苷酸。
27.权利要求20的寡核苷酸,其中Z是包含选自7-脱氮鸟嘌呤、7-脱氮-7-取代的鸟嘌呤,如7-脱氮-7-(C2-C6)炔基鸟嘌呤,7-脱氮-8-取代的鸟嘌呤、次黄嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、2-氨基嘌呤、嘌呤、8-取代的鸟嘌呤,如8-羟基鸟嘌呤,以及6-硫鸟嘌呤、2-氨基嘌呤和氢的鸟嘌呤或经修饰的鸟嘌呤碱基的核苷酸。
28.权利要求20的寡核苷酸,其中该寡核苷酸具有3’-3’键,其具有一个或两个可接近的5’末端。
29.权利要求20的寡核苷酸,其中该寡核苷酸具有两个可接近的5’末端,每一个都是5’TCG。
30.长度为7个核苷酸的寡核苷酸,其中该寡核苷酸具有至少一个CG二核苷酸,其中该寡核苷酸包括至少一个稳定化的核苷酸间键。
31.权利要求30的寡核苷酸,其中所有的核苷酸间键都是硫代磷酸酯键。
32.长度为5到7个核苷酸的寡核苷酸,其中该寡核苷酸包含GTCGT或TCGTT,并且其中该寡核苷酸包括至少一个稳定化的核苷酸间键。
33.权利要求32的寡核苷酸,其中所有的核苷酸间键都是硫代磷酸酯键。
34.包含至少一个具有磷酸乙酯或甲基膦酸酯键的YZ二核苷酸的寡核苷酸,其中Y是包含嘧啶或经修饰的嘧啶碱基的核苷酸,其中Z是包含鸟嘌呤或经修饰的鸟嘌呤的核苷酸。
35.权利要求34的寡核苷酸,其中该寡核苷酸长度为4-100个核苷酸。
36.寡核苷酸,其包含至少一个具有磷酸二酯或磷酸二酯样核苷酸间键的YZ二核苷酸,其中Y是包含嘧啶或经修饰的嘧啶碱基的核苷酸,其中Z是包含鸟嘌呤或经修饰的鸟嘌呤的核苷酸,并且其中该寡核苷酸在其3’末端含有氨基己基基团。
37.寡核苷酸,其包含至少一个具有磷酸二酯或磷酸二酯样核苷酸间键的YZ二核苷酸,其中Y是包含嘧啶或经修饰的嘧啶碱基的核苷酸,其中Z是包含鸟嘌呤或经修饰的鸟嘌呤的核苷酸,并且其中该寡核苷酸在其5’末端含有氨基己基基团。
38.寡核苷酸,其包含至少一个具有磷酸二酯或磷酸二酯样核苷酸间键的YZ二核苷酸,其中Y是包含嘧啶或经修饰的嘧啶碱基的核苷酸,其中Z是包含鸟嘌呤或经修饰的鸟嘌呤的核苷酸,并且其中该寡核苷酸在其5’和3’末端含有氨基己基基团。
39.权利要求36-38任一项的寡核苷酸,其中该寡核苷酸包括至少一个稳定化的核苷酸间键。
40.权利要求36-38任一项的寡核苷酸,其中该寡核苷酸长度为4-100个核苷酸。
41.权利要求36-38任一项的寡核苷酸,其中Y是包含未甲基化胞嘧啶的核苷酸。
42.治疗癌症的方法,其包括对患有癌症的受试者施用治疗癌症有效量的权利要求1-41任一项的寡核苷酸。
43.治疗变态反应的方法,其包括对患有变态反应或有变态反应风险的受试者施用治疗变态反应有效量的权利要求1-41任一项的寡核苷酸。
44.治疗哮喘的方法,其包括对患有哮喘的受试者施用治疗哮喘有效量的权利要求1-41任一项的寡核苷酸。
45.治疗感染性疾病的方法,其包括包含对患有感染性疾病或有感染性疾病风险的受试者施用治疗感染性疾病有效量的权利要求1-41任一项的寡核苷酸。
46.包含权利要求1-41任一项所述的寡核苷酸和可药用载体的药物。
47.权利要求1-41任一项所述的寡核苷酸在制造药物中的用途,所述药物用于治疗或预防受试者中病毒、真菌、细菌或寄生虫感染的方法中。
48.权利要求47的用途,其中所述病毒感染是由乙型肝炎病毒引起的。
49.权利要求47的用途,其中所述病毒感染是由丙型肝炎病毒引起的。
50.权利要求1-41任一项所述的寡核苷酸在制造用于治疗或预防受试者中癌症的方法的药物中的用途。
51.权利要求1-41任一项所述的寡核苷酸在制造用于治疗或预防受试者中哮喘或变态反应的方法的药物中的用途。
52.权利要求1-41任一项所述的寡核苷酸在制造药物中的用途,所述药物在免疫治疗/化学治疗之前、与之一起或之后施用。
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Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN111447949A (zh) * | 2017-12-15 | 2020-07-24 | 拜耳动物保健有限责任公司 | 免疫刺激寡核苷酸 |
Families Citing this family (66)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20030109469A1 (en) * | 1993-08-26 | 2003-06-12 | Carson Dennis A. | Recombinant gene expression vectors and methods for use of same to enhance the immune response of a host to an antigen |
US6727230B1 (en) * | 1994-03-25 | 2004-04-27 | Coley Pharmaceutical Group, Inc. | Immune stimulation by phosphorothioate oligonucleotide analogs |
US6207646B1 (en) | 1994-07-15 | 2001-03-27 | University Of Iowa Research Foundation | Immunostimulatory nucleic acid molecules |
US7935675B1 (en) * | 1994-07-15 | 2011-05-03 | University Of Iowa Research Foundation | Immunostimulatory nucleic acid molecules |
US6429199B1 (en) * | 1994-07-15 | 2002-08-06 | University Of Iowa Research Foundation | Immunostimulatory nucleic acid molecules for activating dendritic cells |
US20030026782A1 (en) | 1995-02-07 | 2003-02-06 | Arthur M. Krieg | Immunomodulatory oligonucleotides |
US6239116B1 (en) | 1994-07-15 | 2001-05-29 | University Of Iowa Research Foundation | Immunostimulatory nucleic acid molecules |
US6406705B1 (en) | 1997-03-10 | 2002-06-18 | University Of Iowa Research Foundation | Use of nucleic acids containing unmethylated CpG dinucleotide as an adjuvant |
DE69837094T2 (de) * | 1997-09-05 | 2007-08-30 | The Regents Of The University Of California, Oakland | Verwendung von immunerregenden oligonukleotiden zur vorbeugung oder behandlung von asthma |
IL139646A0 (en) * | 1998-05-14 | 2002-02-10 | Coley Pharm Group Inc | Methods for regulating hematopoiesis using cpg-oligonucleotides |
SI1077722T1 (sl) | 1998-05-22 | 2007-02-28 | Ottawa Health Research Inst | Metode in produkti za induciranje sluznicne imunosti |
US20030022854A1 (en) | 1998-06-25 | 2003-01-30 | Dow Steven W. | Vaccines using nucleic acid-lipid complexes |
JP5084984B2 (ja) | 1999-02-17 | 2012-11-28 | シーエスエル、リミテッド | 免疫原複合体およびそれに関する方法 |
US6949520B1 (en) * | 1999-09-27 | 2005-09-27 | Coley Pharmaceutical Group, Inc. | Methods related to immunostimulatory nucleic acid-induced interferon |
US7585847B2 (en) * | 2000-02-03 | 2009-09-08 | Coley Pharmaceutical Group, Inc. | Immunostimulatory nucleic acids for the treatment of asthma and allergy |
EP1296714B1 (en) * | 2000-06-22 | 2009-08-26 | University Of Iowa Research Foundation | Combination of CpG and antibodies directed against CD19,CD20, CD22 or CD40 for the treatment or prevention of cancer. |
KR100917101B1 (ko) * | 2000-08-04 | 2009-09-15 | 도요 보세키 가부시키가이샤 | 플렉시블 금속적층체 및 그 제조방법 |
EP1985702A3 (en) * | 2000-12-08 | 2010-08-18 | Coley Pharmaceutical GmbH | CPG-like nucleic acids and methods of use thereof |
KR100991644B1 (ko) | 2001-08-17 | 2010-11-02 | 콜리 파마슈티칼 게엠베하 | 활성이 개량된 조합 모티프 면역자극성 올리고뉴클레오티드 |
ES2734652T3 (es) | 2002-04-04 | 2019-12-11 | Zoetis Belgium S A | Oligorribonucleótidos inmunoestimulantes que contienen G y U |
US7807803B2 (en) | 2002-07-03 | 2010-10-05 | Coley Pharmaceutical Group, Inc. | Nucleic acid compositions for stimulating immune responses |
US7569553B2 (en) * | 2002-07-03 | 2009-08-04 | Coley Pharmaceutical Group, Inc. | Nucleic acid compositions for stimulating immune responses |
US20040053880A1 (en) | 2002-07-03 | 2004-03-18 | Coley Pharmaceutical Group, Inc. | Nucleic acid compositions for stimulating immune responses |
US7605138B2 (en) * | 2002-07-03 | 2009-10-20 | Coley Pharmaceutical Group, Inc. | Nucleic acid compositions for stimulating immune responses |
US7576066B2 (en) * | 2002-07-03 | 2009-08-18 | Coley Pharmaceutical Group, Inc. | Nucleic acid compositions for stimulating immune responses |
AR040996A1 (es) | 2002-08-19 | 2005-04-27 | Coley Pharm Group Inc | Acidos nucleicos inmunoestimuladores |
PT2241325E (pt) | 2002-10-29 | 2012-04-12 | Coley Pharm Gmbh | Utilização de oligonucleótidos cpg no tratamento de infecção com vírus da hepatite c |
JP2006512927A (ja) | 2002-12-11 | 2006-04-20 | コーリー ファーマシューティカル グループ,インコーポレイテッド | 5’cpg核酸およびその使用方法 |
WO2005007672A2 (en) * | 2003-06-20 | 2005-01-27 | Coley Pharmaceutical Gmbh | Small molecule toll-like receptor (tlr) antagonists |
SG123799A1 (en) | 2003-10-30 | 2006-07-26 | Coley Pharm Gmbh | C-class oligonucleotide analogs with enchanced immunostimulatory potency |
US20050239733A1 (en) * | 2003-10-31 | 2005-10-27 | Coley Pharmaceutical Gmbh | Sequence requirements for inhibitory oligonucleotides |
WO2005097993A2 (en) * | 2004-02-19 | 2005-10-20 | Coley Pharmaceutical Group, Inc. | Immunostimulatory viral rna oligonucleotides |
EP1753453A2 (en) * | 2004-06-08 | 2007-02-21 | Coley Pharmaceutical GmbH | Abasic oligonucleotide as carrier platform for antigen and immunostimulatory agonist and antagonist |
MY159370A (en) | 2004-10-20 | 2016-12-30 | Coley Pharm Group Inc | Semi-soft-class immunostimulatory oligonucleotides |
CA2598992A1 (en) * | 2005-02-24 | 2006-08-31 | Coley Pharmaceutical Group, Inc. | Immunostimulatory oligonucleotides |
WO2006110607A2 (en) * | 2005-04-08 | 2006-10-19 | Coley Pharmaceutical Group, Inc. | Methods for treating infectious disease exacerbated asthma |
WO2007008463A2 (en) * | 2005-07-07 | 2007-01-18 | Coley Pharmaceutical Group, Inc. | Anti-ctla-4 antibody and cpg-motif-containing synthetic oligodeoxynucleotide combination therapy for cancer treatment |
BRPI0616235A2 (pt) * | 2005-09-16 | 2011-06-14 | Coley Pharm Gmbh | acido ribonuclÉico monofilamentado imunoestimulante com cadeia principal de fosfodiÉster |
AU2006290435A1 (en) * | 2005-09-16 | 2007-03-22 | Coley Pharmaceutical Gmbh | Modulation of immunostimulatory properties of short interfering ribonucleic acid (siRNA) by nucleotide modification |
BRPI0618857B1 (pt) | 2005-11-25 | 2022-07-19 | Zoetis Belgium S.A | Oligonucleotídeo de rna isolado, e método para regular negativamente células reguladoras cd4+ imunossupressoras |
PT1991678E (pt) * | 2006-02-15 | 2015-11-25 | Adiutide Pharmaceuticals Gmbh | Composições e métodos para formulações de oligonucleótidos |
US20100189772A1 (en) * | 2006-09-27 | 2010-07-29 | Coley Pharmaceutical Group, Inc | Compositions of TLR ligands and antivirals |
CN101517082B (zh) | 2006-09-27 | 2014-01-22 | 科勒制药有限责任公司 | 具有增强的免疫刺激活性的含疏水性T类似物的CpG寡聚核苷酸类似物 |
WO2008068631A2 (en) * | 2006-12-06 | 2008-06-12 | Novartis Ag | Vaccines including antigen from four strains of influenza virus |
CA2687441A1 (en) * | 2007-05-17 | 2008-11-27 | Coley Pharmaceutical Group, Inc. | Class a oligonucleotides with immunostimulatory potency |
US9370531B2 (en) | 2007-08-31 | 2016-06-21 | New York University | Method of providing patient specific immune response in amyloidoses and protein aggregation disorders |
JP5710977B2 (ja) * | 2007-11-05 | 2015-04-30 | バルティック テクノロジー デヴェロプメント,リミテッド | 抗ウイルス薬としての修飾塩基を含むオリゴヌクレオチドの使用 |
US10383887B2 (en) * | 2008-02-20 | 2019-08-20 | New York University | Preventing and treating amyloid-beta deposition by stimulation of innate immunity |
WO2009144365A1 (en) * | 2008-05-30 | 2009-12-03 | Baltic Technology Development, Ltd. | Use of oligonucleotides with modified bases as antiviral agents |
BRPI0923225A2 (pt) | 2008-12-02 | 2016-10-04 | Chiralgen Ltd | metodo para sintese de acidos nucleicos modificados no atomo de fosforo |
EP3173097A3 (en) | 2009-02-10 | 2017-07-12 | Seqirus UK Limited | Influenza vaccines with reduced amounts of squalene |
KR101730351B1 (ko) | 2009-03-25 | 2017-04-28 | 보드 오브 리전츠, 더 유니버시티 오브 텍사스 시스템 | 병원체에 대한 포유동물의 선천성 면역 저항성의 자극을 위한 조성물 |
RU2612521C2 (ru) | 2009-07-06 | 2017-03-09 | Онтории, Инк. | Новые пролекарства нуклеиновых кислот и способы их применения |
US10428019B2 (en) | 2010-09-24 | 2019-10-01 | Wave Life Sciences Ltd. | Chiral auxiliaries |
US9821051B1 (en) | 2010-10-28 | 2017-11-21 | Seqirus UK Limited | Reducing hospitalization in elderly influenza vaccine recipients |
DK2640426T3 (en) * | 2010-11-16 | 2016-05-02 | Selecta Biosciences Inc | Immunostimulating Oligonucleotides |
GB201022007D0 (en) | 2010-12-24 | 2011-02-02 | Imp Innovations Ltd | DNA-sensor |
CN107365339A (zh) | 2011-07-19 | 2017-11-21 | 波涛生命科学有限公司 | 合成官能化核酸的方法 |
JP6246121B2 (ja) * | 2012-07-13 | 2017-12-13 | 株式会社新日本科学 | キラル核酸アジュバント |
EP2872485B1 (en) | 2012-07-13 | 2020-12-16 | Wave Life Sciences Ltd. | Asymmetric auxiliary group |
PL2872147T3 (pl) | 2012-07-13 | 2023-09-25 | Wave Life Sciences Ltd. | Sposób wytwarzania chiralnych oligonukleotydów |
WO2015108047A1 (ja) | 2014-01-15 | 2015-07-23 | 株式会社新日本科学 | 免疫誘導活性を有するキラル核酸アジュバンド及び免疫誘導活性剤 |
EP3095460A4 (en) | 2014-01-15 | 2017-08-23 | Shin Nippon Biomedical Laboratories, Ltd. | Chiral nucleic acid adjuvant having anti-allergic activity, and anti-allergic agent |
JPWO2015108048A1 (ja) | 2014-01-15 | 2017-03-23 | 株式会社新日本科学 | 抗腫瘍作用を有するキラル核酸アジュバンド及び抗腫瘍剤 |
JP6382344B2 (ja) | 2014-01-16 | 2018-08-29 | ウェイブ ライフ サイエンシズ リミテッドWave Life Sciences Ltd. | キラルデザイン |
US10286065B2 (en) | 2014-09-19 | 2019-05-14 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Compositions and methods for treating viral infections through stimulated innate immunity in combination with antiviral compounds |
Family Cites Families (60)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE4338704A1 (de) * | 1993-11-12 | 1995-05-18 | Hoechst Ag | Stabilisierte Oligonucleotide und deren Verwendung |
US5596091A (en) * | 1994-03-18 | 1997-01-21 | The Regents Of The University Of California | Antisense oligonucleotides comprising 5-aminoalkyl pyrimidine nucleotides |
US6727230B1 (en) * | 1994-03-25 | 2004-04-27 | Coley Pharmaceutical Group, Inc. | Immune stimulation by phosphorothioate oligonucleotide analogs |
WO1995026204A1 (en) * | 1994-03-25 | 1995-10-05 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Immune stimulation by phosphorothioate oligonucleotide analogs |
US6429199B1 (en) * | 1994-07-15 | 2002-08-06 | University Of Iowa Research Foundation | Immunostimulatory nucleic acid molecules for activating dendritic cells |
US6207646B1 (en) * | 1994-07-15 | 2001-03-27 | University Of Iowa Research Foundation | Immunostimulatory nucleic acid molecules |
ATE328890T1 (de) * | 1994-07-15 | 2006-06-15 | Univ Iowa Res Found | Immunomodulatorische oligonukleotide |
US7935675B1 (en) * | 1994-07-15 | 2011-05-03 | University Of Iowa Research Foundation | Immunostimulatory nucleic acid molecules |
US20030050263A1 (en) * | 1994-07-15 | 2003-03-13 | The University Of Iowa Research Foundation | Methods and products for treating HIV infection |
US6239116B1 (en) * | 1994-07-15 | 2001-05-29 | University Of Iowa Research Foundation | Immunostimulatory nucleic acid molecules |
US20030026782A1 (en) * | 1995-02-07 | 2003-02-06 | Arthur M. Krieg | Immunomodulatory oligonucleotides |
US5750674A (en) * | 1995-05-23 | 1998-05-12 | Hybridon, Inc. | Methods and compounds for the stereoselective enrichment of oligonucleotide diastereomers and oligonucleotides thereby produced |
US7034007B1 (en) * | 1995-06-07 | 2006-04-25 | East Carolina University | Low adenosine anti-sense oligonucleotide, compositions, kit & method for treatment of airway disorders associated with bronchoconstriction, lung inflammation, allergy(ies) & surfactant depletion |
EP0855184A1 (en) * | 1997-01-23 | 1998-07-29 | Grayson B. Dr. Lipford | Pharmaceutical composition comprising a polynucleotide and an antigen especially for vaccination |
AU738513B2 (en) * | 1997-02-28 | 2001-09-20 | University Of Iowa Research Foundation, The | Use of nucleic acids containing unmethylated CpG dinucleotide in the treatment of LPS-associated disorders |
US6406705B1 (en) * | 1997-03-10 | 2002-06-18 | University Of Iowa Research Foundation | Use of nucleic acids containing unmethylated CpG dinucleotide as an adjuvant |
AU7690898A (en) * | 1997-05-20 | 1998-12-11 | Ottawa Civic Hospital Loeb Research Institute | Vectors and methods for immunization or therapeutic protocols |
JP4280309B2 (ja) * | 1997-06-06 | 2009-06-17 | ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティー オブ カリフォルニア | Dna免疫刺激配列活性の阻害剤 |
WO1999001154A1 (en) * | 1997-07-03 | 1999-01-14 | University Of Iowa Research Foundation | Method for inhibiting immunostimulatory dna associated responses |
DE69935507T2 (de) * | 1998-04-03 | 2007-12-06 | University Of Iowa Research Foundation | Verfahren und produkte zur stimulierung des immunsystems mittels immunotherapeutischer oligonukleotide und zytokine |
IL139646A0 (en) * | 1998-05-14 | 2002-02-10 | Coley Pharm Group Inc | Methods for regulating hematopoiesis using cpg-oligonucleotides |
US6562798B1 (en) * | 1998-06-05 | 2003-05-13 | Dynavax Technologies Corp. | Immunostimulatory oligonucleotides with modified bases and methods of use thereof |
US6207819B1 (en) * | 1999-02-12 | 2001-03-27 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Compounds, processes and intermediates for synthesis of mixed backbone oligomeric compounds |
US6514948B1 (en) * | 1999-07-02 | 2003-02-04 | The Regents Of The University Of California | Method for enhancing an immune response |
SK287400B6 (sk) * | 1999-09-25 | 2010-08-09 | University Of Iowa Research Foundation | Prostriedok s obsahom imunostimulačnej nukleovej kyseliny a jeho použitie na stimuláciu imunitnej reakcie |
CN101491536B (zh) * | 1999-12-13 | 2012-07-04 | 拜昂尼科生命科学有限公司 | 治疗用合成寡核苷酸 |
AU2001227889A1 (en) * | 2000-01-14 | 2001-07-24 | The United States of America, represented by The Secretary, Department of Health & Human Services | Oligodeoxynucleotide and its use to induce an immune response |
EP1253947A4 (en) * | 2000-01-31 | 2005-01-05 | Univ California | IMMUNOMODULATED POLYNUCLEOTIDES FOR THE TREATMENT OF INFECTIONS BY INTRA-CELLULAR DISEASES |
US7585847B2 (en) * | 2000-02-03 | 2009-09-08 | Coley Pharmaceutical Group, Inc. | Immunostimulatory nucleic acids for the treatment of asthma and allergy |
US7129222B2 (en) * | 2000-03-10 | 2006-10-31 | Dynavax Technologies Corporation | Immunomodulatory formulations and methods for use thereof |
US20030129251A1 (en) * | 2000-03-10 | 2003-07-10 | Gary Van Nest | Biodegradable immunomodulatory formulations and methods for use thereof |
US6534062B2 (en) * | 2000-03-28 | 2003-03-18 | The Regents Of The University Of California | Methods for increasing a cytotoxic T lymphocyte response in vivo |
EP1296714B1 (en) * | 2000-06-22 | 2009-08-26 | University Of Iowa Research Foundation | Combination of CpG and antibodies directed against CD19,CD20, CD22 or CD40 for the treatment or prevention of cancer. |
AU2002248185A1 (en) * | 2000-12-14 | 2002-07-16 | Coley Pharmaceutical Group, Inc. | Inhibition of angiogenesis by nucleic acids |
DE60142410D1 (de) * | 2000-12-27 | 2010-07-29 | Dynavax Tech Corp | Immunomodulatorische polynukleotide und verfahren zur deren verwendung |
US20030050268A1 (en) * | 2001-03-29 | 2003-03-13 | Krieg Arthur M. | Immunostimulatory nucleic acid for treatment of non-allergic inflammatory diseases |
US7176296B2 (en) * | 2001-04-30 | 2007-02-13 | Idera Pharmaceuticals, Inc. | Modulation of oligonucleotide CpG-mediated immune stimulation by positional modification of nucleosides |
US7666674B2 (en) * | 2001-07-27 | 2010-02-23 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Use of sterically stabilized cationic liposomes to efficiently deliver CPG oligonucleotides in vivo |
US7514414B2 (en) * | 2001-09-24 | 2009-04-07 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Suppressors of CpG oligonucleotides and methods of use |
US7514415B2 (en) * | 2002-08-01 | 2009-04-07 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Method of treating inflammatory arthropathies with suppressors of CpG oligonucleotides |
US7276489B2 (en) * | 2002-10-24 | 2007-10-02 | Idera Pharmaceuticals, Inc. | Modulation of immunostimulatory properties of oligonucleotide-based compounds by optimal presentation of 5′ ends |
KR101092043B1 (ko) * | 2002-04-22 | 2011-12-12 | 바이오니취 라이프 사이언시즈 인코포레이티드 | 올리고뉴클레오티드 조성물 및 면역 반응 조절시 이의 용도 |
AU2003243409A1 (en) * | 2002-06-05 | 2003-12-22 | Coley Pharmaceutical Group, Inc. | Method for treating autoimmune or inflammatory diseases with combinations of inhibitory oligonucleotides and small molecule antagonists of immunostimulatory cpg nucleic acids |
US20040053880A1 (en) * | 2002-07-03 | 2004-03-18 | Coley Pharmaceutical Group, Inc. | Nucleic acid compositions for stimulating immune responses |
US7569553B2 (en) * | 2002-07-03 | 2009-08-04 | Coley Pharmaceutical Group, Inc. | Nucleic acid compositions for stimulating immune responses |
US7576066B2 (en) * | 2002-07-03 | 2009-08-18 | Coley Pharmaceutical Group, Inc. | Nucleic acid compositions for stimulating immune responses |
AR040996A1 (es) * | 2002-08-19 | 2005-04-27 | Coley Pharm Group Inc | Acidos nucleicos inmunoestimuladores |
PT2241325E (pt) * | 2002-10-29 | 2012-04-12 | Coley Pharm Gmbh | Utilização de oligonucleótidos cpg no tratamento de infecção com vírus da hepatite c |
CA2512484A1 (en) * | 2003-01-16 | 2004-05-08 | Hybridon, Inc. | Modulation of immunostimulatory properties of oligonucleotide-based compounds by utilizing modified immunostimulatory dinucleotides |
WO2005016235A2 (en) * | 2003-04-14 | 2005-02-24 | The Regents Of The University Of California | Combined use of impdh inhibitors with toll-like receptor agonists |
WO2005009355A2 (en) * | 2003-07-15 | 2005-02-03 | Hybridon, Inc. | Synergistic stimulation of the immune system using immunostimulatory oligonucleotides and/or immunomer compounds in conjunction with cytokines and/or chemotherapeutic agents or radiation therapy |
US20050100983A1 (en) * | 2003-11-06 | 2005-05-12 | Coley Pharmaceutical Gmbh | Cell-free methods for identifying compounds that affect toll-like receptor 9 (TLR9) signaling |
WO2005080567A1 (de) * | 2004-02-20 | 2005-09-01 | Mologen Ag | Substituiertes, nicht-kodierendes nukleinsäuremolekül zur therapeutischen und prophylaktischen immunstimulation in menschen und höheren tieren |
WO2005111057A2 (en) * | 2004-04-02 | 2005-11-24 | Coley Pharmaceutical Group, Inc. | Immunostimulatory nucleic acids for inducing il-10 responses |
AU2005257938B2 (en) * | 2004-06-15 | 2010-11-11 | Idera Pharmaceuticals, Inc. | Immunostimulatory oligonucleotide multimers |
JP2008506683A (ja) * | 2004-07-18 | 2008-03-06 | コーリー ファーマシューティカル グループ, リミテッド | 先天免疫応答を誘導するための方法および組成物 |
CA2598992A1 (en) * | 2005-02-24 | 2006-08-31 | Coley Pharmaceutical Group, Inc. | Immunostimulatory oligonucleotides |
US20070093439A1 (en) * | 2005-10-25 | 2007-04-26 | Idera Pharmaceuticals, Inc. | Short immunomodulatory oligonucleotides |
US7470674B2 (en) * | 2005-11-07 | 2008-12-30 | Idera Pharmaceuticals, Inc. | Immunostimulatory properties of oligonucleotide-based compounds comprising modified immunostimulatory dinucleotides |
PT1991678E (pt) * | 2006-02-15 | 2015-11-25 | Adiutide Pharmaceuticals Gmbh | Composições e métodos para formulações de oligonucleótidos |
-
2006
- 2006-02-24 CA CA002598992A patent/CA2598992A1/en not_active Abandoned
- 2006-02-24 EP EP06736157A patent/EP1851314A2/en not_active Withdrawn
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- 2006-02-24 JP JP2007557215A patent/JP2008531018A/ja active Pending
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN111447949A (zh) * | 2017-12-15 | 2020-07-24 | 拜耳动物保健有限责任公司 | 免疫刺激寡核苷酸 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO2006091915A2 (en) | 2006-08-31 |
US20080009455A9 (en) | 2008-01-10 |
AU2006216493A2 (en) | 2008-03-20 |
CA2598992A1 (en) | 2006-08-31 |
AU2006216493A9 (en) | 2008-04-03 |
JP2008531018A (ja) | 2008-08-14 |
US20060211644A1 (en) | 2006-09-21 |
AU2006216493A1 (en) | 2006-08-31 |
WO2006091915A3 (en) | 2007-03-15 |
EP1851314A2 (en) | 2007-11-07 |
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