JP2006512927A - 5’cpg核酸およびその使用方法 - Google Patents

5’cpg核酸およびその使用方法 Download PDF

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Abstract

本発明は、免疫応答を刺激するために有用である、5’TCGモチーフ、あるいは5’末端またはその付近にCGを含むCpG免疫刺激オリゴヌクレオチドのクラスに関する。本発明は、5’CpGを有しているCpG免疫賦活性オリゴヌクレオチドの特異的なサブクラスが、免疫賦活作用を仲介することにおいて非常に有効であるという発見に関する。これらのCpG核酸は、ガン、感染性疾患、アレルギー、喘息、および他の障害を処置するため、ならびに、ガンの化学療法後の日和見感染に対する防御を補助するために免疫系を刺激することに関して、治療的および予防的に有用である。

Description

(発明の分野)
本発明は、一般に、免疫賦活性核酸、その組成物、および免疫賦活性核酸を使用する方法に関する。

(発明の背景)
細菌のDNAは、B細胞およびナチュラルキラー細胞を活性化する免疫賦活作用を有しているが、脊椎動物のDNAはそうではない(Tokunaga、T.ら,1988、Jpn.J.Cancer Res.79:682−686;Tokunaga,T.ら,1984,JNCI 72:955−962;Messina,J.P.ら,1991,J.Immunol.147:1759−1764;およびKrieg,1998,Applied Oligonucleotide Technology,C.A.SteinおよびA.M.Krieg(編),John Wiley and Sons,Inc.,New York,NY,pp431−448、およびKrieg.A.M.,CpG motifs in bacterial DNA and their immune effects(2002)Annu.Rev.Immunol.20:709−760に概説されている)。これらの細菌DNAの免疫賦活作用は、特定の塩基の前後関係においてメチル化されていないCpGジヌクレオチド(GpGモチーフ)が存在する結果であると現在理解されている。このモチーフは細菌DNAに共通のものであるが、脊椎動物DNAにおいてはメチル化されており、実際以下に評価されている(Kriegら,1995 Nature 374:546−549;Krieg,1999 Biochim.Biophys.Acta 93321:1−10)。細菌DNAの免疫賦活作用は、これらのCpGモチーフを含んでいる合成オリゴデオキシヌクレオチド(ODN)を用いて模倣することができる。このようなCpG ODNはヒトおよびマウスの白血球に対して高い賦活作用を有し、その作用としては、B細胞の増殖;サイトカインおよび免疫グロブリンの分泌;ナチュラルキラー(NK)細胞溶解活性、およびIFN−γの分泌;ならびに樹状細胞(DC)および他の抗原提示細胞の活性化による共賦活分子を発現し、サイトカイン、特に、Th1様T細胞応答の発生を促進することにおいて重要なTh1様サイトカインを分泌する作用が挙げられる。天然のホスホジエステル骨格CpG ODNのこれらの免疫賦活作用は、CpGモチーフがメチル化されてGpCに変化した場合、または別の方法で除去されたかもしくは変化した場合に、この作用が大幅に低下するという点で、高度にCpG特異的である(Kriegら,1995 Nature 374:546−549;Hartmannら,1999,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,96:9305−10)。

初期の研究では、免疫賦活性CpGモチーフは、式プリン−プリン−CpG−ピリミジン−ピリミジンの後に続くと考えられていた(Kriegら,1995 Nature 374:546−549;Pisetsky,1996 J.Immunol.156:421−423;Hackerら,1998 EMBO J.17:6230−6240;Lipfordら,1998 Trends in Microbiol.6:496−500)。しかし、現在は、マウスのリンパ球が、この「式」の後には続かないホスホジエステルCpGモチーフに対して極めてよく応答すること(Yiら、1998 J.Immunol.160:5898−5906)、そして同じことがヒトのB細胞と樹状細胞についても当てはまること(Hartmannら、1999、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96:9305−10;Liang,1996 J.Clin.Invest.98:1119−1129)が明らかである。それでもなお、用語「CpGモチーフ」は、一般に、CpGジヌクレオチドが中心に位置しているヘキサマーモチーフを言及するために使用される。

(発明の要旨)
本発明は、5’CpGを有しているCpG免疫賦活性オリゴヌクレオチドの特異的なサブクラスが、免疫賦活作用を仲介することにおいて非常に有効であるという発見に関する。これらのCpG核酸は、ガン、感染性疾患、アレルギー、喘息、および他の障害を処置するため、ならびに、ガンの化学療法後の日和見感染に対する防御を補助するために免疫系を刺激することに関して、治療的および予防的に有用である。CpG刺激によって生じる強くさらにその上バランスのとれた細胞性および体液性の免疫応答は、侵襲性の病原体およびガン性の細胞に対する体自身の天然の防御システムを反映する。

詳細には、5’TCGモチーフを有している免疫賦活CpG含有オリゴヌクレオチドは、通常のヘキサマーモチーフよりも重要な治療特性を有している。さらなるメチル化されていないCpGモチーフを全く含まない5’TCGモチーフを有しているオリゴヌクレオチドは、強い免疫賦活能力を有していることが見出されている。1つの局面において、本発明は、以下のオリゴヌクレオチドを含む組成物である。
5’TCGX3’(ここで、Nは2〜95ヌクレオチドであり、XがCまたはAである場合は、XはA、T、またはCであり(配列番号61)、XがTである場合は、XはAまたはGであり(配列番号62)、XがGである場合は、Xは任意のヌクレオチドである(配列番号63))。

他の局面においては、本発明は、5’TCGTN3’(配列番号64)を含むオリゴヌクレオチドに関する。このオリゴヌクレオチドにおいては、Nは3〜96ヌクレオチドであるが、Nが16ヌクレオチドである場合は、NはC12(5’−CCCCCCCCCCC−3’、配列番号65)を含まず、Nが8ヌクレオチドである場合は、Nは少なくとも50%がCまたは70%がTである(配列番号66)。

他の態様によれば、5’TCGAN3’(配列番号67)を含むオリゴヌクレオチドが提供される。このオリゴヌクレオチドにおいては、Nは3〜96ヌクレオチドであるが、Nが19ヌクレオチドである場合は、Nは少なくとも55%がピリミジンであり(配列番号68)、Nが8ヌクレオチドである場合は、Nは少なくとも50%がTまたはCである(配列番号69)。

他の態様によれば、5’TCGN3’を含むオリゴヌクレオチドが提供される。このオリゴヌクレオチドにおいては、Nは10〜96ヌクレオチドであり、オリゴヌクレオチドのC含量は60%以下、オリゴヌクレオチドのA含量は30%以下である。

他の態様によれば、5’TYZN3’を含むオリゴヌクレオチドが提供される。このオリゴヌクレオチドにおいては、Nは4〜97ヌクレオチドであり、このオリゴヌクレオチドはメチル化されていないCGモチーフは含まない。Yは、シトシンまたは修飾されたシトシンである。Zは、グアニンまたは修飾されたグアニンである。1つの態様では、Yは、5’メチルシトシン、5−メチル−デオキシシトシン、5−メチル−デオキシイソシトシン、5−ヒドロキシ−デオキシシトシン、デオキシウリジン、N4−エチル−デオキシシトシン、2’−デオキシウリジン、5−フルオロ−2’−dU,およびdSpacerである。他の実施形態では、Zは、7−デアザグアニン、7−デアザ−7−置換グアニン(例えば、7−デアザ−7−(C2−C6)アルキニルグアニン)、7−デアザ−8−置換グアニン、ヒポキサンチン、2,6−ジアミノプリン、2−アミノプリン、プリン、8−ヒドロキシグアニンのような8−置換グアニン、および6−チオグアニン、イノシン、2−アミノプリン、ネブラリン、およびdSpacerである。

これらのオリゴヌクレオチドの式においては、5’はオリゴヌクレオチドの遊離の5’末端を意味し、3’はオリゴヌクレオチドの遊離の3’末端を意味する。

いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは以下の構造の1つを有する:5’TT3’(配列番号50)または5’TT3’(配列番号2)。は、ホスホロチオエート結合を意味する。

1つの実施形態によれば、オリゴヌクレオチドには少なくとも1つの修飾されたヌクレオチド間結合が含まれる。他の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも50%の修飾されたナヌクレオチド間結合を含む。状況によっては、オリゴヌクレオチドの全てのヌクレオチド間結合が修飾される。安定化されたヌクレオチド間結合は、ホスホロチオエート結合であり得る。

いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは20〜100ヌクレオチドの長さである。他の実施形態では、40ヌクレオチドまたはそれ未満の長さである。

はメチル化されていないCGモチーフは含まない。NはNによって定義することができる場合がある。ここでは、Nは8〜94ヌクレオチドであるか、またはいくつかの実施形態では8〜40ヌクレオチドであり、Nは2〜5個のピリミジンである。いくつかの実施形態では、NはTTTTT、TTTT、TTT、またはTTである。他の実施形態によれば、Nは少なくとも50%がピリミジンである場合があり、また少なくとも80%がピリミジンである場合もある。さらに他の実施形態では、NはポリA配列およびポリG配列を含まない。他の実施形態では、NはTNであり、Nは8〜94ヌクレオチドである。

本発明は、1つの態様において、免疫刺激ヌクレオチドの5’配列、それらの長さ、およびヌクレオチド間結合が、誘導される免疫応答のサイトカインプロファイルに対して特異的な影響を有していることの発見、およびこれらの発見を、改良された免疫刺激特性を有するCpG免疫刺激オリゴヌクレオチドのサブセットの設計に使用できることの発見に関係している。好ましいCpG免疫刺激オリゴヌクレオチドは、以下の6つの一般式の1つに含まれる:5’−XYRM−3’、5’−XCGM−3’、5’−XCGM−3’、5’−XCGM−3’、5’−XCGM−3’、および5’−TTGM−3’。これらの式によって、優れた免疫刺激特性を示し、別のメチル化されていないCpGモチーフをそれ以上は含まないCpGオリゴヌクレオチドのクラスのサブセットが定義される。これらの式においては、5’はオリゴヌクレオチドの遊離の5’末端を意味し、3’はオリゴヌクレオチドの遊離の3’末端を意味する。

本発明の1つの態様では、ODNは、一般式5’−XYRM−3’を有する。式中、Xは1ヌクレオチドであり;Yはシトシンまたは修飾されたシトシンであり;Rはグアニンまたは修飾されたグアニンであり;そしてMは1〜3ヌクレオチドの核酸である。本発明の他の実施形態によれば、オリゴヌクレオチドのヌクレオチド間結合は全てが安定化されたホスホロチオエートヌクレオチド間結合である。1つの実施形態では、YとRとの間のヌクレオチド間結合は、Rp立体配置のホスホジエステル結合である。本発明のいくつかの実施形態では、修飾されたシトシンはC5置換されており、そして/または修飾されたグアニンはC8またはC7置換されている。本発明の特定の実施形態では、置換されたまたは修飾されたCまたはGは、5−置換シトシン(例えば、5−メチル−シトシン、5−フルオロ−シトシン、5−クロロ−シトシン、5−ブロモ−シトシン、5−ヨード−シトシン、5−ヒドロキシ−シトシン、5−ヒドロキシメチル−シトシン、5−ジフルオロメチル−シトシン、および未置換もしくは置換された5−アルキニル−シトシン)、6−置換シトシン、N4−置換シトシン(例えば、N4−エチル−シトシン)、5−アザ−シトシン、2−メルカプト−シトシン、イソシトシン、シュード−イソシトシン、縮合環系を有しているシトシン類似体(例えば、N,N’−プロピレンシトシンまたはフェノキサジン)、ならびにウラシルおよびその誘導体(例えば、5−フルオロ−ウラシル、5−ブロモ−ウラシル、5−ブロモビニル−ウラシル、4−チオ−ウラシル、5−ヒドロキシ−ウラシル、5−プロピニル−ウラシル)、チミン誘導体(例えば、2−チオチミン、4−チオチミン、6−置換チミン)、7−デアザグアニン、7−デアザ−7−置換グアニン(例えば、7−デアザ−7−(C2−C6)アルキニルグアニン)、7−デアザ−8−置換グアニン、7−デアザ−8−アザ−グアニン、ヒポキサンチン、N2−置換グアニン(例えば、N2−メチル−グアニン)、5−アミノ−3−メチル−3H,6H−チアゾロ[4,5−d]ピリミジン−2,7−ジオン、2,6−ジアミノプリン、2−アミノプリン、プリン、インドール、アデニン、置換アデニン(例えば、N6−メチル−アデニン、8−オキソ−アデニン)、8−置換グアニン(例えば、8−ヒドロキシグアニン、および8−ブロモグアニン)、および6−チオグアニンからなる群より選択される。本発明の別の実施形態では、塩基は、一般的な塩基(例えば、4−メチル−インドール、5−ニトロ−インドール、3−ニトロピロール、P塩基、およびK塩基)、芳香環系(例えば、ベンゾイミダゾール、またはジクロロ−ベンゾイミダゾール、1−メチル−1H−[1,2,4]トリアゾール−3−カルボン酸アミド)、芳香環系(例えば、フルオロベンゼン、またはジフルオロベンゼン)、および水素原子(dSpacer)によって置換される。本発明の1つの実施形態によれば、オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの3’末端に連結された担体を用いて結合させられる。いくつかの実施形態では、担体は、微粒子、デンドリマー、リポソーム、カチオン錯体、および抗原からなる群より選択される。本発明のさらに別の実施形態では、ODNは、抗原とともに被験体に投与される。さらに別の実施形態では、CpG免疫刺激オリゴヌクレオチドは、被験体への治療プロトコールの投与と組み合わせた被験体の処置に有用である。本発明のいくつかの実施形態では、治療プロトコールは外科手術である。

いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは担体とは結合されない。他の実施形態では、オリゴヌクレオチドは多量体化された複合体である。必要に応じて、多量体化された複合体は、第2のオリゴヌクレオチドに対して多量体化単位によって連結させられたオリゴヌクレオチドを含む。第2のオリゴヌクレオチドは、式5’−XYRM−3’を有している場合もある。

1つの態様では、本発明の免疫刺激オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの3’末端に連結された多量体化単位を有している一般式5’−XYRM−3’を有する。Xは、1ヌクレオチド、またはジヌクレオチド、またはCGジヌクレオチドを含まないトリヌクレオチドから構成されている核酸である。Yはシトシンまたは修飾されたシトシンである。Rはグアニンまたは修飾されたグアニンである。Mは0〜27ヌクレオチドの核酸である。いくつかの実施形態では、免疫刺激オリゴヌクレオチドは、以下の構造を有する:5’−TCG−3’、5’−TCGT−3’、5’−UCG−3’、5’−UCGT−3’。さらに別の実施形態では、MはCGジヌクレオチドを含まない。本発明の別の実施形態によれば、Xは1ヌクレオチドであり、Xはピリミジンである。本発明の他の実施形態によれば、オリゴヌクレオチドのヌクレオチド間結合は全て、安定なホスホジエステルヌクレオチド間結合である。

いくつかの実施形態では、多量体化単位は、微粒子、デンドリマー、リポソーム、カチオン錯体、コレステロール、および抗原からなる群より選択される担体である。他の実施形態では、多量体化単位は、オリゴヌクレオチドの3’末端と第2のオリゴヌクレオチドとの間のリンカーである。

本発明のさらに別の実施形態では、ODNは抗原とともに被験体に投与される。さらに別の実施形態では、CpG免疫刺激オリゴヌクレオチドは、被験体に対する治療プロトコールの投与と組み合わせて被験体を処置するために有用である。本発明のいくつかの実施形態では、治療プロトコールは外科手術である。

本発明の別の態様によれば、免疫刺激オリゴヌクレオチドは、一般式5’−XCGM−3’を有する。式中、XはCGジヌクレオチドを含まない1ヌクレオチドであり;MはCGジヌクレオチドを含まない3〜27ヌクレオチドの核酸であり、Mは以下の特性の少なくとも1つを有する:TCジヌクレオチドを含まない、少なくとも30%がTヌクレオチドである、A、T、およびGから構成される、または少なくとも1つの修飾されたヌクレオチド間結合を有しているCCTTCCヘキサマーを含まない。いくつかの実施形態では、Mのうち、少なくとも35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、または100%がTまたはその修飾されたバージョンである。

別の態様では、免疫刺激オリゴヌクレオチドは、一般式5’−XCGM−3’を有する。式中、XはCGジヌクレオチドを含まないジヌクレオチドであり、MはCGジヌクレオチドを含まない2〜26ヌクレオチドの核酸であり、Mは以下の特性の少なくとも1つを有する:TGまたはGTジヌクレオチドを含まない、少なくとも38%がTヌクレオチドである、またはAおよびTから構成される。いくつかの実施形態では、Mのうち、少なくとも40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、または100%がAもしくはT、またはそれらの修飾されたバージョンである。

さらに別の態様では、免疫刺激オリゴヌクレオチドは、一般式5’−XCGM−3’を有する。式中、XはCGジヌクレオチドを含まないトリヌクレオチドであり、MはCGジヌクレオチドを含まない1〜25ヌクレオチドの核酸であり、Mは以下の特性の少なくとも1つを有する:CTジヌクレオチドを含まず、少なくとも1つのホスホロチオエート結合は含まない、少なくとも41%がTヌクレオチドである、またはAおよびCから構成される。いくつかの実施形態では、Mのうち、少なくとも45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、または100%がTまたはその修飾されたバージョンである。

本発明の別の態様によれば、免疫刺激オリゴヌクレオチドは、一般式5’−TTGM−3’を有する。式中、Mは5〜21ヌクレオチドからなる核酸であり、MはCGジヌクレオチドを含まず、Mは、少なくとも30%がTヌクレオチドから構成され、上記ヌクレオチドは10〜24ヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、Mのうち、少なくとも35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、または100%がTまたはその修飾されたバージョンである。

いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは以下の構造の1つを有する:
5’−TT−3’(配列番号32)
5’−TT−3’(配列番号27)
5’−TT−3’(配列番号28)。

記号は、安定なヌクレオチド間結合の存在を示し、_:はホスホジエステル結合の存在を意味する。

5’−XCGM−3’を含むオリゴヌクレオチドが、本発明の1つの態様にしたがって提供される。5’はオリゴヌクレオチドの5’末端を示し、3’はオリゴヌクレオチドの3’末端を示し、Xは1〜3ヌクレオチドであり、CGジヌクレオチドを含まない。Mは6〜27ヌクレオチドの核酸であり、少なくとも3個のCGジヌクレオチドを含み、少なくとも50%がTヌクレオチドである。1つの実施形態では、Mは16〜18ヌクレオチドの長さである。

いくつかの実施形態では、Mは少なくとも4個のCGジヌクレオチドを含む。他の実施形態では、少なくとも1つのCGジヌクレオチドにホスホジエステルヌクレオチド間結合が含まれる。状況によっては、少なくとも3個のCGジヌクレオチドにホスホジエステルヌクレオチド間結合が含まれる。オリゴヌクレオチドは、配列番号33、34、35、36、および37からなる群より選択することができる。

別の態様では、本発明は、5’−’TTGM−3’を含むオリゴヌクレオチドである。式中、5’はオリゴヌクレオチドの5’末端を示し、3’はオリゴヌクレオチドの3’末端を示し、Mは6〜18ヌクレオチドの核酸であり、少なくとも1つのCGジヌクレオチドを含み、少なくとも50%がTヌクレオチドである。状況によっては、Mは14ヌクレオチドの長さである。

免疫刺激オリゴヌクレオチドは、一般に、3から35ヌクレオチドの間の範囲の長さを有する。いくつかの実施形態では、長さは4〜6、3〜32、6〜30、または10〜24ヌクレオチドの範囲、あるいはその間の範囲にある任意の整数である。

1つの実施形態によれば、オリゴヌクレオチドには、少なくとも1つの修飾されたヌクレオチド間結合が含まれる。他の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも50%の修飾されたヌクレオチド間結合を含む。状況によっては、オリゴヌクレオチドの全てのヌクレオチド間結合が修飾される。安定なヌクレオチド間結合はホスホロチオエート結合であり得る。

別の態様では、本発明は、アレルギーまたは喘息を処置するための方法に関する。この方法は、アレルギーまたは喘息を処置するために有効な量の本明細書中に記載される免疫刺激CpGオリゴヌクレオチドを、アレルギーまたは喘息を有しているか、あるいはアレルギーまたは喘息を有するリスクのある被験体に投与することによって行われる。1つの実施形態では、オリゴヌクレオチドは粘膜表面に、例えば、呼吸組織に投与される。他の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、エアゾール処方物として投与される。状況によっては、オリゴヌクレオチドは鼻腔内に投与される。他の実施形態では、被験体はアレルギー性喘息を有しているか、またはアレルギー性喘息を発症するリスクがある。

サイトカインの産生を誘導するための方法は、本発明の別の態様にしたがって提供される。この方法は、IP10、IL6、IL8、IL12、IL18、TNF、IFN−α、ケモカイン、およびIFN−γからなる群より選択されるサイトカインを誘導するために有効な量の本明細書中に記載される免疫刺激CpGオリゴヌクレオチドを被験体に投与することによって行われる。

別の態様では、本発明は、抗原または他の治療用化合物、例えば、抗菌剤または抗ガン剤と組み合わせた、本明細書中に記載されるCpG免疫刺激オリゴヌクレオチドの組成物である。抗菌剤は、例えば、抗ウイルス剤、抗寄生虫剤、抗細菌剤、または抗真菌剤であり得る。

組成物には、必要に応じて薬学的担体が含まれ得、そして/または送達デバイス中に処方され得る。いくつかの実施形態では、送達デバイスは、カチオン性脂質、細胞浸透性タンパク質、および徐放デバイスからなる群より選択される。1つの実施形態では、徐放デバイスは生分解性ポリマーまたは微粒子である。

本発明の別の態様によれば、免疫応答を刺激する方法が提供される。この方法には、被験体の免疫応答を誘導するために有効な量のCpG免疫刺激オリゴヌクレオチドを被験体に投与する段階が含まれる。好ましくは、CpG免疫刺激オリゴヌクレオチドは、経口で、局所的に、徐放デバイスにおいて、粘膜から、全身に、非経口的に、または筋肉内に投与される。CpG免疫刺激オリゴヌクレオチドが粘膜表面に投与される場合は、これは、粘膜の免疫応答または全身の免疫応答を誘導するために有効な量で送達することができる。好ましい実施形態では、粘膜表面は、口腔表面、鼻腔表面、直腸表面、膣表面、または眼球表面である。

いくつかの実施形態では、この方法には、抗原に対して被験体をさらす段階が含まれる。ここでは、免疫応答は抗原特異的免疫応答である。いくつかの実施形態では、抗原は、腫瘍抗原、ウイルス抗原、細菌抗原、寄生虫抗原、およびペプチド抗原からなる群より選択される。

CpG免疫刺激オリゴヌクレオチドは、広域スペクトルの免疫応答を誘発することができる。例えば、これらのCpG免疫刺激オリゴヌクレオチドは、Th2免疫応答からTh1免疫応答へと向け直すために使用することができる。CpG免疫刺激オリゴヌクレオチドはまた、リンパ球(例えば、B細胞およびT細胞)、樹状細胞、およびNK細胞のような免疫細胞を活性化するために使用することもできる。活性化は、インビボ、インビトロ、またはエキソビボで、すなわち、被検体から免疫細胞を単離し、免疫細胞を、免疫細胞を活性化させるために有効な量のCpG免疫刺激オリゴヌクレオチドと接触させ、活性化された免疫細胞を被験体に再び投与することによって行うことができる。いくつかの実施形態では、樹状細胞はガン抗原を提示する。樹状細胞は、エキソビボでガン抗原にさらすことができる。

CpG免疫刺激オリゴヌクレオチドによって生じた免疫応答はまた、サイトカインの産生、例えば、IP10、IL6、IL8、IL12、IL18、TNF、IFN−α、ケモカイン、およびIFN−γの産生の誘導を生じる場合がある。

さらに別の実施形態では、CpG免疫刺激オリゴヌクレオチドは、ガンを有しているか、またはガンを発症するリスクのある被験体においてガンを処置するために有用である。ガンは、胆管ガン、乳ガン、子宮頸ガン、絨毛ガン、結腸ガン、子宮内膜ガン、胃ガン、上皮内ガン、リンパ腫、肝臓ガン、肺ガン(例えば、小細胞肺ガン、および非小細胞肺ガン)、黒色腫、神経芽細胞腫、口腔ガン、卵巣ガン、膵臓ガン、前立腺ガン、直腸ガン、肉腫、甲状腺ガン、および腎臓ガン、ならびに他のガン腫および肉腫からなる群より選択することができる。いくつかの重要な実施形態では、ガンは、骨のガン、脳および中枢神経のガン、結合組織のガン、食道ガン、眼のガン、ホジキンリンパ腫、喉頭ガン、口腔ガン、皮膚ガン、および睾丸ガンからなる群より選択される。

CpG免疫刺激オリゴヌクレオチドはまた、状況に応じて、CpG免疫刺激オリゴヌクレオチドが抗ガン治療と組み合わせて投与される場合には、ガン細胞のガン治療(すなわち、抗ガン治療)に対する反応性を増大させるためにも使用することができる。抗ガン治療とは、例えば、化学療法、ワクチン(例えば、インビトロで感作した樹状細胞ワクチンまたはガン抗原ワクチン)、または抗体に基づく治療のような免疫療法薬であり得る。この後者の治療法には、例えばガン細胞の、細胞表面抗原に特異的な抗体を投与することが含まれる場合がある。ここでは、免疫応答により、抗体依存性細胞傷害作用(ADCC)が生じる。1つの実施形態では、抗体は、リブタキシン(Ributaxin)、ハーセプチン(Herceptin)、クアドラメット(Quadramet)、パノレックス(Panorex)、IDEC−Y2B8、BEC2、C225、オンコリン(Oncolym)、SMART M195、ATRAGEN、オバレックス(Ovarex)、ベキサール(Bexxar)、LDP−03、ior t6、MDX−210、MDX−11、MDX−22、OV103、3622W94、抗VEGF、ゼナパックス(Zenapax)、MDX−220、MDX−447、MELIMMUNE−2、MELIMMUNE−1、CEACIDE、プレターゲット(Pretarget)、NovoMAb−G2、TNT、Gliomab−H、GNI−250、EMD−72000、リンフォシド(LymphoCide)、CMA 676、Monopharm−C、4B5、ior egf.r3、ior c5、BABS、抗FLK−2、MDX−260、ANA Ab、SMART 1D10 Ab、SMART ABL 364 Ab、およびImmuRAIT−CEAからなる群より選択することができる。

したがって、本発明のいくつかの態様にしたがうと、ガンを有しているか、またはガンを有するリスクのある被験体には、CpG免疫刺激オリゴヌクレオチドと抗ガン治療が投与される。いくつかの実施形態では、抗ガン治療は、化学療法薬、免疫療法薬、およびガンワクチンからなる群より選択される。

ガンを処置することに関するこれらの方法のさらに別の実施形態では、被験体にはさらに、インターフェロン−αを投与することができる。

他の態様では、本発明は、先天性の免疫応答を活性化するために有効な量のCpG免疫刺激オリゴヌクレオチドを被験体に投与することによる、先天性の免疫応答を誘導するための方法である。

本発明の別の態様によれば、ウイルス感染またはレトロウイルス感染を処置するための方法が提供される。この方法には、ウイルス感染またはレトロウイルス感染を有しているか、またはそれらの感染を有するリスクのある被験体に、ウイルス感染またはレトロウイルス感染を処置するために有効な量の本発明のいずれかの組成物を投与する段階が含まれる。いくつかの実施形態では、ウイルス感染は、肝炎ウイルス(例えば、B型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス)、HIV、ヘルペスウイルス、またはパピローマウイルスによって引き起こされる。

細菌感染を処置するための方法が、本発明の別の態様にしたがって提供される。この方法には、細菌感染を有しているか、または細菌感染を有するリスクのある被験体に、細菌感染を処置するために有効な量の本発明のいずれかの組成物を投与する段階が含まれる。1つの実施形態では、細菌感染は細胞内の細菌が原因である。

別の態様では、本発明は、寄生虫感染を有しているか、または寄生虫感染を有するリスクのある被験体に、寄生虫感染を処置するために有効な量の本発明のいずれかの組成物を投与することにより、寄生虫感染を処置するための方法である。1つの実施形態では、寄生虫感染は、細胞内の寄生虫が原因である。別の実施形態では、寄生虫感染は、蠕虫以外の寄生虫が原因である。

いくつかの実施形態では被験体はヒトであり、他の実施形態では、被験体はヒト以外の脊椎動物、例えば、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、シチメンチョウ、ヤギ、魚類、サル、ニワトリ、ラット、マウス、またはヒツジである。

別の態様では、本発明は、TH1免疫応答を生じるために有効な量の本発明のいずれかの組成物を被験体に投与することにより、TH1免疫応答を誘導するための方法に関する。

本発明の限定のそれぞれには、本発明の種々の実施形態を含めることができる。したがって、任意の1つの要素または要素の組み合わせを含む本発明の限定のそれぞれには、本発明のそれぞれの態様を含めることができると考えられる。

本発明は、添付の図面と組み合わせると、より容易に、そして完全に理解することができる。

本発明は、1つの態様において、5’TCGを有しているCpG免疫刺激オリゴヌクレオチドの特異的なサブクラスが免疫刺激作用を仲介することにおいて非常に効果的であることを発見したことに関する。これらのCpG核酸は、ガン、感染性疾患、アレルギー、喘息、および他の障害を処置するため、ならびに、ガンの化学療法後の日和見感染からの防御を促進するために免疫系を刺激することについて、治療的および予防的に有用である。CpG刺激によって生じる強く、さらにその上バランスのとれた細胞性および体液性の免疫応答は、侵襲性の病原体およびガン性の細胞に対する体自身の生まれつき備わっている防御システムを反映する。

本発明は、1つの態様において、CpG免疫刺激オリゴヌクレオチドのサブセットが、改良された免疫刺激特性を有していることの発見に関する。好ましいCpG免疫刺激オリゴヌクレオチドは、以下の5つの一般式の1つに含まれる:5’TCGX3’、5’TCGTN3’、5’TCGAN3’、5’TCGN3’、および5’TYZN3’(配列番号61〜69)。XおよびXは、1ヌクレオチドを意味する。

これらの式は、優れた免疫刺激特性を示し、さらに別のメチル化されていないCpGモチーフは含まない、CpGオリゴヌクレオチドのクラスのサブクラスを定義している。これらの式において、5’はオリゴヌクレオチドの遊離の5’末端を示し、3’はオリゴヌクレオチドの遊離の3’末端を意味している。

には、ヌクレオチド配列の可変のセットが含まれる。ヌクレオチド配列は2〜97ヌクレオチドの長さの範囲、またはこれらの間の範囲の任意の整数であり得る。本発明の発見は、CpGモチーフまたはYpZモチーフの位置効果の重要性の発見に一部基づく。さらに別のメチル化されていないCpGモチーフをその中には含まない5’TCGまたは5’TYZを有しているオリゴヌクレオチドは、免疫刺激能力が強いことが発見されている。オリゴヌクレオチドの残りは分子の5’末端に不可欠なモチーフが含まれている限りは、ヌクレオチドまたは修飾されたヌクレオチドの任意の組み合わせであってよい。

のいくつかの配列は、5’TCGまたは5’TYZと組み合わせた場合に、さらに強い免疫刺激活性を有する分子を生じることもまた発見されている。例えば、Nの少なくとも50%がピリミジンである場合は、このオリゴヌクレオチドによってTh1に強く偏った免疫誘導が生じる。いくつかの実施形態では、Nは、少なくとも55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、または100%がピリミジン、例えば、CまたはTである。ピリミジンはTまたはC、あるいはそれらの修飾されたバージョンである。いくつかの実施形態では、Nの最も3’のヌクレオチドはピリミジンである。例えば、3’末端は、TTTTT、TTTT、TTT、TT、T、CCCCC、CCCC、CCC、CC、C、CTT、CCTT、またはピリミジンの任意の他の可能な組み合わせであり得る。いくつかの限られた実施形態では、Nは、C12(5’−CCCCCCCCCCCC−3’(配列番号65))を含まない。

本発明は、1つの態様において、免疫刺激ヌクレオチドの5’配列、その長さ、およびヌクレオチド間結合が、誘導される免疫応答のサイトカインプロファイルに特異的な影響を有していることの発見、これらの発見を、改良された免疫刺激特性を有しているCpG免疫刺激オリゴヌクレオチドのサブセットを設計するために使用できることの発見に関係している。好ましいCpG免疫刺激オリゴヌクレオチドは、以下の6つの一般式の1つに含まれる:5’−XYRM−3’、5’−XCGM−3’、5’−XCGM−3’、5’−XCGM−3’、5’−XCGM−3’、および5’−TTGM−3’。

これらの式によって、優れた免疫刺激特性を示し、別のメチル化されていないCpGモチーフを含まないCpGオリゴヌクレオチドのクラスのサブセットが定義される。これらの式においては、5’はオリゴヌクレオチドの遊離の5’末端を意味し、3’はオリゴヌクレオチドの遊離の3’末端を意味する。

一般式5’−XYRM−3’を有する好ましい実施形態では、Xは1ヌクレオチドであり;Yはシトシンまたは修飾されたシトシンであり;Rはグアニンまたは修飾されたグアニンであり;そしてMは1〜3ヌクレオチドの核酸である。例えばオリゴヌクレオチドは、以下であり得る。

一般式5’−XCGM−3’を有する好ましい実施形態では、Xは、モノヌクレオチド、ジヌクレオチド、またはCGジヌクレオチドを含まないトリヌクレオチドから構成されている核酸であり;Mは0〜27ヌクレオチドの核酸である。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、以下の構造を有する:5’−TCG−3’、5’−TCGT−3’、5’−UCG−3’、5’−UCGT−3’。他の実施形態では、MはCGジヌクレオチドを含まない。

一般式5’−XCGM−3’を有する好ましい実施形態では、Xは、CGジヌクレオチドは含まない1ヌクレオチドであり;MはCGジヌクレオチドを含まない3〜27ヌクレオチドの核酸であり;Mは以下の特性の少なくとも1つを有する:TCジヌクレオチドを含まない、少なくとも30%がTヌクレオチドである、A、T、およびGから構成される、または少なくとも1つの修飾されたヌクレオチド間結合を有しているCCTTCCヘキサマーを含まない。いくつかの実施形態では、Mのうち、少なくとも35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、または100%がTまたはその修飾されたバージョンである。

一般式5’−XCGM−3’を有する好ましい実施形態では、XはCGジヌクレオチドを含まないジヌクレオチドであり、MはCGジヌクレオチドを含まない2〜26ヌクレオチドの核酸であり、Mは以下の特性の少なくとも1つを有する:TGまたはGTジヌクレオチドを含まない、少なくとも38%がTヌクレオチドである、またはAおよびTから構成される。いくつかの実施形態では、Mのうち、少なくとも40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、または100%がAもしくはT、またはそれらの修飾されたバージョンである。

一般式5’−XCGM−3’を有する好ましい実施形態では、XはCGジヌクレオチドを含まないトリヌクレオチドであり、MはCGジヌクレオチドを含まない1〜25ヌクレオチドの核酸であり、Mは以下の特性の少なくとも1つを有する:CTジヌクレオチドを含まず、少なくとも1つのホスホロチオエート結合は含まない、少なくとも41%がTヌクレオチドである、またはAおよびCから構成される。いくつかの実施形態では、Mのうち、少なくとも45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、または100%がTまたはその修飾されたバージョンである。

一般式5’−TTGM−3’を有する好ましい実施形態では、Mは5〜21ヌクレオチドからなる核酸であり、MはCGジヌクレオチドを含まず、Mは、少なくとも30%がTヌクレオチドから構成され、上記ヌクレオチドは10〜24ヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、Mのうち、少なくとも35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、または100%がTまたはその修飾されたバージョンである。

いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは以下の構造の1つを有する:
5’−TT−3’(配列番号32)
5’−TT−3’(配列番号27)
5’−TT−3’(配列番号28)。

記号は、安定なヌクレオチド間結合の存在を示し、_:はホスホジエステル結合の存在を意味する。

これらのオリゴヌクレオチドは、1つまたは2つの利用可能な5’末端を有している場合がある。5’TCGモチーフおよび5’TYZモチーフの重要性が明らかにされているので、このような5’末端を2つ有するように修飾されたオリゴヌクレオチドを作製することも可能である。このことは、例えば、1つまたは2つの利用可能な5’末端を有しているオリゴヌクレオチドを生じるように、3’−3’結合によって2つのオリゴヌクレオチドを結合させることによって行うことができる。このような構造は、5’TCGN−NGCT5’(配列番号13)のような式を有する場合がある。3’−3’結合はホスホジエステル、ホスホロチオエート、または任意の他の修飾されたヌクレオシド間架橋であり得る。このような結合を行うための方法は当該分野で公知である。例えば、このような結合は、Seliger,H等,Oligonucleotide analogs with terminal 3’−3’− and 5’−5’−internucleotidic linkages as antisense inhibitors of viral gene expression,Nucleosides & Nucleotides(1991),10(1−3),469−77、およびJiang等,Pseudo−cyclic oligonucleotides:in vitro and in vivo properties,Bioorganic & Medicinal Chemistry(1999),7(12),2727−2735に記載されている。

さらに、3’末端のヌクレオシド間の結合がホスホジエステル、ホスホロチオエート、または他の修飾された架橋ではない3’−3’結合ODNを、トリ−またはテトラ−エチレングリコールホスフェート部分のようなさらなるスペーサーを使用して調製することができる(Durand,M.等,Triple−helix formation by an oligonucleotide containing one (dA)12 and two (dT)12 sequences bridged by two hexaethylene glycol chains,Biochemistry(1992),31(38),9197−204,米国特許第5658738号、および米国特許第5668265号)。あるいは、ヌクレオチドではないリンカーは、標準的なホスホルアミダイト化学を使用して、エタンジオール、プロパンジオールから誘導することができ、また、塩基性のデオキシリボース(dSpacer)単位から誘導することもできる(Fontanel,Marie Laurence等,Stericl recognition by T4 polynucleotide kinase of non−nucleosidic moieties 5’−attached to oligonucleotides;Nucleic Acids Research(1994),22(11),2022−7)。ヌクレオチドではないリンカーは、1回または複数回組み込むことができ、また、連結される2つのODNの3’末端の間に任意の望ましい距離を生じるように互いに結合させることもできる。

オリゴヌクレオチドは、いくつかの実施形態では、5’TCG以外にはメチル化されていないCGモチーフは含まない。

いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは以下の構造の1つを有する:
5’TT3’(配列番号50)
5’TC3’(配列番号51)
5’TT3’(配列番号13)
5’TU3’(配列番号48)
5’TC_GT3’(配列番号25)
5’TT3’(配列番号14)。

記号は、安定なヌクレオチド間結合の存在を示し、_:はホスホジエステル結合の存在を意味する。

免疫刺激オリゴヌクレオチドは、一般に、7から100ヌクレオチドの間の範囲の長さを有する。いくつかの実施形態では、長さは7〜40、13〜100、13〜40、13〜30、15〜50、または15〜30ヌクレオチドの範囲、あるいはそれらの間の範囲の任意の整数である。

いくつかの好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドは、限定はされないが上記リンカーおよび方法によって、3’末端に連結させられた担体と結合させられる。担体は、微粒子、デンドリマー、リポソーム、カチオン錯体、および抗原からなる群より選択されるが、これらに限定されない。

用語「核酸」および「オリゴヌクレオチド」は、複数のヌクレオチド(すなわち、リン酸基と交換可能な有機塩基とに結合させられた糖(例えば、リボースまたはデオキシリボース)を含む分子であり、置換されたピリミジン(例えば、シトシン(C)、チミン(T)、またはウラシル(U)、または置換されたプリン(例えば、アデニン(A)、またはグアニンG)のいずれかである)を意味するように交換可能に使用される。本明細書中で使用される場合は、用語「核酸」および「オリゴヌクレオチド」は、オリゴリボヌクレオチド、さらにはオリゴデオキシリボヌクレオチドを意味する。用語「核酸」および「オリゴヌクレオチド」には、当然、ポリヌクレオシド(すなわち、ポリヌクレオチドからリン酸を除去したもの)および高分子を含む任意の他の有機塩基も含まれる。核酸分子は、既存の核酸の供給源(例えば、ゲノムまたはcDNA)から得ることができるが、合成のもの(例えば、核酸合成によって産生されたもの)が好ましい。

用語「核酸」および「オリゴヌクレオチド」には、例えば、塩基および/または糖において置換または修飾を有している核酸またはオリゴヌクレオチドも含まれる。例えば、これらには、2’位置でヒドロキシル基以外の低分子量の有機基に、そして5’位置ではリン酸基またはヒドロキシル基以外に共有結合させられている糖骨格を有している核酸が含まれる。このように修飾された核酸には、2’−O−アルキル化リボース基が含まれる場合がある。さらに、修飾された核酸には、リボースの代わりにアラビノースまたは2’−フルオロアラビノースのような糖が含まれる場合もある。したがって、核酸はペプチド−核酸(核酸塩基を含むアミノ酸骨格を有する)のように互いに連結されたポリマー単位の任意の可能な組み合わせを含むことによって、骨格の構成において異種物質を含むものであり得る。他の例は、以下にさらに詳細に記載される。

本発明の免疫刺激オリゴヌクレオチドは、天然のRNAおよびDNAと比較して、種々の化学的な改変および置換を含み得る。これには、ホスホジエステルヌクレオシド間架橋、β−D−リボース単位、および/または天然のヌクレオシド塩基(アデニン、グアニン、シトシン、チミン、ウラシル)が含まれる。化学的改変の複数の例が当業者に公知であり、例えば、Uhlmann Eら(1990)Chem Rev 90:543;「Protocols for Oligonucleotides and Analogs」Synthesis and Properties & Synthesis and Analytical Techniques,S.Agrawal編,Humana Press,Totowa,USA 1993;Crooke STら(1996)Annu Rev Pharmacol Toxicol 36:107−129;およびHunziker Jら(1995)Mod Synth Methods 7:331−417に記載されている。本発明のオリゴヌクレオチドは、1つ以上の改変を含み得、それぞれの改変は、天然のDNAまたはRNAから構成される同じ配列のオリゴヌクレオチドと比較して、特定のホスホジエステルヌクレオシド間架橋、および/または特定のβ−D−リボース単位、および/または特定の天然のヌクレオシド塩基の位置に、配置される。

例えば、オリゴヌクレオチドは、1つ以上の改変を含み得、それぞれの改変は以下から別々に選択される:
a)改変されたヌクレオシド間架橋による、ヌクレオシドの3’末端および/または5’末端に配置されたホスホジエステルヌクレオシド間架橋の置換、
b)デホスホ架橋による、ヌクレオシドの3’末端および/または5’末端に配置されるホスホジエステル架橋の置換、
c)別の単位による、糖リン酸骨格の糖リン酸単位の置換、
d)改変された糖単位による、β−D−リボースの置換、および
e)改変されたヌクレオシド塩基による、天然のヌクレオシド塩基の置換。

オリゴヌクレオチドの化学的改変についてのさらに詳細な例は、以下の通りである。

オリゴヌクレオチドは、上記のaまたはbに記載したような改変されたヌクレオチド間結合を含み得る。これらの改変された結合は、分解に対して部分的に抵抗性であり得る(例えば、安定化されている)。「安定なオリゴヌクレオチド分子」は、当然、このような改変の結果生じる、インビボ分解(例えば、エキソヌクレアーゼによる分解またはエンドヌクレアーゼによる分解)に対して比較的抵抗性があるオリゴヌクレオチドを意味する。ホスホロチオエート結合を有しているオリゴヌクレオチドは、いくつかの実施形態では、最大活性を提供し得、かつ細胞内エキソヌクレアーゼおよび細胞内エンドヌクレアーゼによる分解からオリゴヌクレオチドを保護し得る。

ヌクレオシドの3’末端および/または5’末端に配置されたホスホジエステルヌクレオシド間架橋は、改変されたヌクレオシド間架橋によって置換され得、ここでは、改変されたヌクレオシド間架橋は、例えば、ホスホロチオエート架橋、ホスホロジチオエート架橋、NR−ホスホルアミダイト架橋、ボラノホスフェート架橋、α−ヒドロキシベンジルホスホネート架橋、リン酸−(C−C21)−O−アルキルエステル架橋、ホスフェート−[(C−C12)アリール−(C−C21)−O−アルキル]エステル架橋、(C−C)アルキルホスホネート架橋、および/または(C−C12)アリールホスホネート架橋、(C−C12)−α−ヒドロキシメチル−アリール(例えば、国際公開番号WO95/01363に開示されているもの)から選択される。式中、(C−C12)アリール、(C−C20)アリールおよび(C−C14)アリールは、必要に応じて、ハロゲン、アルキル、アルコキシ、ニトロ、シアノで置換され、RおよびRは、互いに独立して、水素、(C−C18)−アルキル、(C−C20)−アリール、(C−C14)−アリール−(C−C)−アルキルであり、好ましくは、水素、(C−C)−アルキルであり、好ましくは、(C−C)−アルキルおよび/またはメトキシエチルであるか、あるいはRとRとが、それらが保有している窒素原子と共に、O、S、およびNからの別のヘテロ原子をさらに含み得る5〜6員複素環を形成する。

デホスホ架橋(デホスホ架橋は、例えば、Uhlmann E and Peyman A,「Methods in Molecular Biology」,第20巻,「Protocols for Oligonucleotides and Analogs」,S.Agrawal編,Humana Press,Totowa 1993,第16章,pp.355ffに記載されている)によるヌクレオシドの3’末端および/または5’末端に配置されているホスホジエステル結合の置換。ここで、デホスホ架橋は、例えば、ホルムアセタール、3’−チオホルムアセタール、メチルヒドロキシルアミン、オキシム、メチレンジメチル−ヒドラゾ、ジメチレンスルホン、および/またはシアリル基のデホスホ架橋から選択される。

糖リン酸骨格に由来する糖リン酸単位(すなわち、β−D−リボースとホスホジエステルヌクレオシド間架橋とが一緒になって糖リン酸単位を形成する)(すなわち、糖リン酸骨格は、糖リン酸単位から構成される)は、別の単位により置換され得る。ここでは、他の単位は、例えば、「モルホリノ誘導」オリゴマーを組み立てるために適切なもの(例えば、Stirchak EPら(1989)Nucleic Acids Res 17:6129−41)であり、すなわち例えば、モルホリノ誘導単位による置換である;または、ポリアミド核酸(「PNA」;例えば、Nielsen PEら(1994)Bioconjug Chem 5:3−7に記載されているもの)を組み立てるために適切なものであり、すなわち例えば、PNA骨格単位(例えば、2−アミノエチルグリシン)による置換である。オリゴヌクレオチドは、他の炭化水素骨格の改変および置換物(例えば、リン酸基を有しているペプチド核酸(PHONA)、ロック(locked)核酸(LNA)、およびアルキルリンカーもしくはアミノリンカーを有している骨格部分を有するオリゴヌクレオチド)を有し得る。アルキルリンカーは、分岐したもの、または分岐していないもの、置換されたもの、または置換されていないもの、およびキラル純粋なもの、またはラセミ混合物であり得る。

β−リボース単位またはβ−D−2’デオキシリボース単位は、改変された糖単位で置換され得る。ここでは、改変された糖単位は、例えば、β−D−リボース、α−D−2’−デオキシリボース、L−2’−デオキシリボース、2’−F−2’−デオキシリボース、2’−F−アラビノース、2’−O−(C−C)アルキルリボースから選択され、好ましくは、2’−O−(C−C)アルキルリボースは、2’−O−メチルリボース、2’−O−(C−C)アルケニル−リボース、2’−[O−(C−C)アルキル−O−(C−C)アルキル]−リボース、2’−NH−2’−デオキシリボース、β−D−キシロ−フラノース、α−アラビノフラノース、2,4−ジデオキシ−β−D−エリスロ−ヘキソ−ピラノース、および炭素環式の糖アナログ(例えば、Froehler J(1992)Am Chem Soc 114:8320に記載されている)および/または開鎖の糖アナログ(例えば、Vandendriesscheら(1993)Tetrahedron 49:7223に記載されている)、および/または二環糖アナログ(例えば、Tarkov Mら(1993)Helv Chim Acta 76:481に記載されている)である。

いくつかの実施形態では、糖は、特に、ホスホジエステル様ヌクレオシド間結合またはホスホジエステル様ヌクレオシド間結合によって連結された、1つまたは両方のヌクレオチドについて、2’−O−メチルリボースである。

核酸にはまた、置換プリンおよび置換ピリミジン(例えば、C−5プロピンピリミジンおよび7−デアザ−7−置換プリン改変塩基)も含まれる。Wagner RWら(1996)Nat Biotechnol 14:840−4。プリンおよびピリミジンとしては、アデニン、シトシン、グアニン、およびチミジン、ならびに置換芳香族部分および非置換芳香族部分を有する、他の天然に存在する核酸塩基および天然には存在しない核酸塩基が挙げられるがこれらに限定されない。

改変された塩基とは、DNAおよびRNA中に通常見出され得る天然に存在する塩基(例えば、T、C,G、A、およびU)とは化学的に異なる任意の塩基である。しかし改変された塩基は、これらの天然に存在する塩基と共通の基本的化学構造を有している。改変型ヌクレオシド塩基は、例えば、ヒポキサンチン、ウラシル、ジヒドロウラシル、プソイドウラシル、2−チオウラシル、4−チオウラシル、5−アミノウラシル、5−(C−C)−アルキルウラシル、5−(C−C)−アルケニルウラシル、5−(C−C)−アルキニルウラシル、5−(ヒドロキシメチル)ウラシル、5−クロロウラシル、5−フルオロウラシル、5−ブロモウラシル、5−ヒドロキシシトシン、5−(C−C)−アルキルシトシン、5−(C−C)−アルケニルシトシン、5−(C−C)−アルキニルシトシン、5−クロロシトシン、5−フルオロシトシン、5−ブロモシトシン、N−ジメチルグアニン、2,4−ジアミノ−プリン、8−アザプリン、置換7−デアザプリン(好ましくは、7−デアザ−7−置換プリンおよび/または7−デアザ−8−置換プリン)、5−ヒドロキシメチルシトシン、N4−アルキルシトシン(例えば、N4−エチルシトシン)、5−ヒドロキシデオキシシチジン、5−ヒドロキシメチルデオキシシチジン、N4−アルキルデオキシシチジン(例えば、N4−エチルデオキシシチジン)、6−チオデオキシグアノシン、およびニトロピロールのデオキシリボヌクレオシド、C5−プロピニルピリミジン、およびジアミノプリン(例えば、2,6−ジアミノプリン)、イノシン、5−メチルシトシン、2−アミノプリン、2−アミノ−6−クロロプリン、ヒポキサンチン、あるいは天然のヌクレオシド塩基の他の改変体から選択され得る。このリストは、例示であって、限定するものと解釈されるべきではない。

本明細書中に記載される特定の式においては、改変型塩基のセットが定義される。例えば、文字Yは、シトシンまたは改変型シトシンを含むヌクレオチドをいうために使用される。本明細書中で使用される場合は、改変型(改変された)シトシンとは、オリゴヌクレオチドの免疫刺激活性を損なうことなくこの塩基を置換し得る、シトシンの天然に存在するかまたは天然には存在しないピリミジン塩基アナログである。改変型シトシンとしては、5−置換シトシン(例えば、5−メチルシトシン、5−フルオロ−シトシン、5−クロロ−シトシン、5−ブロモ−シトシン、5−ヨード−シトシン、5−ヒドロキシ−シトシン、5−ヒドロキシメチル−シトシン、5−ジフルオロメチル−シトシン、および非置換5−アルキニル−シトシンもしくは置換5−アルキニル−シトシン)、6−置換シトシン、N4−置換シトシン(例えば、N4−エチル−シトシン)、5−アザ−シトシン、2−メルカプト−シトシン、イソシトシン、プソイド−イソシトシン、縮合環系を有しているシトシンアナログ(例えば、N,N’−プロピレンシトシンまたはフェノキサジン)、ならびにウラシルおよびその誘導体(例えば、5−フルオロ−ウラシル、5−ブロモ−ウラシル、5−ブロモビニル−ウラシル、4−チオ−ウラシル、5−ヒドロキシ−ウラシル、5−プロピニル−ウラシル)が挙げられるが、これらに限定されない。好ましいシトシンのいくつかとしては、5−メチル−シトシン、5−フルオロ−シトシン、5−ヒドロキシ−シトシン、5−ヒドロキシメチル−シトシン、およびN4−エチル−シトシンが挙げられる。本発明の別の実施形態では、シトシン塩基は、普遍的塩基(例えば、3−ニトロピロール,P塩基)、芳香環系(例えば、フルオロベンゼン、またはジフルオロベンゼン)、または水素原子(dSpacer)によって置換される。文字Zは、グアニンまたは改変型グアニン塩基をいうために使用される。改変型(改変された)グアニンとは、本明細書中で使用される場合は、オリゴヌクレオチドの免疫刺激活性を損なうことなくこの塩基を置換し得る、グアニンの天然に存在するかまたは天然には存在しないプリン塩基アナログである。改変型グアニンとしては、7−デアザグアニン、7−デアザ−7−置換グアニン(例えば、7−デアザ−7−(C2−C6)アルキニルグアニン)、7−デアザ−8−置換グアニン、ヒポキサンチン、N2−置換グアニン(例えば、N2−メチル−グアニン)、5−アミノ−3−メチル−3H,6H−チアゾロ[4,5−d]ピリミジン−2,7−ジオン、2,6−ジアミノプリン、2−アミノプリン、プリン、インドール、アデニン、置換アデニン(例えば、N6−メチル−アデニン、8−オキソ−アデニン)、8−置換グアニン(例えば、8−ヒドロキシグアニン、および8−ブロモグアニン)、および6−チオグアニンが挙げられるが、これらに限定されない。本発明の別の実施形態では、グアニン塩基は、普遍的塩基(例えば、4−メチル−インドール、5−ニトロ−インドール、およびK塩基)、芳香環系(例えば、ベンズイミダゾール、またはジクロロ−ベンズイミダゾール、1−メチル−1H−[1,2,4]トリアゾール−3−カルボン酸アミド)、または水素原子(dSpacer)によって置換される。

本発明の使用のために、本発明のオリゴヌクレオチドは、当該分野で周知の多数の手順のいずれかを使用して新規に合成され得る。例えば、β−シアノエチルホスホロアミダイト法(Beaucage,S.L.and Caruthers,M.H.,Tet.Let.22:1859,1981);ヌクレオシドH−リン酸法(Gareggら,Tet.Let.27:4051−4054,1986;Froehlerら,Nucl.Acid.Res.14:5399−5407,1986;Gareggら,Tet.Let.27:4055−4058,1986,Gaffneyら,Tet.Let.29:2619−2622,1988)。これらの化学反応は、市販されている種々の自動核酸合成装置によって行う得る。これらのオリゴヌクレオチドは、合成オリゴヌクレオチドと呼ばれる。単離されたオリゴヌクレオチドとは、一般に、自然界において通常付随している成分から分離されているオリゴヌクレオチドをいう。例として、単離されたオリゴヌクレオチドは、細胞から分離されたものであっても、核から分離されたものであっても、ミトコンドリアから分離されたものであっても、またはクロマチンから分離されたものであってもよい。

本発明の免疫刺激核酸分子は、ホスホジエステルヌクレオチド間結合を含み得る。ホスホジエステルヌクレオチド間結合は、天然で見出される核酸に特徴的な結合の型である。図20に示すように、ホスホジエステルヌクレオチド間結合には、2つの架橋している酸素原子が隣接して存在しておりかつ2つの別の酸素原子(一方は電荷を有しており、もう一方は電荷を有していない)によっても結合されている、リン原子が含まれる。ホスホジエステルヌクレオチド間結合は、オリゴヌクレオチドの組織半減期を短くすることが重要である場合に、特に好ましい。

ホスホジエステル様ヌクレオチド間結合は、ホスホジエステルと化学的および/またはジアステレオマー的に類似している、リンを含む架橋基である。ホスホジエステルに対する類似性の尺度として、ヌクレアーゼ消化に対する感受性、およびRNAseHを活性化する能力が挙げられる。従って、ホスホジエステルオリゴヌクレオチドとホスホロチオエートオリゴヌクレオチドのいずれもがRNAseHを活性化するが、例えば、ホスホジエステルオリゴヌクレオチドは、ヌクレアーゼ消化に対して感受性であり、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドはそうではない。好ましい実施形態では、ホスホジエステル様ヌクレオチド間結合は、ボラノホスフェート(または同等の、ボラノホスホネート)結合である。米国特許第5177198号;米国特許第5859231号;米国特許第6160109号;米国特許第6207819号;Sergueevら(1998)J Am Chem Soc 120:9417−27。別の好ましい実施形態では、ホスホジエステル様ヌクレオチド間結合は、ジアステレオマー的に純粋なRpホスホロチオエートである。ジアステレオマー的に純粋なRpホスホロチオエートは、ヌクレアーゼ消化に対してさらに高い感受性であり、混合ホスホロチオエートまたはジアステレオマー的に純粋なSpホスホロチオエートよりも、RNAseHを活性化することにおいて優れていると考えられる。CpGオリゴヌクレオチドの立体異性体は、1999年7月27日に出願された同時係属中の米国特許出願番号09/361,575、および公開されたPCT出願番号PCT/US99/17100(国際公開番号WO00/06588)の対象である。本発明の目的のためには、用語「ホスホジエステル様ヌクレオチド間結合」は、ホスホロジチオエートヌクレオチド間結合およびメチルホスホネートヌクレオチド間結合を特に排除することに、注意すべきである。

本発明の免疫刺激核酸分子は、キメラ骨格を有し得る。本発明の目的のためには、キメラ骨格とは、部分的に安定な骨格をいう。ここでは、少なくとも1つのヌクレオチド間結合が、ホスホジエステルまたはホスホジエステル様であり、少なくとも1つの他のヌクレオチド間結合が、安定なヌクレオチド間結合であり、上記少なくとも1つのホスホジエステルまたはホスホジエステル様結合と、上記少なくとも1つの安定な結合は、異なる。ボラノホスホネート結合がホスホジエステル結合と比較して安定であることが報告されているので、上記骨格のキメラ性質の目的のためには、ボラノホスホネート結合は、文脈に依存して、ホスホジエステル様として、または安定なものとしてのいずれかに、分類され得る。例えば、本発明のキメラ骨格は、1つの実施形態においては、少なくとも1つのホスホジエステル(ホスホジエステルまたはホスホジエステル様)結合と、少なくとも1つのボラノホスホネート(安定な)結合とを含み得る。別の実施形態では、本発明のキメラ骨格は、ボラノホスノネート(ホスホジエステルまたはホスホジエステル様)結合と、ホスホロチオエート(安定な)結合とを含み得る。「安定なヌクレオチド間結合」は、ホスホジエステルヌクレオチド間結合と比較して、インビボ分解(例えば、エキソヌクレアーゼまたはエンドヌクレアーゼによる)に対して比較的抵抗性があるヌクレオチド間結合を意味する。好ましい安定なヌクレオチド間結合としては、ホスホロチオエート結合、ホスホロジチオエート結合、メチルホスホネート結合、およびメチルホスホロトエート結合が挙げられるが、これらに限定されない。他の安定なヌクレオチド間結合としては、ペプチド結合、アルキル結合、デホスホ結合、および上記の他の結合が挙げられるが、これらに限定されない。

ホスホロチオエートのような改変された骨格は、ホスホロアミダイト化学またはH−ホスホネート化学のいずれかを使用する、自動化された技術を用いて合成され得る。アリールホスホネートおよびアルキルホスホネートは、例えば、米国特許第4469863号に記載されているように生成され得、そしてアルキルホスホトリエステル(電荷を有している酸素部分が、米国特許第5,023,243号および欧州特許第092,574号に記載されているようにアルキル化される)は、市販されている試薬を使用して、自動固相合成によって調製され得る。他のDNA骨格の改変および置換を生成するための方法が、記載されている(例えば、Uhlmann,E.and Peyman,A.,Chem.Rev.90:544,1990;Goodchild,J.,Bioconjugate Chem.1:165,1990)。

マウスの系において強い刺激活性を有しているCpGホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、ヒトおよび他の非げっ歯類免疫細胞に対してはより低い活性を示す傾向がある。実施例には、強いヒトCpGモチーフの開発、ならびにヒトPBMC(例えば、B細胞)および形質細胞様樹状細胞に対するその効果および作用機構の特性が、記載される。これらの5’TCG CpGモチーフを含むDNAまたは5’TYZ CpGモチーフを含むDNAは、IL−10、IL−6、IP−10、およびIFN−αを生産するようにヒト末梢血細胞を強く刺激する。5’TCGを含むODNは、特定の長さのODNを選択することによって、さらに最適化され得る。例えば、22ヌクレオチドの長さのODNは、より短いODNよりもより刺激性がある。

CpG免疫刺激オリゴヌクレオチドのサブセットが、PBMCのようなヒト細胞に対して劇的な免疫刺激作用を有していることが、本発明によって発見された。このことは、これらのCpG免疫刺激オリゴヌクレオチドが、ヒトのワクチン接種、ガンの免疫療法、喘息の免疫療法、免疫機能の全般的な強化、放射線治療後または化学療法後の造血系の回復の促進、さらには他の免疫調節用途にとって、有効な治療薬であることを示唆している。

本明細書中で使用される場合は、用語「処置」、「処置された」、または「処置する」は、感染性疾患、ガン、アレルギー、または喘息のような障害に関して使用される場合は、疾患の発症(例えば、病原体への感染)に対する被験体の抵抗性を増大させるか、または言い換えると、被験体が疾患を発症する(例えば、病原体に感染する)可能性を低下させる、予防的な処置、さらには、被験体が疾患を発症した後に疾患と闘う(例えば、感染を減少させるかまたは排除する)ためまたは疾患が悪化することを防ぐための処置をいう。

従って、CpG免疫刺激オリゴヌクレオチドは、アレルギーまたは喘息、感染性生物による感染、もしくは特異的なガン抗原が同定されているガンを、有しているかまたはそれらを発症するリスクのある、被験体の処置のためのワクチンとしての本発明のいくつかの局面において有用である。CpG免疫刺激オリゴヌクレオチドはまた、感染、アレルギー、もしくはガンからの防御のために抗原もしくはアレルギー誘発物質を伴わずに単独で投与され得、または、他の治療薬とともに投与され得る。反復投与により、長期間の防御が可能であり得る。「リスクのある被験体」とは、本明細書中で使用される場合には、病原体による感染、またはガン、またはアレルギー誘発物質に曝されるあらゆるリスクのある被験体、あるいはガンを発症するリスクのある被験体である。例えば、リスクのある被験体は、特定のタイプの感染因子見出されている地域に旅行することを計画している被験体、または、その人の生活習慣もしくは医学的手法を介して、感染性生物を含む可能性がある体液もしくはそのような生物に直接曝される被験体、またさらには、感染性生物もしくはアレルギー誘発物質が同定されている地域で生活する全ての被験体である。感染を発症するリスクのある被験体には、医療機関が特定の感染性生物の抗原でのワクチン接種を勧める、一般的な集団も含まれる。抗原がアレルゲンであり、被験体が特定の抗原に対してアレルギー反応を生じる場合には、被験体は、(すなわち、花粉の季節の間に)抗原に曝され、従って、この被験体は、抗原に曝されるリスクがある。アレルギーまたは喘息を発症するリスクのある被験体としては、アレルギーまたは喘息を有していると同定されているが、CpG免疫刺激オリゴヌクレオチドでの処置の間には活発な疾患は有していない被験体、さらには、遺伝的要因または環境的要因が原因でこれらの疾患を発症するリスクがあると考えられる被験体が含まれる。

ガンを発症するリスクのある被験体とは、ガンを発症する可能性が高い被験体である。これらの被験体としては、例えば、その存在がガンの発症の高い可能性と相関関係があることが実証されている遺伝的な異常を有している被験体、およびタバコ、アスベスト、または他の化学的毒素のようなガンの原因因子に曝された被験体、あるいは、以前にガンを処置されていて今は見かけ上は回復している被験体が挙げられる。ガンを発症するリスクのある被験体が、CpG免疫刺激オリゴヌクレオチド、および必要に応じて、その被験体が発症するリスクのあるガンの型に特異的な抗原で処置されると、その被験体は、ガン細胞が生じた場合にガン細胞を死滅させることが可能であり得る。腫瘍が被験体の内部で形成されはじめると、被験体は、先天性免疫応答を生じるか、または腫瘍抗原に対して特異的な免疫応答を生じる。

予防的処置のためのCpG免疫刺激オリゴヌクレオチドの使用に加えて、本発明にはまた、感染、アレルギー、喘息、またはガンを有している被験体の処置のための、CpG免疫刺激オリゴヌクレオチドの使用も含まれる。

感染を有している被験体とは、感染性の病原体に曝されており、急性または長期的に検出可能なレベルのその病原体を体内に有している被験体である。CpG免疫刺激オリゴヌクレオチドを、その感染性病原体のレベルを低下または全滅させ得る、先天性または抗原特異的な、全身性または粘膜の免疫応答を高めるために、抗原または他の治療薬とともに、またはそれらを伴うことなく、使用され得る。感染性疾患とは、本明細書中で使用される場合は、体内に外来微生物が存在することによって生じる疾患である。病原性物質が侵入する最初の部位である体の粘膜表面を保護するために効果的なワクチン接種ストラテジーおよび処置を開発することが、特に重要である。

アレルギーを有している被験体とは、アレルゲン(アレルギー誘発物質)に反応してアレルギー反応を生じる得る被験体である。アレルギーとは、物質(アレルゲン)に対す後天性過敏性をいう。アレルギー性の状態としては、湿疹、アレルギー性鼻炎、コリーザ、枯草熱、気管支喘息、アレルギー性喘息、蕁麻疹(じんましん)および、食物アレルギー、ならびに他のアトピー性の症状が挙げられるが、これらに限定されない。

アレルギーは、一般的に、無害なアレルゲンに対するIgE抗体の生成によって引き起こされる。CpG免疫刺激オリゴヌクレオチドの全身投与または粘膜投与によって誘導されるサイトカインは、主に、Th1と呼ばれるクラスのものであり(例えば、IL−12、IP−10、IFN−α、およびIFN−γ)、これらは、体液性免疫応答と細胞性免疫応答との両方を誘導する。IL−4およびIL−5サイトカインの生産に関係している免疫応答の他の主要な型は、Th2免疫応答と呼ばれる。一般に、アレルギー性疾患は、Th2型の免疫応答によって媒介されるようである。本明細書中に記載されているCpG免疫刺激オリゴヌクレオチドがTh2優勢(これはIgE抗体の生産およびアレルギーに関係している)からバランスのとれたTh2/Th1応答(これはアレルギー反応に対して防御的である)へと被験体の免疫応答をシフトさせる能力に基づいて、CpG免疫刺激オリゴヌクレオチドの免疫応答を誘導するための有効用量が、喘息およびアレルギーを処置するために被験体に投与され得る。

このように、CpG免疫刺激オリゴヌクレオチドは、アレルギー性症状および喘息の処置において、有意な治療上の有用性を有する。Th2サイトカイン(特に、IL−4およびIL−5)は、喘息の被験体の気道において増大する。これらのサイトカインは、IgEイソ型の切り替え、好酸球の走化性および活性化、ならびに肥満細胞の増殖を含む、喘息の免疫応答の重要な局面を促進する。Th1サイトカイン(特に、IFN−γおよびIL−12)は、Th2クローンの形成、およびTh2サイトカインの生産を抑制し得る。喘息とは、炎症、気道の狭窄、および吸入され因子に対する気道の反応性の増大によって特徴付けられる、呼吸系の障害をいう。喘息は、多くの場合は、アトピー性症状またはアレルギー性症状に関係しているが、かならずしもそうとは限らない。従って、喘息には、アレルギー性喘息と、非アレルギー性喘息とが含まれる。

ガンを有している被験体とは、検出可能なガン性細胞を有している被験体である。このガンは、悪性のガンである場合も、また悪性ではないガンである場合もある。ガンまたは腫瘍としては、胆菅ガン;脳腫瘍;乳ガン;子宮頸ガン;絨毛ガン;結腸ガン;子宮内膜ガン;食道ガン;胃ガン;上皮内ガン;リンパ腫;肝臓ガン;肺ガン(例えば、小細胞肺ガン、および非小細胞肺ガン);黒色腫;神経芽細胞腫;口腔ガン;卵巣ガン;膵臓ガン;前立腺ガン;直腸ガン;肉腫;皮膚ガン;精巣ガン;甲状腺ガン;および腎臓ガン、ならびに他のガン腫および肉腫が挙げられるが、これらに限定されない。1つの実施形態では、上記ガンは、毛様細胞性白血病、慢性骨髄性白血病、皮膚T細胞白血病、多発性骨髄腫、濾胞性リンパ腫、悪性黒色腫、扁平上皮細胞ガン、腎細胞ガン、前立腺ガン、膀胱細胞ガン、または結腸ガン、中枢神経系のガン、結合組織のガン、食道ガン、眼のガン、ホジキンリンパ腫、喉頭ガン、口腔ガン、皮膚ガン、および精巣ガン、ならびに他のガン腫および肉腫である。

被験体とは、ヒト、または脊椎動物(イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、シチメンチョウ、ニワトリ、霊長類(例えば、サル)、および魚類(水産養殖種、例えば、サケ)を含むがこれらに限定されない)を意味する。従って、上記化合物は、ヒト被験体およびヒト以外の被験体のガンおよび腫瘍、感染、ならびにアレルギー/喘息を処置するために使用され得る。ガンは、ペット(すなわち、ネコおよびイヌ)の死の主要な原因の1つである。

CpGオリゴヌクレオチドが抗原とともに投与される例においては、被験体は抗原にさらされる。本明細書中で使用される場合は、用語「さらされる」とは、被験体と抗原との接触の能動的な工程、または生体内での抗原に対する被験体の受動的曝露のいずれかをいう。抗原に対して被験体を能動的にさらすための方法は当該分野で周知である。一般的には、抗原は、静脈内投与、筋肉内投与、経口投与、経皮投与、粘膜投与、鼻腔内投与、気管内投与、または皮下投与のような任意の手段によって被験体に直接投与される。抗原は全身的に、または局所的に投与され得る。抗原およびCpG免疫刺激オリゴヌクレオチドを投与するための方法は、以下にさらに詳細に記載される。被験体は、抗原が体内で免疫細胞にさらすために利用できるようになると、抗原に対して受動的にさらされる。被験体は、例えば、体内への外来の病原体の侵入によって、またはその表面上に外来抗原を発現する腫瘍細胞の発生によって、抗原に受動的にさらされ得る。

被験体を抗原に対して受動的にさらす方法は、特に、CpG免疫刺激オリゴヌクレオチドの投与のタイミングに応じて変化させることができる。例えば、ガン、または感染性の疾患、またはアレルギー応答もしくは喘息応答を生じるリスクのある被験体については、被験体にはそのリスクが最も高い時期、すなわち、アレルギーの季節の間、またはガンの原因因子への曝露の後に、定期的にCpG免疫刺激オリゴヌクレオチドを投与することができる。さらに、CpG免疫刺激オリゴヌクレオチドは、旅行者が感染性因子に曝露されるリスクのある外国に旅行する前に、旅行者に投与される場合もある。同様に、CpG免疫刺激オリゴヌクレオチドは、被験体がそれにさらされた場合に抗原に対する全身性または粘膜の免疫応答を誘導するように、生物戦争にさらされるリスクのある兵士または一般市民に投与され得る。

抗原とは、本明細書中で使用される場合は、免疫応答を引き起こすことができる分子である。抗原としては、細胞、細胞抽出物、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、多糖、多糖結合体、多糖および他の分子のペプチドおよび非ペプチド模倣物、低分子、脂質、糖脂質、炭水化物、ウイルスおよびウイルス抽出物、ならびに寄生虫のような多細胞生物およびアレルゲンが挙げられるが、これらに限定されない。用語「抗原」は広い意味で、宿主の免疫系によって異物と認識されるあらゆる型の分子を含む。抗原としては、ガン抗原、微生物抗原、およびアレルゲンが挙げられるが、これらに限定されない。

ガン抗原とは、本明細書中で使用される場合は、腫瘍またはガン細胞の表面に結合していて、MHC分子の状況では、抗原提示細胞の表面上で発現されると免疫応答を誘発することができる、ペプチドまたはタンパク質のような化合物である。ガン抗原は、例えば、Cohen等,1994,Cancer Research,54:1055によって記載されているように、ガン細胞の粗抽出物を調製することによって、抗原を部分的に精製することによって、組み換え技術によって、または既知の抗原を新しく合成することによってのいずれかで、ガン細胞から調製することができる。ガン抗原としては、組み換えによって発現させられる抗原、その免疫原性部分、または腫瘍もしくはガン細胞全体が挙げられるが、これらに限定されない。このような抗原は、組み換えによって、または当該分野で公知の任意の他の手段によって単離または調製することができる。

本明細書中で使用される場合は、用語「ガン抗原」および「腫瘍抗原」とは交換可能に使用され、ガン細胞によってディファレンシャルに発現され、それによってガン細胞を標的化するために活用され得る抗原をいう。ガン抗原とは、明らかに腫瘍特異的な免疫応答を刺激する可能性のある抗原である。これらの抗原のいくつかは、正常な細胞によってコードされているが、必ずしも発現されているわけではない。これらの抗原は、正常な細胞においては通常はサイレントである(すなわち、発現されていない)もの、特定の分化段階でのみ発現されるもの、ならびに胚抗原および胎児抗原のような一時的に発現されるものとして特徴付けることができる。他のガン抗原は、ガン遺伝子(例えば、活性化されたrasガン遺伝子)、サプレッサー遺伝子(例えば、変異体p53)、内部欠失または染色体転座によって生じる融合タンパク質のような、変異体である細胞遺伝子によってコードされる。さらに他のガン抗原は、RNA腫瘍ウイルスおよびDNA腫瘍ウイルスに保有されているもののような、ウイルス遺伝子によってコードされ得る。

微生物抗原とは、本明細書中で使用される場合は微生物の抗原であり、これには、ウイルス、細菌、寄生虫、および真菌が含まれるがこれらに限定されない。このような抗原には、完全な微生物、さらにはその自然な状態の単離株およびフラグメントまたは誘導体が含まれ、また自然界に存在している微生物抗原と同じかまたはそれに類似しており、その微生物に特異的な免疫応答を誘導する合成化合物も含まれる。化合物は、自然界に存在している微生物抗原に対して免疫応答(体液性および/または細胞性)を誘導する場合に、自然界に存在している微生物抗原と類似している。このような抗原は当該分野で慣用的に使用されており、当業者に周知である。

ヒトにおいて見出されたウイルスの例としては、レトロウイルス科(例えば、HIV−1(HTLV−III、LAV、またはHTLV−III/LAVとも呼ばれる)またはHIV−IIIのようなヒト免疫不全ウイルス;およびHIV−LPのような他の単離株);ピコルナウイルス科(例えば、ポリオウイルス、A型肝炎ウイルス;エンテロウイルス、ヒトコクサッキーウイルス、ライノウイルス、エコーウイルス);カルシウイルス科(例えば、胃腸炎を生じる株);トガウイルス科(例えば、ウマ脳炎ウイルス;風疹ウイルス);フラビウイルス科(例えば、デングウイルス、脳炎ウイルス、黄熱病ウイルス);コロナウイルス科(例えば、コロナウイルス);ラブドウイルス科(例えば、水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス);コロナウイルス科(例えば、コロナウイルス);ラブドウイルス科(例えば、水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス);フィロウイルス科(例えば、エボラウイルス);パラミクソウイルス科(例えば、パラインフルエンザウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、麻疹ウイルス、RSウイルス);オルトミクソウイルス科(例えば、インフルエンザウイルス);ブンガウイルス科(例えば、ハンターンウイルス、ブンガウイルス、フレボウイルス、およびナイロウイルス);アレナウイルス科(出血熱ウイルス);レオウイルス科(例えば、レオウイルス、オルビウイルス、およびロタウイルス);ビルナウイルス科;ヘパドナウイルス科(B型肝炎ウイルス);パルボウイルス科(パルボウイルス);パポバウイルス科(パピローマウイルス、ポリオーマウイルス);アデノウイルス科(ほとんどのアデノウイルス);ヘルペスウイルス科(単純ヘルペスウイルス(HSV)1および2、水痘帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイルス(CMV)、ヘルペスウイルス);ポックスウイルス科(天然痘ウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス);ならびにイリドウイルス科(例えば、アフリカ豚熱ウイルス);および分類されていないウイルス(例えば、デルタ型肝炎の原因因子(B型肝炎ウイルスの欠損性付随体と考えられてる);C型肝炎ウイルス;ノーウォークウイルスおよび関連ウイルス、およびアストロウイルス)が挙げられるが、これらに限定されない。

グラム陰性細菌およびグラム陽性細菌のいずれもが、脊椎動物において抗原として作用する。このようなグラム陽性細菌としては、パスツレラ属(Pasteurella)の種、ブドウ球菌属(Staphylococci)の種、および連鎖球菌属(Streptococcus)の種が挙げられるが、これらに限定されない。グラム陰性細菌としては、大腸菌(Escherichia coli)、シュードモナス属(Pseudomonas)の種、およびサルモネラ属(Salmonella)の種が挙げられるが、これらに限定されない。感染性細菌の特定の例としては、Helicobacter pyloris、Borelia burgdorferi、Legionella pneumophilia、マイコバクテリウム属の種(例えば、M.tuberculosis、M.avium、M.intracellulare、M.kansaii、M.gordonae)、Staphylococcus aureus、Neisseria gonorrhoeae、Neisseria meningitidis、Listeria monocytogenes、Streptococcus pyogenes(A群連鎖球菌)、Streptococcus agalactiae(B群連鎖球菌)、連鎖球菌属(Streptococcus)(ビリダンス群)、Streptococcus faecalis、Streptococcus bovis、連鎖球菌属(嫌気性種)、Streptococcus pneumoniae、病原性Campylobacter種、Enterococcus種、Haemophilus influenzae、Bacillus antracis、Corynebacterium diphtheriae、Corynebacterium種、Erysipelothrix rhusiopathiae、Clostridium perfringers、Clostridium tetani、Enterobacter aerogenes、Klebsiella pneumoniae、Pasturella multocida、Bacteroides種、Fusobacterium nucleatum、Streptobacillus moniliformis、Treponema pallidium、Treponema pertenue、Leptospira、Rickettsia、およびActinomyces israelliが挙げられるが、これらに限定されない。

真菌の例としては、Cryptococcus neoformans、Histoplasma capsulatum、Coccidioides immitis、Blastomyces dermatitidis、Chlamydia trachomatis、Candida albicansが挙げられる。

他の感染性生物(すなわち、原生生物)としては、Plasmodium falciparum、Plasmodium malariae、Plasmodium ovale、およびPlasmodium vivaxのようなPlasmodium種、ならびにToxoplasma gondiiが挙げられる。血液感染性の寄生虫および/または組織寄生虫としては、Plasmodium種、Babesia microti、Babesia divergens、Leishmania tropica、Leishmania種、Leishmania braziliensis、Leishmania donovani、Trypanosoma gambiense、およびTrypanosoma rhodesiense(アフリカ睡眠病)、Trypanosoma cruzi(シャーガス病)、およびToxoplasma gondiiが挙げられる。

他の医学的に関連する微生物は、文献に広く記載されており、例えば、C.G.A.Thomas,Medical Microbiology,Bailliere Tindall,Great Britain 1983を参照のこと。その内容全体が、参考として本明細書中に組み込まれる。

アレルゲンとは、敏感な被験体においてアレルギー応答または喘息の応答を誘導することができる物質(抗原)をいう。アレルゲンのリストは莫大なものであり、これには、花粉、昆虫毒、動物の角質が剥がれたごみ、真菌芽胞、および薬物(例えば、ペニシリン)が含まれ得る。自然界に存在している動物および植物のアレルゲンの例としては、以下の属に特異的なタンパク質が挙げられるが、これらに限定されない:Canine(Canis familiaris);Dermatophagoides(例えば、Dermatophagoides farinae);Felis(Felis domesticus);Ambrosia(Ambrosia artemiisfolia);Lolium(例えば、Lolium perenneまたはLolium multiflorum);Cryptomeria(Cryptomeria japonica);Alternaria(Alternaria alternata;Alder;Alnus(Alnus gultinoasa);Betula(Betula verrucosa);Quercus(Quercus alba);Olea(Olea europa);Artemisia(Artemisia vulgaris);Plantago(例えば、Plantago lanceolata);Parietaria(例えば、Parietaria officinalisまたはParietaria judaica);Blattella(例えば、Blattella germanica);Apis(例えば、Apis multiflorum);Cupressus(例えば、Cupressus sempervirens)、Cupressus arizonica、およびCupressus macrocarpa);Juniperus(例えば、Juniperus sabinoides、Juniperus virginiana、Juniperus communis、およびJuniperus ashei);Thuya(例えば、Thuya orientalis);Chamaecyparis(例えば、Chamaecyparis obtusa);Periplaneta(例えば、Periplaneta americana);Agropyron(例えば、Agropyron repens);Secale(例えば、Secale cereale);Triticum(例えば、Triticum aestivum);Dactylis(例えば、Dactylis glomerata);Festuca(例えば、Festuca elatior);Poa(例えば、Poa pratensisまたはPoa compressa);Avena(例えば、(Avena sativa);Holcus(例えば、Holcus lanatus);Anthoxanthum(例えば、Anthoxanthum odoratum);Arrhenatherum(例えば、Arrhenatherum elatius);Agrostis(例えば、Agrostis alba);Phleum(例えば、Phleum pratense);Phalaris(例えば、Phalaris arundinacea);Paspalum(例えば、Paspalum notatum);Sorghum(例えば、Sorghum halepensis);およびBromus(例えば、Bromus inermis)。

抗原は実質的に精製されている場合もある。用語「実質的に精製されている」は、本明細書中で使用される場合には、他のタンパク質、脂質、炭水化物、またはそれらと自然界において結合している他の物質を実質的に含まない抗原、すなわち、ポリペプチドをいう。当業者は、タンパク質精製のための標準的な技術を使用してポリペプチド抗原を精製することができる。実質的に純粋なポリペプチドは、しばしば、非還元性ポリアクリルアミドゲル上で単一の際立ったバンドを生じる。部分的にグリコシル化されたポリペプチド、またはいくつかの開始コドンを有しているものの場合には、非還元性ポリアクリルアミドゲル上にいくつかのバンドが存在する場合があるが、これらは、そのポリペプチドについて異なったパターンを形成する。ポリペプチド抗原の精製はまた、アミノ末端のアミノ酸配列分析によって決定することもできる。多糖、低分子、模倣物などのような他の型の抗原が本発明に含まれ、これらは状況によっては実質的に純粋なものである場合もある。

本発明のオリゴヌクレオチドは、抗菌剤とともに被験体に投与することができる。抗菌剤とは、本明細書中で使用される場合は、感染性微生物を死滅させるかまたは阻害することができる、自然界に存在している化合物または合成の化合物をいう。本発明に従って有用である抗菌剤の型は、被験体が感染しているか、または被験体が感染するリスクのある微生物の型に依存する。抗菌剤としては、抗細菌剤、抗ウイルス剤、抗真菌剤、および抗寄生虫剤が挙げられるが、これらに限定されない。「抗感染剤」、「抗細菌剤」、「抗ウイルス剤」、「抗真菌剤」、「抗寄生虫剤」、および「殺寄生虫薬」のような語句は、当業者にとって十分に確立されている意味を有し、標準的な医学的テキストにおいて定義されている。簡単には、抗細菌剤は、細菌を死滅させるかまたは阻害し、これには、抗生物質および同様の機能を有している他の合成化合物または自然界に存在している化合物が含まれる。抗生物質は、細胞、例えば、微生物によって二次代謝産物として生産される低分子量の分子である。一般には、抗生物質は、微生物に特異的であり、宿主細胞中には存在しない、1つ以上の細菌の機能または構造を妨害する。抗ウイルス剤は自然界の供給源から単離することができるか、または合成することができ、ウイルスを死滅させるまたは阻害するために有用である。抗真菌剤は、表在性の真菌による感染、および日和見的な初期の全身的な真菌感染を処置するために使用される。抗寄生虫剤は、寄生虫を死滅させるか、または阻害する。

ヒトへの投与に有用な殺寄生虫薬とも呼ばれる、抗寄生虫剤の例として、アルベンダゾール、アンホテリシンB、ベンズイミダゾール、ビチオノール、クロロキンHCl、リン酸クロロキン、クリンダマイシン、デヒドロエメチン、ジエチルカルバマジン、ジロキサニドフロエート、エフロルニチン、フラゾリダオン(furazolidaone)、グルココルチコイド、ハロファントリン、ヨードキノール、イベルメクチン、メベンダゾール、メフロキン、メグルミンアンチモニエート、メラルソプロール、メトリフォネート、メトロニダゾール、ニクロサミド、ニフルティモックス、オキサムニキン、パルモマイシン、ペンタミジン、イセチオネート、ピペラジン、プラジカンテル、リン酸プリマキン、プログアニル、パモ酸ピランテル、ピリメタミンスルフォンアミド、ピリメタミンスルファドキシン、キナクリンHCl、硫酸キニーネ、グルコン酸キニジン、スピラマイシン、スチボグルコネート・ナトリウム(グルコン酸アンチモニルナトリウム)、スラミン、テトラサイクリン、ドキシサイクリン、チアベンダゾール、チニダゾール、トリメトロプリム・スルファメトキサゾール、およびトリパルサミドが挙げられるが、これらに限定されない。これらのいくつかは、単独で、または他のものと組み合わせて使用される。

抗細菌剤は、細菌を死滅させるか、または細菌の増殖もしくは機能を阻害する。抗細菌剤の大きなクラスは抗生物質である。広い範囲の細菌を死滅させるかまたは阻害するために有効な抗生物質は、広域抗生物質と呼ばれる。他の型の抗生物質は、主に、グラム陽性またはグラム陰性のクラスの細菌に対して有効である。これらの型の抗生物質は、狭域抗生物質と呼ばれる。単一の生物または疾患に有効であるが、他の型の細菌に対しては有効ではない他の抗生物質は、限定抗生物質(limited spectrum antibiotics)と呼ばれる。抗細菌剤は、時々、それらの最初の作用形態に基づいて分類される。一般的には、抗細菌剤は、細胞壁合成のインヒビター、細胞膜のインヒビター、タンパク質合成のインヒビター、核酸合成または核酸機能のインヒビター、および競合インヒビターである。

抗ウイルス剤は、ウイルスによる細胞の感染、または細胞内でのウイルスの複製を妨げる化合物である。抗ウイルス剤は、抗細菌剤である薬剤よりもずっと少ない。なぜなら、ウイルスの複製プロセスは、宿主細胞内でのDNA複製とあまりに密接に関係しており、多くの場合に非特異的な抗ウイルス剤が宿主に対して毒性であるからである。抗ウイルス剤によって遮断または阻害することができるウイルス感染のプロセスにはいくつかの段階がある。これらの段階には、宿主細胞へのウイルスの付着(免疫グロブリンまたは結合ペプチド)、ウイルスの脱殻(例えば、アマンタジン)、ウイルスmRNAの合成または転位(例えば、インターフェロン)、ウイルスRNAまたはDNAの複製(例えば、ヌクレオシド類似体)、新しいウイルスタンパク質の成熟(例えば、プロテアーゼインヒビター)、およびウイルスの出芽および放出が含まれる。

ヌクレオチド類似体とは、ヌクレオチドと類似しているが、不完全であるかあるいは異常なデオキシリボースまたはリボース基を有している合成の化合物である。一度、ヌクレオチド類似体が細胞中に存在すると、これらはリン酸化され、ウイルスDNAまたはRNA中への取り込みについて正常なヌクレオチドと競合する、三リン酸形態を生じる。一度、このヌクレオチド類似体の三リン酸形態が成長しつつある核酸鎖に組み込まれると、これはウイルスポリメラーゼとの不可逆的な結合を生じ、これにより鎖の終結を生じる。ヌクレオチド類似体としては、アシクロビル(単純ヘルペスウイルスおよび水痘帯状疱疹ウイルスの処置に使用される)、ガンシクロビル(サイトメガロウイルスの処置に有用である)、イドクスウリジン、リバビリン(呼吸器合胞体ウイルスの処置に有用である)、ジデオキシイノシン、ジデオキシシチジン、ジドブジン(アジドチミジン)、イミキモド、およびレジミキモド(resimiquimod)が挙げられるが、これらに限定されない。

インターフェロンは、ウイルスに感染した細胞、ならびに免疫細胞によって分泌されるサイトカインである。インターフェロンは、感染した細胞に隣接する細胞上の特異的受容体に結合することにより作用して、ウイルスによる感染から細胞を防御する細胞内での変化を生じる。αおよびβインターフェロンはまた、感染した細胞の表面上でのクラスIおよびクラスIIのMHC分子の発現を誘導して、宿主免疫細胞の認識のための抗原提示を増大させる。αおよびβインターフェロンは、組み換え形態として利用することができ、慢性B型肝炎およびC型肝炎感染の処置に使用されている。抗ウイルス治療に有効な投与量では、インターフェロンには、発熱、倦怠感、および体重の減少のような重度の副作用がある。

本発明において有用な抗ウイルス剤としては、免疫グロブリン、アマンタジン、インターフェロン、ヌクレオシド類似体、およびプロテアーゼインヒビターが挙げられるが、これらに限定されない。抗ウイルス剤の特異的な例としては、エースマンナン;アシクロビル;アシクロビルナトリウム;アデフォビル;アロブジン;アルビルセプトスドトックス(Alvircept Sudotox);塩酸アマンタジン;アラノチン(Aranotin);アリルドン(Arildone);メシル酸アテビルジン(Atevirdin Mesylate);アブリジン(Avridine);シドフォビル(Cidofovir);シパムフィリン(Cipamfylline);塩酸シタラビン;メシル酸デラビルジン;デシクロビル;ディダノシン;ディソキサリル(Disoxaril);エドクスジン(Edoxudine);エンビラデン(Enviradene);エンビロキシム(Enviroxime);ファムシクロビル;塩酸ファモチン(Famotine Hydrochloride);フィアシタビン(Fiacitabine);フィアルジビン(Fialuridine);フォサリレート(Fosarilate);ホスカルネットナトリウム;ホスフォネットナトリウム(Fosfonet Sodium);ガンシクロビル;ガンシクロビルナトリウム;イドクスウリジン;ケトキサール(Kethoxal);ラミブジン;ロブカビル(Lobucavir);塩酸メモチン(Memotine Hydrochloride);メチサゾン(Methisazone);ネビラピン;ペンシクロビル;ピロダビル(Pirodavir);リバビリン;塩酸リマンタジン;メシル酸サキナビル;塩酸ソマンタジン(Somantadine Hydrochloride);ソリブジン;スタットロン(Statolon);スタブジン;塩酸チロロン;トリフルウリジン;塩酸バラシクロビル;ビダラビン;リン酸ビダラビン;リン酸ビダラビンナトリウム(Vidarabine Sodium Phosphate);ビルオキシム(Viroxime);ザルシタビン;ジドブジン;およびジンビルオキシム(Zinviroxime)が挙げられるが、これらに限定されない。

抗真菌剤は、感染性の真菌の処置および予防に有用である。抗真菌剤は、時々、それらの作用機構によって分類される。いくつかの抗真菌剤は、グルコースの合成を阻害することによって細胞壁インヒビターとして機能する。これらとしては、バシウンジン(basiungin)/ECBが挙げられるがこれに限定されない。他の抗真菌剤は、膜の完全性を不安定化させることによって機能する。これらとしては、クロトリマゾール、セルタコンゾール、フルコナゾール、イトラコンゾール、ケトコナゾール、ミコナゾール、およびボリコナゾール(voriconacole)のようなイミダゾール、ならびにFK463、アンホテリシンB、BAY38−9502、MK991、パラジマイシン、UK292、ブテナフィン、およびテルビナフィンが挙げられるが、これらに限定されない。他の抗真菌剤は、キチンを崩壊させることによって(例えば、キチナーゼ)、または免疫抑制によって(501クリーム)作用する。

CpG免疫刺激オリゴヌクレオチドは、免疫応答を強化するために、アジュバントのような他の治療薬と混合することができる。CpG免疫刺激オリゴヌクレオチドおよび他の治療薬は、同時にまたは連続して投与することができる。他の治療薬が同時に投与される場合には、これらは、同じ処方物中で、または別の処方物中で投与することができるが、同時に投与される。他の治療薬およびCpG免疫刺激オリゴヌクレオチドの投与が時間的に分けられる場合には、他の治療薬は互いに、そしてCpG免疫刺激オリゴヌクレオチドと連続して投与される。これらの化合物の投与の間の間隔はほんの数分である場合もあり、またそれよりも長い場合もある。他の治療薬としては、アジュバント、サイトカイン、抗体、抗原などが挙げられるが、これらに限定されない。

本発明の組成物はまた、核酸ではないアジュバントと共に投与される場合もある。核酸ではないアジュバントとは、体液性および/または細胞性免疫応答を刺激することができる、本明細書中に記載されているCpG免疫刺激オリゴヌクレオチド以外の任意の分子または化合物である。核酸ではないアジュバントとしては、例えば、デポー効果を生じるアジュバント、免疫刺激アジュバント、およびデポー効果を生じ、かつ免疫系を刺激するアジュバントが挙げられる。

CpG免疫刺激オリゴヌクレオチドはまた、粘膜のアジュバントとしても有用である。全身性および粘膜の免疫の両方が、CpG核酸の粘膜への送達によって誘導されることが以前に発見されている。したがって、オリゴヌクレオチドは、他の粘膜のアジュバントと組み合わせて投与される場合もある。

免疫応答はまた、CpG免疫刺激オリゴヌクレオチドとの、サイトカインの(BuelerおよびMulligan,1996;Chow等,1997;Geissler等,1997;Iwasaki等,1997;Kim等,1997)、あるいはB7のような同時刺激分子(Iwasaki等,1997;Tsuji等,1997)の同時投与または同一線形的な(co−linear)発現によって誘導するか、または増大させることができる。用語「サイトカイン」は、ナノモルからピコモルの濃度で体液性の調節因子として作用し、正常な条件下または病理学的条件下のいずれかで、個々の細胞および組織の機能的活性を調節する、可溶性タンパク質およびペプチドの異なる群についての総称として使用される。これらのタンパク質はまた、細胞間の相互作用を直接媒介し、細胞外環境で生じるプロセスを調節する。サイトカインの例としては、IP−10、IL−1、IL−2、IL−4、IL−5、IL−6、IL−7、IL−10、IL−12、IL−15、IL−18、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF)、顆粒球コロニー刺激因子(G−CSF)、インターフェロン−γ(γ−IFN)、IFN−α、腫瘍壊死因子(TNF)、TGF−β、FLT−3リガンド、およびCD40リガンドが挙げられるが、これらに限定されない。サイトカインに加えて、CpGオリゴヌクレオチドは、抗IL−10および抗TGF−βのような特定のサイトカインに対する抗体、ならびにCoxインヒビター、すなわち、COX−1およびCOX−2インヒビターと組み合わせて使用される場合もある。

オリゴヌクレオチドはまた、Th2免疫応答からTh1免疫応答へと、免疫応答を向け直すためにも有用である。これにより、比較的バランスのとれたTh1/Th2環境が生じる。Th2免疫応答からTh1免疫応答への免疫応答の変更は、核酸に応答して生産される(例えば、単球細胞、およびIL−12、IFN−γ、およびGM−CSFを含むTh1サイトカインを生産する他の細胞を誘導することによる)サイトカインのレベルを測定することによって評価することができる。Th2応答からTh1応答への免疫応答の変更またはバランスを取り戻すことは、喘息の処置に特に有用である。例えば、喘息を処置するために有効な量は、喘息に関係しているTh2型の免疫応答をTh1型の応答へと向け直すために、またはバランスのとれたTh1/Th2環境へと向け直すために有用な量であり得る。Th2サイトカイン、特に、IL−4およびIL−5は、喘息の被験体の気道において増加する。本明細書中に記載されているCpG免疫刺激オリゴヌクレオチドは、免疫系のバランスを取り戻すことを助けるTh1サイトカインの増加を引き起こし、優勢なTh2免疫応答に関係している有害な作用を防ぐかまたは軽減する。

CpG免疫刺激オリゴヌクレオチドは、細胞の生存性、分化、樹状細胞の活性化および成熟を促進する特有の能力を有しており、樹状細胞を含むインビトロ、インビボ、またはエキソビボでの方法に有用である。

CpG免疫刺激オリゴヌクレオチドはまた、ナチュラルキラー細胞溶解活性、および抗体依存性細胞傷害作用(ADCC)を増大させる。ADCCは、ガン細胞のような細胞標的に特異的な抗体と組み合わせてCpG免疫刺激オリゴヌクレオチドを使用して行うことができる。CpG免疫刺激オリゴヌクレオチドは、抗体と組み合わせて被験体に投与されると、被験体の免疫系を、腫瘍細胞を死滅させるように誘導する。ADCC手順において有用である抗体としては、体内の細胞と相互作用する抗体が挙げられる。多くのこのような細胞標的に特異的な抗体が当該分野で記載されており、多くが市販されている。

CpG免疫刺激オリゴヌクレオチドはまた、抗ガン治療と組み合わせて投与される場合もある。抗ガン治療には、ガン用の医薬、放射線治療、および外科手術手順が含まれる。本明細書中で使用される場合は、「ガン用の医薬」とは、ガンの処置の目的のために被験体に投与される薬剤をいう。本明細書中で使用される場合は、「ガンを処置すること」には、ガンの発症を防ぐこと、ガンの症状を緩和すること、および/または確立されたガンの増殖を阻害することが含まれる。他の態様では、ガン用の医薬は、ガンを発症するリスクを少なくする目的のために、ガンを発症するリスクのある被験体に投与される。ガンの処置のための種々の型の医薬が、本明細書中に記載されている。本明細書の目的については、ガン用の医薬は、化学療法薬、免疫治療薬、ガンワクチン、ホルモン治療、および生物学的応答変更因子として分類される。

さらに、本発明の方法は、CpG免疫刺激オリゴヌクレオチドに加えて、1つ以上の癌用の薬物の使用を含むように意図される。一例として、適切である場合には、CpG免疫刺激オリゴヌクレオチドは、化学療法薬および免疫治療薬の両方と組み合わせて投与される場合がある。あるいは、癌用の薬剤は、癌に罹患しているかまたは癌を発症する可能性があるある患者を処置する目的のために、その患者に対して、免疫治療薬と癌ワクチンを投与すること、または化学療法薬と癌ワクチンを投与すること、または化学療法薬、免疫治療薬および癌ワクチンの全ての投与を投与することが包含される。

化学療法薬は、メトトレキサレート、ビンクリスチン、アドリアマイシン、シスプラチン、糖を含まないクロロエチルニトロソウレア、5−フルオロウラシル、マイトマイシンC、ブレオマイシン、ドキソルビシン、ダカルバジン、タキソール、フラジリン(fragyline)、メグラミンGLA(Meglamine GLA)、バルルビシン、カルムスタイン(carmustaine)、およびポリフェルポサン(poliferposan)、MMI270、BAY12−9566、RASファメシルトランスフェラーゼ阻害因子(RAS famesyl transferase inhibitor)、ファメシルトランスフェラーゼ阻害因子(famesyl transferase inhibitor)、MMP、MTA/LY231514、LY264618/ロメテキソール(Lometexol)、グラモレック(Glamolec)、CI−994、TNP−470、ハイカムチン/トポテカン、PKC412、バルスポダール/PSC833、ノバントロン/ミトロキサントロン(Mitroxantrone)、メタレット(Metaret)/スラミン、バチマスタット、E7070、BCH−4556、CS−682、9−AC、AG3340、AG3433、Incel/VX−710、VX−853、ZD0101、ISI641、ODN698,TA2516/マルミスタット(Marmistat)、BB2516/マルミスタット(Marmistat)、CDP845、D2163、PD183805、DX8951f、レモナールDP2202、FK317、ピシバニール/OK−432、AD32/バルルビシン、メタストロン(Metastron)/ストロンチューム誘導体、テモダール/テモゾロミド、エバセット(Evacet)/リポソーム封入ドキソルビシン、イエタキサン(Yewtaxan)/パクリタキセル、タキソール/パクリタキセル、キセロード(Xeload)/カペシタビン、フルツロン/ドキシフルリジン、シクロパックス(Cyclopax)/経口パクリタキセル、経口タキソイド、SPU−077/シスプラチン、HMR1275/フラボピリドール、CP−358(774)/EGFR、CP−609(754)/RAS腫瘍遺伝子阻害因子、BMS−182751/経口白金(oral platinum)、UFT(テガフール/ウラシル)、エルガミソール(Ergamisol)/レバミソール、エニルウラシル/776C85/5FUエンハンサー、カンプト/レバミソール、カンプトサール/イリノテカン、ツモデックス(Tumodex)/ラリトレックス(Ralitrexed)、ロイスタチン/クラドリビン、Paxex/パクリタキセル、ドキシル/リポソーム封入ドキソルビシン、カエリックス(Caelyx)/リポソーム封入ドキソルビシン、フルダラ/フルダラビン、ファーマルビシン(Pharmarubicin)/エピルビシン、DepoCyt、ZD1839、LU79553/Bis−ナフタルイミド、LU103793/ドラスタイン(Dolastain)、カエティックス(Caetyx)/リポソーム封入ドキソルビシン、ジェムザール/ジェムシタビン、ZD0473/アノーメッド(Anormed)、YM116、ロジンシード(lodine seed)、CDK4およびCDK2阻害因子、PARP阻害因子、D4809/デキシフォスアミド(Dexifosamide)、Ifes/メスナ/イフォスファミド、ブモン/テニポシド、パラプラチン/カルボプラチン、プラチノール/シスプラチン、ベペシド/エトポシド、ZD9331、タキソティア/ドセタキセル、グアニンアラビノシドのプロドラッグ、タキサン類似体、ニトロソウレア、メルフェランおよびシクロフォスファミドのようなアルキル化剤、アミノグルテチミド、アスパラギナーゼ、ブスルファン、カルボプラチン、クロロクロロムブシル(Chlorombucil)、シタラビンHCl、ダクチノマイシン、ダウノルビシンHCl、エストラムスチンリン酸ナトリウム、エトポシド(VP16−213)、フロクスウリジン、フルオロウラシル(5−FU)、フルタミド、ヒドロキシウレア(ヒドロキシカルバミド)、イフォスファミド、インターフェロンα−2a、α−2b、酢酸ロイプロリド(LHRH放出因子類似体)、ロムスチン(CCNU)、メクロレタミンHCl(ナイトロジェンマスタード)、メルカプトプリン、メスナ、ミトタン(o.p’−DDD)、ミトキサントロンHCl、オクトレオチド、プリカマイシン、プロカルバジンHCl、ストレプトゾシン、クエン酸タモキシフェン、チオグアニン、チオテパ、硫酸ビンブラスチン、アムサクリン(m−AMSA)、アザシチジン、エリスロポエチン、ヘキサメチルメラミン(HMM)、インターロイキン2、ミトグアゾン(メチル−GAG;メチルグリオキサールビス−グアニルヒドラゾン;MGBG)、ペントスタチン(2’デオキシコホルマイシン)、セムスチン(メチル−CCNU)、テニポシド(VM−26)、および硫酸ビンデシンからなる群より選択することができるが、これらに限定されない。

免疫治療薬は、リブタキシン(Ributaxin)、ハーセプチン、クアドラメット、パノレックス、IDEC−Y2B8、BEC2、C225、オンコリム(Oncolym)、SMART M195、ATRAGEN、オバレックス、ベキサール、LDP−03、ior t6、MDX−210、MDX−11、MDX−22、OV103、3622W94、抗VEGF、ゼナパックス、MDX−220、MDX−447、MELIMMUNE−2、MELIMMUNE−1、CEACIDE、プレターゲット(Pretarget)、NovoMAb−G2、TNT、Gliomab−H、GNI−250、EMD−72000、LimphoCide、CMA676、Monopharm−C、4B5、ior egf.r3、ior c5、BABS、抗FLK−2、MDX−260、ANA Ab、SMART 1D10 Ab、SMART ABL 364 Ab、およびImmuRAIT−CEAからなる群より選択することができるが、これらに限定されない。

癌ワクチンは、EGF、抗イディオタイプ癌ワクチン、Gp75抗原、GMK黒色腫ワクチン、MGVガングリオシド結合ワクチン、Her2/neu、オバレックス、M−Vax、O−Vax、L−Vax、STn−KHLテラトープ(theratope)、BLP25(MUC−1)、リポソーム封入イディオタイプワクチン、メラシン、ペプチド抗原ワクチン、毒素/抗原ワクチン、MVAに基づくワクチン、PACIS、BCGワクチン、TA−HPV、TA−CIN,DISCウイルス、およびImmuCyst/TheraCysからなる群より選択することができるが、これらに限定されない。

モノクローナル抗体のような免疫治療薬と組み合わせたCpG免疫刺激オリゴヌクレオチドの使用により、ADCC(上記)の顕著な増大、ナチュラルキラー(NK)細胞の活性化、およびIFNαレベルの上昇を含む多数の機構を通じて、長期間にわたって生存性を高めることが可能である。それらの核酸は、モノクローナル抗体と組み合わせて使用された場合には、生物学的な結果を達成するために必要な抗体の用量を減少させるように作用する。

本発明はまた、CpG免疫刺激オリゴヌクレオチドを使用する、抗原非特異的な先天性免疫の活性化、および感染源による攻撃に対して広域スペクトルの耐性を誘導するための方法も含む。用語「先天性免疫の活性化」とは、本明細書中で使用される場合は、記憶B細胞以外の免疫細胞の活性化をいい、これらとしては、例えば、NK細胞、T細胞、および/または抗原依存的様式で応答することができる他の免疫細胞の活性化が挙げられる。感染攻撃に対する広域スペクトルの耐性は、免疫細胞が活性な形態であり、任意の侵襲性の化合物または微生物に応答して感作されることが原因で誘導される。それらの細胞は、必ずしも特定の抗原に対して特異的に感作されなくてもよい。このことは、生物戦争において、そして旅行者のような上記の他の状況において、特に有用である。

CpG免疫刺激オリゴヌクレオチドは、被験体に直接投与されるか、または核酸送達複合体と組み合わせて投与される場合もある。核酸送達複合体とは、当然、標的化手段(例えば、細胞を標的化するための高い親和性結合を生じる分子)と結合した(例えば、標的化手段に対するイオン結合もしくは共有結合した;または標的化手段の中にカプセル化された)核酸分子を意味する。核酸送達複合体の例としては、ステロール(例えば、コレステロール)、脂質(例えば、陽イオン性脂質、人工ウイルス粒子、またはリポソーム)、あるいは標的細胞に特異的な結合試薬(例えば、標的細胞特異的受容体によって認識されるリガンド)と結合した核酸が挙げられる。好ましい複合体は、標的細胞による内在化の前の著しい脱共役を防ぐために、生体内で十分に安定であり得る。しかし、複合体は、細胞内の適切な条件下で切断され、その結果、オリゴヌクレオチドを機能的な形態で放出することができる。

CpG免疫刺激オリゴヌクレオチドおよび/または抗原および/または他の治療薬は、単独で(例えば、生理食塩水中または緩衝液中で)、あるいは当該分野で公知の任意の送達ビヒクルを使用して投与することができる。例えば、以下の送達ビヒクルが記載されている:コヒレート(Cochleates)(Gould−Fogerite等、1994,1996);エマルサム(Vancott等,1998、Lowell等,1997);ISCOM(Mowat等,1993,Carlsson等,1991,Hu等,1998,Morein等,1999);リポソーム(Childers等,1999,Michalek等,1989,1992,de Haan 1995a,1995b);生存細菌ベクター(例えば、サルモネラ(Salmonella)、大腸菌(Escherichia coli)、バシラス・カルマット−グエリン(Bacillus calmatte−guerin)、志賀菌(Shigella)、乳酸菌(Lactobacillus)(Hone等,1996,Pouwels等,1998,Chatfield等,1993,Stover等,1991,Nugent等,1998);生存ウイルスベクター(例えば、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス)(Gallichan等,1993,1995,Moss等,1996,Nugent等,1998,Flexner等,1998,Morrow等,1999);マイクロスフェア(Gupta等,1998,Jones等,1996,Maloy等,1994,Moore等,1995,O’Hagan等,1994,Eldrige等,1989);核酸ワクチン(Fynan等,1993,Kuklin等,1997,Sasaki等,1998,Okada等,1997,Ishii等,1997);ポリマー(例えば、カルボキシメチルセルロース、キトサン)(Hamajima等,1998,Jabbal−Gill等,1998);ポリマー環(Wyatt等,1998);プロテオソーム(Vancott等,1998,Lowell等,1988,1996,1997);フッ化ナトリウム(Hashi等,1998);トランスジェニック植物(Tacket等,1998,Mason等,1998,Haq等,1995);人工ウイルス粒子(Gluck等,1992,Mengiardi等,1995,Cryz等,1998);ウイルス様粒子(Jiang等,1999,Leibl等,1998)。他の送達ビヒクルが当該分野で公知である。

用語「CpG免疫刺激オリゴヌクレオチドの有効量」とは、望まれる生物学的効果を得るために必要であるかまたは十分である量をいう。例えば、粘膜の免疫を誘導するための抗原とともに投与されるCpG免疫刺激オリゴヌクレオチドの有効量は、抗原にさらされた際に抗原に応答してIgAの発生を生じるために必要な量であり、一方、全身性免疫を誘導するために必要な量は、抗原にさらされた際に抗原に応答してIgGの発生を生じるために必要な量である。本明細書中に提供される教示と組み合わせて、種々の活性環化合物の中から選択し、効力、相対的な生体利用性、患者の体重、有害な副作用の重篤度、好ましい投与の態様のような要素を計測することにより、実施的な毒性を生じることがなく、なお、特定の被験体を処置するために完全に有効である有効な、予防的または治療的処置レジュメを計画することができる。任意の特定の用途についての有効量は、処置される疾患または症状、投与される特定のCpG免疫刺激オリゴヌクレオチド、被験体の大きさ、あるいは疾患または症状の重篤度のような要因によって変化し得る。当業者は、特定のCpG免疫刺激オリゴヌクレオチドおよび/または抗原および/または他の治療薬の有効量を、過度な実験の必要なく、経験的に決定することができる。

粘膜投与または局所投与について本明細書中に記載されている化合物の対象用量は、通常、1回の投与について約0.1μgから10mgまでの範囲であり、これは、適用によって異なるが、1日に1回、1週間に1回、または1ヶ月に1回、およびこれらの間の任意の他の量、または必要に応じて別の量で、投与することができる。より一般的な粘膜または局所用量は、1回の投与について約10μgから5mgまでの範囲であり、最も典型的には、約100μgから1mgまでであり、2回〜4回の投与が、数日から数週間の間隔をあけて行われる。より一般的には、免疫刺激用量は、1回の投与について1μgから10mgまでの範囲であり、最も典型的には、10μgから1mgまでで、1日1回または1週間に1回の投与である。抗原特異的免疫応答を誘導する目的のための非経口投与についての本明細書中に記載されている化合物の対象用量は(ここでは、化合物は、別の治療薬ではなく抗原とともに投与される)、通常、ワクチンアジュバントまたは免疫刺激適用について有効な粘膜での用量よりも5から10000倍多く、より一般的には、10から1000倍多く、最も典型的には、20から100倍多い。先天性の免疫応答を誘導する目的のため、またはADCCを増大させるため、または抗原特異的免疫応答を誘導するための非経口投与についての本明細書中に記載される化合物の用量は、CpG免疫刺激オリゴヌクレオチドが他の治療薬と組み合わせて、または球形の送達ビヒクル中で投与される場合には、通常、1回の投与について約1.0μgから100mgまでの範囲であり、これは適用に応じて、1日に1回、1週間に1回、または1ヶ月に1回、およびこれらの間の任意の他の量、または必要に応じて別の量で、投与することができる。これらの目的についてのより一般的な非経口用量は、1回の投与について約100μgから50mgまでの範囲であり、最も典型的には、約200μgから2mgまでで、2回〜4回の投与が、数日から数週間の間隔をあけて行われる。しかし、いくつかの実施形態では、これらの目的についての非経口用量は、上記に記載される通常の用量よりも5から10000倍多い範囲で使用される場合がある。

本明細書中に記載される任意の化合物についての治療有効量は、最初に動物モデルから決定することができる。治療有効量はまた、ヒトにおいて試験されている他のCpGオリゴヌクレオチドについてのヒトのデータ(ヒトでの臨床試験が進行中である場合)、および同様の薬理学的活性を示すことが既知である他のアジュバントのような化合物(例えば、LTおよびワクチン接種の目的のための他の抗原)についてのヒトのデータから決定することもできる。非経口投与にはさらに多い用量が必要な場合もある。投与される用量は、相対的な生体利用性、投与される化合物の効力に基づいて調節することができる。上記に記載される方法、および当該分野で周知の他の方法に基づいて最大効力を達成するように用量を調節することは、十分に当業者の能力の範囲内である。

本発明の処方物は、薬学的に許容される濃度の塩、緩衝化剤、保存料、適合性担体、アジュバント、および必要である場合には、他の治療用成分を規定どおり含むことができる、薬学的に許容される溶液中で投与される。

治療において使用するためには、有効量のCpG免疫刺激オリゴヌクレオチドおよび/または他の治療薬を、望まれる表面に化合物を送達する任意の様式によって、例えば、局所、粘膜、全身によって、被験体に投与することができる。本発明の薬学的組成物の投与は、当業者に公知の任意の手段によって達成することができる。好ましい投与経路としては、経口、非経口、筋肉内、鼻腔内、舌下、気管内、吸入、眼、膣、および直腸が挙げられるが、これらに限定されない。

経口投与については、化合物(すなわち、CpG免疫刺激オリゴヌクレオチド、抗原、および/または他の治療薬)は、活性のある化合物(単数または複数)を当該分野で周知の薬学的に許容される担体と混合することによって容易に処方することができる。このような担体は、本発明の化合物が、処置される被験体による経口摂取のための錠剤、丸剤、糖衣錠、カプセル剤、液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー、懸濁剤などとして処方されることを可能にする。経口での使用のための薬学的調製物は、必要に応じて得られた混合物を粉砕し、所望される場合には、錠剤または糖衣錠の核を得るために適切な補助剤を加えた後で、顆粒状の混合物を処理することによって、固形の賦形剤として得ることができる。適切な賦形剤は、具体的には、乳糖、ショ糖、マンニトール、またはソルビトールを含む糖類のような増量剤;例えば、トウモロコシ澱粉、コムギ澱粉、コメ澱粉、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカントガム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、および/またはポリビニルピロリドン(PVP)のようなセルロース調製物である。所望される場合には、架橋されたポリビニルピロリドン、寒天、またはアルギン酸、あるいはアルギン酸ナトリウムのようなそれらの塩などの崩壊剤が添加される場合もある。状況に応じて、経口処方物はまた、内部の酸性条件を中和するために生理食塩水または緩衝液中に処方される場合もあり、また、いずれの担体も伴わずに投与される場合もある。

糖衣錠の核には、適切なコーティングが施される。この目的のためには、濃縮された糖溶液が使用され、これは、必要に応じて、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポールゲル、ポリエチレングリコール、および/または二酸化チタン、ラッカー溶液、および適切な有機溶媒または溶媒混合物を含むこともできる。活性のある化合物の用量の同定、または種々の組み合わせを特徴付けるために、染料または色素が錠剤または糖衣錠に加えられる場合もある。

経口で使用することができる薬学的調製物としては、ゼラチンでできている押し込み型のカプセル、さらにはゼラチンおよび可塑剤(例えば、グリセロールまたはソルビトール)でできている軟らかいシールされたカプセルが挙げられる。押し込み型のカプセルには、乳糖、澱粉のような結合剤、および/または、タルクもしくはステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、必要に応じて、安定剤と混合された活性のある成分を含めることができる。軟カプセルにおいては、活性のある化合物は、脂肪油、流動パラフィン、または液体ポリエチレングリコールのような適切な液体中に溶解させられるか、または懸濁させられる場合がある。さらに、安定剤が添加される場合もある。経口投与のために処方されるマイクロスフェアを使用することもできる。このようなマイクロスフェアは、当該分野で十分に定義されている。経口投与のための全ての処方物は、このような投与に適切な投与量であるはずである。

口腔投与については、組成物は、従来の様式で処方された錠剤またはトローチ剤の形態をとる場合がある。

化合物は、標準的な吸入装置を使用して、肺に、具体的には、気管支に、さらに具体的には、肺の奥深くの肺胞に、吸入によって投与することができる。化合物は、適切な高圧ガス(例えば、ジクロロジフルオソメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素、または他の適切な気体)の使用によって、加圧型のパックまたはネブライザーからのエアゾールスプレーの提示の形態で投与することができる。加圧型エアゾールの場合には、投与量単位は、定量を投与する値に設定することによって決定することができる。吸入装置を、被験体に化合物を投与するために使用することができる。吸入装置とは、本明細書中で使用される場合は、化合物の乾燥粉末形態のような、エアゾールを投与するための任意の機器である。この型の装置は当該分野で周知であり、詳細に記載されており、例えば、そのような記載は、Remington:The Science and Practice of Pharmacy,第19版,1995,Mac Publishing Company,Easton,Pennsylvania,pp1676−1692において見ることができる。米国特許第6,116,237号のような多くの米国特許にもまた、吸入機器が記載されている。

「粉末」とは、本明細書中で記載される場合は、微細に分散させられた固形粒子から構成される組成物を意味する。好ましくは、化合物は吸入機器の中で比較的自由に浮遊し、分散させることができ、その後、被験体によって吸入され、その結果、化合物が肺に達して肺胞への吸入が可能になる。「乾燥粉末」とは、エアゾールを形成するための吸入機器において粒子を容易に分散させることができる程度の水分含量を有している粉末組成物をいう。水分含量は、一般的には、約10重量%(%w)未満の水であり、いくつかの実施形態においては、約5%w未満であり、好ましくは、約3%w未満である。粉末は、ポリマーとともに処方することができ、また状況に応じて、リポソーム、アルブミン、および/または他の担体のような他の物質とともに処方することもできる。

エアゾールの投与量および送達システムは、当業者によって特定の治療投与について選択することができる。例えば、Gonda,I.「Aerosols for delivery of therapeutic and diagnostic agents to the respiratory tract」,Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems,6:273−313(1990)、およびMoren,「Aerosol dosage forms and formulations」,Aerosols in Medicine.Principes,Diagnosis and Therapy,Moren等編,Esevier,Amsterdam,1985に記載されている。

それらの化合物は、それが全身的に投与されることが望ましい場合には、注射による、例えば、ボーラス注入法、または静注による非経口投与のために処方することができる。注射のための処方物は、別の保存剤とともに単位投与量形態で、例えば、アンプル中に、または多用量の容器中に調製することができる。組成物は、坐剤、油性もしくは水性のビヒクル中の液剤または乳濁液のような形態をとることができ、また、懸濁剤、安定剤、および/または分散剤のような処方のための薬剤を含むこともできる。

非経口投与のための薬学的処方物としては、水溶性の形態の活性のある化合物の水溶液が挙げられる。さらに、活性のある化合物の懸濁液を、適切な油状の注射用懸濁液として調製することもできる。適切な親油性溶媒またはビヒクルとしては、ゴマ油のような脂肪油、またはオレイン酸エチルもしくはトリグリセリドのような合成の脂肪酸エステル、またはリポソームが挙げられる。水性の注射用懸濁液には、懸濁液の粘性を増大させる物質、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、またはデキストランが含まれる場合がある。必要に応じて、懸濁液には、適切な安定剤、または化合物の可溶性を増大させて高度に濃縮された溶液を調製することを可能にするための試薬を含めることもできる。

あるいは、活性のある化合物は、使用前に、適切なビヒクル、例えば、滅菌の発熱物質を含まない水を用いて構成される粉末形態である場合もある。

それらの化合物はまた、例えば、ココアバターまたは他のグリセリドのような一般的な坐剤の基剤を含む、坐剤または停留浣腸のような直腸または膣用の組成物に処方することもできる。

上記に記載される処方物に加えて、化合物は、デポー調製物として処方される場合もある。このような長期作用性の処方物は、適切なポリマー材料もしくは疎水性材料を用いて(例えば、許容される油中の乳濁液として)またはイオン交換樹脂を用いて処方されるか、あるいはやや溶けにくい誘導体として、例えば、やや溶けにくい塩として処方される場合もある。

薬学的組成物はまた、適切な固体またはゲル相の担体または賦形剤を含む場合がある。このような担体または賦形剤の例としては、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、種々の糖、澱粉、セルロース誘導体、ゼラチン、およびポリエチレングリコールのようなポリマーが挙げられるが、これらに限定されない。

適切な液体または固体の薬学的調製物の形態は、例えば、吸入用の水溶液または生理食塩溶液、マイクロカプセル化された、渦巻状に巻かれた、金微粒子上にコーティングされた、リポソーム中に含められた、霧状にされたエアゾール、皮膚への移植用の、または皮膚を引っ掻く鋭利なものの上に乾燥させられた小丸薬である。薬学的組成物としてはまた、顆粒、粉末、錠剤、コーティングされた錠剤、(マイクロ)カプセル、坐剤、シロップ剤、乳濁剤、懸濁剤、クリーム剤、点滴剤、または活性のある化合物の持続的な放出を伴う調製物が挙げられる。これらの調製においては、賦形剤および添加剤、ならびに/または、崩壊剤、結合剤、コーティング剤、膨張剤、潤滑剤、香味剤、甘味剤、または安定剤のような補助剤が、上記のように習慣的に使用される。これらの薬学的組成物は、種々の薬物送達システムでの使用に適切である。薬物投与のための方法の簡単な概要については、Langer,Science 249:1527−1533,1990を参照のこと。これは引用により本明細書中に組み込まれる。

CpG免疫刺激オリゴヌクレオチド、ならびに、場合によっては他の治療薬および/または抗原は、それ自体が投与される場合もある(ニート)が、薬学的に許容される塩の形態で投与される場合もある。医薬品において使用される場合は、塩は、薬学的に許容されるものでなければならないが、薬学的には許容されない塩が、その薬学的に許容される塩を調製するために使用されることが好都合である場合もある。そのような塩としては、以下の酸から調製されるものが挙げられるが、これらに限定されない:塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、マレイン酸、酢酸、サリチル酸、p−トルエンスルホン酸、酒石酸、クエン酸、メタンスルホン酸、ギ酸、マロン酸、コハク酸、ナフタレン−2−スルホン酸、およびベンゼンスルホン酸。また、このような塩は、カルボン酸基の、ナトリウム、カリウムまたはカルシウム塩のようなアルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩として調製することができる。

適切な緩衝化剤として、以下が挙げられる:酢酸および塩(1〜2%w/v);クエン酸および塩(1〜3%w/v);ホウ酸および塩(0.5〜2.5%w/v);およびリン酸および塩(0.8〜2%w/v)。適切な保存剤としては、塩化ベンズアルコニウム(0.003〜0.03%w/v);クロロブタノール(0.3〜0.9%w/v);パラベン(0.01〜0.25%w/v)、およびチメロサール(0.004〜0.02%w/v)が挙げられる。

本発明の薬学的組成物は、有効量のCpG免疫刺激オリゴヌクレオチドと、必要に応じて、状況に応じて薬学的に許容される担体中に含まれる抗原および/または他の治療薬を含む。用語「薬学的に許容される担体」とは、ヒトまたは他の脊椎動物への投与に適している、1つ以上の適合性の固体または液体の増量剤、希釈剤、またはカプセル化物質を意味する。用語「担体」とは、適用を容易にするために有効成分と混合される、天然または合成の有機成分または無機成分を示す。薬学的組成物の成分はまた、本発明の化合物と、および互いに、所望される薬学的効力を実質的に損なうような相互作用が生じないような様式で、混合することができる。

本発明は、以下の実施例によってさらに説明される。実施例は、更なる限定としては決して解釈されるべきではない。本明細書中で引用される全ての引用文献(参考文献、発行された特許、公開された特許出願、および同時係属中の特許出願を含む)の全ての内容が、引用により本明細書中に明確に援用される。

(材料および方法)
(オリゴヌクレオチド)
全てのODNは、Coley Pharmaceutical GmbH(Laggenfeld,Germany)によって提供された。ODNをリン酸緩衝生理食塩水(Sigma,Germany)で希釈し、−20℃で保存した。全ての希釈を、発熱物質を含まない試薬を用いて行った。下記の研究において使用したODNを表1に示す。

(細胞の精製)
健常な男性および女性のヒトドナーに由来する抹消血軟膜の調製物を、German Red Cross(Rathingen,Germany)、またはBlood Bank of the University of Duesseldorf(Germany)から入手し、これらからPBMCを、Ficoll−Hypaque(Sigma)での遠心分離によって精製した。精製したPBMCを、新鮮なまま使用した(ほとんどのアッセイについて)か、または凍結培地中に懸濁して−70℃で保存したかのいずれかであった。必要な場合には、これらの細胞のアリコートを解凍し、洗浄し、5%(v/v)の熱不活化ヒトAB血清(BioWhittaker,Belgium)または10%(v/v)の熱不活化FCS、1.5mMのL−グルタミン、100U/mlのペニシリンと、100μg/mlのストレプトマイシン(全てSigma製)を補充したRPMI 1640培養培地中に再懸濁した。

(サイトカインの検出)
解凍したPBMCまたは新鮮なPBMCを、3×10/mlから5×10/mlの濃度で再懸濁し、予め種々の濃度のODNを加えたかまたは何も加えていないプレートに添加した。細胞を、加湿インキュベーター中で37℃にて培養した。指示した時点後に、培養上清を回収した。すぐに使用しない場合は、上清を必要になるまで−20℃で凍結させた。上清中のサイトカインの量を、市販のELISAキットか、または市販の抗体(例えば、Becton Dickinson,Germany)を用いて開発した自社製のELISAを使用して評価した。

(実施例1:5’−TCGは非CpG ODNまたはCpG ODNの免疫刺激活性を増強する(IL−10)。)
2人の代表ドナーのヒトPBMCを、指示したODNとともに48時間インキュベートした(図1)。上清を収集し、IL−10を「材料および方法」に記載したようにELISAによって測定した。非CpG ODN(例えば、ポリT ODN)または別の非CpG ODN(配列番号6)の活性は、その5’末端にTCGトリヌクレオチドを付加することによって大きく増強された。配列番号3のような5’−TCGを欠いているCpG ODN(Magoneら、Eur.J.Immunol.2000;30:1841−1850)もまた、5’TCGの付加を用いてより高い効力(potency)および/または有効性(efficacy)を示すように修飾し得た。

(実施例2:TCGは非CpG ODNまたはCpG ODNの免疫刺激活性を増強する(IFN−α)。)
2人の代表ドナーのヒトPBMCを、指示したODNとともに48時間インキュベートした(図2)。上清を収集し、IFN−αを「材料および方法」に記載したようにELISAによって測定した。このIFN−αアッセイにおいても、図1に示したような同じODNについて5’−TCG修飾の効果が実証された。
(実施例3:免疫応答の増強はCpGジヌクレオチドに依存する。)
2人の代表ドナーのヒトPBMCを、指示したODNとともに48時間インキュベートした(図3)。上清を収集し、IL−10を「材料および方法」に記載したようにELISAによって測定した。5’−TGC(配列番号2)およびポリT配列(配列番号8)の効果を示す。5’−TCG(配列番号10)は、ごくわずかな効果しか有し得ないが、5’−TCG修飾は、明らかに、サイトカインの分泌に関して非常に強い増強を生じた。17マーのポリA ODNの5’−TCG修飾は、効果がないようであった(配列番号9)。同様の結果がインターフェロンの分泌についても得られた。5’−TCG + ポリA ODNとは対照的に、ポリウラシルの状況における5’−TCG ODNは、IL−10の分泌の増加を導いた(図6に示される)。

(実施例4:ODNの5’から3’末端へのCpGジヌクレオチドの移動は免疫刺激能力の段階的な損失を生じる。)
2人の代表ドナーのヒトPBMCを、指示したODNとともに48時間インキュベートした(図4)。上清を収集し、IL−10を「材料および方法」に記載したようにELISAによって測定した。ODNの5’末端のCpGジヌクレオチドは、増強したIL10−分泌を生じた(配列番号2)。CpGをポリT ODNの3’末端に移動させることにより(配列番号11)、サイトカインの分泌の大幅な減少が生じた。5’−CG(配列番号12)もまた、増強効果を有していたが、5’−TCGはサイトカイン応答を増強することにおいてさらに効果的であった。同様の結果が、インターフェロン分泌についても得られた。

(実施例5:5’−TCGに加えてODNの長さも刺激活性に対して効果を有する。)
2人の代表ドナーのヒトPBMCを、指示したODNとともに48時間インキュベートした(図5)。上清を収集し、IL−10を「材料および方法」に記載したようにELISAによって測定した。このデータは、5’−TCG ODNに加えてCpG ODNの長さも、刺激活性において役割を果たすことを示している。21マーは、17マーよりも強力であり効果的であり、17マーは15マーまたは13マーよりも強力である。

(実施例6:5’−TCGは最も刺激性の高い5’修飾であるが、他の修飾もまた増強した免疫刺激を導く。)
3人の代表ドナーのヒトPBMCを、指示したODNとともに48時間インキュベートした(図6)。上清を収集し、IL−10を「材料および方法」に記載したようにELISAによって測定した。上記の実験で示したように、5’−TCGは明らかに最も強力な5’修飾である。それにもかかわらず、他の5’修飾もまた、ヒト細胞におけるポリT ODNの刺激能力を増強し得た。驚くべきことに、5’−TC単独で、サイトカインの分泌を増強し得た。他の5’トリヌクレオチド(例えば、ACG、CCG、およびGCG)もまた増強したIL−10分泌をもたらしたが、5’−TCGは最も強い効果を示した。さらに、5’−TTGが純粋なポリT ODNよりも刺激性が高いことが示された。さらに、配列の3’を5’−TCGへ特異的に修飾することは、免疫刺激を保持した。5’−TCG + ポリA ODN(図3)とは対照的に、ポリウラシルの状況における5’−TCG ODNは、IL−10分泌の増強を導く。

(実施例7)
5’−TCG修飾により、種々の細胞性効果によって示されるように、CpG ODNの刺激能力が高められる。

a.3人のそれぞれのドナーのヒトPBMCを、示したODNとともに48時間インキュベートし、上清を回収し、IL−10を材料および方法に記載したようにELISAによって測定した(図7A)。

b.3人のそれぞれのドナーのヒトPBMCを、示したODNとともに48時間インキュベートし、上清を回収し、IFN−αを材料および方法に記載したようにELISAによって測定した(図7B)。

c.3人のそれぞれのドナーのヒトPBMCを、示したODNとともに20時間インキュベートし、上清を回収し、IL−6を材料および方法に記載したようにELISAによって測定した(図7C)。

図7Aから7Cは、5’−TCGが種々のアッセイにおいてODNの刺激能力を高めることができることを示している。もとのCpG ODN(配列番号18)は5’末端には直接はCpGジヌクレオチドを有していない。5'−TCGでの配列の修飾(配列番号19)もまた、CpG ODNの活性を高めた。

(実施例8)
5’−TCGを有するODNによって誘導されるIL−10の分泌。

ヒトPBMCを漸増濃度の示したODNとともに48時間インキュベートした。上清を回収し、IL−10を材料および方法に記載したようにELISAによって測定した。3人の個々のドナーについての結果を示す。この実験は、1μMまでのODN濃度を用いた、5’−TCGトリヌクレオチドのチミジン3’の寄与を調べる用量応答研究であった。図8に示すように、1μMでは、サイトカインの分泌(IL−10)の低い刺激を、配列番号9(5’−TCGプラスポリA)を用いて観察することができた。

(実施例9)
5’−TCGと漸増数のチミジンを有しているODNによって誘導されるIL−10の分泌。

ヒトPBMCを示したODNとともに48時間インキュベートした。上清を回収し、IL−10を材料および方法に記載したようにELISAによって測定した。3人の個々のドナーについての結果を示す。ODNの3’末端へのチミジンの付加が、インビトロでサイトカインの生産を増加させるかどうかを調べるために、ODNを、アデノシンをチミジンに交換する数を増加させることによって修飾した。ポリAテールへのわずか1つのチミジンの付加は、配列番号41で観察できるように、免疫刺激の増大を導いた(図9)。さらにチミジンを付加することにより、チミジンの数に依存してIL−10の生産のさらなる増加が誘導された。ヌクレオチド配列のホスホロチオエートODN依存性によって免疫刺激を高めるためには、5’−TCGで十分である。それにもかかわらず、ピリミジンの数を増加させることによって、この刺激はさらに助長される。5’−TCGの3’側のわずかに2個から4個のチミジン(ここでは、少なくとも約20%がチミジンである)で、サイトカインの分泌の顕著な増加を導くには十分であった(配列番号42および配列番号43)。

(実施例10)
5’−TCGを有しているODNは、強力なTh1媒介性免疫応答を誘導することについて最も強力であり、効果的なODNである。

3人のそれぞれのドナーのヒトPBMCを、示したODN濃度で48時間インキュベートした(図10Aおよび10B)。上清を回収し、IL−10およびIFN−αを材料および方法に記載したようにELISAによって測定した。平均±標準偏差を示す。5’−TCGは試験した全てのODNのうち最も強力で効果的な免疫刺激を導いた(B細胞関連サイトカインIL−10に関して)。それにもかかわらず、種々の5’末端を有しているODNのTh1関連サイトカインIFN−αを誘導する能力を測定すると、5’−TCGによってのみこのサイトカインの強い分泌がサポートされていることが観察された(図10B)。

(実施例11)
免疫刺激ODN中のCpGジヌクレオチドの位置によってI型IFNの分泌の強さが決定される。

3人のそれぞれのドナーのヒトPBMCを、示したODN濃度で48時間インキュベートした。上清を回収し、IFN−αを材料および方法に記載したようにELISAによって測定した。平均を示す。CpGジヌクレオチド(十分な免疫刺激のためには不可欠である)の5’から3’末端への移動は、免疫刺激の段階的な消失を導いた(B細胞関連サイトカインIL−10の分泌に関して測定した)。図11は、CpGの位置もまた、I型IFNの分泌の強さに大きく影響することを示している。驚くべきことに、CpGをわずか1から3位3’末端方向へ移動させることにより、特にODN(配列番号27および配列番号28)を用いた場合に、大きく増加したIFN−αの分泌が導かれた。さらに3’末端へと移動させることにより、配列番号2(5’−TCG)のレベルを下回るIFN−αの大きな減少が導かれた。

(実施例12)
短い5’−TCG ODNによって誘導されるI型IFNの分泌。

3人のそれぞれのドナーのヒトPBMCを、示したODN濃度で48時間インキュベートした。上清を回収し、IFN−αを材料および方法に記載したようにELISAによって測定した。平均±標準偏差を示す。先の結果では、ODNの長さを短くした場合には免疫刺激の低下(IL−10の分泌として測定した)が示されている。それにもかかわらず、短いODN(例えば、5’−TCGを有している13マー(配列番号32))によるIFN−αの分泌を測定した場合には、驚くべきことに、17マー(配列番号2)と比較して大きく増加したIFN−αの分泌が観察された(図12)。

(実施例13)
本明細書中に記載した観察にしたがって新しく作成したCpG ODNのパネルによるインビトロでの免疫刺激。

先の実施例で記載した重要な観察は以下である:
a.5’TCGは、効率的であり強力なIFN−α(Th1関連サイトカイン)さらにはIL−10の分泌(B細胞関連サイトカイン)をサポートしている;
b.CpGジヌクレオチドを5’から3’末端へと移動させることにより最初に、I型IFNの分泌の増加が導かれ、さらに3’へと移動させることにより、減少が導かれた(B細胞の活性化は減少するのみであったか、またはCpGの移動によってごくわずかに変化した);
c.5’−TCGを有しているODNを短くすることにより、IFN−αを誘導する能力の大幅な増大が導かれた(他の効果、例えば、IL−10の分泌とは対照的である)。

これらの観察を組み合わせて、短いCpG ODNのパネルを作成し、これを、IFN−αの分泌を誘導するそれらの能力、さらにはB細胞を活性化する能力について試験した。3人のそれぞれのドナーのヒトPBMCを、示したODN濃度で48時間インキュベートした。上清を回収し、IL−10およびIFN−αを材料および方法に記載したようにELISAによって測定した。平均±標準偏差を示す。図13Aに示すように、20ヌクレオチド未満の長さを有するODNを作成した。これは、典型的な24マーのBクラスのODN(配列番号26)よりも効果的にIFN−αの分泌を誘導した。図13AのODN(配列番号36)(PS)と配列番号35(セミソフト)との違いによって、ベル型の曲線からより低いODN濃度(活性曲線の下方への湾曲を配列番号35を用いてより低いODN濃度で観察することができる)への移動が示された。さらに、配列番号38から配列番号40のような全てのCpGジヌクレオチドについての1ヌクレオチドの欠失は、サイトカインの分泌の減少を導き、このことによって、観察された効果がCpG依存性であることを確認した。図13B(および図14)は、このような短いODNがB細胞の活性化を誘導することが完全に可能であることを明らかにしている(CD19陽性B細胞についてのCD80のアップレギュレーションとして、さらにはB細胞によって生産されるサイトカインIL−10の分泌として測定した)。

(実施例14)
短いCpG ODNは効果的なB細胞の刺激を完全に誘導することができる。

3人のそれぞれのドナーのヒトPBMCを、示したODN濃度で24時間インキュベートし、細胞を回収し、CD19、CD14、およびCD80について染色した。CD19陽性B細胞上でのCD80の発現を、記載したようにフローサイトメトリーによって測定した。図14は、このような短いODNがB細胞の活性化を完全に誘導できることを示している(CD19陽性B細胞についてのCD80のアップレギュレーション、さらにはB細胞によって生産されるサイトカインIL−10の分泌として測定した)。

(実施例15)
5’CpGジヌクレオチドのCとGとの間のホスホジエステル結合は免疫刺激能力を高める。

3人のそれぞれのドナーのヒトPBMCを、示したODN濃度で48時間インキュベートした。上清を回収し、IL−10を上記のようにELISAによって測定した。5’−TCGを有するODN中のCpGジヌクレオチドの間へのホスホジエステル結合の導入(配列番号25)により、修飾されていない5’−TCGを有しているODN(配列番号2)と比較して、IL−10の分泌はより低いODN濃度へとシフトするように導かれた。データを図15に示す。同様の結果が、IFN−αの分泌についても得られた。

(実施例16)
5’−CGの前でのTの修飾が可能である。

3人のそれぞれのドナーのヒトPBMCを、示したODN濃度で48時間インキュベートした。上清を回収し、IL−10を上記のようにELISAによって測定した。図16に示す結果は以下のことを表している:
1.5’−UCGを有するODN(配列番号54)は、5’−TCGを有するODN(配列番号2)と同様の強いサイトカインの分泌を誘導した。いずれのODNも、純粋なポリT ODN(配列番号8)よりも優れていた。この結果は、CpGの5’側にある種々の化学的に修飾されたヌクレオチドが、免疫刺激の増大を誘導できることを示唆している。

2.5’−TCUを有するODN(配列番号55)または5’−TUGを有するODN(配列番号56)もまた、ポリT ODN(配列番号8)と比較した場合にサイトカインの分泌の増加を示した。それにもかかわらず、5’−TCGはこれらの2つの修飾よりも優れており、5’−TCUは5’−TUGよりも効果的にIL−10の分泌を誘導した。これらの結果は、CpGジヌクレオチドでの種々の化学的修飾により、免疫刺激の増大を誘導できることを示唆している。

上記の明細書は、当業者が本発明を実施できるために十分であると考えられる。本明細書中に示し、記載したものに加えて、本発明に対する種々の変更が、上記から当業者に明らかであるが、これらは添付の特許請求の範囲に含まれる。本発明の利点および目的は、本発明のそれぞれの実施形態に必ずしも含まれるとは限らない。

図1は、IL−10の誘導を通じてCpGではないODNまたはCpG ODNの免疫刺激活性に対する5’−TCGモチーフの影響を示す棒グラフである。 図2は、IFN−αの誘導を通じてCpGではないODNまたはCpG ODNの免疫刺激活性に対する5’−TCGモチーフの影響を示す棒グラフである。 図3は、ポリA配列およびポリT配列に対する5’TCGの影響を示す棒グラフである。 図4は、ODNの5’末端から3’末端へのCpGジヌクレオチドの移動の影響を示す棒グラフである。 図5は、5’−TCGに加えて、ODNの長さも、刺激活性に対して影響を与えることを示す棒グラフである。 図6は、5’−TCGに加えて、他の5’修飾の影響を示す棒グラフである。 図7は、種々の細胞性の作用によって示される、CpG ODNの刺激能力に対する5’−TCG修飾の影響を示す棒グラフである:7A(IL−10の誘導)。 図7は、種々の細胞性の作用によって示される、CpG ODNの刺激能力に対する5’−TCG修飾の影響を示す棒グラフである:7B(IFN−αの誘導)。 図7は、種々の細胞性の作用によって示される、CpG ODNの刺激能力に対する5’−TCG修飾の影響を示す棒グラフである:7C(IL−6の誘導)。 図8は、5’−TCGを有しているODNによって誘導されたIL−10の分泌を示す棒グラフのセットである。 図9は、5’−TCGと、漸増数のチミジンを有しているODNによって誘導されたIL−10の分泌を示す棒グラフのセットである。 図10は、強いTh−1媒介性免疫応答を誘導する最も強力であり効果的であるODNとして、5’−TCGを有しているODNを示す棒グラフのセットである:10A(IL−10の誘導)および10B(IFN−αの誘導)。 図11は、免疫刺激ODN中のCpGジヌクレオチドの位置によってI型IFNの分泌の強さがどのように決定されるかを示す棒グラフのセットである。 図12は、短い5’−TCG ODNによって誘導されたI型IFNの分泌を示す棒グラフのセットである。 図13は、本明細書中に記載された観察にしたがって新たに作成されたCpG ODNのパネルによるインビトロでの免疫刺激を示す棒グラフのセットである:13A(IL−10の誘導)。 図13は、本明細書中に記載された観察にしたがって新たに作成されたCpG ODNのパネルによるインビトロでの免疫刺激を示す棒グラフのセットである:13B(IFN−αの誘導)。 図14は、短いCpG ODNによるB細胞の刺激を示す棒グラフのセットである。 図15は、CpG ODNのパネルによるIL−10の誘導を示す棒グラフであり、これは、CとGの間にホスホジエステル結合を有しているいくつかのODNが高い効力を有していることを示している。 図16は、CpG ODNのパネルによるIL−10の誘導を示す棒グラフであり、これは、修飾された5’TCGを有しているいくつかのODNによってIL−10が誘導されたことを示している。

【配列表】

Claims (89)

  1. 以下:
    5’TCGX3’
    を含むオリゴヌクレオチドであって、
    式中、Xは任意のヌクレオチドであり、XはXがCまたはAである場合にはA、T、またはCであり、XはXがTである場合にはAまたはGであり、XはXがGである場合には任意のヌクレオチドであり、Nは2〜95ヌクレオチドであり、5’はオリゴヌクレオチドの5’末端を示し、3’はオリゴヌクレオチドの3’末端を示し、そしてNはメチル化されていないCGモチーフは含まない、オリゴヌクレオチド。
  2. 以下:
    5’TCGTN3’
    を含むオリゴヌクレオチドであって、
    式中、Nは3〜96ヌクレオチドであり、5’はオリゴヌクレオチドの5’末端を示し、3’はオリゴヌクレオチドの3’末端を示し、Nはメチル化されていないCGモチーフは含まず、Nが16ヌクレオチドである場合にはNはC12は含まず、Nが8ヌクレオチドである場合にはNは少なくとも50%がCまたは70%がTである、オリゴヌクレオチド。
  3. 以下:
    5’TCGAN3’
    を含むオリゴヌクレオチドであって、
    式中、Nは3〜96ヌクレオチドであり、5’はオリゴヌクレオチドの5’末端を示し、3’はオリゴヌクレオチドの3’末端を示し、Nはメチル化されていないCGモチーフは含まず、Nが19ヌクレオチドである場合にはNは少なくとも55%がピリミジンであり、Nが8ヌクレオチドである場合にはNは少なくとも50%がTまたはCである、オリゴヌクレオチド。
  4. 以下:
    5’TCGN3’
    を含むオリゴヌクレオチドであって、
    式中、Nは10〜96ヌクレオチドであり、5’はオリゴヌクレオチドの5’末端を示し、3’はオリゴヌクレオチドの3’末端を示し、オリゴヌクレオチドのC含量は60%以下、A含量は30%以下であり、Nはメチル化されていないCGモチーフは含まない、オリゴヌクレオチド。
  5. 以下:
    5’TYZN3’
    を含むオリゴヌクレオチドであって、
    式中、Yはシトシンまたは修飾されたシトシンであり、Zはグアニンまたは修飾されたグアニンであり、Nは4〜97ヌクレオチドであり、5’はオリゴヌクレオチドの5’末端を示し、3’はオリゴヌクレオチドの3’末端を示し、オリゴヌクレオチドはメチル化されていないCGモチーフは含まない、オリゴヌクレオチド。
  6. オリゴヌクレオチドが少なくとも1つの修飾されたヌクレオチド間結合を含む、請求項1〜5のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチド。
  7. オリゴヌクレオチドが少なくとも50%の修飾されたヌクレオチド間結合を含む、請求項1〜5のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチド。
  8. オリゴヌクレオチドの全てのヌクレオチド間結合が修飾されている、請求項1〜5のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチド。
  9. オリゴヌクレオチドが20〜100ヌクレオチドの長さである、請求項1〜5のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチド。
  10. 安定化されたヌクレオチド間結合がホスホロチオエート結合である、請求項6に記載のオリゴヌクレオチド。
  11. 以下の構造:5’TT3’(配列番号50)を有する請求項3または4のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチドであって、式中、はホスホロチオエート結合を示す、オリゴヌクレオチド。
  12. 以下の構造:5’TT3’(配列番号2)を有する請求項2または4のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチドであって、式中、はホスホロチオエート結合を示す、オリゴヌクレオチド。
  13. がNであり、Nが8〜94ヌクレオチドであり、Nが2〜5個のピリミジンである、請求項1〜5のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチド。
  14. がTTTTTである、請求項13に記載のオリゴヌクレオチド。
  15. がTTである、請求項13に記載のオリゴヌクレオチド。
  16. が8〜40ヌクレオチドである、請求項13に記載のオリゴヌクレオチド。
  17. は少なくとも50%がピリミジンである、請求項1〜5のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチド。
  18. は少なくとも80%がピリミジンである、請求項1〜5のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチド。
  19. はポリA配列およびポリG配列を含まない、請求項1〜5のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチド。
  20. がTNであり、Nが8〜94ヌクレオチドである、請求項1〜5のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチド。
  21. Yが、5−メチルシトシン、5−メチル−イソシトシン、5−ヒドロキシ−シトシン、5−ハロゲノシトシン、ウラシル、N4−エチル−シトシン、5−フルオロ−ウラシル、および水素からなる修飾されたシトシン塩基の群より選択される、請求項1〜5のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチド。
  22. Zが、7−デアザグアニン、7−デアザ−7−置換グアニン(例えば、7−デアザ−7−(C2−C6)アルキニルグアニン)、7−デアザ−8−置換グアニン、ヒポキサンチン、2,6−ジアミノプリン、2−アミノプリン、プリン、8−ヒドロキシグアニンのような8−置換グアニン、6−チオグアニン、2−アミノプリン、および水素からなる修飾されたグアニン塩基の群より選択される、請求項1〜5のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチド。
  23. オリゴヌクレオチドが1つまたは2つの利用可能な5’末端を有している3’−3’結合を有する、請求項1〜5のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチド。
  24. オリゴヌクレオチドが2つの利用可能な5’末端を有しており、そのそれぞれが5’TCGである、請求項23に記載のオリゴヌクレオチド。
  25. アレルギーまたは喘息を処置する方法であって、以下の工程:
    アレルギーまたは喘息を処置するために有効な量の請求項1〜5のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチドを、アレルギーもしくは喘息を有しているか、またはアレルギーもしくは喘息を有するリスクのある被験体に投与する工程、
    を包含する、方法。
  26. オリゴヌクレオチドが呼吸器系組織に投与される、請求項25に記載の方法。
  27. 被験体がアレルギー性喘息を有しているか、またはアレルギー性喘息を発症するリスクがある、請求項25に記載の方法。
  28. サイトカインの生産を誘導する方法であって、以下の工程:
    IP10、IL6、IL12、IL18、TNF、ケモカイン、IFN−α、およびIFN−γからなる群より選択されるサイトカインを誘導するために有効な量の請求項1〜5のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチドを、被検体に投与する工程、
    を包含する、方法。
  29. 感染性疾患を処置する方法であって、以下の工程:
    感染性疾患を処置するために有効な量の請求項1〜5のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチドを、感染性疾患を有しているか、または感染性疾患を有するリスクのある被験体に対して投与する工程、
    を包含する、方法。
  30. 被験体が細菌感染を有しているか、または細菌感染を有するリスクがある、請求項29に記載の方法。
  31. 被験体がウイルス感染を有しているか、またはウイルス感染を有するリスクがある、請求項29に記載の方法。
  32. ガンを処置する方法であって、以下の工程:
    ガンを処置するために有効な量の請求項1〜5のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチドを、ガンを有しているか、またはガンを有するリスクがある被験体に投与する工程、
    を包含する、方法。
  33. ガンが、胆管ガン、乳ガン、子宮頸ガン、絨毛ガン、結腸ガン、子宮内膜ガン、胃ガン、上皮内ガン、リンパ腫、肝臓ガン、肺ガン(例えば、小細胞肺ガン、および非小細胞肺ガン)、黒色腫、神経芽細胞腫、卵巣ガン、膵臓ガン、前立腺ガン、直腸ガン、肉腫、甲状腺ガン、腎臓ガン、骨のガン、脳および中枢神経のガン、結合組織のガン、食道ガン、眼のガン、ホジキンリンパ腫、喉頭ガン、口腔ガン、皮膚ガン、および睾丸ガン、ならびに他のガン腫および肉腫からなる群より選択される、請求項32に記載の方法。
  34. 抗ガン剤を投与する工程を包含する、請求項32に記載の方法。
  35. 被験体の先天性免疫を誘導する方法であって:
    先天性免疫を誘導するために有効な量の請求項1〜5のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチドを被験体に投与する工程、
    を包含する、方法。
  36. Th1免疫応答を誘導する方法であって:
    Th1免疫応答を誘導するために有効な量の請求項1〜5のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチドを被験体に投与する工程、
    を包含する、方法。
  37. 被験体の免疫応答を調節する方法であって、該方法は、免疫応答を調節するために有効な量の以下:
    5’−XYRM−3’
    を含むオリゴヌクレオチドを被験体に投与する工程を包含し、
    式中、5’はオリゴヌクレオチドの5’末端を示し、3’はオリゴヌクレオチドの3’末端を示し、
    はヌクレオチドであり、
    Yはシトシンまたは修飾されたシトシンであり、
    Rはグアニンまたは修飾されたグアニンであり、
    そしてMは1〜3ヌクレオチドの核酸である、方法。
  38. オリゴヌクレオチドのヌクレオチド間結合が安定化されたホスホロチオエートヌクレオチド間結合である、請求項37に記載の方法。
  39. YとRとの間のヌクレオチド間結合がRp立体配置のホスホジエステル結合である、請求項38に記載の方法。
  40. 修飾されたシトシンがC5置換を有している、請求項37に記載の方法。
  41. 修飾されたグアニンがC8またはC7置換を有している、請求項37に記載の方法。
  42. 修飾されたシトシンまたは修飾されたグアニンが、5−置換シトシン(例えば、5−メチル−シトシン、5−フルオロ−シトシン、5−クロロ−シトシン、5−ブロモ−シトシン、5−ヨード−シトシン、5−ヒドロキシ−シトシン、5−ヒドロキシメチル−シトシン、5−ジフルオロメチル−シトシン、および未置換もしくは置換された5−アルキニル−シトシン)、6−置換シトシン、N4−置換シトシン(例えば、N4−エチル−シトシン)、5−アザ−シトシン、2−メルカプト−シトシン、イソシトシン、シュード−イソシトシン、縮合環システムを有しているシトシン類似体(例えば、N,N’−プロピレンシトシンまたはフェノキサジン)、ならびにウラシルおよびその誘導体(例えば、5−フルオロ−ウラシル、5−ブロモ−ウラシル、5−ブロモビニル−ウラシル、4−チオ−ウラシル、5−ヒドロキシ−ウラシル、5−プロピニル−ウラシル)、チミン誘導体(例えば、2−チオチミン、4−チオチミン、6−置換チミン)、7−デアザグアニン、7−デアザ−7−置換グアニン(例えば、7−デアザ−7−(C2−C6)アルキニルグアニン)、7−デアザ−8−置換グアニン、7−デアザ−8−アザ−グアニン、ヒポキサンチン、N2−置換グアニン(例えば、N2−メチル−グアニン)、5−アミノ−3−メチル−3H,6H−チアゾロ[4,5−d]ピリミジン−2,7−ジオン、2,6−ジアミノプリン、2−アミノプリン、プリン、インドール、アデニン、置換されたアデニン(例えば、N6−メチル−アデニン、8−オキソ−アデニン)、8−置換グアニン(例えば、8−ヒドロキシグアニン、および8−ブロモグアニン)、および6−チオグアニンからなる群より選択される、請求項37に記載の方法であって、本発明の別の実施形態では、塩基は、一般的な塩基(例えば、4−メチル−インドール、5−ニトロ−インドール、3−ニトロピロール、P塩基、およびK塩基)、芳香環システム(例えば、ベンズイミダゾール、またはジクロロ−ベンズイミダゾール、1−メチル−1H−[1,2,4]トリアゾール−3−カルボン酸アミド)、芳香環システム(例えば、フルオロベンゼン、またはジフルオロベンゼン)、および水素原子(dSpacer)によって置換される、方法。
  43. オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの3’末端に連結された担体と結合させられている、請求項37に記載の方法。
  44. 担体が、微粒子、デンドリマー、コレステロール、リポソーム、カチオン錯体、および抗原からなる群より選択される、請求項43に記載の方法。
  45. 抗原を被験体に投与する工程をさらに含む、請求項37に記載の方法。
  46. 被験体に治療プロトコールを投与する工程をさらに含む、請求項37に記載の方法。
  47. 治療プロトコールが外科手術である、請求項46に記載の方法。
  48. オリゴヌクレオチドが担体とは結合させられていない、請求項37に記載の方法。
  49. オリゴヌクレオチドが多量体化された複合体である、請求項37に記載の方法。
  50. 多量体化された複合体が第2のオリゴヌクレオチドに対する多量体化単位によって連結されたオリゴヌクレオチドを含む、請求項49に記載の方法。
  51. 第2のオリゴヌクレオチドが式5’−XYRM−3’を有している、請求項49に記載の方法。
  52. 以下:
    5’−XYRM−3’を含むオリゴヌクレオチドであって、
    式中、Xは、モノヌクレオチド、またはCGジヌクレオチドを含まないジヌクレオチドもしくはトリヌクレオチドから構成されている核酸であり、Yはシトシンまたは修飾されたシトシンであり、Rはグアニンまたは修飾されたグアニンであり、Mは0〜27ヌクレオチドの核酸である、オリゴヌクレオチド;および
    オリゴヌクレオチドの3’末端に連結された多量体化単位の多量体化された複合体を含む、組成物。
  53. 多量体化単位が、微粒子、デンドリマー、リポソーム、カチオン錯体、コレステロール、および抗原からなる群より選択される担体である、請求項52に記載の組成物。
  54. オリゴヌクレオチドが、5’TCG3’、5’TCGT3’、5’UCG3’、または5’UCGT3’である、請求項52に記載の組成物。
  55. が1ヌクレオチドである、請求項52に記載の組成物。
  56. がピリミジンである、請求項52に記載の組成物。
  57. オリゴヌクレオチドがホスホジエステルヌクレオチド間結合を有している、請求項52に記載の組成物。
  58. がCGジヌクレオチドを含まない、請求項52に記載の組成物。
  59. 抗原を被験体に投与することをさらに含む、請求項52に記載の組成物。
  60. 治療プロトコールを被験体に投与することをさらに含む、請求項52に記載の組成物。
  61. 治療プロトコールが外科手術である、請求項60に記載の組成物。
  62. 多量体化単位がオリゴヌクレオチドの3’末端と第2のオリゴヌクレオチドとの間のリンカーである、請求項52に記載の組成物。
  63. 以下:
    5’−XCGM−3’
    を含むオリゴヌクレオチドであって、
    式中、5’はオリゴヌクレオチドの5’末端を示し、3’はオリゴヌクレオチドの3’末端を示し、XはCGジヌクレオチドを含まない1ヌクレオチドであり、MはCGジヌクレオチドを含まない3〜27ヌクレオチドの核酸であり、Mは以下の特性の少なくとも1つを有する:TCジヌクレオチドを含まない、少なくとも30%がTヌクレオチドである、A、T、およびGから構成される、または少なくとも1つの修飾されたヌクレオチド間結合を有しているCCTTCCヘキサマーを含まない、オリゴヌクレオチド。
  64. 以下:
    5’−XCGM−3’
    を含むオリゴヌクレオチドであって、
    式中、5’はオリゴヌクレオチドの5’末端を示し、3’はオリゴヌクレオチドの3’末端を示し、XはCGジヌクレオチドを含まないジヌクレオチドであり、MはCGジヌクレオチドを含まない2〜26ヌクレオチドの核酸であり、Mは以下の特性の少なくとも1つを有する:TGまたはGTジヌクレオチドを含まない、少なくとも38%がTヌクレオチドである、またはAおよびTから構成される、オリゴヌクレオチド。
  65. 以下:
    5’−XCGM−3’
    を含むオリゴヌクレオチドであって、
    式中、5’はオリゴヌクレオチドの5’末端を示し、3’はオリゴヌクレオチドの3’末端を示し、XはCGジヌクレオチドを含まないトリヌクレオチドであり、MはCGジヌクレオチドを含まない1〜25ヌクレオチドの核酸であり、かつMは以下の特性の少なくとも1つを有する:CTジヌクレオチドを含まず、少なくとも1つのホスホロチオエート結合を含まない、少なくとも41%がTヌクレオチドである、またはAおよびCから構成される、オリゴヌクレオチド。
  66. CヌクレオチドとGヌクレオチドとの間のヌクレオチド間結合がホスホジエステル結合である、請求項65に記載のオリゴヌクレオチド。
  67. オリゴヌクレオチドが少なくとも2つの修飾されたヌクレオチド間結合を含む、請求項65に記載のオリゴヌクレオチド。
  68. 以下:
    5’−TTGM−3’
    を含むオリゴヌクレオチドであって、
    式中、5’はオリゴヌクレオチドの5’末端を示し、3’はオリゴヌクレオチドの3’末端を示し、Mは5〜21ヌクレオチドからなる核酸であり、MはCGジヌクレオチドを含まず、Mは、少なくとも30%がTヌクレオチドから構成され、前記ヌクレオチドは10〜24ヌクレオチドの長さである、オリゴヌクレオチド。
  69. 以下:
    5’−XCGM−3’
    を含むオリゴヌクレオチドであって、
    式中、5’はオリゴヌクレオチドの5’末端を示し、3’はオリゴヌクレオチドの3’末端を示し、Xは1〜3ヌクレオチドでありかつCGジヌクレオチドを含まず、Mは6〜27ヌクレオチドの核酸であり、少なくとも3個のCGジヌクレオチドを含みかつ少なくとも50%がTヌクレオチドである、オリゴヌクレオチド。
  70. が少なくとも4個のCGジヌクレオチドを含む、請求項69に記載のオリゴヌクレオチド。
  71. 少なくとも1つのCGジヌクレオチドがホスホジエステルヌクレオチド間結合を含む、請求項69に記載のオリゴヌクレオチド。
  72. 少なくとも3個のCGジヌクレオチドがホスホジエステルヌクレオチド間結合を含む、請求項69に記載のオリゴヌクレオチド。
  73. が16〜18ヌクレオチドの長さである、請求項69に記載のオリゴヌクレオチド。
  74. オリゴヌクレオチドが配列番号33、34、35、36、および37からなる群より選択される、請求項69に記載のオリゴヌクレオチド。
  75. 以下:
    5’−’TTGM−3’
    を含むオリゴヌクレオチドであって、
    式中、5’はオリゴヌクレオチドの5’末端を示し、3’はオリゴヌクレオチドの3’末端を示し、Mは6〜18ヌクレオチドの核酸でありかつ少なくとも1つのCGジヌクレオチドを含みかつ少なくとも50%がTヌクレオチドである、オリゴヌクレオチド。
  76. が14ヌクレオチドの長さである、請求項75に記載のオリゴヌクレオチド。
  77. オリゴヌクレオチドが配列番号38、39、および40からなる群より選択される、請求項75に記載のオリゴヌクレオチド。
  78. 免疫応答を誘導する方法であって、以下の工程:
    免疫応答を誘導するために有効な量の請求項63から77のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチド、または請求項52に記載の組成物を被験体に投与する工程、
    を包含する、方法。
  79. オリゴヌクレオチドが、I型およびII型のIFNからなる群より選択されるサイトカインを誘導するために有効な量で被験体に投与される、請求項78に記載の方法。
  80. オリゴヌクレオチドが、感染性疾患を処置するために有効な量で被験体に投与される、請求項78に記載の方法。
  81. 被験体が細菌感染を有しているか、または細菌感染を有するリスクがある、請求項78に記載の方法。
  82. 被験体がウイルス感染を有しているか、またはウイルス感染を有するリスクがある、請求項78に記載の方法。
  83. オリゴヌクレオチドがガンを処置するために有効な量で被験体に投与される、請求項78に記載の方法。
  84. ガンが、胆管ガン、乳ガン、子宮頸ガン、絨毛ガン、結腸ガン、子宮内膜ガン、胃ガン、上皮内ガン、リンパ腫、肝臓ガン、肺ガン(例えば、小細胞肺ガン、および非小細胞肺ガン)、黒色腫、神経芽細胞腫、卵巣ガン、膵臓ガン、前立腺ガン、直腸ガン、肉腫、甲状腺ガン、腎臓ガン、骨のガン、脳および中枢神経のガン、結合組織のガン、食道ガン、眼のガン、ホジキンリンパ腫、喉頭ガン、口腔ガン、皮膚ガン、および睾丸ガン、ならびに他のガン腫および肉腫からなる群より選択される、請求項78に記載の方法。
  85. 抗ガン剤を投与する工程をさらに含む、請求項78に記載の方法。
  86. オリゴヌクレオチドが先天性免疫を誘導するために有効な量で被験体に投与される、請求項78に記載の方法。
  87. オリゴヌクレオチドがTh1免疫応答を誘導するために有効な量で被験体に投与される、請求項78に記載の方法。
  88. オリゴヌクレオチドがアレルギーを処置するために有効な量で被験体に投与される、請求項78に記載の方法。
  89. オリゴヌクレオチドが喘息を処置するために有効な量で被験体に投与される、請求項78に記載の方法。
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