KR20050048539A - ＣｐＧ 제제 및 관련된 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 수 중 유 에멀션과 같은 다른 치료학적 제제와 조합된 면역 자극성 핵산에 관한 방법 및 조성물을 제공한다. 치료제의 조합이 질병 및 암과 같은 질환의 치료를 위하여 다양한 투여량 또는 다양한 시간 스케줄로 투여된다.

Description

ＣｐＧ 제제 및 관련된 방법{ＣｐＧ formulations and related methods}

본 발명은 다른 치료학적 제제와 조합된 면역 자극성 핵산의 용도에 관한 것이다.

미국에 있어서 감염성 질환으로 인한 사망률은 1980과 1992년 사이에 58 % 증가하였다. 이 기간 동안 감염성 질환을 퇴치하기 위한 항 감염성 치료법의 이용이 현저하게 성장하였으며, 현재 년 수십억 달러 산업이다. 항 감염성 제제 사용에 있어서의 이러한 증가에도 불구하고, 감염성 질환의 치료와 예방은 전세계적으로 의학계의 도전 대상으로 남아 있다. 일반적으로, 3 종류의 항 감염성 제제 즉, 항 박테리아제, 항 바이러스제 및 항 진균제가 있으며, 제제의 이들 분류 내에서도 치료하는데 효과가 있는 미생물의 형태에 관점에서 일부 중복이 있다.

항 감염성 치료제와 관련된 문제들 중의 하는 항 감염제로 치료되는 숙주에서 일어나는 부작용이다. 예를 들면, 많은 항 감염제가 광범위 미생물을 죽이거나 억제할 수 있으며, 특정한 형태의 종에 특이적이지 않다. 이러한 형태의 항 감염제로 치료하는 경우, 감염성 미생물 뿐만 아니라 숙주 내의 정상 미생물 군집의 사멸을 초래한다. 상기 미생물 군집의 손실은 상기 미생물 군집이 감염성 병원체와 경쟁하고 장벽으로서 기능하기 때문에, 질환 복합증을 초래할 수 있고, 다른 병원체에 의하여 숙주가 감염되기 쉽도록 할 수 있다. 다른 부작용이 숙주의 세포 또는 조직에 대한 이들 화학물질의 특이적 또는 비특이적 작용의 결과로서 초래될 수 있다.

항 감염제에 더하여, 백신은 감염성 질환을 예방하고 치료하기 위하여 사용된다. 백신은 보조제 (adjuvant)와 조합된 항원을 포함한다. 보조제는 감염성 질환의 치료와 예방에 대한 백신의 효능에 중요한 역할을 한다. 면역 반응의 강도와 속도 (kinetics)를 증가시키는 것 외에, 보조제는 또한 생성되는 면역 반응의 형태를 결정하는 역할을 한다. 알루미늄 히드록사이드와 알루미늄 포스페이트를 포함한, 알루미늄 화합물이 인간 백신에 널리 사용되고 있다. 이들 보조제는 IL-4 및 IL-5와 같은 Th2 형태의 사이토카인을 분비하고 IgG1 및 IgE 형태 항체를 생성하나, 세포독성 T 림프구 (CTL) 반응은 약하거나 없는 것이 특징인 (Bomford, R. 1998. Will adjuvants be needed for vaccines of the future ? Dev.Biol.Stand. 92:13-17; Brazolot Millan, C.L., et al. 1998. CpG DNA can induce strong Thl humoral and cell-mediated immune responses against hepatitis B surface antigen in young mice. Proc.Natl.Acad. Sci. USA 95: 15553-15558; Davis, H.L., et al. 1998. CpG DNA is a potent enhancer of specific immunity in mice immunized with recombinant hepatitis B surface antigen. J. Immunol. 160: 870-876), T-헬퍼 2 형태 (Th2) 반응 쪽으로 상기 면역 반응을 치우치게 한다. 적절한 형태의 면역 반응의 생성이 성공적인 면역화에 있어서 필수적이다. Thl 형태 면역 반응과 연관된 강한 선천성 (innate) 면역은 세포내 병원체의 제어에 필수적인 것으로 여겨지고 있는 반면, Th1 및 Th2 형태 면역 반응 모두가 발견될 수 있는, 강한 체액성 면역은 세포 외 병원체의 제어에 필수적인 것처럼 보인다 (Constant, S.L. and K. Bottomly. 1997. Induction of Thl and Th2 CD4+ T cell responses : the alternative approaches. Ann.Rev.Immunol. 15: 297-322). 메틸화되지 않은 CpG 디뉴클레오티드 (CpG ODN)를 포함하는 합성 올리고뉴클레오티드는 IFN-γ, TNF-a 및 IL-12 사이토카인을 분비하고 IgG2a 이소타입 항체와 같은 항체를 옵소닌화하고, 강한 CTL을 유도하는 Th1 형태 면역 반응을 촉진하는 것으로 알려진 신규한 보조제이다 (Chu, R.S., et al. 1997. CpG oligodeoxynucleotides act as adjuvants that switch on T helper 1 (Th1) immunity. J.Exp.Med. 186 : 1623-1631; Klinman, D.M et al. 1999. CpG motifs as immune adjuvants. Vaccine 17: 19-25).

알파 헤르페스비리네 (alpha herpesvirinae) 수퍼 패밀리의 일원인, 소 헤르페스바이러스-1 (BHV-1)은, 비기관염, 음문질염, 유산, 결막염, 뇌염 및 전신 감염을 포함한 다양한 임상적 질병 증상과 연관되어 있다 (Gibbs, E.P.J and M.M. Rweyemainu. 1977. Bovine herpesvirus-1, p.317. Anonymous Bovine herpesvirus. Vet. Bull, London ; Yates, W.D. G. 1982. A review of infectious bovine rhinotracheitis, shipping fever pneumonia and viral-bacterial synergism in respiratory disease of cattle. Can.J.Comp.Med. 46:225-263). 소 호흡기 질환은 북아메리카에서 매년 최대 10 억 달러까지의 축우 산업 손실을 초래하였다 (Yates, W.D.G. 1982. A review of infectious bovine rhinotracheitis, shipping fever pneumonia and viral-bacterial synergism in respiratory disease of cattle. Can.J.Comp.Med. 46:225-263). 이들 손실은 생 약독화 및 사백신이 이용가능함에도 불구하고 발생하고 있다. 현재, BHV-1에 대한 조합된 효능, 안전성, 항원 특이성 및 보호에 대한 가장 큰 잠재력은 하나 이상의 바이러스 당단백질, gB, gC 및 gD 및 보조제로 구성되는 서브 유니트 백신에 있다. 그러나, VSA3와 같은 통상적인 보조제는 Th2-유사 면역 반응을 생성시킬 뿐만 아니라, 대사되지 않고 주사 부위 반응을 일으킨다. 그러한 반응은 인간 또는 수의용 백신용으로는 허용되지 않는다.

도 1은 일차 면역화 후 14, 47 및 64일에 백신접종된 동물과 대조군 동물의 혈청에서의 BHV-1 중화 항체 반응을 나타내는 막대 그래프이다 (Imm 1 (14 일); 일차 면역접종 후 14일, Imm 2 (47 일); 2차 접종후 8 일, 챌린지 후 (64 일); 바이러스 챌린지 후 11 일). 항체가는 BHV-1의 100 PFU를 사용하여 50 % 종말점으로서 나타내었다. 오차 막대는 7 개 동물에 대한 결과의 기하 평균의 표준 오차를 나타낸다.

도 2는 백신접종 후 세포성 면역 반응을 나타내는 3 개의 막대 그래프이다. 데이터는 평균 ± 평균의 표준 오차로 나타내었다. (a) 챌린지 전과 후에 PBMC의 항원 특이적 증식. 자극된 지수 (stimulated index)는 항원 존재하에서의 갯수/min 값을 항원 부재하에서의 개수/min 값으로 나눈 값을 나타낸다. (b) 항원-자극된 웰에서 스팟의 개수/10⁶ 세포 및 자극되지 않은 웰에서 스팟의 개수/10⁶ 세포에 있어서의 차이. (c) BHV-1 gD 에 대한 반응 24 시간 후에 PBMC에 의하여 분비되는 IFN-γ의 양.

도 3은 2차 면역화 후 8일 (Imm 2) 및 바이러스 감염 11일 (챌린지 후)에 BHV-1 당단백질에 대한 혈청 항체를 나타내는 2개의 막대 그래프이다. (a) tgD에 대한 항체 (b) tgB에 대한 항체.

도 4는 BHV-1으로 챌린지된 동물에서 면역화가 직장 온도에 미치는 영향을 나타내는 2개의 그래프이다. a. 평균 온도 반응 b. 열 있는 날 (fever day)의 수; 온도가 ≥40 ℃인 날의 총 수.

도 5는 BHV-1으로 챌린지된 동물에서 면역화가 체중에 미치는 영향을 나타내는 2개의 그래프이다. (a) 축적된 체중 변화. (b) 체중 손실이 5 kg 미만 보다 큰 동물 일수의 수.

도 6은 -1 챌린지 후에 바이러스 증식의 정도를 나타내는 그래프이다. 챌린지 당일 및 그 후 격일마다, 바이러스 역가를 면역화된 동물의 코 분비물로 결정하였다. 오차 막대는 7개 동물에 대한 데이터의 기하 평균의 표준 오차를 나타낸다.

본 발명은 특정한 제제와 조합된 면역 자극성 핵산을 사용하여 개체를 치료하기 위한 개선된 방법 및 산물을 제공한다. 본 발명은 일부 형태의 면역 자극성 핵산 분자가 특정한 제제와 조합되어 사용되는 경우, 일부 예기치 않은 개선된 결과가 관찰된다는 발견에 부분적으로 근거하는 것이다. 예를 들면, 일부 면역 자극성 핵산 및 제제의 조합의 효능은 상기 면역 자극성 핵산을 단독으로 사용하는 경우에 비하여 현저하게 개선된다. 상기 면역 자극성 핵산과 상기 제제는 다른 기작을 통하여 작용하고 상승적 방식으로 다른 성분의 효능을 개선하는 것으로 반드시 예상되는 것은 아니기 때문에, 상기 결과는 부분적으로 놀라운 것이다.

본 발명의 일 양상은 바이러스로 감염되거나 바이러스 감염의 위험이 있는 인간이 아닌 동물에 바이러스 방출 (shedding)을 감소시키기에 효과적인 양의 면역자극성 핵산 및 수 중 유 에멀션을 투여하는 단계를 포함하는, 인간이 아닌 동물에서 바이러스 방출을 감소시키는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 일 구체예에서, 상기 수 중 유 에멀션은 EMULSIGEN^TM이다. 선택적으로 상기 인간이 아닌 동물은 개, 고양이, 말, 소, 돼지, 양, 염소, 영장류 또는 닭이다.

활성제의 조합은 항원 또는 항바이러스제와 함께 또는 없이 투여될 수 있다. 일부 구체예에서, 상기 항바이러스제는 아세마난; 아씨클로비르; 아씨클로비르 소듐; 아데포비르; 알로부딘; 알비르셉트 수도톡스; 아만타딘 염산; 아라노틴; 아릴돈; 아테비르딘 메실레이트; 아브리딘; 씨도포비르; 씨팜필린; 씨타라빈 염산; 델라비르딘 메실레이트; 데시클로비르; 디다노신; 디스옥사릴; 에독수딘; 엔비라덴; 엔비르옥심; 팜씨클로비르; 파모틴 염산; 피아씨타빈; 피알우리딘; 포사릴레이트; 포스카르네트 소듐; 포스포네트 소듐; 간시클로비르; 간시클로비르 소듐; 이독수리딘; 케톡살; 라미부딘; 로부카비르; 메모틴 염산; 메티사존; 네비라핀; 펜시클로비르; 피로다비르; 리바비린; 리만타딘 염산; 사퀴나비르 메실레이트; 소만타딘 염산; 소리부딘; 스타톨론; 스타부딘; 틸로론 염산; 트리플루리딘; 발라시클로비르 염산; 비다라빈; 비다라빈 포스페이트; 비다라빈 소듐 포스페이트; 비록심; 잘씨타빈; 지도부딘; 및 진비록심으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것이다.

본 발명의 다른 양상은, 항원보강된 (adjuvanted) 백신으로부터 야기되는 조직 손상을 감소시키기에 효과적인 양의 항원보강된 백신 및 면역자극성 핵산을 침습성 경로에 의하여 개체에 투여하는 단계를 포함하고, 상기 백신은 수 중 유 에멀션으로 항원보강된 것임을 특징으로 하는, 개체의 백신 접종으로 인한 조직 손상을 감소시키는 방법이다. 일 구체예에서, 상기 수 중 유 에멀션은 EMULSIGEN^TM이다. 상기 침습성 경로는 피부와 같은, 조직 장벽 (barrier)에 구멍을 만드는 임의의 형태의 경로일 수 있다. 일부 구체예에서, 상기 침습성 경로는 피하 또는 근육 내이다.

다른 양상에 따르면, 본 발명은 면역 반응을 생성하기에 효과적인 양의 수 중 유 에멀션 및 CpG 올리고뉴클레오티드를 개체에 투여함으로써, 면역 반응을 유도하는 방법이다. 선택적으로 상기 면역 반응은 항원 특이적 면역 반응이고, 상기 개체에는 항원이 투여된다. 일 구체예에서, 상기 수 중 유 에멀션은 EMULSIGEN^TM이다.

또다른 양상에 따르면, 본 발명은 서브 치료적 투여량의 항원과 면역자극성 핵산을 개체에 투여하는 단계를 포함하고, 상기 서브 치료적 투여량의 항원과 면역자극성 핵산의 조합은 항원 특이적 면역 반응을 생성하는 것을 특징으로 하는, 항원 특이적 면역 반응을 생성시키기 위하여 개체에 투여되는 항원의 투여량을 감소시키는 방법에 관한 것이다. 일부 구체예에서, 상기 항원의 서브 치료적 투여량은 상기 항원이 알럼과 제제화되는 경우 항원 특이적 면역 반응을 생성하기에 최소 효과적인 투여량의 항원 보다 50 % 미만인 용량이다. 또한, 상기 항원의 서브 치료적 투여량은 상기 항원이 알럼과 제제화되는 경우 항원 특이적 면역 반응을 생성하기에 최소 효과적인 투여량의 항원 보다 90 % 미만인 용량일 수 있다.

본 발명의 방법은 면역 자극성 핵산의 사용과 관련된다. 상기 면역 자극성 핵산은 CpG 올리고뉴클레오티드일 수 있고, 일부 구체예에서는 2007 (TCGTCGTTGTCGTTTTGTCGTT); 2142 (TCGCGTGCGTTTTGTCGTTTTGACGTT); 2135 (TCGTCGTTTGTCGTTTTGTCGTT); 및/또는 2216 (ggGGGACGATCGTCgggggG)이다. 또한, 상기 면역 자극성 핵산은 서열번호 52-57 및/또는 서열번호 62-94의 올리고뉴클레오티드와 같은 T-부유 핵산, 또는 서열번호 46, 서열번호 47, 서열번호 58, 서열번호 61, 및/또는 서열번호 95-133의 올리고뉴클레오티드와 같은 폴리-G 핵산일 수 있다. 다른 구체예에서, 상기 면역 자극성 핵산은 서열번호 1 내지 서열번호 146으로 구성되는 군으로부터 선택되는 서열일 수 있다.

상기 CpG 올리고뉴클레오티드와 같은, 상기 면역 자극성 핵산은 단일 회 또는 복수 회로 투여될 수 있다. 상기 CpG 올리고뉴클레오티드가 복수 회로 투여되는 경우, 일주일 단위, 일별 단위, 또는 월별 단위와 같이, 규칙적 간격으로 투여될 수 있다.

상기 CpG 올리고뉴클레오티드와 같은, 상기 면역 자극성 핵산은 임의의 경로에 의하여 투여될 수 있다. 예를 들면, 상기 면역 자극성 핵산은 경구, 주사, 또는 서방 장치 (sustained release device)를 통하여 투여될 수 있다.

본 발명의 일부 구체예에서, 상기 개체는 암 또는 감염성 질환을 갖는다. 다른 구체예에서, 상기 개체는 암 또는 감염성 질환을 일으킬 수 위험이 있다. 선택적으로 상기 개체는 골암, 뇌암 및 중추신경계암, 결합조직암, 식도암, 눈암, 호치킨 림프종, 후두암, 구강암, 피부암, 및 고환암으로 구성되는 군으로부터 선택되는 암을 가지고 있다. 상기 개체는 또한 면역 약화된 개체일 수 있다. 다른 구체예에서, 상기 개체는 바이러스, 박테리아, 진균 및 기생중 감염으로 구성되는 군으로부터 선택되는 감염성 질환을 가지고 있다. 또다른 구체예에서, 상기 개체는 바이러스, 박테리아, 진균 및 기생중 감염으로 구성되는 군으로부터 선택되는 감염성 질환에 걸릴 위험이 있다.

상기 면역 자극성 핵산은 포스페이트 개질된 골격 또는 펩티드 개질된 올리고뉴클레오티드 골격과 같은 개질된 골격을 가질 수 있다. 일 구체예에서, 상기 포스페이트 개질된 골격은 포스포로티오에이트 개질된 골격이다.

다른 양상에 있어서, 본 발명은 면역 자극성 핵산 및 수 중 유 에멀션의 조성물이다. 일 구체예에서, 상기 수 중 유 에멀션은 EMULSIGEN^TM이다.

본 발명의 모든 양상의 특정한 구체예에서, 상기 면역 자극성 핵산은 Th1 면역 반응을 자극하는 핵산일 수 있다. 비슷하게, 본 발명의 일부 양상에 있어서, 하나 이상의 다른 면역 자극성 핵산이 개체에 투여되는 것도 가능하다. 따라서, 구체예에 따라서, 하나, 둘, 셋, 넷 또는 다섯 또는 그 이상의 다른 면역 자극성 핵산이 특정한 방법으로 개체에 투여될 수 있다. 따라서, "면역 자극성 핵산 (an immunostimulatory nucleic acid)"이라는 용어는 단일 면역 자극성 핵산, 특정한 부류의 복수의 면역 자극성 핵산 및 다른 부류의 복수의 면역 자극성 핵산을 포함하는 의미이다.

다른 구체예에 따르면, 상기 면역 자극성 핵산은 다른 치료학적 제제 예를 들면, 수 중 유 에멀션, 항원 등의 투여와 동시에, 투여 전에 또는 투여 후에 투여된다.

일부 구체예에서, 상기 면역 자극성 핵산은 면역 반응을 상승조절, 증진 또는 활성화시키기에 효과적인 양으로 투여된다. 일부 구체예에서, 상기 면역 자극성 핵산은 Th2 면역반응으로부터 Th1 면역반응으로 재조정하기에 효과적인 양으로 투여된다. 또다른 구체예에서, 다른 핵산 서열 및 다른 기능적 효과물 (effects)과 함께, 복수의 면역 자극성 핵산이 투여된다.

본 발명의 상기 한정 사항 (limitation) 각각은 본 발명의 다양한 구체예를 포함할 수 있다. 그러므로, 임의의 하나의 요소 또는 요소의 조합과 관련되는 본 발명의 한정 사항의 각각은 본 발명의 각 양상에 포함되어질 수 있다.

면역 자극성 핵산과 수 중 유 에멀션과 같은 치료학적 제제의 조합을 선택하는 것이 어느 한 성분을 단독으로 사용하는 경우에 비하여 면역 반응을 개선하는데 있어서 현저하게 좋게, 때로는 상승적으로 작용한다는 것이 본 발명에 따라 놀랍게도 발견되었다. 약물을 투여하기 위하여 많은 제제들이 개발되고 시험되었지만, 이들 특정한 형태는 상기 면역 자극성 핵산의 활성을 현저하게 증진시킨다. 이는 다른 유사한 제제가 본 명세서에 개시된 상기 치료학적 제제와 동일한 현저한 형태의 개선을 입증하지 않았기 때문에, 부분적으로 놀라운 것이었다. 본 명세서에 사용된 "치료학적 제제 (therapeutic formulations)"란 용어는 EMULSIGEN^TM과 같은 수 중 유 에멀션을 의미한다.

이하 기술하게 될 실시예에서 입증되는 바와 같이, 상기 면역 자극성 핵산의 조합은 감염성 질환의 치료와 예방에 있어서 현저하게 개선된 치료학적 효과를 입증하였다. 최근, 알럼과 CpG ODN의 상기 조합이 생쥐에서 다른 보조제 조합에 비하여 주사 부위에서 최소한의 부작용을 갖는 면역 반응을 증가시킬 수 있는 큰 잠재력을 가지고 있음이 밝혀졌다 (Weeratna, R.D., et al. 2000. CpG DNA induces stronger immune responses with less toxicity than other adjuvants. Vaccine 18: 1755-1762). 그러나, 생쥐에서의 기대되는 결과에도 불구하고, CpG ODN과 알럼으로 항원보강된 BHV-1 tgD가 CpG ODN 단독으로 항원보강된 tgD에 비하여 비슷한 면역 반응을 유도하였고, BHV-1 챌린지로부터 송아지들을 완전히 보호하지 못한다는 것이 밝혀졌다. 더욱이, 프로인트 불완전 보조제로 항원보강된 BHV-1 서브유니트 백신도 또한 BHV-1 챌린지로부터 송아지들을 보호하지 못하였다 (Israel, B.A., et al. 1988. Epitope specificity and protective efficacy of the bovine immune response to bovine herpesvirus-1 glycoprotein vaccines. Vaccine 6:349-356).

놀랍게도, CpG ODN 및 EMULSIGEN^TM과 같은 수 중 유 에멀션으로 공동-항원보강된 BHV-1 tgD 백신은, tgD가 CpG ODN, VSA3 또는 EMULSIGEN^TM 단독으로 항원보강되거나, 또는 비-CpG ODN 및 EMULSIGEN^TM과 공동-항원보강된 경우 보다 더 강하고 더 균형잡힌 면역 반응을 유도하였을 뿐만 아니라 BHV-1 챌린지로부터 더 높은 보호를 제공한다는 것이 본 발명에 의하여 발견되었다. 더욱이, EMULSIGEN^TM의 존재 또는 부존재하에서 CpG ODN와 제제화된 tgD에 의하여 유도된 상기 면역 반응은, EMULSIGEN^TM, VSA3 또는 비-CpG ODN 및 EMULSIGEN^TM과 제제화된 tgD로부터 유도된 면역 반응과는 대조적으로 더 Th1으로 치우쳐 있었다. 상기 데이터는 CpG ODN 및 EMULSIGEN^TM으로 항원보강된 BHV-1 서브 유니트 백신과 같은 백신으로 동물을 면역화시킴으로써 비-CpG ODN과 EMULSIGEN^TM, EMULSIGEN^TM, CpG ODN 또는 VSA3 단독으로 항원보강된 백신에 비하여, 바이러스 감염에 대하여 더 강하고 더 균형잡힌 체액성 및 세포성 반응 및 더 높은 보호를 유도한다는 것을 입증하는 것이다.

가축에서, BHV-1에 대한 보호는 현저한 체액성 면역에 의하여 주로 매개되고 있다. 실제로, 높은 항체가 부재하에서의 강한 세포성 반응은 감염에 대하여 완전하게 보호하지 못한다 (Loehr, B.L, et al. 2000. Gene gun-mediated DNA immunization primes development of mucosal immunity against bovine herpesvirus 1 in cattle. J. Virol. 74.6077-6086). 종래의 연구 결과는 BHV-1 유도된 질병으로부터의 현저한 보호는 하나 이상의 바이러스 당단백질을 포함하는 서브 유니트 백신에 의하여 달성될 수 있다는 것을 나타낸다 (Gao, Y., et al. 1994. Truncated bovine herpesvirus-1 glycoprotein 1 (gp1) initiates a protective local immune response in its natural host. Vaccine 12:145-152; Baca-Estrada, ME., et al. 1996 Immunogenicity of bovine herpesvirus 1 glycoprotein D in mice: effect of antigen form on the induction of cellular and humoral immune responses. Viral. Immunol. 9:11-22; Babiuk, L.A., L. et al. 1996 Immunology of bovine herpesvirus 1 infection. Vet.Microbiol. 53:31-42; Zhu, X., S. et al. 1997. Yeast-secreted bovine herpesvirus type 1 glycoprotein D has authentic conformational structure and immunogenicity. Vaccine 15:679-688; van Drunen Littel-van den Hurk, S., et al. 1994. A subunit gIV vaccine, produced by transfected mammalian cells in culture, induces mucosal immunity against bovine herpesvirus-1 in cattle. Vaccine 12:1295-1302). 그러나, 비효율적인 체액성 면역 반응으로 인하여, 일부 BHV-1 서브 유니트 백신은 챌린지로부터 거의 또는 전혀 보호를 유도하지 않았다 (Israel, B.A., et al. 1988. Epitope specificity and protective efficacy of the bovine immune response to bovine herpesvirus-1 glycoprotein vaccines. Vaccine 6:349-356). VSA3와 같은 종래의 보조제는 강한 면역 반응을 생성하나 바람직하지 못한 주사 부위 반응 (injection site reaction)을 남긴다. VSA3는 광유에 기초한 에멀션과 염증성 화합물 : 디메틸 디옥타데실 암모늄 브로마이드 (DDA)로 구성된다. 인간에 있어서, DDA는 주사 부위에서 부기 (swelling) 및 통증 및 지연 과민증 포함하는 숙주의 염증 반응을 유도하는 것으로 알려져 있다 (Vogel, F.R. and M.F. Powell. 1995. A compendium of vaccine adjuvants and excipients, p. 141-228. In M.F.Powell, M.J Newman, and JR. Burdinan (eds.), Vaccine Design: the subunit and adjuvant approach. Plenum Press, New York). 염증성 경향으로 인하여, DDA는 또한 랫트에서 실험적 관절염을 유도하기 위하여 사용된다 (Mia, M. Y., Let al. 2000. Dimethyl dioctadecyl ammonium bromide (DDA) induced arthritis in rats: a model of experimental arthritis. J. Autoimmun. 14:303-310).

더욱이, 증진된 보호 면역 반응이 피하 (s.c.) 전달 경로를 사용함으로써 유도된다는 것이 발견되었다. 피하 투여는 투여가 용이하고 피부의 면역능력 (immunocompetence)으로 인하여 수의 및 인간 시술 모두에 있어서 유용한 전달 방법이다. 일반적으로 백신은 근육내 (i.m.)로 투여되었다. 본 발명의 조성물은 근육내 (i.m.) 보다 피하 (s.c.)로 전달되는 경우 훨씬 더 증진된 효과를 나타낼 수 있다.

하기하는 데이터는 면역 자극성 핵산과 치료학적 제제의 조합에 의하여 바이러스 방출 (shedding)이 현저하게 감소시킨다는 것을 입증한다. 사실 일부 동물에서는 바이러스 방출이 전혀 없었다. 이것은 감염으로부터 보호의 양을 반영하는 것이기 때문에, 아주 중요한 변수이다. "바이러스 방출 (viral shedding)"이란 바이러스로 감염된 동물에 의하여 점액성 표면에서 바이러스 입자를 생성하는 것을 나타낸다. 바이러스 방출의 존재 또는 부존재는 동물로부터 시료 (예, 코 분비물)를 채취하고 바이러스의 존재에 대하여 시료를 분석함으로써 결정될 수 있다. 약물이 바이러스 방출을 예방하는 경우, 그 동물에서 감염을 효과적으로 예방한다. 본 발명의 치료학적 제제 중의 상기 핵산이 바이러스 방출을 감소시키고 심지어는 제거할 수 있는 능력은 상기 조성물의 놀라운 능력을 입증하는 것이다.

따라서, 상기 치료학적 제제와 조합된 상기 면역 자극성 핵산은 면역 시스템을 자극하여 감염성 질환을 예방하거나 치료한다. 상기 핵산의 면역 자극성 능력에 의하여 야기되는 강하고 균형잡힌, 세포성 및 체액성 면역 반응은 침입하는 미생물에 대항하는 개체의 천연 방어 시스템을 반영한다.

본 명세서에서, "예방 (prevent)", "예방된 (prevented)", 또는 "예방하는 (preventing)" 및 "치료 (treat)", "치료된 (treated)", 또는 "치료하는 (treating)"이라는 용어는 감염성 질환의 예방 및 치료와 관련하여 사용되는 경우, 개체가 감염된 후 상기 감염성 질환과 싸우기 위한, 예를 들면, 감염성 질환을 감소시키거나 완전히 제거하거나 더 악화되는 것을 방지하기 위한 치료 뿐만 아니라, 미생물에 대한 개체의 저항성을 증가시키는, 다시말하면, 상기 개체가 상기 미생물에 대한 감염성 질환을 일으킬 가능성을 감소시키는 예방적 치료를 의미한다.

상기 면역 자극성 핵산은 개체에서 감염성 질환을 치료하거나 예방하는데 유용하다. "개체 (subject)"란 개, 고양이, 말, 소, 돼지, 양, 염소, 또는 영장류, 예를 들면, 원숭이를 포함하나, 이들에 한정되지 않는 인간 또는 척추 포유동물을 의미한다. 일부 구체예에서, 개체는 생쥐와 같은 설치류를 특이적으로 배제한다.

상기 면역 자극성 핵산은 본 발명의 일부 구체예에서, 개체의 미생물에의 노출 또는 미생물에 대하여 예상되는 노출이 알려지거나 의심되는 경우 감염성 질환을 일으킬 위험이 있는 개체의 치료를 위한 예방제 (prophylactic)로서 유용하다. 본 명세서에 사용된 감염성 질환을 일으킬 "위험이 있는 개체 (subject at risk)"란 미생물에 노출된 임의의 위험을 가지고 있는 개체, 예를 들면, 감염된 개체와 접촉하고 있는 사람 또는 특정한 미생물이 발견된 장소를 여행하는 사람이다. 예를 들면, 위험이 있는 개체는 특정한 미생물이 발견된 지역을 여행할 계획이 있는 사람이거나 심지어는 미생물이 확인된 지역에 살고 있는 임의의 개체일 수 있다. 감염성 질환을 일으킬 위험이 있는 개체에는 개체를 특정한 미생물에 노출시키는, 의학적 또는 환경적 인자 때문에 감염성 질환을 일으킬 특정한 위험이 있는 것으로 여겨지는 개체 뿐만 아니라, 미생물, 예를 들면, 인플루엔자에 노출될 일반적인 위험을 가지고 있으나, 본 발명의 치료 동안 활성 질환을 가지고 있지 않은 개체를 포함한다.

예방적 치료를 위하여 상기 면역 자극성 핵산 및 항 미생물제를 사용하는 것에 더하여, 본 발명은 또한 감염성 질환을 가진 개체의 치료를 위하여 약물의 조합을 사용하는 것을 포함한다. "감염성 질환을 갖는 개체 (subject having an infectious disease)"는 미생물과 접촉한 개체이다. 따라서, 상기 미생물은 상기 개체의 신체에 침입하였다. 본 발명에서 사용된 "침입하다 (invade)"란 단어는 미생물이 상기 개체의 외부 표면, 예를 들면, 피부 또는 점막에 접촉하는 것을 의미하거나 상기 미생물이 상기 개체의 외부 표면을 투과하는 것을 의미한다.

본 명세서에 사용된 "감염성 질환 (infectious disease)"이란 감염성 미생물이 표면적으로, 국부적으로 또는 전신적으로 숙주에 침입함으로써 야기되는 교란 (disorder)을 의미한다. 감염성 미생물에는, 박테리아, 바이러스 및 진균이 포함된다. 박테리아는 이중 분열 (binary fission)에 의하여 무성적으로 증식하는 단세포 생물이다. 박테리아는 형태, 염색 반응, 영양 및 대사적 필수요건, 항원성 구조, 화학적 조성, 및 유전적 상동성에 근거하여 분류되고 명명된다. 박테리아는 형태학적 형태에 근거하여, 구형 (코커스), 직선-로드 (바실러스) 및 곡선 또는 나선형 로드 (비브리오, 캠필로박터, 스피릴럼 및 스피로케테 (spirochaete))의 3개 그룹으로 분류된다. 박테리아는 또한, 염색 반응에 근거하여 그람 양성과 그람 음성의 2개의 부류로 더 흔하게 특징지워진다. 그람은 미생물학 실험실에서 흔하게 수행되고 있는 염색 방법을 의미한다. 그람 양성 생물은 염색 과정 후에 염색을 보유하고 있으며, 짙은 보라색으로 보인다. 그람 음성 생물은 상기 염색을 보유하지 않으나, 반대 염색을 취하여 분홍으로 보인다.

감염성 박테리아에는 그람 음성 및 그람 양성 박테리아가 포함되나, 여기에 한정되는 것은 아니다. 그람 양성 박테리아에는, 파스테렐라 (Pasteurella) 종, 스타필로코키 (Staphylococci) 종, 및 스트렙토코커스 (Streptococcus) 종이 포함되나 여기에 한정되는 것은 아니다. 그람 음성 박테리아에는 에세리키아 콜리 (Escherichia coli), 수도모나스 (Pseudomonas) 종, 및 살모넬라 (Salmonella) 종이 포함되나 여기에 한정되는 것은 아니다. 감염성 박테리아의 특정한 예에는, 헬리코박터 필로리 (Helicobacter pyloris), 보렐리아 부르그도르페리 (Borelia burgdorferi), 레지오넬라 뉴모필리아 (Legionella pneumophilia), 미코박테리아 종 (Mycobacteria sps) (예, M. tuberculosis, M. avium, M. intracellulare, M. kansaii, M. gordonae), 스타필로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus), 네이세리아 고노레아 (Neisseria gonorrhoeae), 네이세리아 메닌지티디스 (Neisseria meningitidis), 리스테리아 모노시토젠스 (Listeria monocytogenes), 스트렙토코커스 파이로젠스 (Streptococcus pyogenes) (A 그룹 스트렙토코커스), 스트렙토코커스 아갈티애 (Streptococcus agalactiae) (B 그룹 스트렙토코커스), 스트렙토코커스 (Streptococcus) (비리단스 그룹), 스트렙토코커스 패칼리스 (Streptococcus faecalis), 스트렙토코커스 보비스 (Streptococcus bovis), 스트렙토코커스 (Streptococcus) (혐기종), 스트렙토코커스 뉴모니애 (Streptococcus pneumoniae), 병원성 캠필로박터 종 (Campylobacter sp.), 엔테로코커스 종 (Enterococcus sp.), 해모필러스 인플루엔자 (Haemophilus influenzae), 바실러스 안트라시스 (Bacillus antracis), 코리네박테리움 디프테리아 (corynebacterium diphtheriae), 코리네박테리움 종 (corynebacterium sp.), 에리시펠로트릭스 루시오파티애 (Erysipelothrix rhusiopathiae), 클로스트리디움 퍼프린저스 (Clostridium perfringers), 클로스트리디움 테타니 (Clostridium tetani), 엔테로박터 에어로젠스 (Enterobacter aerogenes), 클렙시엘라 뉴모니애 (Klebsiella pneumoniae), 파스테렐라 물토시다 (Pasturella multocida), 박터로이즈 종 (Bacteroides sp.), 푸소박테리움 뉴클레아툼 (Fusobacterium nucleatum), 스트렙토바실러스 모닐리포르미스 (Streptobacillus moniliformis), 트레포네마 팔리디움 (Treponema pallidium), 트레포네마 퍼테뉴 (Treponema pertenue), 렙토스피라 (Leptospira), 리케치아 (Rickettsia), 및 악티노미세테스 이스라엘리 (Actinomyces israelli)가 포함되나, 여기에 한정되는 것은 아니다.

바이러스는 핵산 핵 (core)과 단백질 외피를 포함하는 작은 감염성 인자이나, 독립적으로 살아가는 생물은 아니다. 바이러스는 증식할 수 있는 살아 있는 세포의 부존재하에서는 생존할 수 없다. 바이러스는 DNA (파아지)의 세포내이입 (endocytosis)이나 직접적 주입에 의하여 특정한 살아 있는 세포 내로 도입되어, 증식하여 질병을 야기한다. 그런 다음, 상기 증식된 바이러스는 방출되어 추가의 세포를 감염할 수 있다. 일부 바이러스는 DNA-함유 바이러스이고, 일부 바이러스는 RNA-함유 바이러스이다.

일단 상기 바이러스가 상기 세포 내에 도입되면 다양한 생리학적 효과를 야기시킨다. 한 가지 효과는, 세포 내에 바이러스가 축적되어 세포를 죽게하고 조각으로 파괴하여 상기 바이러스를 방출시키는, 세포 퇴화 (degeneration)이다. 또다른 효과는 감염된 세포가 이웃 세포와 융합하여 합포체 (syncytia)를 생성하는 세포 융합이다. 다른 형태의 바이러스는 종양 형성을 초래하는 세포 증식을 야기시킨다.

바이러스에는, 인테로바이러스 (폴리오바이러스, 콕사키 바이러스, 에코 바이러스와 같은 피코나비리데 (picornaviridae) 패밀리가 포함되나 이들 예에 한정되는 것은 아니다), 로타바이러스, 아데노바이러스, 간염 바이러스가 포함되나, 여기에 한정되는 것은 아니다. 인간에게서 발견된 바이러스의 특정한 예에는, 레트로비리데 (Retroviridae) (예, HIV-1 (또한, HTLV-III, LAV 또는 HTLV-III/FLAV, 또는 HIV-III라고도 한다); 및 HIV-LP와 같은 다른 분리주와 같은 인간 면역결핍증 바이러스, 피코나비리데 (Picornaviridae) (예, 폴리오바이러스, A형 간염 바이러스; 엔테로바이러스, 인간 콕사키 바이러스, 라이노바이러스, 에코바이러스); 칼키비리데 (Calciviridae) (예, 위장염을 일으키는 스트레인); 토가비리데 (Togaviridae) (예, 말 뇌염 바이러스, 루벨라 바이러스); 플라비비리데 (Flaviridae) (예, 뎅기 바이러스, 뇌염 바이러스, 황열 바이러스); 코로노비리데 (Coronoviridae) (예, 코로나바이러스); 라브도비리데 (Rhabdoviradae) (예, 수포성 구내염 (VSV), 광견병 바이러스); 코로나비리데 (Coronaviridae) (예, 코로나바이러스); 라브도비리데 (Rhabdoviradae) (예, 수포성 구내염 (VSV), 광견병 바이러스); 필로비리데 (Filoviridae) (예, 에볼라 바이러스); 파라믹소비리데 (Paramyxoviridae) (예, 파라인플루엔자 바이러스, 볼거리 바이러스, 홍역 바이러스, 호흡기세포융합바이러스 (respiratory syncytial virus)); 오르토믹소비리데 (Orthomyxoviridae) (예, 인플엔자 바이러스); 분가비리데 (Bungaviridae) (예, 한탄 바이러스, 분가 바이러스, 플레보바이러스 (phleboviruse) 및 나이로 바이러스); 아레나비리데 (Arenaviridae) (출혈열 바이러스); 레오비리데 (Reoviridae) (예, 레오바이러스, 오르비바이러스 및 로타바이러스); 비르나비리데 (Birnaviridae); 헤파디엔에이비리데 (Hepadnaviridae) (B형 간염 바이러스); 파르보비리다 (Parvovirida) (파르보바이러스); 파포바비리데 (Papovaviridae) (유두종 바이러스 (papilloma viruse), 폴리오마바이러스); 아데노비리데 (Adenoviridae) (대부분의 아데노바이러스); 헤르페스비리데 (Herpesviridae) (헤르페스 심플렉스 바이러스 (HSV) 1 및 2, 바리셀라 조스터 바이러스 (VZV), 사이토메갈로바이러스 (CMV), 헤르페스 바이러스; 폭스비리데 (Poxviridae) (마마 (variola) 바이러스, 백시니아 바이러스, 폭스 바이러스); 및 이리도비리데 (Iridoviridae) (예, 아프리카 돼지 발열 바이러스); 및 분류되지 않은 바이러스 (예, 해면뇌병증 (Spongiform encephalopathies)의 원인 인자, 델타 간염의 인자 (B 형 간염 바이러스의 결함성 위성인 것으로 생각됨), 비-A, 비-B 간염의 인자 (부류 1 = 내부적으로 전염; 부류 2 = 비경구적으로 전염 (즉, C 형 간염); 노르워크 및 관련 바이러스, 및 아스트로바이러스)가 포함되나, 여기에 한정되는 것은 아니다.

인간 질환 (disorder)을 야기시키는 인간 개체를 감염하는 바이러스에 더하여, 본 발명은 또한 다른 인간이 아닌 척추동물을 치료하는데 유용하다. 인간이 아닌 척추동물은 또한 본 명세서에 개시된 면역 자극성 핵산 및 항 미생물제의 상기 조합으로 예방되거나 치료될 수 있는 질환을 일으킬 수 있다. 예를 들면, 감염성 인간 질환을 치료하는 것에 더하여, 본 발명의 방법은 인간이 아닌 동물을 치료하거나 예방하는데 유용하다.

인간 및 인간이 아닌 척추동물 모두의 감염성 바이러스에는, 레트로바이러스, RNA 바이러스 및 DNA 바이러스가 포함된다. 레트로바이러스의 이 그룹에는 단순 레트로바이러스 및 복합 레트로바이러스 모두가 포함된다. 상기 단순 레트로바이러스에는, B-형 레트로바이러스, C-형 레트로바이러스 및 D-형 레트로바이러스의 서브 그룹이 포함된다. B-형 레트로바이러스의 예는, 쥐유방종양바이러스 (MMTV)이다. C-형 레트로바이러스에는 서브 그룹 C-형 그룹 A (라우스 사코마 바이러스 (RSV), 조류 백혈병 바이러스 (ALV), 및 조류 미엘로블라스토시스 (myeloblastosis) 바이러스 (AMV)가 포함됨) 및 C-형 그룹 B (생쥐 백혈병 바이러스 (MLV), 고양이 백혈병 바이러스 (FeLV), 생쥐 사코마 바이러스 (MSV), 기본 원숭이 백혈병 바이러스 (GALV), 비장 괴사 바이러스 (SNV), 세망내피증 바이러스 (reticuloendotheliosis virus) (RV) 및 시미안 사코마 바이러스 (SSV)를 포함함)가 포함된다. 상기 D-형 레트로바이러스에는 마손-파이저 원숭이 바이러스 (MPMV) 및 시미안 레트로바이러스 1형 (SRV-1)이 포함된다. 상기 복합 레트로바이러스에는 렌티바이러스의 서브 그룹, T-세포 백혈병 바이러스 및 거품형성바이러스가 포함된다. 렌티바이러스에는 HIV-1, HIV-2, SIV, 비스나 바이러스, 고양이 면역결핍증 바이러스 (FIV), 및 말 전염성 빈혈 바이러스 (EIAV)가 포함된다. 상기 T-세포 백혈병 바이러스에는 HTLV-1, HTLV-II, 시미안 T-세포 백혈병 바이러스 (STLV), 및 소 백혈병 바이러스 (BLV)가 포함된다. 상기 거품형성 바이러스 (foamy viruse)에는 인간 거품형성 바이러스 (HFV), 시미안 거품형성 바이러스 (SFV) 및 소 거품형성 바이러스 (BFV)가 포함된다.

척추동물 내에서 항원인 RNA 바이러스의 예에는 하기의 바이러스가 포함되나, 여기에 한정되는 것은 아니다 : 오르토레오바이러스 (Orthoreovirus) 속 (포유동물 및 조류 레트로바이러스 모두 복수의 혈청형), 오르비바이러스 (Orbivirus) (블루텅 바이러스, 유진안게 바이러스 (Eugenangee virus), 케니에로보 바이러스, 아프리카 말 병 바이러스, 및 콜로라도 진드기 열 바이러스), 로타바이러스 (Rotavirus) 속 (인간 로타바이러스, 네브라스카 송아지 설사 바이러스, 생쥐 로타바이러스, 시미안 로타바이러스, 소 또는 양 로타바이러스, 조류 로타바이러스)을 포함한 레오비리데 (Reoviridae) 패밀리; 엔테로바이러스 (Enterovirus) (폴리오바이러스, 콕사키 바이러스 A 및 B, 장내 세포독성 인간 오펀 (ECHO) 바이러스, A형 간염 바이러스, 시미안 엔테로바이러스, 생쥐 뇌염 (encephalomyelitis) (ME) 바이러스, 생쥐 폴리오바이러스, 소 엔테로바이러스, 돼지 엔테로바이러스, 카르디오바이러스 (Cardiovirus) 속 (뇌심근염바이러스 (EMC), 멘고바이러스), 라이노바이러스 (Rhinovirus) 속 (113개 이상의 혈청을 포함하는 인간 라이노바이러스; 다른 라이노바이러스), 아프토바이러스 (Apthovirus) 속 (푸트 앤 마우스 바이러스 (FMDV)를 포함한 피코나비리데 (Picoraviridae) 패밀리; 돈 수포진 바이러스, 산 미겔 바다 사자 바이러스, 고양이 피코나바이러스 및 노르워크 바이러스를 칼키비리데 (Calciviridae) 패밀리; 알파바이러스 (Alphavirus) 속 (동부말뇌염 바이러스, 셈리키 포레스트 바이러스, 신드비스 바이러스, 치쿵군야 바이러스 (Chikungunya virus), 오뇽-뇽 바이러스 (O'Nyong-Nyong virus), 로스강 바이러스, 베네주엘라 말 뇌염 바이러스, 서부말뇌염 바이러스), 플라비바이러스 (Flavirius) 속 (모기 매개 황열 바이러스, 뎅기 바이러스, 일본 뇌염 바이러스, 세인트 루이스 뇌염 바이러스, 머레이 계속 뇌염 바이러스, 웨스트 나일 바이러스, 쿤진 (Kunjin) 바이러스, 중앙 유럽 진드기 매개 바이러스, 극동 진드기 매개 바이러스, 키아사누르 포레스트 바이러스, 루핑 (Louping) III 바이러스, 포와산 바이러스, 옴스크 출혈열 바이러스), 루비바이러스 (Rubivirus) (루벨라 바이러스), 페스티바이러스 (Pestivirus) 속 (점막병 바이러스, 돼지 콜레라 바이러스, 보더 병 바이러스)를 포함하는 토가비리데 (Togaviridae) 패밀리; 버니바이러스 속 (번야웨라 및 관련 바이러스, 캘리포니아 뇌염 군 바이러스), 플레보바이러스 (Phlebovirus) (눈에놀이 (sandfly) 열 시실리아 바이러스, 리프브 벨리 열 바이러스), 나이로바이러스 (Nairovirus) 속 (크리미언-콩고 출혈열 바이러스, 나이로비 양 병 바이러스), 및 우쿠바이러스 (Uukuvirus) 속 (우우케니에미 및 관련 바이러스)를 포함한 번야비리데 (Bunyaviridae); 인플루엔자 바이러스 (Influenza) 속 (인플루엔자 A형 , 많은 인간 서브타입)을 포함하는 오르토믹소비리데 (Orthomyxoviridae) 패밀리; 돼지 인플루엔자 바이러스, 및 조류 및 말 인플루엔자 바이러스; 인플루엔자 B 형 (많은 인간 서브타입), 및 C 형 인플루엔자 (분리된 속 가능); 파라믹소바이러스 (Paramyxovirus) 속 (파라인플루엔자 바이러스 1형, 센다이 바이러스, 헴흡착 바이러스, 파라인플루엔자 바이러스 2형 내지 5형, 뉴케슬병 바이러스, 볼거리 바이러스), 모르빌리바이러스 (Morbillivirus) (홍역 바이러스, 아급성경화범뇌염 바이러스 (subacute sclerosing panencephalitis virus), 디스템퍼 바이러스, 우역 (牛疫) 바이러스 (Rinderpest virus)), 뉴모바이러스 (Pneumovirus) (호흡기세포융합바이러스 (RSV), 소 호흡기세포융합바이러스 및 생쥐의 뉴모니아 (Pneumonia) 바이러스)를 포함한 파라믹소비리데 (paramyxoviridae) 패밀리; 포레스트 바이러스, 신드비스 바이러스, 치쿵군야 바이러스 (Chikungunya virus), 오뇽-뇽 바이러스 (O'Nyong-Nyong virus), 로스강 바이러스, 베네주엘라 말 뇌염 바이러스, 서부말뇌염 바이러스), 플라비바이러스 (Flavirius) 속 (모기 매개 황열 바이러스, 뎅기 바이러스, 일본 뇌염 바이러스, 세인트 루이스 뇌염 바이러스, 머레이 계속 뇌염 바이러스, 웨스트 나일 바이러스, 쿤진 (Kunjin) 바이러스, 중앙 유럽 진드기 매개 바이러스, 극동 진드기 매개 바이러스, 키아사누르 포레스트 바이러스, 루핑 (Louping) III 바이러스, 포와산 바이러스, 옴스크 출혈열 바이러스), 루비바이러스 (Rubivirus) (루벨라 바이러스), 페스티바이러스 (Pestivirus) 속 (점막병 바이러스, 돼지 콜레라 바이러스, 보더 병 바이러스)를 포함하는 토가비리데 (Togaviridae) 패밀리; 버니바이러스 속 (번야웨라 및 관련 바이러스, 캘리포니아 뇌염 군 바이러스), 플레보바이러스 (Phlebovirus) (눈에놀이 (sandfly) 열 시실리아 바이러스, 리프브 벨리 열 바이러스), 나이로바이러스 (Nairovirus) 속 (크리미언-콩고 출혈열 바이러스, 나이로비 양 병 바이러스), 및 우쿠바이러스 (Uukuvirus) 속 (우우케니에미 및 관련 바이러스)를 포함한 번야비리데 (Bunyaviridae); 인플루엔자 바이러스 (Influenza) 속 (인플루엔자 A형 , 많은 인간 서브타입)을 포함하는 오르토믹소비리데 (Orthomyxoviridae) 패밀리; 돼지 인플루엔자 바이러스, 및 조류 및 말 인플루엔자 바이러스; 인플루엔자 B 형 (많은 인간 서브타입), 및 C 형 인플루엔자 (분리된 속 가능); 파라믹소바이러스 (Paramyxovirus) 속 (파라인플루엔자 바이러스 1형, 센다이 바이러스, 헴흡착 바이러스, 파라인플루엔자 바이러스 2형 내지 5형, 뉴케슬병 바이러스, 볼거리 바이러스), 모르빌리바이러스 (Morbillivirus) (홍역 바이러스, 아급성경화범뇌염 바이러스 (subacute sclerosing panencephalitis virus), 디스템퍼 바이러스, 우역 (牛疫) 바이러스 (Rinderpest virus)), 뉴모바이러스 (Pneumovirus) (호흡기세포융합바이러스 (RSV), 소 호흡기세포융합바이러스 및 생쥐의 뉴모니아 (Pneumonia) 바이러스)를 포함한 파라믹소비리데 (paramyxoviridae) 패밀리; 베시큐로바이러스 (Vesiculovirus) (VSV) 속, 칸디푸라 바이러스, 플란더스-하르트 공원 바이러스), 리사바이러스 (Lyssavirus) 속 (광견병 바이러스), 어류 라브도바이러스, 및 2개의 가능한 라브도바이러스 (마버그 바이러스와 에볼라 바이러스)를 포함한 라브도비리데 (Rhabdoviridae) 패밀리; 림프구맥락수막염바이러스 (lymphocytic choriomeningitis virus ; LCMV), 타카리베 바이러스 복합체, 및 라싸 바이러스를 포함한 아레나비리데 (Arenaviridae); 전염성기관지염 바이러스 (IBV), 생쥐 간염 바이러스, 인간 장 코로나바이러스, 및 고양이 전염성 복막염 (고양이 코로나바이러스)를 포함한, 코로나비리데 (Coronoaviridae) 패밀리.

척추동물을 감염하는 DNA 바이러스의 예에는, 오르토폭스바이러스 (Orthopoxvirus) 속 (대두창 (variola major), 소두창 (Variola minor), 원숭이 폭스 백시니아, 우두, 버팔로폭스, 토끼폭스, 서두 (Ectromelia)), 레포리폭스바이러스 (Leporipoxvirus) 속 (Myxoma, Fibroma), 아비폭스바이러스 (Avipoxvirus) 속 (Fow1pox, 다른 조류 폭스바이러스), 카프리폭스바이러스 (Capripoxvirus) 속 (sheeppox, goatpox), 수이폭스바이러스 (Suipoxvirus) 속 (Swinepox), 파라폭스바이러스 (Parapoxvirus) 속 (전염성 포스툴라 (postular) 피부염 바이러스, 가성우두 (pseudocowpox), 소 구진성 구내염 (stomatitis) 바이러스)를 포함한 폭스비리데 (Poxviridae) 패밀리; 이리도비리데 (Iridoviridae) 패밀리 (아프리카 돼지 발열병 바이러스, 개구리 바이러스 2 및 3, 어류의 림포시스티스병 바이러스); 알파-헤르페스바이러스 (헤르페스 심플렉스 1 형 및 2형, 베리셀라-조스터 바이러스, 말 유산 바이러스, 말 헤르페스 바이러스 2 및 3, 가성광견병 바이러스, 전염성 소 각결막염 (keratoconjunctivitis) 바이러스, 전염성 소 비기관염 바이러스, 고양이 비기관염 바이러스, 전염성 후두기관지염 바이러스), 베타-헤르페스바이러스 (인간 사이토메갈로바이러스 및 돼지, 원숭이 및 설치류의 사이토메갈로바이러스); 감마-헤르페스바이러스 (엡스타인-바 바이러스 (EBV), 마레크병 바이러스, 헤르페스 사이미리, 헤르페스바이러스 아텔레스 (ateles), 헤르페스바이러스 실비라구스 (Herpesvirus sylvilagus), 기니피그 헤르페스 바이러스, 루크 (Lucke) 종양 바이러스)를 포함한 헤르페스비리데 (Herpesviridae) 패밀리; 마스트아데노바이러스 (Mastadenovirus) 속 (인간 서브그룹 A,B,C,D,E 및 그룹되지 않은 : 시미안 아데노바이러스 (적어도 23 혈청형), 전염성 개 간염, 및 소, 돼지, 양, 개구리 및 많은 다른 종의 아데노바이러스, 아비아데노바이러스 (Aviadenovirus) 속 (조류 아데노바이러스); 및 배양가능하지 않은 아데노바이러스를 포함한 아데노비리데 (Adenoviridae) 패밀리; 파필로마바이러스 (Papillomavirus) 속 (인간 파필로마 바이러스, 소 파필로마 바이러스, 쇼페 (Shope) 토끼 파필로마 바이러스, 및 다른 종의 다양한 병원성 파필로마 바이러스), 폴리오마바이러스 (Polyomavirus) 속 (폴리오마바이러스, 시미안 공포화 (vacuolating) 인자 (SV-40), 토끼 공포화 인자 (RKV), K 바이러스, BK 바이러스, JC 바이러스, 및 림프구친화성 파피로마 바이러스 (Lymphotrophic papilloma virus)와 같은 다른 영장류의 폴리오마바이러스)를 포함한 파포비리데 (Papoviridae) 패밀리; 아데노-연관 바이러스 속, 파르보바이러스 (Parvovirus) 속 (고양이 범백혈구감소증 (panleukopenia) 바이러스, 소 파르보바이러스, 개 파르보바이러스, 알류샨 밍크 병 바이러스 등)을 포함하는 파르보비리데 (Parvoviridae) 패밀리가 포함되나, 여기에 한정되는 것은 아니다. 마지막으로, DNA 바이러스는 쿠루 및 크로이츠펠트-야콥 병 바이러스 및 만성 전염성 신경병증 인자 (CHINA 바이러스)와 같은 상기 패밀리에 해당하지 않는 바이러스를 포함한다.

진균 (fungi)은 그 중 일부만이 척추 포유동물에서 감열을 일으키는, 진핵 생물이다. 진균은 진핵 생물이기 때문에, 크기, 구조 조직, 생활환 및 증식 기작에 있어서, 원핵 생물인 박테리아와 현저하게 다르다. 진균은 일반적으로 형태학적 특징, 증식 방법 및 배양 특성에 근거하여 분류된다. 진균은 개체에서 진균 항원을 흡입한 후의 호흡기 알러지, 독성 버섯에 의하여 생산된 아마타톡신 및 팔로톡신 및 아스퍼질러스 종에 의하여 생산되는 아플라톡신과 같은 독성 물질의 섭취로 인한 진균 중독과 같은 다른 형태의 질병을 야기시킬 수 있으나, 모든 진균이 감염성 질병을 야기하는 것은 아니다.

감염성 진균은 전신성 또는 표면성 감염을 야기할 수 있다. 일차 전신성 감염은 정상의 건강한 개체 및 기회 감염으로 일으날 수 있으며, 가장 흔하게는 면역 약화된 개체에서 발견된다. 일차 전신성 감염을 야기하는 가장 흔한 진균성 인자에는, 블라스토미세스 (blastomyces), 콕시디오이데스 (coccidioides), 및 히스토플스마 (histoplasma)가 포함된다. 면역 약화되거나 면역 억제된 개체에서 기회 감염을 야기시키는 흔한 진균에는, 칸디다 알비칸스 (candida albicans) (기도 균 군집의 정상적인 일부분인 생물), 크립토코커스 네오포르만스 (cryptococcus neoformans) (때때로 기도의 정상 균 군집 중에 있음), 및 다양한 아스퍼질러스 종이 포함되나, 여기에 한정되는 것은 아니다. 전신성 진균 감염은 내부 기관의 침습성 감염이다. 상기 생물은 일반적으로 폐, 위장관, 또는 정맥내 주름 (line)을 통하여 몸 안으로 들어간다. 이들 형태의 감염은 일차 병원성 진균 또는 기회성 진균에 의하여 야기될 수 있다.

표면성 진균 감염은 내부 조직으로의 침입없이 외부 표면에서의 진균의 성장과 관련된다. 일반적인 표면성 진균 감염은 피부, 머리 카락, 또는 손발톱 (nail)과 관련되는 피부 (cutaneous) 진균 감염을 포함한다. 피부 감염의 예는, 미크로스포룸 (microsporum) 또는 트라이코피톤 (traicophyton) 종과 같은 더마토피테스 (dermatophytes)에 의하여 야기되는 백선증 (ringworm)과 같은 백선증 감염 (Tinea infections)이다. 즉, 미크로스포룸 카니스 (microsporum canis), 미크로스포룸 집섬 (microsporum gypsum), 트리코피틴 루브룸 (tricofitin rubrum)이다.

진균의 예에는, 크립토코커스 네오포르만스 (Cryptococcus neoformans), 히스토플라스마 캅술라툼 (Histoplasma capsulatum), 콕시디오이데스 아니미티스 (Coccidioides inimitis), 블라스토미세스 더마티티디스 (Blastomyces dermatitidis), 클라미디아 트라코마티스 (Chlamydia trachomatis), 칸디다 알비칸 (Candida albicans)가 포함된다.

본 발명의 방법에 의하여 표적으로 되는 기생충 감염에는 하기 기생충에 의하여 야기되는 감염을 포함한다: 플라스모디움 팔시파룸 (Plasmodium falciparum), 플라스모디움 오발레 (Plasmodium ovale), 플라스모디움 말라리애 (Plasmodiwn malariae), 플라스모디움 비박스 (Plasmdodium vivax), 플라스모디움 크놀레스키 (Plasmodium knowlesi), 바베시아 미크로티 (Babesia microti), 바베시아 디버전스 (Babesia divergens), 트리파노조마 크루지 (Trypanosoma cruzi), 폭소플라스마 곤디이 (Toxoplasma gondii), 트리키넬라 스피랄리스 (Trichinella spiralis), 레이쉬마니아 메이저 (Leishmania major), 레이쉬마니아 도노바니 (Leishmania donovani), 레이쉬마니아 브라질리엔시스 (Leishmania braziliensis) 및 레이쉬마니아 트로피카 (Leishmania tropica), 트리파노조마 감비엔세 (Trypanosoma gambiense), 트리파노조마 로데시엔세 (Trypanosmoina rhodesiense) 및 쉬스토조마 만소니 (Schistosoma mansoni). 바라직한 구체예에서, 상기 방법은 말라리아를 일으키는 기생충 감염의 예방을 대상으로 한다.

다른 의학적으로 관련되는 미생물은 그 전체 내용이 원용에 의하여 본 명세서에 포함되어지는, 문헌 예를 들면, C.G.A Thomas, Medical Microbiology' Bailliere Tindall, 영국, 1983에 광범위하게 개시되어 있다. 상기 목록의 각각은 예시적인 것이며, 이들 예에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 방법은 면역 자극성 핵산 및 치료학적 제제의 조합과 관련된다. 활성 제제의 상기 조합은 또한 감염성 질환의 치료 또는 예방을 위하여 항 미생물제와 조합되어 투여될 수 있다. 본 명세서에 사용된, 항 미생물제는 감염성 미생물을 죽이거나 억제할 수 있는 천연 또는 합성 화합물을 의미한다. 본 발명에 따르는 경우 유용한 항 미생물제의 형태는 개체를 감염하거나 감염될 위험이 있도록 하는 미생물의 형태에 달려있다. 항 미생물제의 한 가지 형태는 항 박테리아제이다. 항 박테리아제는 박테리아의 성장 또는 기능을 죽이거나 억제한다. 항 박테리아제의 큰 부류는 항생제이다.

항 바이러스제는 바이러스에 의한 세포의 감염 또는 세포 내에서의 바이러스의 증식을 예방하는 화합물이다. 바이러스 증식의 과정은 숙주 세포 내에의 DNA 복제와 너무 밀접하게 관련되어 있어서 비특이적 항 바이러스제는 종종 숙주에게 독성이 있기 때문에, 항 박테리아 약물에 비하여 수가 더 적은 많은 항 바이러스 약물이 있다. 항 바이러스제에 의하여 차단되거나 억제될 수 있는 바이러스 감염의 과정에는 여러 단계가 있다. 이들 단계에는, 상기 바이러스의 숙주 세포에의 부착 (면역글로불린 또는 결합 펩티드), 상기 바이러스의 탈외피 (uncoating) (예, 아만타딘), 바이러스 mRNA의 합성 또는 번역 (예, 인터페론), 바이러스 RNA 또는 DNA의 복제 (예, 뉴클레오시드 유사체), 새로운 바이러스 단백질의 성숙 (예, 프로테아제 억제제), 및 상기 바이러스의 버딩 (budding)과 방출.

항 진균제는 감염성 진균의 치료 및 예방에 유용하며, 살기생충제 (parasiticide)는 기생충을 직접적으로 죽이는 제제이다. 그러한 화합물은 당업계에 알려져 있으며, 일반적으로 상업적으로 이용가능하다.

인간에서의 감염을 예방하기 위하여 상기 면역 자극성 핵산 및 치료학적 제제를 사용하는 것에 더하여, 바람직한 구체예의 방법은 인간이 아닌 척추동물의 치료를 위하여 특히 잘 적합화되어 있다. 동물원, 농장 및 연구 동물의 경우에서와 같이, 비좁은 곳에 빽빽하게 살고 서로 융합하도록 되어 있는 인간이 아닌 척추동물도 또한 본 발명의 방법을 위한 개체로서 포함되어 진다. 예를 들면, 사자, 호랑이, 표범, 치타, 및 쿠거 (cougar)를 포함한 고양이과 종; 코끼리, 기린, 곰, 사슴, 늑대, 야크, 인간이 아닌 영장류, 물개, 돌고래 및 고래와 같은 동물원 동물; 및 생쥐, 랫트, 햄스터 및 게르빌루스쥐와 같은 연구 동물은 모두 본 발명의 방법을 위한 잠재적 개체이다.

암닭, 닭, 칠면조, 오리 (duck), 거위 (geese), 메추라기 및 꿩과 같은 조류는 많은 형태의 감염에 대한 주요 표적이다. 부화하는 조류는 태어난 직후 병원성 미생물에 노출된다. 이들 조류는 모 유래 항체에 의하여 병원체에 대하여 초기에는 보호되어지나, 이 보호는 단지 임시적이며 상기 조류 자신의 미성숙한 면역 체계가 상기 병원체에 대한 보호를 개시하여야만 한다. 가장 민감성 있는 어린 조류의 감염을 예방하는 것이 종종 바람직하다. 조류가 비좁은 곳에서 빽빽하게 사육되어 질병이 빠르게 전파되도록 하는 경우에는 특히, 늙은 조류의 감염을 예방하는 것이 또한 바람직하다. 따라서, 감염성 질환을 예방하기 위하여, 상기 면역 자극성 핵산 및 항 미생물제를 투여하는 것이 바람직하다.

닭에서 흔한 감염의 예는 닭 감염성 빈혈 바이러스 (CIAV)이다. CIAVE는 마레크병 (Marek's disease) 백신접종 브레이크의 조사 중에서 1979년 일본에서 처음으로 분리되었다 (Yuasa et al., 1-979, Avian Dis. 23:366-385). 그 이후 CIAV는 모든 주요 가축 생산국에서 상업적 가축에서 검출되었다 (van Bulow et al., 199 1, pp. 690-699) in Diseases of Poultry, 9th edition, Iowa State University Press).

CIAV 감염은 어린 민감성 닭에 있어서, 빈혈 (anemia), 출혈 및 면역억제에 의하여 특징지워지는 임상 질병을 야기시킨다. CIAV 감염된 닭의 흉선 및 골수의 위축 및 지속적 상처 (lesion)도 또한 CIAV 감염의 특징이다. 흉선 및 때로는 파브리시우스낭 (bursa of Fabricius)에서 림프구 고갈은 면역 억제를 초래하고, 질병의 경과를 복합화하는 바이러스, 박테리아 또는 진균 감염에 대한 민감성을 증가시킨다. 상기 면역 억제는 하나 이상의 마렉병 바이러스 (MDV), 감염성 F낭 병 바이러스, 세망내피증 (reticuloendotheliosis) 바이러스, 아데노바이러스, 또는 레오바이러스로 감염된 후 악화된 질병을 야기시킬 수 있다. NIDV의 발병 과정은 CIAV에 의하여 증진되는 것으로 보고된 바 있다 (DeBoer et al., 1989, p. 28 In Proceedings of the 38th Western Poultry Diseases Conference, Tempe, Ariz.). 더욱이, CIAV는 감염성 파부리시우스낭병 (Infectious bursal disease)의 증상을 악화시키는 것으로 보고된 바 있다 (Rosenberger et al., 1989, Avian Dis. 33:707-713). 닭은 CAA로 인하여 실험적으로 유도된 질병에 대하여 나이 저항성을 발달시킨다. 이는 2 주의 나이 안에 실질적으로 완전하나, 더 나이가 많은 조류도 여전히 감염에 민감하다 (Yuasa, N. et al., 1979 supra; Yuasa, N. et al., Arian Diseases 24, 202-209, 1980). 그러나, 닭이 CAA와 면역 억제제 (IBDV, MDV 등.)와 이중으로 감염되는 경우, 상기 질병에 대한 나이 저항성은 지연된다 (Yuasa, N. et al., 1979 and 1980 supra; Bulow von V. et al., J. Veterinary Medicine 33, 93-116, 1986). 질병 전염을 강하시킬 수 있는 CIAV의 특징에는 환경적 불활성화 및 일부 흔한 방부제에 대한 높은 저항성이 포함된다. 가금 산업에 미치는 CIAV 감염의 경제적 충격은 질병 발생 (outbreak)에 있어서 감염된 조류의 10 % 내지 30 %가 죽는다는 사실로부터 분명하다.

소 (cattle)와 가축 또한 감염에 민감성이다. 이들 동물에 영향을 미치는 질병은 특히 소 사이에서 심한 경제적 손실을 일으킬 수 있다. 본 발명의 방법은 암소, 말, 돼지, 양 및 염소와 같은 가축에서 감염에 대하여 보호하기 위하여 사용될 수 있다.

소는 소 바이러스에 의하여 감염될 수 있다. 소 바이러스성 설사 바이러스 (BVDV)는 작고 외피 (envelop)를 갖는 양성-가닥 RNA 바이러스이고, 페스트바이러스 속의 돼지 콜레라 바이러스 (HOCV) 및 양 보더병 바이러스 (BDV)와 함께 분류된다. 페스트바이러스는 종전에 토가비리데 (Togaviridae) 패밀리로 분류되었으나, 일부 연구 결과, 플라비바이러스 및 C 형 간엽 바이러스 그룹과 함께 플라비비리데 (Flaviviridae) 패밀리에 속하는 것으로 재분류할 것이 제안되었다 (Fraticki, et al., 1991).

소의 중요한 병원체인 BVDV는 세포 배양 분석에 근거하여 세포병원성 (CP) 및 비세포병원성 (NCP) 바이오타입으로 구별될 수 있다. 두 바이오타입 모두 소에서 발견될 수 있으나, 상기 NCP 바이오타입이 더 널리 퍼져 있다. 임신된 암소가 NCP 스트레인으로 감염되면, 평생 동안 바이러스를 전염시키게 될 지속적으로 감염되어 있고 특이적으로 면역 사면성 (immunotolerant)인 송아지를 낳게 된다. 상기 지속적으로 감염된 소는 점막 질병에 걸릴 수 있고 그에 따라 두 가지 바이오타입이 상기 동물로부터 분리될 수 있다. 임상적 증상으로 유산, 기형발생 (teratogenesis) 및 호흡기 질환, 점막 질환 및 약한 설사이 포함한다. 더욱이, 동물의 죽음을 야기시킬 수 있는, 가축 전염병 (herd epidemics)과 관련되는 심한 저혈소판증 (thrombocytopenia)이 개시된 바 있으며, 이 질병과 연관된 스트레인이 고전적 BVDV 보다 더 독성이 있는 것처럼 보인다.

말 헤르페스바이러스 (EHV)는 말에서 서브임상적 질환으로부터 치명적 질환에 이르는 다양한 감염을 야기시키는 항원적으로 구별되는 생물학적 인자의 그룹을 포함한다. 이들에는 말에서 어디에나 있는 병원체인 말 헤르페스바이러스-1 (EHV-1)가 포함된다. EHV-1은 유산, 기도 질환, 및 중추신경계 질환의 전염병과 연관되어 있다. 어린 말의 상기도의 일차 감염에 의하여 8 내지 20일 동안 지속되는 발열성 질환이 발생된다. 면역학적으로 경험이 있는 암말은 질병이 명확하게 나타나지 않으면서 기도를 통하여 재감염될 수 있기 때문에, 유산은 보통 경고 없이 일어난다. 신경증 (neurological syndrome)은 호흡기 질환 또는 유산과 연관되고 전 나이의 양성 모두의 동물에 영향을 미칠 수 있고, 부조화 (in-coordination), 약함 및 후부 마비 (posterior paralysis)를 초래할 수 있다 (Telford, E. A. R. et al., Virology 189, 304-316, 1992). 다른 EHV에는 종래 EHV-1 서브타입 2로서 분류된, EHV-2, 또는 말 사이토메갈로바이러스, EHV-3, 말 코이탈 엑산테마 바이러스 (equine coital exanthema virus), 및 EHV-4가 포함된다.

양과 염소는 비즈나-마에디 (visna-maedi)를 포함한 다양한 위험한 미생물에 의하여 감염될 수 있다.

원숭이 (monkey), 꼬리없는 원숭이 (ape) 및 꼬리짧은 원숭이 (macaque)와 같은 영장류는 시미안 면역결힙증 바이러스에 의하여 감염될 수 있다. 불활성화된 세포-바이러스 및 무세포 전 시미안 면역결힙증 바이러스 백신이 꼬리짧은 원숭이 (macaque)에서 보호를 제공할 수 있는 것으로 보고된 바 있다 (Stott et al. (1990) Lancet 36:1538-1541; Desrosiers et al. PNAS USA (1989) 86:6353-6357; Murphey-Corb et al. (1989) Science 246:1293-1297; and Carlson et al. (1990) AIDS Res. Human Retroviruses 6:1239-1246). 재조합 HIV gpl2O 백신이 침팬지에서 보호를 제공할 수 있는 것으로 보고된 바 있다 (Berman et al. (1990) Nature 345:622-625).

길들어진 고양이류 및 야생 고양이류 모두를 포함한, 고양이류는 다양한 미생물에 의한 감염에 민감성이다. 예를 들면, 고양이 전염성 복막염은 사자, 표범, 치타, 및 재규어와 같은 길들어진 및 야생형 고양이류 모두에서 발생하는 질병이다. 고양이류에서 이러한 및 다른 형태의 병원성 생물에 의하여 감염되는 것을 예방하는 것이 바람직한 경우, 본 발명의 방법이 고양이류에서 감염의 예방 또는 치료를 위하여 사용될 수 있다.

길들여진 고양이류는 고양이 백혈병 바이러스 (FeLV), 고양이 사코마 바이러스 (FeSV), 내생적 C 형 온고마바이러스 (oncomavirus) (RD-1 14), 및 고양이 합포체 형성 바이러스 (FeSFV)를 포함하나, 이들 예에 한정되는 것은 아닌 여러 레트로바이러스로 감염될 수 있다. 일들 중 FeLV은 림프망세포 및 골수종, 빈혈, 면역 매개 질병 및 인간 면역결핍증 (AIDS)과 유사한 면역결핍증을 포함한 다양한 증상을 야기시키는 가장 중요한 병원체이다. 최근, FeLV-AIDS로 명명된 특정한 복제 결함 FELV 돌연변이체가 면역억제성 특성과 더욱 더 구체적으로 연관되는 것으로 보고된 바 있다.

고양이 T-림프구지향성 렌티바이러스 (이하 고양이류 면역결핍증이라고도 한다)의 발견은 Pedersen et al. (1987) Science 235:790-793에 처음 보고되었다. FIV의 특징은 Yamamoto et al. (1988) Leukemia, December Supplement 2:204S-215S; Yamamoto et al. (1988) Am. J. Vet. Res. 49:1246-1258; and Ackley et al. (1990) J. Virol. 64:5652에 보고되었다. FIV의 클로닝과 서열분석은 Ohnsted et al. (1989) Proc. NatI. Acad. Sci. USA 86:2448-2452 및 86:4355-4360에 보고되었다.

고양이 전염성 복막염 (Feline Infectious Peritonitis) (FIP)은 길들여진 및 야생형 고양이류 (Felidae)에서 예측불가능하게 발생하는 산발성 질환이다. FIP은 주로 길들여진 고양이류의 질병이나, 사자, 산 사자, 표범, 치타 및 재규어에서 진단된 바 있다. FIP에 걸린 적이 있는 더 작은 야생형 고양이류에는 스라소니 및 및 카라칼 (caracal), 모래 고양이 (sand cat), 및 팔라스 고양이 (pallas cat)가 포함된다. 길들여진 고양이류에서, 모든 나이의 고양이류가 민감성지만, 상기 질병은 어린 동물에서 우세하게 일어난다. 발생 정점은 6 내지 12 개월 사이의 나이에서 일어난다. 5 내지 15 세 나이에서는 발병이 감소하고, 그 후 14 내지 15 세된 고양이류에서 발병이 증가하였다.

핀 피쉬 (fin-fish), 갑각류 (shellfish) 또는 다른 수생 생물 형태에서의 바이러스, 박테리아 및 기생충 질병은 양식 산업에 심각한 문제을 일으킨다. 부화 탱크 또는 가두리 해양 양식장에 있어서 동물이 고밀도로 존재하기 때문에, 감염성 질환은 예를 들면, 핀 피쉬, 갑각류, 또는 다른 수생 생물 형태 시설에 있는 군체의 많은 부분을 제거시킬 수 있다. 어류 면역 체계는 B 세포, T 세포, 림포카인 (lymphokine), 보조체 (complement), 및 면역글로불린이 존재하는 것과 같은, 포유동물 면역 체계와 유사한 많은 특징을 가지고 있다. 어류는 많은 관점에서 포유동물의 B 및 T 세포의 역할과 유사한 것 처럼 보이는 역할을 갖는 림프구 서브 클라스를 가지고 있다.

수산 양식 (aquaculture) 종에는 핀 피쉬, 갑각류, 및 다른 수생 동물이 포함되나, 여기에 한정되는 것은 아니다. 핀 피쉬에는 예를 들면, 연어 (salmonids), 잉어, 메기, 방어류, 도미, 및 바다배스와 같은 경골 어류 또는 연골 어류일 수 있는 모든 척추동물 어류가 포함된다. 연어류는 송어 (무지개 송어를 포함한), 연어, 및 아크틱 차 (Arctic char)를 포함하는 핀 피쉬 과의 일종이다. 갑각류의 예에는 대합조개, 바다가재, 새우, 게, 및 굴이 포함되나, 여기에 한정되는 것은 아니다. 다른 양식된 수생 동물에는 뱀장어, 오징어 및 낙지가 포함되나, 여기에 한정되는 것은 아니다.

일부 경우에 있어서 면역 자극성 핵산 및 치료학적 제제와 함께 항원을 투여하는 것이 바람직하고, 다른 경우에는 항원이 전달되지 않는다. 항원이 사용되는 경우, 항원은 바람직하게는 미생물 항원이다. 미생물 항원에는 세포, 세포 추출물, 단백질, 폴리펩티드, 펩티드, 다당류, 다당류 접합체, 다당류 및 다른 분자의 펩티드 및 비-펩티드 모사체 (mimics), 작은 분자, 지질, 당지질, 및 탄수화물이 포함되나, 여기에 한정되는 것은 아니다. 그러나, 단백질과 폴리펩티드가 일반적으로 탄수화물 또는 지방에 비하여 항원성이 더 크기 때문에, 많은 미생물 항원이 천연의 단백질 또는 폴리펩티드이다. 항원을 투여하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 일반적으로, 항원은 예를 들면, 정맥내, 근육내, 경구, 경피 (transdermal), 점막, 코안, 기관내 또는 피하 투여와 같은, 임의의 수단에 의하여 개체로 직접적으로 투여된다. 상기 항원은 전신적으로 또는 국부적으로 투여될 수 있다. 일부 바람직한 구체예에서, 상기 항원은 상기 면역 자극성 핵산에 접합되지 않은 것이다. 투여 방법은 아래 더 상세하게 설명되어 있다.

본 명세서에 사용된 "실질적으로 정제된 (substantially purified)"이라는 용어는 천연적으로 연관되어 있는 다른 단백질, 지질, 탄수화물 또는 다른 물질이 실질적으로 없는 분자 종을 의미한다. 당업자라면 단백질 정제를 위한 표준 방법을 사용하여, 폴리펩티드 예를 들면, 항원을 정제할 수 있다. 상기 실질적으로 정제된 폴리펩티드는 비환원 폴리아크릴아미드 겔 상에서 단일의 주요 밴드를 종종 형성한 다. 부분적으로 글리코실화되어 있는 폴리펩티드 또는 여러 개시 코돈을 갖는 폴리펩티드의 경우, 비환원 폴리아크릴아미드 겔 상에서 여러 밴드가 있을 수 있으나, 이들 밴드는 상기 폴리펩티드에 대하여 구분되는 패턴을 형성한다. 상기 폴리펩티드의 순도는 또한 아미노 말단 아미노산 서열 분석에 의하여 결정될 수 있다.

상기 미생물 항원이 투여되고 그 미생물 항원이 폴리펩티드인 경우, 상기 미생물 항원은 개체에 투여되었을 때 폴리펩티드의 형태일 수 있거나, 핵산 벡터에 의하여 코딩될 수 있다. 상기 핵산 벡터가 개체에 투여되는 경우, 상기 단백질은 인 비보에서 발현된다. 또한 폴리펩티드 미생물 항원의 일차 아미노산 서열의 사소한 개질에 의하여 개질되지 않은 대상 폴리펩티드와 비교하여, 실질적으로 동등한 항원 활성을 갖는 폴리펩티드가 얻어질 수 있다. 그러한 개질은 부위-지향 돌연변이 유발에 의한 것과 같이 고려되어지거나 자발적일 수 있다. 따라서, 그러한 개질을 갖는 핵산도 또한 포함된다. 핵산 벡터에 의하여 코딩되는 항원이 투여되는 경우, 상기 면역 자극성 핵산은 상기 항원을 포함하는 동일한 플라스미드 또는 발현 벡터가 아니다.

상기 항원을 코딩하는 핵산은 진핵 세포 내에서 단백질의 발현을 유도하는 유전자 발현 서열에 작동가능하게 연결되어 있다. 상기 "유전자 발현 서열 (gene expression sequence)"이란 작동가능하게 연결되어 있는 단백질의 효과적인 전사와 번역을 촉진하는, 프로모터 서열 또는 프로모터-인핸서 조합과 같은 임의의 조절성 뉴클레오티드 서열이다. 상기 유전자 발현 서열은 예를 들면, 구성적 또는 유도성 프로모터와 같이, 포유동물 또는 바이러스 프로모터일 수 있다. 구성적 포유동물 프로모터에는 하기 유전자를 위한 프로모터가 포함될 수 있으나, 여기에 한정되는 것은 아니다: 히포잔틴 포스포리보실 트란스퍼라제 (BPTR), 아데노신 데아미나제, 피루베이트 키나제, b-액틴 프로모터 및 다른 구성적 프로모터. 진핵 세포에서 구성적으로 기능하는 바이러스 프로모터의 예에는 예를 들면, 사이토메갈로바이러스 유래 프로모터 (CMV), 시미안 바이러스 (예, SV40), 파필로마 바이러스, 아데노바이러스, 인간 면역결핍증 바이러스 (HIV), 라우스 사코마 바이러스, 사이토메갈로바이러스, 몰로니 백혈병 바이러스 및 다른 레트로바이러스의 긴 말단 반복 (LTR) , 및 헤르페스바이러스 심플렉스 바이러스의 티미딘 키나제 프로모터. 다른 구성적 프로모터는 당업자에게 알려져 있다. 또한 본 발명의 유전자 발현 서열로서 유용한 프로모터에는 유도성 프로모터가 포함된다. 유도성 프로모터는 유도제의 존재하에서 발현된다. 예를 들면, 메탈로티오네인 (metallothionein) 프로모터가 특정한 금속 이온의 존재하에서 유도되어 전사와 번역을 촉진한다. 다른 유도성 프로모터는 당업자에게 알려져 있다.

본 발명의 면역 자극성 핵산과 치료학적 제제의 조합은 또한 암을 치료하고 예방하는데 유용하다. 현재의 암 치료는 주로 종양 세포에 대한 독성 특이성의 부족으로 인하여, 높은 수준의 환자 사망률과 연관될 뿐만 아니라, 너무 종종 비효율적이다. 본 발명의 조성물은 증진된 면역 반응을 촉진함으로써 더 효과적인 암 치료법을 제공한다. 상기 면역 반응은 항원 특이적이거나 선천 면역 반응 (비항원 특이적)일 수 있다. 일부 예에서, 본 발명의 면역 자극성 핵산과 치료학적 제제의 조합은 상승적이어서, 상기 제제를 개별적으로 사용하는 경우 예방되는 것 보다, 그의 상가적 효과 보다 더 큰 효과를 가져 온다.

따라서, 일 양상에 있어서, 본 발명은 암을 가지고 있는 개체 또는 암에 걸릴 위험이 있는 개체에 암을 예방하거나 치료하기에 효과적인 양으로 일부 형태의 상기 면역 자극성 핵산과 일부 형태의 상기 치료학적 제제를 투여하는 것과 관련되는 암을 치료하거나 예방하는 방법을 제공한다.

암 세포는 정상적인 성장 조절 기능의 상실로 인하여 비정상적으로 분열하고 증식하는 세포이다. 암 세포는 거의 대부분은 하나 이상의 유전적 돌연변이로부터 발생한다. 일부 예에서, 발현된 유전자 및 단백질의 프로필에 근거하는 것 뿐만 아니라 그 발현의 수준에 근거하여 암 세포를 대응 정상 세포로부터 구분할 수 있다. 암 세포에서 흔하게 영향을 받는 유전자에는 ras, neu/HER2/erbB, myb, myc 및 abl과 같은 발암 유전자 (oncogene) 뿐만 아니라, p53, Rb. DCC, RET 및 WT와 같은 종양 억제 유전자가 포함된다. 이들 유전자의 일부에서 있어서, 암과 관련된 돌연변이는 그들의 발현에 있어서의 감소 또는 완전한 결실을 유도한다. 다른 경우에 있어서, 돌연변이는 발현의 증가를 야기시키거나 정상 대응세포의 활성화된 변이체의 발현의 증가를 야기시킨다. 암 세포에 있어서 유전적 돌연변이는 일부 예에서 치료학적 제제의 표적일 수 있다. 예를 들면, 일부 약물은 암세포에서 하기 단백질 중 많은 단백질이 상향조절되거나 탈조절되어 있는 세포 주기 단백질 (예, 시클린 의존성 키나제), 텔로머라제 및 텔로머라제 관련 단백질, 및 종양 억제자 단백질과 같은 암세포 생존 및 분열에 필수적인 것으로 생각되는 단백질을 표적으로 한다.

"종양 (tumor)"이라는 용어는 문언적으로 "신 성장 (new growth)"을 의미하는 신생물 (neoplasm)과 보통 동격이고, "암 (cancer)"과 교환가능하게 사용된다. "신생물 병 (neoplastic disorder)"은 세포 증식, 구체적으로 신생물 (neoplasm)과 연관된 임의의 질환이다. "신생물 (neoplasm)"은 신생물의 모양을 개시시켰던 발암 인자를 제거한 후에도 지속하고 증식하는 조직의 비정상적 덩어리 (mass)이다. 양성과 악성의 두가지 형태의 신생물 (neoplasm)이 있다. 거의 모든 양성 종양은 피막으로 쌓여지고 비침습성이다: 대조적으로, 악성 종양은 거의 모두 피막으로 쌓여 있지 않으나, 침윤성 파괴성 성장에 의하여 이웃하는 조직을 침습한다. 이 침윤성 성장 후에 원래 종양과는 불연속적인 위치에서 종양 세포가 착상한다. 본 발명의 방법은 하기 질병을 포함하는 인간에서의 신생물 병을 치료하는데 사용될 수 있으나, 이들예에 한정되는 것은 아니다: 육종 (sarcoma), 암종 (carcinoma), 섬유종 (fibroma), 백혈병 (leukemia), 림프종 (lymphoma), 흑색종 (melanoma), 골수종 (myeloma), 신경모세포종 (neuroblastoma), 횡문근육종 (rhabdomyosarcoma), 망막모세포종 (retinoblastoma) 및, 신경아교종 뿐만 아니라 본 명세서에 개시된 다른 종양들의 각 종양.

본 명세서에 사용된 "암 (cancer)"은 신체 기관 및 시스템의 정상 기능을 방해하는 세포의 제어되지 않은 성장을 의미한다. 자신의 원래 위치로부터 이동하고 핵심 기관에 착상하는 암은 결국에는 영향을 받은 기간의 가능적 퇴화를 통하여 상기 개체의 죽음을 유도할 수 있다. 백혈병 (leukemia)과 같은 조혈 암 (hemopoietic cancer)은 개체에서 정상 조혈 기관 (compartment)과의 경쟁에서 이길 수 있어, 조혈 기능 이상을 (빈혈, 저혈소판증 및 호중성백혈구감소증의 형태로) 유도하여, 결국에는 죽음을 야기시킨다.

전이 (metastasis)는 일차 종양으로부터 신체의 다른 부분으로의 암 세포의 전파로부터 야기되는 일차 종양 위치로부터 구별되는, 암 세포의 영역이다. 상기 일차 종양 덩어리의 진단의 시점에서, 상기 개체는 전이의 존재에 대하여 모니터링될 수 있다. 전이는 특정한 증상의 모니터링에 더하여 자기공명영상 (Magnetic resonance imaging, MRI) 스캔, 컴퓨터단층 (computed tomography, CT) 스캔, 혈액 및 혈소판 계수, 간기능 검사, 가슴 X-레이 및 뼈 스캔의 단독 또는 조합된 사용을 통하여 가장 빈번하게 검출된다.

암에는 기저 세포 암종, 담도 암; 방광 암; 골육종; 뇌 및 중추신경계 암; 유방암; 경부암 ; 융모막암종 (choriocarcinoma); 결장 및 직장 암; 결합조직 암; 소화 체계의 암; 자궁내막암; 식도암 (esophageal cancer); 눈 암; 머리와 목의 암; 위암; 상피내암; 신장암; 후두암; 백혈병; 간암; 폐암 (예, 소세포 및 비소세포); 호치킨과 비호치킨 림프종을 포함하는 림프종; 흑색종; 골수종; 신경모세포종; 구강암 (예, 입술, 혀, 입 및 인두); 난소암; 췌장암; 전립선암; 망막모세포종; 횡문근육종; 직장암; 신장암; 호흡기 체계의 암; 육종; 피부 암; 위암; 고환암; 갑상선암; 자궁암; 비뇨기계의 암, 뿐만 아니라 다른 암종 및 육종을 포함하나, 여기에 한정되는 것은 아니다.

상기 면역 자극성 핵산 및 치료학적 제제는 개체에서 암의 치료 또는 예방을 위하여 유용하다. 본 발명은 인간 및 인간이 아닌 개체에서 암 및 종양을 치료하는데 유용하다. 암은 반려동물 (companion animal) (예, 고양이 및 개)에서 주용 사망 원인 중의 하나이다. 암은 가정 애완 동물의 경우에 있어서, 가족으로 동화된 나이 많은 동물을 보통 공격한다. 나이가 10 세 보다 많은 개의 45 %가 상기 질병으로 죽는다. 가장 흔한 치료 방법은 수술, 화학요법 및 방사선 요법이 포함된다. 일부 성공적으로 사용된 바 있는 다른 치료 방식은 레이저 치료, 냉동 요법, 온열요법 (hyperthermia), 및 면역 요법이다. 치료법의 선택은 암의 형태와 전파의 정도에 따라 달라진다. 악성 종양이 신체의 특정한 영역에 한정되어 있지 않으면, 정상 세포에 영향을 미치지 않고 악성 조직만을 제거하는 것은 어렵다.

개와 고양이에서 흔히 진단되는 악성 질환에는 림프육종, 골육종 (osteosarcoma), 유방 종양, 비만세포종 (mastocytoma), 뇌 종양, 흑색종, 선편평세포암종 (adenosquamous carcinoma), 카르시노이드 폐종양, 기관지샘 종양, 세기관지 샘암종 (adenocarcinoma), 섬유종 (fibroma), 점액연골종 (myxochondroma), 폐 육종 (pulmonary sarcoma), 신경육종 (neurosarcomna), 골종 (osteoma), 유두종 (papilloma), 망막모세포종, 이윙스 육종 (Ewing's sarcoma), 윌름스 종양 (Wilm's tumor), 버키트 림프종, 미세아교세포종, 신경모세포종, 파골세포종, 구강 암 (oral neoplasia), 섬유육종 (fibrosarcoma), 골육종 및 횡문근육종. 개의 다른 암에는 생식계 편평세포암종, 전염성 베너럴 (veneral) 종양, 고환종양, 정상피종양 (seminoma), 세르톨리 세포종, 혈관주위세포종 (hemangiopericytoma), 조직구종 (histiocytoma), 녹색종 (chloroma) (과립구성 육종), 각막 파필로마 (corneal papilloma), 각막 편평세포 암종, 혈관육종 (hemangiosarcoma), 흉막 중피종 (pleural mesothelioma), 기저세포암, 흉선종 (thymoma), 위암, 부신 암종, 경구 유두종증 (oral papillomatosis), 혈관내피종 (hemangioendothelioma) 및 낭성선종 (cystadenoma)이 포함되나, 여기에 한정되는 것은 아니다. 고양이에서 진단된 추가의 악성 종양에는 여포성 림프종, 내장 림프육종, 섬유육종 및 폐 편평세포 암종이 포함된다. 여전히 인기 있는 가정용 애완 동물인 족제비는 인슐린종, 림프종, 육종, 신경종, 췌장 섬세포종, 위 NLUT 림프종 및 위 선암종에 걸치는 것으로 알려져 있다.

농업 가축에 영향을 미치는 암에는 백혈병, 혈관주위세포종 및 소 안구 암 (소에서); 음경꺼플 섬유육종, 궤양성 편평세포 암종, 음경꺼플 암종, 결합조직 암 및 비만세포종 (mastocytoma) (말에서); 간세포성 암종 (돼지에서) ; 림프종 및 폐 샘종증 (adenomatosis) (양에서); 폐 육종, 림프종, 라우스 육종, 세망내피증 (reticuloendotheliosis), 섬유육종, 신장모세포종 (nephroblastoma), B-세포 림프종 및 임파구성 백혈병 (lymphoid leukosis) (조류 종에서); 망막모세포종 (retinoblastoma), 간의 종양, 림프육종 (림프모구림프종: lymphoblastic lymphoma), 형질구양 백혈병 (plasmacytoid leukemia) 및 부레 육종 (어류에서), 건락 루파데나이티스 (caseous lumphadenitis) (CLA): 박테리아 코리네박테리움 수도튜버쿨로시스 (Corynebacterium pseudotuberculosis)에 의하여 야기되는 양과 염소의 만성, 감염성, 전염성 질환 및 자아그시에크테 (jaagsiekte)에 의하여 야기되는 양의 전염성 폐 종양.

일 양상에서, 암을 치료하는 방법으로서 암을 가진 개체에 본 발명의 조성물을 투여하는 것과 관련되는 방법이 제공된다. "암을 가진 개체 (subject having cancer)"는 암으로 진단된 개체이다. 일 구체예에서, 상기 개체는 고체 덩어리 종양에 의하여 특징지워지는 암 형태를 갖는다. 상기 고체 종양 덩어리는, 만약 존재하는 경우, 일차 종양 덩어리일 수 있다. 일차 종양 덩어리는 조직의 정상 세포의 형질전환 (transformation)으로부터 야기되는 조직에서의 암 세포의 성장을 의미한다. 대부부의 경우에, 상기 일차 종양 덩어리는 육안 또는 촉진 방법을 통하여 확인되는 낭종의 존재에 의하여, 또는 모양의 불규칙성, 촉감 또는 조직의 무게에 의하여 확인된다.

그러나, 일부 일차 종양은 촉진될 수 없고 X-레이 (예, 마모그래피)와 같은 의학 영상 기법을 통하여, 또는 바늘 흡입 (aspiration)에 의하여만 검출되어질 수 있다. 초기 검출에 이들 후자의 방법의 사용이 더욱 흔하다. 조직 내에서의 암 세포의 분자적 및 표현형적 분석은 상기 암이 상기 조직에 내재적인지 또는 상기 상흔 (lesion)이 다른 부위로부터의 전이로 인한 것인지를 보통 확인하여 준다.

예방적 치료 방법에 관하여, 본 발명은 본 발명의 조성물을 암에 걸릴 위험이 있는 개체에 투여하는 것을 목적으로 하고 있다. 암에 걸릴 위험이 있는 개체는 암에 걸릴 높은 확율을 가진 개체이다.

이들 개체에는 예를 들면, 그 존재가 암에 걸릴 높은 개연성과 상관적 관계를 갖는 것으로 입증된 유전적 이상을 갖는 개체가 포함된다. 담배, 석면 또는 다른 화학 독소 (toxin)와 같은 암 유발 인자에 노출된 개체도 또한 본 명세서에서 사용된 암에 걸릴 위험이 있는 개체이다. 암에 걸릴 위험이 있는 개체가 면역 자극성 핵산 및 치료학적 제제로 월 단위와 같은 규칙적 단위로 치료되는 경우, 상기 개체는 상기 암에 대하여 연속적인 면역 반응을 일으킬 수 있다. 항원이 또한 암 특이적 면역 반응을 유도하기 위하여 사용될 수 있다. 종양이 개체 내에서 형성되기 시작하는 경우, 상기 개체는 하나 이상의 암 항원에 대하여 특이적 면역 반응을 일으킬 것이다. 본 발명의 이 양상은 상기 개체가 노출되어질 항원이 알려져 있는 경우 특히 이롭다. 예를 들면, 특히 암-유발 인자는 보통 특이적인 기관 또는 조직을 보통 우선적으로 표적으로 하기 때문에, 연속 기준 (ongoin basis)으로 암-유발 인자에 노출된 특정한 트레이드 (trade)에 채용된 개체가 본 발명에 따른 치료에 대한 이상적인 개체일 것이다. 예를 들면, 많은 공기 유래, 또는 흡입된 담배 연기 및 석면과 같은 발암물질 (carcinogen)은 폐 암과 연관되어 있다. 개체가 수동적으로 발암물질에 노출되는 상기 방법은 상기 면역 자극성 핵산 및 상기 치료학적 제제의 투여의 시기, 바람직하게는 암 백신 (예, 암 항원)의 형태에 특히 의존될 수 있다. 예를 들면, 암에 걸릴 위험이 있는 개체에서, 그 위험이 가장 큰 경우, 즉, 암 유발 인자에 노출된 후에 상기 개체는 규칙적 단위로 상기 면역 자극성 핵산 및 암 항원을 포함하는 상기 암 백신으로 투여될 수 있다.

상기 면역 자극성 핵산 및 치료학적 제제는 암 약물과 조합되어 또한 투여될 수 있다. 본 명세서에서, "암 약물 (cancer medicament)"이란 암을 치료할 목적으로 투여되는 제제를 의미한다. 본 명세서에 사용된, "암을 치료하는 (treating cancer)"에는 암의 발달을 예방하는 것, 암의 증상을 감소시키는 것, 및/또는 확립된 암의 성장을 억제하는 것을 포함한다. 다른 양상에서, 상기 암 약물은 암에 걸릴 위험을 감소시킬 목적으로 암에 걸릴 위험이 있는 개체에게 투여된다. 암 약물은 화학 요법제, 면역요법제, 암 백신, 호르몬 치료 및 생물학적 반응 개질자 (modifier)와 같은 카테고리를 포함한다. 암 약물에는 또한 개체에서 종양 또는 암 부하 (burden) (즉, 암 또는 종양 세포의 수)을 감소시키기 보다, 암의 증상을 감소시키기 위하여 개체에 투여되는 제제가 포함된다. 이 후자 형태의 암 약물의 일 예는 적혈구 및/또는 혈소판을 정상 범위에 유지하기 위하여 암을 갖는 개체에 투여되는 혈액 수혈 (blood transfusion)이다. 예를 들면, 그러한 수혈의 부존재하에서, 정상 수준 미만의 혈소판을 가지고 있는 암 환자는 제어되지 않은 출혈 (bleeding)의 위험에 놓여 있는 것이다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, 암 항원은 암 세포에 의하여 발현되는 항원으로서 널리 정의된다. 바람직하게는, 상기 항원은 암 세포의 표면에서 발현된다. 더욱 바람직하게는, 상기 항원은 정상 세포에 의하여 발현되지 않거나, 적어도 암 세포에서 발현되는 수준과 동일한 수준으로는 발현되지 않는 항원이다. 예를 들면, 일부 암 항원은 정상 세포에서 보통 침묵하고 (즉, 발현되지 않음), 일부 암 항원은 분화의 특정한 단계서만 발현되고, 다른 항원은 배아 및 태아 항원과 같이 일시적으로 발현된다. 다른 암 항원은 발암 유전자 (예, 활성화된 ras 발암 유전자), 억제자 유전자 (예, 돌연변이 p53), 내부 결실 또는 염색체 전치 (translocation)로부터 야기되는 융합 단백질와 같은 돌연변이 세포성 유전자에 의하여 코딩된다. 또다른 암 항원은 RNA 및 DNA 종양 바이러스 상에 가지고 있는 것과 같은 바이러스 유전자에 의하여 코딩될 수 있다. 정상 세포와 암 세포에서 암 항원의 차등적 발현은 암 세포를 표적화하기 위하여 이용될 수 있다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, "암 항원 (cancer antigen)" 및 "종양 항원 (tumor antigen)"이란 용어는 교환가능하게 사용된다.

본 발명의 다른 양상에서, 단독 또는 상기 치료학적 제제와 조합된, 면역 자극성 핵산의 핵산은 효과적인 항원 특이적 면역 반응을 생성하기 위하여 보통 투여될 수 있는 것 보다 더 작은 용량의 항원이 투여되도록 한다. 따라서, 상기 면역 자극성 핵산은 더 낮은 서브 치료학적 용량의 상기 항원을 투여하도록 하나, 그러한 낮은 용량으로 사용된 경우 보다 더 높은 효능으로 투여되도록 한다. 일 실시예로서, 알럼과 같은 종래 보조제와 조합되어 사용되는 경우 비효과적일 수 있는 항원 용량으로 면역 자극성 핵산을 투여함으로써, 당업자가 그 용량의 항원이 치료학적 이득 (예, 서브 치료학적 용량)을 제공할 것을 예상하지 못할 정도의, 항원에 대한 효과적인 면역 반응을 달성할 수 있다.

본 명세서에 사용된 "면역 자극성 핵산 (immunostimulatory nucleic acid)"란 면역 반응을 유도하는 면역 자극성 모티프 또는 골격을 포함하는 임의의 핵산이다. 상기 면역 반응은 Th1-형 면역 반응 또는 Th2-형 면역 반응으로 특징지워질 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다. 그러한 면역 반응은 활성화된 면역 세포에 의하여 유도되는 사이토카인과 항체 생산 프로필에 의하여 정의된다.

헬퍼 (CD4+) T 세포는 다른 T 세포를 포함한, 다른 면역 체계 세포에 작용하는 용해성 인자의 생산을 통하여 포유동물의 면역 반응을 전체적으로 조절한다. 헬퍼 CD4+ 및 일부 예에서는 CD8+ T 세포는 사이토카인 생산 프로필에 따라, 생쥐 및 인간 시스템 모두에 있어서 Th1 및 Th2 세포로서 특징지워진다 (Romagnani, 1991, Immunol. Today 12: 256-257, Mosamann, 1989, Annu. Rev. Immunol., 7: 145-173). Th1 세포는 인터루킨 2 (IL-2), IL-12, 종양괴사인자 (TNFα) 및 인터페론 (IFN-γ)을 생산하고 지연형 관민성 반응과 같은 세포 매개 면역에 주로 관여한다. 상기 면역 자극성 핵산의 투여에 의하여 유도되는 상기 사이토카인은 Th1 부류가 우세하다. Th1 반응과 연관된 항체의 형태가 높은 중화 및 옵손화 능력을 가지고 있기 때문에 일반적으로 더 보호성이 강하다. Th2 세포는 IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10 및 IL-13을 생산하고 IgE 및 IgG4 항체 이소타입 전환과 같은 체액성 면역 반응를 위하여 최적의 도움을 제공하는데 주로 연관된다 (Mosmann, 1989, Annu. Rev. Immunol., 7 :145-173). Th2 반응은 감염에 대하여 보호 효과가 적은 항체와 주로 관련된다.

"핵산 (nucleic acid)" 및 "올리고뉴클레오티드 (oligonucleotide)"란 용어는 복수의 뉴클레오티드 (즉, 포스페이트 기 및 치환된 피리미딘 (예, 시토신 (C), 티민 (T), 또는 우라실 (U)) 또는 치환된 푸린 (예, 아데닌 (A), 또는 구아닌 (G))인 교환가능한 유기 염기에 연결된 당 (예, 리보즈 또는 데옥시리보즈)을 포함하는 분자)를 의미하기 위하여 교환가능하게 사용된다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 상기 용어는 올리고리보뉴클레오티드 뿐만 아니라 올리고데옥시리보뉴클레오티드 를 의미한다. 상기 용어는 또한 폴리뉴클레오시드 (즉, 폴리뉴클레오티드 - 포스페이트) 및 임의의 다른 유기 염기 함유 중합체를 포함한다. 핵산에는 올리고뉴클레오티드 뿐만 아니라, 벡터, 예를 들면, 플라스미드가 포함된다. 핵산 분자는 기존 핵산 분리원 (예, 분리된 핵산으로 불리어지는, 게놈 또는 cDNA)으로부터 얻어질 수 있으나, 바람직하게는 합성 (예, 올리고뉴클레오티드 합성에 의하여 생산)된다.

면역 자극성 핵산은 CpG 모티프, 및 폴리 G-모티프와 같은 면역 자극성 모티프를 가질 수 있다. 본 발명의 일부 구체예에서, 확인가능한 모티프를 가지고 있는지와는 상관없이, 임의의 핵산이 상기 조합 치료에 사용되어 면역 반응을 유도할 수 있다. 면역 자극성 골격에는 포스포로티오에이트 골격과 같은 포스페이트 개질 골격이 포함되나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다. 면역 자극성 핵산은 선행기술에서 광범위하게 설명되어 있으며, 아래에 이들 핵산에 대하여 간단하게 요약하였다. 본 발명의 대부분의 양상, 특히 암을 가지거나 암에 걸릴 위험이 있는 개체를 치료 것을 목적으로 하는 본 발명의 양상은, T-부유 또는 메틸화된 CpG 핵산 (즉, T-부유 또는 메틸화 CpG 모티프를 가지는 핵산)을 사용하는 것을 포함하지 않는다.

일부 구체예에서, CpG 면역 자극성 핵산은 본 발명의 방법에 사용된다. CpG 면역 자극성 핵산은 C 잔기가 메틸화되지 않은 CG 디뉴클레오티드를 포함하는 핵산이다. CpG 면역 자극성 핵산은 Th1-형 면역 반응을 자극하는 것으로 알려져 있다. 인간 DNA에서 상대적으로 희귀한 CpG 서열은 박테리아와 감염성 생물의 DNA에는 흔하게 발견된다. 인간 면역 체계는 외견상으로 감염의 초기 경고 신호로서 CpG 서열을 인지하고 다른 면역 자극제에서 흔히 관찰되는 부작용을 유발하지 않으면서 침범하는 병원체에 대항하여 즉각적이고 (immediate) 강력한 면역 반응을 개시하도록 진화되었다. 따라서, 이 선천성 면역 방어 체계에 의존하는, CpG 함유 핵산은 면역 치료를 위하여 독특하고 천연적인 경로를 이용할 수 있다. CpG 핵산이 면역 조절에 미치는 영향은 미국특허 제6,194,388호 및 PCT US95/01570, PCT/US97/19791, PCT/US98/03678, PCT/US98/10408, PCT/US98/04703, PCT/TJS99/07335, 및 PCT/US99/09863과 같은, 공개된 특허출원에 광범위하게 개시되어 있다. 이들 발행된 특허 및 특허 출원의 각각의 전체 내용은 원용에 의하여 본 명세서에 포함되어진다.

CpG 핵산은 하나 이상의 메틸화되지 않은 CpG 디뉴클레오티드를 포함하는 핵산이다. 하나 이상의 메틸화되지 않은 CpG 디뉴클레오티드를 포함하는 핵산은 시토신-구아닌 디뉴클레오티드 서열 (즉, CpG DNA 또는 5' 시토신 다음에 3' 구아노신을 포함하고 포스페이트 결합에 의하여 연결된 DNA)에 메틸화되지 않은 시토신을 포함하는 핵산 분자이고 면역 체계를 활성화한다. 상기 CpG 핵산은 이중가닥 또는 단일가닥일 수 있다. 일반적으로, 인 비보에서 이중가닥이 더 안정하나, 단일가닥 분자가 증가된 면역 활성을 갖는다. 따라서 본 발명의 일부 양상에 있어서 상기 핵산이 단일가닥인 것이 바람직하고, 다른 양상에 있어서 상기 핵산이 이중가닥인 것이 바람직하다. 본 명세서에 사용된 CpG 핵산 또는 CpG 올리고뉴클레오티드라는 용어는 달리 언급이 없으면 면역 자극성 CpG 핵산을 의미한다. 상기 전체 면역 자극성 핵산이 메틸화되어 있지 않거나 일부분이 메틸화되어 있지 않을 수 있으나, 상기 5' CG 3'의 적어도 C는 메틸화되어 있지 않아야 한다.

바람직한 일 구체예에서 상기 발명은 적어도 하기 식으로 표시되는 CpG 핵산인 면역 자극성 핵산을 제공한다:

5′-X₁X₂CGX₃X₄-3′

상기 X₁, X₂, X₃, 및 X₄는 뉴클레오티드이다. 일 구체예에서, X₂는 아데닌, 구아닌, 시토신, 또는 티민이다. 또다른 구체예에서, X₃은 시토신, 구아닌, 아데닌 또는 티민이다. 다른 구체예에서, X₂는 아데닌, 구아닌, 또는 티민이고 X₃는 시토신, 아데닌, 또는 티민이다.

또다른 구체예에서 상기 면역 자극성 핵산은 적어도 하기 식을 갖는 분리된 CpG 핵산이다:

5′-N₁X₁X₂CGX₃X₄N₂-3′

상기 X₁, X₂, X₃, 및 X₄는 뉴클레오티드이고 N는 임의의 뉴클레오티드이고 N₁과 N₂는 각각 약 0-25 N으로 구성되는 핵산 서열이다. 일 구체예에서, X₁X ₂는 아래 뉴클레오티드로 구성되는 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드이고: GpT, GpG, GpA, ApA, ApT, ApG, CpT, CpA, CpG, TpA, TpT, 및 TpG; X₃X₄는 하기 뉴클레오티드로 구성되는 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드이다: TpT, ApT, TpG, ApG, CpG, TpC, ApC, CpC, TpA, ApA, 및 CpA. 바람직하게는, X₁X₂은 GpA 또는 GpT이고 X₃ X₄는 TpT이다. 다른 구체예에서 X₁ 또는 X₂ 또는 둘다는 푸린이고 X₃ 또는 X ₄ 또는 둘다는 피리미딘이거나 X₁X₂는 GpA이고 X₃ 또는 X₄ 또는 둘다는 피리미딘이다. 또다른 바람직한 구체예에서 X₁X₂는 TpA, ApA, ApC, ApG, 및 GpG로 구성되는 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드이다. 또 다른 구체예에서, X₃X₄는 TpT, TpA, TpG, ApA, ApG, ApC, 및 CpA로 구성되는 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드이다. 또다른 구체예에서, X₁X₂는 TpT, TpG, ApT, GpC, CpC, CpT, TpC, GpT 및 CpG로 구성되는 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드이다.

또다른 바람직한 구체예에서, 상기 면역 자극성 핵산은 서열 5′-TCN₁TX₁X₂CGX₃X₄-3′을 갖는다. 일 구체예에서 본 발명의 상기 면역 자극성 핵산은 GpT, GpG, GpA 및 ApA로 구성되는 군으로부터 선택되는 X₁X₂를 포함하고, X₃ X₄는 TpT, CpT 및 TpC로 이루어지는 군으로부터 선택된다.

세포 내로의 섭취를 촉진하기 위하여, 상기 면역 자극성 핵산은 바람직하게는, 길이가 6 내지 100 염기의 범위이다. 그러나, 6 뉴클레오티드 이상의 임의의 크기의 핵산 (심지어는 많은 kb 길이)이 충분한 면역 자극성 모티프가 존재하는 경우 본 발명에 따른 면역 반응을 유도할 수 있다. 바람직하게는, 상기 면역 자극성 핵산은 크기가 8 내지 100 뉴클레오티드의 범위이고, 일부 구체예에서 5 내지 50 뉴클레오티드 또는 8 내지 30 뉴클레오티드의 범위이다.

"회문 서열 (palindromic sequence)"이란 역-반복 (inverted repeat) (즉, A와 A′이 통상의 왓슨-크리크 염기쌍을 형성할 수 있는 ABCDEE'D'C'B'A'와 같은 서열)을 의미한다. 인 비보에서 그러한 서열은 이중가닥 구조를 형성할 수 있다. 일 구체예에서, 상기 CpG 핵산은 회문 서열을 포함한다. 이 문맥에서 사용되는 회문 서열은 상기 CpG가 상기 회문 (palindrom)의 일부이고, 바람직하게는, 상기 회문의 중앙인 회문을 의미한다. 또다른 구체예에서, 상기 CpG 핵산은 회문이 없다. 회문이 없는 면역 자극성 핵산은 상기 CpG가 상기 회문의 일부분이 아닌 핵산이다. 그러한 올리고뉴클레오티드는 상기 CpG가 상기 회문의 중앙이 아닌 회문을 포함할 수 있다.

본 발명의 일부 구체예에서, 비-CpG 면역 자극성 핵산이 사용된다. 비-CpG 면역 자극성 핵산은 상기 C가 메틸화되어 있는지 또는 되어 있지 않은 상기 디뉴클레오티드인지 여부와는 상관없이, 그 서열에 CpG 모티프를 가지지 않은 핵산이다. 비-CpG 면역 자극성 핵산은 그의 서열, 투여되는 그의 전달 방법 및 투여량에 따라, Th1 또는 Th2 면역 반응을 유도할 수 있다.

비-CpG 면역 자극성 핵산의 중요한 서브세트는 폴리-G 면역 자극성 핵산이다. Pisetsky and Reich, 1993 MoL BioL Reports, 18:217-221; Krieger and Herz, 1994,,4nn. Rev. Biochem., 63:601637; Macaya et al., 1993, PNAS, 90:3745-3749; Wyatt et al., 1994, PM4S, 91:1356-1360; Rando and Hogan, 1998, In Applied Antisense Oligonucleotide Technology, ed. Krieg and Stein, p. 335-352; and Kimura et al., 1994, J Biochem. 116, 991-994를 포함한, 다양한 참고문헌이 또한 폴리-G 핵산의 상기 면역 자극성 특성을 기술하고 있다. 본 발명의 일 양상에 따르면, 폴리-G 함유 뉴클레오티드는 특히, 박테리아, 바이러스 및 진균 감염을 치료하고 예방하는데 유용하며, 그에 따라 이들 감염이 암 환자의 치료에 미치는 충격을 최소화하는 사용될 수 있다.

폴리-G 핵산은 바람직하게는, 하기 식을 갖는 핵산이다 :

5′-X₁X₂GGGX₃X₄-3′

상기 X₁, X₂, X₃, 및 X₄는 뉴클레오티드이다. 바람직한 구체예에서, X3 및 X4 중 적어도 하나는 G이다. 다른 구체예에서, X3 및 X4 둘다 G이다. 또다른 구체예에서, 상기 바람직한 식은 N이 0 내지 20 뉴클레오티드를 나타내는 5'-GGGNGGG-3', 또는 5'-GGGNGGGNGGGG-3'이다. 다른 구체예에서, 상기 폴리-G 핵산은 예를 들면, 상기 서열번호 95 내지 서열번호 133의 핵산과 같은, 메틸화되지 않은 CpG 디뉴클레오티드가 없다. 다른 구체예에서, 상기 폴리-G 핵산은 예를 들면, 서열번호 46, 서열번호 47, 서열번호 58 및 서열번호 61과 같은 하기하는 핵산과 같은, 하나 이상의 메틸화되지 않은 CG 디뉴클레오티드를 포함한다.

그러한 모티프를 포함하는 T-부유 모티프 및 핵산은 공개된 PCT 특허 출원 WO 01/22972 및 2000년 9월 25일 출원된 관련 미국특허 출원 제09/669,187호에 개시되어 있으며, 원용에 의하여 그 전체가 본 명세서에 포함되어진다.

면역 자극성 핵산 서열의 예에는 하기 표 1에 나타낸 면역 자극성 서열을 갖는 핵산이 포함되나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다:

표 1.

본 발명에 사용하기 위하여, 상기 면역 자극성 핵산은 당업계에 잘 알려진 많은 방법 중 임의의 방법을 사용하여 새로 (de novo) 합성되어질 수 있다. 그러한 화합물은 "합성 (synthetic)" 핵산으로 불리어진다. 예를 들면, b-시아노에틸 포스포아미다이트 방법 (Beaucage, S.L., and Caruthers, M.H., Tet. Let. 22:1859, 1981); 뉴클레오시드 H-포스포네이트 방법 (Garegg et aL, Tet. Let. 27:4051-4054, 1986; Froehler et al., NucL Acid. Res. 14:5399-5407, 1986, ; Garegg et aL, Tet. Let. 27:4055-4058, 1986, Gaffney et aL, Tet. Let. 29:2619-2622, 1988). 이들 화학 반응은 시장에서 구입가능한 다양한 자동화된 올리고뉴클레오티드 합성기에 의하여 수행될 수 있다. 이들 핵산은 합성 핵산으로서 불리어진다. 또한, 면역 자극성 핵산은 플라스미드로 대량으로 생산될 수 있으며, (Sambrook, T., et aL, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor laboratory Press, New York, 1989 참조), 작은 분량으로 분리되거나 전체로 투여될 수 있다. 핵산은 제한효소, 엑소뉴클레아제 또는 엔도뉴클레아제를 이용하는 방법과 같은, 알려진 방법을 사용하여 기존 핵산 서열 (예, 게놈 또는 cDNA)로부터 제조될 수 있다. 이 방법으로 제조된 핵산은 분리된 핵산으로 불리어진다. "면역 자극성 핵산 (immunostimulatory nucleic acid)"에는 합성 및 분리된 면역 자극성 핵산이 모두 포함된다.

인 비보에서 사용하기 위하여, 핵산은 분해에 대하여 상대적으로 저항성 (예, 안정화되어 있는)인 것이 바람직하다. "안정화된 핵산 분자 (stabilized nucleic acid molecule)"는 인 비보 (예, 엑소- 또는 엔도-뉴클레아제를 통한) 분해에 상대적으로 저항성인 핵산 분자를 의미한다. 안정화는 길이 또는 2차 구조의 기능일 수 있다. 수십 내지 수백 kb 길이인 면역 자극성 핵산은 상대적으로 인 비보 분해에 대하여 저항성이다. 더 짧은 면역 자극성 핵산에 대하여, 2차 구조가 안정화시키고 그 효과를 증가시킬 수 있다. 예를 들면, 핵산의 3′말단이 상류 영역에 자기 상보적이어서, 뒤로 접혀질 수 있어 일종의 스템 루프 구조를 형성할 수 있는 경우, 상기 핵산은 안정화되고 그에 따라 더 높은 생물학적 인 비보 활성을 보인다.

또한, 핵산 안정화는 골결 개질을 통하여 수반될 수 있다. 본 발명의 바람직한 안정화된 핵산은 개질된 골격을 갖는다. 핵산 골격의 개질은 인 비보에 투여되는 경우 상기 면역 자극성 핵산의 증진된 활성을 제공하는 것으로 입증된 바 있다. 개질된 골격의 한 가지 형태는 포스페이트 골격 개질이다. 2 이상의 상기 올리고뉴클레오티드의 5′말단에서의 포스포로티오에이트 결합 및 복수의 3′에서의 포스포로티오에이트 결합, 바람직하게는 5 개 결합을 포함하는, 면역 자극성 핵산은 일부 환경에 있어서 최대 활성을 제공하여 세포내 엑소 및 엔도 뉴클레아제에 의한 분해로부터 핵산을 보호한다. 다른 포스페이트 개질된 핵산에는 포스포디에스테르 개질된 핵산, 포스포디에스테르와 포스포로티오에이트 핵산의 조합, 메틸포스포네이트, 메틸포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 및 그들의 조합이 포함된다. CpG 핵산에서 이들 각각의 조합 및 이들이 면역 세포에 미치는 특정한 효과는 미국특허 제6,194,388호; 제6,207,646호, 및 제6,239,116호에 개시되어 있으며, 원용에 의하여 그 전체로서 본 명세서에 포함되어진다. 특정한 이론에 한정시키고자 하는 의도는 아니지만, 이들 포스페이트 개질된 핵산은 증진된 뉴클레아제 저항성, 증가된 세포 섭취, 증가된 단백질 결합, 및/또는 변화된 세포내 위치로 인하여 더 자극적 활성을 나타낼 수 있다고 여겨지고 있다.

포스포로티오에이트와 같은 개질된 골격은 포스포아미다이트 또는 H-포스포네이트 법을 이용하는 자동화된 방법을 사용하여 합성될 수 있다. 아릴 및 알킬 포스포네이트가 예를 들면, 미국특허 제4,469,863호에 개시된 바와 같이, 제조될 수 있다. 미국특허 제5,023,243호와 유럽특허 제092,574호에 개시된 바와 같이 전하를 띤 산소 부위가 알킬화되어 있는, 알킬포스포트리에스테르가 상업적으로 이용가능한 시약을 사용하여 자동화된 고상 합성에 의하여 제조될 수 있다. 다른 DNA 골격 개질 및 치환을 제조하는 방법은 개시되어 있다 (Uhlmann, E. and Peyman, A., Cliem. Rev. 90:544, 1990; Goodchild, J., Bioconjugate Chem. 1: 165, 1990).

포스포로티오에이트 및 포스포디에스테르 핵산을 모두 포함하는 면역 자극성 모티프는 면역세포에서 활성이 있다. 그러나, 면역 자극성 핵산 특이적 효과를 유도하는데 필요한 농도에 근거하여, 상기 뉴클레아제 저항성 포스포로티오에이트 골격 면역 자극성 핵산이 포스포디에스테르 골격 면역 자극성 핵산 보다 더 강력하다. 예를 들면, 2 ㎍/ml 의 포스포로티오에이트가 90 ㎍/ml의 포스포디에스테로와 동일한 면역자극 효과를 나타내었다.

본 발명에 따라 유용한, 또다른 형태의 개질된 골격은 펩티드 핵산이다. 상기 골격은 아미노에틸글리신으로 구성되고 DNA 특성을 제공하는 염기를 지지한다. 상기 골격은 어떠한 포스페이트도 포함하고 있지 않아서, 선택적으로 전하를 띠지 않을 수 있다. 전하의 결여는 두 가닥 사이에 전하 반발이 존재하지 않기 때문에 더 강하게 DNA-DNA 결합이 이루어지도록 한다. 더욱이, 상기 골격은 추가의 메틸렌 기를 가지고 있기 때문에, 상기 올리고뉴클레오티드는 효소/프로테아제 저항성이다. 펩티드 핵산은 다양한 상업적 구입원, 예를 들면, 퍼킨 엘머 (Perkin Elmer)로부터 구입되거나, 새로 합성되어질 수 있다.

골격 개질의 또다른 부류에는 2'-O-메틸리보뉴클레오시드 (2'-Ome)가 포함된다. 이들 형태의 치환은 선행기술에 광범위하게 개시되어 있으며, 특히 그들의 면역 자극 특성에 관하여 Zhao et al., Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters, 1999, 9:24:3453에 개시되어 있다. Zhao 등의 문헌에는 핵산에 2'-Ome 개질을 제조하는 방법이 개시되어 있다.

본 발명의 핵산 분자는 개질된 골격 뿐만 아니라, 천연 또는 합성 퓨린 또는 피리미딘 헤테로환 염기를 포함할 수 있다. 퓨린 또는 피리미딘 헤테로환 염기에는 아데닌, 구아닌, 시토신, 티미딘, 우라실, 및 이노신을 포함하나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다. 다른 대표적 헤테로환 염기는 Merigan의 미국특허 제3,687,808호에 개시되어 있다. 본 명세서에 사용된 "퓨린 (purines)" 또는 "피리미딘 (pyrimidines)" 또는 "염기 (bases)"는 천연 또는 합성 퓨린, 피리미딘 또는 염기 모두를 의미한다.

다른 안정화된 핵산에는 (상기 전하를 띤 포스포네이트 산소가 알킬 또는 아릴 기에 의하여 치화된) 알킬 및 아릴포스페이트, 상기 전하를 띤 산소 부위가 알킬화된 포스포디에스테르 및 알킬포스포트리에스테르와 같은, 비이온성 DNA 유사체가 포함된다. 양말단의 어느 한 쪽 또는 양말단 모두에 테트라에틸렌글리콜 또는 헥사에틸렌글리콜과 같은, 디올을 포함하는 핵산도 또한 뉴클레아제 분해에 대하여 실실적으로 저항성을 보였다.

일부 구체예에서 본 발명에 따라 유용한 골격 개질을 갖는 상기 면역 자극성 핵산은 S- 또는 R-회전성 (chiral) 면역 자극성 핵산이다. 본 명세서에 사용된 "S 회전성 면역 자극성 핵산 (S chiral immunostimulatory nucleic acid)"이란 2 이상의 뉴클레오티드가 키랄 중심 (chiral center)을 형성하는 골격 개질을 가지고 있고 키랄 중심의 75 % 이상이 S 키랄성을 가지고 있는 면역 자극성 핵산이다. 본 명세서에 사용된 "R 회전성 면역 자극성 핵산 (R chiral immunostimulatory nucleic acid)"이란 2 이상의 뉴클레오티드가 키랄 중심 (chiral center)을 형성하는 골격 개질을 가지고 있고 키랄 중심의 75 % 이상이 R 키랄성을 가지고 있는 면역 자극성 핵산이다. 상기 골격 개질은 키랄 중심을 형성하는 임의의 형태의 개질일 수 있다. 상기 개질에는 포스포로티오에이트, 메틸포스포네이트, 메틸포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 2′-Ome 및 그들의 조합이 포함되나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다.

상기 키랄 면역 자극성 핵산은 골격 개질을 가진 상기 핵산 내에 2 개 이상의 뉴클레오티드를 가지고 있어야만 한다. 그러나, 상기 뉴클레오티드의 모든 또는 모든 뉴클레오티드 이하의 뉴클레오티드가 개질된 골격을 가질 수 있다. 개질된 골격을 갖는 뉴클레오티드 (이하 키랄 중임이라 한다) 중에서, 75 % 이상이 단일 키랄성 S 또는 R을 갖는다. 따라서, 상기 키랄 중심의 75 % 이상이 S 또는 R 키랄성을 갖는 한 모든 키랄 중심 미만의 키랄 중심이 S 또는 R 키랄성을 갖는다. 일부 구체예에서, 상기 키랄 중심의 80,%, 85%, 90%, 95%, 또는 100% 이상이 S 또는 R 키랄성을 갖는다. 다른 구체예에서, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100% 이상의 뉴클레오티드가 골격 개질을 갖는다.

상기 S 또는 R 키랄성 면역 자극성 핵산은 키랄적으로 순수한 올리고뉴클레오티드를 생산하기 위하여 당업계에 알려진 임의의 방법에 의하여 제조될 수 있다. Stec 등은 옥사티아포스포란 (oxathiaphospholane)을 사용하여 입체순수한 포스포로티오에이트 올리고데옥시뉴클레오티드를 생산하는 방법을 개시하고 있다 (Stec, W.J., et al., 1995, J. Am. Chem. Soc., 1 1 7:12019). 키랄적으로 순수한 올리고뉴클레오티드를 제조하는 다른 방법은 ISIS Pharmaceuticals과 같은 회사에 의하여 개시되었다. 입체 순수한 올리고뉴클레오티드를 생성하기 위한 방법을 개시하는 미국특허에는 5883237, 5837856, 5599797, 5512668, 5856465, 53590523, 5506212, 5521302 및 5212295가 포함되며, 이들 각 특허는 원용에 의하여 본 명세서에 포함되어진다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, 면역 자극성 핵산의 투여는 프로필, 서열, 골격 개질 및 생물학적 효과의 관점에서 다르거나 다르지 않을 수 있는 하나 이상의 면역 자극성 핵산의 투여를 포함하는 의도이다. 예로서, CpG 핵산 및 폴리-G 핵산은 단일 개체에 투여될 수 있다. 또다른 실시예에서, 뉴클레오티드 서열이 다른 복수의 CpG 핵산이 또한 개체 투여될 수 있다.

본 발명의 상기 치료학적 제제는 수 중 유 에멀션이다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 상기 수 중 유 에멀션이라는 용어는 물 중에 현탁된 미세한 기름 방울의 비균질 혼합물로 구성되는 액체를 나타낸다. 수 중 유 에멀션은 당업계에 잘 알려져 있다. 하나의 바람직한 수 중 유 에멀션은 EMULISGEN^TM (MPV Laboratories에 의하여 판매, Nebraska, 미국)라는 상표명으로 팔리고 있다.

면역 자극성 핵산의 "효과적인 양 (effective amount)"이란 용어는 원하는 생물학적 효과를 실현하기 위하여 필요하거나 충분한 양을 의미한다. 예를 들면, 면역 자극성 핵산의 효과적인 양은 잠재적으로 항원 특이적 면역 반응이 생기도록 하는, 면역 체계의 활성화를 야기시키기 위하여 필요한 양일 수 있다. 본 발명의 일부 양상에 따르면, 효과적인 양은 암 또는 감염성 질환의 예방 또는 치료에 있어서, 조합되거나 공동 투여되는 경우, 면역 자극성 핵산의 효과적인 양 및 치료학적 제제의 효과적인 양이다. 상승적 양은 상기 면역 자극성 핵산 및 상기 치료학적 제제 어느 하나 단독의 개별적 효과의 합 보다 큰 반응을 생성하는 상승적 양이다. 예를 들면, 면역 자극성 핵산 및 치료학적 제제의 상승적 조합은 상기 성분 (즉, 상기 핵산 및 약물) 각각을 개별적으로 사용하여 얻을 수 있었던 조합된 생물학적 효과 보다 더 큰 생물학적 효과를 제공한다. 상기 생물학적 효과는 암 또는 감염성 질환으로부터 야기되는 증상의 개선 및/또는 절대적 제거일 수 있다. 또다른 구체예에서, 상기 생물학적 효과는 예를 들면, 종양의 부재 또는 암 세포가 없는 생검 또는 혈액 표본 (smear)에 의하여 입증되는 바와 같은, 상기 암 또는 감염성 질환의 완전한 폐기이다.

암 또는 감염성 질환의 치료에 있어서 또는 암 또는 감염성 질환에 걸릴 위험을 감소시키는데 있어서 치료학적 제제와 상승적으로 작용하기에 필요한 면역 자극성 핵산의 상기 효과적인 양은 상기 면역 자극성 핵산의 서열, 상기 핵산의 골격 구성, 및 상기 핵산의 전달 방법에 따라 달라질 수 있다. 임의의 특정한 적용을 위하여 상기 효과적인 양은 또한 치료되는 질병, 투여되는 특정한 면역 자극성 핵산 (예, 상기 핵산 중의 면역 자극성 모티프의 성질, 수 또는 위치), 개체의 크기, 질병 또는 조건의 경중과 같은 인자에 따라 또한 다를 수 있다. 당업자라면 과도한 실험을 할 필요 없이 특정한 면역 자극성 핵산 및 치료학적 제제 조합의 효과적인 양을 경험적으로 결정할 수 있다. 본 명세서에 개시된 개시 내용을 조합하여, 다양한 활성 성분 중에서 선택하고 성능, 상대적 생물학적 이용성, 환자 체중, 부작용의 경중 및 바람직한 투여 방법과 같은 인자를 고려함으로써, 실질적으로 독성을 야기시키깆 않으면서도 특정한 개체를 치료하는데 전적으로 효과적인, 효과적인 예방 또는 치료학적 치료 계획 (regimen)이 계획될 수 있다.

일부 구체예에서, 상기 면역 자극성 핵산은 효과적인 양으로 투여되어 Th1 면역 반응, 또는 Th2 면역 반응, 또는 일반적 면역 반응을 촉진하거나 유도한다. Th1 면역 반응을 촉진하기에 효과적인 양은 하나 인터루킨 2 (IL-2), IL-12, 종양괴사인자 (TNFα) 및 인터페론 감마 (IFNγ)와 같은 하나 이상의 Th1 형 사이토카인의 생산, 및/또는 하나 이상의 Th1 형 항체의 생산을 촉진하는 양으로 정의될 수 있다. 반면, Th2 면역 반응을 촉진하기에 효과적인 양은 하나 IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10, 및 IL-13과 같은 하나 이상의 Th2 형 사이토카인의 생산, 및/또는 하나 이상의 Th2 형 항체의 생산을 촉진하는 양으로 정의될 수 있다.

본 발명의 일부 구체예에서, 상기 면역 자극성 핵산은 박테리아, 바이러스 또는 진균 감염을 예방하기에 효과적인 양으로 투여된다. 면역 자극성 핵산은 박테리아 및 바이러스 감염을 예방하는데 유용한 것으로 알려져 있다.

일부 예에서, 항원의 서브 치료학적 투여량이 암 또는 감염성 질환을 가지거나, 걸릴 위험이 있는 개체의 치료에 사용된다. 예로서, 상기 항원이 상기 면역 자극성 핵산과 함께 사용되는 경우, 상기 항원은 서브 치료학적 용량으로 투여되어 여전히 원하는 치료학적 결과를 얻을 수 있다. "서브 치료학적 용량 (sub-therapeutic dose)"이란 다른 제제의 부재하에서 투여되는 경우 상기 개체에서 치료학적 결과를 얻을 수 있는 투여량 보다 적은 투여량을 의미한다. 따라서, 항원의 상기 서브 치료학적 용량은 단독으로 또는 알럼과 같은 종래 보조제와의 조합으로, 상기 면역 자극성 핵산의 투여 없이 상기 개체에서 상기 원하는 치료학적 결과가 생성되지 않을 용량이다. 항원의 치료학적 용량은 백신접종의 분야에서는 잘 알려져 있다. 이들 투여량은 백신접종을 위한 지침으로서 의료업자에 의하여 신뢰받고 있는 참고문헌에 광범위하게 개시되어 있다. 면역 자극성 핵산의 치료학적 투여량은 또한 당업계에 알려져 있으며 개체의 치료학적 투여량을 확인하는 방법도 본 명세서에 보다 상세하게 개시되어 있다.

본 명세서에 기재된 임의의 화합물에 대하여, 치료학적으로 효과적인 양은 세포 배양 분석으로부터 초기 결정될 수 있다. 특히, 면역 자극성 핵산의 효과적인 양은 인 비트로 자극 분석을 이용하여 결정될 수 있다. 상기 면역 자극성 핵산의 상기 자극 지수는 종래 시험된 면역 자극성 핵산의 자극 지수와 비교될 수 있다. 상기 자극 지수는 특정한 개체에 대하여 특정한 올리고뉴클레오티드의 효과적인 양을 결정하기 위하여 사용될 수 있으며, 상기 투여량은 개체에서 원하는 수준을 얻기 위하여 상향 또는 하향 조절될 수 있다.

치료학적으로 효과적인 양은 또한 동물 연구에서 결정될 수 있다. 예를 들면, 상승적 반응을 유도하기에 효과적인 양의 면역 자극성 핵산 및 치료학적 제제는 종양 퇴화 (regression) 및/또는 종양 형성의 예방의 인 비보 분석을 이용하여 검사될 수 있다. 관련된 동물 모델에는 악성 세포가 보통 정의된 부위에서 동물 개체 내로 주사되는 분석 방법이 포함된다. 일반적으로, 면역 자극성 핵산 용량의 일 범위는 일 범위의 치료학적 제제 용량과 함께 동물 내로 투여된다. 상기 종양 세포의 투여 후의 종양 성장의 억제는 암에 걸릴 위험을 감소시키는 능력을 나타내는 것이다. 기존 종양의 추가의 성장 억제 (또한 크기 감소)는 암 치료 능력을 나타내는 것이다. 인간 면역 체계 요소를 가지도록 개질된 생쥐가 상승적 조합의 상기 효과적인 양을 결정하기 위하여 인간 암 세포주의 수용체로서 사용될 수 있다.

치료학적으로 효과적인 용량은 또한 (인간 임상 시험이 개시된) 인간에서 시험되었던 면역 자극성 핵산에 대한 인간 데이터 및 백신접종을 위한 다른 보조제 예를 들면, LT 및 다른 항원과 같은 비슷한 약리학적 활성을 보이는 것으로 알려진 화합물에 대한 인간 데이터로부터 결정될 수 있다.

상기 면역 자극성 핵산 및 치료학적 제제의 적용된 용량은 사용된 보조제를 포함한, 투여된 화합물의 상대적 생물이용성 및 성능에 근거하여 조정될 수 있다. 상기한 방법 및 다른 방법에 근거하여 최대 효능을 얻기 위하여 상기 용량을 조정하는 것은 당업자의 능력 범위 내에서 용이하게 가능한 것이다.

일반적으로 본 명세서에 개시된 화합물의 개체 용량은 약 0.1 ㎍ 내지 10,000 mg, 더욱 일반적으로는 약 1 ㎍/일 내지 8,000 mg, 및 가장 일반적으로는 약 10 ㎍ 내지 100 ㎍의 범위이다. 개체 체중 기준으로, 일반적 용량은 약 0.1 ㎍ 내지 20 mg/kg/day, 더욱 일반적으로 약 1 내지 10 mg/kg/day, 및 가장 일반적으로는 약 1 내지 5 mg/kg/day의 범위이다.

본 발명의 다른 구체예에서, 상기 면역 자극성 핵산은 통상 스케줄로 투여된다. "통상 스케줄 (routine schedule)"이란 미리 설정된 지정된 기간을 의미한다. 상기 통상 스케줄은 상기 스케줄이 미리 설정되어 있는 한, 길이에 있어서 동일하거나 다른 기간을 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 통상 스케줄은 상기 면역 자극성 핵산을 일 기준, 매 2일, 매 3일, 매 4일, 매 5일, 매 6일, 주 기준, 월 기준 또는 그 사이의 임의의 설정된 수의 날 또는 주, 매 2 월, 3월, 4월, 5월, 6월, 7월, 8월, 9월, 10월, 11월, 12월 등의 기준으로 투여하는 것과 관련된다. 또한, 상기 설정된 통상 스케줄은 제1 주 동안은 일 단위로, 그 후 수 개월 동안은 월 기준으로, 그 후에는 3 개월 기준으로 상기 면역 자극성 핵산을 투여하는 것과 관련될 수 있다. 적절한 스케줄이 특정한 일에 투여하는 것과 관련되도록 미리 설정되어 있는 한 상기 임의의 특정한 조합은 통상 스케줄에 의하여 해결될 수 있다.

상기 면역 자극성 핵산은 플라스미드 벡터의 형태로 상기 개체에 전달될 수 있다. 일부 구체예에서, 하나의 플라스미드 벡터가 상기 면역 자극성 핵산 및 항원을 코딩하는 핵산을 모두 포함할 수 있다. 다른 구체예에서, 별도의 플라스미드가 사용될 수 있다. 또다른 구체예에서, 플라스드가 사용되지 않을 수 있다.

상기 면역 자극성 핵산 및 상기 치료학적 제제는 단독 (예, 염수 또는 버퍼)으로 또는 당업계에 알려진 임의의 전달 벡터를 사용하여 투여될 수 있다. 예를 들면, 하기와 같은 전달 매체가 개시되어 있다: 코클리에이트 (cochleate) (Gould-Fogerite et al., 1994, 1996); 에멀좀 (Emulsome) (Vancott et al., 1998, Lowell et al., 1997); ISCOMs (Mowat et al., 1993, Carlsson et al., 1991, Hu et., 1998, Morein et al., 1999); 리포좀 (Childers et al., 1999, Michalek et al., 1989, 1992, de Haan 1995a, 1995b); 생 박테리아 벡터 (예, 살모넬라 (Salmonella), 에세리키아 콜리 (Escherichia coli), 바실러스 칼마테-게링 (Bacillus calmatte-guerin), 쉐겔라 (Shigella), 락토바실러스 (Lactobacillus)) (Hone et al., 1996, Pouwels et al., 1998, Chatfield et al., 1993, Stover et al., 1991, Nugent et al., 1998); 생 바이러스 벡터 (예, 백시니아, 아데노바이러스, 헤르페스 심플렉스) (Gallichan et al., 1993, 1995, Moss et al., 1996, Nugent et al., 1998, Flexner et al., 1988, Morrow et al., 1999); 마이크로구 (Gupta et al., 1998, Jones et al., 1996, Maloy et al., 1994, Moore et al., 1995, O'Hagan et al., 1994, Eldridge et al., 1989); 핵산 백신 (Fynan et al., 1993, Kuklin et al., 1997, Sasaki et al., 1998, Okada et al., 1997, Ishii et al., 1997); 중합체 (예, 카르복시메틸셀룰로즈, 키토산) (Hamajima et al., 1998, Jabbal-Gill et al., 1998); 중합체 고리 (Wyatt et al., 1998); 프로테오좀 (Vancott et al., 1998, Lowell et al., 1988, 1996, 1997); 소듐 플루오라이드 (Hashi et al., 1998); 유전자이식 식물체 (Tacket et al., 1998, Mason et al., 1998, Haq et al., 1995); 비트로좀 (Gluck et al., 1992, Mengiardi et al., 1995, Cryz et al., 1998); 및, 바이러스-유사 입자 (Jiang et al., 1999, Leibl et al., 1998).

상기 면역 자극성 핵산은 더욱 더 면역반응을 증진시키기 위하여 사이토카인과 같은 추가의 치료학적 제제와 조합되어질 수 있다. 상기 면역 자극성 핵산 및 상기 치료학적 제제는 동시 또는 순차적으로 투여될 수 있다. 다른 치료학적 제제가 동시에 투여되는 경우, 동일 또는 별개의 제제로 투여될 수 있으나, 동시에 투여된다. 상기 다른 치료학적 제제 및 상기 면역 자극성 핵산의 투여는 또한 일시적으로 분리될 수 있는데, 이는 상기 치료학적 제제가 상기 면역 자극성 핵산의 투여 전 또는 후에 다른 시간에 투여되는 것을 의미한다. 이들 화합물의 투여 사이의 시간의 분리는 분 단위 또는 더 길 수도 있다. 다른 치료학적 제제에는 사이토카인, 면역치료학적 항체, 항원 등이 포함되나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다.

면역반응은 또한 상기 면역 자극성 핵산과 함께 사이토카인 또는 공동 자극 분자의 공동 투여 또는 동반 발현에 의하여 유도되거아 증가될 수 있다. 상기 사이토카인은 상기 면역 자극성 핵산과 함께 직접적으로 투여되거나, 상기 사이토카인이 인 비보에서 발현되도록 핵산 벡터의 형태로 투여될 수 있다. 일 구체예에서, 상기 사이토카인은 플라스미드 발현 벡터의 형태로 투여된다. 상기 "사이토카인 (cytokine)"이라는 용어는 나노 내지 피코 몰 농도에서 체액성 조절자로서 작용하고, 정상 또는 병리적 조건 하에서, 개별적 세포 및 조직의 기능적 활성을 조절하는 다양한 그룹의 용해성 단백질 및 펩티드에 일반 명칭으로서 사용된다. 이들 단백질은 또한 직접적으로 세포 사이의 상호작용을 매개하고 세포외 환경에서 일어나는 과정을 조절한다. 사이토카인은 또한 T 세포 반응을 지시하는 중심적 분자이다. 사이토카인의 예에는, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-10, IL-12, IL-15, IL-18, 과립구 콜로니 자극인자 (GM-CSF), 과립세포 콜로니 자극인자 (G-CSF), 인터페론-γ (IFN-γ), IFN-α, 종양 괴사 인자 (TNF), TGF-β, FLT-3 리간드, 및 CD40 리간드를 포함하나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다. 일부 구체예에서, 상기 사이토카인은 Thl 사이토카인이다. 또다른 구체예에서, 상기 사이토카인은 Th2 사이토카인이다. 다른 구체예에서, 사이토카인은 상기 면역 자극성 핵산과 함께 조합되어 투여되지 않는다.

다른 양상에서, 본 발명은 키트와 관련된다. 본 발명의 일 키트는 면역 자극성 핵산을 포함하는 용기 및 수 중 유 에멀션를 수용하는 용기 및 상기 면역 자극성 핵산 및 상기 수 중 유 에멀션의 투여 시기에 대한 지침서를 포함한다. 본 발명의 다른 키트는 면역 자극성 핵산을 수용하는 용기 및 상기 면역 자극성 핵산의 투여 시기에 대한 지침서를 포함한다. 선택적으로 상기 키트는 별도 용기에 수용되거나 상기 면역 자극성 핵산 또는 치료학적 제제와 제제화되어 있는 항원을 포함한다. 항원을 천천히 방출하는 임의의 장치인 서방 매체 (vehicle)이 종래 기술에 따라 본 발명에 사용된다.

그러한 시스템은 상기 화합물을 반복적으로 투여하는 것을 할 수 있도록 하여, 개체와 의사에게 편리함을 증가시킨다. 많은 형태의 방출 전달 시스템이 이용가능하며 당업자에게 알려져 있다. 이들 시스템에는 폴리 (락타이드-글리콜라이드), 코폴리옥살레이트, 폴리카프로락톤, 폴리에스테르아미드, 폴리오르토에스테르 (polyorthoester), 폴리히드록시부티릭산, 및 폴리무수물과 같은 중합체 기초 시스템이 포함된다. 약물을 함유하는 상기 중합체의 미세캡슐이 미국특허 제5,075,109호에 개시되어 있다. 전달 시스템에는 하기와 같은 비중합체 시스템이 또한 포함된다 : 콜레스테롤, 콜레스테롤 에스테르와 같은 스테롤 및 모노, 디 및 트리글리세리드와 같은 지방산 또는 중성 지방을 포함하는 지질; 히드로겔 방출 시스템; 펩티드 근거 시스템; 왁스 코팅; 종래의 결합제와 부형제를 사용한 압축된 정제; 부분적으로 융합된 이식물 (implant) 등. 특정한 예에는, (a) 본 발명의 제제가 미국특허 제4,452,775호, 제4,675,189호, 및 제5,736,152호에 개시되어 있는 것과 같은 기질 내에 한 형태로 포함되어 있는 부식 시스템 (erosional systems), 및 (b) 활성 성분이 미국특허 제3,854,480호, 제5,133,974호 및 제5,407,686호에 개시되어 있는 바와 같은 중합체로부터 제어된 속도로 스며드는 확산 시스템이 포함될 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다. 더욱이, 폄프에 기초한 하드웨어 전달 시스템이 그의 일부가 이식 (implantation)에 적합화되어 사용될 수 있다.

상기 수 중 유 에멀션과 같은 상기 제제는 하나 이상의 용기에 수용된다. 상기 용기는 모든 상기 제제를 함께 수용하는 단일 용기일 수 있거나, 발포제 팩과 같은 개별적 투여량을 수용하는 복수의 용기 또는 챔버일 수 있다. 상기 키트는 또한 상기 치료학적 제제의 투여 시기에 대한 지침서를 갖는다. 상기 지침서는 암을 가진 개체 또는 암에 걸릴 위험이 있는 개체가 적당한 시간에 상기 치료학적 제제를 취하도록 지시한다. 예를 들면, 약물 전달의 적당한 시기는 증상이 나타내는 때일 수 있다. 또한, 약물 투여의 적당한 시기는 월별 또는 년별 기준과 같은 통상 스케줄에 의할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 선택적으로 포함되는 약제학적으로 허용가능한 담체 내에 효과적인 양의 면역 자극성 핵산 및 치료학적 제제를 포함한다. "약제학적으로 허용가능한 담체 (pharmaceutically-acceptable carrier)"라는 용어는 인간 또는 다른 척추동물에 투여하기에 적합한 하나 이상의 적합성 고체 또는 액체 충진재 (filler), 희석제 또는 캡슐화 물질을 의미한다. "담체 (carrier)"란 활성 성분이 적용을 촉진하기 위하여 조합되어지는 유기 또는 무기 성분, 천연 또는 합성 성분을 의미한다. 상기 약제학적 조성물의 성분은 본 발명의 화합물과 또한 혼합되어질 수 있으며, 서로 원하는 약제학적 효능에 실질적으로 손상을 가하는 상호작용이 없도록 혼합되어질 수 있다.

상기 면역 자극성 핵산 및 치료학적 제제은 그 자체로 투여되거나 약제학적으로 허용가능한 염의 형태로 투여될 수 있다. 의약에 사용되는 경우 상기 염은 약제학적으로 허용가능하여야 하나, 비-약제학적으로 허용가능한 염은 그의 약제학적으로 허용가능한 염을 제조하기 위하여 편리하게 사용될 수 있다. 그러한 염에는 하기 산으로부터 제조되는 염이 포함되나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다 : 염산, 히드로브롬산, 황산, 질산, 인산, 말레산, 아세트산, 살리실산, p-톨루엔 술폰산, 타르타르산, 시트르산, 메탄 술폰산, 포름산, 말론산, 숙신산, 나프탈렌 술폰산, 및 벤젠 술폰산. 또한, 그러한 염은 카르복실 기의 소듐, 포타슘 또는 칼슘 염과 같이, 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염으로서 제조될 수 있다.

적합한 버퍼링 제에는 하기의 것이 포함된다: 아세트산 및 염 (1-2% w/v); 시트르산 및 염 (1-3% w/v); 붕산 및 염 (0.5-2.5 % w/v); 및 인산 및 염 (0.8-2% w/v). 적합한 보존제에는 벤즈알코늄 클로라이드 (0.003-0.03% w/v); 클로로부탄올 (0.3- 0.9 % w/v); 파라벤 (0.01-0.25 % w/v) 및 티메로살 (0.04-0.02 % w/v).

비경구 투여를 위한 약제학적 제제에는 수용성 형태의 활성 화합물의 수용액을 포함한다. 더욱이, 상기 활성 화합물의 현탁액은 적합한 기름상 주사 현탁액으로서 제조될 수 있다. 적합한 친유성 용매 또는 매체에는 참기름과 같은 지방 기름, 또는 에틸 올리에이트 또는 트리글리세리드와 같은 합성 지방산 에스테르, 또는 리포좀이 포함된다. 수성 주사 현탁액은 소듐 카르복시메틸셀룰로즈, 소르비톨, 또는 덱스트란과 같은 현탁액의 점도를 증가시키는 물질을 포함할 수 있다. 선택적으로, 상기 현탁액은 적합한 안정화제 또는 고도로 농축된 용액을 제조할 수 있도록 하기 위하여 상기 화합물의 용해도를 높이는 제제를 또한 포함할 수 있다. 지속적 방출 전달을 위한 또다른 적합한 화합물은 개질된 콜라겔 섬유로 구성된 상업적으로 이용가능한, GELFOAM이다.

또한, 상기 활성 화합물은 사용 전에 적합한 매체 (vehicle), 예를 들면, 무발열제 (pyrogen) 물을 구성하기 위하여 분말 형태일 수 있다.

상기 약제학적 조성물은 적합한 고체상 또는 겔상 담체 또는 부형제를 또한 포함할 수 있다. 그러한 담체 또는 부형제의 예에는, 칼슘 카르보네이트, 칼슘 포스페이트, 다양한 당, 녹말, 셀룰로즈 유도체, 젤라틴 및 폴리에틸렌 글리콜과 같은 중합체가 포함되나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다.

상기 면역 자극성 핵산 및 치료학적 제제는 고정된 스케줄로 또는 서로 다른 시간적 관계로 투여될 수 있다. 상기 다양한 조합은 종래 방법에 비하여 많은 잇점을 가지고 있다.

상기 면역 자극성 핵산 및 치료학적 제제는 약물 투여를 위한 임의의 통상 경로에 의하여 투여될 수 있다. 치료되어야 할 질병의 형태에 따라, 면역 자극성 핵산 및 치료학적 제제는 흡입 (inhaled), 섭취 (ingested) 또는 전신성 경로에 의하여 투여될 수 있다. 전신성 경로는 경구 및 비경구를 포함한다. 특히, 호흡기 질환 또는 폐암의 치료에 있어서 폐에 직접적으로 전달되기 때문에 흡입 투약이 일부 구체예에서 바람직하다. 여러 형태의 계량된 용량 흡입기가 흡입에 의한 투여를 위하여 규칙적으로 사용되고 있다. 이들 형태의 장치에는 계량된 용량 흡입기 (MDI), 호흡 (breath)-활성화된 MDI, 건조분말 흡입기 (DPI), MDI와 조합된 스페이서/보유 챔버, 및 분무기가 포함된다. 바람직한 투여 경로에는 경구, 비경구, 근육내, 코안, 기관 내, 경막 내, 점맥 내, 흡입, 안구, 질내 및 직장내가 포함되나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다.

치료에 사용하기 위하여, 상기 면역 자극성 핵산 및 치료학적 제제의 효과적인 양이 영향을 받고 있는 기관 또는 조직에, 또는 대안으로 면역 체계에 상기 핵산을 전달하는 임의의 방법에 의하여 개체에 투여될 수 있다. 본 발명의 상기 약제학적 조성물을 "투여하는 (administering)"이란 당업자에게 알려진 임의의 방법에 의하여 달성될 수 있다. 바람직한 투여 경로에는 경구, 비경구, 근육내, 피하, 코안, 기관 내, 흡입, 안구, 질내 및 직장 내가 포함되나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다.

경구 투여를 위하여, 상기 화합물 (즉, 면역 자극성 핵산, 치료학적 제제 및 다른 치료학적 약제)이 당업계에 잘 알려진 약제학적으로 허용가능한 담체와 상기 활성 화합물을 조합함으로써 용이하게 제제화될 수 있다. 그러한 담체는 치료되어질 개체에 의한 경구 섭취를 위하여, 본 발명의 상기 화합물이 정제, 알약, 드라제 (dragee), 캡슐, 액체, 겔, 시럼, 슬러리, 현탁액 등으로 제제화될 수 있도록 한다. 경구 사용을 위한 약제학적 조제물은 정제 또는 드라제 핵을 얻기 위하여, 선택적으로 얻어진 혼합물으 갈고, 과립 혼합물을 처리하고, 원하는 경우 적합한 보조물질을 첨가한 후에 고체 부형제로서 얻어질 수 있다. 적합한 부형제는 특히, 유당, 자당, 마니톨, 또는 소르비톨을 포함한 당과 같은 충전물; 예를 들면, 옥수수 녹말, 밀 녹말, 쌀 녹말, 감자 녹말, 젤라틴, 검 트라가칸트, 메틸 셀룰로즈, 히드록시프로필메틸-셀룰로즈, 소듐 카르복시메틸셀룰로즈, 및/또는 폴리비닐피롤리돈 (PVP)과 같은 셀룰로즈 조제물이다. 원하는 경우, 가교된 폴리비닐피롤리돈, 한천, 또는 알긴산 또는 소듐 알지네이트와 같은 그의 염과 같은, 붕해제가 첨가될 수 있다. 선택적으로 상기 경구 제제는 또한 내부 산 조건을 중화시키기 위하여 염수 또는 버퍼에 제제화되거나 담체 없이 투여될 수 있다.

드라제 핵은 적합한 코팅과 함께 제공된다. 이러한 목적을 위하여, 선택적으로 아랍 검, 탈크, 폴리비닐피롤리돈, 카르보폴 겔, 폴리에틸렌글리콜, 및/또는 티타늄 디옥사이드, 락커 용액 및 적합한 유기 용매 또는 용매 혼합물을 포함할 수 있는, 농축 당 용액이 사용될 수 있다. 염료 또는 색소가 확인 또는 활성 화합물 용량의 다른 조합을 나타내기 위하여 상기 정제 또는 드라제 코팅에 검가될 수 있다.

경구적으로 사용될 수 있는 약제학적 조제물에는 젤라틴으로 만들어진 푸쉬-피트 (push-fit) 캡슐, 젤라틴으로 만든 연하고, 밀봉된 캡슐, 및 글리세롤 또는 소르비톨과 같은 가소제가 포함된다. 상기 푸쉬-피트 (push-fit) 캡슐은 유당과 같은 충전물, 전분과 같은 결합제, 및/또는 탈크 또는 마그네슘 스테아레이트와 같은 윤활제, 및 선택적으로 안정화제와 혼합된 활성 성분을 포함할 수 있다. 연한 캡슐에서, 상기 활성 화합물은 지방 기름, 액체 파라핀, 또는 액체 폴리에틸렌 글리콜과 같은, 적합한 액체에 용해되거나 현탁되어질 수 있다. 경구 투여를 위하여 제제화된 마이크로구가 또한 사용될 수 있다. 그러한 마이크로구는 당업계에서 잘 정의되었다. 경구 투여를 위한 모든 제제가 그러한 투여에 적합한 투여량이어야 한다.

구강 (buccal) 투여를 위하여, 상기 조성물은 종래의 방법으로 제제화된 정제 또는 로젠지의 형태를 취할 수 있다.

흡입에 의한 투여를 위하여, 본 발명에 따른 사용을 위한 상기 화합물은 적합한 추진제 예를 들면, 티클로로디플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 티클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소 또는 다른 적합한 기체를 사용하는 것과 함께, 가압된 팩 또는 분무기로부터 에어로졸 분무 제공의 형태로 편리하게 전달될 수 있다. 가압된 에어로졸의 경우, 상기 투여량 단위는 계량된 양을 전달하기 위하여 밸브를 제공함으로써 결정될 수 있다. 예를 들면, 흡입기 또는 주입기 (insufflator)에 사용하기 위한 젤라틴의 캡슐 또는 카트리지가 상기 화합물 및 유당 또는 전분과 같은 적합한 분말 기저의 분말 믹스를 포함하여 제제화될 수 있다. 에어로졸 전달 시스템을 제조하는 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다. 일반적으로, 그러한 시스템은 상기 핵산의 면역 자극 능력과 같은, 상기 치료제의 생물학적 특성을 현저하게 손상시키지 않을 성분을 사용하여야 한다 (예를 들면, Sciarra and Cutie, "Aerosols," in Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, 1990, pp 1694-1712 참조; 원용에 의하여 본 명세서에 포함되어짐). 당업자는 과도한 실험을 하지 않고서도 에어로졸을 생산하기 위한 다양한 인자 및 조건을 용이하게 결정할 수 있다.

전신적으로 전달하는 것이 바람직한 경우, 상기 화합물은 주사, 예를 들면, 볼루스 주사 또는 연속 주입 (infusion)에 의한 비경구 투여를 위하여 제제화될 수 있다. 주사를 위한 제제는 첨가된 보존제와 함께, 단위 투여량 형태, 예를 들면, 앰플 또는 복수 용량 용기 내에 제공될 수 있다. 상기 조성물은 유상 또는 수성 매체 중에서 현탁액, 용액 또는 에멀션과 같은 형태를 취할 수 있으며, 현탁제, 안정화제 및/또는 분산제와 같은 제제화 약제를 포함할 수 있다.

본 발명의 또다른 구체예에서, 상기 면역 자극성 핵산은 암 환자에게 수혈을 전달하기 위하여 사용되는 정맥내 용액, 백 및/또는 튜빙 내에 제공된다. 상기 면역 자극성 핵산은 상기 수혈을 받기 전에 개체에 투여되는 정맥 내 용액 내로 도입될 수 있거나, 혈액 수혈 그 자체 (즉, 적혈구 또는 혈소판의 현탁액) 내로 도입될 수 있다. 또한, 상기 정맥내 백 및 튜빙은 면역 자극성 핵산으로 그 내부 표면 상에 그 자체가 코팅되어질 수 있거나, 제조 중에 면역 자극성 핵산이 스며들게 할 수 있다. 생물학적 활성 물질의 전달을 위한 정맥 내 시스템의 제조 방법은 당업계에 알려져 있다. 예에는 알자 사 (Alza, Corp.)의 미국특허 제4,973,307호 및 제5,250,028호에 개시된 것이 포함된다.

상기 화합물은 또한 예를 들면, 코코아 버터 또는 다른 글리세리드와 같은 종래의 좌약 기저를 함유하는, 좌약 또는 체류 관장제와 같은 직장 또는 질내 조성물로 제제화될 수 있다. 전기 기술한 제제에 더하여, 상기 화합물은 저장 조제물 (depot preparation)으로서 또한 제제화될 수 있다. 그러한 장기 활성 제제는 적합한 중합체성 또는 소수성 물질 (예, 허용가능한 기름 중의 에멀션으로서) 또는 이온교환 수지와 함께, 또는 예를 들면, 불용성 염으로서, 불용성 유도체로서 제제화될 수 있다.

적합한 액체 또는 고체 약제학적 조제물 형태는 예를 들면, 흡입을 위한 수정 또는 염수 용액, 미세캡슐화, 코크리트 (cochleate), 미세 금 입자에 코팅된 것, 리포좀 속에 포함된 것, 분무화된 것, 에어로졸, 피부에 이식하기 위한 펠렛, 또는 피부로 긁혀 들어갈 날카로운 물체 상에 건조된 것이다. 상기 약제학적 조성물에는 또한 붕해제, 결합제, 코팅제, 부풀림제, 윤활제, 풍미제, 감미제 또는 가용화제와 같은 조제물 부형제 및 첨가제 및/또는 보조물질이 상기한 바와 같이 통상적으로 사용되어진 과립, 분말, 정제, 코팅된 정제, (마이크로)캡슐, 좌약, 시럽, 에멀션, 현탁액, 크림, 방울 (drop) 또는 활성 화합물이 지연 방출되는 조제물이 포함된다. 상기 약제학적 조성물은 다양한 약물 전달 시스템에 사용하기 적합하다. 약물 전달방법의 간단한 리뷰를 위하여, 원용에 의하여 본 명세서에 포함되어지는, Langer, Science 249:1527-1533, 1990 참조.

본 발명을 하기 실시예 의하여 예시적으로 설명하나, 추가적으로 한정하는 것으로 해석되어서는 안된다.

실시예 1 : EMULSIGEN^TM과 조합된 CpG.

실험은 소에서 EMULSIGEN^TM (Em)와 CpG 올리고뉴클레오티드로 공동 항원보강괸 소 헤르페스바이러스-1 (BHV-1) 서브유니트 백신의 면역유발성 및 보호 효능을 시험하기 위하여 수행되었다. 25, 2.5 또는 0.25 mg/용량 (dose)의 농도로 Em 및 CpG 올리고뉴클레오티드로 공동 항원보강된 BHV-1 당단백질 D (tgD)의 잘려진 형태는, VSA3, Em 또는 CpG 올리고뉴클레오티드 단독으로 항원보강된 tgD에 비하여 더 강하고 더 균형잡힌 Th1/Th2 면역 반응, 더 높은 혈청 중화 항체 및 BHV-1 챌린지에 대한 더 높은 보호율을 생성하였다. 더욱이, Em과 25 mg의 비-CpG 올리고뉴클레오티드/용량으로 공동 항원보강된 tgD는 Em 단독에 대한 면역성과 비교될 만한 수준을 생성하였고, CpG 올리고뉴클레오티드/Em 조합물 보다는 작은 면역성을 생성하였다.

재료 및 방법

세포 및 바이러스 :

BHV-1의 P8-2 및 108 스트레인이 종래 개시된 바와 같이 마딘 다르비 소 신장 (Madin Darby bovine kidney) (MDBK) 세포에서 증식되었다 (van Drunen Littel-van den Hurk, S., J. et al 1994. A subunit gIV vaccine, produced by transfected mammalian cells in culture, induces mucosal immunity against bovine herpesvirus-1 in cattle. Vaccine 12:1295-1302). 108 스트레인을 동물을 챌린지하는데 사용하였고, P8-2 스트레인을 PBMC의 인 비트로 증식의 자극을 위하여 사용하였다.

BHV-1 tgD의 생산, 처리 및 정제: BHV-1 gD (tgD)의 잘려진 형태를 막관통 앵커의 바로 상류인 아미노산 355에서 단백질을 종결시킴으로써 제작되었다. 소 열충격 70A (hsp70) 유전자 프로모터의 조절하에서 MDBK에서 발현되었다 (Kowalski, Jet al 1993. Heat-shock promoter-driven synthesis of secreted bovine herpesvirus glycoproteins in transfected cells. Vaccine 11:1100-1107). 다른 문헌에 개시된 바에 따라 잘려진 gD가 생산되고, 가공되고 정제되었다 (van Drunen Littel-van den Hurk, S., J. et al 1994. A subunit gIV vaccine, produced by transfected mammalian cells in culture, induces mucosal immunity against bovine herpesvirus-1 in cattle. Vaccine 12:1295-1302).

CpG 및 비-CpG 올리고뉴클레오티드 : 합성 올리고데옥시뉴클레오티드 (올리고뉴클레오티드) 조제물 (Qiagen, Hilden, Gennany) 중의 메틸화되지 않은 CpG 디뉴클레오티드를 본 연구에서 보조제 또는 공동 보조제로서 사용하였다. 상기 사용된 CpG 올리고뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드 2007이었다 (TCGTCGTTGTCGTTTTGTCGTT; CpG 모티프는 밑줄로 표시하였다). 상기 CpG 디뉴클레오티드에 의하여 면역 반응이 유도되는지를 결정하기 위하여, 본 발명자들은 또한 비-CpG 올리고뉴클레오티드; 2041 (CTGGTCTTTCTGGTTTTTTTCTGG) (Qiagen)를 사용하였다. 상기 CpG 와 비-CpG 올리고뉴클레오티드는 뉴클레아제 분해에 대한 저항성을 증가시키기 위하여 포스포로티오에이트 개질되었다 (Kuhnle, G, A, et al. 1998. The class II membrane glycoprotein G of bovine respiratoly syncytial virus, expressed from a synthetic open reading frame, is incorporated into virions of recombinant bovine herpesvirus 1. J. Prot. 72:3804-3811).

면역화 : 7 두, 9 개월된 BHV-1-혈청음성 안구스와 헤레포드 잡종 송아지의 8개 그룹에 30% v/v EMULSIGEN^TM (Em) (MVP Laboratories, Nebraska, 미국), 30% v/v VSA3 (24 mM 디메틸디옥타데실암모늄 브로마이드 [DDA]을 함유하는 Em), 25 mg의 CpG 올리고뉴클레오티드 (CpG), 30% Em과 25 (높음), 2.5 (중간) 또는 0.25 (낮음) mg CpG 올리고뉴클레오티드 (각각 H CpG/Em, M CpG/Em, L CpG/Em)과의 조합, 또는 Em과 25 mg 비-CpG 올리고뉴클레오티드 (비-CpG/Em)의 조합 중 어느 하나로 항원보강된 50 ㎍ BHV-1 tgD로 피하로 면역화하였다. 상기 백신은 피하로 2 ml 부피로 투여되었다. 송아지의 플라시보 그룹은 2 ml PBS 만으로 면역화되었다. 39일 후, 상기 동물을 재면역 접종한 다음, 2 차 면역 후 2 일째 (백신 접종 53일)에 챌린지하였다.

실험적 챌린지 및 임상적 평가 : 2차 면역 5 주 후에, 동물을 격리된 축사로 옮기고 체중을 측정하고 임상적으로 검사하였다. 상기 송아지는 개시된 바와 같이 10⁷ PFU의 BHV-1의 에어로졸에 4 분 동안 개별적으로 노출되었다 (Loehr, B.L, et al. 2000. Gene gun-mediated DNA immunization primes development of mucosal immunity against bovine herpesvirus 1 in cattle. J. Virol. 74: 6077-6086, van Drunen Littel-van den Hurk, S., et. al. 1990. Epitope specificity of the protective immune response induced by individual bovine herpesvirus-1 glycoproteins. Vaccine 8:358-368). 챌린지 후, 송아지의 무게를 매일 측정하였다. 더욱이, 상기 송아지에 대하여 연속 11일 동안 임상적으로 평가하였다. 임상적 평가는 동물의 백신 상태에 대하여 알지 못하는 수의사에 의하여 매일 같은 시간에 수행되었다. 평가된 임상적 증상에는 발열 (직장 온도 >40 ℃), 우울, 비염, 및 결막염이 포함되었다.

샘플링 및 바이러스 분리 : 백신 접종 후 0, 14, 39, 47, 53, 57, 61, 64 및 67 일에 동물로부터 혈액을 채취하여 항체 반응의 검사를 하였다. 항응고제 (에틸렌디아민 테트라아세트산 (EDTA) 최종 농도 0.2%)와 함께 혈액을 50 및 61일에 수집하여 ELISPOT 및 ELISA 분석에 의한 인 비트로 증식 및 IFN-γ 생산의 검사를 위하여 사용하였다. 5 ml 까지의 코 액체를 포함하는 코 탐폰을 챌린지 매 2일 마다 수집하고 같은 날 바이러스 방출을 측정하기 위하여 처리하였다. 코 탐폰으로부터 회수된 바이러스는 종래 개시된 바와 같이 미세역가 플레이트에서 항체 오버레이 하여 플라크 적정에 의하여 정량하였다 (Rouse, B. T. and L.A. Babiuk. 19 74. Host responses to infectious bovine rhinotracheitis virus. III. Isolation and immunologic activities of bovine T lymphocytes. J. Immunol. 113:1391-1398).

효소 연결 면역흡착 분석 (ELISA): 챌린지 전후 특이적 항체 반응을 결정하기 위하여, 96 웰 폴리스티렌 미세역가 판 (Immulon 2, Dynatech, Gaithersburg, Md)을 웰 당 0.05 ㎍의 정제된 tgD 또는 정제된 tgB로 밤새 코팅하였다 (Li, Y, et al. 1996. Production and characterization of bovine herpesvirus 1 glycoprotein B ectodomain derivatives in an hsp7OA gene promoter based expression system. Arch. Virol. 141:2019-2029). 1: 10에서 시작하여 3 배 희석으로, 연속적으로 희석된 소 혈청을 실온에서 2 시간 동안 배양하였다. 1:5,000으로 희석된 알칼리 포스파타제 (AP)-접합된 염소 항-소 IgG (Kirkegaard & Perry Laboratories, Gaithersburg, Md)를 결합된 IgG를 검출하기 위하여 사용하였다. 상기 반응을 p-니트로페닐 포스페이트로 가시화하였다 (Sigma Chemical Co., Oakville, Ontario, Canada).

효소-연결 면역흡착 분석을 사용한 면역글로불린 이소타입 : tgD로 면역 접종된 소의 특이적 IgG1과 IgG2 항체 반응을 결정하기 위하여, 폴리스티렌 미세역가 판을 웰 당 0.05 ㎍으로 밤새 코팅하고, 1 % 열 불활성화된 말 혈청으로 37 ℃에서 30 분 동안 차단하였다. 1: 10에서 시작하여 3 배 희석으로, 연속적으로 희석된 소 혈청을 4 ℃에서 밤새 동안 배양하였다. 결합된 항체는 각가 1:40,000 및 1:8000으로 희석된 소 IgG1 (M-23) 또는 IgG2 (M-37)에 대한 단일 클론 항체로 검출하고, 다음으로 1:10,000으로 희석된 알칼리 포스파타제 (AP)-접합된 염소 항-생쥐 IgG (Kirkegaard & Perry Laboratories, Gaithersburg, Md)로 검출하였다. 상기 반응을 ELISA 분석을 위하여 가시화하였다. 결과를 IgG2에 대한 IgG1의 비율로 나타내었다.

바이러스 중화 분석 : 소 혈청의 중화가를 개시된 바에 따라 결정하였다 (Babiuk, L.A., et al. 1975. Defense mechanisms against bovine herpesvirus: relationship of virus-host cell events to susceptibility to antibodycontplement cell lysis. Infect.1nimun. 12:958-963). 상기 역가는 바이러스 대조군에 비하여 50 % 플라크 감소를 야기시키는 최대 항체 희석의 역수로서 나타내었다.

PBMC의 인 비트로 증식: 말단 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 Ficoll-Plaque PLUS (Pharmacia, Mississauga, Ontario, Canada) 상에서 분리하고, 10 % (v/v) FBS, (Sigma Chemical Co), 2mM L-글루타민 (Gibco-BRL), 500 mg/ml 젠타미신, 5 x 10^-5 M 2-머캅토에탄올 및 1 mg/ml 덱사메타손으로 보충된 MEM (Gibco BRL, Grand Island N.Y, 미국)에서 3.5 x 10⁵ 세포/웰로 96 웰 조직 배양 플레이트에서 3 배수로 배양하였다. 세포를 최종 농도 1 ㎍/ml의 gD로 자극하였다. 배양 72 시간 후, 상기 세포를 0.4 μCu/웰의 농도에서 [메틸-³H] 티미딘 (Amersham, Oakville, Ontario, Canada)으로 펄스하였다. 18 시간 후 반자동 세포 수확기 (Skatron, Starling VA, U.S.A)를 사용하여 세포를 회수하고, 방사능을 신틸레이션 계수에 의하여 결정하였다. 증식 반응은 3 배수 웰의 평균으로 계산하였고 자극 지수 (stimulated index) (SI)로 나타내었는데, SI는 항원의 존재하에서의 개수/분 값을 항원의 부재하에서의 개수/분 값으로 나눈 것이다.

ELISPOT 분석 : 니크로셀룰로즈 플레이트 (Whatman, New Jersey, 미국)를 1:400으로 희석된 소 인터페론-감마 (IFN-γ)-특이적 단일클론 항체로 4 ℃에서 밤새 코팅하였다. 결합되지 않은 항체는 0.05% v/v PBS-Tween-20 (PBS-T)으로 세척하여 내고, 마지막으로 PBS로 세척하였다. PBMC를 증식 분석에 대하여와 동일하게 분리하고 최종 농도 0.4 ㎍/ml의 gD의 존재하에서 10⁶ 세포/웰에서 배양하였다. 대조군 세포는 배지만으로 배양하였다. 24 시간 후, 상기 세포를 세척하고, 배양 배지에 재현탁하고, 니트로셀룰로즈 플레이트로 전이하고 37 ℃에서 24 시간 동안 더 배양한 후, 세포를 0.05% v/v PBS-T로 세척하였다. 다음으로, 상기 플레이트를 1: 100으로 희석된 소 IFN-γ에 대한 토끼 다클론 항체로 실온에서 2 시간 동안 배양한 다음, 1:1000으로 희석된 비오틴화된 랫트 항-토끼 IgG (Zymed, San Francisco, CA, U.S.A)로 실온에서 2 시간 동안 배양한 다음, 1:1000으로 희석된 스트렙타비딘-AP (GIBCO-BRL, Ontario, Canada)로 실온에서 2 시간 동안 배양하였다. 결합된 IFN-γ를 브로모클로로인돌릴 포스페이트/니크로-블루 테트라졸리움 (BCIP/NBT) 기질 정제 (Sigma Chemical Co.)를 사용하여 기시화하였다. 상기 플레이트를 증류수로 세척하고 공기 건조한 후, 염색된 스팟을 400 배의 배율하에서 계수하였다. IFN-γ 분비 세포의 수는 gD 자극된 웰에서 10⁶ 세포 당 스팟의 수 및 대조군 웰에서 10⁶ 세포 당 스팟의 수의 차이로서 나타내었다.

IFN-γ ELISA: 소 PBM를 ELISPOT 분석에서 동일하게 배양하였다. 24 시간 후, 상등액을 회수하고, 소 IFN-γ에 대한 단일클론 항체로 코팅된 96 웰 플레이트 내에서 연속적으로 희석하였다. 알려진 농도의 정제된 소 IFN-γ를 표준으로서 사용하였다. 표준 곡선은 2000 내지 7.8 pg/ml (r > 0.98)의 범위이다. 시료 및 표준품은 100 ㎕/웰의 PBS-T에서 8회 2 배 희석으로 희석하여 분석하였다. 결합된 IFN-γ를 토끼 항-IFN-γ IgG를 사용하여 검출하고, 차례로 AP-접합된 염소 항-토끼 IgG를 사용하여 검출하였다. 상기 기질의 흡광도는 405 및 490 nm에서 측정하였다. 표준 곡선을 만들고 시료 내의 IFN-γ의 농도를 계산하기 위하여 ELISA 판독기 프로그램 (Microplate manager 5, BIO RAD Laboratories, Ontario, Canada)를 사용하였다.

통계적 분석 : 불균등 분포가 될 수 있도록 하기 위하여, 통계적 분석을 하기 전에 모든 데이터는 로그 전환에 의하여 전화되었다. 중화 항체가, 이소타입 비율, 인 비트로 증식 반응, ELISPOT 및 IFN-γ ELISA 데이터의 차이는 분산의 일 방향 분석 및 투키의 다중 비교 시험 (Tukey's multiple comparison test)을 이용하여 조사하였다. 백신 그룹 중의 질병의 징후 (온도의 증가, 체중 감소 및 바이러스 방출)를 갖는 동물의 수 및 챌린지 전후의 소혈청 내의 tgD와 tgB-특이적 항체 사이의 차이는 분산의 이방향 분석 및 투키 정직하게 현저하게 다른 (honestly singifically different : HSD) 다중 비교 시험에 의하여 결정하였다.

결 과

tgD에 대한 체액성 면역 반응 :

CpG ODN의 보조제 능력을 검사하기 위하여, BHV-1 tgD를 25 mg/용량의 CpG, Em 또는 VSA3로 항원보강하거나, 또는 25, 2.5 또는 0.25 mg/용량 (H-, M- 또는 L-CpG/Em)의 농도에서 Em 및 CpG로 공동 항원보강하거나, 또는 Em와 25 mg/용량의 비-CpG ODN (비-CpG/Em)으로 항원보강하였다. VSA3 그룹을 제외하고, 모든 백신접종된 그룹은 일차 면역접종 후 14일에 플라시보 그룹에 비하여 현저하게 높은 수준의 중화 항체를 가졌다 (p<0.001) (도 4). H-CpG/Em 그룹에서의 항체 수준은 비-CpG/Em, Em, CpG 또는 VSA3 그룹의 항체 수준에 비하여 현저하게 (p<0.001) 더 높았다. 상기 항체 수준은 2차 면역접종 후에 현저하게 증가하여 47 일에 모든 3개의 CpG/Em 그룹은 모든 다른 백신 그룹에 비하여 현저하게 (p<0.001) 더 높은 역가를 가졌다. 이 데이터는 백신 내의 CpG ODN의 농도가 2 차 면역 반응에 유의한 효과를 미치지 않는다는 증거를 제공하는 것이다. 중요하게도, 비-CpG/Em 으로 공동 항원보강된 tgD로 면역접종된 동물의 항체가는 상기 Em 그룹의 역가와 현저하게 다르지 않았다. 더욱이, 비-CpG/Em 그룹의 역가는 CpG 및 VSA3 그룹의 그것과 현저하게 다르지 않았다.

생성된 면역 반응의 형태를 결정하기 위하여, 소 혈청 중의 tgD-특이적 IgG1 및 IgG2 항체를 결정하고, IgG1:IgG2 비율을 2차 면역 접종 후 8일에 측정하였다. 상기 비율은 일차 면역 접종 후 및 챌린지 후 모두 유사하였다. 균형잡힌 면역 반응 (∼1:1 비율)를 3개의 CpG /Em 그룹 및 CpG 그룹에서 측정하였고, 이들 사이에는 통계학적 차이가 없었다. 대조적으로, Em, VSA3 및 비-CpG/Em 제제화된 백신은 IgG1에 치우친 면역 반응 (>1600:1)을 생성하였다. 상기 비-CpG/Em 그룹은 L-CpG/Em 그룹에 비하여, 더 높은 IgG1 : IgG2 비율을 생성하였다. 그러나, 비-CpG/Em 그룹은 M-CpG/Em 및 H-CpG/Em 그룹 모두와 현저하게 (P<0.05) 달랐다. 3개의 CpG/Em 그룹 사이 및 비-CpG/Em과 Em 그룹 사이에 어떠한 유의한 차이도 없었다. 더욱이, 모든 3개의 CpG/Em 그룹은 Em (P<0.001) 및 VSA3 (p<0.01) 그룹 모두와 현저하게 달랐다.

tgD에 대한 세포 매개성 면역 반응 : 백신 접종에 의하여 유도된 세포-매개성 면역을 조사하기 위하여, BHV-1 gD에 대한 소 림프구의 인 비트로 증식 반응을 측정하였다. 챌린지 전의 증식 반응은 비-CpG/Em, CpG, 또는 Em으로 백신 접종된 동물에 비하여 CpG/Em으로 백신접종된 동물에서 더 강한 경향이 있었으나, 그 차이는 통계적으로 유의하지 않았다 (도. 5a). 그러나, H-CpG/Em and L-CpG/Em 그룹에 있어서의 증식 반응은 VSA3 및 플라시보 그룹에서의 그것에 비하여 유의하게 (p<0.05) 더 높았다. T-세포 활성화를 더 확인하기 위하여, IFN-γ 생산을 조사하였다. CpG/Em 그룹에서 IFN-γ 분비 세포의 수는 사용된 CpG ODN 농도에 의존하지 않았으나, 비-CpG/Em, Em, VSA3 및 플라시보 그룹에서의 IFN-γ 분비 세포의 수에 비하여 유의하게 (p<0.001) 더 높았다 (도. 5b). BHV-1 챌린지 후, PBMC 그룹의 증식 반응은 다른 백신 접종된 그룹에 비하여 CpG/Em에서 ∼2 배 더 강하였다 (도. 5b). 대조적으로, CpG/Em 그룹과 CpG 그룹 사이에는 차이가 없었다. 백신 접종된 동물의 배양된 PBMC의 상등액에서 챌린지 전에 측정된 IFN-γ의 양은 ELISPOT의 반응 양상과 비슷한 반응 양상을 따랐다 (도. 5c). 상기 CpG/Em 그룹은 서로 유의하게 다르지 않았으며, CpG 또는 Em 그룹으로부터도 현저하게 다르지 않았다. 그러나, 이들 그룹에서 측정된 IFN-γ의 양은 플라시보 (p<0.01), 비-CpG/Em (p<0.05) 및 VSA3 (p<0.01) 그룹에서 측정된 것에 비하여 유의하게 더 높았다. 이들 데이터는 EMULSIGEN^TM와 조합되는 경우 CpG ODN가 Th1 형 면역 반응을 유도하는 능력을 확인하는 것이다.

BHV-1 감염 후의 면역 반응 : 챌린지 후의 혈청 중화 항체 또는 바이러스 단백질에 특이적인 항체 수준의 증가는 또다른 감염의 지시자이다. 챌린지 전에는 모든 그룹이 BHV-1 당단백질 B (tgB)에 대하여 혈청음성이었으나, 챌린지 후에는 CpG/Em 그룹을 제외하고, 플라시보, CpG, Em, VSA3 및 비-CpG/Em 그룹에서 tgB에 대한 항체가 유의하게 (p<0.01) 증가하였다 (도. 6b). 플라시보, CpG, Em, VSA3 및 비-CpG/Em 그룹에서 혈청 중화 역가 (도 4) 및 tgD에 대한 항체 (도 6a)도 또한 챌힌지 후 유의하게 (p<0.005) 증가하였으며, 이는 이들 그룹이 BHV-1 감염으로부터 완전하게 보호되지 않는다는 것을 암시하는 것이다. M-CpG/Em 그룹 역시 챌린지 후에 혈청 중화 항체 및 tgD에 대한 항체 모두에 있어서 일부 증가를 보였으나, 이들 증가는 유의하지 않았다. H-CpG/Em에 있어서 혈청 중화 역가 및 tgD에 대한 항체는 챌린지 후 실제적으로 감소하였으나, M-CpG/Em에 있어서의 이들 값들은 안정하게 유지되었다. 이들 결과는 CpG-EMULSIGEN^TM 제제에 있어서 무익한 면역을 유도한다는 것을 암시한다.

BHV-1 챌린지로부터의 보호 : 모든 동물은 챌린지 전에 건강하였다. 챌린지 후, 전 추적 기간 동안 온도가 ≤ 39.5 ℃로 유지되었던 M- 및 H-CpG/Em 그룹을 제외하고, 평균 직장 온도는 2일 내지 6일에서 증가하였다 (도 7). 플라시보와 비-CpG/Em 그룹은 가장 큰 온도 증가를 보였으며 (6일 째에 ∼ 40.1 ℃), M- 및 H-CpG/Em 그룹 (p<0.002)과는 유의하게 달랐다. L-CpG/Em 그룹 내의 송아지의 온도는 6일까지 39.5 ℃까지 서서히 증가하였으며, 온도는 H-CpG/Em 그룹의 온도와 유의하게 (p=0.006) 달랐으며, 또한 플라시보 그룹 (p<0.001)과도 달랐으나, M-CpG/Em 그룹과는 다르지 않았다. Em, CpG 및 VSA3 그룹에 있어서 평균 직장 온도는 또한 2 일 내지 4 일에 > 39.4 ℃까지 증가하였으나 그 후 < 39 ℃으로 떨어졌다.

치사율의 또다른 검사는 BHV-1 감염 후 체중 손실의 정도이다. H- 및 L-CpG/Em 그룹의 동물은 실험 전 기간에 걸쳐서 체중 손실이 최소로 되거나 전혀 없었으나, 다른 그룹 동물에서는 챌린지 후 4일에 8 kg까지의 체중 손실을 경험하였다 (도 8).

BHV-1 감염으로부터 보호의 수준을 더 결정하기 위하여, 코 경로 (nasal passage)로부터 방출의 정도를 검사하였다. CpG, Em, and nonCpG/Em 그룹의 동물은 챌린지 후 2일에 바이러스 방출하기 시작하여 적어도 8 일까지는 그렇게 계속되었으나, CpG/Em 그룹의 동물의 코 탐폰으로부터는 어떠한 바이러스도 회수되지 않았다 (도. 9). 백신 접종이 바이러스 방출에 유의한 (p<0.001) 영향을 미쳤으나, 3개의 CpG/Em 그룹은 비-CpG/Em (p=0.003) 및 플라시보 (p<0.001) 그룹과만 통계적으로 달랐다.

상기한 명세서는 당업자가 본 발명을 실시예하도록 하기에 충분한 것으로 여겨진다. 본 발명은 제공된 실시예에 의하여 그 범위가 한정되지 않으며, 상기 실시예는 본 발명의 일 양상의 하나의 예시로서 의도한 것이고 기능적으로 균등한 구체예가 본 발명의 범위내에 있다. 본 명세서에 나타내어지고 개시된 내용에 더하여 본 발명의 다양한 변경은 상기 명세서로부터 당업자에게 명확하게 될 것이며 첨부된 청구범위의 범위 내에 들어간다. 본 발명의 잇점과 목적은 본 발명의 각 구체예에 의하여 반드시 포함되어질 필요는 없다.

본 출원에서 언급된 모든 참고 문헌, 특허 및 공개 특허는 원용에 의하여 본 명세서에 포함되어진다.

SEQUENCE LISTING <110> QIAGEN GmbH <120> CPG FORMULATIONS AND RELATED METHODS <130> PA098-PCT <140> PCT/EP02/11206 <141> 2002-10-07 <150> US 60/327,734 <151> 2001-10-06 <160> 154 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 15 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 gctagacgtt agcgt 15 <210> 2 <211> 15 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 gctagatgtt agcgt 15 <210> 3 <211> 15 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 gctagacgtt agcgt 15 <210> 4 <211> 15 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 gctagacgtt agcgt 15 <210> 5 <211> 15 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 gcatgacgtt gagct 15 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 6 atggaaggtc cagcgttctc 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 7 atcgactctc gagcgttctc 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 8 atcgactctc gagcgttctc 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 9 atcgactctc gagcgttctc 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 10 atggaaggtc caacgttctc 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 11 gagaacgctg gaccttccat 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 12 gagaacgctc gaccttccat 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 13 gagaacgctc gaccttcgat 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 14 gagaacgctg gaccttccat 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 15 gagaacgatg gaccttccat 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 16 gagaacgctc cagcactgat 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 17 tccatgtcgg tcctgatgct 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 18 tccatgtcgg tcctgatgct 20 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 19 tccatgacgt tcctgatgct 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 20 tccatgtcgg tcctgctgat 20 <210> 21 <211> 8 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 21 tcaacgtt 8 <210> 22 <211> 8 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 22 tcagcgct 8 <210> 23 <211> 8 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 23 tcatcgat 8 <210> 24 <211> 8 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 24 tcttcgaa 8 <210> 25 <211> 7 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 25 caacgtt 7 <210> 26 <211> 8 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 26 ccaacgtt 8 <210> 27 <211> 8 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 27 aacgttct 8 <210> 28 <211> 8 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 28 tcaacgtc 8 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 29 atggactctc cagcgttctc 20 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 30 atggaaggtc caacgttctc 20 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 31 atcgactctc gagcgttctc 20 <210> 32 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 32 atggaggctc catcgttctc 20 <210> 33 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 33 atcgactctc gagcgttctc 20 <210> 34 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 34 atcgactctc gagcgttctc 20 <210> 35 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 35 tccatgtcgg tcctgatgct 20 <210> 36 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 36 tccatgccgg tcctgatgct 20 <210> 37 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 37 tccatggcgg tcctgatgct 20 <210> 38 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 38 tccatgacgg tcctgatgct 20 <210> 39 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 39 tccatgtcga tcctgatgct 20 <210> 40 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 40 tccatgtcgc tcctgatgct 20 <210> 41 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 41 tccatgtcgt ccctgatgct 20 <210> 42 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 42 tccatgacgt gcctgatgct 20 <210> 43 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 43 tccataacgt tcctgatgct 20 <210> 44 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 44 tccatgacgt ccctgatgct 20 <210> 45 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 45 tccatcacgt gcctgatgct 20 <210> 46 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 46 ggggtcaacg ttgacgggg 19 <210> 47 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 47 ggggtcagtc gtgacgggg 19 <210> 48 <211> 15 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 48 gctagacgtt agtgt 15 <210> 49 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 49 tccatgtcgt tcctgatgct 20 <210> 50 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 50 accatggacg atctgtttcc cctc 24 <210> 51 <211> 18 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 51 tctcccagcg tgcgccat 18 <210> 52 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 52 accatggacg aactgtttcc cctc 24 <210> 53 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 53 accatggacg agctgtttcc cctc 24 <210> 54 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 54 accatggacg acctgtttcc cctc 24 <210> 55 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 55 accatggacg tactgtttcc cctc 24 <210> 56 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 56 accatggacg gtctgtttcc cctc 24 <210> 57 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 57 accatggacg ttctgtttcc cctc 24 <210> 58 <211> 15 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 58 cacgttgagg ggcat 15 <210> 59 <211> 12 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 59 tcagcgtgcg cc 12 <210> 60 <211> 17 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 60 atgacgttcc tgacgtt 17 <210> 61 <211> 17 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 61 tctcccagcg ggcgcat 17 <210> 62 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 62 tccatgtcgt tcctgtcgtt 20 <210> 63 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 63 tccatagcgt tcctagcgtt 20 <210> 64 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 64 tcgtcgctgt ctccccttct t 21 <210> 65 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 65 tcctgacgtt cctgacgtt 19 <210> 66 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 66 tcctgtcgtt cctgtcgtt 19 <210> 67 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 67 tccatgtcgt ttttgtcgtt 20 <210> 68 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 68 tcctgtcgtt ccttgtcgtt 20 <210> 69 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 69 tccttgtcgt tcctgtcgtt 20 <210> 70 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 70 tcctgtcgtt ttttgtcgtt 20 <210> 71 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 71 tcgtcgctgt ctgcccttct t 21 <210> 72 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 72 tcgtcgctgt tgtcgtttct t 21 <210> 73 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 73 tccatgcgtg cgtgcgtttt 20 <210> 74 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 74 tccatgcgtt gcgttgcgtt 20 <210> 75 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 75 tccacgacgt tttcgacgtt 20 <210> 76 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 76 tcgtcgttgt cgttgtcgtt 20 <210> 77 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 77 tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24 <210> 78 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 78 tcgtcgttgt cgttttgtcg tt 22 <210> 79 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 79 gcgtgcgttg tcgttgtcgt t 21 <210> 80 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 80 tgtcgtttgt cgtttgtcgt t 21 <210> 81 <211> 25 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 81 tgtcgttgtc gttgtcgttg tcgtt 25 <210> 82 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 82 tgtcgttgtc gttgtcgtt 19 <210> 83 <211> 14 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 83 tcgtcgtcgt cgtt 14 <210> 84 <211> 13 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 84 tgtcgttgtc gtt 13 <210> 85 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 85 tccatagcgt tcctagcgtt 20 <210> 86 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 86 tccatgacgt tcctgacgtt 20 <210> 87 <211> 6 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 87 gtcgyt 6 <210> 88 <211> 7 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 88 tgtcgyt 7 <210> 89 <211> 18 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 89 agctatgacg ttccaagg 18 <210> 90 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 90 tccatgacgt tcctgacgtt 20 <210> 91 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 91 atcgactctc gaacgttctc 20 <210> 92 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 92 tccatgtcgg tcctgacgca 20 <210> 93 <211> 8 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 93 tcttcgat 8 <210> 94 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 94 ataggaggtc caacgttctc 20 <210> 95 <211> 15 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 95 gctagagggg agggt 15 <210> 96 <211> 15 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 96 gctagatgtt agggg 15 <210> 97 <211> 15 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 97 gctagagggg agggt 15 <210> 98 <211> 15 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 98 gctagagggg agggt 15 <210> 99 <211> 15 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 99 gcatgagggg gagct 15 <210> 100 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 100 atggaaggtc cagggggctc 20 <210> 101 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 101 atggactctg gagggggctc 20 <210> 102 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 102 atggactctg gagggggctc 20 <210> 103 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 103 atggactctg gagggggctc 20 <210> 104 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 104 atggaaggtc caaggggctc 20 <210> 105 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 105 gagaaggggg gaccttccat 20 <210> 106 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 106 gagaaggggg gaccttccat 20 <210> 107 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 107 gagaaggggg gaccttggat 20 <210> 108 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 108 gagaaggggg gaccttccat 20 <210> 109 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 109 gagaaggggg gaccttccat 20 <210> 110 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 110 gagaaggggc cagcactgat 20 <210> 111 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 111 tccatgtggg gcctgatgct 20 <210> 112 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 112 tccatgtggg gcctgatgct 20 <210> 113 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 113 tccatgaggg gcctgatgct 20 <210> 114 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 114 tccatgtggg gcctgctgat 20 <210> 115 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 115 atggactctc cggggttctc 20 <210> 116 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 116 atggaaggtc cggggttctc 20 <210> 117 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 117 atggactctg gaggggtctc 20 <210> 118 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 118 atggaggctc catggggctc 20 <210> 119 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 119 atggactctg gggggttctc 20 <210> 120 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 120 atggactctg gggggttctc 20 <210> 121 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 121 tccatgtggg tggggatgct 20 <210> 122 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 122 tccatgcggg tggggatgct 20 <210> 123 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 123 tccatggggg tcctgatgct 20 <210> 124 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 124 tccatggggg tcctgatgct 20 <210> 125 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 125 tccatgtggg gcctgatgct 20 <210> 126 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 126 tccatgtggg gcctgatgct 20 <210> 127 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 127 tccatggggt ccctgatgct 20 <210> 128 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 128 tccatggggt gcctgatgct 20 <210> 129 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 129 tccatggggt tcctgatgct 20 <210> 130 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 130 tccatggggt ccctgatgct 20 <210> 131 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 131 tccatcgggg gcctgatgct 20 <210> 132 <211> 14 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 132 gctagaggga gtgt 14 <210> 133 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 133 gggggggggg gggggggggg 20 <210> 134 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 134 actgacagac tgacagactg a 21 <210> 135 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 135 agtgacagac agacacactg a 21 <210> 136 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 136 actgacagac tgatagaccc a 21 <210> 137 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 137 agtgagagac tgcaagactg a 21 <210> 138 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 138 aatgccagtc cgacaggctg a 21 <210> 139 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 139 ccagaacaga agcaatggat g 21 <210> 140 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 140 cctgaacaga agccatggat g 21 <210> 141 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 141 gcagaacaga agacatggat g 21 <210> 142 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 142 ccacaacaca agcaatggat a 21 <210> 143 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 143 aagctagcca gctagctagc a 21 <210> 144 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 144 cagctagcca cctagctagc a 21 <210> 145 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 145 aagctaggca gctaactagc a 21 <210> 146 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 146 gagctagcaa gctagctagg a 21 <210> 147 <211> 10 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (5)..(6) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (9)..(10) <223> n is a, c, g, or t <400> 147 tcntnncgnn 10 <210> 148 <211> 7 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> n is a, c, g, or t <400> 148 gggnggg 7 <210> 149 <211> 11 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> n is a, c, g, or t <400> 149 gggngggngg g 11 <210> 150 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 150 tcgtcgttgt cgttttgtcg tt 22 <210> 151 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 151 ctggtctttc tggttttttt ctgg 24 <210> 152 <211> 27 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 152 tcgcgtgcgt tttgtcgttt tgacgtt 27 <210> 153 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 153 tcgtcgtttg tcgttttgtc gtt 23 <210> 154 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 154 gggggacgat cgtcgggggg 20

Claims (45)

1. 바이러스로 감염되거나 바이러스 감염의 위험이 있는 인간이 아닌 동물에 바이러스 방출 (shedding)을 감소시키기에 효과적인 양의 면역자극성 핵산 및 수 중 유 에멀션을 투여하는 단계를 포함하는, 인간이 아닌 동물에서 바이러스 방출을 감소시키는 방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 수 중 유 에멀션은 EMULSIGEN^TM인 방법.
3. 제1항에 있어서, 항원은 상기 인간이 아닌 동물에 투여되지 않은 것을 특징으로 하는 방법.
4. 제1항에 있어서, 상기 인간이 아닌 동물에 항원을 투여하는 단계를 더 포함하는 방법.
5. 제1항에 있어서, 항 바이러스제를 투여하는 단계를 더 포함하는 방법.
6. 제5항에 있어서, 상기 항 바이러스제는 아세마난; 아씨클로비르; 아씨클로비르 소듐; 아데포비르; 알로부딘; 알비르셉트 수도톡스; 아만타딘 염산; 아라노틴; 아릴돈; 아테비르딘 메실레이트; 아브리딘; 씨도포비르; 씨팜필린; 씨타라빈 염산; 델라비르딘 메실레이트; 데시클로비르; 디다노신; 디스옥사릴; 에독수딘; 엔비라덴; 엔비르옥심; 팜씨클로비르; 파모틴 염산; 피아씨타빈; 피알우리딘; 포사릴레이트; 포스카르네트 소듐; 포스포네트 소듐; 간시클로비르; 간시클로비르 소듐; 이독수리딘; 케톡살; 라미부딘; 로부카비르; 메모틴 염산; 메티사존; 네비라핀; 펜시클로비르; 피로다비르; 리바비린; 리만타딘 염산; 사퀴나비르 메실레이트; 소만타딘 염산; 소리부딘; 스타톨론; 스타부딘; 틸로론 염산; 트리플루리딘; 발라시클로비르 염산; 비다라빈; 비다라빈 포스페이트; 비다라빈 소듐 포스페이트; 비록심; 잘씨타빈; 지도부딘; 및 진비록심으로 구성되는 군으로부터 선택되는 방법.
7. 제1항에 있어서, 인간이 아닌 동물은 개, 고양이, 말, 소, 돼지, 양, 염소, 영장류 또는 닭인 방법.
8. 항원보강된 (adjuvanted) 백신으로부터 야기되는 조직 손상을 감소시키기에 효과적인 양의 항원보강된 백신 및 면역자극성 핵산을 침습성 경로에 의하여 개체에 투여하는 단계를 포함하고, 상기 백신은 수 중 유 에멀션으로 항원보강된 것임을 특징으로 하는, 개체의 백신 접종으로 인한 조직 손상을 감소시키는 방법.
9. 제8항에 있어서, 상기 수 중 유 에멀션은 EMULSIGEN^TM인 방법.
10. 제8항에 있어서, 상기 침습성 경로는 피하인 방법.
11. 제8항에 있어서, 상기 침습성 경로는 근육내인 방법.
12. 면역 반응을 생성하기에 효과적인 양의 수 중 유 에멀션 및 CpG 올리고뉴클레오티드를 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 면역 반응을 유도하는 방법.
13. 제12항에 있어서, 상기 면역 반응은 항원 특이적 면역 반응인 방법.
14. 제12항에 있어서, 항원을 투여하는 단계를 더 포함하는 방법.
15. 제12항에 있어서, 상기 수 중 유 에멀션은 EMULSIGEN^TM인 방법.
16. 제12항에 있어서, 상기 개체는 암을 가지고 있는 것을 특징으로 하는 방법.
17. 제12항에 있어서, 상기 개체는 감염성 질환을 가지고 있는 것을 특징으로 하는 방법.
18. 제12항에 있어서, 상기 개체는 감염성 질환을 발생시킬 위험이 있는 것인 방법.
19. 서브 치료적 투여량의 항원과 면역자극성 핵산을 개체에 투여하는 단계를 포함하고, 상기 서브 치료적 투여량의 항원과 면역자극성 핵산의 조합은 항원 특이적 면역 반응을 생성하는 것을 특징으로 하는, 항원 특이적 면역 반응을 생성시키기 위하여 개체에 투여되는 항원의 투여량을 감소시키는 방법.
20. 제19항에 있어서, 상기 항원의 서브 치료적 투여량은 상기 항원이 알럼과 제제화되는 경우 항원 특이적 면역 반응을 생성하기에 최소 효과적인 투여량의 항원 보다 50 % 미만의 용량인 방법.
21. 제19항에 있어서, 상기 항원의 서브 치료적 투여량은 상기 항원이 알럼과 제제화되는 경우 항원 특이적 면역 반응을 생성하기에 최소 효과적인 투여량의 항원 보다 90 % 미만의 용량인 방법.
22. 제1항, 제8항, 제12항 또는 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역 자극성 핵산은 CpG 올리고뉴클레오티드인 방법.
23. 제22항에 있어서, 상기 CpG 올리고뉴클레오티드는 균일한 간격으로 투여되는 방법.
24. 제22항에 있어서, 주 단위로 투여되는 방법.
25. 제22항에 있어서, 상기 CpG 올리고뉴클레오티드는 일 단위로 투여되는 방법.
26. 제22항에 있어서, 상기 CpG 올리고뉴클레오티드는 개월 단위로 투여되는 방법.
27. 제22항에 있어서, 상기 CpG 올리고뉴클레오티드는 경구로 투여되는 방법.
28. 제22항에 있어서, 상기 CpG 올리고뉴클레오티드는 주사에 의하여 투여되는 방법.
29. 제22항에 있어서, 상기 CpG 올리고뉴클레오티드는 지속 방출 장치 (sustained release device)를 통하여 투여되는 방법.
30. 제22항에 있어서, 상기 CpG 올리고뉴클레오티드는

    2007 (TCGTCGTTGTCGTTTTGTCGTT);

    2142 (TCGCGTGCGTTTTGTCGTTTTGACGTT);

    2135 (TCGTCGTTTGTCGTTTTGTCGTT); 및

    2216 (ggGGGACGATCGTCgggggG)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 방법.
31. 제1항, 제8항, 제12항 또는 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역 자극성 핵산은 T-부유 핵산인 방법.
32. 제31항에 있어서, 상기 T-부유 핵산은 서열번호 52 내지 서열번호 57 및 서열번호 62 내지 서열번호 94로 구성되는 군으로부터 선택되는 서열을 갖는 방법.
33. 제1항, 제8항, 제12항 또는 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역 자극성 핵산은 폴리-G 핵산인 방법.
34. 제33항에 있어서, 상기 폴리-G 핵산은 서열번호 46, 서열번호 47, 서열번호 58, 서열번호 61 및 서열번호 95 내지 서열번호 133으로 구성되는 군으로부터 선택되는 서열을 갖는 방법.
35. 제1항, 제8항, 제12항 또는 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역 자극성 핵산은 서열번호 1 내지 서열번호 146으로 구성되는 군으로부터 선택되는 서열을 갖는 방법.
36. 제1항, 제8항, 제12항 또는 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 개체는 골 암, 뇌 및 중추신경계 암, 결합조직암, 식도암, 눈암, 호치킨 림프종, 후두암, 구강암, 피부암, 및 고환암으로 구성되는 군으로부터 선택되는 암을 갖는 방법.
37. 제1항, 제8항, 제12항 또는 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역 자극성 핵산은 개질된 골격을 갖는 방법.
38. 제37항에 있어서, 상기 개질된 골격은 포스페이트 개질된 골격인 방법.
39. 제38항에 있어서, 상기 포스페이트 개질된 골격은 포스포로티오에이트 개질된 골격인 방법.
40. 제37항에 있어서, 상기 개질된 골격은 펩티드 개질된 올리고뉴클레오티드 골격인 방법.
41. 제1항, 제8항, 제12항 또는 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 개체는 면역약화된 (immunocompromised) 개체인 방법.
42. 제1항, 제8항, 제12항 또는 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 개체는 바이러스, 박테리아, 진균 및 기생충 감염으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 감염성 질환을 가지고 있는 것인 방법.
43. 제1항, 제8항, 제12항 또는 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 개체는 바이러스, 박테리아, 진균 및 기생충 감염으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 감염성 질환을 발생시킬 위험이 있는 것인 방법.
44. 면역 자극성 핵산 및 수 중 유 에멀션을 포함하는 조성물.
45. 제44항에 있어서, 상기 수 중 유 에멀션은 EMULSIGEN^TM인 방법.