CN100438908C

CN100438908C - CpG制剂及相关方法

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Publication number: CN100438908C
Application number: CNB028227158A
Authority: CN
Inventors: L·A·巴比尤克; R·海克尔
Original assignee: University of Saskatchewan; Merial Ltd
Current assignee: University of Saskatchewan; Merial Ltd
Priority date: 2001-10-06
Filing date: 2002-10-07
Publication date: 2008-12-03
Anticipated expiration: 2022-10-07
Also published as: CA2471968C; AU2002347062B2; HK1065722A1; CN1671414A; WO2003030934A2; WO2003030934A3; US20050238660A1; EP1434602B1; KR20050048539A; CA2471968A1; JP2005508945A; EP1434602A2

Abstract

本发明涉及与其它治疗制剂例如水包油乳剂组合的免疫刺激核酸的方法和组合物。制剂组合以不同的剂量或以不同的时间表给药，用于治疗紊乱例如疾病和癌症。

Description

CpG制剂及相关方法

发明领域

本发明涉及与其它治疗制剂组合的免疫刺激性核酸的用途。

发明背景

仅在美国因感染性疾病所致的死亡率在1980和1992年间上升58％。在此期间，与感染性疾病对抗的抗感染疗法的应用显著增长，目前成为每年数十亿美元的产业。即使存在抗感染剂应用的这些增长，感染性疾病的治疗和预防依然是全世界医学领域的难题。一般说来，存在3类抗感染剂，抗细菌剂、抗病毒剂和抗真菌剂，而且即便是在这些类别的制剂内，就它们用于治疗的微生物类型而言，仍存在一些重叠。

抗感染剂疗法的一个问题是发生在用该抗感染剂治疗的宿主中的副作用。例如，许多抗感染剂能够杀死或抑制广谱的微生物，而非特定类型物种特异性的。用这些类型的抗感染剂治疗导致杀死生活在宿主内的正常微生物菌群及传染微生物。微生物菌群的丧失能够引起疾病并发症，并使得宿主易被其它病原体感染，因为微生物菌群与传染性病原体竞争并起屏障的作用。其它副作用可能由于这些化学药品对宿主的非微生物细胞或组织的特异性或非特异性作用而引起。

除了抗感染剂之外，疫苗被用于预防和治疗感染性疾病。疫苗包括与佐剂组合的抗原。佐剂在疫苗治疗和预防感染性疾病的功效方面起着重要作用。除了提高免疫应答的强度和动力学，佐剂还起着决定所产生的免疫应答的类型的作用。铝化合物，包括氢氧化铝和磷酸铝，被广泛用于人类疫苗。这些佐剂使免疫应答偏向T-辅助细胞2型(Th2)应答，它的特征是Th2型细胞因子例如IL-4和IL-5的分泌以及IgG1和IgE型抗体的产生，但细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答微弱或者不存在(Bofraford，R.1998.Will adiuvants be needed for vaccines of thefuture？Dev.Biol.Stand.92：13-17；Brazolot Millan，C.L.等1998.CpGDNA can induce strong Th1 humoral and cell-mediated immuneresponses against hepatitis B surface antigen in young mice.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：15553-15558；Davis，H.L.等1998.CpG DNA is apotent enhancer of specific immunity in mice immunized withrecombinant hepatitis B surface antigen.J：Immunol 160：870-876)。适当类型的免疫应答对于成功免疫是必要的。与Th1型免疫应答相关联的强有力的先天免疫被认为对于控制胞内病原体是必要的，反之，强有力的体液免疫，其被发现与Th1和Th2型免疫应答相关，似乎对于控制胞外病原体是必要的(Constant，S.L.和K.Bottomly.1997.Induction of Th1 and Th2 CD4+T cell responses：the alternativeapproaches.Ann.Rev.Immunol.15：297-322)。含有未甲基化的CpG二核苷酸的合成寡聚脱氧核糖核苷酸(CpG ODN)是新佐剂，已知其促进Th1型免疫应答，分泌IFN-γ、TNF-α和IL-12细胞因子，调理诸如那些IgG2a同型的抗体，和强CTL诱导(Chu，R.S.等1997.CpGoligodeoxynucleotides act as adjuvants that switch on T helper 1(Th1)immunity.J.Exp.Med 186：1623-1631；Klinman，D.M等1999.CpGmotifs as immune adjuvants.Vaccine 17：19-25)。

牛疱疹病毒-1(Bovine herpesvirus-1，BHV-1)，α疱疹病毒亚科的一个成员，与包括鼻气管炎、外阴阴道炎、流产、结膜炎(conjuctivitis)、脑炎以及全身性的系统感染在内的许多临床疾病表现有关(Gibbs，E.P.J.和M.M.Rweyemamu.1977.Bovine herpesvirus-1，p.31：Anonymous Bovine herpesvirus.Vet.Bull，London；Yates，W.D.G.1982.A review of infectious bovine rhinotrachetitis，shipping feverpneumonia and viral-bacterial synergism in respiratory disease of cattle.Can.J.Comp.Med 46：225-263)。牛呼吸道疾病在北美导致养牛业每年高达10亿美元的损失(Yates，W.D.G.1982.A review of infectiousbovine rhinotrachetitis，shipping fever pneumonia and viral-bacterialsynergism in respiratory disease of cattle.Can.J.Comp.Med 46：225-263)。即使有减毒活疫苗以及灭活疫苗可用，这些损失仍然发生。目前，能够最大潜力地集合针对BHV-1的功效、安全性、抗原特异性和保护的在于亚单位疫苗，它由一种或多种病毒糖蛋白gB、gC和gD，以及佐剂组成。但是，常规佐剂例如VSA3，不仅产生Th2-样免疫应答，而且不被代谢并遗留注射部位反应。这种反应是人类或兽医疫苗所无法接受的。

发明概述

本发明提供了利用免疫刺激核酸联合特定的制剂治疗受试个体的改善的方法和产品。本发明部分地建立在当某些类型的免疫刺激核酸与特定制剂联合使用时，观察到意料之外的、改善的结果这一发现的基础上。例如，某些免疫刺激核酸和制剂联合的功效比免疫刺激核酸单独使用有极大的提高。这个结果令人惊讶，部分地是因为免疫刺激核酸与制剂是通过不同的机制起作用的，不会必然地预期能以协同的方式提高另一个的功效。

在一方面，本发明涉及通过向感染病毒或具有病毒感染风险的非人动物施用降低病毒释放(viral shedding)有效量的免疫刺激核酸和水包油乳剂，来降低非人动物体内病毒释放的方法。在一个实施方案中，水包油乳剂是EMULSIGEN^TM。可选地，非人动物为狗、猫、马、牛、猪、绵羊、山羊、灵长类动物或鸡。

活性剂的组合可以与或不与抗原或抗病毒剂一起给药。在一些实施方案中，抗病毒剂从由醋孟南(Acemannan)、阿昔洛韦(Acyclovir)、阿昔洛韦钠(Acyclovir Sodium)、阿德福韦(Adefovir)、Alovudine、阿韦舒托(Alvircept Sudotox)、盐酸金刚烷胺(AmantadineHydrochloride)、阿拉诺丁(Aranotin)、阿立酮(Arildone)、甲磺酸阿替韦啶(Atevirdine Mesylate)、阿夫立定(Avridine)、Cidofovir、Cipamfylline、盐酸阿糖胞苷(Cytarabine Hydrochloride)、甲磺酸地拉夫定(Delavirdine Mesylate)、地昔洛韦(Desciclovir)、去羟肌苷(Didanosine)、二噁沙利(Disoxaril)、依度尿苷(Edoxudine)、恩韦拉登(Enviradene)、恩韦肟(Enviroxime)、泛昔洛韦(Famciclovir)、盐酸法莫汀(Famotine Hydrochloride)、非西他滨(Fiacitabine)、非阿尿苷(Fialuridine)、膦利脂(Fosarilate)、膦甲酸钠(FoscarnetSodium)、膦乙酸钠(Fosfonet Sodium)、更昔洛韦(Ganciclovir)、更昔洛韦钠(Ganciclovir Sodium)、碘苷(Idoxuridine)、乙氧丁酮醛(Kethoxal)、拉米夫定(Lamivudine)、洛布卡韦(Lobucavir)、盐酸美莫汀(Memotine Hydrochloride)、美替沙腙(Methisazone)、奈韦拉平(Nevirapine)、喷昔洛韦(Penciclovir)、吡罗达韦(Pirodavir)、利巴韦林(Ribavirin)、盐酸金刚乙胺(RimantadineHydrochloride)、甲磺酸沙奎那韦(Saquinavir Mesylate)、盐酸索金刚胺(Somantadine Hydrochloride)、索立夫定(Sorivudine)、维司托隆(Statolon)、司他夫定(Stavudine)、盐酸替洛隆(TiloroneHydrochloride)、曲氟尿苷(Trifluridine)、盐酸伐昔洛韦(ValaciclovirHydrochloride)、阿糖腺苷(Vidarabine)、磷酸阿糖腺苷(VidarabinePhosphate)、磷酸阿糖腺苷钠(Vidarabine Sodium Phosphate)、韦罗肟(Viroxime)、扎西他滨(Zalcitabine)、齐多夫定(Zidovudine)和净韦肟(Zinviroxime)组成的组中选择。

在另一方面，本发明是通过经侵入途径向受试个体施用加佐剂疫苗(adjuvanted vaccine)以及降低加佐剂疫苗引起的组织损伤有效量的免疫刺激核酸，来降低受试个体接种后的组织损伤的方法，其中疫苗以水包油乳剂为佐剂。在一个实施方案中，水包油乳剂是EMULSIGEN^TM。侵入途径可以是造成组织屏障(例如皮肤)开口的任何类型途径。在一些实施方案中，侵入途径是皮下或肌内途径。

根据另一方面，本发明是通过向受试个体施用产生免疫应答有效量的CpG寡核苷酸和水包油乳剂，来诱导免疫应答的方法。可选地，免疫应答为抗原特异性免疫应答，并向受试个体施用抗原。在一个实施方案中，水包油乳剂是EMULSIGEN^TM。

而根据另一方面，本发明涉及通过向受试个体施用亚治疗剂量的抗原和免疫刺激核酸，来降低向受试个体给药产生抗原特异性免疫应答的抗原剂量的方法，其中亚治疗剂量的抗原和免疫刺激核酸的联合产生抗原特异性免疫应答。在一些实施方案中，抗原的亚治疗剂量是比在抗原与明矾配制时产生抗原特异性免疫应答的抗原最小有效剂量少至少50％的剂量。作为选择地，抗原的亚治疗剂量可以是比在抗原与明矾配制时产生抗原特异性免疫应答的抗原最小有效剂量少至少90％的剂量。

本发明的方法包括免疫刺激核酸的应用。免疫刺激核酸可以是CpG寡核苷酸，而且在一些实施方案中是2007(TCGTCGTTGTCGTTTTGTCGTT)、2142(TCGCGTGCGTTTTGTCGTTTTGACGTT)、2135(TCGTCGTTTGTCGTTTTGTCGTT)和/或2216(ggGGGACGATCGTCgggggG)。作为选择地，免疫刺激核酸可以是富含T的核酸，例如SEQ ID NO：52-57和/或SEQ ID NO：62-94的ODN，或者多聚-G核酸例如SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：61和/或SEQ ID NO：95-133的ODN。在另外的实施方案中，免疫刺激核酸可以具有从由SEQ ID NO：1到SEQ ID NO：146组成的组中选择的序列。

免疫刺激核酸，例如CpG寡核苷酸可以单次或多次给药。如果CpG寡核苷酸多次给药，它可以定期给药，例如，象以周计、以天计或以月计。

免疫刺激核酸，例如CpG寡核苷酸，可以通过任何途径给药。例如，免疫刺激核酸可以通过口服、通过注射、或者通过持续释放装置给药。

在本发明的一些实施方案中，受试个体患有癌症或感染性疾病。在其它实施方案中，受试个体处于患癌症或感染性疾病的风险中。可选地，受试个体患有从由骨癌、脑癌和CNS癌、结缔组织癌、食道癌、眼癌、霍奇金淋巴瘤、喉癌、口腔癌、皮肤癌和睾丸癌组成的组中选择的癌症。受试个体还可能是免疫受损的(immunocompromised)个体。在其它实施方案中，受试个体具有选自病毒性、细菌性、真菌性和寄生虫性感染的感染性疾病。而在另一个实施方案中，受试个体处于患从由病毒性、细菌性、真菌性和寄生虫性感染组成的组中选择的感染性疾病的风险中。

免疫刺激核酸可以具有修饰的主链，例如磷酸修饰的主链或肽修饰的寡核苷酸主链。在一个实施方案中，磷酸修饰的主链为硫代磷酸修饰的主链。

在另一方面，本发明是免疫刺激核酸与水包油乳剂的组合物。在一个实施方案中，水包油乳剂为EMULSIGEN^TM。

在本发明所有方面的某些实施方案中，免疫刺激核酸可以是刺激Th1免疫应答的核酸。类似地，在本发明的某些方面，有可能向受试个体给药一种或多种不同的免疫刺激核酸。因此根据此实施方案，可以在特定的方法中向受试个体给药一种、两种、三种、四种、五种或更多不同的免疫刺激核酸。因此，术语“免疫刺激核酸”旨在包括单个免疫刺激核酸、特定类型的多种免疫刺激核酸，以及不同类型的多种免疫刺激核酸。

根据其它实施方案，免疫刺激核酸在给药其它治疗制剂如水包油乳剂、抗原等的同时、之前或之后给药。

在一些实施方案中，免疫刺激核酸以上调、增强或激活免疫应答的有效量给药。在一些实施方案中，免疫刺激核酸以使免疫应答由Th2改向为Th1免疫应答的有效量给药。而在其它实施方案中，给药具有不同的核酸序列并且具有不同的功效的多种免疫核酸分子。

本发明的各种限制可以涵盖本发明的各种实施方案。所以，可以预期涉及任何一个元素或元素组合的本发明的各种限制可以被包括在本发明的各个方面。

附图的简单说明

图1是描绘接种动物和对照动物在初次免疫14、47和64天后，BHV-1中和抗体反应的条形图(Imm 1(14天)：初次免疫后14天，Imm2(47天)：二次免疫后8天，post chall(64天)：病毒攻击后11天)。抗体滴度表达为使用100PFU BHV-1的50％终点。误差条表示7个动物的几何平均值的标准误差。

图2是描绘接种后细胞免疫应答的三个条形图。数据表达为平均数±平均值标准误差。(a)攻击前后PBMC抗原特异性增殖。刺激指数代表存在抗原时的每分钟计数除以不存在抗原时的每分钟计数。(b)抗原-刺激孔中每10⁶个细胞的斑点数目与非刺激孔中每10⁶个细胞的斑点数目的差别。(c)24小时后PBMC响应BHV-1gD所分泌的IFN-γ的量。

图3是描绘二次免疫8天后(Imm 2)和病毒感染11天后(攻击后)针对BHV-1糖蛋白的血清抗体的两个条形图。(a)针对tgD的抗体，(b)针对tgB的抗体。

图4是描绘在用BHV-1攻击的动物中免疫对直肠温度的影响的两个图。a.平均温度反应b.发热天数；温度≥40℃的全部天数。

图5是描绘在用BHV-1攻击的动物中免疫对体重增加的影响的两个图。(a)累积体重变化。(b)体重损失超过或低于5kg的动物天数(number of animal days)。

图6是描绘-1攻击后病毒复制程度的图。在攻击当天及之后交替的天数中，在免疫动物的鼻分泌物中测定病毒滴度。误差条表示7个动物的几何平均值的标准误差。

发明的详细说明

根据本发明令人惊奇地发现，免疫刺激核酸和治疗制剂例如水包油乳剂的被选组合比其中任一组分单独时作用引人注目地更好，并且有时甚至协同地作用，提高免疫应答。虽然许多制剂已经被开发和测试用于施用药物，但这些特定类型引人注目地增强免疫刺激核酸的活性。这令人惊奇，部分是因为其它相似制剂不表现出与本文描述的治疗制剂同样引人注目的改进。如本文所用的术语“治疗制剂”是指水包油乳剂例如EMULSIGEN^TM。

正如下文所描述的实施例中所证明的那样，免疫刺激核酸的组合在治疗和预防感染性疾病方面表现出显著提高的治疗效果。最近证明CpG ODN与明矾的组合具有增强小鼠免疫应答的极大潜力，与其它佐剂组合相比在注射部位具有最小的副作用(Weeratha，R.D.，等2000.CpG DNA induces stronger immune responses with less toxicity thanother adjuvants.Vaccine 18：1755-1762)。不过，尽管在小鼠中存在有前景的结果，但发现以CpG ODN与明矾组合为佐剂的BHV-1tgD与以单独CpG ODN为佐剂的tgD诱导类似的免疫应答，未能完全保护小牛免受BHV-1的攻击。另外，佐以弗氏不完全佐剂的BHV-1亚单位疫苗也不能保护小牛免受BHV-1的攻击(Israel，B.A.，等1988.Epitopespecificity and protective efficacy of the bovine immune response tobovine herpesvirus-1 glycoprotein vaccines.Vaccine 6：349-356)。

根据本发明令人惊讶地发现，以CpG ODN和水包油乳剂例如EMULSIGEN^TM为共同佐剂的BHV-1 tgD疫苗比单以CpG ODN、VSA3或EMULSIGEN^TM为佐剂或者以非-CpG ODN和EMULSIGEN^TM为共同佐剂的tgD诱导更强和更平稳的免疫应答，而且提供更好的对BHV-1攻击的保护。此外，存在或不存在EMULSIGEN^TM时与CpG ODN配制的tgD诱导的免疫应答是Th1-偏向性的，与跟EMULSIGEN^TM、VSA3或非-CpG ODN和EMULSIGEN^TM配制的那些相反。该数据表明用以CpG ODN和EMULSIGEN^TM为佐剂的疫苗例如BHV-1亚单位疫苗免疫动物，比单以非-CpG ODN和EMULSIGEN^TM、EMULSIGEN^TM、CpG ODN或VSA3为佐剂的疫苗诱导更强更平稳的体液和细胞应答，和更好的抗病毒感染保护。

在牛中，针对BHV-1的防护在主要地是由显著的体液免疫应答介导的。确实，在不存在高抗体滴度下的强细胞免疫不能充分防止感染(Loehr，B.I，等2000.Gene gun-mediated DNA immunization primesdevelopment of mucosal immunity against bovine herpesvirus 1 in cattle.J.Virol.74：6077-6086)。早先的研究指出BHV-1诱导的疾病的有效防止可以通过含有一种或多种病毒糖蛋白的亚单位疫苗实现(Gao，Y.，等1994.Truncated bovine herpesvirus-1 glycoprotein I(gpI)initiates aprotective local immune response in its natural host.Vaccine 12：145-152；Baca-Estrada，M.E.，等1996.Immunogenicity of bovine herpesvirus 1glycoprotein D in mice：effect of antigen form on the induction ofcellular and humoral immune responses.Viral Immunol 9：11-22；Babiuk，L.A.，L.等1996.Immunology of bovine herpesvirus 1 infection.Vet.Microbiol.53：31-42；Zhu，X，S.等1997.Yeast-secreted bovineherpesvirus type 1 glycoprotein D has authentic conformationalstructure and immunogenicity.Vaccine 15：679-688；van DrunenLittel-van den Hurk，S.，等1994.A subunit gIV vaccine，produced bytransfected mammalian cells in culture，induces mucosal immunityagainst bovine herpesvirus-1 in cattle.Vaccine 12：1295-1302)。不过，由于效率低下的体液免疫应答，一些BHV-1亚单位疫苗诱导很小或者没有防止攻击的保护(Israel，B.A.，等1988.Epitope specificity andprotective efficacy of the bovine immune response to bovineherpesvirus-1 glycoprotein vaccines.Vaccine 6：349-356)。常规佐剂例如VSA3产生强烈的免疫应答，但它们留下不受欢迎的注射部位反应。VSA3由以矿物油为基础的乳剂和炎性化合物：溴化双甲基双十八烷基铵(DDA)组成。在人类中，DDA公知诱导宿主注射部位的炎性反应，包括肿胀和疼痛，以及延迟型超敏反应(Vogel，F.R.和M.F.Powell.1995.A compendium of vaccine adjuvants and excipients，p.141-228.InM.F.Powell，M.J Newman，和JR.Burdman(编辑)，Vaccine Design：thesubunit and adjuvant approach.Plenum Press，New York)。由于它的炎性倾向，DDA还被用来诱导大鼠实验用关节炎(Mia，M.Y.，Let al.2000.Dimethyl dioctadecyl ammonium bromide(DDA)-induced artritis in rats：a model of experimental arthritis.J.Autoimmun.14：303-310)。

另外发现利用皮下(s.c.)途径递送可诱导增强的保护性免疫应答。皮下给药由于它的给药容易加上皮肤的免疫活性，在兽医和人类实践中是有用的递送方式。通常疫苗是通过肌内(i.m.)给药的。本发明的组合物当s.c.递送时比i.m.递送可具有甚至更加增强的效果。

下文显示的数据证明免疫刺激核酸与治疗制剂的组合导致病毒释放显著下降。事实上，有些动物表现出零病毒释放。这是极为重要的一个参数，因为它反映了抗感染保护的量。“病毒释放”是指感染病毒的动物在粘膜表面产生病毒颗粒。病毒释放的存在或缺乏可以通过从动物取样(也就是鼻分泌物)，并分析样品中病毒的存在进行确定。如果药物防止病毒释放，则它有效地预防该动物的感染。本发明的治疗制剂中核酸降低甚至消除病毒释放的能力显示了该组合物令人惊讶的效力。

因此，与治疗制剂组合的免疫刺激核酸可刺激免疫系统预防或治疗感染性疾病。由该核酸的免疫刺激能力所致的强而平衡的细胞和体液免疫应答反映了受试个体针对入侵微生物的天然防御系统。

如本文所用，术语“预防”、“防治”或“防止”以及“治疗”、“治愈”或“处置”当就预防或治疗感染性疾病而言使用时，是指增强受试个体对微生物的抗性，或者换言之，降低受试个体患该微生物感染性疾病的可能性的预防性治疗，以及受试个体感染后的治疗以便与感染性疾病对抗，例如，减轻或者完全消除疾病或者防止其恶化。

免疫刺激核酸可用于治疗或预防受试个体的感染性疾病。“受试个体”应当意味着人或脊椎哺乳动物，包括但不限于狗、猫、马、牛、猪、绵羊、山羊或灵长类动物，例如猴。在一些实施方案中，受试个体明确排除啮齿类动物例如小鼠。

免疫刺激核酸在本发明的某些方面可用作处置处于患感染性疾病风险中的受试个体的预防药，其中已知或怀疑受试个体暴露于微生物或者预期暴露于微生物。如本文所用的患感染性疾病“风险中的受试个体”是具有暴露于微生物的任何风险的受试个体，例如与感染的受试个体接触或者将要到发现特定微生物的地方旅行的人。例如，有风险的受试个体可能是计划到发现特定微生物的地区旅行的受试个体，或者可能甚至是居住在鉴定到微生物的地区的任何受试个体。处于患感染性疾病风险中的受试个体包括具有暴露于微生物(例如流感)的一般风险，但在本发明的治疗期间没有活动性疾病的那些受试个体，以及由于医学或环境因素使之暴露于特定微生物而被认为是处于患感染性疾病的明确风险中的受试个体。

除了利用免疫刺激核酸和抗微生物剂作为预防治疗，本发明还包括利用药物组合治疗患有感染性疾病的受试个体。“患有感染性疾病的受试个体”是已经与微生物接触过的受试个体。因此，该微生物已经侵入该受试个体的身体。这里所用的词“侵入”是指微生物与受试个体外表面，例如皮肤或粘膜接触和/或指微生物穿过受试个体的外表面。

如本文所用的“感染性疾病”是指由于传染性微生物表面地、局部地或者全身地侵入宿主而引起的疾病。传染性性微生物包括细菌、病毒和真菌。细菌是通过二分分裂无性繁殖的单细胞生物。它们是基于它们的形态学、染色反应、营养和代谢需求、抗原结构、化学组成和基因同源性而被分类和命名的。细菌基于它们的形态学形状可以被分为三组，球形(球菌)、直杆状(杆菌)和弯曲或螺旋杆状(弧菌、弯曲菌、螺菌和螺旋体)。细菌还更常见地基于它们的染色反应而被表征为两类生物，革兰氏阳性和革兰氏阴性。革兰氏染色是微生物实验室普遍进行的染色方法。革兰氏阳性生物在染色操作后保留染料并呈深紫罗兰色。革兰氏阴性生物不保留染料但吸收复染剂因而呈粉红色。

传染性细菌包括，但不限于，革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌。革兰氏阳性菌包括，但不限于，巴氏杆菌属(Pasteurella)物种、葡萄球菌属(Staphylococci)物种和链球菌属(Streptococcus)物种。革兰氏阴性菌包括，但不限于大肠埃希氏菌(Escherichia coli)、假单胞菌属(Pseudomonas)物种和沙门氏菌属(Salmonella)物种。传染性细菌的具体例子包括，但不限于：幽门螺杆菌(Helicobacter pyloris)、布氏疏螺旋体(Borelia burgdorferi)、侵肺军团菌(Legionellapneumophilia)、分枝杆菌属菌种(Mycobacteria sps)(例如结核分枝杆菌(M.tuberculosis)、鸟分枝杆菌(M.avium)，胞内分枝杆菌(M.intracellulare)，堪萨斯分枝杆菌(M.kansaii)，戈登分枝杆菌(M.gordonae))、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonorrhoeae)、脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseriameningitidis)、单核细胞增生利斯特氏菌(Listeria monocytogenes)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)(A组链球菌)、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)(B组链球菌)、链球菌属(Streptococcus)(viridans组)、粪链球菌(Streptococcus faecalis)、牛链球菌(Streptococcus bovis)、链球菌属(Streptococcus)(厌氧种)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、致病性弯曲杆菌属物种(Campylobacter sp.)、肠球菌属(Enterococcus sp.)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、炭疽杆菌(Bacillus antracis)、白喉棒杆菌(corynebacterium diphtheriae)、棒状杆菌属菌种(corynebacterium sp.)、猪红斑丹毒丝菌(Erysipelothrixrhusiopathiae)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringers)、破伤风梭菌(Clostridium tetani)、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、多杀巴斯德氏菌(Pastsurellamultocida)、拟杆菌属(Bacteroides sp.)、具核梭杆菌(Fusobacteriumnucleatum)、念珠状链杆菌(Streptobacillus moniliformis)、苍白密螺旋体(Treponema pallidium)、极细密螺旋体(Treponema pertenue)、钩端螺旋体属(Leptospira)、立克次氏体属(Rickettsia)和衣氏放线菌(Actinomyces israelli)。

病毒是含有核酸核芯和蛋白外壳的小的传染性因子，但不是独立生存的生物。病毒在缺乏它在其中能够复制的活细胞时不能够存活。病毒或者通过内吞作用或者通过直接注入DNA(噬菌体)进入特定的活细胞并繁殖，导致疾病。繁殖的病毒可以接着释放并感染另外的细胞。一些病毒时含DNA的病毒，而其它的为含RNA的病毒。

一旦病毒进入细胞，它可以导致许多生理学效应。一个效应是细胞变性，其中病毒在细胞内的积聚导致细胞死亡和变成碎片，并释放病毒。另一个效应是细胞融合，其中感染的细胞与相邻细胞融合产生合胞体。其它类型的病毒导致细胞增殖，这导致肿瘤形成。

病毒包括，但不限于，interoviruses(包括，但不限于，小RNA病毒科(picornaviridae)的病毒，例如脊髓灰质炎病毒(polio virus)、柯萨奇病毒(coxsackie virus)、人肠道孤病毒(echo virus))、轮状病毒(rotaviruses)、腺病毒(adenovirus)、肝炎病毒(hepatitus)。已经在人类中发现的具体的病毒的例子包括但不限于：逆转录病毒科(Retroviridae)(如人免疫缺陷病毒，例如HIV-1(还被称之为HTLV-III、LAV或HTLV-III/LAV，或者HIV-III；以及其它分离群，例如HIV-LP)；小RNA病毒科(Picornaviridae)(如脊髓灰质炎病毒(polio viruses)、甲型肝炎病毒(hepatitis A virus)、肠道病毒(enteroviruses)、人柯萨奇病毒(Coxsackie viruses)、鼻病毒(rhinoviruses)、人肠道孤病毒(echoviruses))；Calciviridae(如导致肠胃炎的毒株)；披盖病毒科(Togaviridae)(如马脑炎病毒(equineencephalitis viruses)、风疹病毒(rubella viruses))；黄病毒科(Flaviridae)(如登革热病毒(dengue viruses)、脑炎病毒(encephalitisviruses)、黄热病毒(yellow fever viruses))；冠状病毒科(Coronoviridae)(如冠状病毒(coronaviruses))；棒状病毒科(Rhabdoviradae)(如水泡性口膜炎病毒(vesicular stomatitisviruses)、狂犬病病毒(rabies viruses))；冠状病毒科(Coronoviridae)(如冠状病毒(coronaviruses))；棒状病毒科(Rhabdoviradae)(如水泡性口膜炎病毒(vesicular stomatitis viruses)、狂犬病病毒(rabiesviruses))；线状病毒科(Filoviridae)(如欧鲍拉病毒(ebola viruses))；副粘病毒科(Paramyxoviridae)(如副流感病毒(parainfluenzaviruses)、腮腺炎病毒(mumps virus)、麻疹病毒(measles virus)、呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus))；正粘病毒科(Orthomyxoviridae)(如流感病毒(influenza viruses))；布尼亚病毒科(Bungaviridae)(如汉坦病毒(Hantaan viruses)、bunga viruses、白蛉病毒(phleboviruses)和纳伊罗病毒(Nairo viruses))；沙粒病毒科(Arena viridae)(出血热病毒(hemorrhagic fever viruses))；呼肠孤病毒科(Reoviridae)(如呼肠孤病毒(reoviruses)、环状病毒(orbiviurses)和轮状病毒(rotaviruses))；双RNA病毒科(Birnaviridae)；嗜肝DNA病毒科(Hepadnaviridae)(乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus))；细小病毒科(Parvovirida)(细小病毒(parvoviruses))；乳多空病毒科(Papovaviridae)(乳头瘤病毒(papilloma viruses)、多瘤病毒(polyoma viruses))；腺病毒科(Adenoviridae)(大多数腺病毒(adenoviruses))；疱疹病毒科(Herpesviridae)(单纯疱疹病毒(herpes simplex virus)(HSV)1和2、水痘带状疱疹病毒(varicella zoster virus)、巨细胞病毒(cytomegalovirus)(CMV)、疱疹病毒(herpes virus))；痘病毒科(Poxviridae)(天花病毒(variola viruses)、痘苗病毒(vacciniaviruses)、痘病毒(pox viruses))；和虹彩病毒科(Iridoviridae)(如非洲猪瘟病毒(African swine fever virus))；以及无分类病毒(如海绵状脑病的病原体、丁型肝炎病原体(被认为是乙型肝炎病毒的缺损随体)、非-A非-B肝炎因子(1类＝内部传播；2类＝肠胃外传播(即丙型肝炎)；诺沃克因子(Norwalk)和相关病毒，以及星状病毒(astroviruses))。

除了感染人类受试个体导致人类紊乱的病毒，本发明还可用于治疗其它非人脊椎动物。非人脊椎动物也可以患感染性疾病，其可用本文公开的免疫刺激核酸和抗微生物制剂组合预防或治疗。例如，除了治疗传染性人类疾病，本发明的方法可用于治疗或预防非人动物的感染。

人类和非人脊椎动物的传染性病毒包括逆转录病毒、RNA病毒和DNA病毒。这类逆转录病毒包括简单逆转录病毒和复杂逆转录病毒。简单逆转录病毒包括B-型逆转录病毒、C-型逆转录病毒和D-型逆转录病毒亚组。B-型逆转录病毒的例子是小鼠乳腺瘤病毒(MMTV)。C-型逆转录病毒包括亚类C-型A组(包括劳斯肉瘤病毒(RSV)、禽白血病病毒(ALV)和禽类成髓细胞瘤病毒(AMV))和C-型B组(包括鼠白血病病毒(MLV)、猫白血病病毒(FeLV)、鼠肉瘤病毒(MSV)、长臂猿白血病病毒(GALV)、脾坏死病毒(SNV)、网状内皮组织增殖病病毒(RV)和猿肉瘤病毒(SSV))。D-型逆转录病毒包括Mason-Pfizer猴病毒(MPMV)和猿逆转录病毒-1型(SRV-1)。复杂逆转录病毒包括慢病毒、T-细胞白血病病毒和泡沫病毒亚组。慢病毒包括HIV-1，但也包括HIV-2、SIV、绵羊髓鞘脱落病毒、猫免疫缺陷病毒(FIV)以及马传染性贫血病病毒(EIAV)。T-细胞白血病病毒包括HTLV-1、HTLV-II、猿T-细胞白血病病毒(STLV)和牛白血病病毒(BLV)。泡沫病毒包括人泡沫病毒(HFV)、猿泡沫病毒(SFV)和牛泡沫病毒(BFV)。

在脊椎动物中是抗原的其它RNA病毒的例子包括，但不限于，以下：呼肠孤病毒科成员，包括正呼肠孤病毒属(哺乳动物和禽类逆转录病毒多血清型)、环状病毒属(蓝舌病病毒、Eugenangee virus、Kemerovo virus、非洲马瘟病毒和科洛拉多蜱传热病毒)、轮状病毒属(人轮状病毒、内布拉斯加州犊牛腹泻病毒、鼠轮状病毒、猿轮状病毒、牛或绵羊轮状病毒、禽轮状病毒)，小核糖核酸病毒科，包括肠道病毒(脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒A和B、肠细胞病变人孤儿(ECHO)病毒、甲型肝炎病毒、猿肠道病毒、鼠脑脊髓炎(ME)病毒、鼠脊髓灰质炎病毒、牛肠道病毒、猪肠道病毒、心病毒属(脑心肌炎病毒(EMC)、门戈病毒)，鼻病毒属(包括那至少113革亚型的人鼻病毒；其它鼻病毒)，Apthovirus(口蹄疫(FMDV)；Calciviridae科，包括猪水泡疹病毒、San Miguel海狮病毒、猫细小核糖核酸病毒和诺沃克病毒；囊膜病毒科，包括甲病毒属(东方马脑炎病毒、西门利克森林病毒、辛德毕斯病毒、切昆贡亚热病毒、O′Nyong-Nyong病毒、罗斯河病毒、委内瑞拉马脑炎病毒、西方马脑炎病毒)，Flavirius(蚊子传播的黄热病病毒、登革热病毒、日本脑炎病毒、圣路易斯脑炎病毒、墨莱溪谷脑炎病毒、西尼罗河病毒、Kunjin病毒、中欧蜱传播的病毒、远东蜱传播的病毒、科萨努尔森林病毒、Louping III病毒、Powassan病毒、鄂木斯克出血热病毒)，Rubivirus属(风疹病毒)，瘟病毒(粘膜病病毒、猪瘟病毒、边境病病毒)，Bunyaviridae，包括Bunyvirus属(Bunyamwera及相关病毒、加利福尼亚脑炎类病毒)，Phlebovirus属(白蛉热西西里岛病毒、里夫特山谷热病毒)，Nairovirus属(克里米亚-刚果出血热病毒、内罗毕绵羊病病毒)以及Uukuvirus属(Uukuniemi及相关病毒)；正粘病毒科，包括流感病毒属(A型流感病毒，许多人亚型)；猪流感病毒以及禽和马流感病毒；B型流感病毒(许多人亚型)以及C型流感病毒(可能是独立的属)；副粘病毒科，包括副粘病毒属(1型副流感病毒、仙台病毒、血细胞吸附病毒、2到5型副流感病毒、新城疫病毒、腮腺炎病毒)，Morbillivirus属(麻疹病毒、亚急性硬化性全脑炎病毒、瘟热病毒、牛瘟病毒)，肺炎病毒属(呼吸道合胞体病毒(RSV)、牛呼吸道合胞病毒和小鼠肺炎病毒)；森林病毒、辛德毕斯病毒、切昆贡亚热病毒、O′Nyong-Nyong病毒、罗斯河病毒、委内瑞拉马脑炎病毒、西方马脑炎病毒)，Flavirius属(蚊子传播的黄热病病毒、登革热病毒、日本脑炎病毒、圣路易斯脑炎病毒、墨莱溪谷脑炎病毒、西尼罗河病毒、Kunjin病毒、中欧蜱传播的病毒、远东蜱传播的病毒、科萨努尔森林病毒、Louping III病毒、Powassan病毒、鄂木斯克出血热病毒)，Rubivirus属(风疹病毒)，瘟病毒(粘膜病病毒、猪瘟病毒、边境病病毒)；Bunyaviridae，包括Bunyvirus属(Bunyamwera及相关病毒、加利福尼亚脑炎类病毒)，Phlebovirus属(白蛉热西西里岛病毒、里夫特山谷热病毒)，Nairovirus属(克里米亚-刚果出血热病毒、内罗毕绵羊病病毒)以及Uukuvirus属(Uukuniemi及相关病毒)；正粘病毒科，包括流感病毒属(A型流感病毒，许多人亚型)；猪流感病毒以及禽和马流感病毒；B型流感病毒(许多人亚型)以及C型流感病毒(可能是独立的属)；副粘病毒科，包括副粘病毒属(1型副流感病毒、仙台病毒、血细胞吸附病毒、2到5型副流感病毒、新城疫病毒、腮腺炎病毒)，Morbillivirus属(麻疹病毒、亚急性硬化性全脑炎病毒、瘟热病毒、牛瘟病毒)，肺炎病毒属(呼吸道合胞体病毒(RSV)、牛呼吸道合胞病毒和小鼠肺炎病毒)；弹状病毒科，包括Vesiculovirus属(VSV)、Chandipura病毒、弗兰德-雄鹿公园病毒)、狂犬病毒属(狂犬病病毒)、鱼弹状病毒、以及两个可能的弹状病毒(马伯格氏病毒和埃博拉病毒)；嵌沙样病毒科，包括淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCM)、Tacaribe virus complex和拉沙病毒；冠状病毒科，包括传染性支气管炎病毒(IBV)、小鼠肝炎病毒、人肠冠状病毒和猫传染性的腹膜炎(猫冠状病毒)。

说明性的感染脊椎动物的DNA病毒包括，但不限于：痘病毒科，包括正痘病毒属(重型天花、轻型天花、猴痘、牛痘、水牛痘、兔痘、缺肢畸形)，野兔痘病毒属(粘液瘤、纤维瘤)，禽痘病毒属(传染性上皮瘤其它禽痘病毒)，山羊痘病毒属(绵羊痘、山羊痘)，猪痘病毒属(猪痘)，副痘病毒属(传染性postular皮炎病毒、伪牛痘、牛丘疹性口炎病毒)；虹彩病毒科(非洲猪瘟病毒、蛙病毒2和3、鱼淋巴球增多病毒)；疱疹病毒科，包括α-疱疹病毒(1型和2型单纯性疱疹、水痘-带状疱疹、马流产病毒、马疱疹病毒2和3、伪狂犬病病毒、传染性牛角膜结膜炎病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、猫鼻气管炎病毒、传染性喉气管炎病毒)，β-疱疹病毒(人巨细胞病毒以及猪、猴和啮齿类动物巨细胞病毒)；γ-疱疹病毒(EB病毒(EBV)、马立克氏病病毒、Herpes saimiri、蛛猴属疱疹病毒、棉尾兔属疱疹病毒、豚鼠疱疹病毒、勒克肿瘤病毒)；腺病毒科，包括柱状腺病毒属(人亚组A、B、C、D、E以及未分类的：猿腺病毒(至少23个血清型)，犬传染性肝炎以及牛、猪、羊、蛙和许多其它物种的腺病毒，禽腺病毒属(禽腺病毒)；以及不可培养的腺病毒；乳多泡病毒科，包括乳头状瘤病毒属(人乳头状瘤病毒、牛乳头瘤病毒、肖普兔乳头状瘤病毒以及其它物种的各种致病乳头状瘤病毒)，多瘤病毒属(多瘤病毒、猿空泡因子(SV-40)，兔空泡因子(RKV)，K病毒，BK病毒，JC病毒以及其它灵长类动物多形瘤病毒例如嗜淋巴细胞乳头状瘤病毒)；细小病毒科包括腺病毒相关病毒属、细小病毒属、(猫泛白细胞减少症病毒、牛细小病毒、犬细小病毒、阿留申貂病病毒等)。最后，DNA病毒可以包括不适合上述的病毒，例如苦鲁病和早老痴呆症病毒以及慢性传染性神经病因子(CHINA病毒)。

真菌是真核生物体，其中只有少数导致脊椎动物感染。由于真菌是真核生物体，它们与原核细菌在大小、结构组织、生命周期和繁殖机制方面显著不同。真菌通常是基于形态学特点、繁殖方式和培养特征而分类的。虽然真菌能够导致受试个体不同型新的疾病，例如吸入真菌抗原后的呼吸过敏症，由于摄入有毒物质，例如毒蘑菇产生的amatatoxin和鬼笔毒蕈肽以及曲菌属菌种产生的aflotoxins而引起的真菌中毒，但并非所有真菌都引起感染性疾病。

传染性真菌可以导致全身或表面感染。初次全身感染可以发生在正常健康受试个体中，而机会感染最频繁地发现于免疫受损个体中。导致初次全身感染的最常见的真菌因子包括芽生菌属(blastomyces)、球孢菌属(coccidioides)和组织胞浆菌属(histoplasma)。导致免疫受损个体或免疫抑制个体机会感染的常见真菌包括，但不限于，白色假丝酵母(candida albicans)(为呼吸道菌群正常部分的一种生物体)、新型隐球酵母(cryptococcus neoformans)(有时为呼吸道正常菌群)以及各种曲霉属菌种。全身真菌感染为内部器官的侵入性感染。生物体通常通过肺、胃肠道或静脉网络进入身体。这些类型的感染可以由初次致病真菌或者机会致病真菌导致。

表面真菌感染包括真菌在外表面生长而不侵入内部组织。典型的表面真菌感染包括涉及皮肤、头发或指甲的皮肤真菌感染。皮肤感染的例子有癣感染，例如由dermatohytes，例如小孢子菌属(microsporum)或traicophyton种，也就是犬子孢子菌(microsporumcanis)、石膏状小孢子菌(microsporum gypsum)、石膏状小孢子菌(tricofitin rubrum)所致的轮癣。

真菌的例子包括：新型隐球酵母(Cryptococcus neoformans)、荚膜组织胞浆菌(Histoplasma capsulatum)、粗球孢菌(Coccidioidesimmitis)、皮炎芽生菌(Blastomyces dermatitidis)、沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)、白色假丝酵母(Candida albicans)。

本发明的方法靶向的寄生性感染包括如下寄生虫所引起的那些感染：镰状疟原虫(Plasmodium falciparum)、卵形疟原虫(Plasmodiumovale)、三日疟原虫(Plasmodium malariae)、间日疟原虫(Plasmdodium vivax)、Plasmodium knowlesi、微小巴贝虫(Babesiamicroti)、分歧巴贝虫(Babesia divergens)、克氏锥虫(Trypanosomacruzi)、鼠弓形体(Toxoplasma gondii)、旋毛虫(Trichinella spiralis)、硕大利什曼原虫(Leishmania major)、杜氏利什曼原虫(Leishmaniadonovani)、巴西利什曼原虫(Leishmania braziliensis)、和热带利什曼虫(Leishmania tropica)、冈比亚锥虫(Trypanosoma gambiense)、罗德西亚锥虫(Trypanosmoma rhodesiense)及曼氏血吸虫病(Schistosoma mansoni)。

在优选的实施方案中，本方法涉及导致疟疾的寄生虫感染的预防。

其它医学相关微生物在文献中被广泛描述，如参见C.G.AThomas，Medical Microbiology，Bailliere Tindall，英国，1983，兹将其全文并入作为参考。每一个前述列表都是举例说明性的，而并非旨在限制。

本发明的方法涉及免疫刺激核酸与治疗制剂的组合。活性剂的组合还可以与抗微生物剂联合给药以治疗或预防感染性疾病。如本文所用的抗微生物制剂，是指能够杀死或抑制传染性微生物的天然存在的或者合成的化合物。根据本发明，可用的抗微生物剂的类型取决于受试个体感染的或者处于感染风险中的微生物类型。一类抗微生物剂为抗细菌剂。抗细菌剂杀死或抑制细菌的生长或功能。一大类抗细菌剂是抗生素。

抗病毒剂是防止细胞被病毒感染或者病毒在细胞内复制的化合物。抗病毒药物要比抗细菌药物少的多，因为病毒复制过程与宿主细胞内的DNA复制关系如此密切，以至于非特异性抗病毒剂对宿主通常有毒。在病毒侵染过程中有若干阶段可以由抗病毒剂阻断或者抑制。这些阶段包括，病毒对宿主细胞的吸附(免疫球蛋白或结合肽)、病毒脱壳(如金刚胺)、病毒mRNA的合成或翻译(如干扰素)、病毒RNA或DNA的复制(如核苷类似物)、新生病毒蛋白的成熟(如蛋白酶抑制剂)以及病毒的出芽和释放。

抗真菌剂用于治疗和预防传染性真菌，杀寄生物药是直接杀死寄生虫的药剂。这样的化合物是本领域公知的并且一般商业上可获得。

除了利用免疫刺激核酸和治疗制剂预防人类感染外，优选的实施方案的方法尤其较好地适于非人脊椎动物的治疗。近距离存在的、以及象在动物园动物、农场动物和科研动物的情况下允许混合的非人脊椎动物也涵盖在本发明的方法的受试个体中。动物园动物例如猫科动物物种包括例如狮、虎、豹、猎豹和美洲狮；象、长颈鹿、熊、鹿、狼、牦牛、非人灵长类动物、海豹、海豚和鲸；以及科研动物例如小鼠、大鼠、仓鼠和沙鼠都是本发明的方法的潜在受试个体。

禽类例如母鸡、小鸡、火鸡、鸭、鹅、鹌鹑和雉是许多类型的感染的主要靶。孵化的禽类刚出生不久就暴露于病原微生物。虽然这些禽类最初通过来自母亲的抗体可以防范病原体，但这种保护仅仅是暂时的，并且禽类自身未发育完全的免疫系统必须开始针对病原体保护其自己。通常期望在它们最易感的情况下预防幼禽类的感染。还期望预防老龄禽类的感染，特别是当这些禽类近距离圈养，导致疾病迅速传播时。因此，期望向禽类给药免疫刺激核酸和抗微生物剂以预防感染性疾病。

小鸡中常见感染的例子是小鸡传染性贫血病毒(CIAV)。CIAV首次于1979年在日本调查马立克氏病接种失败期间分离(Yuasa等，1979，Avian Dis.23：366-385)。从那时起，CIAV已经在所有主要的家禽生产国家的商业家禽中检测到(van Bulow等，1991，pp.690-699)in Diseasesof Poultry，第9版，Iowa State University Press)。

CIAV感染导致临床疾病，以年幼易感小鸡的贫血、出血和免疫抑制为特征。CIAV-感染的小鸡的胸腺和骨髓萎缩以及与之一致的损伤也是CIAV感染的特征。胸腺以及偶尔的法氏囊中的淋巴细胞损耗，导致免疫抑制和对二次病毒、细菌和真菌感染的增加的易感性，这随之使疾病的进程复杂化。免疫抑制在感染一种或多种马立克氏病病毒(MDV)、传染性鸡囊病病毒、网状内皮组织增殖病毒、腺病毒或呼肠孤病毒后可导致疾病恶化。已经报道MDV发病机理被CIAV增强(DeBoer等，1989，p.28 In Proceedings of the 38th Western PoultryDiseases Conference，Tempe，Ariz.)。此外，已经报道CIAV恶化传染性鸡囊病的病征(Rosenberger等，1989，Avian Dis.33：707-713)。小鸡对由CAA引起的试验诱导的疾病形成年龄抗性。这基本上是在2周龄时完成的，但更大的禽类仍然易受感染(Yuasa，N.等，1979，同上；Yuasa，N.等，Arian Diseases 24，202-209，1980)。不过，如果小鸡具有CAA和免疫抑制因子(IBDV，MDV等)双重感染，针对疾病的年龄抗性延迟(Yuasa，N.等，1979和1980，同上；Bulow von V.等，J.VeterinaryMedicine 33，93-116，1986)。可能加强疾病传播的CIAV的特征包括对环境钝化和常见消毒剂的高抗性。CIAV感染对养禽业的经济影响从10％到30％的感染禽类在疾病爆发中死亡的事实中显而易见。

牛和家畜也易受感染。影响这些动物的疾病可以造成严重的经济损失，特别是牛。本发明的方法可用来保护家畜，例如奶牛、马、猪、绵羊和山羊免于感染。

奶牛可被牛病毒感染。牛病毒性腹泻病毒(BVDV)是小的包膜正链RNA病毒，并且与猪霍乱病毒(HOCV)和边地绵羊病病毒(BDV)一起分类在瘟病毒属(pestiviruses)中。虽然，瘟病毒属以前被归类为囊膜病毒科，一些研究建议它们与flavivirus和丙型肝炎病毒(HCV)群一起重新分类在Flaviviridae科内(Francki，等，1991)。

BVDV，是重要的牛病原体，可以根据细胞培养分析区分为致细胞病变(CP)和非致细胞病变(NCP)生物型。NCP生物型分布更为广泛，虽然两种生物型都见于牛中。如果怀孕奶牛感染了NCP菌株，该奶牛可生产持久感染并且特异性免疫耐受的小牛，它一生中将传播病毒。持久感染的牛可死于粘膜疾病，而后可以从该动物中分离到两种生物型。临床表现可包括流产、畸形发生以及呼吸问题、粘膜疾病和中度腹泻。另外，伴随着兽群流行病的、可能导致动物死亡的严重血小板减少症已有描述，并且与该病有关的株系似乎比标准的BVDV更加致命。

马疱疹病毒(EHV)包括一组抗原性不同的生物学因子，它们导致马从临床症状不明显的到致命的疾病的许多感染。这些包括马疱疹病毒-1(EHV-1)，一种马中普遍存在的病原体。EHV-1与流产、呼吸道疾病和中枢神经系统紊乱的流行病有关联。年轻马的上呼吸道初感染导致持续8-10天的发热。经过免疫的母马可能通过呼吸道再感染，而没有明显的疾病，因此流产通常没有预兆就发生了。神经综合症伴随着呼吸疾病和流产，并且可以侵袭任何年龄任一性别的动物，导致不协调、无力和后躯瘫痪(Telford，E.A.R.等，Virology 189，304-316，1992)。其它EHV包括EHV-2或马巨细胞病毒、EHV-3、马交媾疹病毒以及以前归类为EHV-1亚型2的EHV-4。

绵羊和山羊可被许多危险微生物感染，包括羊进行性间质肺炎(visna-maedi)。

灵长类动物例如猴、猿和恒河猴可被猴免疫缺陷病毒感染。已报道失活的细胞病毒和无细胞全猴免疫缺陷疫苗在恒河猴中提供保护(Stott等，(1990)Lancet 36：1538-1541；Desrosiers等，PNAS USA(1989)86：6353-6357；Murphey-Corb等(1989)Science 246：1293-1297；以及Carlson等(1990)AIDS Res.Human Retroviruses 6：1239-1246)。已报道重组HIV gp120疫苗在黑猩猩中提供保护(Berman等(1990)Nature 345：622-625)。

家养和野生的猫科动物都易受许多微生物的感染。例如，猫科传染性腹膜炎是发生在家养和野生猫科动物，例如狮、豹、猎豹和美洲虎中的疾病。当期望预防猫科动物感染这种和其它类型的病原微生物时，本发明的方法可用来预防或治疗猫科动物的感染。

家养猫可感染许多逆转录病毒，包括但不限于猫白血病毒(FeLV)、猫肉瘤病毒(FeSV)、内生性C型致癌RNA病毒(RD-114)和猫合胞体形成病毒(FeSFV)。其中，FeLV是最重要的病原体，导致不同的症状，包括淋巴网状内皮系统性和骨髓性赘生物、贫血、免疫介导的紊乱以及与人类获得性免疫缺损综合症(AIDS)相似的免疫缺陷综合症。最近发现，一种特别的复制缺陷FeLV突变体，命名为FeLV-AIDS，与免疫抑制性质特别相关。

猫嗜T-淋巴细胞性慢病毒(也被称之为猫免疫缺陷)的发现首先报道在Pedersen等(1987)Science 235：790-793中。FIV的特征描述报道在Yamamoto等(1988)Leukemia，December Supplement 2：204S-215S；Yamamoto等(1988)Am.J.Vet.Res.49：1246-1258以及Ackley等(1990)J.Virol.64：5652-5655中。FIV的克隆和序列分析报道在Olmsted等(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA86：2448-2452以及86：4355-4360中。

猫传染性腹膜炎(FIP)是不可预测地发生在家养和野生猫科动物中的散发疾病。虽然FIP主要是家养猫的疾病，它在狮子、美洲狮、豹、猎豹和美洲虎中诊断到。受FIP折磨的小型野生猫类包括猞猁以及狞獾、沙猫(sand cat)和帕拉猫(pallas cat)。在家养猫中，疾病主要是在年幼动物中发生，虽然所有年龄的猫都易感。高峰发病率发生在6-12月龄之间。在5-13岁龄中观察到下降的发病率，接着是14-15岁龄猫中提高的发病率。

在有鳍水生动物、有壳水生动物或其它水生生命形式中的病毒、细菌和寄生病给水产业造成严重的问题。由于孵卵场池或围闭的海洋牧场区域中动物的高密度，感染性疾病可消灭，例如有鳍水生动物、有壳水生动物或其它水生生命形式的设施中大比例的动物。鱼免疫系统与哺乳动物免疫系统具有许多相似的特点，例如B细胞、T细胞、淋巴因子、补体和免疫球蛋白的存在。鱼具有似乎在许多方面与哺乳动物的B和T细胞相似的作用的淋巴细胞亚型。

水产业物种包括但不限于有鳍水生动物、有壳水生动物或其它水生动物。有鳍水生动物包括所有的脊椎动物鱼，它可能是硬骨鱼或软骨鱼，例如，象鲑鱼、鲤鱼、鲶鱼、黄尾鱼、海鲷和海鲈。鲑鱼是有鳍水生动物中的科，其包括鳟鱼(包括虹鳟)、大麻哈鱼和北极红点鲑。有壳水生动物的例子包括，但不限于，蛤、龙虾、河虾、螃蟹和牡蛎。其它培养的水生动物包括，但不限于鳗鲡、鱿鱼和章鱼。

在有些情况下，期望与免疫刺激核酸和治疗制剂一起施用抗原，而在其它情况下不递送抗原。如果使用的话，抗原优选为微生物抗原。微生物抗原包括，但不限于细胞、细胞提取物、蛋白、多肽、肽、多糖、多糖缀合物、多糖和其它分子的肽及非肽模拟物、小分子、脂肪、糖脂和碳水化合物。不过，许多微生物抗原在本质上为蛋白或多肽，因为蛋白和多肽一般比碳水化合物或脂肪更具抗原性。向受试个体给药抗原的方法是本领域公知的。一般而言，抗原可通过任何途径直接给予受试个体，例如象静脉内、肌内、口服、经皮、粘膜、鼻内、气管内或皮下给药。抗原可以全身或局部给药。在一些优选的实施方案中，抗原不与免疫刺激核酸缀合。给药方法在下文更加详细地描述。

如本文所用的术语“基本上纯的”是指基本上不含它在自然状态下结合的其它蛋白、脂肪、碳水化合物或者其它材料的分子物质。本领域熟练技术人员可以利用蛋白纯化的标准技术纯化多肽，如抗原。基本上纯的多肽通常在非还原性聚丙烯酰胺凝胶上产生单条主带。在部分糖基化的多肽或者具有数个起始密码子的多肽的情况下，在非还原性聚丙烯酰胺凝胶上可能有数条带，但这些条带将形成该多肽有特色的模式。多肽的纯度还可以通过氨基末端氨基酸序列分析测定。

微生物抗原，如果给药并且如果是多肽的话，当向受试个体给药时可以是多肽的形式，或者它可以由核酸载体编码。如果向受试个体给药核酸载体，该蛋白在体内表达。多肽微生物抗原的一级氨基酸序列的小的修饰也可以产生与未修饰的对应多肽相比具有基本上等同的抗原活性的多肽。这种修饰可能是有意的，如定点突变那样，或者可能是自发的。因此，还包括了具有这种修饰的核酸。当给药由核酸载体编码的抗原时，免疫刺激核酸与含有抗原的质粒或表达载体不同。

编码抗原的核酸可操作地连接于指导在真核细胞内表达蛋白的基因表达序列。“基因表达序列”是任何调控核苷酸序列，例如启动子序列或者启动子增强子组合，它促进与它可操作地连接的蛋白的有效转录和翻译。基因表达序列可以是，例如，哺乳动物或病毒启动子，例如组成型或诱导型启动子。组成型哺乳动物启动子包括，但不限于，下列基因的启动子：次黄嘌呤磷酸核糖转移酶(HPTR)、腺苷脱氨酶、丙酮酸激酶、b-肌动蛋白启动子和其它组成型启动子。在真核细胞中组成型起作用的例示性病毒启动子包括，例如，来自巨细胞病毒(CMV)、猿猴病毒(如SV40)、乳头状瘤病毒、腺病毒、人类免疫缺陷性病毒(HIV)、劳氏肉瘤病毒、巨细胞病毒的启动子，莫洛尼氏白血病病毒及其他逆转录病毒的长末端重复(LTR)，以及单纯疱疹病毒的胸腺嘧啶核苷激酶启动子。其它组成型启动子是本领域熟练技术人员公知的。可用作本发明的基因表达序列的启动子还包括诱导型启动子。诱导型启动子在诱导剂存在下表达。例如，金属硫蛋白启动子在某些金属离子存在下被诱导促进转录和翻译。其它诱导型启动子是本领域普通技术人员公知的。

免疫刺激核酸与治疗制剂组合还可用于治疗核预防癌症。目前的癌症治疗太常无效，而且伴随着高度的患者发病率，最可能是由于缺乏对肿瘤细胞的毒性特异性。本发明的组合物通过促进增强的免疫应答提供了更有效的癌症治疗。免疫应答可以是抗原特异性的或者先天的免疫应答(非抗原特异性的)。在有些情况下，免疫刺激核酸与治疗制剂的组合是协同的，产生以单独利用这些物质本来所预期的加和更大的效应。

因此，在一个方面，本发明提供了治疗或预防癌症的方法，包括向患有癌症的受试个体或者处于患癌症风险中的受试个体施用预防或治疗癌症有效量的一些形式的免疫刺激核酸和一些形式的治疗制剂。

癌细胞是由于丧失正常的生长调控而异常分裂和繁殖的细胞。癌细胞几乎总是由于至少一个基因突变引起的。在有些情况下，有可能根据表达的基因和蛋白的类型及其表达的水平来区分癌细胞和它们的正常对应物。通常在癌细胞中起作用的基因包括致癌基因，例如ras、neu/HER2/erbB、myb、myc和abl，还有肿瘤抑制基因例如p53、Rb、DCC、RET和WT。这些基因中某些基因的癌相关突变导致它们的表达的下降或者完全的缺失。在其它基因中突变导致表达增加或者表达正常对应物的活化变体。癌细胞中的遗传突变在有些情况下可以是治疗制剂的靶。例如，一些药物靶向被认为对癌细胞存活和分裂所必需的蛋白，例如细胞周期蛋白(如细胞周期蛋白依赖性激酶)、端粒酶和端粒酶相关蛋白，以及肿瘤抑制蛋白，其中许多在癌细胞中上调或者失调。

术语“肿瘤”通常与赘生物等价，在文字上意味着“新生物”并可与癌症交换使用。“赘生性紊乱”是与细胞增殖，特别是赘生物相关的任何紊乱。“赘生物”是在撤除引起它出现的致癌因子后存留且增殖的异常组织块。有两类赘生物，良性和恶性的。几乎所有的良性肿瘤是包囊的并且是非侵袭性的；相反，恶性肿瘤几乎从不包囊，但是通过浸润破坏性生长侵袭邻近组织。浸润生长可以继之以肿瘤细胞植入与原始肿瘤不连续的部位。本发明的方法可用来治疗人类赘生性紊乱，包括但不限于：肉瘤、恶性肿瘤、纤维瘤、白血病、淋巴瘤、黑色素瘤、骨髓瘤、成神经细胞瘤、横纹肌肉瘤、成视网膜细胞瘤和神经胶质瘤以及本文所描述的每一种其它肿瘤。

如本文所用的“癌症”是指干扰身体器官和系统的正常功能的失控的细胞生长。从它们的起始位置迁徒和植入关键器官的癌症可通过感染器官的功能衰竭最终导致受试个体死亡。血生成性癌，例如白血病，能够胜过受试个体的正常造血区室，藉此导致造血失败(以贫血、血小板减少和中性粒细胞减少的形式)，最终导致死亡。

转移是由于癌细胞从初始肿瘤向身体其它部分扩散引起的，区别于原发性肿瘤位置的癌细胞区域。在原发性肿瘤块诊断时，可以监测受试个体中转移的存在。除了监视特定症状外，转移最常通过单独或联合利用磁共振成象(MRI)扫描、计算机断层(CT)扫描、血和血小板计数、肝功能研究、胸X-光和骨扫描进行检测。

癌症包括，但不限于，基层细胞癌、胆道癌；膀胱癌；骨癌；脑和CNS癌；乳腺癌；子宫颈癌；绒毛膜癌；结肠和直肠癌结缔组织癌；消化系统癌；子宫内膜癌；食道癌；眼癌；头和颈部癌；胃癌；上皮内赘生物；肾癌；喉癌；白血病；肝癌；肺癌(例如小细胞性及非小细胞性)；淋巴瘤包括霍奇金和非霍奇金淋巴瘤；黑色素瘤；骨髓瘤；成神经细胞瘤；口腔癌(例如唇、舌、口和咽癌)；卵巢癌；胰腺癌；前列腺癌；成视网膜细胞瘤；横纹肌肉瘤；直肠癌；肾癌；呼吸系统癌；肉瘤；皮肤癌；胃癌；睾丸癌；甲状腺癌；子宫癌；泌尿系统癌；以及其它恶性肿瘤和肉瘤。

免疫刺激核酸和治疗制剂可用于治疗或预防受试个体的癌症。本发明可用于治疗人或非人受试个体的癌症和肿瘤。癌症是陪伴动物(即猫和狗)死亡的主要原因。癌症通常攻击老龄动物，在家庭宠物的情况下，它们已经与家庭融为一体。45％大于10岁龄的狗很可能死于该病。最常见的治疗选择包括外科手术、化疗和放射疗法。已经取得些许成功的其它治疗方式是激光疗法、低温疗法、高温和免疫疗法。治疗的选择取决于癌症的类型和扩散的程度。除非恶性生长局限于身体上不连续的区域，否则难于仅除去恶性组织而不同时影响正常细胞。

通常在狗和猫中诊断的恶性紊乱包括但不限于淋巴肉瘤、骨肉瘤、乳房瘤、肥大细胞瘤、脑瘤、黑色素瘤、腺鳞癌、良性肿瘤肺肿瘤、支气管腺瘤、支气管腺瘤、纤维瘤、粘液软骨瘤、肺肉瘤、神经肉瘤、骨瘤、乳头状瘤、成视网膜细胞瘤、尤因氏肉瘤、胚胎性癌肉瘤、伯基特氏淋巴瘤小神经胶质细胞瘤、成神经细胞瘤、破骨细胞瘤、口腔瘤形成、纤维肉瘤、骨肉瘤和横纹肌肉瘤。狗的其它赘生物包括生殖器鳞状细胞癌、传染性毒液瘤、睾丸瘤、精原细胞瘤、睾丸足细胞瘤、血管外皮细胞瘤、组织细胞瘤、绿色瘤(粒细胞肉瘤)、角膜乳头状瘤、角膜鳞状细胞癌、血管肉瘤、胸膜间皮瘤、基底细胞瘤、胸腺瘤、胃瘤、肾上腺恶性肿瘤、口腔乳头状瘤、血管内皮瘤和囊腺瘤。额外在猫中诊断的恶性瘤包括滤泡性淋巴瘤、肠淋巴肉瘤、纤维肉瘤和肺鳞状细胞癌。雪貂，一直以来比较流行的家庭宠物，已知可患胰岛细胞癌、淋巴瘤、肉瘤、神经瘤、郎格罕氏岛细胞瘤、胃MALT淋巴瘤和胃腺癌。

影响农业家畜的瘤形成包括白血病、血管外皮细胞瘤和牛眼瘤形成(牛)；包皮纤维肉瘤、溃疡性鳞状细胞癌、包皮恶性肿瘤、结缔组织瘤形成和肥大细胞瘤(马)；肝细胞癌(猪)；淋巴瘤和绵羊肺腺瘤病(羊)；肺肉瘤、淋巴瘤、鲁斯氏肉瘤、成血细胞综合征、纤维肉瘤、肾母细胞瘤、B细胞淋巴瘤和淋巴白血病(禽类)；成视网膜细胞瘤、肝瘤形成、淋巴肉瘤成淋巴细胞性淋巴瘤)、血浆白血病和鳔肉瘤(鱼)、干酪块腺炎(CLA)：由细菌假结核棒状杆菌(Corynebacterium pseudotuberculosis)导致的绵羊和山羊的慢性感染性疾病，以及由肺腺瘤病导致的绵羊传染性肺肿瘤。

在一方面，提供了治疗癌症的方法，它包括向患有癌症的受试个体给予本发明的组合物。“患有癌症的受试个体”是诊断具有癌症的受试个体。在一些实施方案中，受试个体具有以实体肿瘤为特征的癌症类型。实体肿瘤块，如果存在的话，可能是原发性肿瘤块。原发性肿瘤块是指由于组织中正常细胞的转化引起的组织中癌细胞的生长物。在大多数情况下，原发性肿瘤块是通过囊肿的存在鉴定的，它可通过目视或触诊法，或者通过该组织形状、质地或重量的不规则而发现。

不过，有些原发性肿瘤是不可触摸的，并且只能通过医学成像技术例如X-光(如乳房造影术)或者通过针吸术进行检测。后面的这些技术在早期检测中更为常见。组织内癌细胞的分子和表型分析通常会确认肿瘤是否为组织内生的，或者损害是否归因于从其它部位的转移。

关于预防性治疗方法，本发明旨在向处于患癌症风险的受试个体施用本发明的组合物。处于患癌症风险的受试个体是具有患癌症高度可能性的个体。这些受试个体包括，例如，具有遗传异常的受试个体，这种异常的存在已被证明与较高的患癌可能性有相关关系。暴露于致癌因子例如烟草、石棉或其它化学毒素的受试个体也是本文所用的处于患癌症风险的受试个体。当处于患癌症风险的受试个体用免疫刺激核酸和治疗制剂定期，例如按月治疗时，受试个体将能够针对癌症发动连续的免疫应答。还可以利用抗原刺激肿瘤特异性免疫应答。如果肿瘤开始在受试个体中形成，受试个体将形成针对一种或多种癌抗原的特异性免疫应答。当受试个体将要接触的抗原已知时，本发明的这个方面尤为有利。例如，根据本发明，在某些行业就职的、不间断地暴露于致癌因子的受试个体将是理想的治疗受试个体，特别是因为致癌因子通常优先靶向特定的组织或器官。例如，许多空气传播、或者吸入的致癌剂例如烟草烟雾和石棉与肺癌相关。其中受试个体被动暴露于致癌剂的方法可以特别地取决于给药免疫刺激核酸和治疗制剂(优选以癌疫苗(例如癌抗原)的形式)的时间安排。例如，在有患癌症风险的受试个体中，当风险最大，也就是在暴露于致癌因子之后，受试个体可以癌定期地给药免疫刺激核酸和含有癌抗原的肿瘤疫苗。

免疫刺激核酸和治疗制剂还可以与癌症药联合给药。如本文所用，“癌症药”是指为治疗癌症的目的给予受试个体的制剂。如本文所用，“治疗癌症”包括防止癌症发生，减轻癌症症状和/或抑制已形成的癌症的生长。在其它方面，癌症药为减小患癌症的风险的目的向处于患癌症风险的受试个体给药。癌症药涵盖诸如化疗剂、免疫治疗制剂、癌症疫苗、激素疗法和生物学应答修饰剂的范畴。癌症药还包括为了减轻癌症症状，而非减少受试个体的肿瘤或癌症负担(即癌症或肿瘤细胞的数目)而向受试个体给药的制剂。这后一种类型的癌症药的例子是向患癌症的受试个体输血，以使红细胞和/或血小板水平维持在正常范围内。作为例子，在不存在输血时，血小板低于正常水平的癌症患者处于失控出血的风险中。

如本文所用，癌抗原被广义地定义为癌细胞表达的抗原。优选地，抗原表达在癌细胞的细胞表面。甚至更优选地，抗原不被正常细胞表达，或者至少不表达与癌细胞相同的水平。例如，有些癌抗原在正常细胞中正常地是沉默的(即不表达)，有些仅在分化的某些阶段表达，而其它的则短暂表达，例如胚胎和胎儿抗原。其它癌抗原由突变的细胞基因编码，例如致癌基因(如活化的ras致癌基因)、抑制基因(如突变p53)，由于内部缺失或染色体易位产生的融合蛋白。其它癌抗原可以由病毒基因例如RNA和DNA肿瘤病毒携带的那些基因编码。可以利用癌抗原在正常和癌细胞中的差异表达靶向癌细胞。如本文所用，术语“癌抗原”和“肿瘤抗原”可互换使用。

在本发明的其它方面，免疫刺激核酸的利用，单独或者与治疗制剂联合，允许给药比通常给药产生有效的抗原特异性免疫应答更低的抗原剂量。因此，免疫刺激核酸允许给药更低的亚治疗剂量的抗原，但具有比利用如此低的剂量本来所实现的更高的功效。作为例子，通过给药免疫刺激核酸和如果本来与常规佐剂例如明矾联合使用将会无效的剂量的抗原，有可能获得针对该抗原的有效免疫应答，即便是本领域技术人员不会预料到该剂量的抗原可提供治疗益处(即亚治疗剂量)。

如本文所用，“免疫刺激核酸”是含有诱导免疫应答的免疫刺激基序或主链的任何核酸。免疫应答可以表征为，但不限于，Th1-型免疫应答或Th2-型免疫应答。这种免疫应答由激活的免疫细胞所诱发的细胞因子和抗体产生分布图限定。

辅助(CD4⁺)T细胞通过产生对其它免疫系统细胞，包括其它T细胞起作用的可溶性因子协调哺乳动物的免疫应答。辅助CD4⁺而且有些情况下也CD8⁺的T细胞在小鼠和人类系统中都被表征为Th1和Th2细胞，取决于它们细胞因子产生的分布(Romagnani，1991，ImmunolToday 12：256-257，Mosmann，1989，Annu Rev Immunol，7：145-173)。Th1细胞产生白介素2(IL-2)、IL-12、肿瘤坏死因子(TNFα)和干扰素γ(IFN-γ)，并且它们主要负责细胞介导的免疫，例如延迟型过敏反应。给药免疫刺激核酸诱导的细胞因子主要为Th1型。与Th1应答有关的抗体类型通常更有保护性，因为它们具有高的中和及调理能力。Th2细胞产生IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10和IL-13，并且主要参与为体液免疫应答例如IgE和IgG4抗体同型转换提供最佳帮助(Mosmann，1989，Annu Rev Immunol，7：145-173)。Th2应答主要涉及对感染具有较少保护效果的抗体。

术语“核酸”和“寡核苷酸”可互换使用来指多核苷酸(即包含与磷酸基团以及可交换有机碱连接的糖(如核糖或脱氧核糖)的分子，碱基或者是取代的嘧啶(如胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)或者尿嘧啶(U))，或者是取代的嘌呤(如腺嘌呤(A)或鸟嘌呤(G))。如本文所用，该术语指寡聚核糖核苷酸以及寡聚脱氧核糖核苷酸。该术语还应当包括多聚核苷(即，除去磷酸的多聚核苷酸)以及含有有机碱的任何其它多聚体。核酸包括载体，如质粒，以及寡核苷酸。核酸分子可以从现存的核酸来源(如基因组或cDNA，称为分离的核酸)中获取，但优选是合成的(如通过寡核苷酸合成制备)。

免疫刺激核酸可以包括免疫刺激基序例如CpG基序和多聚-G基序。在本发明的一些实施方案中，任何核酸，不管它是否拥有可鉴定的基序，都可用于联合治疗以引发免疫应答。免疫刺激主链包括，但不限于，磷酸修饰的主链，例如硫代磷酸酯主链。免疫刺激核酸在现有技术中被广泛描述，并且下文提供了这些核酸的简要概述。本发明的大多数方面，特别是涉及患有或处于患癌症风险中的受试个体的那些方面，不包括利用富含T的或甲基化的CpG核酸(即，拥有富含T或甲基化CpG基序的核酸)。

在一些实施方案中，CpG免疫刺激核酸被用于本发明的方法。CpG免疫刺激核酸是含有CG二核苷酸的核酸，它的C残基未甲基化。CpG免疫刺激核酸已知刺激Th1-型免疫应答。CpG序列，尽管在人DNA中相对稀少，当常见于传染性生物例如细菌的DNA中。人类免疫系统显然进化到将CpG序列作为感染早期警报信号予以识别，并针对侵入的病原体起始紧急和有力的免疫应答，而不导致频繁见于其它免疫刺激因子的不良反应。因此含CpG的核酸，依靠这种先天的免疫防御机制，能够利用独特和天然的途径进行免疫治疗。CpG核酸对免疫调节的作用在美国专利No.6,194,388以及公开的专利申请，例如PCT US95/01570、PCT/US97/19791、PCT/US98/03678、PCT/US98/10408、PCT/US98/04703、PCT/US99/07335和PCT/US99/09863中被详尽描述。兹将这些发表的专利和专利申请中每一个的全部内容并入作为参考。

CpG核酸是包括至少一个未甲基化的CpG二核苷酸的核酸。含有至少一个未甲基化的CpG二核苷酸的核酸是在胞嘧啶-鸟嘌呤二核苷酸序列中含有未甲基化的胞嘧啶的核酸分子(即“CpG DNA”或者含有5′胞嘧啶，接着是3′鸟嘌呤，并且通过磷酸酯键连接的DNA)并且激活免疫系统。CpG核酸可以是双链或单链的。一般而言，双链分子在体内更稳定，而单链分子具有提高的免疫活性。因此在本发明的某些方面，优选核酸是单链的，而在其它方面优选核酸是双链的。如本文所用，术语CpG核酸或CpG寡核苷酸除非另行指明，是指免疫刺激CpG核酸。整个免疫刺激核酸可以是未甲基化的，或者部分可以是未甲基化的，但是至少5′CG 3′中的C必需是未甲基化的。

在本发明一个优选的实施方案中，提供了免疫刺激核酸，它是至少由通式：5′X₁X₂CGX₃X₄3′代表的CpG核酸。其中X₁、X₂、X₃和X₄是核苷酸。在一个实施方案中，X₂为腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶或胸腺嘧啶。在另一个实施方案中，X₃为胞嘧啶、鸟嘌呤、腺嘌呤或胸腺嘧啶。在其它实施方案中，X₂为腺嘌呤、鸟嘌呤或胸腺嘧啶而X₃为胞嘧啶、腺嘌呤或胸腺嘧啶。

在另一个实施方案中，免疫刺激核酸是至少由通式：5′N₁X₁X₂CGX₃X₄N₂3′代表的分离的CpG核酸。其中X₁、X₂、X₃和X₄是核苷酸而N是任何核苷酸，并且N₁和N₂分别是由0-25个N组成的核酸序列。在一个实施方案中，X₁X₂是从由GpT、GpG、GpA、ApA、ApT、ApG、CpT、CpA、CpG、TpA、TpT和TpG组成的组中选择的核苷酸；而X₃X₄是从由TpT、ApT、TpG、ApG、CpG、TpC、ApC、CpC、TpA、ApA和CpA组成的组中选择的核苷酸。优选地，X₁X₂是GpA或GpT而X₃X₄是TpT。在其它实施方案中，X₁或X₂或两者都是嘌呤，而X₃或X₄或两者都是嘧啶，或者X₁X₂是GpA而X₃或X₄或两者都是嘧啶。在另一个优选的实施方案中，X₁X₂是从由TpA、ApA、ApC、ApG和GpG组成的组中选择的核苷酸。而在另一个实施方案中，X₃X₄是从由TpT、TpA、TpG、ApA、ApG、ApC和CpA组成的组中选择的核苷酸。X₁X₂在另一个实施方案中是从由TpT、TpG、ApT、GpC、CpC、CpT、TpC、GpT和CpG组成的组中选择的核苷酸。

在另一个优选的实施方案中，免疫刺激核酸具有序列5′TCN₁TX₁X₂CGX₃X₄3′。本发明的免疫刺激核酸在一些实施方案中包括选自GpT、GpG、GpA和ApA的X₁X₂，并且X₃X₄选自TpT、CpT和TpC。

为便于摄入至细胞中，免疫刺激核酸优选长度在6-100个碱基的范围内。不过，根据本发明，大于6个核苷酸的任意大小的核酸(甚至几kb长)能够诱导免疫应答，如果存在足够的免疫刺激基序的话。优选地，免疫刺激核酸的大小在8-100个核苷酸之间，而在一些实施方案中，在8-50个核苷酸之间或者8-30个核苷酸之间。

“回文顺序”应当指倒转重复(即，例如ABCDEE′D′C′B′A′的序列，其中A和A′是能够形成通常的Watson-Crick碱基对的碱基)。在体内，这样的序列可能形成双链结构。在一个实施方案中，CpG核酸含有回文顺序。本上下文中所用的回文顺序是指CpG为回文的一部分的回文，并且优选CpG是回文的中心。在另一个实施方案中，CpG核酸不含回文。不含回文的免疫刺激核酸是CpG不是回文的一部分的核酸。这样的寡核苷酸可以包括CpG不是回文的中心的回文。

在本发明的一些实施方案中，利用了非-CpG免疫刺激核酸。非-CpG免疫刺激核酸是它的序列中没有CpG基序的核酸，不管C是否为二核苷酸，是否甲基化或未甲基化。非-CpG免疫刺激核酸可能诱导Th1或Th2免疫应答，取决于它们的序列，它们的递送方式以及它们给药的剂量。

非-CpG免疫刺激核酸一个重要的亚群为多聚-G免疫刺激核酸。许多参考文献，包括Pisetsky和Reich，1993 Mol.Biol.Reports，18：217-221；Krieger和Herz，1994，Ann.Rev.Biochem.，63：601-637；Macaya等，1993，PNAS，90：3745-3749；Wyatt等，1994，PNAS，91：1356-1360；Rando 和Hogan，1998，In Applied AntisenseOligonucleotide Technology，编辑Krieg和Stein，p.335-352；以及Kimura等，1994，J Biochem.116，991-994也描述了多聚-G核酸的免疫刺激性能。根据本发明的一个方面，含多聚-G的核苷酸尤其可用于治疗和预防细菌、病毒和真菌感染，并因而可用来使这些感染对癌症患者的治疗的影响最小化。

多聚-G核酸优选是具有如下通式的核酸：5′X₁X₂GGGX₃X₄3′。其中X₁、X₂、X₃和X₄是核苷酸。在优选的实施方案中，X₃和X₄中至少一个为G。在其它实施方案中，X₃和X₄都是G。而在其它的实施方案中，优选的通式为5′GGGNGGG 3′或者5′GGGNGGGNGGG 3′，其中N代表0-20个核苷酸。在其它实施方案中，多聚-G核酸不含未甲基化的CG二核苷酸，例如象上文所列的SEQ ID NO：95到SEQ IDNO：133的核酸。在其它实施方案中，多聚-G核酸包括至少一个未甲基化的CG二核苷酸，例如象下文所列的SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：58和SEQ ID NO：61的核酸。

富含T基序以及拥有这种基序的核酸描述在公开的PCT专利申请WO01/22972和于2000年9月25日递交的相关美国专利申请No.09/669,187中，兹将其全部内容并入作为参考。

例示性的免疫刺激核酸包括但不限于表1所示的那些免疫刺激核酸。

表1

为用于本发明，免疫刺激核酸可以利用本领域公知的许多操作从头合成。这样的化合物称之为“合成”核酸。例如，b-氰乙基亚磷酰胺法(Beaucage，S.L.，和Caruthers，M.H.，Tet.Let.22：1859，1981)；核苷H-膦酸酯法(Garegg等，Tet.Let.27：4051-4054，1986；Froehler等，Nucl.Acid.Res.14：5399-5407，1986；Garegg等，Tet.Let.27：4055-4058，1986，Gaffney等，Tet.Let.29：2619-2622，1988)。这些化学方法可以通过市场上可获得的各种自动寡核苷酸合成仪进行。这些核酸被称为合成核酸。作为选择地，免疫刺激核酸可以在质粒中大规模产生(参见Sambrook，T.，等，″Molecular Cloning：A Laboratory Manual″，冷泉港实验室出版，New York，1989)并且分成小份或者整体给药。核酸可以利用已知技术从现存的核酸序列中制备(如基因组或cDNA)，例如使用限制性酶、核酸外切酶或核酸内切酶的那些技术。以这种方式制备的核酸被称为分离的核酸。术语“免疫刺激核酸”包括合成和分离的免疫刺激核酸。

为在体内应用，核酸优选相对抵抗降解(如稳定化的)。“稳定化的核酸分子”是指相对能抵抗体内降解(如通过外切-或内切-核酸酶)的核酸分子。稳定化可以是长度或二级结构的功能。数十到数百kb长的免疫刺激核酸相对抵抗体内降解。对于较短的免疫刺激核酸，二级结构可以稳定并增强它们的功效。例如，如果核酸的3′末端具有与上游区域的自身互补性，使得它可以折叠回来，并形成短的茎环结构，则该核酸变得稳定，因而表现出更多的生物学体内活性。

作为选择地，核酸稳定化可以通过主链修饰实现。优选的稳定的当前发明的核酸具有修饰的主链。已经证明当体内给药时，修饰核酸主链为免疫刺激核酸提供增强的活性。一种类型的修饰主链是磷酸主链修饰。在寡核苷酸5′末端包括至少两个硫代磷酸酯键而在3′末端有多个，优选5个硫代磷酸酯键的免疫刺激核酸，能够在某些场合下提供最大的活性，并保护该核酸免受胞内外切-或内切-核酸酶的降解。其它磷酸修饰核酸包括磷酸二酯修饰核酸、组合磷酸二酯和硫代磷酸酯核酸、甲基膦酸酯、甲基硫代磷酸酯酯、二硫代磷酸酯酯、及其组合。CpG核酸中的这些组合每一种及它们对免疫细胞的特定效果在发表的美国专利6,194,388、6,207,646和6,239,116中更加详细地讨论，兹将其全部内容并入作为参考。虽然不旨在束缚于任何特定的理论，我们相信这些磷酸修饰核酸可能由于增强的核酸酶抗性、提高的细胞摄取、增强的蛋白结合和/或改变的胞内定位而表现出更大的刺激活性。

修饰的主链例如硫代磷酸酯可以使用氨基磷酸酯或者H-膦酸酯化学利用自动化技术合成。芳基和烷基膦酸酯可以，例如，象美国专利No.4,469,863中所描述的那样制备。烷基磷酸三酯，其中带电的氧原子成分如美国专利No.5,023,243和欧洲专利No.092,574所述被烷基化，可以利用商业上可获得的试剂通过自动固相合成制备。进行其它DNA主链修饰和取代的方法已有描述(Uhlmann，E.和Peyman，A.，Chem.Rev.90：544，1990；Goodchild，J.，Bioconjugate Chem.1：165，1990)。

含有免疫刺激基序的硫代磷酸酯和磷酸二酯核酸在免疫细胞中都有活性。不过，根据诱导免疫刺激核酸特异性效果所需的浓度，核酸酶抗性硫代磷酸酯主链免疫刺激核酸比磷酸二酯主链免疫刺激核酸更为有力。例如，2μg/ml硫代磷酸酯已表明实现与90μg/ml磷酸二酯相同的免疫刺激。

根据本发明可用的另一种类型的修饰主链，为肽核酸。主链由氨基乙基甘氨酸构成，并支撑提供DNA特征的碱基。主链不包括任何磷酸，因而可以任选地没有净电荷。没有电荷允许更强的DNA-DNA结合，因为两条链之间的电荷排斥不存在。另外，由于主链具有额外的亚甲基基团，寡核苷酸是酶/蛋白酶抗性的。肽核酸可以从各种商业来源，例如Perkin Elmer购得，或者从头合成。

另一类主链修饰包括2′-O-甲基核糖核苷(2′-Ome)。这些类型的取代在现有技术中广泛地描述过，而且具体与它们的免疫刺激性能相关的有Zhao等，Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters，1999，9：24：3453。Zhao等描述了制备核酸2′-Ome修饰的方法。

本发明的核酸分子可以包括天然存在的或者合成的嘌呤或嘧啶杂环碱基以及修饰的主链。嘌呤或嘧啶杂环碱基包括，但不限于，腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶和次黄嘌呤。其它有代表性的杂环碱基在Merigan等的美国专利No.3,687,808中公开了。术语“嘌呤”或“嘧啶”或“碱基”在这里是指天然存在的或合成的嘌呤、嘧啶或碱基。

其它稳定化的核酸包括非离子DNA类似物，例如烷基-和-芳基磷酸酯(其中带电的膦酸氧原子被烷基或芳基基团代替)、磷酸二酯和烷基磷酸三酯，其中带电的氧成分被烷基化。在任一端或两端含有二醇，例如四乙二醇或六乙二醇的核酸也已证明对核酸酶降解具有抗性。

根据本发明可用的具有主链修饰的免疫刺激核酸，在一些实施方案中是S-或R-手性免疫刺激核酸。如本文所用的“S手性免疫刺激核酸”是其中至少两个核苷酸具有形成手性中心的主链修饰，并且其中至少75％的手性中心具有S手性的免疫刺激核酸。如本文所用的“R手性免疫刺激核酸”是其中至少两个核苷酸具有形成手性中心的主链修饰，并且其中至少75％的手性中心具有R手性的免疫刺激核酸。主链修饰可以是形成手性中心的任何类型的修饰。修饰包括但不限于硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、甲基硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、2′-Ome及其组合。

手性免疫刺激核酸在核酸内必需具有至少两个具有主链修饰的核苷酸。不过，全部或少于全部的核苷酸可以具有修饰的主链。在具有修饰主链的核苷酸中(称之为手性中心)，至少75％具有单一手性S或R。因此，不到全部的手性中心可能具有S或R手性，只要至少75％的手性中心具有S或R手性。在一些实施方案中，至少80％、85％、90％、95％或100％的手性中心具有S或R手性。在其它实施方案中，至少80％、85％、90％、95％或100％的核苷酸具有主链修饰。

S-和R-手性免疫刺激核酸可以通过本领域公知的制备手性纯寡核苷酸的任何方法制备。Stec等教导了利用oxathiaphospholane制备立体纯硫代磷酸酯寡聚脱氧核糖核苷酸的方法(Stec，W.J.，等，1995，J.Am.Chem.Soc.，117：12019)。制备手性纯寡核苷酸的其它方法已经被公司例如ISIS制药公司描述过。公开了生产立体纯寡核苷酸的方法的美国专利包括5883237、5837856、5599797、5512668、5856465、5359052、5506212、5521302和5212295，兹将每一篇全文并入作为参考。

如本文所用，给药免疫刺激核酸旨在涵盖给药一种或多种就其类型(profile)、序列、主链修饰和生物学效应而言可能有或可能没有差异的免疫刺激核酸。作为例子，CpG核酸和多聚-G核酸可以给予单个受试个体。在另一个例子中，还可以向受试个体给予核苷酸序列不同的多个CpG核酸。

本发明的治疗制剂为水包油乳剂。如本文所用的术语水包油乳剂是指悬浮于水中的油微滴的异质混合物组成的液体。水包油乳剂是本领域公知的。一个优选的水包油乳剂以商标名EMULSIGEN^TM(由MPV Laboratories，Nebraska，U.S.A出售)出售。

术语“有效量”的免疫刺激核酸是指实现预期的生物学效应所必需的或足够的量。例如，有效量的免疫刺激核酸可以是导致激活免疫系统，潜在地导致形成抗原特异性免疫应答所必需的量。根据本发明的某些方面，有效量是免疫刺激核酸的该量和治疗制剂的该量，当它们组合或共给药时，在预防或者治疗癌或感染性疾病中，产生对肿瘤或传染因子的协同应答。协同量是产生大于免疫刺激核酸及治疗制剂单独的个别效应的加和的应答的量。例如，免疫刺激核酸和治疗制剂的协同组合提供的生物学效应大于分别利用每一种组份(即所述核酸和药剂)所实现的组合的生物学效应。生物学效应可以是因癌症或感染性疾病引起的症状的改善或者完全消除。在另一个实施方案中，生物学效应是癌症或感染性疾病的彻底消失，例如象通过肿瘤的缺失或者没有癌细胞的生检或者血涂片所证实的那样。

在治疗癌症或感染性疾病或者在降低患癌症或感染性疾病的风险中，与治疗制剂协同所必需的免疫刺激核酸的有效量可能根据免疫刺激核酸的序列、核酸的主链成分以及核酸的递送方式而变化。任何特定应用的有效量可以根据诸如治疗的疾病、给药的特定免疫刺激核酸(例如，核酸中免疫刺激基序的性质、数目或位置)、受试个体的大小或者疾病或状况的严重度等因素变化。本领域普通技术人员能够经验性地确定特定免疫刺激核酸和治疗制剂组合的有效量而无需过度的实验。结合本文提供的教导，通过在各种活性化合物中选择，并衡量诸如药效、相对生物利用度、患者体重、不良副作用的严重度以及优选的给药方式等因素，可以设计有效的预防性或治疗性治疗方案，其不导致实质上的毒性，而又完全有效地治疗特定的受试个体。

在一些实施方案中，免疫刺激核酸以刺激或诱导Th1免疫应答、或者Th2免疫应答、或者普通的免疫应答的有效量给药。刺激Th1免疫应答的有效量可定义为刺激产生一种或多种Th1-型细胞因子例如白介素2(IL-2)、IL-12、肿瘤坏死因子(TNFα)以及干扰素γ(IFN-γ)和/或产生一种或多种Th1-型抗体的量。另一方面，刺激Th2免疫应答的有效量可以定义为刺激产生一种或多种Th2-型细胞因子例如IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10以及IL-13和/或产生一种或多种Th2-型抗体的量。

在本发明的某些实施方案中，免疫刺激核酸以预防细菌、病毒或真菌感染的有效量给药。免疫刺激核酸已知可用于预防细菌和病毒感染。

在某些情况下，亚治疗剂量的抗原被用来治疗患癌症或感染性疾病或者处于患癌症或感染性疾病风险中的受试个体。作为例子，根据本发明已发现，当抗原与免疫刺激核酸共同给药时，抗原能够以亚治疗剂量给药而仍然产生期望的治疗结果。如本文所用的“亚治疗剂量”是指比如果在不存在另一制剂时给药会在受试个体中产生治疗结果的剂量小的剂量。因此，亚治疗剂量的抗原是单独或与常规佐剂例如明矾组合时在不给药免疫刺激核酸的情况下不会在受试个体中产生预期的治疗结果的量。抗原的治疗剂量在疫苗接种领域是公知的。这些剂量已经在文献中广泛地描述，医学行业依靠其作为疫苗接种的指导。免疫刺激核酸的治疗剂量在本领域中也有描述，并且鉴定受试个体治疗剂量的方法在这里更加详细地描述了。

对于本文所述的任何化合物，治疗有效量可以最初从细胞培养试验中确定。具体地，免疫刺激核酸的有效量可以利用体外刺激试验进行确定。免疫刺激核酸的刺激指数可以与事先测试的免疫刺激酸的指数进行比较。刺激指数可以用来确定特定寡核苷酸对特定受试个体的有效量，并且剂量可以向上或向下调整以在受试个体中达到预期的水平。

治疗有效量还可以在动物研究中确定。例如，诱导协同应答的免疫刺激核酸和治疗制剂的有效量可以利用肿瘤退化和/或预防肿瘤形成的体内测定进行评估。相关的动物模型包括将恶性细胞注入动物受试个体的测定，通常注射在限定的部位。一般而言，一定剂量范围的免疫刺激核酸与一定剂量范围的治疗制剂一起向动物给药。注射恶性细胞后肿瘤生长的抑制指示降低患癌症风险的能力。预存肿瘤进一步生长的抑制(或尺寸的减小)指示治疗癌症的能力。经过改造含有人类免疫系统元件的小鼠可用作人类癌细胞系的受体以确定协同组合的有效量。

对于已经在人类中测试(已经开始人类临床试验)的免疫刺激核酸以及对于已知表现出相似药理学活性治疗的化合物，例如其它佐剂，如LT以及用于免疫接种目的的其它抗原，有效剂量还可以从人类数据中确定。

应用的免疫刺激核酸和治疗制剂的剂量可以根据相对生物利用度以及给药的化合物，包括所用的佐剂的药效进行调整。根据上文所述方法和其它方法调整剂量实现最大效果，完全是本领域熟练技术人员能力范围之内的事。

本文所述的化合物的受试个体剂量典型地在从大约0.1μg到10,000mg的范围内，更典型地从大约1μg/天到8000mg，并且最典型地从大约10μg到100μg。就受试个体体重而言，典型的剂量在从大约0.1μg到20mg/kg/天的范围内，更典型地从大约1到10mg/kg/天，并且最典型地从大约1到5mg/kg/天。

在本发明的其它实施方案中，免疫刺激核酸以常规时间表给药。如本文所用的“常规时间表”是指预定的指定时间段。常规时间表可以涵盖相同长度或长度不等的时间段，只要时间表是预定的。例如，常规时间表可以包括以每天、每两天、每三天、每四天、每五天、每六天、每周、每月或其间任何设定数目的天数或周、每两个月、三个月、四个月、五个月、六个月、七个月、八个月、九个月、十个月、十一个月、十二个月等为基础给药免疫刺激核酸。作为替代，预定的常规时间表可以包括第一周按每天给药免疫刺激核酸，接着数月按每月给药，之后按每三个月给药。任何特定的组合可被常规时间表覆盖，只要提前确定适当的日程表包括在某一天给药。

免疫刺激核酸可以以质粒载体的形式向受试个体递送。在一些实施方案中，一个质粒载体可以既包括免疫刺激核酸又包括编码抗原的核酸。在其它实施方案中，可以利用分开的质粒。而在其它实施方案中，可以不利用质粒。

免疫刺激核酸和治疗制剂可以单独(例如在盐水或缓冲液中)或者利用本领域已知的任何递送载体给药。例如，下列递送介质已被描述：cochleates(Gould-Fogerite等，1994，1996)；Emulsomes(Vancott等，1998，Lowell等，1997)；ISCOMs(Mowat等，1993，Carlsson等，1991，Hu et.，1998，Morein等，1999)；脂质体(Childers等，1999，Michalek等，1989，1992，de Haan 1995a，1995b)；活细菌载体(如沙门氏菌属(Salmonella)、大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)，Bacilluscalmatte-guerin、志贺氏菌属(Shigella)、乳酸杆菌属(Lactobacillus))(Hone等，1996，Pouwels等，1998，Chatfield等，1993，Stover等，1991，Nugent等，1998)；活病毒载体(例如牛痘、腺病毒、单纯疱疹)(Gallichan等，1993，1995，Moss等，1996，Nugent等，1998，Flexner等，1988，Morrow等，1999)；微球体(Gupta等，1998，Jones等，1996，Maloy等，1994，Moore等，1995，O′Hagan等，1994，Eldridge等，1989)；核酸疫苗(Fynan等，1993，Kuklin等，1997，Sasaki等，1998，Okada等，1997，Ishii等，1997)；聚合物(例如，羧甲基纤维素、脱乙酰壳多糖)(Hamajima等，1998，Jabbal-Gill等，1998)；聚合物环(Wyatt等，1998)；蛋白体(Vancott等，1998，Lowell等，1988，1996，1997)；氟化钠(Hashi等，1998)；转基因植物(Tacket等，1998，Mason等，1998，Haq等，1995)；病毒体(Gluck等，1992，Mengiardi等，1995，Cryz等，1998)；以及病毒样颗粒(Jiang等，1999，Leibl等，1998)。

免疫刺激核酸可以与另外的治疗剂例如细胞因子组合以甚至进一步增强免疫应答。免疫刺激核酸和其它治疗剂可以同时或者前后给药。当其它治疗剂同时给药时，它们可以在同一或分开的制剂中给药，但在同一时间给药。其它治疗剂与免疫刺激核酸的给药还可以暂时分开，意味着治疗剂在不同的时间，在给药免疫刺激核酸之前或之后给药。这些化合物给药时间之间的分开可能是几分钟的事情，或者可能更长。其它治疗因子包括但不限于细胞因子、免疫治疗抗体、抗原等。

免疫应答还可以通过与免疫刺激核酸共给药或共线性表达细胞因子或共刺激分子而诱导或增强。细胞因子可以直接与免疫刺激核酸给药，或者以编码该细胞因子的核酸载体的形式给药，从而细胞因子可以在体内表达。在一个实施方案中，细胞因子以质粒表达载体的形式给药。术语“细胞因子”用作为各类可溶性蛋白或肽的通称，它们在纳摩尔或皮摩尔浓度时起体液调节剂的作用，并且它们在正常或病理条件下，调节各细胞和组织的功能性活动。这些蛋白还直接介导细胞之间的相互作用，并调节发生在胞外环境中的过程。细胞因子还是指导T细胞应答的中心。细胞因子的例子包括，但不限于IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-18、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、干扰素γ(IFN-γ)、IFN-α、肿瘤坏死因子(TNF)、TGF-β、FLT-3配体以及CD40配体。在一些实施方案中，细胞因子是Th1细胞因子。而在其它实施方案中，细胞因子为Th2细胞因子。在其它实施方案中，细胞因子不与免疫刺激核酸联合给药。

在其它方面，本发明涉及试剂盒。本发明的一种试剂盒包括盛装免疫刺激核酸的容器和盛装水包油乳剂的容器以及给药免疫刺激核酸和水包油乳剂的说明书。本发明的另一种试剂盒包括盛装免疫刺激核酸的容器和的时间安排给药免疫刺激核酸的时间安排的说明书。可选地，该试剂盒还可以包括抗原，盛装在分开的容器中或者与免疫刺激核酸或治疗制剂配制在一起。可选地，抗原可以处在持续释放装置中。持续释放载体在这里根据现有技术是用来指缓慢释放抗原的任何装置。

这种系统能够避免重复给药化合物，增加受试个体和医师的方便。存在许多类型的释放递送系统并且是本领域普通技术人员公知的。它们包括聚合物为基础的系统例如聚(丙交酯-乙交酯)、共聚草酸酯、聚己内酯、聚酯酰胺、聚原酸酯、聚羟基丁酸和聚酐。含有的药物前述聚合物的微胶囊描述在，例如美国专利5,075,109中。递送系统还包括非聚合物系统，它们是：包括固醇在内的脂肪，例如胆固醇、胆固醇酯和脂肪酸或中性脂肪例如单-、双-或三-甘油酯；水凝胶释放系统；sylastic系统；肽为基础的系统；蜡包衣；利用常规粘结剂和赋形剂的压制片剂；部分融合的植入物等。具体的例子包括，但不限于：(a)腐蚀系统，其中本发明的制剂包含在如美国专利Nos.4,452,775、4,675,189和5,736,152中所述的基质形式中，和(b)扩散系统，其中活性组份以可控速率从例如美国专利Nos.3,854,480、5,133,974和5,407,686中所述的聚合物中渗透。另外，可以利用基于泵的硬件递送系统，其中一些适合植入。

制剂例如水包油乳剂被盛装在至少一个容器中。容器可以是一起盛装所有制剂的单个容器，或者可以是盛装单个剂量的多个容器或腔室，例如硬质泡沫塑料衬垫包装。试剂盒还具有给药治疗制剂时间安排的说明书。说明书将指导患有癌症或处于患癌症风险中的受试个体在适当的时间服用治疗制剂。例如，递送药物的合适时间可能是症状发生的时候。作为替代方式，给药药物的合适时间可能是依照常规时间表例如每月或每年。

本发明的药物组合物含有有效量的免疫刺激核酸和治疗制剂，任选地包括在药学上可接受的载体中。术语“药学上可接受的载体”是指适于给药人类或其它脊椎动物的一种或多种相容固体或液体填料、稀释剂或者胶囊物质。术语“载体”表示有机或无机成分，天然的或合成的，活性成分与之组合便于施用。药物组合物的组份还能够以一定方式与本发明的化合物混合，以及彼此之间混合，使得没有在实质上会削减预期的药效的相互作用。

免疫刺激核酸和治疗制剂可以自身(纯的)或者以药学可接受的盐的形式给药。当用于药时，盐应当是药学上可接受的，但是非药学上可接受的盐可以常规地用来制备其药学上可接受的盐。这样的盐包括，但不限于，从如下酸中制备的那些盐：盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、马来酸、乙酸、水杨酸、p-甲苯磺酸、酒石酸、柠檬酸、甲磺酸、蚁酸、丙二酸、琥珀酸、萘-2-磺酸和苯磺酸。而且，这样的盐可以作为碱金属或碱土金属盐制备，例如羧酸基团的钠盐、钾盐或钙盐。

合适的缓冲剂包括：乙酸和盐(1-2％w/v)；柠檬酸和盐(1-3％w/v)；硼酸和盐(0.5-2.5％w/v)；以及磷酸和盐(0.8-2％w/v)。合适的防腐剂包括洁尔灭(0.003-0.03％w/v)；氯代丁醇(0.3-0.9％w/v)；parabens(0.01-0.25％w/v)和硫柳汞(0.004-0.02％w/v)。

肠胃外给药的药物制剂包括水溶性形式的活性化合物的水溶液。另外，活性活化合物悬浮液可作为合适的油注射悬浮液制备。合适的亲脂溶剂或介质包括脂肪油例如芝麻油，或者合成的脂肪酸酯，例如油酸乙酯或甘油三酸酯，或者脂质体。水性注射悬浮液可以包含增加悬浮液粘度的物质，例如羧甲基纤维素钠、山梨醇或葡聚糖。任选地，悬浮液还可以含有合适的稳定剂或者增加化合物溶解度的制剂，以允许制备高度浓缩的溶液。用于持续释放递送的另一个合适的化合物是GELFOAM，一种由修饰的胶原纤维组成的商业上可获得的产品。

作为替代，活性化合物可以是粉剂形式，用前与合适的载体如无菌无热原的水配制。

药物组合物还可以包含合适的固体和凝胶相载体或赋形剂。这样的载体或赋形剂的例子包括但不限于碳酸钙、磷酸钙、各种糖、淀粉、纤维素衍生物、明胶和聚合物例如聚乙二醇。

免疫刺激核酸和治疗制剂可以按固定的时间表或者以彼此不同的时间关系给药。各种组合比现有技术的方法具有很多优势。

免疫刺激核酸和治疗制剂可以通过任何平常的药物给药途径给药。根据治疗的紊乱的类型，免疫刺激核酸和治疗制剂可以吸入、咽下或通过系统途径。系统途径包括口服和肠胃外。由于直接递送到肺部，特别是在治疗呼吸道疾病或肺癌中，在某些实施方案中优选吸入的药物。许多类型的计量型剂量吸入器被常规地用来吸入给药。这些类型的装置包括计量型剂量吸入器(MDI)、呼吸驱动型MDI、干粉吸入器(DPI)、与MDI组合的间隔/容纳腔以及喷雾器。优选的给药途径包括但不限于口服、肠胃外、肌内、鼻内、气管内、鞘内、静脉内、吸入、眼睛、阴道和直肠途径。

为用于治疗，有效量的免疫刺激核酸和治疗制剂可以通过将核酸递送到感染的器官或组织，或者作为替代地，递送到免疫系统的任何方式向受试个体给药。“给药”本发明的药物组合物可以通过熟练技术人员公知的任何手段实现。优选的给药途径包括但不限于口服、肠胃外、肌内、皮下、鼻内、气管内、吸入、眼睛、阴道和直肠途径。

对于口服给药，化合物(即免疫刺激核酸、治疗制剂和其它治疗剂)可以通过组合活性化合物和本领域公知的药学上可接受的载体容易地配制。这样的载体使得本发明的化合物配制成片剂、药丸、糖衣丸、胶囊、液体、凝胶、糖浆剂、膏剂、悬浮液等，用于被治疗的受试个体口服摄入。口服用的药学制剂可以作为固体赋形剂获得，任选地研磨所得的混合物，并处理颗粒混合物，在加入合适的助剂后，如果需要的话，获得片剂或糖衣丸核芯。合适的赋形剂为，特别地，填料例如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨醇；纤维素制剂例如，象玉米淀粉、小麦淀粉、水稻淀粉、马铃薯淀粉、凝胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羟基丙基甲基-纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。如果需要，可以添加崩解剂，例如交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂或褐藻酸或其盐例如褐藻酸钠。任选地，口服制剂还可以在盐水或用于中和内部酸环境的缓冲液中配制，或者可以无需任何载体给药。

糖衣丸核芯被提供合适的包衣。为了这个目的，可以利用浓缩的糖溶液，它可以任选地含有阿拉伯胶、滑石粉、聚乙烯吡咯烷酮、聚羧乙烯凝胶、聚乙二醇和/或二氧化钛、漆溶液和适当的有机溶剂或溶剂混合物。可以向片剂或糖衣丸衣料中添加染料或颜料用于识别或表征不同的活性化合物剂量的组合。

口服用的药学制剂包括由明胶制成的推入配合胶囊(push-fitcapsules)，以及由明胶和增塑剂，例如甘油或山梨醇制成的软密封胶囊。推入配合胶囊可以含有与填料例如乳糖、粘附剂例如淀粉和/或润滑剂例如滑石粉或硬脂酸镁，以及任选地，稳定剂混合的活性成分。在软胶囊中，活性化合物可以溶解或悬浮在合适的液体，例如脂肪油、液体石蜡或液体聚乙二醇中。另外，可以添加稳定剂。也可以利用配制成口服给药的微球体。这种微球体在本领域已经被很好地详细说明。所有口服给药的制剂应当处于适于这样给药的剂量。

对于口腔给药，组合物可采取以常规方式配制的片剂或药糖块的形式。

对于吸入给药，根据本发明可用的化合物可以方便地从加压包装或喷雾器中借助于适当的推进剂，例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它适当的气体，以气溶胶喷射呈递的形式递送。在加压气溶胶的情况下，剂量单位可以通过提供阀门递送计量的量进行确定。用于吸入器或吹药器的例如明胶的胶囊和药筒可以配成含有化合物的粉末混合物和适当的粉末基底例如乳糖或淀粉。制备气溶胶递送系统的技术是本领域熟练技术人员公知的。一般而言，这种系统应当利用不会显著削减治疗剂的生物学性能，例如核酸的免疫刺激能力的组分(例如参见Sciarra和Cutie，″Aerosols，″inRemington′s Pharmaceutical Sciences，第18版，1990，pp 1694-1712；并入作为参考)。本领域熟练技术人员能够容易地确定制备气溶胶的各种参数和条件而无需采取过多的实验。

当期望全身递送时，化合物可以配制为通过注射，例如通过快速浓注或连续输注的肠胃外给药。注射用制剂可以以单位剂量的形式呈现，例如，在安瓿中或在多剂量容器中，并添加有防腐剂。组合物可以采取诸如悬浮液、溶液或油或水性载体中的乳剂的形式，并且可以含有配制剂例如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。

而在本发明的其它实施方案中，免疫刺激核酸提供在用于将输注递送到癌症患者的静脉内溶液，袋和/或管中。免疫刺激核酸可以被引入静脉内溶液，在接受输注之前向受试个体给药，或者它可以被引入到输血液本身(即红细胞或血小板悬浮液)中。作为选择地，静脉内袋或管本身可以在其内表面涂敷免疫刺激核酸，或者它们可以在制造期间用免疫刺激核酸饱和。制造静脉内系统用于递送生物学活性材料的方法是本领域公知的。例子包括Alza，Corp的美国专利Nos.：4,973,307和5,250,028中所描述的那些。

化合物还可以配制成直肠或阴道组合物，例如栓剂或滞留灌肠剂，例如含有常规栓剂基底可可脂或其它甘油酯。

除了以前描述的制剂，化合物还可以配制成储藏制剂。这种长效作用制剂可以与合适的聚合物或疏水材料(例如作为在可接受的油中的乳剂)或离子交换树脂，或者作为有限可溶性衍生物，例如，作为有限可溶性盐配制。

合适的液体或固体药学制剂形式有，例如，用于吸入的水或盐水溶液，装入微胶囊中，螺旋化(encochleaed)，涂敷到显微金颗粒上，包含在脂质体中，喷雾化，气溶胶，植入皮肤内的小团块，或者干燥于锐器上以擦伤皮肤。药物组合物还包括颗粒、粉末、片剂、包衣片剂、(微)胶囊、栓剂、糖浆剂、乳剂、混悬剂、霜剂、滴剂或延迟释放活性化合物的制剂，在这种制剂中，通常如上所述利用赋形剂和添加剂和/或助剂例如崩解剂、粘附剂、包衣剂、膨胀剂、润滑剂、调味剂、增甜剂或增溶剂。药物组合物适用于许多药物递送系统。有关药物递送方法的简要综述，参见Langer，Science 249：1527-1533，1990，兹将其并入作为参考。

本发明进一步通过如下实施例进行举例说明，它们决不应当理解为进一步的限制。

实施例1：与EMULSIGEN ^TM 组合的CpG：

进行实验测试以EMULSIGEN^TM(Em)和CpG ODN为共同佐剂的牛疱疹病毒-1(BHV-1)亚单位疫苗在牛中的免疫原性和保护功效。与单加VSA3、Em或CpG ODN作佐剂的tgD相比，以Em和CpG ODN为共同佐剂的截短形式的BHV-1糖蛋白D(tgD)在25、2.5或0.25mg/剂量的浓度时产生更强和更平衡的Th1/Th2免疫应答，更高的血清中和抗体以及BHV-1攻击后更大的保护。此外，以Em和25mg非-CpGODN/剂量为共同佐剂的tgD产生与单独的Em相当的免疫水平，并且免疫水平低于CpG ODN/Em组合。

材料和方法

细胞和病毒：BHV-1毒株P8-2和108在Madin Darby牛肾(MDBK)细胞中如以前所描述的那样繁殖(van Drunen Littel-van den Hurk，S.，J.等1994.Asubunit gIV vaccine，produced by transfected mammaliancells in culture，induces mucosal immunity against bovine herpesvirus-1in cattle.Vaccine 12：1295-1302)。毒株108用来攻击动物，而对于刺激PBMC体外增殖，则利用毒株P8-2。

BHV-1tgD的制备、处理和纯化：截短形式的BHV-1gD(tgD)通过在氨基酸355，紧接跨膜锚定的上游处，终止蛋白来构建。它在MDBK细胞中在牛热激70A(hsp70)基因启动子的调控下表达(Kowalski，J等1993.Heat-shock promoter-driven synthesis of secretedbovine herpesvirus glycoproteins in transfected cells.Vaccine11：1100-1107)。如别处所述制备、处理并纯化截短的gD(van DrunenLittel-van den Hurk，S.，J.等1994.A subunit gIV vaccine，produced bytransfected mammalian cells in culture，induces mucosal immunityagainst bovine herpesvirus-1 in cattle.Vaccine 12：1295-1302)。

CpG和非-CpG ODN：合成寡聚脱氧核糖核苷酸(ODN)制备物(Qiagen，Hilden，德国)中未甲基化的CpG二核苷酸在本研究中被用作为佐剂或共佐剂。所用的CpG ODN为ODN 2007(TCGTCGTTGTCGTTTTGTCGTT；CpG基序加有下划线)。为确定免疫应答是否由CpG二核苷酸诱导，我们还利用了非-CpG ODN；2041(CTGGTCTTTCTGGTTTTTTTCTGG)(Qiagen)。CpG和非-CpG ODN被硫代磷酸酯修饰以增加对核酸酶降解的抗性(Kuhnle，G.，A.等1998.The class II membrane glycoprotein G of bovine respiratorysyncytial virus，expressed from a synthetic open reading frame，isincorporated into virions of recombinant bovine herpesvirus 1.J.Virol.72：3804-3811)。

免疫：8组，每组7个9月龄的BHV-1-血清反应阴性的Angus和Hereford杂交小牛用以30％vol/vol EMULSIGEN^TM(Em)(MVPLaboratories，Nebraska，U.S.A)、30％vol/vol VSA3(含有24mM溴化二甲基双十八烷基铵[DDA]的Em)、25mg CpG ODN(CpG)、30％Em与25(高)、2.5(中)或0.25(低)mg CpG ODN组合(分别为HCpG/Em，M CpG/Em，L CpG/Em)或者Em与25mg非-CpG ODN(非-CpG/Em)组合为佐剂的50μg BHV-1tgD皮下免疫。疫苗以2ml的体积皮下给药。小牛的安慰剂组仅用2ml PBS免疫。39天后，动物再次免疫，然后在二次免疫2周后攻击(接种的第53天)。

实验性攻击和临床评估：二次免疫5周后，动物被运输到隔离的围栏中，称重并临床检查。然后如以前所描述的那样使小牛单个地暴露于10⁷PFU BHV-1的气溶胶4分钟(Loelir，B.L，等2000.Genegun-mediated DNA immunization primes development of mucosalimmunity against bovine herpesvirus I in cattle.J.Virol.74：6077-6086；van Drunen Littel-van den Hurk，S.，等1990.Epitope specifcity of theprotective immune response induced by individual bovine herpesvirus-1glycoproteins.Vaccine 8：358-368)。攻击后，小牛每天称重。此外，连续11天对它们进行临床评估。临床评估由对动物的接种状态一无所知的兽医在每天的同一时间进行。评估的临床征象包括发热(直肠温度＞40℃)、抑郁、鼻粘膜炎和conjuctivitis。

取样和病毒分离：在接种后第0、14、39、47、53、57、61、64和67天对动物放血评价抗体应答。在第50和61天收集带有抗凝血剂(终浓度0.2％的乙二胺四乙酸[EDTA])的血液，通过ELISPOT和ELISA试验来评价体外增殖和IFN-γ的产生。在攻击后每两天收集含有高达5ml鼻液的鼻棉塞，并在当天处理以测量病毒释放。从鼻棉塞中回收的病毒如以前所描述的那样在具有抗体涂层的微量滴定板中通过噬斑滴定法定量(Rouse，B.T.和L.A.Babiuk.1974.Host responses toinfectious bovine rhinotracheitis virus.III.Isolation and immunologicactivities of bovine T lymphocytes.J.Immunol 113：1391-1398)。

酶联免疫吸附试验(ELISA)：为了确定攻击前后的特异性抗体应答，96孔聚苯乙烯微量滴定板(Immulon 2，Dynatech，Gaithersburg，Md)每孔用0.05μg每孔的纯化tgD或纯化tgB过夜包被(Li，Y.，等1996.Production and characterization of bovine herpesvirus 1 glycoprotein Bectodomain derivatives in an hsp 70A gene promoter-based expressionsystem.Arch Virol.141：2019-2029)。系列稀释的牛血清(从1∶10开始以三倍稀释)在室温下温育2小时。利用1∶5,000稀释度的碱性磷酸酶(AP)-缀合的山羊抗牛IgG(Kirkegaard & Perry Laboratories，Gaithersburg，Md)检测结合的IgG。反应用磷酸对硝基苯酯(SigmaChemical Co.，Oakville，Ontario，Canada)视觉化。

利用酶联免疫吸附试验的免疫球蛋白同种型：为了确定用tgD免疫的牛的特异性IgG1和IgG2抗体应答，聚苯乙烯微量滴定板每孔用0.05μg纯化的tgD过夜包被，并用热失活的马血清于37℃封闭30分钟。系列稀释的牛血清(从1∶10开始以三倍稀释)于4℃过夜温育。结合的抗体分别用1∶40,000和1∶8000稀释度的针对牛IgG1(M-23)或IgG2(M-37)的单克隆抗体检测，它们依次用1∶10,000稀释的AP-耦连的山羊抗小鼠IgG(Kirkegaard & Perry Laboratories，Gaithersburg，Md)检测。反应如ELISA试验那样视觉化。结果表示为IgG1与IgG2的比率。

病毒中和试验：牛血清的中和滴度如先前所描述的那样确定(Babiuk，L.A.，等1975.Defense mechanisms against bovine herpesvirus：relationship of virus-host cell events to susceptibility toantibody-complement cell lysis.Infect.Immun.12：958-963)。滴度表示为导致相对于病毒对照而言噬斑减少50％的抗体最高稀释度的倒数。

PBMC的体外增殖：外周血单个核细胞(PBMC)在Ficoll-PlaquePLUS(Pharmacia，Mississauga，Ontario，Canada)中分离，并以3.5×10⁵细胞/孔在补充有10％(vol/vol)胎牛血清(Sigma Chemical Co)、2mM L-谷氨酰胺(Gibco-BRL)、500mg/ml庆大霉素、5×10^-5 M 2-巯基乙醇和1mg/ml地塞米松的极限必需培养基(Gibco BRL，GrandIsland N.Y，U.S.A)中于96孔组织培养板中一式三份培养。细胞用gD以1μg/ml的终浓度刺激。对照细胞不刺激。培养72小时后，细胞用[甲基-³H]胸苷(Amersham，Oakville，Ontario，Canada)以0.4μCu/孔的浓度脉冲。18小时后用半自动细胞收集器(Skatron，Starling VA，U.S.A)收集细胞，并通过闪烁计数确定放射活性。增殖反应作为三份孔的平均值计算，并表示为刺激指数(SI)，其中SI代表存在抗原时的每分钟计数除以不存在抗原时的每分钟计数。

ELISPOT试验：硝酸纤维素板(Whatman，New Jersey，U.S.A)用1∶400稀释度的牛干扰素γ(IFN-γ)特异性单克隆抗体于4℃过夜包被。未结合的抗体用0.05％vol/vol PBS-Tween-20(PBS-T)洗涤除去，终了在PBS中洗涤。如增殖试验一样分离PBMC，并以10⁶细胞/孔在存在终浓度为0.4μg/ml的gD时培养。对照细胞仅用培养基培养。24小时后，洗涤细胞，重悬于培养基中，转移到硝酸纤维素板中，并于37℃进一步温育24小时，之后细胞用0.05％vol/vol PBS-T洗涤。随后，板在室温下与1∶100的稀释度的针对牛IFN-γ的兔多克隆抗体温育2小时，然后室温下与生物素标记的大鼠抗兔IgG(Zymed，SanFrancisco，CA，U.S.A)温育2小时，接着是抗生蛋白链菌素-AP(GIBCO-BRL，Ontario，Canada)，各自为1∶1000的稀释度。结合的IFN-γ利用溴氯吲哚磷酸/氮蓝四唑(BCIP/NBT)底物片(SigmaChemical Co)视觉化。板子在蒸馏水中洗涤并在空气中干燥，之后在400×放大倍数下计数染色斑点。IFN-γ分泌细胞的数目表示为gD-刺激孔中每10⁶细胞的斑点数目与对照孔中每10⁶细胞的斑点数目之间的差额。

IFN-γELISA：如ELISPOT试验一样培养牛PBMC。24小时后，收集上清，并在涂敷有针对IFN-γ的单克隆抗体的96孔板中进行系列稀释。已知浓度的纯化的牛IFN-γ用作标准品。标准曲线范围从2000到7.8pg/ml(r＞0.98)。样品和标准品在8个2倍PBS-T稀释液中以100μl/孔进行分析。结合的IFN-γ利用兔抗-IFN-γIgG检测，它依次用AP-耦连的山羊-抗-兔IgG检测。反应如tgD特异性抗体ELISAs中所述视觉化。底物的吸光度在405和490nm处测量。利用ELISA读数程序(Microplate manager 5，BIO RAD Laboratories，Ontario，Canada)构建标准曲线和计算样品中IFN-γ的浓度。

统计学分析：为考虑不均衡分布，所有的数据在进行统计学分析之前通过对数变换进行转化。血清中和滴度、同型比率、体外增殖反应、ELISPOT和IFN-γELISA数据的差异，是利用单向方差分析和Tukey′s多对比检验研究的。接种组中具有疾病征兆(温度升高、体重损失和病毒释放)的动物数目的差异以及攻击前后牛血清中tgD和tgB-特异性抗体之间的差异，是通过二向方差分析和Tukey真实显著性差异(honestly significantly different，HSD)多对比检验确定的。

结果

针对tgD的体液免疫应答：为了评价CpG ODN的佐剂能力，BHV-1tgD以25mg/剂量的CpG、Em或VSA3为佐剂，或者以Em和25、2.5或0.25mg/剂量浓度的CpG(H-、M-或L-CpG/Em)为共同佐剂，或者佐以Em和25mg/剂量的非-CpG ODN(非-CpG/Em)为共同佐剂。除了VSA3组外，所有的接种组在初次免疫后14天比安慰剂组具有显著更高水平的中和抗体(p＜0.001)(图4)。H-CpG/Em组中的抗体水平显著(p＜0.001)高于非-CpG/Em、Em、CpG或VSA3组的水平。抗体水平在二次免疫后急剧升高，以至于在第47天，全部3个CpG/Em组比所有其它接种组具有显著(p＜0.001)更高的滴度。这个数据提供了疫苗中CpG ODN的浓度对二次免疫应答没有显著影响的证据。重要的是，用以非-CpG/Em为共同佐剂的tgD免疫的动物的抗体滴度与Em组的滴度没有显著的差异。另外，非-CpG/Em组的滴度与CpG和VSA3组的那些滴度没有显著差异。

为确定产生的免疫应答的类型，测定了牛血清中tgD-特异性的IgG1和IgG2抗体，并在二次免疫后8天测量了IgG1∶IgG2比率。初次免疫后和攻击后的比率都相似。在三个CpG/Em组和CpG组中测量到平衡的免疫应答(～1∶1比率)，这些组间没有统计差异。相反，Em、VSA3和非-CpG/Em配制的疫苗产生IgG1-偏向的免疫应答(＞1600∶1)。非-CpG/Em组比L-CpG/Em组产生更高的IgG1∶IgG2比率。不过，非-CpG/Em组显著(p＜0.05)不同于M-CpG/Em和H-CpG/Em组。三个CpG/Em组间或者非-CpG/Em和Em组间没有显著性差异。另外，所有三个CpG/Em组与Em(p＜0.001)和VSA3(p＜0.01)组都有显著性差异。

细胞介导的针对tgD的免疫应答：为检查由疫苗接种诱导的细胞介导的免疫，测量了牛淋巴细胞对BHV-1gD的体外增殖反应。虽然CpG/Em接种的动物中攻击前的增殖反应趋向于比接种非-CpG/Em、CpG或Em的动物中的更强，但是差异没有统计学显著性(图5a)。不过，H-CpG/Em和L-CpG/Em组中的增殖反应显著(p＜0.05)高于VSA3和安慰剂组。为进一步确认T-细胞激活，评价了IFN-γ的产生。虽然CpG/Em组中IFN-γ分泌细胞的数目不依赖于所用的CpGODN的浓度，它们显著高于(p＜0.001)非-CpG/Em、Em、VSA3和安慰剂组中IFN-γ分泌细胞的数目(图5b)。BHV-1攻击后，CpG/Em中PBMC群的增殖反应比其它免疫组强～2倍(图5b)。相反，CpG/Em组和CpG组间没有差异。攻击前测量的培养的接种动物PBMC上清中IFN-γ的量遵从与ELISPOT中相似的应答模式(图5c)。CpG/Em组相互之间或者与CpG或Em组之间没有显著性差异。不过，这些组中测量的IFN-γ的量显著高于安慰剂(p＜0.01)、非-CpG/Em(p＜0.05)和VSA3(p＜0.01)组。这些数据证实了CpG ODN即使是与EMULSIGEN^TM组合时诱导Th1-型免疫应答的能力。

BHV-1感染之后的免疫应答：攻击后血清中和抗体或病毒蛋白特异性抗体水平的提高是感染的另一种迹象。虽然所有的组在攻击前对BHV-1糖蛋白B(tgB)是血清反应阴性的，但攻击后安慰剂、CpG、Em、VSA3和非-CpG/Em组中，而不是CpG/Em组中，针对tgB的抗体显著增加(p＜0.01)(图6b)。攻击后安慰剂、CpG、Em、VSA3和非-CpG/Em组中的血清中和滴度(图4)以及针对tgD的抗体(图6a)也显著增加(p＜0.005)，表明这些组未能完全被保护以免于BHV-1感染。虽然M-CpG/Em组在攻击后也表现出血清中和抗体以及针对tgD的抗体的水平些许增加，但这些增加不显著。血清中和滴度以及针对tgD的抗体在H-CpG/Em组中事实上在攻击后是下降的，而在M-CpG/Em组中保持稳定。这些结果表明了CpG-EMULSIGEN^TM制剂诱导的无菌免疫。

免于BHV-1攻击的保护：所有动物在攻击前是健康的。攻击后，除M-和H-CpG/Em组在整个跟踪期间温度保持≤39.5℃外，所有组的平均直肠温度从第2天到第6天提高(图7)。安慰剂和非-CpG/Em组表现出最大的温度增加(到第6天达～40.1℃)，并与M-和H-CpG/Em组具有显著型差异(p＜0.002)。虽然L-CpG/Em组中小牛的温度到第6天稳定地增至39.5℃，并且其温度与H-CpG/Em组有显著差异(p＝0.006)，但它们也不同于安慰剂组(p＜0.001)，而与M-CpG/Em组设有不同。Em、CpG和VSA3组中平均直肠温度也在第2天到第4天增至＞39.4℃，之后降至＜39℃。

致病率的另一种评估是BHV-1感染后重量损失的程度。尽管H-和L-CpG/Em组中的动物在试验过程中经历最小的或者没有重量损失，其它组中的动物在攻击后4天经历高达8kg的重量损失(图8)。

为了进一步确定防止BHV-1感染的保护水平，评价了来自鼻通道的病毒释放程度。尽管CpG、Em和非-CpG/Em组中的动物在攻击后第2天开始排放病毒，并这样持续至少到第8天，从任一CpG/Em组的动物鼻棉塞中未回收到病毒(图9)。虽然接种疫苗对病毒释放具有显著(p＜0.001)作用，三个CpG/Em组仅与非CpG/Em(p＝0.003)和安慰剂(p＜0.001)组有统计学差异。

前述的书面说明书被认为足以能够使本领域熟练技术人员实施本发明。本发明的范围不受所提供的实施例的限制，因为实施例旨在作为本发明的一个方面的个别举例说明，而且其它功能等同的实施方案在本发明的范围之内。从前述的描述中，除了那些本文所显示和描述的之外的本发明的各种修饰，对本领域熟练技术人员是明显的，并且落在所附的权利要求的范围之内。本发明的优点和目的无需为本发明的每一个实施方案涵盖。

兹将本申请所引用的所有参考文献、专利和专利申请全文并入作为参考。

Claims

1.免疫刺激核酸、水包油乳剂和BHV-1抗原在制备药物中的应用，所述药物具有在该水包油乳剂中的该免疫刺激核酸和该BHV-1抗原，其中免疫刺激核酸为CpG寡核苷酸，且其中该药物用于在牛体内增加对该BHV-1抗原的免疫应答，并由此改善BHV防护和/或降低BHV释放。

2.权利要求1的应用，其中水包油乳剂为EMULSIGEN^TM。

3.权利要求1的应用，其中所述CpG寡核苷酸是：

TCGTCGTTGTCGTTTTGTCGTT。

4.权利要求1的应用，其中免疫刺激核酸具有修饰的主链。

5.权利要求4的应用，其中修饰的主链为磷酸修饰的主链。

6.权利要求5的应用，其中磷酸的修饰主链为硫代磷酸酯修饰的主链。

7.权利要求4的应用，其中修饰的主链为肽修饰的寡核苷酸主链。

8.权利要求1的应用，其中所述BHV-1抗原为亚治疗剂量。

9.权利要求8的应用，其中BHV-1抗原的亚治疗剂量是比在抗原与明矾配制时产生抗原特异性免疫应答的抗原最小有效剂量少至少50％的剂量。

10.权利要求8的应用，其中BHV-1抗原的亚治疗剂量是比在抗原与明矾配制时产生抗原特异性免疫应答的抗原最小有效剂量少至少90％的剂量。

11.权利要求1的应用，其中所述免疫刺激核酸、水包油乳剂和BHV-1抗原通过口服给药。

12.权利要求1的应用，其中所述免疫刺激核酸、水包油乳剂和BHV-1抗原通过注射给药。

13.权利要求12的应用，其中所述免疫刺激核酸、水包油乳剂和BHV-1抗原通过皮下途径来注射。

14.权利要求1的应用，其中所述牛为免疫受损个体。