CN110218729B - 一种鸡特异性免疫活化剂CpG-ODN及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种鸡特异性免疫活化剂CpG‑ODN及其应用，所述CpG‑ODN的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。该CpG‑ODN能提高对鸡的先天性免疫及特异性体液和细胞介导的免疫反应的诱发作用，可将其转入质粒载体pVAX1构建重组质粒pVAX1‑CpG，并制备含有重组质粒pVAX1‑CpG的制剂。该制剂不仅能有效地激活鸡的天然免疫功能，作为免疫激活剂，成功替代或部份替代抗生素；还能有效地激活鸡的获得性免疫功能，尤其是细胞免疫，可作为免疫佐剂提高疫苗保护效果；且对机体毒副作用小，具有巨大潜力，可广泛应用于生鸡养殖业，有利于降低养殖成本，减少生鸡发病率，提高其存活率及养殖效率。

Description

一种鸡特异性免疫活化剂CpG-ODN及其应用
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体地，涉及一种鸡特异性免疫活化剂CpG-ODN及其应用。
背景技术
长期以来，人们一直以为DNA的作用仅是控制性状表达，并没有认识到DNA的免疫学作用。早在19世纪就有人发现，感染细菌的癌症病人更容易清除肿瘤，后来一位外科医生发现给癌症患者注射细菌提取物，能明显减轻病情(Coley,1991)，并认为起作用的活性成分可能是提取物中的脂多糖。后来Braw等人于1965年用寡聚脱氧核糖核酸和绵羊红细胞一起免疫小鼠，发现与单独红细胞免疫组相比，小鼠能产生更强的免疫应答水平，于是首次提出了寡聚脱氧核糖核酸可作为免疫佐剂，但当时并没有引起足够的重视。随后Tokunaga等人报道了牛结核分支杆菌卡介苗在肿瘤治疗中的作用，并发现细菌DNA才是产生抗肿瘤效应的活性物质(Tokunaga et al,1984)，从此人们才认识到DNA的免疫学作用。几年后，Yamamoto等进一步研究证明，细菌DNA具有直接的免疫活性和抗肿瘤效应(Tokunaga etal,1984；Yamamoto et al,1992)，后来又用人工合成的含有非甲基化CpG基序的寡聚脱氧核糖核苷酸CpG-ODN(Oligodeoxynucleotide，ODN)来进行试验，发现细菌DNA的免疫活性只与其中含有的非甲基化胞嘧啶和鸟嘌呤二核苷酸有关(Yamamoto et al,1994)。直到1995年，美国学者Krieg等首次提出了CpG基序的概念，即CpG基序是由未甲基化的胞嘧啶和鸟嘌呤二核苷酸为核心序列构成的特定核苷酸序列结构(Krieg et al,1995)。Ballas等人将组成CpG基序的DNA称为CpG-DNA，将含有CpG基序的寡聚脱氧核糖核苷酸称为CpG-ODN(Ballaset al,1996)。
具有免疫刺激活性的CpG序列必须是未甲基化的，其核心结构为5’-X1X2CGY1Y2-3’，5’端为两个嘌呤，3’端为两个嘧啶，这段核心结构被Krieg等命名为CpG基序(Krieg etal,1995)。CpG-ODN需要有一定的长度才可以发挥免疫活性，研究发现，在一段刺激序列中可以有一个或多个CpG基序，真正产生免疫效果的最短序列为包含CpG基序在内的约30个核苷酸残基，且CpG基序的侧翼序列和之间连接碱基的不同都会影响免疫应答的类型和强度(Krieg et al,2000；Tokunaga et al,1984)。另外，CpG基序的细胞内受体识别位点位于5’端，因此5’端若出现发卡结构或是二聚体时，则会影响受体对CpG基序的识别和结合，阻断信号转导通路(Jover et al,2011)。
迄今为止，国内外学者已研究出几千种具有免疫刺激活性的CpG序列，可分为A、B、C、P四种类型。A型为磷酸二酯骨架，含多个CpG基序和Poly G尾，主要激活树突状细胞和NK细胞；B型为硫代磷酸骨架，含多个TCG基序，可促进B细胞增殖和分化，促进pDC成熟较弱；C型为磷酸二酯键和硫代磷酸键混合型骨架，综合了A型和B型的特点，5’端有CG，3’端有较长的回文结构，可以促进B细胞的增殖和pDC的成熟(Booth et al,2007；Vollmer et al,2004)；P型与C型相似，但对pDC的促进作用稍强，对B细胞的也有一定的增殖作用(Donhauser et al,2010；Vollmer et al,2009)。在实践中，科研和治疗的目的不同，选择的类型也不同。
CpG-ODN作为一种高效的非特异性免疫刺激序列，对多种免疫细胞都具有直接或间接的激活作用，包括B淋巴细胞、T淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞，诱导这些细胞分泌IL-6、IL-12、TNF-α等Th1型细胞因子，刺激细胞表面分子MHC II、B7-1、B7-2的表达(孙梯业等，2010)。并能使Th2型反应向Th1型反应转变，还可特异性的增强抗原的免疫原性，产生较强的抗原特异性体液和细胞免疫反应(de Brito et al,2010)。
CpG-ODN作为一种先天性免疫激活剂，可以非特异的保护有机体免受致病菌的感染。大量的动物实验已证实，在感染的过程中，CpG可作为一种危险信号，被机体的CpG分子受体识别，从而激活机体的先天性免疫防御系统，产生一系列的免疫反应来清除病原体。例如，给小鼠免疫CpG-ODN，每月免疫2～4次，六周后用李斯特菌和野兔热弗朗西斯菌以致死剂量对小鼠进行攻毒，小鼠健康良好，无任何组织损伤和炎症(Maurer et al,2011)。用产肠毒素大肠杆菌对断奶仔猪进行攻击感染后，发现用CpG-ODN免疫可快速下调产肠毒素大肠杆菌在仔猪肠道中的数量，明显降低了仔猪的死亡率，腹泻症状也比未免疫的仔猪明显减轻(Cheng et al,2010)。
大量研究表明，CpG-ODN可作为一种疫苗佐剂增强动物抗原的特异性体液和细胞免疫反应，是一种高效的疫苗免疫佐剂，可解决疫苗反复使用导致的免疫原性弱的问题(Guo et al,2011)。CpG-ODN的免疫佐剂效应在哺乳动物实验中均已得到证实，张玲华等将CpG-ODN同猪伪狂犬病毒活疫苗联合免疫初生仔猪，试验结果表明，CpG-ODN能显著增强仔猪对疫苗的体液免疫和细胞免疫反应(张玲华等，2004)。郭晓磊将乙肝表面抗原和CpG-ODN单独或联合免疫小鼠，发现CpG-ODN能够显著增强小鼠脾脏淋巴细胞对HbsAg抗原的应答能力，高剂量的CpG-ODN并未损伤小鼠脾脏，实验证明CpG-ODN可以作为乙肝病毒表面抗原的免疫佐剂(郭晓磊，2008)。CpG-ODN除了可以增强系统免疫反应外，还可以作为粘膜佐剂，增强免疫反应能力(刘艳环等，2006)。
目前报道的CpG主要是用于鸡疫苗佐剂，同时具备先天性免疫提升和疫苗佐剂(获得性免疫)功能的鸡特异性CpG制剂还未见报道。此外，现有已报道的大多数CpG-ODN为了防止其易降解，需要硫代化，合成的成本非常高，不适合于现有的鸡的养殖。因此，需要研发一种新型高效的CpG-ODN，能有效提升鸡的先天性及获得性免疫，同时降低人工合成成本。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术的上述不足，提供一种鸡特异性免疫活化剂CpG-ODN，所述CpG-ODN能提高对鸡的先天性免疫及特异性体液和细胞介导的免疫反应的诱发作用。
本发明的另一目的在于提供一种含有上述CpG-ODN的重组质粒，制备成本低。
本发明的另一目的在于提供上述CpG-ODN、重组质粒在制备治疗和/或预防鸡疾病的制剂中的应用。
本发明的另一目的在于提供一种治疗和/或预防鸡疾病的制剂。
为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：
本发明通过设计合成35余条CpG基序，通过建立的外周血单核细胞IFN-r和SI快速测定的高效可靠的定向筛选模式，筛选出最佳鸡CpG基序。再通过细胞学实验，以该基序为基准，以多个拷贝的CpG基序作为CpG-ODN，筛选得到最佳的CpG-ODN，并将其转入质粒载体pVAX1构建重组质粒pVAX1-CpG，制备含有重组质粒pVAX1-CpG的制剂。该制剂不仅能有效地激活鸡的天然免疫功能，作为免疫激活剂，成功替代或部份替代抗生素；还能有效地激活鸡的获得性免疫功能，尤其是细胞免疫，可作为免疫佐剂提高疫苗保护效果，减少生鸡发病率。
因此，本发明请求保护一种鸡特异性免疫活化剂CpG-ODN，其核苷酸序列如SEQ IDNO:1所示，该CpG-ODN能提高对鸡的先天性免疫及特异性体液和细胞介导的免疫反应的诱发作用。
本发明还请求保护一种含有上述CpG-ODN的重组质粒，该重组质粒是将CpG-ODN连接入质粒载体pVAX1中得到的，即为pVAX1-CpG。所采用的连接方法为本生物工程技术领域常规技术。
本发明还请求保护上述CpG-ODN、重组质粒在制备治疗和/或预防鸡疾病的制剂中的应用。
优选地，所述鸡疾病为由沙门氏菌或肠毒性大肠杆菌引起的疾病。
本发明还请求保护一种治疗和/或预防鸡疾病的制剂，所述制剂为含有10～100μg/mL上述重组质粒的PBS溶液。
优选地，所述PBS溶液还含有以下重量百分比的各组分：0.50～1.05％NaCl，0.01～0.045％KCl，0.0123～0.0165％Na2HPO4，0.014～0.035％KH2PO4，余量去离子水。
更优选地，所述PBS溶液还含有以下重量百分比的各组分：0.6％NaCl，0.01％KCl，0.0124％Na2HPO4，0.014％KH2PO4，余量去离子水。
优选地，当所述制剂作为鸡免疫激活剂时，其注射剂量为0.1～1.0mL/kg体重。
具体地，当所述制剂作为鸡免疫激活剂使用、用于预防鸡疾病时，是每只鸡经肌肉注射0.1～1.0mL/kg体重pVAX1-CpG制剂，首次免疫3天后加强免疫，方法与剂量与首次免疫相同。
优选地，当所述制剂作为鸡免疫佐剂时，其注射剂量为0.2～1.0mL/kg体重。
具体地，所述制剂作为鸡免疫佐剂时，按每只鸡经肌肉注射0.2～1.0mL/kg体重CpG/疫苗(将相应的pVAX1-CpG制剂与一头份疫苗混匀)，首次免疫3天后加强免疫，方法与剂量与首次免疫相同。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明提供的CpG-ODN能提高对鸡的先天性免疫及特异性体液和细胞介导的免疫反应的诱发作用，可将其转入质粒载体pVAX1构建重组质粒pVAX1-CpG，并制备含有重组质粒pVAX1-CpG的制剂，该制剂生产成本低。
(2)本发明提供的含有CpG-ODN的制剂不仅能有效地激活鸡的天然免疫功能，作为免疫激活剂，成功替代或部份替代抗生素；还能有效地激活鸡的获得性免疫功能，尤其是细胞免疫，可作为免疫佐剂提高疫苗保护效果；且对机体毒副作用小，具有巨大潜力，可广泛应用于生鸡养殖业，有利于降低生产成本，减少生鸡发病率，提高其存活率及养殖效率。
附图说明
图1为CpG-poly系列DNA刺激鸡淋巴细胞IP-10表达量情况。其中，横坐标的1到10分别是质粒CpG-poly-1到CpG-poly-10刺激鸡体外淋巴细胞IP-10的相对表达含量，11为CpG-ODN刺激IP-10的相对表达含量；图中数值均为3个个体9次RT-qRCR的平均值；相同时间内不同CpG-poly刺激产生IP-10的相对含量与PBS组(参照组)相比较，*表示差异显著p<0.05。
图2为重组质粒的双酶切鉴定结果。其中，泳道M为Marker DL2000，泳道1为pVAX1-CpG酶切产物。
图3为重组菌质粒抽提检测结果。其中，泳道M为Marker DL2000，泳道1为pVAX1-CpG质粒条带。
图4为重组菌质粒的构建流程图。
具体实施方式
下面结合说明书附图及具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1特异性CpG-ODN的筛选
1、本实施例采用现有基因工程或化学方法，设计合成了35余条CpG基序(如表1所示)，通过建立的外周血单核细胞IFN-r和SI快速测定的高效可靠的定向筛选模式，筛选出最佳鸡CpG基序(结果如表2所示)。
表1体外筛选鸡特异性CpG ODN的结构特征
Figure GDA0004235400780000051
Figure GDA0004235400780000061
注：CpG基序用下划线标出，其中小写字母表示用硫代修饰，大写字母表示未经硫代修饰。
表2不同的鸡特异性CpG ODN体外对鸡PBMC的刺激效果
Figure GDA0004235400780000062
Figure GDA0004235400780000071
注：以上数据为5个个体的平均值；相同字母表示差异不显著p>0.05，不同字母表示差异显著p<0.05。
由表2可知，CpG22能诱导较强的淋巴细胞增殖，及IFN-γ诱生能力。因此，选择CpG22作为基序用于下一步的基序数量的确定研究。
2、以CpG22基序为基准，以多个拷贝的CpG基序作为CpG-ODN，并转入质粒载体pVAX1中，构建重组质粒pVAX1-CpG，并编号(如表3所示)。再通过细胞学实验，筛选得到最佳的CpG-ODN序列。
表3本实施例所用CpG-poly序列
质粒编号 含CpG基序个数
CpG-poly-1 1
CpG-poly-2 3
CpG-poly-3 4
CpG-poly-4 7
CpG-poly--5 10
CpG-poly-6 13
CpG-poly-7 19
CpG-poly-8 25
CpG-poly-9 49
CpG-poly-10 73
将含有CpG-poly系列序列的重组质粒分别进行体外刺激鸡淋巴细胞，培养6h后进行细胞总RNA的提取，检测IP-10的相对表达含量。IP-10表达含量的RT-qPCR检测结果如图1所示。
由图1可以看出CpG-poly-5刺激淋巴细胞时IP-10的相对表达量为对照的12倍，与对照组差异极显著(p<0.01)与阳性对照CpG-ODN差异不显著。
综合分析可知，CpG-poly-5(含10个CpG基序)对鸡体外淋巴细胞IP-10的分泌具有最佳刺激效果。因此，将CpG-poly-5作为最优CpG-ODN序列，其核苷酸序列如SEQ ID:1所示。
实施例2
可采用现有基因工程或化学方法合成CpG-ODN的核苷酸序列(SEQ ID NO:1)。合成后，构建pVAX1-CpG重组质粒，将目的基因CpG的核苷酸序列(SEQ ID NO:1)与pVAX1片段进行连接(如图1～3所示)，得重组质粒，保存于-15℃备用。
一种治疗和/或预防鸡疾病的制剂，所述制剂为含有30μg/mL上述重组质粒的无菌PBS溶液(即pVAX1-CpG制剂)。
所述无菌PBS溶液(1L)还含有以下重量百分比的各组分：0.6％NaCl，0.01％KCl，0.0124％Na2HPO4，0.014％KH2PO4，余量去离子水。
所述无菌PBS溶液的制备方法：将各组分按比例混合均匀后，采用湿热高压灭菌法在115℃下，灭菌20min。湿热高压灭菌法是本领域常用的灭菌方法，其操作可以参照现有技术进行。
预防：作为鸡免疫激活剂时，每只鸡经肌肉注射0.4mL/kg体重pVAX1-CpG制剂，首次免疫3天后加强免疫，方法与剂量与首次免疫相同。
治疗：作为鸡疫苗佐剂时，按每只鸡经肌肉注射0.4mL/kg体重CpG/疫苗(将相应的pVAX1-CpG制剂与一头份疫苗混匀)，首次免疫3天后加强免疫，方法与剂量与首次免疫相同。
实施例3
可采用现有基因工程或化学方法合成CpG-ODN的核苷酸序列(SEQ ID NO:1)。合成后，构建pVAX1-CpG重组质粒，将目的基因CpG的核苷酸序列(SEQ ID NO:1)与pVAX1片段进行连接(如图1～3所示)，得重组质粒，保存于-15℃备用。
一种治疗和/或预防鸡疾病的制剂，所述制剂为含有30μg/mL上述重组质粒的无菌PBS溶液(即pVAX1-CpG制剂)。
所述无菌PBS溶液(1L)还含有以下重量百分比的各组分：0.7％NaCl，0.02％KCl，0.0134％Na2HPO4，0.024％KH2PO4，余量去离子水。
所述无菌PBS溶液的制备方法：将各组分按比例混合均匀后，采用湿热高压灭菌法在117℃下，灭菌21min。湿热高压灭菌法是本领域常用的灭菌方法，其操作可以参照现有技术进行。
预防：作为鸡免疫激活剂时，每只鸡经肌肉注射0.5mL/kg体重pVAX1-CpG制剂，首次免疫3天后加强免疫，方法与剂量与首次免疫相同。
治疗：作为鸡疫苗佐剂时，按每只鸡经肌肉注射0.5mL/kg体重CpG/疫苗(将相应的pVAX1-CpG制剂与一头份疫苗混匀)，首次免疫3天后加强免疫，方法与剂量与首次免疫相同。
实施例4
可采用现有基因工程或化学方法合成CpG-ODN的核苷酸序列(SEQ ID NO:1)。合成后，构建pVAX1-CpG重组质粒，将目的基因CpG的核苷酸序列(SEQ ID NO:1)与pVAX1片段进行连接(如图1～3所示)，得重组质粒，保存于-15℃备用。
一种治疗和/或预防鸡疾病的制剂，所述制剂为含有30μg/mL上述重组质粒的无菌PBS溶液(即pVAX1-CpG制剂)。
所述无菌PBS溶液(1L)还含有以下重量百分比的各组分：0.8％NaCl，0.03％KCl，0.0144％Na2HPO4，0.0245％KH2PO4，余量去离子水。
所述无菌PBS溶液的制备方法：将各组分按比例混合均匀后，采用湿热高压灭菌法在118℃下，灭菌22min。湿热高压灭菌法是本领域常用的灭菌方法，其操作可以参照现有技术进行。
预防：作为鸡免疫激活剂时，每只鸡经肌肉注射0.6mL/kg体重pVAX1-CpG制剂，首次免疫3天后加强免疫，方法与剂量与首次免疫相同。
治疗：作为鸡疫苗佐剂时，按每只鸡经肌肉注射0.6mL/kg体重CpG/疫苗(将相应的pVAX1-CpG制剂与一头份疫苗混匀)，首次免疫3天后加强免疫，方法与剂量与首次免疫相同。
实施例5
可采用现有基因工程或化学方法合成CpG-ODN的核苷酸序列(SEQ ID NO:1)。合成后，构建pVAX1-CpG重组质粒，将目的基因CpG的核苷酸序列(SEQ ID NO:1)与pVAX1片段进行连接(如图1～3所示)，得重组质粒，保存于-15℃备用。
一种治疗和/或预防鸡疾病的制剂，所述制剂为含有30μg/mL上述重组质粒的无菌PBS溶液(即pVAX1-CpG制剂)。
所述无菌PBS溶液(1L)还含有以下重量百分比的各组分：1.0％NaCl，0.04％KCl，0.0164％Na2HPO4，0.034％KH2PO4，余量去离子水。
所述无菌PBS溶液的制备方法：将各组分按比例混合均匀后，采用湿热高压灭菌法在121℃下，灭菌25min。湿热高压灭菌法是本领域常用的灭菌方法，其操作可以参照现有技术进行。
预防：作为鸡免疫激活剂时，每只鸡经肌肉注射0.8mL/kg体重pVAX1-CpG制剂，首次免疫3天后加强免疫，方法与剂量与首次免疫相同。
治疗：作为鸡疫苗佐剂时，按每只鸡经肌肉注射0.8mL/kg体重CpG/疫苗(将相应的pVAX1-CpG制剂与一头份疫苗混匀)，首次免疫3天后加强免疫，方法与剂量与首次免疫相同。
对比例1
实验方法同实施例4，唯一不同的是，替换了所用的CpG-ODN的部份序列，对比ODN1序列如下：5’-TATGACGTTCAAG-3’。
对比例2
实验方法同实施例4，唯一不同的是，替换了所用的CpG-ODN的部份序列，对比ODN2序列如下：5’-TCCATGACGTTTTGACGTTTCCA-3’。
对比例3
实验方法同实施例4，唯一不同的是，替换了所用的CpG-ODN的部份序列，对比ODN3序列如下：5’-TCCATGTCGTTTTGTCGTTTCCA-3’。
实施例6动物实验
1、先天性免疫保护(预防疾病)动物实验
取健康的1日龄小鸡(来航蛋公鸡)进行分组，各组的饲养情况相同，以此为实验对象，分别采用本发明实施例2～5制备得到的重组质粒pVAX1-CpG制剂作为免疫刺激剂，以对比ODN1、2、3组作为ODN效果对照，肠毒性大肠杆菌作为病原菌。当用于预防时，7日龄进行首次免疫。对照组：每只鸡皮下注射生理盐水0.4mL；实验组：鸡皮下注射pVAX1-CpG制剂。三天后加强免疫，方法与剂量与首次免疫相同。第二次免疫后三天，给每头小鸡1010CFU肠毒性大肠杆菌的剂量口服攻毒。作为先天性免疫保护制剂(预防疾病)研究预防效果。实验结果如表4所示。
表4 pVAX1-CpG制剂的预防效果攻毒后的发病率
实验组 0a D/Tb 7D/T
PBS 21.5％±0.9％ 71％±2.4％
实施例2 22.5％±4.6％ 11.4％±0.6％
实施例3 2.3±0.7％ 0
实施例4 15％±3.3％ 7.2％±2.3％
实施例5 23％±6.5％ 0
对比例1 27.5％±3.4％ 92％±5.1％
对比例2 14％±4.6％ 93％±4.2％
对比例3 31％±2.1％ 95％±3.4％
注：a：分别表示攻毒后的第0，7天；b：腹泻数/总数。
2、获得性免疫保护(疫苗佐剂)动物实验
取健康的1日龄小鸡(来航蛋公鸡)进行分组，各组的饲养情况相同，以此为实验对象，分别采用本发明实施例2～5制备得到的重组质粒pVAX1-CpG制剂作为疫苗佐剂，以对比ODN1、2、3组作为ODN效果对照，现有的市售的上海海利生物药品有限公司的禽流感疫苗作为实验用疫苗，收取血清，-20摄氏度冰箱保存，作为获得性免疫保护制剂(疫苗佐剂)研究治疗效果。实验结果如表5所示。
表5 pVAX1-CpG+疫苗制剂的免疫第7天的特异抗体滴度值log2(x)值
实验组 IgG IgA
PBS 6.2±0.73 5.33±0.91
禽流感疫苗 15.4±3.2 12.5±7.25
实施例2 23.9±8.2 11.83±3.01
实施例3 21.6±2.03 14.33±2.12
实施例4 29.3±3.22 12.83±1.93
实施例5 27.8±4.34 10.23±3.54
对比例1 4.3±1.28 6.2±2.04
对比例2 5.2±1.62 4.4±1.64
对比例3 7.3±1.42 5.8±1.47
从表4、表5可知，本发明实施例2～5制备的pVAX1-CpG制剂，在预防方面效果比单一疫苗的效果要好。在治疗方面效果比单一疫苗的效果更好。因此，pVAX1-CpG制剂完全有希望代替或部份代替传统抗生素，作为一种新型、高效、安全的制剂应用到养殖动物――鸡的防病中。
实施例7毒性研究
本实施例选用7日龄balb/c小鼠，随机分为空白对照组和将本发明实施例2～5制备得到的pVAX1-CpG制剂组，每个动物注射免疫0.5mL，每组3个重复。对照组饲喂采用饲养试验、动物组织解剖及外观性能等各项指标等方法。试验时间为2个月，试验结束时检测小鼠的死亡率和组织病变情况。结果显示(表6)：pVAX1-CpG处理组和对照组的动物死亡率均为零，组织解剖未发现明显病变，处理组小鼠活泼好动，说明pVAX1-CpG对BALB/C小鼠安全无毒害。
表6 pVAX1-CpG制剂毒性研究
Figure GDA0004235400780000121
Figure GDA0004235400780000131
注：“-”表示无组织病变。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。
序列表
<110> 华南农业大学
<120> 一种鸡特异性免疫活化剂CpG-ODN及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 306
<212> DNA
<213> 人工合成序列(Synthetic sequence)
<400> 1
gaattctcgc gtgcgttttg tcgttttgac gttaagcttg tcgactcgcg tgcgttttgt 60
cgttttgacg tttcgcgtgc gttttgtcgt tttgacgttt cgcgtgcgtt ttgtcgtttt 120
gacgttctcg actcgcgtgc gttttgtcgt tttgacgttt cgcgtgcgtt ttgtcgtttt 180
gacgtttcgc gtgcgttttg tcgttttgac gttctcgact cgcgtgcgtt ttgtcgtttt 240
gacgtttcgc gtgcgttttg tcgttttgac gtttcgcgtg cgttttgtcg ttttgacgtt 300
ctcgag 306

Claims (8)

1.一种鸡特异性免疫活化剂CpG-ODN，其特征在于，所述CpG-ODN以CpG22基序为基准，所述CpG22基序的核苷酸序列为：5’-tcgcgtgcgttttgtcgttttg acgtt-3’，小写字母表示用硫代修饰；所述CpG-ODN的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.一种重组质粒，其特征在于，所述重组质粒为pVAX1-CpG，其含有权利要求1所述CpG-ODN。
3.权利要求1所述CpG-ODN或权利要求2所述重组质粒在制备治疗和/或预防由肠毒性大肠杆菌引起的鸡疾病的制剂中的应用。
4.一种治疗和/或预防鸡疾病的制剂，其特征在于，所述制剂为含有10～100μg/mL权利要求2所述重组质粒的PBS溶液；所述鸡疾病为由肠毒性大肠杆菌引起的疾病。
5.根据权利要求4所述制剂，其特征在于，所述PBS溶液还含有以下重量百分比的各组分：0.50～1.05％NaCl，0.01～0.045％KCl，0.0123～0.0165％Na2HPO4，0.014～0.035％KH2PO4，余量为去离子水。
6.根据权利要求5所述制剂，其特征在于，所述PBS溶液还含有以下重量百分比的各组分：0.6％NaCl，0.01％KCl，0.0124％Na2HPO4，0.014％KH2PO4，余量为去离子水。
7.根据权利要求4至6任一项所述制剂，其特征在于，当所述制剂作为鸡免疫激活剂时，其使用剂量为0.1～1.0mL/kg体重。
8.根据权利要求4至6任一项所述制剂，其特征在于，当所述制剂作为鸡免疫佐剂时，其使用剂量为0.2～1.0mL/kg体重。
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