CN109234280B - 一种梅花鹿特异性CpG寡聚脱氧核苷酸及其应用 - Google Patents

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Abstract

一种梅花鹿特异性CpG寡聚脱氧核苷酸及其应用，涉及鹿的免疫增强剂和鹿用疫苗佐剂领域。为了增强梅花鹿的免疫力、提高梅花鹿用疫苗的免疫效力以及提高鹿源牛病毒性腹泻/粘膜病灭活疫苗的抗体水平，本发明提出一种梅花鹿特异性CpG寡聚脱氧核苷酸，其序列如SEQ ID NO.3所示，用于制备梅花鹿免疫增强剂、制备梅花鹿用疫苗免疫佐剂、制备抗鹿源牛病毒性腹泻/粘膜病病毒制品、制备诱生细胞产生抗鹿源牛病毒性腹泻/粘膜病病毒物质、提高鹿源牛病毒性腹泻/粘膜病灭活疫苗抗体水平。通过试验证实本发明通过人工合成的梅花鹿特异性CpG寡聚脱氧核苷酸可用于梅花鹿外周血单个核细胞表现出抗病毒活性，同时对鹿源牛病毒性腹泻/粘膜病灭活疫苗的免疫具有增强作用。

Description

一种梅花鹿特异性CpG寡聚脱氧核苷酸及其应用
技术领域
本发明涉及鹿的免疫增强剂和鹿用疫苗佐剂技术领域，具体涉及一种梅花鹿特异性CpG寡聚脱氧核苷酸及其应用。
背景技术
CpG ODN是一类含有胞嘧啶-鸟嘌呤二核苷酸的寡聚脱氧核苷酸链，呈单链DNA形式，含有1个或多个非甲基化的CpG基序，由于具有良好的促进免疫应答的效果而常在临床研究中被用作佐剂。基于CpG ODN结构上的不同及其诱导的免疫反应性质的差异，在人体中已经鉴定出四类不同的CpG ODN，尽管每类CpG ODN都包含至少一个由中央未甲基化CG二核苷酸加上结合区域组成的基序，但它们在结构和免疫学活性方面却不尽相同：B型ODN通常在硫代磷酸酯骨架内包含有1到5个CpG基序，这种骨架增强了其对核酸酶消化的抵抗力，并且显著延长了体内半衰期(30-60分钟，而磷酸二酯为5-10分钟)，B型ODN具有诱导pDC分化的能力，在产生TNF-α的同时也刺激B细胞增殖和分泌IgM，是B细胞的强活化剂，但是在诱导IFN-α产生和激活NK细胞方面的能力较弱。与B型CpG ODN不同的是，A型CpG ODN可诱导高水平的IFN-α产生，并且引起明显的NK细胞活化。A型CpG ODN具有两侧被硫代磷酸酯末端核苷酸修饰的磷酸二酯核，因其两侧携带的单个CpG基序呈回文结构，所以能够形成茎环结构。B型CpG ODN与A型CpG ODN的活性不同很大程度上是因为二者的CpG/TLR9复合物在pDC核内体的保留时间不同，B型ODN可通过早期核内体快速转运至晚期核内体，但A型ODN却可在早期核内体中保留较长时间。A型ODN与MyD88/IRF-7复合物在早期核内体中相互作用，触发能够诱导干扰素(IFN)产生的信号级联反应。由于poly-G尾部之间的相互作用，A型ODN在溶液中更倾向于形成复杂的多聚体，但是A型ODN这一特性却成为其应用于临床试验的障碍，近年来为了解决这个问题，通常把A型ODN包装成稳定的病毒样颗粒(VLP)，以便它在临床研究中能充分发挥其佐剂作用；C型ODN在完全由硫代磷酸核苷酸组成方面与B型ODN类似，在含有可形成茎环结构或二聚体的回文CpG基序方面与A型ODN类似，这类ODN在刺激B细胞分泌IL-6的同时也刺激pDC产生IFN，由于在早期和晚期核内体中均有活性所以C型ODN可以表达B型和A型ODN所共有的特性。C型ODN具有中等免疫效应以及独特的结构特征，在体内具备良好的稳定性：由于含有双重回文序列所以C型CpG ODN在其富含GC的3'末端可以形成发夹结构，又由于存在5'回文序列而可以进行串联，这些高度有序的结构能够诱导任何类型的CpGODN产生I型IFN。
CpG ODN的免疫调节机制：Toll样受体(Toll-like receptors，TLRs)是免疫调节中一种非常重要的蛋白质分子，作为一种信号转导型抗原识别受体，既可以参与固有免疫，又可以识别适应性免疫和固有免疫之间的关系，为我们开发新型疫苗佐剂或免疫增强剂奠定基础。
TLR9是TLRs家族成员之一，主要识别细菌DNA的CpG基序。CpG寡聚脱氧核苷酸(CpGODN)是人工合成的含有非甲基化的CpG的ODN，能以TLR9依赖的方式刺激机体固有免疫应答，通常用于TLR9的研究。病毒和细菌基因组中的CpG-DNA是TLR9的天然激动剂，所以一旦细胞感染或摄取细菌，TLR9就会启动Th1型优势免疫应答。TLR9分子在不同物种之间存在差异，人体与小鼠中TLR9的结构相差24％；在细胞类型表达方面，物种之间也存在差异：例如，TLR9受体存在于啮齿动物中，但不存在于原始巨噬细胞和髓样树突细胞(mDC)中。在人体中，TLR9主要由浆细胞样CD(pDC)和B细胞表达，暴露于TLR9激动剂中的B淋巴细胞更容易被Ag激活以反映它们作为疫苗佐剂的效用，而TLR9刺激pDC产生I型干扰素，从而更有效地将Ag呈递给T细胞。
CpG ODN不仅能够刺激表达TLR9分子的细胞，引发免疫调节级联反应，最终产生Th1和促炎细胞因子和趋化因子，还能改善树突细胞、单核细胞和巨噬细胞的抗原呈递功能，诱导B细胞的增殖，刺激NK细胞的免疫保护活性，诱导机体内免疫应答反应更倾向于Th1型。CpG ODN对不同宿主免疫环境具有不同的作用是它们作为疫苗佐剂的价值基础，使其能在预防和治疗感染、过敏以及癌症等疾病中充分发挥其免疫作用。
CpG ODN作为免疫增强剂的作用如下：
CpG ODN在预防和治疗感染中的作用：疫苗(抗原)主要是通过诱导体液免疫以预防感染的。因此疫苗诱导机体产生抗体，并通过抗体中和作用或调理作用阻止病原体感染宿主细胞。
CpG ODN通过激活TLR9信号，可以与B细胞抗原受体信号协同促进初始B细胞、已诱发B细胞和记忆性B细胞的激活，并进一步分化为分泌抗体分子的浆细胞。一般来说，由于初始B细胞不具备表达TLR9的能力，所以其对于CpG ODN的激活作用并无响应，因此必须事先用抗原刺激初始B细胞以确保其被CpG ODN激活后可分化成浆细胞。
此外，IL-6是一种能够促进抗原特异性B细胞增殖及活化的细胞因子，由CpG ODN刺激的抗原特异性B细胞可分泌IL-6。
CpG ODN在预防和治疗过敏中的作用：在房尘螨和豚草诱发的变态反应中，pDCs捕获过敏原后会分泌IL-4和IL-5等Th2型细胞因子，这些细胞因子是通过诱导浆细胞产生过敏原特异性IgE而得到的。过敏原特异性IgE首先与肥大细胞上的IgE受体结合，然后当受体上的IgE与过敏原结合时，颗粒就会从肥大细胞中释放出来，从而引发流鼻涕和打喷嚏等过敏症状，持续暴露于过敏原会导致以肺嗜酸性粒细胞增多和气道阻塞为特征的肺部炎症。过敏免疫疗法是一种通过过敏原疫苗诱导Th1免疫并抑制Th2免疫的治疗性技术。
CpG ODN既可以刺激pDC和B细胞、又可以诱导Th0细胞向Th1细胞的分化，由Th1细胞分泌的IFN-γ在降低Th2偏向反应的同时也会抑制IgE的分泌。
CpG ODN在癌症免疫治疗中的作用：CpG ODN由于具有激活获得性免疫应答和先天性免疫应答的能力，所以可在肿瘤治疗方面发挥巨大潜力而作为高效的肿瘤治疗剂而存在，CpG ODN不仅能够促进Thl、促炎性细胞因子的产生以及APC的成熟和活化，还能增强多肽类肿瘤疫苗的免疫原性。它诱导的细胞因子微环境能促进辅助性T细胞应答，这些特性使其可在临床研究中用作抗肿瘤的免疫佐剂。CpG ODN可通过多种途径进入不同组织并且产生积聚效应从而在肿瘤组织中达到最高浓度，在MCF-7荷瘤动物模型中，低剂量的CpG ODN即可抑制肿瘤生长达40％，而作为免疫调节剂与抗肿瘤抗体药物赫赛汀联用，可抑制超过96％的肿瘤生长。由此可见，CpG ODN或许可作为一种独特的免疫调节剂应用于肺癌抗肿瘤治疗。一般来说，CpG ODN独立用于癌症治疗虽然是相对安全的，但其诱导的免疫应答的强度并不足以消除肿瘤，所以目前有许多评估CpG ODN与其他免疫佐剂组合的免疫效果的研究正在进行。
梅花鹿是珍贵的药用动物，具有极高的药用和滋补价值。然而现阶段梅花鹿产业存在一些突出的矛盾和问题严重制约和限制了该产业的发展。尤其是梅花鹿的主要传染病难以预防的问题。由于针对于鹿的主要传染病目前尚无有效的疫苗用于防控，尤其是人兽共患病结核和布鲁氏菌，不仅给养鹿业造成巨大的经济损失，而且严重影响梅花鹿的用药安全，威胁人类的健康。
梅花鹿病毒性腹泻/粘膜病：牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrheavirus，BVDV)是黄病毒科瘟病毒属的成员之一，与同属内的猪瘟病毒及羊边界病毒在血清学上存在着交叉反应。BVDV可引起牛、羊、猪和鹿等动物感染发病，临床表现为发热、黏膜溃疡、持续性感染，腹泻和生殖障碍等。鹿感染BVDV可造成母鹿流产，产死胎、弱胎、畸形胎，产下病毒血症仔鹿，使鹿发生顽固性腹泻和黏膜病，导致采食和营养吸收受阻，以至继发感染，严重影响幼鹿的发育和成鹿的生产性能，甚至使鹿大批死亡，给养鹿业造成严重的经济损失。在我国，对吉林省的松原、长春、伊通、双阳4个地区的228份样品进行了检测，表明幼鹿感染粘膜病病毒的感染率为60-86.7％，病毒性腹泻/黏膜病在梅花鹿群中呈蔓延扩散的趋势。
发明内容
为了增强梅花鹿的免疫力、提高梅花鹿用疫苗的免疫效力以及提高鹿源牛病毒性腹泻/粘膜病灭活疫苗的抗体水平，本发明提供一种梅花鹿特异性CpG寡聚脱氧核苷酸及其应用。
本发明为解决技术问题所采用的技术方案如下：
本发明的一种梅花鹿特异性CpG寡聚脱氧核苷酸，其序列如序列表中的SEQ IDNO.3所示。
本发明的一种梅花鹿特异性CpG寡聚脱氧核苷酸在制备梅花鹿免疫增强剂中的应用。
本发明的一种梅花鹿特异性CpG寡聚脱氧核苷酸在制备梅花鹿用疫苗免疫佐剂中的应用。
本发明的一种梅花鹿特异性CpG寡聚脱氧核苷酸在制备抗鹿源牛病毒性腹泻/粘膜病病毒制品中的应用。
本发明的一种梅花鹿特异性CpG寡聚脱氧核苷酸在制备诱生细胞产生抗鹿源牛病毒性腹泻/粘膜病病毒物质中的应用。
本发明的一种梅花鹿特异性CpG寡聚脱氧核苷酸在提高鹿源牛病毒性腹泻/粘膜病灭活疫苗抗体水平中的应用。
本发明还提供了一种含有上述梅花鹿特异性CpG寡聚脱氧核苷酸重复序列的质粒。
本发明的有益效果是：通过试验证实本发明通过人工合成的具有SEQ ID NO.3所示序列的梅花鹿特异性CpG寡聚脱氧核苷酸可用于梅花鹿外周血单个核细胞表现出抗病毒活性，同时对鹿源牛病毒性腹泻/粘膜病灭活疫苗的免疫具有增强作用，可将其制备成梅花鹿免疫增强剂和梅花鹿用疫苗免疫佐剂，并在预防梅花鹿疾病中推广应用。本发明的梅花鹿特异性CpG寡聚脱氧核苷酸不仅可以作为梅花鹿免疫增强剂增强梅花鹿的抗病能力，降低发病率，同时可作为梅花鹿用疫苗免疫佐剂，提高疫苗的免疫保护效果，可有效提高鹿源牛病毒性腹泻/粘膜病灭活疫苗的抗体水平，同时，本发明的梅花鹿特异性CpG寡聚脱氧核苷酸还能诱生细胞产生抗鹿源牛病毒性腹泻/粘膜病病毒物质，用于抵抗梅花鹿感染鹿源牛病毒性腹泻/粘膜病病毒。
附图说明
图1为实施例5中CpG-03对鹿源牛病毒性腹泻/粘膜病灭活疫苗的免疫增强作用结果。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步详细说明。在如下实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法，例如序列合成采用固相亚磷酰胺三脂法。在如下实施例中，所用试剂的来源、商品名和有必要列出其组成成分者，均只标明一次。在其后所用相同试剂如无特殊说明，不再赘述上述内容。
实施例1 CpG-ODN序列的设计、合成
采用固相亚磷酰胺三脂法，以对人、牛、羊、猪和鸡在内的多种畜禽的淋巴细胞增殖具有活化作用的CpG基序GTCGTT为核心，设计出多条CpG-ODN序列，涉及到CpG-ODN序列中序列的长度、骨架修饰、CpG基序列及基序的位置数量等。设计合成的CpG-ODN序列(SEQ IDNO.3)见表1，其中磷酸二酯键被全部硫代修饰。
表1 CpG-ODN序列
编号 名称 序列
SEQ ID NO.1 阳性序列(CpG-2006) TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT
SEQ ID NO.2 阴性序列 TGCTGCTTTTGTGCTTTTGTGCTT
SEQ ID NO.3 CpG-03 GGATGTCGTTGTGTCGTTGGTCGTCTT
实施例2梅花鹿外周血单个核细胞的分离
梅花鹿采取颈静脉采血的方式：可供采血的正常健康梅花鹿3只；各种动物外周血单个核细胞分离试剂盒，购自天津市灏洋生物制品科技有限责任公司；所分离外周血单个核细胞的培养使用的是含10％胎牛血清的IMDM营养液。
方法：
(1)将梅花鹿保定，颈部剪毛，用酒精棉球沿颈静脉来回擦拭消毒，使用一次性采血器，与皮肤成45度角由下方向上方刺入，使用一次性无菌肝素抗凝采血管收集血液，每只梅花鹿采血10ml，采血结束，拔下采血器，用碘酊棉球按压针孔片刻即结束。
(2)取50ml无菌离心管，将所采集梅花鹿血液混匀备用。
(3)取一支15ml离心管，分别加入3ml分离液，200g离心1min，用吸管小心吸取3ml抗凝血样本加于分离液液面上，400g离心20min。
(4)离心后用吸管小心吸取第二层环状乳白色单个核细胞层到另一个15ml离心管中，在离心管中加入10ml清洗液，混匀细胞。
(5)250g离心5min，弃上清，重复清洗1次。
(6)用吸管以5ml含10％胎牛血清的IMDM营养液重悬所得细胞，细胞计数后用于后续实验。
实施例3 CpG-ODN对梅花鹿外周血单个核细胞的刺激作用
将获得的梅花鹿外周血单个核细胞计数，用含10％胎牛血清的IMDM营养液进行稀释，使梅花鹿外周血单个核细胞的终浓度为5×106个/ml，将细胞接种于96孔细胞培养板，每孔0.1ml。向细胞培养孔内分别加入人工合成的CpG-ODN，终浓度为5～50μg/ml，每组设3个重复孔。置于37℃，5％CO2培养箱培养32小时，取出细胞培养板在每孔内加入20μl MTS溶液，继续置于37℃，5％CO2培养箱培养4小时。培养结束后将细胞培养板置于酶标仪上测定各孔490nm波长的OD值。设CpG-2006(编号SEQ ID NO.1)为阳性对照，不含CpG基序的阴性序列为阴性对照，PBS为空白对照，计算刺激指数(SI)。SI＝(OD样品-OD空白对照)/(OD阴性孔-OD空白对照)。各组OD值及刺激指数见表2。结果表明，CpG-03对梅花鹿外周血淋巴细胞具有较好的刺激活性，刺激指数高于CpG-2006，接近刀豆蛋白(ConA)。
表2 CpG ODN刺激梅花鹿外周血单个核细胞增殖OD值及刺激指数
Figure GDA0001904035880000071
实施例4梅花鹿特异性CpG-ODN对BVDV增殖抑制效果的测定
将获得的梅花鹿外周血单个核细胞用含10％胎牛血清的IMDM营养液稀释后接种于24孔细胞培养板，细胞接种密度为2×106个/ml，每孔接种1ml。向孔内分别加入CpG-03序列和CpG-2006序列，每个样品接5个重复孔，样品终浓度均为5-50μg/ml，同时设5个阴性对照孔。将细胞培养板置于37℃，5％CO2培养箱培养36小时，收集上清。
将生长状况良好的MDBK细胞接种于96孔细胞培养板，细胞接种密度为1.5×105个/ml，每孔0.1ml，细胞生长液为含8％胎牛血清的DMEM营养液。将细胞培养板置于37℃，5％CO2培养箱中培养32小时，细胞形成单层后备用。将鹿源牛病毒性腹泻/粘膜病病毒(BVDV)JL05株使用含2％胎牛血清的DMEM进行10倍系列稀释，稀释度分别为10-1、10-2和10-3，将各稀释倍数的病毒液接种于96孔细胞培养板，每个稀释度分别接种8个孔，每孔接种0.1ml，病毒接种后，将细胞培养板置于37℃，5％CO2培养箱吸附1.5h，弃上清液，使用无菌PBS清洗2遍后，每孔补加0.1ml含2％胎牛血清的DMEM营养液，并分别加入0.05ml CpG-03序列和CpG-2006序列刺激梅花鹿外周血单个核细胞后的培养上清，各样品组分别重复3次，同时设只加BVDV的阳性对照组和无BVDV的细胞对照组。将细胞培养板置于37℃，5％CO2培养箱培养96小时，每日观察细胞病变，统计各组细胞病变阳性孔数。比较CpG-ODN刺激梅花鹿外周血单个核细胞培养上清对BVDV在MDBK细胞增殖的影响。
本试验测得加入CpG-03培养上清组BVDV阳性孔数少于CpG-2006组和阳性对照组，结果见表3。结果表明，本发明的CpG-03可作用于梅花鹿外周血单个核细胞表现出抗病毒活性。
表3 CpG-ODN对BVDV增殖抑制效果的测定
Figure GDA0001904035880000081
实施例5不同剂量CpG-03序列对鹿源牛病毒性腹泻/粘膜病灭活疫苗的免疫增强作用
将鹿源BVDV JL05株接种到长满80％单层的MDBK细胞中，细胞维持液为含3％马血清的DMEM，继续培养60-84小时，当细胞病变达到80-90％时收获病毒液，-20℃保存备用。取收获的BVDV JL05株病毒液，加入BEI，终浓度为3mM，置于37℃，灭活18小时，经硫代硫酸钠中和后与ISA206佐剂混合、乳化制备鹿源牛病毒性腹泻/粘膜病灭活疫苗，每毫升疫苗的病毒含量为107.0TCID50。将制备的CpG-03与制备的鹿源牛病毒性腹泻/粘膜病灭活疫苗联合使用。试验分4组，每组5只梅花鹿，第一组至第二组每只梅花鹿接种疫苗2ml，同时联合使用CpG-03序列，各组使用剂量分别为100μg和200μg，第三组只接种2ml疫苗，第四组为不接种疫苗的对照组。疫苗免疫后14日进行二次免疫，免疫剂量及方法同首免，疫苗首次接种当日，接种后7日、14日、21日和28日分别采血，分离血清，测定血清中和抗体。结果表明，疫苗与CpG-03联合使用组免疫后14-28日中和抗体水平明显高于疫苗单独免疫组和对照组，说明CpG-03对鹿源牛病毒性腹泻/粘膜病灭活疫苗的免疫具有增强作用，如图1所示。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 吉林农业大学
<120> 一种梅花鹿特异性CpG寡聚脱氧核苷酸及其应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工(Primer sequence)
<400> 1
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工(Primer sequence)
<400> 2
tgctgctttt gtgcttttgt gctt 24
<210> 3
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工(Primer sequence)
<400> 3
ggatgtcgtt gtgtcgttgg tcgtctt 27

Claims (7)

1.一种梅花鹿特异性CpG寡聚脱氧核苷酸，其特征在于，其序列如序列表中的SEQ IDNO.3所示，其中磷酸二酯键被全部硫代修饰。
2.如权利要求1所述的一种梅花鹿特异性CpG寡聚脱氧核苷酸在制备梅花鹿免疫增强剂中的应用。
3.如权利要求1所述的一种梅花鹿特异性CpG寡聚脱氧核苷酸在制备梅花鹿用疫苗免疫佐剂中的应用。
4.如权利要求1所述的一种梅花鹿特异性CpG寡聚脱氧核苷酸在制备抗鹿源牛病毒性腹泻/粘膜病病毒制品中的应用。
5.如权利要求1所述的一种梅花鹿特异性CpG寡聚脱氧核苷酸在制备诱生细胞产生抗鹿源牛病毒性腹泻/粘膜病病毒物质中的应用。
6.如权利要求1所述的一种梅花鹿特异性CpG寡聚脱氧核苷酸在提高鹿源牛病毒性腹泻/粘膜病灭活疫苗抗体水平中的应用。
7.含有权利要求1所述的一种梅花鹿特异性CpG寡聚脱氧核苷酸重复序列的质粒。
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