CN104174017A

CN104174017A - 梅花鹿粘膜病同源灭活疫苗及其制备方法

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Publication number: CN104174017A
Application number: CN201410401027.1A
Authority: CN
Inventors: 丁壮; 董航; 丛彦龙; 尹仁福; 母连志; 张晓东; 周玉龙; 穆昱
Original assignee: Jilin University
Current assignee: Jilin University
Priority date: 2014-08-14
Filing date: 2014-08-14
Publication date: 2014-12-03

Abstract

本发明公开了一种梅花鹿粘膜病同源灭活疫苗及其制备方法。该梅花鹿粘膜病病同源灭活疫苗是将鹿源BVDV(牛病毒性腹泻/粘膜病病毒)接种培养至3～6代、稳定的、单层铺满的MDBK细胞的细胞瓶进行培养，挑选在培养72～144小时之间发生细胞病变(CPE)的细胞瓶，病变后反复冻融，收集病毒液，在病毒液中加入甲醛灭活，之后将灭活之后的病毒液与白油、司本组成的油剂相混合，并加入硬脂酸铝，得到梅花鹿粘膜病病同源灭活疫苗。

Description

梅花鹿粘膜病同源灭活疫苗及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种梅花鹿粘膜病同源灭活疫苗及其制备方法。

背景技术

梅花鹿粘膜病由牛病毒性腹泻/粘膜病病毒(BVDV)引起的一种以发热、粘膜糜烂溃疡、白细胞减少、腹泻、免疫耐受与持续感染、免疫抑制、先天性缺陷、咳嗽、怀孕母鹿流产、产死胎或畸形胎为主要特征的一种接触性传染病，严重影响养鹿业健康发展。当前制约梅花鹿产业快速发展的瓶颈问题一是针对梅花鹿粘膜病专用疫苗在我国尚属空白，大多数养鹿场处于无免疫状况。

灭活疫苗是指将病原生物及其代谢产物用物理或化学的方法使其失去毒力,但仍保留其免疫原性而制成。接种后能产生特异性免疫力。在机体内不能生长繁殖,相对安全稳定。

发明内容

本发明的目的是提供一种梅花鹿粘膜病病同源灭活疫苗及其制备方法。

本发明所提供的梅花鹿粘膜病病同源灭活疫苗，是将胎牛肾细胞(MDBK)接种牛病毒性腹泻/粘膜病毒(BVDV)毒株得到的病毒液灭活得到的。

本发明提供一种梅花鹿粘膜病病同源灭活疫苗油乳剂，由终浓度为0.01克/毫升的硬脂酸铝和下述体积份数的组分组成：

油相：注射用白油 94体积份司本 6体积份

水相：梅花鹿粘膜病病毒液 96体积份吐温-80 4体积份

所述梅花鹿粘膜病病同源灭活疫苗为上述的疫苗。

本发明所提供的梅花鹿粘膜病病同源灭活疫苗的制备方法，是将接种牛病毒性腹泻/粘膜病毒毒株的胎牛肾细胞培养增殖，进行电镜观察，挑选在培养72～144小时之间产生明显病变的细胞，收集病毒液，在病毒液中加入甲醛灭活，之后将灭火后的病毒液与油剂相混合，得到梅花鹿粘膜病同源灭活疫苗。

所述方法中，所述加入甲醛的终浓度为0.15％(体积百分比浓度)。

所述方法中，所述接种牛病毒性腹泻/粘膜病毒毒株为CC-CRB01。

所述方法中，所述胎牛肾细胞为第3～6代，所述培养增殖方法为细胞增殖病毒，所述培养的温度为37摄氏度。

本发明提供的梅花鹿粘膜病病同源灭活疫苗油乳剂的制备方法，包括下述步骤：

1)油相制备：取注射用白油94体积份，加司本-80 6体积份，混合后，加硬脂酸铝至浓度为0.02克/毫升，混匀灭菌；

2)水相制备：取吐温-804体积份，灭菌，加入权利要求5-8所述的方法获得的梅花鹿粘膜病同源灭活疫苗96体积份，振摇使吐温-80完全溶解；

3)乳化：取步骤1)获得的油相1与步骤2)获得的水相按照1︰1的体积份数比搅拌混匀，得到梅花鹿粘膜病同源灭活疫苗油乳剂。

本发明的梅花鹿粘膜病同源灭活疫苗可以直接对种鹿进行免疫，预防仔鹿的粘膜病。经过鹿场安全试验证实，此疫苗对种鹿是安全的，对产仔率、仔鹿成活率影响很小。该疫苗能使免疫鹿产生抵抗牛病毒性腹泻/粘膜病病毒的抗体效价水平。免疫母鹿产仔后代的成活率为78％～82％(用户观察统计)，其中的未成活数大都系自然淘汰数和非特异死亡数。本发明梅花鹿粘膜病病同源灭活疫苗油乳剂制备工艺获得的油包水型油乳剂灭活苗乳化程序简单、粘稠度适宜[用1毫升吸管(下口内径1.2毫米，上口内径2.7毫米)，吸取25摄氏度左右的疫苗1毫升，令其垂直自然流出，流出0.4毫升所需时间为6秒]。

具体实施方式

下面结合具体实例对本发明做详细说明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

实施例1、梅花鹿粘膜病同源灭活疫苗及其制备方法

为了安全地特异性地预防梅花鹿粘膜病这种病毒性传染病，研制了同源灭活疫苗。其制备方法如下所述：

一、梅花鹿粘膜病病毒液的制备

1、材料

梅花鹿源牛病毒性腹泻毒株CC-CRB01(吉林大学动物医学学院传染病实验室分离鉴定)2代基础毒种，病毒毒力为10^5.5TCID₅₀/0.1mL

CC-CRB01株病毒含量测定

将病毒样品作10倍倍比稀释，分别接种到已长满单层的MDBK细胞上，每稀释度重复4孔，同时将直接加入维持液的孔作为空白对照，37℃，5％CO₂培养1h后，加入维持液，100μl/孔；然后37℃，5％CO₂条件下培养。逐日观察记录细胞病变情况，144h后判定最终结果。按Reed-Muench法计算TCID₅₀。MDBK细胞：胎胎牛肾细胞，本实验室保存。

2、生产用毒种的制备和鉴定

1)细胞培养

细胞冻存管从液氮中迅速取出，立即放入42℃水浴中，边浸边摇动，使细胞冻存液尽快融化，75％酒精消毒后，打开冻存管盖，吸出细胞悬液，1000rpm×5min,吸弃冻存液，加入细胞培养液悬浮细胞，接入100ml培养瓶内，37℃，5％CO₂的CO₂培养箱中培养。当细胞基本长满单层后进行传代，方法是倾弃细胞旧液，用PBS液洗涤2－3次，加入0.25％的胰酶(以浸没细胞单层为佳)进行消化，待细胞将要分离而呈圆粒时，加入新鲜细胞培养液终止消化，用吸管反复吹打细胞，直至细胞完全分散，1000rpm×5min离心后吸弃上清，再加新鲜培养液，重新悬浮细胞，按一传二接入新的培养瓶中，置37℃，5％CO₂的CO₂培养箱中培养。

2)病毒增殖

取长满单层的细胞，倾弃旧液，用PBS液洗涤2－3次，接种病毒液(用维持液4倍稀释)，37℃，5％CO₂培养1h后,再加维持液，置37℃，5％CO₂继续培养。当有75％以上细胞出现致细胞病变(CPE)现象时，收获病毒。

3)毒种鉴定按基础毒种鉴定项目(《中华人民共和国兽用生物制品规程》2000年版：243～245页)进行，合格即为生产用毒种。

生产用毒种制备及检验结果见表1，从表1可见，制备的生产用毒种符合基础毒种的标准。

表1.生产用毒种制备及检验结果

生产用毒种代次	传1代	继2代	继3代
				接种的细胞孔数	160	240	320
病毒液量(毫升)	16	24	32
				细菌检验	无细菌生长	无细菌生长	无细菌生长
支原体检验	未检出	未检出	未检出
				外源病毒检验	未检出	未检出	未检出
毒力测定(logTCID₅₀/0.1毫升)	5.6	5.7	5.6

3、制苗用毒液繁殖与检验

1)接种

用维持液对步骤2获得的合格生产用毒种作4倍稀释，大量接种于单层铺满MDBK细胞的细胞瓶上，每个细胞瓶1ml。37℃，5％CO₂培养1h后,再加维持液，每个细胞瓶加入15ml维持液。置37℃，5％CO₂继续培养。

2)收获及保存

接种后细胞，每日电镜观察一次，当有75％以上细胞出现致细胞病变(CPE)现象时，然后以无菌条件收取病毒液，若干病毒液混为1组，置于灭菌瓶中。

3)制苗用毒液检验

无菌检验：按《中国华人民共和国兽药典(三部)》2010年版：附录42页进行。

支原体检验：按《中国华人民共和国兽药典(三部)》2010年版：附录49页进行。

外源病毒检验：按《中国华人民共和国兽药典(三部)》2010年版：附录40页进行。

病毒毒力(TCID₅₀)测定：按《中国华人民共和国兽药典(三部)》2010年版：附录7页测定。

制苗毒液的制备及检验结果如表2所示，从表2可见，生产用毒种接种MDBK细胞，制备制苗用病毒毒液1515毫升，检验结果，符合中间品检验的标准。

表2.制苗用毒液制备及检验结果

生产用毒种代次	继2代	继3代	继3代
				接种细胞瓶数(每瓶15ml病毒液)	30	40	40
72～144小时细胞病变(CPE)瓶数	28	37	36
				病毒液量(毫升)	420	555	540
无菌检验	无细菌生长	无细菌生长	无细菌生长
				支原体检验	未检出	未检出	未检出
外源病毒检验	未检出	未检出	未检出
				毒力测定(logTICD₅₀/0.1毫升)	5.4	5.5	5.5

4、鹿源牛病毒性腹泻/粘膜病病毒的灭活及灭活检验

灭活是灭活疫苗的关键的一步，如果灭火有问题就会有散毒的问危险，为养殖业带来巨大的危害。因此我们对梅花鹿粘膜病同源灭活疫苗甲醛灭活条件的优化进行研究。

将步骤3获得的接种后收集并检测合格的病毒液进行甲醛灭活浓度梯度、灭活时间优化实验。实验设置如表3所示，将收获的病毒液以4层纱布及一层细铜沙网滤过，终浓度如表3所示的量加入甲醛，密封，充分震荡混匀后，置于37摄氏度灭活，每2小时摇振1次。每12小时取出部分进行灭活检验。用灭菌生理盐水稀释灭活病毒液成相当200个TCID₅₀浓度,再以油乳剂混合均匀。其所述油乳剂以背景技术所述方法制备。

灭活检验：

灭活检验：取单层铺满的MDBK细胞的细胞瓶，分3组，每组10瓶，每组每个细胞瓶分别接种上述各组灭活处理得到的灭活病毒液2毫升，观察5日，细胞发生特异性病变(CPE)的细胞瓶数每组不应超过1个，经过无菌检验，支原体检验，外源病毒检验，判为灭活完全。

结果如表7所示，结果显示，CC-CRB01株制苗毒液，用终浓度为0.10％(体积百分比浓度)甲醛灭活36小时、终浓度为0.15％(体积百分比浓度)甲醛灭活24小时、终浓度为0.20％(体积百分比浓度)甲醛灭活24小时、终浓度为0.25％(体积百分比浓度)甲醛灭活12小时，细胞发生特异性病变(CPE)的细胞瓶数每组不应超过1个，经过无菌检验，支原体检验，外源病毒检验，判为灭活完全。考虑到灭活时间及甲醛残留问题，因此我们采用终浓度0.15％(体积百分比浓度)甲醛进行灭活。

表3.不同甲醛浓度和灭活时间对CC-CRB01株制苗毒液灭活的影响

按终浓度为0.15％(体积百分比浓度)的量在上述获得病毒液终加入40％(体积百分比浓度)甲醛溶液，37摄氏度，24小时，可完全灭活。制苗用毒液的灭活和灭活检验见表4。

表4.制苗用毒液灭活检验结果

生产用毒种代次	继2代	继3代	继3代
				制苗用毒液量(毫升)	420	555	540
40％甲醛加入量(毫升)	0.63	0.83	0.81
				灭活检验	灭活完全	灭活完全	灭活完全

5、梅花鹿粘膜病同源灭活疫苗批量生产及检验

灭活制苗用毒液制备及检验结果见表5

表5.制苗用毒液制备及检验结果

大批次制苗用毒液的灭活和灭活检验，均灭活完全。

二、灭活苗油乳剂的制备

1)油相制备：取注射用白油(购自北京石油化工科学院)94体积份，加司本-80(购自上海大众制药厂)6体积份，混合后，加硬脂酸铝(购自天津天大化工实验厂)使其浓度为0.02克/毫升，随加随搅拌至透明为止，121.3摄氏度高压灭菌30分钟备用。

2)水相制备：取吐温-80(购自上海大众制药厂)4体积份，装入带玻璃球的瓶中灭菌，冷却后加入灭活病毒液[步骤4制备]96体积份，充分振摇，使吐温-80完全溶解。

3)乳化：取上述制备的油相，放入乳剂缸内，开动电机慢速转动搅拌，同时徐徐加入上述制备的水相中，加完后以10000转/分钟搅拌5分钟，制成梅花鹿粘膜病同源灭活疫苗

4)分装：定量分装，加盖密封。

按照上述油乳剂灭活苗的具体配制见表6。

表6.梅花鹿粘膜病同源灭活疫苗配制

上述制备的各批次苗油乳剂灭活苗的进行如下所述检测：

观察物理性状：外观为乳白色乳剂。剂型为油包水型。

粘度检测：用1毫升吸管(下口内径1.2毫米，上口内径2.7毫米)，吸取25摄氏度左右的疫苗1毫升，令其垂直自然流出，结果表明上述各批次苗油乳剂灭活苗记录流出0.4毫升所需时间均为6秒以内。

安全检验：上述5批疫苗分别用5只易感母鹿，每只肌肉注射疫苗2毫升，观察14日，结果不出现由疫苗引起的任何局部和全身反应。

甲醛残留量测定：按《中国华人民共和国兽药典(三部)》2010年版：附录20页进行，符合《兽用生物制品通则的规定》。

稳定性：在2～8摄氏度保存1年，均不出现分层和破乳现象。

效力检验：

1)实验动物为健康的日本大耳白兔，购自长春市宏达医学实验动物养殖场。分为3组，每组取4只。每组4只中，每2只免疫相同批次的灭活疫苗。其中,第3组为对照组,加入生理盐水；第1组和第2组为灭活苗不同免疫次数组。第1组梅花鹿源BVDV灭活苗组(1mL)和第3组生理盐水对照组(1mL)分别于1d、14d、28d免疫3次；第2组梅花鹿源BVDV灭活苗组(1mL)只于1d免疫1次。上述3组所有试验兔分别于免疫后的1d、7d、14d、21d、28d、35d采集血液。

2)使用吉林大学动物医学学院传染病实验室已经建立的ELISA检测程序进行检测,方法如下:将BVDV可溶性全病毒抗原,用包被液稀释,每孔加入100μL,包被酶标板4℃过夜。弃去孔内液体,PBST(200μL/孔),每5min洗涤1次,洗涤2次。用含10％胎牛血清37℃封闭2h。每5min洗涤1次,洗涤2次。加入200倍稀释的待检兔血清100μL,37孵育1h。每5min洗涤1次,洗涤2次。加入5000倍稀释的山羊抗兔酶标二抗,37℃孵育1h。每5min洗涤1次,洗涤2次。加入底物37℃显色反应20min。加入2mol/LH2SO4,50μL/孔终止反应,测定OD490值。

3)梅花鹿源BVDV分离株灭活苗体液免疫检测结果见表7

表7.大耳白兔免疫效力试验结果

由表7可见,免疫1d时,第1组和第2组灭活苗免疫家兔血清抗体与生理盐水对照组无明显的差异(P>0105)；从免疫的第7d开始,第1组和第2组油灭活苗免疫家兔血清抗体显著高于生理盐水对照组。第1组和第2组油剂灭活苗均产生明显的抗体应答,然后抗体水平在逐渐上升。其中第一组抗体应答增长趋势更显著。免疫的第35d时,第1组和第2组油剂灭活苗的抗体水平达到了最高峰。可以说明本梅花鹿源BVDV分离株油剂灭活苗免疫家兔,产生了免疫应答。

实施例2、梅花鹿粘膜病同源灭活疫苗的效果检测

一、梅花鹿粘膜病同源灭活疫苗田间试验报告

在完成灭活苗的实验室试验后，用检验合格的四批实验室制品进行了田间试验，观察在生产条件下，疫苗的安全性和效力。

1、材料

疫苗：实施例1制备的批号00201、00202、00203、00301的梅花鹿粘膜病同源灭活疫苗。

免疫母鹿：选4个试验场点分别是：

免疫前临床检查观察表现，剔除病鹿。

2、田间效力试验

1)免疫接种：实施例1制备的批号00201、00202、00203、00301梅花鹿粘膜病同源灭活疫苗分别对上述4个试验场点的母鹿肌注1份(2毫升)(具体分组如表14所示)。

2)接种后观察：14天内每天观察动物的局部和全身反应，如局部红肿、麻痹症状。如有应查明原因，必要时病理剖检。

3)田间效力试验：从各试验场于免疫后14日和120日，分别随机从免疫鹿群中和非免疫鹿群中各抽检5份血清，检验免疫效力。

其中，免疫及非免疫母鹿血清抗体效价检测方法，即抗BVDV中和抗体效价检测如下：

取BVDV毒种，作10倍系列稀释，分装到两列无菌试管中，第一列加等量健康鹿血清(对照组)，第二列加等量待检血清(试验组)，混合后放置1小时，然后每组分别接种单层培养的MDBK细胞5瓶，每瓶2毫升(其中毒液1升)，置37摄氏度继续孵育，记录72～144小时细胞病变情况，按照Reed-Muench法计算其半数致死量(TCID₅₀)，求得中和指数。测抗BVDV中和指数中和指数应≥10^1.8。

中和指数＝试验组TCID₅₀/对照组TCID

免疫母鹿田间效力试验结果如表8所示。

表8.田间效力试验结果

注：对照组检查结果未列入表中。

从表8可见，4个试验场免疫种鹿，免后14天和120天，随机采血测抗体效价，均高于最低抗体保护效价。说明灭活苗对生产条件下种鹅的免疫效果是确实的。

田间安全试验结果如表9所示，从表9可见，1份灭活苗免疫生产条件下的种鹿，从临诊症状、局部表现、14天抽样剖检，均证明是安全的。产仔率及成活率，都在正常范围之内。因此，苗对种鹿是安全的。

表9.田间安全试验结果

上述田间安全试验证实，灭活对种鹿是安全的，对产仔率、仔鹿成活率影响甚微。

田间效力试验结果表明苗能使免疫鹿产生抵抗BVDV病毒的抗体效价水平。免疫母鹅产蛋孵化后代的成活率为78％～82％(用户观察统计)，其中的未成活数大都系自然淘汰数和非特异死亡数。田间试验证明此疫苗安全有效的灭活苗，可进行中间试制和区域试验。

二、梅花鹿粘膜病同源灭活疫苗中间试制报告

梅花鹿粘膜病同源灭活疫苗在田间试验完成后，由吉林省五星动物保健药厂生物制品车间中间试制。中间试制的五批产品，用以进行区域试验。并确定苗实验室生产工艺可否适用工厂化生产。

生产用毒种制备方法和检验方法同实施例1，生产用毒种制备及检验结果如表10所示，从表10可见两种毒种均继3代，经鉴定，均符合基础毒种的标准，可做为生产用毒种使用，用以制备制苗用毒液。

表10.生产用毒种制备及检验结果表

制苗用毒液的繁殖及检验方法同实施例1，制苗用毒液的繁殖及检验结果如表11所示，从表11可见，用繁殖的3代生产用毒种制备的制苗毒液，符合中间品检验标准。共繁殖制苗用毒液：BVDVCC-CRB01株42000毫升。

表11.制苗用毒液的繁殖及检验

制苗用毒液的灭活和灭活检验如实施例1所示，制苗用毒液的灭活和灭活检验结果见表12，从表12可见，按病毒液量的0.15％加入40％的甲醛溶液，37摄氏度24小时均可完全灭活两种病毒液。

表12.制苗用毒液的灭活和灭活检验

油乳剂灭活苗的制备同实施例1，具体配制如表13，从表13可见，将制苗灭活毒液按照实验室配制油乳剂灭活疫苗的工艺，配制了五批灭活苗，每份2毫升，共3.8万只份。

表13.梅花鹿粘膜病同源灭活疫苗的配制

三、灭活疫苗效力和安全性检验结果

按照实施例1和实施例2的步骤一的方法对上述五批灭活苗进行表14～表18中各项目检测，均由中间试制单位—吉林省五星动物保健药厂质检室进行检验，结果详见“检验报告单”(表14～表18)。五批产品均检验合格，可用于扩大的区域试验。五批灭活苗的中间试制，证明灭活苗的生产工艺可行，适合于工厂化生产，生产的五批灭活苗均符合试行规程的质量标准。

表14.00301车间成品检验报告单01

表15.00302批车间成品检验报告单

表16.00303车间成品检验报告单

表17.车间成品检验报告单

表18.车间成品检验报告单

Claims

1.梅花鹿粘膜病同源灭活疫苗，所述的梅花鹿粘膜病同源灭活疫苗的其中的病毒液，是将MDBK(牛肾)细胞接种鹿源BVDV(牛病毒性腹泻/粘膜病病毒)，收获病毒液灭活得到的。

2.根据1所述，梅花鹿粘膜病病同源灭活疫苗油乳剂，是由终浓度为0.01克/毫升的硬脂酸铝和下述体积份数比的组分组成：

所述梅花鹿粘膜病病同源灭活疫苗为权利1要求中所述的疫苗。

3.梅花鹿粘膜病病同源灭活疫苗的制备方法，是将接种鹿源BVDV(牛病毒性腹泻/粘膜病病毒)，挑选在培养72～144小时之间发生细胞病变(CPE)的细胞，收集细胞液，在病毒液中加入甲醛灭活得到梅花鹿粘膜病病同源灭活疫苗。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述加入甲醛的终浓度为0.15％(体积百分比浓度)。

5.根据权利要求3中所述的方法，其特征在于：所述胎牛肾细胞为第3～6代，所述培养增殖方法为细胞增殖病毒，所述培养的温度为37摄氏度。

6.权利要求2所述梅花鹿粘膜病病同源灭活疫苗油乳剂的制备方法，包括下述步骤：

1)油相制备：取注射用白油94体积份，加司本-806体积份，混合后，加硬脂酸铝至浓度为0.02克/毫升，混匀灭菌；

2)水相制备：取吐温-804体积份，灭菌，加入权利要求5～8所述的方法获得的梅花鹿粘膜病病同源灭活疫苗96体积份，振摇使吐温-80完全溶解；

3)乳化：取步骤1)获得的油相与步骤2)获得的水相按照1︰1的体积份数比搅拌混匀，得到梅花鹿粘膜病病同源灭活疫苗油乳剂。