CN107670032A - 家禽油乳剂灭活疫苗佐剂及其相应疫苗的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种家禽油乳剂灭活疫苗佐剂及其相应疫苗的制备方法。本发明经过特定的筛选及组合，能较好的发挥其功能，使各组分之间取长补短，所制备获得家禽油乳剂灭活疫苗佐剂，能非特异性与特异性增强疫苗免疫效果、促进灭活疫苗吸收、减缓抗体衰减，新型家禽油乳剂灭活疫苗佐剂的制备方法简单易行，成本低廉，性能稳定，安全、高效，适用性广，便于大量生产和推广，克服了传统疫苗佐剂吸收不良、抗体效价偏低和免疫效果不佳的缺点。

Description

家禽油乳剂灭活疫苗佐剂及其相应疫苗的制备方法
技术领域
本发明涉及家禽医药技术领域，尤其是一种家禽油乳剂灭活疫苗佐剂及其相应疫苗的制备方法。
背景技术
随着现代养殖业规模的扩大，由各种畜禽细菌、病毒、寄生虫等引起的传染性疾病愈发严重，成为了制约养殖业发展的重要因素。如何提高动物的抗病能力、增强疫苗的免疫效果成为当下研究的热点课题。
免疫增强剂(Immunoenhancement)作为一种疫苗佐剂，常与各种疫苗配合使用，可促进机体对抗原的特异性免疫应答，增强疫苗的免疫效果。目前常用的免疫增强剂有以下几种：1.免疫刺激复合物(Immune stimulating complexs，ISCOMs)：典型的免疫刺激复合物是由皂苷、胆固醇、卵磷脂、可溶性蛋白抗原等构成的球形笼状颗粒，此复合物不影响疫苗活力，能够显著增强疫苗效果；2.脂质体：脂质体(Liposome)是由磷酸类脂、胆固醇、硬脂胺等类脂质组成的单层或多层双分子层结构，内含水相空间可包裹多种疫苗，作为载体可有效地将其引入细胞内，增强机体对抗原的免疫应答，提高巨噬细胞吞噬功能及抗原递呈作用，并可同时诱导体液免疫和细胞免疫；3.细胞因子类：如淋巴因子、单核因子、IL-1、IL-2、IL-4、IL-6等。这类生物活性物质主要刺激T细胞、B细胞分化和发育，快速诱导抗原在淋巴母细胞表面上的表达；4.胞嘧啶-鸟嘌呤寡脱氧核苷酸(Cytosine phosphate guanidineoligodeoxynucleotide，CpG ODN)：一类以非甲基化的胞嘧啶核苷酸和鸟嘌呤核苷酸为核心的特定核苷酸序列，可诱发机体产生多种免疫学效应，促进其分泌多种细胞因子，提高机体的特异及非特异性免疫反应能力；5.天然类：蜂胶、中草药等。如中草药田基黄，对正常组织细胞无毒副作用，并有增强免疫功能的作用，实验证明田基黄能作用于机体的免疫器官和免疫细胞，能促进T淋巴细胞的分化与成熟，从而增强机体的特异性细胞免疫和免疫调节作用，并能提高机体对细菌及病毒的抗感染能力；6.微量因子类：如硒、维生素A、维生素D、维生素E、维生素B1、维生素B2等，它们在物质代谢和免疫调节中起重要作用。
随着集约化和标准化养殖模式的不断普及，家禽往往处于一种亚健康状态，这一普遍现象给现有疫苗生产工艺技术带来了新的挑战。伴随着国内外抗原生产技术的不断发展，各种多价苗、多联苗、亚单位疫苗、DNA重组疫苗及合成肽疫苗等新型疫苗大量出现，虽使疫苗的抗原种类得到了丰富、安全性得到了提高，但其免疫原性还有待加强，因此急需开发更为高效、低毒的免疫增强佐剂以提高疫苗的免疫效果。
发明内容
本发明的目的是：提供一种家禽油乳剂灭活疫苗佐剂其制备方法与应用，它能非特异性与特异性增强疫苗免疫效果、促进灭活疫苗吸收、减缓抗体衰减的新型家禽油乳剂灭活疫苗佐剂，且制备方法简单。
本发明是这样实现的：家禽油乳剂灭活疫苗佐剂，用于配制1mL灭活疫苗的佐剂中含有天蚕素83μg、肽聚糖50μg、维生素A 267IU、维生素E 200IU及油乳佐剂0.66mL。
采用上述家禽油乳剂灭活疫苗佐剂及其疫苗的制备方法，包括如下步骤：
1)水相佐剂浓缩液制备：取PBS缓冲液，121℃灭菌30min，PBS缓冲液冷却至室温后，加入天蚕素和肽聚糖，使其溶解或均匀分布于PBS缓冲液中，配制得到天蚕素浓度为25000μg/mL和肽聚糖浓度为15000μg/mL的水相佐剂浓缩液，4℃保存备用；
2)改良水相配制：将浓缩灭活后的鸡胚培养病毒液配制为抗原液，按体积份数计算，取抗原液95份，加入灭菌的吐温-80 4份，充分搅拌，直到吐温-80完全溶解，加入1份水相佐剂浓缩液，混合后获得改良水相备用；
3)油相佐剂浓缩液制备：取注射用白油，加入油相罐中，121℃灭菌30min，冷却至室温，加入维生素A和维生素E溶解于灭菌注射用白油中，配制得到维生素A浓度为40000IU/mL和维生素E浓度为30000IU/mL的油相佐剂浓缩液，4℃保存备用；
4)改良油相制备：按体积份数计算，取注射用白油92份，加硬脂酸铝1份，边加边搅拌，直到完全透明为止，再加入司本-80 6份，混合后，116℃高压灭菌40min，加入1份油相佐剂浓缩液，混合后获得改良油相备用；
5)乳化：按体积份数计算，取改良油相2份放入乳化罐内，在30～50rpm下慢速搅拌同时缓缓加入1份改良水相，再在2500～3500rpm下中速混合，然后在9000～12000下rpm高速乳化，乳化完成后获得疫苗。
步骤1)中所述的肽聚糖，是按照包括如下步骤制备获得的：
A)细菌培养
将乳酸杆菌菌种接种于MRS液体培养基中，37℃培养48h，采用冰浴，在10min内降温至2～8℃；然后在4℃条件下2000r/min离心10min收集细菌；并在4℃条件下用质量百分比为0.9％生理盐水反复洗涤细菌至白色，收集细菌，将收集的细菌在沸水中加热20min，在4℃保存备用；
B)肽聚糖提取
1)超声破碎：将菌体悬浮于蒸馏水中，超声物理破碎3次，每次20min，获得超声破碎液；
2)粗细胞壁的分离：将超声破碎液在1000r/min离心15min，收集上清去除未破碎的菌体，再上清液在10000r/min离心20min，弃上清收集粗细胞壁；
3)SDS处理：将步骤2)差速离心分离得到的粗细胞壁，加10g/dL SDS，沸水浴10min，在10000r/min离心20min，沉淀物用蒸馏水洗涤4次，再用无水乙醇脱水，获得洗净后粗细胞壁；
4)胰蛋白酶处理：将洗净后粗细胞壁溶于0.1g/dL Trypsin 0.1mol/L Tris缓冲液中，pH值为7.5，37℃水浴振荡，以OD620基本不再下降为准；10000r/min离心20min，沉淀物用蒸馏水洗涤4次，获得酶处理粗细胞壁，无水乙醇脱水，获得酶处理沉淀物；
5)三氯乙酸处理：将酶处理沉淀物悬浮在10g/dL TCA溶液中，沸水浴20min冷却，去除共价结合的磷壁酸；10000r/min离心20min，蒸馏水洗3次，无水乙醇脱水，70℃干燥后，获得肽聚糖，将其在4℃保存备用。
天蚕素(Cecropins)是第一个被发现的动物抗菌肽，其分量小，分子内无二硫键和α-螺旋结构，具有抗细菌、真菌、病毒、肿瘤和寄生虫等多种活性。此外在动物日粮中添加天蚕素还能提高动物的生长性能，改善饲料转化率，控制炎性反应，减少应激，促进免疫器官发育，提高免疫器官指数，提高抗病力，增强动物免疫力。肽聚糖(Peptidoglycan)是细菌等原核生物细胞壁的特有多层网状大分子结构，是复合糖化物中的一类物质，同时也是免疫增强剂中的重要成员之一，它能通过诱导机体内各种非特异或特异性免疫因子的表达或分泌来发挥其免疫功能。除此之外，肽聚糖中的多糖成分还具有抗肿瘤、抗感染作用。维生素A又名视黄醇(Retinol)，它能促进抗原递呈细胞的抗原递呈作用，促进T、B淋巴细胞的增殖、分化和成熟，调控T淋巴细胞参与的细胞的凋亡。缺乏维生素A会降低中性粒细胞的吞噬功能，影响单核巨噬细胞和NK细胞的活性。维生素E又名生育酚(Tocopherol)，是一种优秀的抗氧化剂，它能增强机体免疫水平，提高血液中免疫球蛋白含量，增强机体对疫苗或其它抗原产生抗体的能力，而缺乏维生素E则与体液免疫抑制状态有关。
由于采用了以上技术方案，本发明经过特定的筛选及组合，能较好的发挥其功能，使各组分之间取长补短，所制备获得家禽油乳剂灭活疫苗佐剂，能非特异性与特异性增强疫苗免疫效果、促进灭活疫苗吸收、减缓抗体衰减。新型家禽油乳剂灭活疫苗佐剂的制备方法简单易行，成本低廉，性能稳定，安全、高效，适用性广，便于大量生产和推广，克服了传统疫苗佐剂吸收不良、抗体效价偏低和免疫效果不佳的缺点。
附图说明
图1是NDV HI抗体效价动态监测对比结果图；
图2是γ干扰素动态检测对比结果图；
图3是白细胞介素4动态检测对比结果图；
图4是白细胞介素10动态检测对比结果图；
图5是T淋巴细胞亚群(CD3，CD4，CD8)动态检测结果图；
图6是SPF鸡体重的动态测量对比结果图；
图7是疫苗吸收的对比结果图；
图8是新支流三联灭活疫苗NDV HI抗体的影响对比结果图；
图9是新支流三联灭活疫苗IBV HI抗体的影响对比结果图；
图10是新支流三联灭活疫苗AIV H9抗体的影响对比结果图。
具体实施方式
本发明的实施例：家禽油乳剂灭活疫苗佐剂，用于配制1mL灭活疫苗的佐剂中含有天蚕素83μg、肽聚糖50μg、维生素A 267IU、维生素E 200IU及油乳佐剂0.66mL。
家禽油乳剂灭活疫苗佐剂及其疫苗的制备方法，包括如下步骤：
1)水相佐剂浓缩液制备：取PBS缓冲液，121℃灭菌30min，PBS缓冲液冷却至室温后，加入天蚕素和肽聚糖，使其溶解或均匀分布于PBS缓冲液中，配制得到天蚕素浓度为25000μg/mL和肽聚糖浓度为15000μg/mL的水相佐剂浓缩液，4℃保存备用；
2)改良水相配制：按照规程或农业部公告里的质量标准将浓缩灭活后的鸡胚培养病毒液配制为抗原液，按体积份数计算，取抗原液95份，加入灭菌的吐温-80 4份，充分搅拌，直到吐温-80完全溶解，加入1份水相佐剂浓缩液，混合后获得改良水相备用；
3)油相佐剂浓缩液制备：取注射用白油，加入油相罐中，121℃灭菌30min，冷却至室温，加入维生素A和维生素E溶解于灭菌注射用白油中，配制得到维生素A浓度为40000IU/mL和维生素E浓度为30000IU/mL的油相佐剂浓缩液，4℃保存备用；
4)改良油相制备：按体积份数计算，取注射用白油92份，加硬脂酸铝1份，边加边搅拌，直到完全透明为止，再加入司本-80 6份，混合后，116℃高压灭菌40min，加入1份油相佐剂浓缩液，混合后获得改良油相备用；
5)乳化：按体积份数计算，取改良油相2份放入乳化罐内，在30～50rpm下慢速搅拌同时缓缓加入1份改良水相，再在2500～3500rpm下中速混合，然后在9000～12000下rpm高速乳化，乳化完成后获得疫苗。取制备的疫苗10mL加入离心管中，以3000r/min离心15分钟，应不出现分层。
步骤1)中所述的肽聚糖，是按照包括如下步骤制备获得的：
A)细菌培养
将乳酸杆菌菌种接种于MRS液体培养基中，37℃培养48h，立即冰浴10min，使其降温至2～8℃；在4℃条件下2000r/min离心10min收集细菌；并在4℃条件下用质量百分比为0.9％生理盐水反复洗涤细菌至白色，收集细菌，将收集的细菌在沸水中加热20min，在4℃保存备用；
B)肽聚糖提取
1)超声破碎：将菌体悬浮于蒸馏水中，超声物理破碎3次，每次20min，获得超声破碎液；
2)粗细胞壁的分离：将超声破碎液在1000r/min离心15min，收集上清去除未破碎的菌体，再上清液在10000r/min离心20min，弃上清收集粗细胞壁；
3)SDS处理：将步骤2)差速离心分离得到的粗细胞壁，加10g/dL SDS，沸水浴10min，在10000r/min离心20min，沉淀物用蒸馏水洗涤4次，再用无水乙醇脱水，获得洗净后粗细胞壁；
4)胰蛋白酶处理：将洗净后粗细胞壁溶于0.1g/dL Trypsin 0.1mol/L Tris缓冲液中，pH值为7.5，37℃水浴振荡20h，以OD620基本不再下降为准；10000r/min离心20min，沉淀物用蒸馏水洗涤4次，获得酶处理粗细胞壁，无水乙醇脱水，获得酶处理沉淀物；
5)三氯乙酸处理：将酶处理沉淀物悬浮在10g/dL TCA溶液中，沸水浴20min冷却，去除共价结合的磷壁酸；10000r/min离心20min，蒸馏水洗3次，无水乙醇脱水，70℃干燥后，获得肽聚糖，将其在4℃保存备用。
实施例2：含免疫增强剂的家禽新城疫油乳剂灭活疫苗对鸡血清抗体维持及相关免疫参数影响的研究
一、实验材料
1.试验动物：SPF种蛋购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司，孵化后置贵州福斯特生物科技有限公司动物房负压隔离区进行饲养。
2.疫苗：鸡新城疫灭活疫苗(La Sota株)由贵州福斯特生物科技有限公司生产。
3.佐剂成分：所用天蚕素(购自中农颖泰林州生物科园有限公司)；维生素A、维生素E(购自新昌国邦进出口有限公司)；肽聚糖(公司自制)。
二、实验方法
1.佐剂溶液配制
按实施例1所述方法制备得到含佐剂的家禽油乳剂灭活疫苗。
2.分组情况
选取体重基本一致的SPF雏鸡120羽，随机分为2组，每组60羽于负压隔离区中分别饲养，于7日龄通过肌肉注射接种疫苗，一组接种0.3mL鸡新城疫灭活疫苗，另一组接种0.3mL含免疫增强剂的鸡新城疫灭活疫苗。
3.抗体检测
3.1血清制备
每组每次随机取5羽试验鸡，每周心脏或翅下静脉取血一次，3500rpm离心，转移上层透明血清(至少需要200μL)，-20℃低温保存待测。
3.2血清抗体检测
参照现行《中华人民共和国兽药典》红细胞凝集抑制试验法进行检测：测定血清中鸡新城疫抗体效价。
4.T淋巴细胞亚群检测
参照T淋巴细胞亚群(CD3，CD4，CD8)ELISA检测试剂盒说明书进行测定。
5.细胞因子检测
将每周采集到的鸡血清进行相关细胞因子的检测，参照鸡血清IFN-γ细胞因子ELISA检测试剂盒说明书、鸡血清IL-4细胞因子ELISA检测试剂盒说明书和鸡血清IL-10细胞因子ELISA检测试剂盒说明书进行。
三、实验结果
1.1NDV HI抗体效价动态监测结果
由图1可知，免疫增强剂在疫苗免疫初期能较早的促进特异性保护抗体产生，并维持较高的抗体滴度，两次对比试验的曲线趋势基本一致。
1.2γ干扰素动态检测结果
由图2可知，在鸡的外周血γ干扰素含量这一指标中，含免疫增强剂组的动态含量除第3周外，均高于普通疫苗组相应点的检测含量，两次对比试验的曲线趋势基本一致。
1.3白细胞介素4动态检测结果
由图3可知，在鸡的外周血白细胞介素4含量这一指标中，免疫增强剂组的IL-4动态含量高于对应普通疫苗组相应点的检测含量，两次对比试验的曲线趋势基本一致。
1.4白细胞介素10动态检测结果
由图4可知，在鸡的外周血的白细胞介素10含量这一指标中，含免疫增强剂组的IL-10动态含量除第5周外，均高于普通疫苗组相应点的检测含量，两次对比试验的曲线趋势基本一致。
1.5T淋巴细胞亚群(CD3，CD4，CD8)动态检测结果
由图5可知，在鸡的外周血的T淋巴细胞亚群含量这一指标中，含免疫增强剂组的动态含量除第3周外，均高于普通疫苗组相应点的检测含量，两次对比试验的曲线趋势基本一致。
1.6免疫增强剂对疫苗吸收的对比结果
由图6可知，添加免疫增强剂组自第2周开始出现明显吸收，普通疫苗组在第3周开始出现明显吸收，含免疫增强剂组疫苗吸收情况明显优于普通疫苗组。
由图7可知，添加免疫增强剂可促进疫苗的明显吸收，剖检观察未发现接种部位疫苗残留情况，而普通疫苗组剖检观察发现肌肉中存在疫苗残留。
实施例3：含免疫增强剂的家禽油乳剂灭活疫苗应用
本发明所述的疫苗佐剂在家禽油乳剂灭活疫苗中的应用，其特征在于所述的改良水相(含新城疫病毒、传染性支气管炎病毒、H9亚型禽流感病毒抗原)和改良油相按体积比为1:2混合后即为含佐剂的家禽油乳剂灭活疫苗，提高疫苗的免疫效果。
一、实验材料
1.试验动物：SPF种蛋购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司，孵化后置贵州福斯特生物科技有限公司动物房负压隔离区进行饲养。
2.疫苗：鸡新城疫、传染性支气管炎、禽流感(H9亚型)三联灭活疫苗(La Sota株+M41株+NJ02株)由贵州福斯特生物科技有限公司生产；按实施例1所述方法制备得到含免疫增强佐剂的家禽新支流三联油乳剂灭活疫苗由贵州福斯特生物科技有限公司生产。
3.佐剂成分：同实施例2。
二、实验方法
1.分组情况
选取体重基本一致的SPF雏鸡450羽，随机分为3组，每组150羽于负压隔离区中分别饲养，于7日龄通过颈部皮下注射接种疫苗，第一组接种0.3mL普通鸡新支流三联灭活疫苗，第二组组接种0.3mL含免疫增强剂的鸡新支流三联灭活疫苗，第三组接种0.3mL磷酸盐缓冲液。
2.抗体检测
2.1血清制备
每组每次随机取5羽试验鸡，每周心脏或翅下静脉取血一次，3500rpm离心，转移上层透明血清(至少需要200μL)，-20℃低温保存待测。
2.2血清抗体检测
参照现行《中华人民共和国兽药典》红细胞凝集抑制试验法进行检测：测定血清中鸡新城疫、传染性支气管炎、H9亚型禽流感抗体效价。
三、实验结果
3.1免疫增强剂对新支流三联灭活疫苗NDV HI抗体的影响
由图8可知，同一时期含免疫增强剂的新支流三联灭活疫苗相对于普通新支流三联灭活疫苗来说具有更高的NDV HI抗体水平，免疫增强剂能够促进鸡只较早的产生NDV抗体，并能够减缓NDV抗体的衰减。
3.2免疫增强剂对新支流三联灭活疫苗IBV HI抗体的影响
由图9可知，同一时期含免疫增强剂的新支流三联灭活疫苗相对于普通新支流三联灭活疫苗来说具有更高的IBV HI抗体水平，免疫增强剂能够促进鸡只较早的产生IBV抗体，并能够减缓IBV抗体的衰减。
3.3免疫增强剂对新支流三联灭活疫苗AIV H9亚型HI抗体的影响
由图10可知，同一时期含免疫增强剂的新支流三联灭活疫苗相对于普通新支流三联灭活疫苗来说具有更高的AIV H9亚型HI抗体水平，免疫增强剂能够促进鸡只较早的产生AIV H9亚型抗体，并能够减缓AIV H9亚型抗体的衰减。
本发明所述并不限于具体实施方式中所述的实施例，本领域技术人员根据本发明的技术方案得出其他的实施方式，同样属于本发明的技术创新范围。显然本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术范围内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims (3)

1.一种家禽油乳剂灭活疫苗佐剂，其特征在于：用于配制1mL灭活疫苗的佐剂中含有天蚕素83μg、肽聚糖50μg、维生素A 267 IU、维生素E 200 IU及油乳佐剂0.66mL。
2.一种采用权利要求1所述的家禽油乳剂灭活疫苗佐剂的疫苗制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)水相佐剂浓缩液制备：取PBS缓冲液，121℃灭菌30min，PBS缓冲液冷却至室温后，加入天蚕素和肽聚糖，使其溶解或均匀分布于PBS缓冲液中，配制得到天蚕素浓度为25000μg/mL和肽聚糖浓度为15000μg/mL的水相佐剂浓缩液，4℃保存备用；
2)改良水相配制：将浓缩灭活后的鸡胚培养病毒液配制为抗原液，按体积份数计算，取抗原液95份，加入灭菌的吐温-80 4份，充分搅拌，直到吐温-80完全溶解，加入1份水相佐剂浓缩液，混合后获得改良水相备用；
3)油相佐剂浓缩液制备：取注射用白油，加入油相罐中，121℃灭菌30min，冷却至室温，加入维生素A和维生素E溶解于灭菌注射用白油中，配制得到维生素A浓度为40000IU/mL和维生素E浓度为30000IU/mL的油相佐剂浓缩液，4℃保存备用；
4)改良油相制备：按体积份数计算，取注射用白油92份，加硬脂酸铝1份，边加边搅拌，直到完全透明为止，再加入司本-80 6份，混合后，116℃高压灭菌40min，加入1份油相佐剂浓缩液，混合后获得改良油相备用；
5)乳化：按体积份数计算，取改良油相2份放入乳化罐内，在30～50rpm下慢速搅拌同时缓缓加入1份改良水相，再在2500～3500rpm下中速混合，然后在9000～12000下rpm高速乳化，乳化完成后获得疫苗。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤1)中所述的肽聚糖，是按照包括如下步骤制备获得的：
A)细菌培养
将乳酸杆菌菌种接种于MRS液体培养基中，37℃培养48h，采用冰浴，在10min内降温至2～8℃；然后在4℃条件下2000r/min离心10min收集细菌；并在4℃条件下用质量百分比为0.9％生理盐水反复洗涤细菌至白色，收集细菌，将收集的细菌在沸水中加热20min，在4℃保存备用；
B)肽聚糖提取
1)超声破碎：将菌体悬浮于蒸馏水中，超声物理破碎3次，每次20min，获得超声破碎液；
2)粗细胞壁的分离：将超声破碎液在1000r/min离心15min，收集上清去除未破碎的菌体，再上清液在10000r/min离心20min，弃上清收集粗细胞壁；
3)SDS处理：将步骤2)差速离心分离得到的粗细胞壁，加10g/dLSDS，沸水浴10min，在10000r/min离心20min，沉淀物用蒸馏水洗涤4次，再用无水乙醇脱水，获得洗净后粗细胞壁；
4)胰蛋白酶处理：将洗净后粗细胞壁溶于0.1g/dL Trypsin 0.1mol/L Tris缓冲液中，pH值为7.5，37℃水浴振荡，以OD620基本不再下降为准；10000r/min离心20min，沉淀物用蒸馏水洗涤4次，获得酶处理粗细胞壁，无水乙醇脱水，获得酶处理沉淀物；
5)三氯乙酸处理：将酶处理沉淀物悬浮在10g/dL TCA 溶液中，沸水浴20min冷却，去除共价结合的磷壁酸；10000r/min离心20min，蒸馏水洗3次，无水乙醇脱水，70℃干燥后，获得肽聚糖，将其在4℃保存备用。
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