CN106215185A - 一种禽呼肠孤病毒多联亚单位疫苗的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种禽呼肠孤病毒多联亚单位疫苗的制备方法，该技术方案针对禽呼长孤病毒标准毒株S1133株中主要产生群特异性中和抗体的抗原，和携带有型特异性的中和反应表面抗原分别进行原核表达，各种抗原以一定的比例配比，加入免疫增强剂，能够充分激发机体的免疫应答反应，不同抗原蛋白引起机体产生不同的特异性抗体，增加抗体交叉保护范围，对临床养殖快大型家禽起到很好的保护作用。利用本方法制备的疫苗，其中抗原纯净、不使用灭活剂，从而降低了免疫副作用，同时其抗体水平高，临床保护好，再加入具有成本低、易于规模化生产的优势，因此具有良好的推广前景。

Description

一种禽呼肠孤病毒多联亚单位疫苗的制备方法

技术领域

本发明涉及兽用生物制品技术领域，具体涉及一种禽呼肠孤病毒多联亚单位疫苗的制备方法。

背景技术

禽呼肠孤病毒是鸡病毒性关节炎和腱鞘炎的主要病原之一，属于呼肠孤病毒科，呼肠孤病毒属的一种。该毒株自1954年首次从患慢性呼吸道病的鸡呼吸道分离得到以来，多种禽呼肠孤病毒分离株相继被报道。随着近年来相关研究的深入，已发现禽呼肠孤病毒可能导致除病毒性关节性和腱鞘炎外的其他病症，在患有呼吸道病、肠道病、心肝病损、蓝翅病、肉鸡矮小综合症、暂时性消化系统紊乱等疾病的鸡体内均分离到禽呼肠孤病毒。

禽呼肠孤病毒(Avianreovirus,ARV)属于呼肠孤病毒科，正呼肠孤病毒属。ARV基因组dsRNA外包裹有双层蛋白衣壳——核心衣壳和外层衣壳。病毒经宿主细胞受体介导的内吞饮作用侵入，在吞饮泡中除去外层衣壳，随后病毒核心粒子被释放到细胞质中，病毒基因开始表达。在编码禽呼肠孤病毒的10个结构蛋白当中μB、μBC、μBN、σB和σC构成病毒的外衣壳，λA、λB、μA和σA构成病毒的内衣壳，λC则贯穿病毒的内衣壳和外衣壳。λB蛋白由L2基因所编码，是ARV内衣壳的结构蛋白之一，它能使感染的细胞发生融合形成合胞体，也能诱导宿主细胞产生群特异性中和抗体。σC蛋白是病毒外壳蛋白中最小的一个蛋白质，由S1基因编码翻译，分子量34.9kD，以单体和三聚体的形式存在，携带有型特异性的中和反应表面抗原，能够诱导细胞凋亡。σB蛋白是由S3基因(1104bp)编码，长367个氨基酸，是病毒外衣壳的主要组分，携带有群特异性的中和抗原表位，能提高ARV感染细胞的能力，引起宿主细胞融合，在病毒的感染和致病中有一定的作用。

基因工程疫苗是利用生物技术制备的分子水平的疫苗，包括基因工程亚单位疫苗，活载体疫苗，DNA疫苗等。ARV的基因工程疫苗是ARV疫苗研究当中最为广泛的疫苗种类。虽然已有相关报道有亚单位疫苗的研究，但是禽呼长孤病毒存在血清型多，交叉范围广的特性，单独的抗原蛋白很难引起机体的免疫反应，或者是机体免疫反应产的的抗体保护范围小。

发明内容

本发明旨在针对现有技术的技术缺陷，提供一种禽呼肠孤病毒多联亚单位疫苗的制备方法，以解决现有技术的禽呼肠孤病毒疫苗免疫效力较低的技术问题。

本发明要解决的另一技术问题是现有技术的禽呼肠孤病毒对不同抗原血清型的覆盖范围较下。

为实现以上技术目的，本发明采用以下技术方案：

一种禽呼肠孤病毒多联亚单位疫苗的制备方法，包括以下步骤：

1)配制含有100～300μg/ml禽呼肠孤病毒σC蛋白、100～300μg/ml禽呼肠孤病毒λB蛋白、100～300μg/ml禽呼肠孤病毒σB蛋白的水溶液，即得到多联蛋白溶液；

2)配制含有10～100mg/L天蚕素、10～100mg/L胞壁酰二肽的水溶液，即得到免疫增强剂；

3)取步骤1)所得的多联蛋白溶液与步骤2)所得的免疫增强剂混合，即为疫苗水相；

4)取疫苗油相，与步骤3)所得的疫苗水相混合，而后乳化，即得到所述禽呼肠孤病毒多联亚单位疫苗。

作为优选，步骤1)所述的多联蛋白溶液中禽呼肠孤病毒σC蛋白、禽呼肠孤病毒λB蛋白、禽呼肠孤病毒σB蛋白三者的浓度比例为1:(0.5～1):(0.5～1)。

作为优选，步骤3)中，步骤1)所得的多联蛋白溶液与步骤2)所得的免疫增强剂二者混合体积比为1:(3～5)。

作为优选，步骤4)中，疫苗油相与步骤3)所得的疫苗水相二者混合体积比为2:(3～6)。

作为优选，所述禽呼肠孤病毒σC蛋白是禽呼肠孤病毒S1133株的σC蛋白，所述禽呼肠孤病毒λB蛋白是禽呼肠孤病毒S1133株的λB蛋白，所述禽呼肠孤病毒σB蛋白是禽呼肠孤病毒S1133株的σB蛋白。

在以上技术方案中，所述σC蛋白、λB蛋白、σB蛋白，是利用公知方法制备的，例如，可以将上述三种蛋白的表达基因通过载体导入大肠杆菌表达系统，而后诱导表达σC蛋白、λB蛋白、σB蛋白，再通过常规的方法提纯，稀释制备成贮存液。

本发明提供了一种禽呼肠孤病毒多联亚单位疫苗的制备方法，该技术方案针对禽呼长孤病毒标准毒株S1133株中主要产生群特异性中和抗体的抗原，和携带有型特异性的中和反应表面抗原分别进行原核表达，各种抗原以一定的比例配比，加入免疫增强剂，能够充分激发机体的免疫应答反应，不同抗原蛋白引起机体产生不同的特异性抗体，增加抗体交叉保护范围，对临床养殖快大型家禽起到很好的保护作用。利用本方法制备的疫苗，其中抗原纯净、不使用灭活剂，从而降低了免疫副作用，同时其抗体水平高，临床保护好，再加入具有成本低、易于规模化生产的优势，因此具有良好的推广前景。

具体实施方式

以下将对本发明的具体实施方式进行详细描述。为了避免过多不必要的细节，在以下实施例中对属于公知的结构或功能将不进行详细描述。除有定义外，以下实施例中所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。

实施例1

一种禽呼肠孤病毒多联亚单位疫苗的制备方法，包括以下步骤：

1)配制含有200μg/ml禽呼肠孤病毒σC蛋白、200μg/ml禽呼肠孤病毒λB蛋白、200μg/ml禽呼肠孤病毒σB蛋白的水溶液，即得到多联蛋白溶液；

2)配制含有55mg/L天蚕素、55mg/L胞壁酰二肽的水溶液，即得到免疫增强剂；

3)取步骤1)所得的多联蛋白溶液与步骤2)所得的免疫增强剂混合，即为疫苗水相；

4)取疫苗油相，与步骤3)所得的疫苗水相混合，而后乳化，即得到所述禽呼肠孤病毒多联亚单位疫苗。

在以上技术方案的基础上，满足以下条件：

步骤3)中，步骤1)所得的多联蛋白溶液与步骤2)所得的免疫增强剂二者混合体积比为1:3。

在于步骤4)中，疫苗油相与步骤3)所得的疫苗水相二者混合体积比为2:3。

所述禽呼肠孤病毒σC蛋白是禽呼肠孤病毒S1133株的σC蛋白，所述禽呼肠孤病毒λB蛋白是禽呼肠孤病毒S1133株的λB蛋白，所述禽呼肠孤病毒σB蛋白是禽呼肠孤病毒S1133株的σB蛋白。

以下通过实验方法考察该疫苗的免疫效果：

(1)试验分组

取3-4周龄SPF鸡30只，分为3组，每组10只鸡，第1组皮下或肌肉注射多联亚单位疫苗0.2mL，第2组注射常规灭活疫苗，第3组为不免疫对照组，同样条件下饲养，实验分组见表1。免疫后每周采集血清，利用美国IDEXX公司的禽呼肠孤病毒抗体检测试剂盒(产品编号99-09264)对呼肠孤病毒特异性抗体进行检测。

表1两种不同剂型的禽呼肠孤病毒油乳剂灭活疫苗免疫剂量及分组

(2)试验结果

实验结果如表2。在实验结果中规定当抗体滴度大于1:396时判为阳性，否则为阴性。由实验结果可知两种疫苗在免疫后1周即可诱导产生禽呼肠孤病毒特异性抗体，第3～4周抗体水平达到高峰；多联亚单位疫苗与常规灭活疫苗相比免疫后两周抗体水平上升较快，到免疫后4周抗体水平达到5000以上。对照组则无法诱导产生特异性抗体。本实施例说明多联亚单位疫苗具有一定的优势，其产生抗体快，并且可以诱导产生更高水平的抗体。

表2抗体水平检测结果

(3)免疫攻毒法检验

免疫疫苗后第28天，足垫接种0.2mLAV2311禽呼肠孤病毒(病毒含量为10^4.0EID₅₀)，每天观察鸡的发病症状，共观察10天，结果如表3所示。

表3攻击AV2311病毒后两种剂型疫苗产生的保护作用

由表3可知，免疫鸡攻击AV2311禽呼肠孤病毒后，对照组10只鸡全部出现发病症状，发病时间可以持续10d左右；油包水型疫苗组有1只鸡发病，病鸡足垫肿胀7d后略有消肿，该疫苗可以达到90％的保护率；多联亚单位疫苗组则10只鸡全部正常，没有出现发病症状，可以产生100％保护率。

实施例2

一种禽呼肠孤病毒多联亚单位疫苗的制备方法，包括以下步骤：

1)配制含有300μg/ml禽呼肠孤病毒σC蛋白、150μg/ml禽呼肠孤病毒λB蛋白、150μg/ml禽呼肠孤病毒σB蛋白的水溶液，即得到多联蛋白溶液；

2)配制含有100mg/L天蚕素、100mg/L胞壁酰二肽的水溶液，即得到免疫增强剂；

3)取步骤1)所得的多联蛋白溶液与步骤2)所得的免疫增强剂混合，即为疫苗水相；

4)取疫苗油相，与步骤3)所得的疫苗水相混合，而后乳化，即得到所述禽呼肠孤病毒多联亚单位疫苗。

在以上技术方案的基础上，满足以下条件：

步骤3)中，步骤1)所得的多联蛋白溶液与步骤2)所得的免疫增强剂二者混合体积比为1:5。

在于步骤4)中，疫苗油相与步骤3)所得的疫苗水相二者混合体积比为1:3。

实施例3

一种禽呼肠孤病毒多联亚单位疫苗的制备方法，包括以下步骤：

1、σC蛋白浓度按照常规方法提纯后进行稀释，浓度为200ug/ml。

2、λB蛋白浓度按照常规方法提纯后进行稀释，浓度为100ug/ml。

3、σB蛋白浓度按照常规方法提纯后进行稀释，浓度为200ug/ml。

4、σC蛋白、λB蛋白、σB蛋白三种蛋白的比例为1:1:1。

5、将三种蛋白溶液混合后，加入天蚕素，其终浓度为50mg/mL和10mg mg/mL的胞壁酰二肽。

6、将步骤5中的水相充分混合，与进口油佐剂按1:2的比例进行乳化，乳化时间8min。

7、性状性检测

剂型：油包水型。取一清洁吸管，吸取少量疫苗滴入冷水中，除第1滴外，均不扩散

稳定性：吸取疫苗10ml加入离心管中，以3000r/min离心15分钟，管底析出的水相应≤0.5ml。

黏度：按现行《中国兽药典》附录进行，应符合规定。

以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明。凡在本发明的申请范围内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种禽呼肠孤病毒多联亚单位疫苗的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1)配制含有100～300μg/ml禽呼肠孤病毒σC蛋白、100～300μg/ml禽呼肠孤病毒λB蛋白、100～300μg/ml禽呼肠孤病毒σB蛋白的水溶液，即得到多联蛋白溶液；

2)配制含有10～100mg/L天蚕素、10～100mg/L胞壁酰二肽的水溶液，即得到免疫增强剂；

3)取步骤1)所得的多联蛋白溶液与步骤2)所得的免疫增强剂混合，即为疫苗水相；

4)取疫苗油相，与步骤3)所得的疫苗水相混合，而后乳化，即得到所述禽呼肠孤病毒多联亚单位疫苗。

2.根据权利要求1所述的一种禽呼肠孤病毒多联亚单位疫苗的制备方法，其特征在于步骤1)所述的多联蛋白溶液中禽呼肠孤病毒σC蛋白、禽呼肠孤病毒λB蛋白、禽呼肠孤病毒σB蛋白三者的浓度比例为1:(0.5～1):(0.5～1)。

3.根据权利要求1所述的一种禽呼肠孤病毒多联亚单位疫苗的制备方法，其特征在于步骤3)中，步骤1)所得的多联蛋白溶液与步骤2)所得的免疫增强剂二者混合体积比为1:(3～5)。

4.根据权利要求1所述的一种禽呼肠孤病毒多联亚单位疫苗的制备方法，其特征在于步骤4)中，疫苗油相与步骤3)所得的疫苗水相二者混合体积比为2:(3～6)。

5.根据权利要求1所述的一种禽呼肠孤病毒多联亚单位疫苗的制备方法，其特征在于所述禽呼肠孤病毒σC蛋白是禽呼肠孤病毒S1133株的σC蛋白，所述禽呼肠孤病毒λB蛋白是禽呼肠孤病毒S1133株的λB蛋白，所述禽呼肠孤病毒σB蛋白是禽呼肠孤病毒S1133株的σB蛋白。