CN103479997A - 一种禽呼肠孤病毒水包油包水型灭活疫苗制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种禽呼肠孤病毒水包油包水型灭活疫苗制备方法，包括鸡胚成纤维细胞的制备、病毒的培养、病毒灭活、疫苗乳化等步骤。与现有技术相比本发明采用了本土分离的禽呼肠孤病毒，免疫原性好，具有更高的保护率；本发明采用鸡胚成纤维细胞取代利用鸡胚绒毛尿囊膜接种方式繁殖禽呼肠孤病毒，节省了疫苗制备成本，各批间质量差异降低，产量大，病毒毒价和疫苗质量提高；本发明利用均质机对疫苗进行乳化，制备的疫苗为水包油包水型，相对于传统的油包水剂型而言该疫苗粘度低，粒度小，易吸收；本发明选用的佐剂在疫苗制备过程中无需要额外添加任何表面活性剂成分，制备的疫苗安全性好，避免了传统油佐剂难以吸收造成的副作用。

Description

一种禽呼肠孤病毒水包油包水型灭活疫苗制备方法

技术领域

本发明涉及兽用疫苗技术领域，具体涉及一种禽呼肠孤病毒水包油包水型灭活疫苗制备方法。

背景技术

禽呼肠孤病毒是鸡病毒性关节炎和腱鞘炎的主要病原之一，属于呼肠孤病毒科，呼肠孤病毒属的一种。该毒株自1954年首次从患慢性呼吸道病的鸡呼吸道分离得到以来，多种禽呼肠孤病毒分离株相继被报道。随着近年来相关研究的深入，已发现禽呼肠孤病毒可能导致除病毒性关节性和腱鞘炎外的其他病症，在患有呼吸道病、肠道病、心肝病损、蓝翅病、肉鸡矮小综合症、暂时性消化系统紊乱等疾病的鸡体内均分离到禽呼肠孤病毒。

禽呼肠孤病毒在世界范围内均有分布，广泛流行于鸡、火鸡中，其他禽类感染禽呼肠孤病毒的病例也有报道。由禽呼肠孤病毒导致的关节炎、腱鞘炎以及其他病症会造成鸡的废弃率高和生长抑制，饲料转化率低等问题，因此禽呼肠孤病毒的流行往往造成巨大的经济损失，尤其对于养鸡场这种禽类集中的环境，如果禽呼肠孤病毒大规模爆发会形成难以控制的局面。

现有技术中，控制禽呼肠孤病毒发病的主要手段是接种灭活全病毒疫苗，通过免疫接种来控制典型的鸡呼肠孤病毒感染，但目前灭活疫苗多为油包水型，注射时阻力大，不易吸收，并具有一定的毒副作用。因此有必要开发一种剂型更合理，更易吸收同时具有更好的免疫应答效应的疫苗产品。

发明内容

为克服现有技术的技术缺陷，本发明提供一种禽呼肠孤病毒水包油包水型灭活疫苗制备方法。

为实现以上技术目的，本发明采用以下技术方案：

一种禽呼肠孤病毒水包油包水型灭活疫苗制备方法，包括以下步骤：

1）病毒的培养、收获：取9-11日龄的SPF鸡胚，制备原代鸡胚成纤维细胞，以2.5×10⁶-3.5×10⁶细胞量/mL的接种量将制备的细胞接种于含有8%(v/v)胎牛血清的M199培养基中，于37℃条件下摇瓶培养过夜；当细胞长满培养基单层时，按细胞悬液0.1-0.3%(v/v)的接种量向细胞悬液中接种毒价≥10^6.5TCID₅₀/0.1mL的禽呼肠孤病毒，控制温度在37℃继续摇瓶培养60-84小时，收获细胞培养物，反复冻融3次，得到含上清液的细胞毒液；

2）病毒的灭活：将步骤2）得到的含上清液的细胞毒液置于灭菌容器内，根据病毒液体积加入甲醛溶液并调整甲醛终浓度至0.5-2‰(v/v)，充分摇匀毒液，在摇床上调整摇床转速为180r/min于37℃条件下灭活12-48小时；

3）疫苗的制备：将灭活的病毒液以3500r/min离心20min，再经8层纱布过滤，弃去沉淀，用磷酸盐缓冲液将灭活的病毒液做1.5-2倍（v/v）稀释，并置于28-32℃水浴锅中进行预热至水浴锅温度，即为水相；取法国赛比克公司的MONTANIDE^TMISA206VG型佐剂，充分混匀后置于28-32℃水浴锅中预热至水浴锅温度，即为油相；将上述预热后的水相和油相按1:0.8-1:1.2（w/w）比例混合，利用磁力搅拌装置进行预混合1h，然后采用ATS工业系统有限公司的AH100D型均质机调整二级阀压力为20-30bar、一级阀压力为400-500bar对该混合物乳化2-3次，即得到一种禽呼肠孤病毒水包油包水型灭活疫苗。

上述方法中，步骤1）所述的细胞接种量优选为3×10⁶细胞量/mL；步骤1）所述的病毒接种量优选为细胞悬液的0.2%(v/v)；步骤2）所述的甲醛终浓度优选为1‰(v/v)；步骤3）所述的病毒液稀释倍数优选为1.7倍(v/v)；步骤3）所述的水相预热温度优选为31℃；步骤3）所述的油相预热温度优选为31℃；步骤3）所述的水相与油相比例优选为1:1(w/w)；步骤3）所述的均质机参数优选为二级阀压力20bar、一级阀压力450bar；步骤3）所述的乳化次数优选为2次。

本发明的有益效果包括：采用了本土分离的禽呼肠孤病毒，免疫原性好，具有更高的保护率；本发明采用鸡胚成纤维细胞取代利用鸡胚绒毛尿囊膜接种方式繁殖禽呼肠孤病毒，节省了疫苗制备成本，各批间质量差异降低，产量大，病毒毒价和疫苗质量提高；本发明利用均质机对疫苗进行乳化，制备的疫苗为水包油包水型，相对于传统的油包水剂型而言该疫苗粘度低，粒度小，易吸收；本发明选用的佐剂在疫苗制备过程中无需要额外添加任何表面活性剂成分，制备的疫苗安全性好，避免了传统油佐剂难以吸收造成的副作用。

附图说明

图1为疫苗接种后产生抗体水平对比图

具体实施方式

实施例1

1.1病毒的培养、收获

取10日龄的SPF鸡胚，制备原代鸡胚成纤维细胞，以3×10⁶细胞量/mL的接种量将制备的细胞接种于含有8%(v/v)胎牛血清的M199培养基中，于37℃条件下摇瓶培养过夜；当细胞长满培养基单层时，按细胞悬液0.2%(v/v)的接种量向细胞悬液中接种毒价≥10^6.5TCID₅₀/0.1mL的禽呼肠孤病毒，控制温度在37℃继续摇瓶培养72小时，收获细胞培养物，反复冻融3次，得到含上清液的细胞毒液；

1.2病毒的灭活

将以上得到的含上清液的细胞毒液置于灭菌容器内，根据病毒液体积加入甲醛溶液并调整甲醛终浓度至1‰(v/v)，充分摇匀毒液，在摇床上调整摇床转速为180r/min于37℃条件下灭活16小时；

1.3疫苗的制备

将灭活的病毒液以3500r/min离心20min，再经8层纱布过滤，弃去沉淀，用磷酸盐缓冲液将灭活的病毒液做1.7倍（v/v）稀释，并置于31℃水浴锅中进行预热至31℃，即为水相；取法国赛比克公司的MONTANIDE^TMISA206VG型佐剂，充分混匀后置于31℃水浴锅中预热至31℃，即为油相；将上述预热后的水相和油相按1:1（w/w）比例混合，利用磁力搅拌装置进行预混合1h，然后采用ATS工业系统有限公司的AH100D型均质机调整二级阀压力为20bar、一级阀压力为450bar对该混合物乳化2次，即得到一种禽呼肠孤病毒水包油包水型灭活疫苗。

1.4禽呼肠孤病毒水包油包水型灭活疫苗的质量检测

取上述制得的禽呼肠孤病毒水包油包水型灭活疫苗，进行如下检测：

1.4.1外观检测

通过肉眼观察发现疫苗为乳白色乳剂，合格。

1.4.2剂型检测

取一清洁吸管，吸取少许疫苗滴于清洁冷水表面，液滴呈云雾状扩散，合格。

1.4.3离心稳定性检测

取10mL疫苗，3000r/min离心15min，不分层，析出约30uL水相，合格。

1.4.4粘度检验

用1mL吸管（下口的内径1.2mm，上口内径2.7mm）吸取25℃左右的疫苗1mL，令其垂直自然流出，流出0.4mL所需的时间为4秒。同时采用BrookfieldDVI粘度计检测，该剂型疫苗粘度为28mPa.s，合格。

1.4.5粒径检测

用移液枪精确取乳液10uL于测试杯中，加入290uL磷酸盐缓冲液充分混匀，确保乳化颗粒良好分散，将测试杯放入粒度仪中测定，测定温度设定为25℃，平均粒径为280nm，合格。

1.5禽呼肠孤病毒水包油包水型灭活疫苗安全检验

取上述制得的禽呼肠孤病毒水包油包水型灭活疫苗，进行如下检验：

将疫苗分别进行1次超剂量（1mL）和单剂量重复接种（0.3mL×2）的安全试验。观察14天，试验鸡均无任何局部和全身不良反应，表明上述疫苗安全性良好.

1.6禽呼肠孤病毒水包油包水型灭活疫苗效力检验

用上述灭活后的病毒液再制备出油包水型疫苗，用于同制备出的禽呼肠孤病毒水包油包水型灭活疫苗做效力比较。

1.6.1血清学方法检验

取3-4周龄SPF鸡30只，分为3组，每组10只鸡，第1组皮下或肌肉注射油包水型疫苗0.3mL，第2组注射水包油包水型疫苗，第3组注射磷酸盐缓冲液作为对照，同样条件下饲养，实验条件见表1免疫后每周采集血清，利用美国IDEXX公司的禽呼肠孤病毒抗体检测试剂盒（产品编号99-09264）对呼肠孤病毒特异性抗体进行检测。

表1两种不同剂型的禽呼肠孤病毒油乳剂灭活疫苗免疫剂量及分组

实验结果如表2和图1所示。在实验结果中规定当抗体滴度大于1:396时判为阳性，否则为阴性。由实验结果可知常规的油包水型疫苗在免疫后第2周即可诱导产生禽呼肠孤病毒特异性抗体，第3周抗体水平达到高峰，第4周抗体水平有所下降，但仍为阳性；水包油包水型疫苗则在免疫后第1周即可诱导产生特异性抗体，第3周抗体水平达到高峰，第4周抗体水平有所下降，但仍可诱导产生禽呼肠孤病毒病毒特异性抗体；对照组则无法诱导产生特异性抗体。本实施例制备的水包油包水型疫苗相对于常规的油包水型疫苗具有一定的优势，其产生抗体快，并且可以诱导产生更高水平的抗体。

表2抗体水平检测结果

1.6.2免疫攻毒法检验

免疫疫苗后第28天，足垫接种0.3mL AV2311禽呼肠孤病毒（病毒含量为10⁴ELD₅₀/0.1mL），每天观察鸡的发病症状，共观察14天，结果如表3所示。

表3攻击AV2311病毒后两种剂型疫苗产生的保护作用

由表3可知，免疫鸡攻击AV2311禽呼肠孤病毒后，对照组10只鸡全部出现发病症状，即病鸡足垫开始肿胀，发红发紫，甚至有的鸡爪正面出现抓痕，流血，发病时间可以持续10d左右；油包水型疫苗组有1只鸡发病，病鸡足垫肿胀7d后开始消肿，基本恢复正常，该疫苗可以达到80%的保护率；水包油包水型疫苗组则10只鸡全部正常，没有出现发病症状，可以产生100%保护率。

实施例2

1.1病毒的培养、收获

取11日龄的SPF鸡胚，制备原代鸡胚成纤维细胞，以3.3×10⁶细胞量/mL的接种量将制备的细胞接种于含有8%(v/v)胎牛血清的M199培养基中，于37℃条件下摇瓶培养过夜；当细胞长满培养基单层时，按细胞悬液0.3%(v/v)的接种量向细胞悬液中接种毒价≥10^6.5TCID₅₀/0.1mL的禽呼肠孤病毒，控制温度在37℃继续摇瓶培养66小时，收获细胞培养物，反复冻融3次，得到含上清液的细胞毒液；

1.2病毒的灭活

将以上得到的含上清液的细胞毒液置于灭菌容器内，根据病毒液体积加入甲醛溶液并调整甲醛终浓度至0.8‰(v/v)，充分摇匀毒液，在摇床上调整摇床转速为180r/min于37℃条件下灭活24小时；

1.3疫苗的制备

将灭活的病毒液以3500r/min离心20min，再经8层纱布过滤，弃去沉淀，用磷酸盐缓冲液将灭活的病毒液做1.9倍（v/v）稀释，并置于29℃水浴锅中进行预热至水浴锅温度，即为水相；取法国赛比克公司的MONTANIDE^TMISA206VG型佐剂，充分混匀后置于29℃水浴锅中预热至水浴锅温度，即为油相；将上述预热后的水相和油相按1:1.2（w/w）比例混合，利用磁力搅拌装置进行预混合1h，然后采用ATS工业系统有限公司的AH100D型均质机调整二级阀压力为25bar、一级阀压力为470bar对该混合物乳化3次，即得到一种禽呼肠孤病毒水包油包水型灭活疫苗。

以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明。凡在本发明的申请范围内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种禽呼肠孤病毒水包油包水型灭活疫苗制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1）病毒的培养、收获：取9-11日龄的SPF鸡胚，制备原代鸡胚成纤维细胞，以2.5×10⁶-3.5×10⁶细胞量/mL的接种量将制备的细胞接种于含有8%(v/v)胎牛血清的M199培养基中，于37℃条件下摇瓶培养过夜；当细胞长满培养基单层时，按细胞悬液0.1-0.3%(v/v)的接种量向细胞悬液中接种毒价≥10^6.5TCID₅₀/0.1mL的禽呼肠孤病毒，控制温度在37℃继续摇瓶培养60-84小时，收获细胞培养物，反复冻融3次，得到含上清液的细胞毒液；

2）病毒的灭活：将步骤1）得到的含上清液的细胞毒液置于灭菌容器内，根据病毒液体积加入甲醛溶液并调整甲醛终浓度至0.5-2‰(v/v)，充分摇匀毒液，在摇床上调整摇床转速为180r/min于37℃条件下灭活12-48小时；

3）疫苗的制备：将灭活的病毒液以3500r/min离心20min，再经8层纱布过滤，弃去沉淀，用磷酸盐缓冲液将灭活的病毒液做1.5-2倍（v/v）稀释，并置于28-32℃水浴锅中进行预热至水浴锅温度，即为水相；取疫苗佐剂，充分混匀后置于28-32℃水浴锅中预热至水浴锅温度，即为油相；将上述预热后的水相和油相按1:0.8-1:1.2（w/w）比例混合，利用磁力搅拌装置进行预混合1h，然后采用均质机调整二级阀压力为20-30bar、一级阀压力为400-500bar对该混合物乳化2-3次，即得到一种禽呼肠孤病毒水包油包水型灭活疫苗。

2.根据权利要求1所述的一种禽呼肠孤病毒水包油包水型灭活疫苗制备方法，其特征在于步骤1）所述的细胞接种量为3×10⁶细胞量/mL。

3.根据权利要求1所述的一种禽呼肠孤病毒水包油包水型灭活疫苗制备方法，其特征在于步骤1）所述的病毒接种量为细胞悬液的0.2%(v/v)。

4.根据权利要求1所述的一种禽呼肠孤病毒水包油包水型灭活疫苗制备方法，其特征在于步骤2）所述的甲醛终浓度为1‰(v/v)。

5.根据权利要求1所述的一种禽呼肠孤病毒水包油包水型灭活疫苗制备方法，其特征在于步骤3）所述的病毒液稀释倍数为1.7倍(v/v)。

6.根据权利要求1所述的一种禽呼肠孤病毒水包油包水型灭活疫苗制备方法，其特征在于步骤3）所述的水相预热温度为31℃。

7.根据权利要求1所述的一种禽呼肠孤病毒水包油包水型灭活疫苗制备方法，其特征在于步骤3）所述的油相预热温度为31℃。

8.根据权利要求1所述的一种禽呼肠孤病毒水包油包水型灭活疫苗制备方法，其特征在于步骤3）所述的水相与油相比例为1:1(w/w)。

9.根据权利要求1所述的一种禽呼肠孤病毒水包油包水型灭活疫苗制备方法，其特征在于步骤3）所述的均质机参数为二级阀压力为20bar、一级阀压力为450bar。

10.根据权利要求1所述的一种禽呼肠孤病毒水包油包水型灭活疫苗制备方法，其特征在于步骤3）所述的乳化次数为2次。

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