CN106511995A - 一种水包油包水型疫苗佐剂及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种水包油包水型疫苗佐剂及其应用，该技术方案优选符合大生产需求、具有免疫增强作用的成分，根据水包油包水型微球的控释原理设计添加方式，使其更有效的直接作用于免疫细胞，从而提升了免疫效力。与现有技术的常规佐剂相比，本发明制备的疫苗佐剂具有合理的控释、靶向和隔离特性，注射免疫家禽后，水包油包水微球适时代谢破裂，全面刺激家禽淋巴细胞产生抗体。水相重的免疫增强剂能持久缓慢释放在后期免疫细胞浸润过程中，使其生物利用度达到最大化，表现为注射部位吸收良好、被注射动物快速产生免疫保护作用，既能诱导短期免疫，又能诱导长期免疫。

Description

一种水包油包水型疫苗佐剂及其应用
技术领域
本发明涉及疫苗技术领域，具体涉及一种水包油包水型疫苗佐剂及其应用。
背景技术
疫苗是具有免疫原性又不至于导致机体患病的预防性生物制品。疫苗的抗原物质多取自致病微生物的灭活产物或减毒产物，灭活抗原单独免疫动物时，不足以产生免疫原性，特别是免疫原性低、分子量小的抗原。因此需要用不同种类的佐剂来增强机体对抗原的免疫应答。
研究证实，在疫苗的制备过程中，佐剂作为能同抗原一起或预先注射到机体内能增强免疫原性或改变免疫反应类型的物质，受到研究者在新型、高效疫苗复合物的研发中的重视。佐剂又称非特异性免疫增强剂，本身不具抗原性，是一类先于抗原或与抗原同时作用，能非特异性地改变或增强免疫原性或改变免疫反应类型。免疫佐剂的主要生物作用包括以下几个方面：抗原物质混合佐剂注入机体后，改变了抗原的物理性状，可使抗原物质缓慢地释放，延长了抗原的作用时间；佐剂吸附了抗原后，增加了抗原的表面积，使抗原易于被抗原呈递细胞吞噬；佐剂能刺激抗原呈递细胞对抗原的处理；佐剂可促进淋巴细胞之间的接触，增强辅助T细胞的作用；可刺激致敏淋巴细胞的分裂和浆细胞产生抗体。
疫苗佐剂根据剂型分为三类，分别为油包水型，水包油型和水包油包水型。油包水型油疫苗佐剂是由抗原液、稳定剂及白油混合后，在高剪切力作用下制备而成。其免疫机理是在接种部位贮存一段时间，局部产生肉芽肿和炎症反应，吸引巨噬细胞、淋巴细胞等聚集以识别抗原，产生抗体。同时，缓慢扩散的油佐剂使抗原输送到二级淋巴器官的时间延长，不断刺激机体的免疫系统，从而产生续期长、抗体水平高的免疫效力。虽然国内外疫苗生产厂家的生产工艺不断改进，用油质量也不断提高、但由于这种制剂的联系油相在注射部位有驻留的倾向，注射阻力大，不易吸收，容易产生大量无菌脓肿和肉芽肿，保护性抗体产生速度慢、易对动物胴体品质造成不良影响，并且在接种期间可能引起剧烈的疼痛；水包油型具有注射部位显现局部反应小且稳定性高的优势，然而包含或者暴露在连续相中的抗原很快在注射部位分散好被体液酶分解，难易提供长期的保护性抗体，常常需要特殊的免疫刺激剂和多次加强免疫，制备成本高，不被广泛使用。
迄今为止，水包油包水型兽用疫苗佐剂的开发鲜有报道，这与其开发工艺的难度是密切相关的，现有技术的水包油包水型佐剂由于配方成分、制备工艺不够合理，因此在使用环节仍存在注射困难、免疫效力较低的缺陷。在这种情况下，如果能研制出一种高效佐剂，进而提高兽用疫苗的效力和免疫时间，将会为家畜养殖业预防疾病带来很广阔的市场前景。
发明内容
本发明旨在针对现有技术的技术缺陷，提供一种水包油包水型疫苗佐剂及其应用，以解决现有技术的疫苗佐剂所制备的疫苗存在注射困难的技术问题。
本发明要解决的另一技术问题是现有技术的疫苗佐剂对疫苗的免疫促进作用较低。
本发明要解决的再一技术问题是现有技术的疫苗佐剂容易对机体产生刺激作用。
本发明要解决的又一技术问题是现有技术的疫苗佐剂成本较高。
本发明要解决的又一技术问题是如何进一步提升上述水包油包水型疫苗佐剂的免疫促进效果。
本发明要解决的又一技术问题是在利用本发明佐剂制备疫苗的过程中如何保证成品苗的使用性能。
为实现以上技术目的，本发明采用以下技术方案：
一种水包油包水型疫苗佐剂，包括以下重量百分比的成分：亲水复合表面活性剂0.7～1.2％、亲油复合表面活性剂0.9～1.5％、矿物油55～75％；同时，所述水包油包水型疫苗佐剂还包括以下浓度的成分：稳定剂6～9g/L、添加剂2～5g/L。
作为优选，所述亲水复合表面活性剂选自以下成分的一种或几种：月桂基葡糖苷、聚乙烯吡咯烷酮PVP-K30、聚乙二醇单油酸酯。
作为优选，所述亲油复合表面活性剂选自以下成分的一种或几种：脂肪酸甲酯、单硬脂酸甘油酯、聚乙二醇双油酸酯。
作为优选，所述亲水复合表面活性剂与亲油表面活性剂的质量百分比为6:4。
作为优选，所述矿物油是白油。
作为优选，所述白油在水包油包水型疫苗佐剂中所占的质量百分比为83～90％。
作为优选，所述稳定剂是1,2-丙二醇。
作为优选，所述水包油包水型疫苗佐剂还包括浓度为0.2～0.3g/mL的黄氏多糖注射液或浓度为0.2～0.3g/mL的黄氏多糖粉水溶液。
作为优选，所述添加剂是葡萄糖甘氨酸。
同时，本发明提供了上述水包油包水型疫苗佐剂用于制备疫苗的应用。
作为优选，所述应用包括以下步骤：在低速搅拌条件下，将灭活的抗原液滴加到所述水包油包水型疫苗佐剂中，滴加结束后低速搅拌30min，而后以5000rpm的剪切速度乳化3～5min。即得到所述疫苗；其中所述抗原液是新城疫病毒液、传染性法氏囊病毒液、猪圆环病毒液或猪乙型脑炎病毒液。
作为优选，以上操作步骤在无菌环境下操作，制备所用原料也均为无菌原料。
本发明提供了一种水包油包水型疫苗佐剂及其应用，该技术方案优选符合大生产需求、具有免疫增强作用的成分，根据水包油包水型微球的控释原理设计添加方式，使其更有效的直接作用于免疫细胞，达到作用持久、生物利用度最大的效果。
本发明水包油包水型疫苗佐剂与传统佐剂相比，更易注射，可以同时诱导短期免疫和长期免疫，提高免疫效力和细胞免疫水平，免疫持续期长，不易引起刺激，减少现有灭活疫苗的用油量，本发明优选符合大生产需求的原材料，大大降低了制备成本。与此同时，本发明匹配了应用其制备疫苗的方法，该方法经过反复试验，各组分成份的量变及操作步骤顺序的改变均会影响复乳的包被效果、成品苗的粘度、稳定性、免疫效果及注射后吸收情况等。
本发明制备的疫苗佐剂具有合理的控释、靶向和隔离特性，注射免疫家禽后，水包油包水微球适时代谢破裂，全面刺激家禽淋巴细胞产生抗体。水相重的免疫增强剂能持久缓慢释放在后期免疫细胞浸润过程中，使其生物利用度达到最大化，表现为注射部位吸收良好、被注射动物快速产生免疫保护作用。
具体实施方式
以下将对本发明的具体实施方式进行详细描述。为了避免过多不必要的细节，在以下实施例中对属于公知的结构或功能将不进行详细描述。
以下实施例中所使用的近似性语言可用于定量表述，表明在不改变基本功能的情况下可允许数量有一定的变动。因此，用“大约”、“左右”等语言所修正的数值不限于该准确数值本身。在一些实施例中，“大约”表示允许其修正的数值在正负百分之十(10％)的范围内变化，比如，“大约100”表示的可以是90到110之间的任何数值。此外，在“大约第一数值到第二数值”的表述中，大约同时修正第一和第二数值两个数值。在某些情况下，近似性语言可能与测量仪器的精度有关。
除有定义外，以下实施例中所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。
以下实施例中所用的试验试剂耗材，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值；以下实施例中的％，如无特别说明，均为质量百分含量。
以下实施例及实验中所述的白油采用天津佐沐生物科技有限公司的产品，型号为VACCUTE-L；所述的新城疫病毒和传染性法氏囊病毒均属于常规毒株。
实施例1
一种水包油包水型疫苗佐剂，由以下成分组成：月桂基葡萄糖苷3.5g，聚乙二醇单油酸酯3.7g，脂肪酸甲酯2.0g，单硬脂酸甘油酯2.8g，白油VACCUTE-L88g，1,2-丙二醇1g，葡萄糖甘氨酸1g。
上述各成分按顺序依次混匀，制备得到稳定的水包油包水型疫苗佐剂。将上述佐剂平均分为5份，分别制备得到水包油包水型新城疫灭活疫苗、水包油包水型传染性法氏囊病毒灭活疫苗、水包油包水型猪圆环病毒灭活疫苗、水包油包水型猪乙型脑炎病毒灭活疫苗。
以上5类疫苗均为乳白色稳定乳剂，37℃保存35天，6000rpm离心15min，无水相析出；取清洁吸管吸取少许疫苗滴于清洁冷水表面，液滴呈云雾状扩散；
水包油包水型新城疫病毒灭活疫苗注射21日龄SPF鸡，易注射，一周即可产生抗体，2-3周抗体达到高峰，免疫持续期长，不易产生副反应，成本低廉。
水包油包水型传染性法氏囊病毒灭活疫苗注射1日龄SPF鸡，易注射，一周即可产生抗体，2-3周抗体达到高峰，免疫持续期长，不易产生副反应，成本低廉。
水包油包水型猪圆环病毒灭活疫苗免疫4周龄仔猪，易注射，一周即可产生抗体，2-3周抗体达到高峰，免疫持续期长，不易产生副反应，成本低廉。
水包油包水型猪乙型脑炎病毒灭活疫苗免疫6-7月龄种猪，易注射，一周即可产生抗体，2-3周抗体达到高峰，免疫持续期长，不易产生副反应，成本低廉。
实施例2
一种水包油包水型疫苗佐剂，由以下成分组成：月桂基葡萄糖苷4.0g，聚乙二醇单油酸酯3.92g，脂肪酸甲酯3.0g，单硬脂酸甘油酯2.28g，白油VACCUTE-L 85g，1,2-丙二醇0.5g，司班80 1.3g。
上述各成分按顺序依次混匀，制备得到稳定的水包油包水型疫苗佐剂。将上述佐剂平均分为5份，分别制备得到水包油包水型新城疫灭活疫苗、水包油包水型传染性法氏囊病毒灭活疫苗、水包油包水型猪圆环病毒灭活疫苗、水包油包水型猪乙型脑炎病毒灭活疫苗。
以上5类疫苗均为乳白色稳定乳剂，37℃保存35天，6000rpm离心15min，无水相析出；取清洁吸管吸取少许疫苗滴于清洁冷水表面，液滴呈云雾状扩散；
水包油保水型新城疫病毒灭活疫苗注射21日龄SPF鸡，易注射，一周即可产生抗体，2-3周抗体达到高峰，免疫持续期长，不易产生副反应，成本低廉。
水包油包水型传染性法氏囊病毒灭活疫苗注射1日龄SPF鸡，易注射，一周即可产生抗体，2-3周抗体达到高峰，免疫持续期长，不易产生副反应，成本低廉。
水包油包水型猪圆环病毒灭活疫苗免疫4周龄仔猪，易注射，一周即可产生抗体，2-3周抗体达到高峰，免疫持续期长，不易产生副反应，成本低廉。
水包油包水型猪乙型脑炎病毒灭活疫苗免疫6-7月龄种猪，易注射，一周即可产生抗体，2-3周抗体达到高峰，免疫持续期长，不易产生副反应，成本低廉。
实施例3
一种水包油包水型疫苗佐剂，由以下成分组成：聚乙烯吡咯烷酮2.8g，聚乙二醇单油酸酯3.2g，单硬脂酸甘油酯2.1g，聚乙二醇双油酸酯3.9g，白油VACCUTE-L 89g，1,2-丙二醇0.5g，葡萄糖甘氨酸0.5g。
上述各成分按顺序依次混匀，制备得到稳定的水包油包水型疫苗佐剂。将上述佐剂平均分为5份，分别制备得到水包油包水型新城疫灭活疫苗、水包油包水型传染性法氏囊病毒灭活疫苗、水包油包水型猪圆环病毒灭活疫苗、水包油包水型猪乙型脑炎病毒灭活疫苗。
以上5类疫苗均为乳白色稳定乳剂，37℃保存35天，6000rpm离心15min，无水相析出；取清洁吸管吸取少许疫苗滴于清洁冷水表面，液滴呈云雾状扩散；
水包油保水型新城疫病毒灭活疫苗注射21日龄SPF鸡，易注射，一周即可产生抗体，2-3周抗体达到高峰，免疫持续期长，不易产生副反应，成本低廉。
水包油包水型传染性法氏囊病毒灭活疫苗注射1日龄SPF鸡，易注射，一周即可产生抗体，2-3周抗体达到高峰，免疫持续期长，不易产生副反应，成本低廉。
水包油包水型猪圆环病毒灭活疫苗免疫4周龄仔猪，易注射，一周即可产生抗体，2-3周抗体达到高峰，免疫持续期长，不易产生副反应，成本低廉。
水包油包水型猪乙型脑炎病毒灭活疫苗免疫6-7月龄种猪，易注射，一周即可产生抗体，2-3周抗体达到高峰，免疫持续期长，不易产生副反应，成本低廉。
实施例4
一种水包油包水型疫苗佐剂，由以下成分组成：聚乙烯吡咯烷酮4.5g，聚乙二醇单油酸酯4.8g，单硬脂酸甘油酯3.3g，聚乙二醇双油酸酯2.9g，白油VACCUTE-L 83g，1,2-丙二醇0.7g，司班80 0.8g。
上述各成分按顺序依次混匀，制备得到稳定的水包油包水型疫苗佐剂。将上述佐剂平均分为5份，分别制备得到水包油包水型新城疫灭活疫苗、水包油包水型传染性法氏囊病毒灭活疫苗、水包油包水型猪圆环病毒灭活疫苗、水包油包水型猪乙型脑炎病毒灭活疫苗。
以上5类疫苗均为乳白色稳定乳剂，37℃保存35天，6000rpm离心15min，无水相析出；取清洁吸管吸取少许疫苗滴于清洁冷水表面，液滴呈云雾状扩散；
水包油保水型新城疫病毒灭活疫苗注射21日龄SPF鸡，易注射，一周即可产生抗体，2-3周抗体达到高峰，免疫持续期长，不易产生副反应，成本低廉。
水包油包水型传染性法氏囊病毒灭活疫苗注射1日龄SPF鸡，易注射，一周即可产生抗体，2-3周抗体达到高峰，免疫持续期长，不易产生副反应，成本低廉。
水包油包水型猪圆环病毒灭活疫苗免疫4周龄仔猪，易注射，一周即可产生抗体，2-3周抗体达到高峰，免疫持续期长，不易产生副反应，成本低廉。
水包油包水型猪乙型脑炎病毒灭活疫苗免疫6-7月龄种猪，易注射，一周即可产生抗体，2-3周抗体达到高峰，免疫持续期长，不易产生副反应，成本低廉。
实施例5
一种水包油包水型疫苗佐剂，由以下成分组成：聚乙烯吡咯烷酮2.94g，聚乙二醇单油酸酯3.6g，单硬脂酸甘油酯2.03g，聚乙二醇双油酸酯2.33g，白油VACCUTE-L 87g，1,2-丙二醇0.9g，葡萄糖甘氨酸1.2g。
上述各成分按顺序依次混匀，制备得到稳定的水包油包水型疫苗佐剂。将上述佐剂平均分为5份，分别制备得到水包油包水型新城疫灭活疫苗、水包油包水型传染性法氏囊病毒灭活疫苗、水包油包水型猪圆环病毒灭活疫苗、水包油包水型猪乙型脑炎病毒灭活疫苗。
以上5类疫苗均为乳白色稳定乳剂，37℃保存35天，6000rpm离心15min，无水相析出；取清洁吸管吸取少许疫苗滴于清洁冷水表面，液滴呈云雾状扩散；
水包油保水型新城疫病毒灭活疫苗注射21日龄SPF鸡，易注射，一周即可产生抗体，2-3周抗体达到高峰，免疫持续期长，不易产生副反应，成本低廉。
水包油包水型传染性法氏囊病毒灭活疫苗注射1日龄SPF鸡，易注射，一周即可产生抗体，2-3周抗体达到高峰，免疫持续期长，不易产生副反应，成本低廉。
水包油包水型猪圆环病毒灭活疫苗免疫4周龄仔猪，易注射，一周即可产生抗体，2-3周抗体达到高峰，免疫持续期长，不易产生副反应，成本低廉。
水包油包水型猪乙型脑炎病毒灭活疫苗免疫6-7月龄种猪，易注射，一周即可产生抗体，2-3周抗体达到高峰，免疫持续期长，不易产生副反应，成本低廉。
实施例6
一种水包油包水型疫苗佐剂，由以下成分组成：亲水复合表面活性剂0.7～1.2％、亲油复合表面活性剂0.9～1.5％、矿物油55～75％；同时，所述水包油包水型疫苗佐剂还包括以下浓度的成分：稳定剂6～9g/L、添加剂2～5g/L，水余量。
在以上技术方案的基础上，满足以下条件：
所述亲水复合表面活性剂选自以下成分的一种或几种：月桂基葡糖苷、聚乙烯吡咯烷酮PVP-K30、聚乙二醇单油酸酯。
所述亲油复合表面活性剂选自以下成分的一种或几种：脂肪酸甲酯、单硬脂酸甘油酯、聚乙二醇双油酸酯。
所述亲水复合表面活性剂与亲油表面活性剂的质量百分比为6:4。
所述矿物油是白油。
所述白油在水包油包水型疫苗佐剂中所占的质量百分比为83～90％。
所述稳定剂是1,2-丙二醇。
所述水包油包水型疫苗佐剂还包括浓度为0.2～0.3g/mL的黄氏多糖注射液或浓度为0.2～0.3g/mL的黄氏多糖粉水溶液。
一种上述水包油包水型疫苗佐剂用于制备疫苗的应用，具体包括以下步骤：将灭活的抗原液与所述水包油包水型疫苗佐剂混合，而后以16000～19000rpm的剪切速度乳化4～7min，即得到所述疫苗；其中所述抗原液是新城疫病毒液、传染性法氏囊病毒液、猪圆环病毒液或猪乙型脑炎病毒液。
以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明。凡在本发明的申请范围内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种水包油包水型疫苗佐剂，其特征在于包括以下重量百分比的成分：亲水复合表面活性剂0.7～1.2％，亲油复合表面活性剂0.9～1.5％；同时，所述水包油包水型疫苗佐剂还包括以下浓度的成分：稳定剂6～9g/L，添加剂2～5g/L。
2.根据权利要求1所述的一种水包油包水型疫苗佐剂，其特征在于所述亲水复合表面活性剂选自以下成分的一种或几种：月桂基葡糖苷，聚乙烯吡咯烷酮PVP，聚乙二醇单油酸酯。
3.根据权利要求1所述的一种水包油包水型疫苗佐剂，其特征在于所述亲油复合表面活性剂选自以下成分的一种或几种：脂肪酸甲酯，单硬脂酸甘油酯，聚乙二醇双油酸酯。
4.根据权利要求1所述的一种水包油包水型疫苗佐剂，其特征在于所述亲水复合表面活性剂与亲油表面活性剂的质量百分比为6:4。
5.根据权利要求1所述的一种水包油包水型疫苗佐剂，其特征在于所述矿物油是白油。
6.根据权利要求5所述的一种水包油包水型疫苗佐剂，其特征在于所述白油在水包油包水型疫苗佐剂中所占的质量百分比为83～90％。
7.根据权利要求1所述的一种水包油包水型疫苗佐剂，其特征在于所述稳定剂是1,2-丙二醇。
8.根据权利要求1所述的一种水包油包水型疫苗佐剂，其特征在于所述水包油包水型疫苗佐剂还包括浓度为0.2～0.3g/mL的黄氏多糖注射液或浓度为0.2～0.3g/mL的黄氏多糖水溶液。
9.一种权利要求1所述水包油包水型疫苗佐剂用于制备疫苗的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于包括以下步骤：将灭活的抗原液与所述水包油包水型疫苗佐剂混合，而后以低速搅拌乳化4～7min，即得到所述疫苗；
其中所述抗原液是新城疫病毒液，传染性法氏囊病毒液，猪圆环病毒液或猪乙型脑炎病毒液。
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