CN109464395A

CN109464395A - 一种水包油包凝胶乳液及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN109464395A
Application number: CN201910004899.7A
Authority: CN
Inventors: 马光辉; 吴颉; 邹勇娟; 吴楠; 苗春宇; 周炜清
Original assignee: Institute of Process Engineering of CAS
Current assignee: Institute of Process Engineering of CAS
Priority date: 2019-01-03
Filing date: 2019-01-03
Publication date: 2019-03-15
Anticipated expiration: 2039-01-03
Also published as: CN109464395B

Abstract

本发明提供了一种水包油包凝胶乳液及其制备方法和应用，所述水包油包凝胶乳液包括内凝胶相、油相和外水相，所述油相包裹内凝胶相，所述外水相包裹油相。本发明提供的可用于人或动物的递送载体水包油包凝胶乳液，其内凝胶相具有良好的生物相容性、可在温和条件下制备得到、同时也具备环境刺激响应性，在温和条件下制备得到的复乳结构，大大改善了复乳稳定性差的问题；能够实现对亲疏水性物质尤其是生物活性物质的高效装载及活性保持，改善了原位凝胶只能达到局部给药的问题，最终能够在人或动物上实现靶向递送及智能型可控释放，在制备疫苗佐剂、药物缓释控释、靶向给药、疾病诊断、日化用品领域具有广泛的应用前景。

Description

一种水包油包凝胶乳液及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及一种水包油包凝胶乳液及其制备方法和应用，尤其涉及一种用作人或动物的递送载体的水包油包凝胶乳液及其制备方法和应用。

背景技术

近年来，将多种药物共同装载于一种递送载体中进行组合给药可以实现优良的协同治疗的效果，因此在药剂学领域具有广泛的应用前景。被装载药物往往具有不同的亲疏水性，目前许多载体被开发用于共同装载亲水性药物和疏水性药物，如生物可降解聚合物颗粒、脂质体、水包油包水型复合乳液、凝胶体系。

其中，水包油包水型复合乳液具有独特的“两膜三相”的结构，能够共同装载溶解于水相中的亲水性药物及溶解于油相中的疏水性药物，能够起到保护药物、缓控释放、靶向释放等多种效果。但复乳作为递送载体存在以下几个问题：(1)复乳是热力学不稳定体系，外环境的细微变化就会导致破乳，因此需要严格控制运输和储存条件，这大大限制了其作为递送载体的应用；(2)尽管两步乳化法比一步乳化法更容易控制内外水相的比例及亲水性物质的分配，但在制备过程中乳液内外水相重新聚并的比率大，导致复乳对亲水性物质的包埋率不高(一般不超过60％)；(3)为尽可能得到稳定的复乳，需要含有较大用量的自乳化表面活性剂，自乳化表面活性剂通常毒性高于普通的表面活性剂，且较大剂量的给药后容易引起刺激反应；(4)水相中装载的药物容易与油水界面接触发生失活，不利于包埋药物尤其是生物大分子活性物质的活性保持；(5)表面活性剂稳定的乳液通常不具有环境响应性。此外，凝胶体系作为药物载体，尤其是智能型水凝胶载体，成为目前研究的热点。目前智能型水凝胶体系能够有效包埋亲水性药物，形成的水凝胶具有良好的生物相容性，但(1)需要对智能型水凝胶的胶凝时间需要严格把控，胶凝过快会堵塞针管、胶凝过慢会使溶胶被体液冲散；(2)水凝胶通常只能在局部给药，大大限制了其作为药物递送载体的应用；(3)水凝胶通常由一些亲水性高分子组成，对疏水性药物的装载能力及缓释效果不佳。

针对上述问题，我们设计了利用水包油包凝胶乳液对亲疏水性药物进行共同装载及缓控释放。与水包油包水乳液剂型不同的是，我们可采用较低剂量的普通表面活性剂、在温和的条件下即可制备得到稳定的水包油包凝胶乳液，乳液由内凝胶相、油相及外水相组成。与传统制剂相比，其具有以下显著优势：(1)内凝胶相的形成降低了内水相与外水相在渗透压驱动下的物质交换，降低了外部环境对复乳的扰动，从而大大提高了乳液的稳定性及有利于亲水性药物的高效装载；(2)内凝胶相具有高含水率，且在人或动物生理条件或模拟生理条件下形成，有利于其装载的生物大分子活性物质的活性保持，具有良好的生物相容性；(3)形成的内凝胶相还具有环境响应性，在靶向区域环境变化或刺激下，水凝胶的体积或分子结构的变化会扰动复乳体系，从而智能可控地释放出靶向药物，显著提高药物在作用部位的浓度，提高了药物的有效性。

目前，已有研究在水包油包水乳液的内水相中添加聚合物或蛋白溶液，以此作为药物制剂，但聚合物或蛋白溶液缺乏环境响应性，不利于乳液中亲疏水药物的可控释放。比如，CN106511995A公开了一种水包油包水型疫苗佐剂及其应用，该发明中亲水复合表面活性剂选自月桂基葡糖苷、聚乙烯吡咯烷酮PVP-K30、聚乙二醇单油酸酯中的一种或几种，亲油复合表面活性剂选自脂肪酸甲酯、单硬脂酸甘油酯、聚乙二醇双油酸酯中的一种或几种，内水相中加入0.2-0.3g/mL黄芪糖注射液或浓度为0.2-0.3g/mL的黄芪多糖粉水溶液作为免疫增强剂，制备得到的疫苗在37℃能保存35天。但该疫苗佐剂中采用的亲水及亲油复合表面活性剂均限定在自乳化表面活性剂中，利用增加内水相粘度的方式制备得到的疫苗稳定性有所提高但提高能力有限。比如，有研究通过高温使内相中蛋白质变性，从而实现水包油包水乳液的稳定，但这种制备方式显然不适合活性物质的包埋。

另一方面，目前鲜有报道报导开发水包油包凝胶乳液以及其作为人或动物药用制剂的应用。鉴于水包油包凝胶乳液在共同高效装载亲疏水性药物、保护药物活性、减少毒副作用、提高药物的生物利用度、实现靶向递送及智能型可控释放等方面的诸多优势，使得水包油包凝胶乳液作为药物载体的开发尤为重要。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种水包油包凝胶乳液及其制备方法和应用，乳液具有良好的稳定性，可以实现对于亲水性药物的高效装载，可作为一种递送载体。

为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供了一种水包油包凝胶乳液，所述水包油包凝胶乳液包括内凝胶相、油相和外水相，所述油相包裹内凝胶相，所述外水相包裹油相。

本发明所述内凝胶相具有高含水率。

本发明提供的水包油包凝胶乳液，与传统水包油包水乳液相比，内水相中聚合物的加入增加了内水相粘度，减少了乳液制备过程中乳液重新聚合的比率，从而降低了乳液的粒径，而且内水相的凝胶化降低了内水相与外水相在渗透压驱动下的物质交换，降低了外部环境对复乳的扰动，从而大大提高了乳液的稳定性及有利于亲水性药物的高效装载。其次，内凝胶相在生理条件或模拟生理条件下形成，有利于活性物质的活性保持。此外，油相包括化妆品级、食品级以及药品级油性物质，内凝胶相由生物可降解聚合物组成，具有良好的生物相容性及安全性。再者，形成的内凝胶相具有环境响应性，与传统水凝胶相比，水包油包凝胶乳液能够主动或被动地从给药部位到达作用部位，靶区内部或外部环境的改变使得内凝胶发生诸如体积、分子结构、凝胶-溶胶的改变，从而扰动本就热力学不稳定的复乳体系，智能可控地释放亲疏水性药物，进而能够显著药物在作用部位的浓度，提高了药物的有效利用率及降低了药物对其他组织的毒副作用。

优选地，所述内凝胶相为具有环境刺激相转变特性的溶液经胶凝化得到的凝胶相。

上述相转变可在人或动物的正常生理条件或模拟生理条件下实现。

优选地，所述相转变前的溶液粘度为1mPa·s～3000mPa·s，例如可以是3000mPa·s、2500mPa·s、2000mPa·s、1800mPa·s、1500mPa·s、1200mPa·s、1000mPa·s、800mPa·s、500mPa·s、400mPa·s、300mPa·s、200mPa·s、100mPa·s、50mPa·s或1mPa·s等。进一步优选为1mPa·s～2000mPa·s。

在本发明中，相转变前的溶液粘度过大会导致凝胶相本身的聚合物分子之间相互缠绕，在低混合力度下油包水乳液的粒径偏大，还会导致溶胶-凝胶相变后得到的内凝胶相含水率偏低，进而影响其生物相容性。

优选地，所述内凝胶相为三维多孔结构，其中孔径小于0.1nm～10μm，例如可以是0.1nm、1nm、20nm、100nm、200nm、500nm、1μm、2μm、3μm、4μm、5μm、6μm、7μm、8μm、9μm或10μm等。

在本发明中，内凝胶相的孔径过大会导致形成的内凝胶相不具有三维孔状结构，甚至不能形成凝胶，而且孔径的偏大导致包埋的药物释放速率过快或者发生突释，达不到乳液及凝胶双重载体的作用。

优选地，所述内凝胶相的含水率为50％～100％。例如可以是50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％等。

优选地，所述环境刺激的方式包括利用pH值、温度、光、磁场、电场、离子强度、生物活性物质中的任意一种或至少两种的组合进行刺激；优选为利用pH、温度、离子强度中的任意一种或至少两种的组合进行刺激；

优选地，所述内凝胶相的临界相转变pH值低于8.5。临界相转变一般可以在不同组织环境下进行，例如可以是组织液pH值7.0-7.5、唾液pH值6.8-7.5、胃液pH值1.5-2.0、大肠液pH值8.4、血液pH值7.35-7.45、小肠液pH值7.6等等。

优选地，所述内凝胶相的临界相转变温度为25℃～40℃，例如可以是25℃、27℃、30℃、32℃、35℃、37℃、40℃。

在本发明中，内凝胶相的临界相变温度不能太低，太低会导致水包油包凝胶乳液制备过程中需要严格控制温度，控制不严会出现胶凝，影响乳液的形成及性质；太高导致凝胶相在人或动物的正常生理条件或模拟生理条件下不能胶凝，装载的活性物质需要具有耐温性质。这两者均大大增加了乳液制备的难度及成本。

优选地，所述内凝胶相的临界相转变离子强度为1mmol/L～160mmol/L，例如可以是1mmol/L、10mmol/L、30mmol/L、50mmol/L、100mmol/L、110mmol/L、130mmol/L、150mmol/L或160mmol/L等。

优选地，所述内凝胶相还具有环境刺激响应性，在原位、递送过程中及靶区进一步改变凝胶结构。即通过环境刺激来改变凝胶的结构。

优选地，所述环境刺激响应性的方式包括pH敏感、温度敏感、光敏感、磁场敏感、电场敏感、离子强度敏感、生物活性物质敏感中的任意一种或至少两种的组合。

所述的pH敏感指交联形成的高分子网络中含有酸性或碱性基团，在环境pH或离子强度发生变化时酸性或碱性基团电离导致水凝胶变化。优选地，基团包括-COO^-、-PO₄ ^-、OH^-等阴离子基团以及-NH₃ ⁺、-NRH₂ ⁺、-NR₂H⁺、-NR₃ ⁺等阳离子基团。其中R基可以为直链烷基、支链烷基、芳基等。

所述的温度敏感指聚合物水凝胶体积随温度变化而变化，在最低临界转变温度附近发生改变。

所述的光敏感指通过聚合物分子上光异构型、光裂解型、光二聚型等发色基团的化学变化来改变水凝胶的结构和性能。优选地，发色基团为螺吡喃、偶氮苯、1,2-苯乙烯、邻硝基苄基及其衍生物、蒽、肉桂酸、香豆素、二氧化钛、二氧化锆、氧化锌中的一种或多种。

所述的磁敏感指水凝胶一般由高分子三维网络和磁性材料组成，利用磁性材料的磁性以及磁性材料与高分子链的相互作用，使高分子凝胶在磁场作用下发生膨胀和收缩。优选地，磁性材料为铁、钴等纯金属及其氧化物、氧化硅、碳纳米管中的一种或多种。

所述的电场敏感指聚合物分子上带有可离子化的基团，对电场作用有反应。

所述的离子强度敏感指聚合物分子随着氯化钠、钾离子等不同浓度盐浓度改变产生凝胶结构改变的行为。

所述的生物活性物质敏感指有些凝胶的溶胀行为会因为特定的物质如糖类、抗原、酶等的刺激而发生改变。

优选地，所述具有环境刺激相转变特性的溶液由环境响应基质材料、交联剂及承载物质组成。本发明中，承载物质不特定某一种物质，任何可装载的物质均适用于上述溶液中。例如可以是药物、食品、化妆品或诊断试剂等等。

优选地，所述环境响应基质材料包括天然高分子化合物、天然高分子化合物的衍生物、泊洛沙姆、卡波姆、N-异丙基丙烯酰胺、聚乳酸嵌段共聚物、聚丙烯酸、聚丙烯酸钠、聚甲基丙烯酸、聚乙烯醇、聚氨酯或聚肽类中的任意一种或至少两种的组合。

优选地，所述天然高分子化合物包括壳聚糖、卡拉胶、瓜尔胶、冷结胶、纤维素、淀粉、环糊精、海藻酸、海藻酸钠、葡聚糖、木聚糖、琼脂糖、透明质酸或胶原中的任意一种或至少两种的组合。

在本发明中，所述的壳聚糖是由甲壳素在浓碱中脱去乙酰基而得到的可溶于酸性水溶液的聚氨基葡萄糖，结构单元由一分子N-乙酰氨基葡萄糖和一分子葡萄糖胺组成。壳聚糖分子链中有活性基团如羟基和氨基，可进行化学改性。壳聚糖来源丰富，价格低廉，安全无毒，具备良好的生物相容性，是一种天然阳离子性多糖化合物。研究表明，壳聚糖还具有生物吸附性，可吸附在黏膜表面，打开上皮细胞间的紧密连接，促进药物的透膜吸收。因此，壳聚糖在食品、医药、生物技术等领域被广泛研究。

优选地，酸性水溶液包括盐酸、透明质酸、谷氨酸、硝酸、乳酸、壬二酸、硫酸、琥珀酸、乙酰水杨酸、酒石酸、柠檬酸、醋酸。

优选地，酸溶液中酸摩尔浓度为0.05M-1.0M，例如0.05M、0.1M、0.15M、0.2M、0.25M、0.3M、0.35M、0.4M、0.45M、0.5M、0.55M、0.6M、0.65M、0.7M、0.75M、0.8M、0.85M、0.9M、0.95M、1.0M。

优选地，水凝胶溶液中壳聚糖及其衍生物的浓度为1mg/mL～60mg/mL，例如1mg/mL、5mg/mL、8mg/mL、10mg/mL、12mg/mL、15mg/mL、16mg/mL、20mg/mL、25mg/mL、30mg/mL、35mg/mL、40mg/mL、45mg/mL、50mg/mL、55mg/mL、60mg/mL。其中壳聚糖及其衍生物链的分子量优选为2万-100万，例如2万、5万、10万、20万、40万、60万、70万、100万。

优选地，所述天然高分子化合物的衍生物为对天然高分子化合物进行季铵化、胺化、羧甲基化、羟基化、烷基化、酰基化、磺化、硝化或卤化修饰后得到的化合物。

优选地，所述交联剂为α,β-甘油磷酸钠。

α,β-甘油磷酸钠为α-甘油磷酸钠与β-甘油磷酸钠的混合物，每天用量通常为10mL(含无水甘油磷酸钠2.16g甘油磷酸钠)。因此所选的交联剂无论在人体还是动物体内均具有良好的生物安全性。α,β-甘油磷酸钠是静脉磷补充剂，用以满足人体每天对磷的需要。α,β-甘油磷酸钠可作为成人静脉营养的磷补充剂，磷参与骨质的形成，以磷脂形式参与细胞膜的组成，同时磷与许多代谢中的酶活性有关，在能量代谢中的作用至关重要。

优选地，所述交联剂的浓度为20mg/mL～180mg/mL，例如20mg/mL、30mg/mL、40mg/mL、50mg/mL、60mg/mL、70mg/mL、80mg/mL、90mg/mL、100mg/mL、110mg/mL、120mg/mL、130mg/mL、140mg/mL、150mg/mL、160mg/mL、170mg/mL或180mg/mL等。

优选地，所述油相包括化妆品级油性物质、食品级油性物质或药品级油性物质中的任意一种或至少两种的组合。

优选地，所述油性物质包括角鲨烯、角鲨烷、芝麻油、花生油、小麦胚芽油、葵花籽油、棉籽油、玉米油、橄榄油、茶树油、棕榈油、中链甘油三酯、大豆油、油酸乙酯、油酸、亚油酸乙酯、丁酸乙酯、乳酸乙酯、月见草油、苯甲酸苄酯、鱼肝油、南瓜籽油、红花油、中链油、二甲硅油、丁香茎叶油、丁香油、丁香酚、油酰聚氧乙烯甘油酯、氢化大豆油、氢化蓖麻油、蓖麻油、生育酚、维生素E、维生素E琥珀酸酯、维生素E醋酸酯、白油、白凡士林或轻质液体石蜡中的任意一种或至少两种的组合。

优选地，所述油性物质为角鲨烯、中链甘油三酯、生育酚或白油中的任意一种或至少两种的组合。

本发明所述角鲨烯是一种脂质不皂化物，其化学名称为2,6,10,15,19,23-六甲基-2,6,10,14,18,22-二十四碳六烯，属于开链三萜，最初是从鲨鱼的肝油中发现的，角鲨烯广泛分布在人体内膜、皮肤、皮下脂肪等器官内，在植物中分布也很广。角鲨烯具有提高机体抗氧化及免疫能力、抗肿瘤等多种生理功能。

所述中链甘油三酯是由6-12个碳原子的脂肪酸组成的甘油酯，主要从椰子油或棕榈油中提取，具有良好的抗氧化性、溶解性、低粘度、低凝固点，其形成的脂肪乳剂常用非肠道给药的注射类药物中。

所述生育酚是一种脂溶性维生素，主要有四种衍生物，按甲基位置分为α、β、γ和δ四种，优选α生育酚。作为疫苗组分，能够诱导白介素6(IL-6)、趋化因子1(CXCL1)、趋化因子1(CCL11)、趋化因子24(CCL24)、白介素1β(IL-1β)等细胞因子的分泌，增加单核及巨噬细胞摄取抗原至淋巴结，具有免疫增强效果。

所述白油是由石油中精炼液体烃混合物，又叫石蜡油、矿物油，主要成分为C16-C31的正异构烷烃。因价格低廉、来源广泛，白油被广泛应用于动物疫苗的生产，是市售油乳剂疫苗的主要成分，可以增强抗原的免疫原性，诱导机体产生有效免疫应答。

优选地，所述油相还包括亲油性乳化剂。

优选地，所述亲油性乳化剂选自失水山梨醇三油酸酯、失水山梨醇三硬脂酸酯、失水山梨醇倍半油酸酯、失水山梨醇单油酸酯、单硬脂酸甘油酯、阿拉伯胶、卵磷脂、大豆磷脂、倍半油酸山梨坦、单硬脂酸山梨坦、聚乙二醇双油酸酯、阴离子乳化蜡、硬脂酸聚氧乙烯酯、聚氧乙烯脂肪醇醚、聚氧乙烯(30)二聚羟基硬脂酸脂、鲸蜡基聚乙二醇/聚丙二醇-10/1二甲基硅氧烷、PO500乳化剂、脂肪酸甲酯中的任意一种或至少两种的组合。

优选地，所述亲油性乳化剂在油相中的质量分数为1％～20％，例如可以是1％、2％、4％、6％、8％、10％、15％或20％。

优选地，所述外水相包括可注射用水、乳酸钠林格注射液、葡萄糖溶液、甘油水溶液、氯化钠溶液、木糖醇溶液、甘露醇溶液、磷酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液或柠檬酸缓冲液中的任意一种或至少两种的组合。其中，注射用溶液的pH值在5.0-9.0之间，例如5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0，对于pH值敏感型凝胶作为内水相的水包油包凝胶乳液，溶液的pH值范围可扩宽至2.0-12.0之间。

优选地，所述外水相还包括亲水性表面活性剂。

优选地，所述亲水性表面活性剂选自聚氧乙烯单月桂酸酯、聚氧乙烯月桂醚、聚氧乙烯单棕榈酸酯、聚氧乙烯蓖麻油、聚氧乙烯氢化蓖麻油、聚氧乙烯烷基醚、吐温60、吐温65、吐温80、吐温85、泊洛沙姆、聚乙烯醇、十二烷基硫酸钠、辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯、聚乙二醇-15羟基硬脂酸酯、聚乙二醇300、聚乙二醇400、乙醇、丙二醇、十八醇中的任意一种或至少两种的组合。

优选地，所述亲水性表面活性剂在外水相中的质量分数为5％～30％，例如可以是5％、6％、7％、8％、9％、10％、12％、14％、16％、18％、20％、24％、26％或30％等。

优选地，所述水包油包凝胶乳液中的乳滴的平均粒径为100nm～300μm，例如可以是100nm、200nm、500nm、1μm、2μm、5μm、10μm、20μm、30μm、40μm、50μm、60μm、70μm、80μm、90μm、100μm、110μm、150μm或200μm等，进一步优选为200nm～200μm。

优选地，所述水包油包凝胶乳液中的多分散系数PDI值小于0.5或分布宽度Span值小于1.5。

第二方面，本发明提供了一种第一方面所述的水包油包凝胶乳液的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：配制得到具有环境刺激相转变特性的溶液，在不满足临界相变的条件下加入到油相中，第一次分散后在相变条件下固化得到油相包内凝胶相乳液，而后将油相包内凝胶相乳液加入外水相中，第二次分散得到所述水包油包凝胶乳液。

优选地，所述油相包内凝胶相乳液中凝胶的粒径为50nm～30μm，例如可以是50nm、100nm、150nm、200nm、500nm、1μm、3μm、10μm、15μm、20μm、25μm或30μm等。

优选地，所述环境刺激相转变特性的溶液与油相的体积比为1:(1～30)，例如可以是1:1、2:3、3:7、1:4、1:5、1:6、1:8、1:10、1:12、1:14、1:15、1:16、1:18、1:20或1:30等。

优选地，所述油相包内凝胶相乳液与外水相的体积比为(1～5):(4～10)，例如可以是5:4、1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9或1:10。

本发明还提供了另一种水包油包凝胶乳液的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：配制得到具有环境刺激相转变特性的溶液，在不满足临界相变的条件下加入到油相中，第一次分散得到未固化的油相包内凝胶相乳液，而后将未固化的油相包内凝胶相乳液加入外水相中，第二次分散后水包油包未固化内凝胶相乳液，相变条件下固化，得到水包油包凝胶乳液。

优选地，所述油相包内凝胶相乳液中乳滴的粒径为50nm～10μm，例如可以是50nm、100nm、150nm、200nm、500nm、1μm、3μm或10μm等。

优选地，所述水包油包未固化内凝胶相乳液中内水相与外水相的体积比为(1～5):(4～60)，例如可以是5:4、1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:20、1:30、1:40、1:50或1:60等。

优选地，所述固化时间为2min～180min，例如可以是2min、10min、20min、30min、40min、50min、60min、70min、80min、90min、100min、120min或180min等。

在本发明中，上述两种制备方法均包括第一次分散和第二次分散两个分散步骤。

优选地，第一次分散的方式包括超声、均质、膜乳化、微流控、机械搅拌、磁力搅拌、涡旋、振荡中的一种。每一种分散方式均需要设置具体的操作参数，例如，超声需要设置的参数包括超声时间、间隔时间、超声功率等，膜乳化需要设置的参数包括膜管孔径、膜材、过膜压力、过膜次数等。根据分散方式及所选操作参数的不同会影响到乳液的粒径大小、分散系数、乳滴稳定性。这与传统的乳液制备过程类似，但与水作为内水相的传统水包油体系相比，水凝胶溶液作为内水相更易形成稳定的、分散性良好、更小粒径的油包水乳液。因此可对应地采用更温和的分散方式。

优选地，第二次分散的方式包括搅拌、注射器双推乳化、摇晃、振荡中的一种。根据批量大小确定所用的混合方式，例如制备1-5mL乳液体系常选用注射器双推乳化、制备0.5-50mL乳液体系可选用摇晃方式。

第三方面，本发明提供了一种如第一方面所述的水包油包凝胶乳液作为递送载体的应用。

优选地，所述递送载体装载水可溶性物质、油可溶性物质或两相不可溶物质中的任意一种或至少两种的组合。

在本发明中，水包油包凝胶乳液可装载水可溶性物质、油可溶性物质以及两相不可溶物质，其中水可溶性物质可装载于内凝胶相及外水相中的一种或两种，油可溶性物质可装载于油相中，两相不可溶物质可分散于内凝胶相、油相以及外水相中的一种或多种。

优选地，所述水可溶性物质包括生物大分子活性物质、亲水性免疫刺激剂及免疫调节剂、细胞因子中的任意一种或至少两种的组合。

优选地，所述生物大分子活性物质包括蛋白质类、多肽类或核酸类物质中的任意一种或至少两种的组合。其中，蛋白类物质包括抗原、酶、单克隆抗体、药用性蛋白中的一种或多种，进一步地抗原包括灭活或减毒活病毒、亚单位抗原、重组蛋白抗原、裂解抗原中的一种或多种。

优选地，所述生物大分子活性物质的活力保持率为85％～100％，例如可以是85％、86％、88％、90％、91％、93％、95％、96％、97％、98％、99％或100％等。

优选地，所述亲水性免疫刺激剂及免疫调节剂包括皂苷、鞭毛蛋白、脂多糖、三酰脂肽、含有CpG基序的DNA中的任意一种或至少两种的组合。

优选地，所述细胞因子包括粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、白细胞介素-12、白细胞介素-15、白细胞介素-18白细胞介素-2、白细胞介素-4、白细胞介素-21(IL-21)、干扰素、肿瘤坏死因子-α中的任意一种或至少两种的组合。

优选地，所述油可溶性物质包括脂类、疏水性免疫刺激剂及免疫调节剂、抗肿瘤药物中的任意一种或至少两种的组合。其中，脂类可以是油脂或类酯等等。

优选地，所述抗肿瘤药物包括长春花属生物碱类、紫杉烷类、埃博霉素类、抗叶酸剂、嘌呤类似物、嘧啶类似物、喜树生物碱、鬼臼生物碱、蒽环类药物、蒽醌类药物、氮芥类、亚硝脲类、烷基磺酸酯类、氮丙环类、链霉菌霉素、有机铂化合物、卟啉衍生物或蛋白酶体抑制剂中的任意一种或至少两种的组合.

优选地，所述疏水性免疫刺激剂及免疫调节剂包括单磷脂酰A、嘎德莫特、雷西莫特、咪喹莫特、单链RNA或双链RNA中的任意一种或至少两种的组合。

优选地，两相不可溶物质包括脂质体、聚合物颗粒、无机金属颗粒、天然有机颗粒、病毒样颗粒或细胞囊泡中的任意一种或至少两种的组合。

聚合物颗粒和天然有机颗粒为聚合物或天然有机物所形成的粒径较小的颗粒。

优选地，无机金属颗粒包括铂颗粒、氧化铁颗粒、金颗粒、银颗粒、硅颗粒或二硫化钼颗粒中的任意一种或至少两种的组合。

优选地，病毒样颗粒针对的疾病包括新城疫、口蹄疫、猪圆环病、猪蓝耳病、猪瘟、禽腺病毒、流感、手足口病、百日咳、白喉、破伤风、乙型肝炎、戊型肝炎、疟疾、结核病、肠道病毒71型、肺炎链球菌引起的感染性疾病、志贺氏菌引起的传染性疾病、脑膜炎球菌引起的感染性疾病或癌症中的任意一种或至少两种的组合。

优选地，细胞囊泡包括EG7肿瘤细胞囊泡、4T1肿瘤细胞囊泡、Hela肿瘤细胞囊泡、MCF肿瘤细胞囊泡、树突状细胞囊泡、巨噬细胞囊泡、肥大细胞囊泡或粒细胞囊泡中的任意一种或至少两种的组合。

优选地，装载于内凝胶相中的水可溶性物质及两相不可溶物质的包封率为85％～100％。

在本发明中，水包油包凝胶乳液还可包含药用辅料，包括着色剂、稳定剂、矫味剂、防腐剂、抗氧剂、渗透促进剂中的一种或多种。着色剂例如叶绿素、苋菜红、柠檬红、胭脂红等，稳定剂例如商品化白油佐剂中油相中加入的硬脂酸铝，矫味剂如蔗糖、单糖浆、芳香糖浆、甘油、山梨醇、甘露醇，防腐剂如山梨酸、苯甲酸钠、苯扎氯铵，抗氧剂如亚硫酸盐类、维生素类、氨基酸类，渗透促进剂如月桂氮卓酮。中国药典中虽然对药用添加剂没有明确规定，但药用添加剂对整个乳液体系存在一定影响，如体系的粘度及稳定性。优选地，所述药用添加剂在水包油包凝胶乳液中的质量分数为0-50％。

本发明还提供了一种如第一方面所述的水包油包凝胶乳液在制备疫苗佐剂、药物缓释制剂、药物控释制剂、靶向给药制剂、疾病诊断试剂或日化用品中的应用。

本发明中，所述的水包油包凝胶乳液制备疫苗佐剂，可作为人用、兽用、禽用、鱼用疫苗佐剂等；制备药物缓释制剂、药物控制制剂，可包埋盐酸二甲双弧用于糖尿病的治疗、包埋降压药硝苯地平、包埋丙戊酸钠用于治疗癫痫发作、包埋咪唑斯汀用于治疗过敏性症状、包埋吡贝地尔用于帕金森病的治疗、包埋盐酸文拉法辛用于治疗抑郁症、包埋阿昔洛韦用于治疗疱疹感染等；制备靶向给药系统，可作为抗肿瘤药物的靶向递送、胰岛素给药系统等。所述的乳液制剂并不限制在上述提到的具体疾病中。

本发明中，所述水包油包凝胶乳液可采用的免疫接种或给药方式包括口服给药、静脉注射、肌肉注射、皮下注射、皮内注射、舌下含服、直肠给药、阴道给药、滴眼给药、耳内给药、鼻腔喷雾、口腔喷雾、经皮给药、瘤内注射、淋巴结给药中的一种。免疫接种或给药方式依据方便和治愈患者为宗旨。

本发明提供的水包油包凝胶乳液，非常适用于人或动物的递送载体。

相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明提供的水包油包凝胶乳液，内凝胶相的形成在人或动物生理条件或模拟生理条件下形成，制备过程温和且制备得到的乳液稳定，大大改善了复乳稳定性差的问题，且油相的加入能够实现对疏水性药物的有效装载；温和条件下形成的内凝胶相具有高含水率，由可降解聚合物组成，具有良好的生物相容性及安全性，能够实现对亲水性物质尤其是生物活性物质的高效装载及活性保持。

(2)本发明提供的水包油包凝胶乳液，采用的油相可为化妆品级、食品级以及药品级油性物质，作为疫苗佐剂具有明显的优势。目前，油乳佐剂能显著提升体液免疫水平却不能诱导长效的细胞免疫水平，新型颗粒佐剂能显著提升细胞免疫水平却具有有限的体液免疫增强效果。与油乳佐剂及固体颗粒相比，水包油包凝胶乳液不仅能够实现乳液在注射部位大量募集巨噬细胞、单核细胞和中性粒细胞等抗原提呈细胞、上调细胞因子和趋化因子等的分泌水平、促进树突细胞摄取抗原、活化免疫环境等作用；内凝胶相还能作为凝胶颗粒，能携带抗原被大量抗原提呈细胞摄取，在溶酶体等酸性环境下实现抗原逃逸到细胞质中，从而促进其交叉提呈，从而实现对抗原的交叉提呈，进一步活化T细胞。因此水包油包凝胶乳液作为疫苗佐剂，能够同时增强体液免疫及细胞免疫，从而达到更好的免疫增强效果。

(3)本发明提供的水包油包凝胶乳液，能够同时装载水可溶性物质、油可溶性物质以及两相不可溶物质。目前许多靶向载体需要经过复杂的亲疏水性修饰，而且制备过程复杂。而水包油包凝胶乳液能够高效转载亲疏水性药物，而且对于一些纳米磁性材料等两相不可溶物质也能实现装载，利用水凝胶的磁敏感等环境敏感性实现靶向递送，降低了诸如化疗药物等对全身的毒副作用；且水凝胶的智能性在肿瘤等靶向部位实现可控释放具有明显疗效-剂量依赖关系的化疗药物、释放能够改变肿瘤微环境的免疫药物。作为肿瘤靶向递送体系，能够将化疗、热疗、免疫疗法等多种治疗方法结合起来，实现协同增效。因此水包油包凝胶乳液在靶向给药领域具有巨大的前景。

附图说明

图1是本发明实施例1中智能型水凝胶的流变性能图。

图2是本发明实施例4中制备得到的油包凝胶乳液的粒径分布图。

图3是本发明实施例5中制备的水包油包凝胶乳液的直观图。

图4是本发明实施例5中制备的水包油包凝胶乳液的光学显微镜图(标尺10μm)。

图5是本发明实施例5中制备的水包油包凝胶乳液的粒径分布图。

图6是本发明实施例5中制备的水包油包凝胶乳液中各组分分布的激光共聚焦图(标尺5μm)。

图7A是本发明实施例9中水包油包凝胶乳液在pH＝2.0下平衡10min后乳液的光学显微镜图(标尺10μm)。

图7B是本发明实施例9中水包油包凝胶乳液在pH＝2.0下平衡30min后乳液的光学显微镜图(标尺10μm)。

图8是本发明实施例10中制备的水包油包凝胶乳液不同时间在注射部位的缓释情况图。

图9是本发明实施例13中制备的水包油包凝胶乳液在体内的分布图。

具体实施方式

下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。

本发明实施例中使用的原料如下表1所示：

表1

壳聚糖季铵盐的合成工艺如下：将一定量的壳聚糖粉末分散于异丙醇中，转移至三口烧瓶内，在搅拌状态下加热并控制温度恒定于80℃；将季铵化试剂2,3-环氧丙基三甲基氯化铵(EPTAC)溶解于一定量的纯水中，装入恒压分液漏斗内，调整合适加样速率，逐滴加入上述EPTAC水溶液至壳聚糖异丙醇混悬液中，使其与壳聚糖在80℃下恒温反应7h。反应完毕后抽滤收集制得的壳聚糖季铵盐(HTCC)沉淀，并加入冷丙酮于4℃搅拌过夜洗涤沉淀。次日再次使用冷丙酮抽滤洗涤3次，收集洗涤后的终产物，于60℃烘箱烘干即得到HTCC。

本发明实施例中用到的仪器如下表2所示：

表2

本发明以下实施例中颗粒或乳滴的粒径检测方法如下：

纳米级颗粒及乳滴粒径用zeta粒度仪分析仪检测，具体操作如下：制备得到的油包水乳液或油包凝胶乳液加入10倍体积的油相，混匀后取1mL加入样品池中检测；制备得到的水包油包凝胶乳液分散于10倍体积的外水相中，混匀后放入样品池中检测。粒径均一性由分散系数(Polydispersity，PDI)表征，PDI越小说明粒径分布越窄、均一性越好。

微米级颗粒及乳滴粒径用激光粒度仪检测，具体操作如下：制备得到的水凝胶颗粒先固化洗涤，干燥后取5mg颗粒分散于5mL去离子水中，混匀后放入样品池中检测；制备得到的水包油包凝胶乳液直接取1mL逐滴加入样品池中检测。粒径均一性由粒径分布系数(Span)值表示，其值越小表明粒径越均一。

实施例1

本实施例制备具有温度刺激相转变特性的溶胶

采用电子天平准确称取0.3g的基质材料壳聚糖季铵盐(分子量为70万，脱乙酰度为90％，季铵取代度40％)及1.4g的甘油磷酸钠。将壳聚糖季铵盐加入8mL 0.25M乳酸溶液中，25℃磁力搅拌过夜溶解，得到壳聚糖季铵盐溶液。甘油磷酸钠溶于2mL去离子水中，涡旋使之完全溶解，得到甘油磷酸钠溶液。在4℃下将壳聚糖季铵盐溶液及甘油磷酸钠溶液混合均匀，制备得到了具有温度敏感相转变特性的溶液。制备得到溶胶用流变仪检测得到对应的流变性能曲线，其中弹性模量G'小于粘性模量G”代表处于水凝胶溶液状态，弹性模量G'大于粘性模量G”表示凝胶已经胶凝成固体。流变性能曲线如图1所示。胶凝后的固体在特定的条件下具有环境刺激响应性。

本实施例还可采用其他材料制备得到温度刺激相转变特性的溶液，其制备步骤与实施例1相似，具体参数及结果如表3所示。

表3

实施例2

本实施例制备具有pH刺激相转变特性的溶胶

用电子天平准确称取1.5g的卡波姆971P加入100mL去离子水中，得到卡波姆溶液；用电子天平准确称取18g的泊洛沙姆407加入100mL去离子水中，放在4℃完全溶解备用，得到泊洛沙姆溶液。用移液枪取1mL卡波姆溶液和1mL泊洛沙姆溶液混合搅拌均匀，即可制备得到具有pH敏感刺激相转变特性的溶胶。制备得到的溶胶用流变仪检测临界相变pH。配制pH＝2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、7.4、8.0、9.0的缓冲溶液，将凝胶与缓冲溶液以1:9的体积比混合，25℃下以20rpm的搅拌速度磁力搅拌，平衡10min后用流变仪检测凝胶粘度，考察pH对凝胶粘度的影响。在pH-粘度折线图中，pH-粘度折线斜率突增，以突增点的pH作为临界相变pH。本实施例中流变仪检测得到临界相变pH＝7.4。

实施例3

本实施例制备具有离子强度刺激相转变特性的溶胶

用电子天平准确称取0.6g的脱乙酰结冷胶缓慢加入100mL去离子水中，加热至形成澄清的溶液，自然冷却至室温，得到结冷胶溶液；用电子天平准确称取10g的泊洛沙姆407加入100mL去离子水中，放在4℃完全溶解备用，得到泊洛沙姆溶液。用移液枪取1mL结冷胶溶液和1mL泊洛沙姆溶液混合搅拌均匀，即可制备得到具有离子强度刺激相转变特性的溶胶。制备得到的溶胶用流变仪检测临界相变离子强度，具体步骤如下：配制模拟体液(Na⁺～150mmol/L，K⁺～41mmol/L，Ca²⁺～8mmol/L)以及相当于模拟体液离子强度0.25、0.5、0.75、1.2倍的电解质溶液，将凝胶与电解质液以1:9的体积比混合，25℃下以20rpm的搅拌速度磁力搅拌，平衡10min后用流变仪检测凝胶粘度，考察离子强度对凝胶粘度的影响。在离子强度-粘度折线图中，离子强度-粘度折线斜率突增，以突增点的离子强度作为临界相变离子强度。本实施例中流变仪检测得到临界相变离子强度为120mmol/L。

实施例4

本实施例通过实施例1-3中制备得到的水凝胶溶液制备油相包内凝胶相的乳液

在5mL油性物质白油中加入5％的油溶性表面活性剂聚氧乙烯(30)二聚羟基硬脂酸脂，为使油溶性表面活性剂溶解，可升温至40℃，搅拌混合均匀得到油相，取3mL备用。用移液枪取2mL壳聚糖季铵盐-甘油磷酸钠溶胶，在4℃下滴加入3mL油相中，用IKA均质机均质(12000rpm，4min)，即可得到内含溶胶的油包水乳液。制备得到的油包水乳液粒径为150nm，PDI为0.142，检测得到的粒径如图2所示。

本实施例还可采用工艺制备得到内含溶胶的油包水乳液，其制备步骤与实施例4相似，具体参数及结果如表4所示。这里水凝胶溶液简化为各溶胶的基质成分。

表4

实施例5

本实施例利用实施例4制备的油相包凝胶相乳液制备水包油包凝胶乳液

这里可以选择在制备水包油包凝胶乳液前，利用具有环境响应相转变特性的溶胶，制备得到油相包凝胶相乳液，再制备得到水包油包凝胶乳液；也可以在制备得到水包油包未固化凝胶相乳液后，利用溶胶相转变特性制备得到水包油包凝胶乳液。在本实施例中，采用前一种方式。

将实施例4中的2号油包水乳液放置在37℃下15min，即可固化得到油包凝胶乳液；在2mL注射用水中加入10％的水溶性表面活性剂吐温80，搅拌混合均匀得到外水相，将外水相放在磁力搅拌器上搅拌(400rpm)，用移液枪取1mL油包凝胶乳液，缓慢加入外水相中，混合5min，制备得到水包油包凝胶乳液，乳滴表观状态如图3所示，光学显微镜图如图4所示，颗粒体积粒径分布图如图5所示，激光共聚焦考察其各相分布如图6所示。

激光共聚焦考察各相分布时需要对乳液各组分进行标记，标记步骤如下：

壳聚糖标记-将称取的壳聚糖粉末溶于酸溶液中，调节pH值调节至约9.0，用移液枪移取一定体积的Cy5SE荧光染料(1mg/mL溶于DMSO中)至壳聚糖溶液中，混合均匀，在震荡器上4℃条件下避光震荡过夜。然后加入乙醇胺终止反应。然后在冷冻干燥条件下得到荧光标记的壳聚糖粉末。最后把标记好的壳聚糖溶解于乳酸溶液中。

复合油相标记-取适量尼罗红荧光染料分散于油相中，4℃条件下避光震荡过夜，临用前10000g离心5min，取上清液。

本实施例还可采用工艺制备得到水包油包凝胶乳液，其制备步骤与实施例5相似，其中油包水乳液的标号与实施例4中的标号对应，具体参数及结果如表5所示。

表5

实施例6

本实施例制备装载物质的水包油包凝胶乳液

采用与实施例1-5类似的方法制备得到装载亲疏水性物质的水包油包凝胶乳液。

采用电子天平准确称取0.15g的基质材料壳聚糖(分子量为40万，脱乙酰度为90％)及0.9g的甘油磷酸钠。将壳聚糖加入4mL 0.3M乳酸溶液中，25℃磁力搅拌过夜溶解，得到壳聚糖溶液。甘油磷酸钠溶于1mL去离子水中，涡旋使之完全溶解，得到甘油磷酸钠溶液。在4℃下将壳聚糖溶液及甘油磷酸钠溶液混合均匀，制备得到了具有温度敏感相转变特性的溶胶。采用电子天平准确称取10mg的亲水性物质OVA，溶解于5mL磷酸盐缓冲液中，得到亲水性物质OVA分散液。取壳聚糖溶液-甘油磷酸钠溶胶与OVA分散液以1:1的体积比混合，得到装载亲水性物质OVA的溶胶。

在白油中加入10％的油溶性表面活性剂聚氧乙烯(30)二聚羟基硬脂酸脂，为油溶性表面活性剂的溶解，可升温至40℃，搅拌混合均匀得到油相I。采用电子天平准确称取1mg单磷酰脂A，分散至1mL白油中，4℃下超声分散30min，得到油相II。取油相I与油相II以体积比1:1混合，即可得到装载疏水性物质单磷酰脂A的油相。

用移液枪取0.4mL装载OVA的溶胶，在4℃下滴加入0.6mL装载单磷酰脂A的油相中，振荡(频率45Hz，15min)，即可得到内含溶胶的油包水乳液。将油包水乳液放置在37℃下20min，即可固化得到油包凝胶乳液；在2mL注射用水中加入10％的水溶性表面活性剂吐温80，搅拌混合均匀得到外水相，将外水相加入油包凝胶乳液中，继续振荡(频率10Hz，15min)，制备得到水包油包凝胶乳液。检测得到乳液粒径为1281nm，OVA的包埋率为90％，单磷酰脂A的包埋率为95.2％。其他物质的包埋方式类似。此外，水包油包凝胶乳液中外水相中的装载物质与内凝胶相类似，为简单混合，这里不考虑包埋率。

制备得到的油包水乳液用如下检测方法检测包埋率：

准确量取1mL包埋抗原或药物的乳液，置于透析袋中，准确量取10mL去离子水，将透析袋放置于去离子水中，4℃条件下混悬过夜，第二天取透析袋外溶液。同时也设置一组同样体积的不包埋抗原或药物的乳液作为空白对照。亲水化合物采用micro-BCA试剂盒、Lorry试剂或其他适宜的检测方法测定。疏水化合物采用高效液相色谱(HPLC)或其他适宜的检测方法测定。抗原或药物包埋率按以下公式计算：包埋率＝(包埋前抗原或药物量—透析袋外上清中抗原或药物量)/包埋前抗原或药物量×100％。

本实施例还可采用工艺制备得到装载物质的水包油包凝胶乳液，其制备步骤与实施例6相似，具体参数及结果如表6所示。

表6

实施例7

本实施例对水包油包凝胶乳液的稳定性考察

此处采用与实施例6相似的方法制备得到装载亲疏水性物质的水包油包凝胶乳液。对照A为商品化的装载有同样亲疏水性物质的ISA206复乳。稳定性考察在25℃。从表7可以看出，优化制备得到的乳液具有良好的稳定性。

表7

实施例8

本实施例对水包油包凝胶乳液装载的生物活性物质活力评价

采用与实施例6相似的方法制备得到装载超氧化物歧化酶的水包油包凝胶乳液。再使用相同的油相及表面活性剂利用更严苛的条件制备得到相同粒径的水包油包水乳液，同时制备得到与水包油包凝胶乳液相同粒径的凝胶颗粒(制备方法见实施例9)。制备好的制剂放在4℃冰箱内一周。采用超氧化物歧化酶(SOD)检测试剂盒检测装载酶的活性。对比装载SOD的装载率以及活力保持率，如表8所示，发现水包油包凝胶乳液制备条件温和，有利于生物活性物质的活性保持，而且制备得到的乳液内SOD具有良好的储存稳定性。

表8

制剂	装载率	刚制备完的SOD活力保持率	1周后SOD活力保持率
				水包油包凝胶乳液	95.2％	98.4％	91.4％
水包油包水乳液	75.5％	71.2％	21.7％
				凝胶颗粒	83.1％	80.5％	60.8％

实施例9

本实施例对水包油包凝胶乳液的环境响应性评价

此处采用与实施例6相似的方法制备得到装载亲疏水性物质的水包油包凝胶乳液。实施例6中的凝胶相具有pH敏感性，检测方法如下：配制pH＝7.4、2.0两种不同pH的磷酸盐缓冲液，离子强度I均为0.1，温度均为37℃。取两份等体积的水包油包凝胶乳液，一份加入等体积的pH＝7.4的磷酸盐缓冲液，一份加入pH＝2.0的磷酸盐缓冲液，放入恒温振荡器中平衡一定时间，取样观察。

发现加入pH＝7.4磷酸盐缓冲液的乳液并没有出现分层。而加入pH＝2.0磷酸盐缓冲液的乳液出现了明显的油层和水层，取样在光学显微镜下观察，如图7A所示，平衡10min时乳液已经出现了严重变形和粒径增大；如图7B所示，平衡30min时乳液出现完全破裂。可以看出制备得到的水包油包凝胶乳液具有内凝胶相一致的环境响应性，从而使得物质从乳液中智能释放。

实施例10

本实施例测试水包油包凝胶乳液在体内的释放曲线

采用与实施例6相似的方法制备得到装载亲疏水性物质的水包油包凝胶乳液。实验首先用NHS-Cy7染料对亲水性物质OVA进行标记，具体方法是将一定量的染料加入OVA分散液中，在4℃垂直混悬12h，之后通过超滤离心的方式去除游离染料，将收集到的荧光OVA通过BCA试剂盒确定蛋白浓度。其余操作步骤与实施例6一致，制备得到的水包油包凝胶乳液粒径为1203±17nm，PDI为0.243。设置对照组：单纯OVA组、水包油包水组、凝胶颗粒组。其中水包油包水组为实施例8中的对照品A。

凝胶颗粒的制备步骤如下：采用电子天平准确称取0.15g的基质材料壳聚糖(分子量为40万，脱乙酰度为90％)及0.9g的甘油磷酸钠。将壳聚糖加入4mL 0.3M乳酸溶液中，25℃磁力搅拌过夜溶解，得到壳聚糖溶液。甘油磷酸钠溶于1mL去离子水中，涡旋使之完全溶解，得到甘油磷酸钠溶液。取壳聚糖溶液-甘油磷酸钠溶胶与OVA分散液以1:1的体积比混合，得到装载亲水性物质OVA的溶胶。在4℃下将壳聚糖溶液及甘油磷酸钠溶液混合均匀，制备得到了具有温度敏感相转变特性的溶胶。采用电子天平准确称取10mg的亲水性物质OVA，溶解于5mL磷酸盐缓冲液中，得到亲水性物质OVA分散液。取壳聚糖溶液-甘油磷酸钠溶胶与OVA分散液以1:1的体积比混合，得到装载亲水性物质OVA的溶胶。37℃固化30min，加水至10mL，2档均质30s；加水至30mL，高压预均质10min，得到包埋OVA的凝胶颗粒。制备得到的凝胶颗粒粒径为1167±53nm，PDI为0.307。

将实验组及对照组的制剂用1mL注射器在Balb/c小鼠后背部皮下注射，每只注射100μL，异氟烷麻醉后放入小动物成像系统采集图像。图8表示各制剂在不同时间点注射部位荧光强度与初始荧光强度的比值，发现与各对照组相比，水包油包凝胶乳液具有更加明显的缓释作用。

实施例11

本实施例对水包油包凝胶乳液的安全性评价

采用与实施例6相似的方法制备得到装载亲疏水性物质的水包油包凝胶乳液。分布通过皮下注射、口服、滴鼻三种途径对Balb/c小鼠进行给药，给药剂量均为100μL/只，0天-14天分别给药一次。分别于0-14-28天称取小鼠体重变化情况，如表9所示。35天时取血，10000g离心10min分离得到血清，检测血清中的生化指标：心肌指标(乳酸脱氢酶LDH)、肾功指标(尿素氮BUN)、肝功指标(丙氨酸转氨酶ALT、天门冬氨酸转氨酶AST、碱性磷酸酶ALP)，如表10所示。表9表明水包油包凝胶乳液对小鼠不会造成体重的下降，表10表明其对主要的器官并没有明显毒性，安全性良好。

表9

	空白组	皮下注射	口服	滴鼻
					0天	16.9±0.7g	16.6±0.9g	16.9±0.8g	16.9±1.0g
14天	19.0±0.8g	18.8±0.5g	19.0±0.8g	18.8±0.7g
					28天	20.5±0.8g	20.7±0.2g	20.6±1.8g	20.5±0.6g

表10

组别	ALT	ALP	LDH	BUN	AST
						空白对照组	40.0±10.0	205.8±24.2	1167.5±272.5	8.2±2.0	78.3±8.3
皮下注射	41.7±6.7	206.7±13.3	1063.3±156.7	8.0±0.4	80±10.0
						口服	41.7±6.7	200.0±20.0	940.8±109.2	8.2±1.6	85.8±14.2
滴鼻	41.7±3.3	205.0±15.0	1080.0±150.0	8.2±0.3	86.7±13.3

实施例12

本实施例对水包油包凝胶乳液作为免疫佐剂的效果评价

采用与实施例6相似的方法制备得到装载亲疏水性物质的水包油包凝胶乳液，不同的在于作为免疫佐剂需要进行无菌处理。具体步骤如下：

称取分子量10万的壳聚糖0.2g，将壳聚糖溶解于4mL 0.3M乳酸中，得到壳聚糖溶液，过滤除菌；称取甘油磷酸钠1.4g，溶于1mL去离子水中，得到甘油磷酸钠溶液，过滤除菌；无菌配制含有5mL一定浓度抗原的水溶液；在4℃下将壳聚糖溶液、甘油磷酸钠溶液与抗原水溶液混合，制备得到10mL溶胶；称取0.1g失水山梨醇三油酸酯溶解于2mL角鲨烯中，制备得到油相，过滤除菌；将1mL内水相加入2mL油相中，不同制备条件下得到油包水乳液；乳液放置在37℃固化60min，得到油包凝胶乳液；称取不同剂量的亲水性表面活性剂溶解于2mL磷酸盐缓冲液中，得到外水相，过滤除菌；在400rpm磁力搅拌下，将油包凝胶乳液加入外水相中，搅拌10min，即可得到疫苗水包油包凝胶乳液。用制备得到的疫苗开展动物实验。

实验选用BALB/c小鼠(6～8周龄)，性别为雌鼠，每组6只，适应环境3～5天，自由给食与饮水。分别于第0天和14天进行第一次和第二次免疫，每只每次肌肉注射100μL，28天眼眶取血并分离血清测定血清中抗原特异性抗体水平，第35天处死小鼠，取脾培养脾细胞一段时间后，用ELISA试剂盒检测培养液上清中细胞因子IFN-γ的浓度。结果如表11所示。

表11

从表11可以看出，水包油包凝胶乳液能够显著提高IgG抗体滴度的分泌，促进体液免疫应答；同时也能促进IFN-γ(主要介导细胞内感染病原菌的免疫应答，有助于杀伤胞内菌、病毒等胞内感染型微生物)的分泌，促进细胞免疫应答。因此，水包油包凝胶乳液能够同时增强体液及细胞免疫，产生更加平衡的免疫应答。

实施例13

本实施例对水包油包凝胶乳液的靶向性进行评价

采用与实施例6相似的方法制备得到具有肿瘤靶向性的水包油包凝胶乳液，具体步骤如下：

采用电子天平准确称取0.15g的基质材料壳聚糖(分子量为40万，脱乙酰度为90％)及0.9g的甘油磷酸钠。用Cy7标记壳聚糖。将标记好的壳聚糖加入8mL 0.3M乳酸溶液中，甘油磷酸钠溶于2mL去离子水中，在4℃下将壳聚糖溶液及甘油磷酸钠溶液混合均匀，制备得到了具有温度敏感相转变特性的溶胶。采用电子天平准确称取10mgOVA，加入壳聚糖溶液-甘油磷酸钠溶胶中混合。在角鲨烯中加入5％的油溶性表面活性剂卵磷脂及25mg阿霉素，得到油相。用移液枪取0.4mL溶胶，在4℃下滴加入0.6mL油相中，超声(80W，60s)，即可得到内含溶胶的油包水乳液。将油包水乳液放置在37℃下40min，即可固化得到油包凝胶乳液；在2mL注射用水中加入4％的水溶性表面活性剂吐温80，搅拌混合均匀得到外水相，将外水相加入油包凝胶乳液中，继续振荡(频率30Hz，15min)，制备得到水包油包凝胶乳液。检测得到OVA的包埋率为94.7％，阿霉素的包埋率为91.4％。乳液的粒径为200±31nm，PDI为0.290。

选择6-8周龄雌性Balb/c小鼠，每只在右前腿处皮下接种105个EG7肿瘤细胞，肿瘤生长10天后将乳液进行尾静脉注射。在注射8小时后，采用小动物成像仪(In Vivo ImageSystem.Kodak)观察乳液的体内荧光分布，如图9所示，与空白组相比，除了部分肝聚集之外，大部分水包油包凝胶乳液都靶向到肿瘤部位，证明利用实体瘤组织的高通透性和滞留效应(EPR效应)，水包油包凝胶乳液能够被动靶向至肿瘤部位，适合用作被动靶向给药制剂。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的工艺方法，但本发明并不局限于上述工艺步骤，即不意味着本发明必须依赖上述工艺步骤才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims

1.一种水包油包凝胶乳液，其特征在于，所述水包油包凝胶乳液包括内凝胶相、油相和外水相，所述油相包裹内凝胶相，所述外水相包裹油相。

2.根据权利要求1所述的水包油包凝胶乳液，其特征在于，所述内凝胶相为具有环境刺激相转变特性的溶液经胶凝化得到的凝胶相；

优选地，所述相转变在人或动物的正常生理条件下或模拟生理条件下进行；

优选地，所述相转变前的溶液粘度为1mPa·s～3000mPa·s；进一步优选为1mPa·s～2000mPa·s；

优选地，所述内凝胶相为三维多孔结构，其中孔径小于0.1nm～10μm；

优选地，所述内凝胶相的含水率为50％～100％；

优选地，所述内凝胶相的临界相转变pH值低于8.5；

优选地，所述内凝胶相的临界相转变温度为25℃～40℃；

优选地，所述内凝胶相的临界相转变离子强度为1mmol/L～160mmol/L；

优选地，所述内凝胶相还具有环境刺激响应性，在原位、递送过程中及靶区进一步改变凝胶结构；

优选地，所述环境刺激响应性包括pH敏感、温度敏感、光敏感、磁场敏感、电场敏感、离子强度敏感或生物活性物质敏感中的任意一种或至少两种的组合。

3.根据权利要求1或2所述的水包油包凝胶乳液，其特征在于，所述具有环境刺激相转变特性的溶液由环境响应基质材料、交联剂及承载物质组成；

优选地，所述环境响应基质材料包括天然高分子化合物、天然高分子化合物的衍生物、泊洛沙姆、卡波姆、N-异丙基丙烯酰胺、聚乳酸嵌段共聚物、聚丙烯酸、聚丙烯酸钠、聚甲基丙烯酸、聚乙烯醇、聚氨酯或聚肽类中的任意一种或至少两种的组合；

优选地，所述天然高分子化合物包括壳聚糖、卡拉胶、瓜尔胶、冷结胶、纤维素、淀粉、环糊精、海藻酸、海藻酸钠、葡聚糖、木聚糖、琼脂糖、透明质酸或胶原中的任意一种或至少两种的组合；

4.根据权利要求1-3中任一项所述的水包油包凝胶乳液，其特征在于，所述油相包括化妆品级油性物质、食品级油性物质或药品级油性物质中的任意一种或至少两种的组合；

优选地，所述油性物质包括角鲨烯、角鲨烷、芝麻油、花生油、小麦胚芽油、葵花籽油、棉籽油、玉米油、橄榄油、茶树油、棕榈油、中链甘油三酯、大豆油、油酸乙酯、油酸、亚油酸乙酯、丁酸乙酯、乳酸乙酯、月见草油、苯甲酸苄酯、鱼肝油、南瓜籽油、红花油、中链油、二甲硅油、丁香茎叶油、丁香油、丁香酚、油酰聚氧乙烯甘油酯、氢化大豆油、氢化蓖麻油、蓖麻油、生育酚、维生素E、维生素E琥珀酸酯、维生素E醋酸酯、白油、白凡士林或轻质液体石蜡中的任意一种或至少两种的组合；

优选地，所述油性物质为角鲨烯、中链甘油三酯、生育酚或白油中的任意一种或至少两种的组合；

优选地，所述油相还包括亲油性乳化剂；

优选地，所述亲油性乳化剂选自失水山梨醇三油酸酯、失水山梨醇三硬脂酸酯、失水山梨醇倍半油酸酯、失水山梨醇单油酸酯、单硬脂酸甘油酯、阿拉伯胶、卵磷脂、大豆磷脂、倍半油酸山梨坦、单硬脂酸山梨坦、聚乙二醇双油酸酯、阴离子乳化蜡、硬脂酸聚氧乙烯酯、聚氧乙烯脂肪醇醚、聚氧乙烯(30)二聚羟基硬脂酸脂、鲸蜡基聚乙二醇/聚丙二醇-10/1二甲基硅氧烷、PO500乳化剂、脂肪酸甲酯中的任意一种或至少两种的组合；

优选地，所述亲油性乳化剂在油相中的质量分数为1％～20％。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的水包油包凝胶乳液，其特征在于，所述外水相包括可注射用水、乳酸钠林格注射液、葡萄糖溶液、甘油水溶液、氯化钠溶液、木糖醇溶液、甘露醇溶液、磷酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液或柠檬酸缓冲液中的任意一种或至少两种的组合；

优选地，所述外水相还包括亲水性表面活性剂；

优选地，所述亲水性表面活性剂选自聚氧乙烯单月桂酸酯、聚氧乙烯月桂醚、聚氧乙烯单棕榈酸酯、聚氧乙烯蓖麻油、聚氧乙烯氢化蓖麻油、聚氧乙烯烷基醚、吐温60、吐温65、吐温80、吐温85、泊洛沙姆、聚乙烯醇、十二烷基硫酸钠、辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯、聚乙二醇-15羟基硬脂酸酯、聚乙二醇300、聚乙二醇400、乙醇、丙二醇、十八醇中的任意一种或至少两种的组合；

优选地，所述亲水性表面活性剂在外水相中的质量分数为5％～30％。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的水包油包凝胶乳液，其特征在于，所述水包油包凝胶乳液中的乳滴的平均粒径为100nm～300μm，进一步优选为200nm～200μm；

7.根据权利要求1-6所述的水包油包凝胶乳液的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：配制得到具有环境刺激相转变特性的溶液，在不满足临界相变的条件下加入到油相中，第一次分散后在相变条件下固化得到油相包内凝胶相乳液，而后将油相包内凝胶相乳液加入外水相中，第二次分散得到所述水包油包凝胶乳液；

优选地，所述油相包内凝胶相乳液中凝胶的粒径为50nm～30μm；

优选地，所述环境刺激相转变特性的溶液与油相的体积比为1:(1～30)；

优选地，所述油相包内凝胶相乳液与外水相的体积比为(1～5):(4～10)。

8.根据权利要求1-6所述的水包油包凝胶乳液的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：配制得到具有环境刺激相转变特性的溶液，在不满足临界相变的条件下加入到油相中，第一次分散得到未固化的油相包内凝胶相乳液，而后将未固化的油相包内凝胶相乳液加入外水相中，第二次分散后水包油包未固化内凝胶相乳液，相变条件下固化，得到水包油包凝胶乳液；

优选地，所述油相包内凝胶相乳液中乳滴的粒径为50nm～10μm；

优选地，所述水包油包未固化内凝胶相乳液中内水相与外水相的体积比为(1～5):(4～60)；

优选地，所述固化时间为2min～180min。

9.根据权利要求1-6中任一项所述的水包油包凝胶乳液作为递送载体的应用；

优选地，所述递送载体装载水可溶性物质、油可溶性物质或两相不可溶物质中的任意一种或至少两种的组合；

优选地，所述水可溶性物质包括生物大分子活性物质、亲水性免疫刺激剂及免疫调节剂、细胞因子中的任意一种或至少两种的组合；

优选地，所述生物大分子活性物质包括蛋白质类、多肽类或核酸类物质中的任意一种或至少两种的组合；

优选地，所述生物大分子活性物质的活力保持率为85％～100％；

优选地，所述亲水性免疫刺激剂及免疫调节剂包括皂苷、鞭毛蛋白、脂多糖、三酰脂肽、含有CpG基序的DNA中的任意一种或至少两种的组合；

优选地，所述细胞因子包括粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、白细胞介素-12、白细胞介素-15、白细胞介素-18白细胞介素-2、白细胞介素-4、白细胞介素-21(IL-21)、干扰素、肿瘤坏死因子-α中的任意一种或至少两种的组合；

优选地，所述油可溶性物质包括脂类、疏水性免疫刺激剂及免疫调节剂、抗肿瘤药物中的任意一种或至少两种的组合；

优选地，所述抗肿瘤药物包括长春花属生物碱类、紫杉烷类、埃博霉素类、抗叶酸剂、嘌呤类似物、嘧啶类似物、喜树生物碱、鬼臼生物碱、蒽环类药物、蒽醌类药物、氮芥类、亚硝脲类、烷基磺酸酯类、氮丙环类、链霉菌霉素、有机铂化合物、卟啉衍生物或蛋白酶体抑制剂中的任意一种或至少两种的组合；

优选地，所述疏水性免疫刺激剂及免疫调节剂包括单磷脂酰A、嘎德莫特、雷西莫特、咪喹莫特、单链RNA或双链RNA中的任意一种或至少两种的组合；

优选地，两相不可溶物质包括脂质体、聚合物颗粒、无机金属颗粒、天然有机颗粒、病毒样颗粒或细胞囊泡中的任意一种或至少两种的组合；

优选地，无机金属颗粒包括铂颗粒、氧化铁颗粒、金颗粒、银颗粒、硅颗粒或二硫化钼颗粒中的任意一种或至少两种的组合；

优选地，病毒样颗粒针对的疾病包括新城疫、口蹄疫、猪圆环病、猪蓝耳病、猪瘟、禽腺病毒、流感、手足口病、百日咳、白喉、破伤风、乙型肝炎、戊型肝炎、疟疾、结核病、肠道病毒71型、肺炎链球菌引起的感染性疾病、志贺氏菌引起的传染性疾病、脑膜炎球菌引起的感染性疾病或癌症中的任意一种或至少两种的组合；

优选地，细胞囊泡包括EG7肿瘤细胞囊泡、4T1肿瘤细胞囊泡、Hela肿瘤细胞囊泡、MCF肿瘤细胞囊泡、树突状细胞囊泡、巨噬细胞囊泡、肥大细胞囊泡或粒细胞囊泡中的任意一种或至少两种的组合；

10.根据权利要求1-6所述的水包油包凝胶乳液在制备疫苗佐剂、药物缓释制剂、药物控释制剂、靶向给药制剂、疾病诊断试剂或日化用品中的应用。