CN103223164A - 一种水包油包水型佐剂疫苗及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种水包油包水型佐剂疫苗及其制备方法，该佐剂疫苗，其由内部水相、用于包覆内部水相的中间油相以及用于包覆中间油相的外部水相组成，外部水相中的各组分包括：复合表面活性剂、亲水性表面活性剂、生理盐水；中间油相中的各组分包括：亲油性表面活性剂、稳定剂、矿物质油；内部水相中的各组分包括：免疫增强剂溶液、亲水性表面活性剂、灭活抗原液。本发明W/O/W型佐剂疫苗比传统W/O型油佐剂疫苗能更早诱导免疫反应，可使实验动物获得更早的保护性抗体，且疫苗吸收良好，在接种部位引起的炎症反应小；比现有的W/O/W剂型疫苗稳定性好，抗体产生速度快。

Description

一种水包油包水型佐剂疫苗及其制备方法

技术领域

本发明涉及疫苗领域，具体涉及一种水包油包水型佐剂疫苗及其制备方法。

背景技术

灭活抗原单独免疫动物时，不足于产生免疫原性，特别是免疫原性低、分子量小的抗原。因此需要用不同种类的佐剂来增强抗原所诱导的免疫应答。国内外兽用疫苗生产商推广应用的油佐剂疫苗含有大量的矿物质油，在为养禽业保驾护航的同时也带来了不少的食品安全问题，例如，肉鸡胴体的疫苗残留问题已经引起越来越多人的担忧。

油包水（W/O）型油佐剂疫苗是由抗原液、稳定剂及矿物质油混合后，在高剪切力作用下制备而成。其免疫机理是在接种部位贮存一段时间，局部产生肉芽肿和炎症反应，吸引巨噬细胞、淋巴细胞等聚集以识别抗原，产生抗体。同时，缓慢扩散的油佐剂使抗原输送到二级淋巴器官的时间延长，不断刺激机体的免疫系统，从而产生续期长、抗体水平高的免疫效力。虽然国内外疫苗生产厂家的生产工艺不断改进，用油质量也不断提高，但由于这种制剂的连续油相在注射部位有驻留的倾向，在不少的情形中，这种W/O型油佐剂疫苗在接种部位附近产生大量无菌脓肿和肉芽肿，保护性抗体产生速度慢、易对动物胴体品质造成不良影响，并且在接种期间可能引起剧烈的疼痛。

水包油（O/W）型佐剂疫苗具有注射部位显现局部反应小且稳定性高的优势，然而包含或者暴露在连续相中的抗原很快在注射部位分散和被体液酶分解，难以提供长期的保护性抗体，常常需要特殊的免疫刺激剂和多次加强免疫，制备成本高，不被广泛使用。

因此运用复合微球制备概念，研究有效的可用于畜禽，且能解决上述问题的佐剂疫苗是非常有意义的。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种水包油包水型佐剂疫苗。本发明的佐剂疫苗可以减少现有灭活油苗的用油量，加快被免疫动物相应抗体的产生速度，减少疫苗制备成本。

本发明另一目的在于提供上述水包油包水型佐剂疫苗的制备方法。本发明制备的成品苗稳定性高。本发明方法操作步骤经过反复试验，各组成成分的量变及操作步骤顺序的改变均会影响复乳的包被效果、成品苗的粘度、稳定性、免疫效果及注射后吸收情况等。

本发明所采用的技术方案是：

一种水包油包水型佐剂疫苗，其由内部水相、用于包覆内部水相的中间油相以及用于包覆中间油相的外部水相组成；外部水相中的各组分，按水包油包水型佐剂疫苗原料的总体积计，包括：复合表面活性剂0.5～1.5%、亲水性表面活性剂0.3～0.6%、生理盐水9～18%；中间油相中的各组分，按水包油包水型佐剂疫苗原料的总体积计，包括：亲油性表面活性剂2～4%、稳定剂5～10 g/L、矿物质油30～50%；内部水相中的各组分，按水包油包水型佐剂疫苗原料的总体积计，包括：免疫增强剂溶液1.5～2.5%、亲水性表面活性剂0.5～1.5%，余量为灭活抗原液；所述百分比为体积百分比。

优选的，复合表面活性剂含有如下体积百分比的组分：40～60% Span-80、10～20%丙二醇，余量为油酸。

优选的，复合表面活性剂的HLB值为9～15。

优选的，外部水相和内部水相中的亲水性表面活性剂独立选自Tween-20、Tween-60、Tween-80中的至少一种。

优选的，亲油性表面活性剂为Span-20、Span-60、Span-80中的至少一种。

优选的，矿物质油为白油。

优选的，稳定剂为硬酯酸铝。

优选的，免疫增强剂溶液为黄芪多糖注射液或黄芪多糖粉水溶液。优选的，黄芪多糖注射液或黄芪多糖粉水溶液的浓度为0.1～0.15g/mL。

优选的，灭活抗原液中的抗原为传染性法氏囊病毒、腺病毒、新城疫病毒、禽流感病毒、禽多杀性巴氏杆菌、沙门氏菌中的至少一种。

上述的水包油包水型佐剂疫苗的制备方法，包括以下步骤：

1）将灭活抗原液、内部水相组分中的亲水性表面活性剂充分混合，然后加入免疫增强剂溶液，混匀，得内部水相； 

3）将稳定剂溶解于矿物质油中，然后加入中间油相组分中的亲油性表面活性剂，混匀，得中间油相；

4）将内部水相加入到中间油相中， 15000～20000rpm的剪切速度下乳化，得稳定的内球初乳；优选的，乳化时间为2～5min；

5）将生理盐水和外部水相组分中的亲水性表面活性剂充分混合，然后加入复合表面活性剂，混匀，得外部水相；

6）将内球初乳加入到外部水相中，800～1300rpm的剪切速度下乳化，得水包油包水型佐剂疫苗。优选的，乳化时间为4～6min。

优选的，本发明水包油包水型佐剂疫苗制备过程，在无菌环境下操作，制备所用原料也均为无菌原料。

在多重包被的复乳体系中，乳液稳定性的高低取决于很多因素。其主要因素包括：各相体积比、各层表面活性剂的性质及其用量、乳化工艺等。基于安全性、免疫原性及生产成本要求，各相体积比及表面活性剂用量被要求控制在一个固定的范围，变动空间有限。表面活性剂的作用在于其亲水亲油基团排列于油相层和水相层之间，使两相的表面的分子互相进入其内部，从而降低表面张力。在表面活性剂用量有限的情况下，调节其HLB值及添加助表面活性剂是调控其性质达到要求的最佳途径。为了获得稳定的W/O/W剂型复乳，调配其内层油包水中亲水性表面活性剂和亲油性表面活性剂二者的HLB值为3～6；调配其外层水相中的复合表面活性剂的HLB值为9～15，另加入助表面活性剂丙二醇和油酸调节其性质。乳化工艺采用单因子变量法进行优选。

制备中间油相过程中，由于硬脂酸铝是固体稳定剂，溶解速度较慢。所以要求充分加热使其溶解，否则将增加成品苗的粘度和注射机体后局部吸收的速度。

本发明优选符合大生产需求、具有免疫增强作用的药物，根据水包油包水型微球的控释原理科学添加，使其更有效的直接作用于免疫细胞，达到作用持久、生物利用度最大化的效果。

本发明的有益效果是：

本发明水包油包水（W/O/W）型佐剂疫苗比传统W/O型油佐剂疫苗能更早诱导免疫反应，可使实验动物获得更早的保护性抗体，且疫苗吸收良好，在接种部位引起的炎症反应小；比现有的W/O/W剂型疫苗稳定性好、抗体产生速度快。

本发明制备的佐剂疫苗具有合理的控释、靶向和隔离特性，注射免疫家禽后，水溶性的外球在注射部位具有加快扩散的作用。适时代谢破裂后，稳定的内球油包水结构作用于淋巴细胞，缓慢释放抗原，全面刺激家禽淋巴细胞产生抗体。内部水相中的免疫增强剂能持久缓慢释放在后期免疫细胞浸润过程中，使其生物利用度达到最大化，表现为注射局部吸收良好、被注射动物快速产生免疫保护作用。

附图说明

图1是本发明W/O/W型佐剂疫苗粒径模型图及实拍显微图片；

图2是不同外水相乳化速度对内球初乳包封效果显微图；

图3是实施例1所制备的W/O/W型复乳内球初乳粒径分布；

图4是实施例1所制备的W/O/W型复乳成品疫苗粒径分布。

具体实施方式

下面结合具体的实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。

以下实施例中所述百分比，如无特别说明，均为为体积百分比。

以下实施例及实验中所述的进口白油采用法国埃克森美孚（Exxonmobil）公司的产品，型号为marcol52；所述的黄芪多糖注射液是由注射用黄芪多糖原粉溶于水得到的，而注射用黄芪多糖原粉由得阳恒宇生物科技有限公司提供，批号DYSW20120304；所述的禽流感病毒H9亚型灭活胚液（代号：A/Chicken/Guangdong/SS/94(H9N2)株）由广州市华南农大生物药品有限公司提供，灭活后抗原血凝价（Hemagglutination，HA）为9Log2。

实施例1 

一种水包油包水型佐剂疫苗，其由内部水相、用于包覆内部水相的中间油相以及用于包覆内部水相的中间油相组成；

外部水相中的各组分，按水包油包水型佐剂疫苗原料的总体积计，配比为：复合表面活性剂1%、Tween-80 0.3%、生理盐水15.5%；

中间油相中的各组分，按水包油包水型佐剂疫苗原料的总体积计，配比为： span 80 3%、硬质酸铝8.5 g/L、进口白油47%；

内部水相中的各组分，按水包油包水型佐剂疫苗原料的总体积计，配比为：0.15g/mL黄芪多糖注射液2%、Tween-80 1.2%，余量为灭活抗原液；上述水包油包水型佐剂疫苗原料的总体积百分比为100%，其中，复合表面活性剂组分为：55.6%Span-80、22.2%丙二醇、22.2%油酸。

上述水包油包水型佐剂疫苗的制备方法，包括以下步骤：

1）将灭活抗原液、内部水相组分中的Tween-80充分混合，然后加入无菌黄芪多糖注射液，混匀，得内部水相；

3）将硬质酸铝加入进口白油中，加热到150℃使硬质酸铝充分溶解，然后加入span 80，混匀，灭菌，得中间油相；

4）将内部水相加入到中间油相中，在无菌环境下、高速剪切力20000rpm下乳化5min，得稳定的内球初乳； 

5）将生理盐水和外部水相组分中的Tween 80充分混合，灭菌，然后在无菌环境下，加入无菌复合表面活性剂，混匀，得外部水相；

6）将内球初乳加入到外部水相中，在无菌环境下、在低速剪切力1100rpm下搅拌5min，得水包油包水型佐剂疫苗。

实施例2 

一种水包油包水型佐剂疫苗，其由内部水相、用于包覆内部水相的中间油相以及用于包覆内部水相的中间油相组成；

外部水相中的各组分，按水包油包水型佐剂疫苗原料的总体积计，配比为：复合表面活性剂0.5%、Tween-20 0.6%、生理盐水18%；

中间油相中的各组分，按水包油包水型佐剂疫苗原料的总体积计，配比为： span 60 2%、硬质酸铝10 g/L、进口白油30%；

内部水相中的各组分，按水包油包水型佐剂疫苗原料的总体积计，配比为：0.1g/mL黄芪多糖注射液1.5%、Tween-80 0.5%，余量为灭活抗原液；上述水包油包水型佐剂疫苗原料的总体积百分比为100%，其中，复合表面活性剂组分为：40%Span-80、20%丙二醇、40%油酸。

上述水包油包水型佐剂疫苗的制备方法，包括以下步骤：

1）将灭活抗原液、内部水相组分中的Tween-80充分混合，然后加入无菌黄芪多糖注射液，混匀，得内部水相；

3）将硬质酸铝加入进口白油中，加热到150℃使硬质酸铝充分溶解，然后加入span 60，混匀，灭菌，得中间油相；

4）将内部水相加入到中间油相中，在无菌环境下、高速剪切力15000rpm下乳化2min，得稳定的内球初乳； 

5）将生理盐水和外部水相组分中的Tween-20充分混合，灭菌，然后在无菌环境下，加入无菌复合表面活性剂，混匀，得外部水相；

6）将内球初乳加入到外部水相中，在无菌环境下、在低速剪切力1300rpm下搅拌4min，得水包油包水型佐剂疫苗。

实施例3 

一种水包油包水型佐剂疫苗，其由内部水相、用于包覆内部水相的中间油相以及用于包覆内部水相的中间油相组成；

外部水相中的各组分，按水包油包水型佐剂疫苗原料的总体积计，配比为：复合表面活性剂1.51%、Tween-60 0.5%、生理盐水9%；

中间油相中的各组分，按水包油包水型佐剂疫苗原料的总体积计，配比为： span 80 4%、硬质酸铝5 g/L、进口白油50%；

内部水相中的各组分，按水包油包水型佐剂疫苗原料的总体积计，配比为：0.13g/mL黄芪多糖粉水溶液2.5%、Tween-20 1.5%，余量为灭活抗原液；上述水包油包水型佐剂疫苗原料的总体积百分比为100%，其中，复合表面活性剂组分为：60%Span-80、10%丙二醇、30%油酸。

上述水包油包水型佐剂疫苗的制备方法，包括以下步骤：

1）将灭活抗原液、内部水相组分中的Tween-20充分混合，然后加入无菌黄芪多糖注射液，混匀，得内部水相；

3）将硬质酸铝加入进口白油中，加热到150℃使硬质酸铝充分溶解，然后加入span 80，混匀，灭菌，得中间油相；

4）将内部水相加入到中间油相中，在无菌环境下、高速剪切力18000rpm下乳化4min，得稳定的内球初乳； 

5）将生理盐水和外部水相组分中的Tween-60充分混合，灭菌，然后在无菌环境下，加入无菌复合表面活性剂，混匀，得外部水相；

6）将内球初乳加入到外部水相中，在无菌环境下、在低速剪切力800rpm下搅拌6min，得水包油包水型佐剂疫苗。

不同配方制备的佐剂疫苗的性质判定：

将实施例1制备的水包油包水型佐剂疫苗（表1中，疫苗序列号为5）与四组对比佐剂疫苗进行性质判定，四组对比佐剂疫苗： 

1）疫苗序列号1组：佐剂疫苗原料的各物质具体用量及制备方法基本同实施例1，不同之处仅在于：复合表面活性剂中不添加丙二醇；

2）疫苗序列号2组：佐剂疫苗原料的各物质具体用量及制备方法基本同实施例1，不同之处仅在于：复合表面活性剂中不添加油酸；

3）疫苗序列号3组：佐剂疫苗原料的各物质具体用量及制备方法基本同实施例1，不同之处仅在于：不添加复合表面活性剂，生理盐水的体积用量增加1%；

4）疫苗序列号4组：佐剂疫苗原料的各物质具体用量及制备方法基本同实施例1，不同之处仅在于：不添加稳定剂硬质酸铝。

五组实验用佐剂疫苗配方可见表1。表中“∕”表示无添加，“/丙二醇”表示无添加丙二醇，“/油酸”表示无添加油酸。

疫苗性质判定，以现行《中国兽药典》为最低标准，进行外观、剂型、粘度及稳定性检验。具体方法为通过肉眼观察进行外观检验；取清洁吸管吸取少许疫苗滴于清洁冷水表面，呈云雾状扩散为W/O/W剂型，除第1滴外，均不扩散为W/O剂型；取疫苗适量用美国博飞粘度计进行粘度检验；取疫苗10ml加入离心管中，放于37℃恒温保存，定期抽样观察乳液。另取10ml加入离心管中，梯度离心15分钟。

五组实验用佐剂疫苗均为白色乳液状。

五组实验用佐剂疫苗的性质判定结果见表2，表中，- 表示肉眼观察无破乳，抽取试管底部乳液，显微镜下观察无可见小水滴；+ 表示肉眼观察无破乳，抽取试管底部乳液，显微镜下观察可见少量小水滴；++ 表示肉眼可观察到破乳现象。

由表2可知，5号疫苗（实施例1制备的疫苗）稳定性较好，37℃保存35天、6000rpm离心15分钟均无水相析出。3号疫苗（无复合表面活性剂组疫苗）不能形成复乳结构，为W/O 剂型，1号疫苗（复合表面活性剂中无丙二醇组）、2号疫苗（复合表面活性剂中无油酸组）、4号疫苗（无稳定剂组）稳定性均较差。由此可见，复合表面活性剂，尤其是复合表面活性剂中的丙二醇、油酸对本发明佐剂疫苗的水包油包水型结构的稳定性起到了协同促进作用，缺一不可。

不同外水相乳化速度对内球初乳包封效果的测定：

为了进一步优化制备工艺，针对第二步乳化，采用不同乳化速度，采用实施例1中的外部水相对内球初乳进行乳化包封，研究其对初乳包封效果的影响。

取乳化成品少量，用生理盐水适当稀释后滴加于洁净的玻璃片上，盖上盖玻片，放于显微镜上观察。调节显微镜以观察样品的微观结构，并用易创数字互动显微系统拍摄其显微结构，计算标定比例尺。结果（见图2）显示不同乳化速度下复乳粒径的显微图，以反映不同外水相乳化速度对内球初乳的包封效果。可以看出当乳化时间相同时，乳化速度为500rpm时所得到的复乳粒径较大且均匀度差。随着乳化速度的增加，1100rpm的乳化速度制备得到的复乳粒径较小且均匀度高，经稳定性测得出，10ml成品复乳在6000rpm离心15min无破乳现象，稳定性较好。但进一步增大乳化速度至1400rpm，所得到的复乳已经有明显的破损，显微图中出现内球初乳。其主要原因是随着乳化速度的增大，剪切所产生的逐渐增加的粘性力破坏了复乳的平衡体系。另外，当乳化强度过大时，复乳粒径减少，外水相不足于提供更大的表面积以包被内球初乳。

本发明佐剂疫苗制备过程中内球初乳粒度测定：

将实施例1中制备的内球初乳，运用Mastersizer激光粒度仪进行粒度测定，统计分析制表。结果（见图3）表明制备的内球初乳粒径小，且分布相对集中，粒径2.2um以下的占所有颗粒的96.5%，粒径0.25～1.80um之间的约占所有颗粒的90%以上。

本发明制备的佐剂疫苗粒度测定：

将实施例1制备的佐剂疫苗，运用Mastersizer激光粒度仪进行粒度测定，统计分析制表。结果（见图4）表明1100rpm的乳化速度下，制备的W/O/W型复乳粒径合适，且分布集中，粒径4.0um以下占所有颗粒的96.8%，粒径1.0～3.9um之间的约占所有颗粒的90%以上。

本发明方法制备的流感H9亚型（SS株）疫苗在SPF鸡中的效应测试：

以H9亚型（SS株）灭活抗原液为材料，制备不同组别的佐剂疫苗，实验分组：

1）本发明疫苗组：按实施例1的方法制备W/O/W型佐剂疫苗；

2）无黄芪添加复乳疫苗（无黄芪W/O/W）组：在1）中本发明疫苗组制备的原料和方法的基础上，不添加黄芪多糖注射液；

3）普通油包水疫苗（普通W/O组）：在2）中疫苗组制备的原料和方法的基础上，按照其内球初乳的制备方法制备。

4）外部水相添加黄芪复乳疫苗（外黄芪W/O/W组）：在1）本发明疫苗组制备的原料和方法的基础上，将原内部水相的黄芪多糖注射液添加到外部水相中制备而成。

5）普通油包水黄芪疫苗（黄芪W/O组）：在1）中本发明疫苗组制备的原料和方法的基础上，按照其内球初乳的制备方法制备。

部分组抗原浓缩使得各组同体积疫苗内抗原量相同，黄芪添加组同体积疫苗内黄芪含量相同。

按照现行《中国兽药典》要求，分别将五组疫苗及生理盐水、灭活抗原（即H9亚型（SS株）灭活抗原液）（1.0ml/只）颈部皮下注射45日龄SPF鸡5只。14日内，注射各组SPF鸡均未出现精神情况差、食欲减退等不良反应，说明各组佐剂制备的禽流感H9亚型（SS株）疫苗对实验动物SPF鸡是安全的。即各组佐剂均不出现由疫苗引起的任何局部和全身不良反应。

按照现行《中国兽药典》要求，分别将五组疫苗0.25ml/只、及生理盐水0.25ml/只、灭活抗原0.10 ml/只（同条件下的H9亚型灭活抗原液，其单只灭活抗原液注射量与五组疫苗中的单只灭活抗原液注射量相同）分别颈部皮下免疫45日龄SPF鸡20只，设置灭活抗原及生理盐水对照组。分别于免疫前及免疫后采血，分离血清，采用中监所标准H9抗原检测HI抗体（结果见表3）。

结果表明各组与单灭活抗原组比，均可有效刺激SPF鸡使其获得特异性抗体。与普通W/O组比，黄芪W/O组抗体产生较快，于免疫后7日龄抗体平均值高0.8log2，说明黄芪多糖具有免疫增强作用；与外黄芪W/O/W组（外水相添加黄芪多糖）比，本发明疫苗组（即内水相添加黄芪多糖组）抗体产生速度较快，于免疫后7日龄抗体平均值高1.1log2，说明黄芪多糖添加于内水相，更能发挥其免疫增强作用，使其生物利用度达到最大化。分析其原因是添加于内水相的黄芪多糖释放在油包水内球破裂时的淋巴细胞浸润过程中，直接作用于淋巴细胞。

于免疫后21日各组随机挑选 5只，扑杀剖检。观察各组实验鸡局部组织病变，以评估免疫后疫苗吸收情况。结果显示，各组均吸收良好，无局部组织坏死、溃烂损伤，部分组有黄色疫苗残留。本发明疫苗组及W/O/W系列组疫苗残留较其它组少且残留块直径较小，说明复乳在机体内吸收较快。

Claims (10)

1.一种水包油包水型佐剂疫苗，其由内部水相、用于包覆内部水相的中间油相以及用于包覆中间油相的外部水相组成；

外部水相中的各组分，按水包油包水型佐剂疫苗原料的总体积计，包括：复合表面活性剂0.5～1.5%、亲水性表面活性剂0.3～0.6%、生理盐水9～18%；

中间油相中的各组分，按水包油包水型佐剂疫苗原料的总体积计，包括：亲油性表面活性剂2～4%、稳定剂5～10 g/L、矿物质油30～50%；

内部水相中的各组分，按水包油包水型佐剂疫苗原料的总体积计，包括：免疫增强剂溶液1.5～2.5%、亲水性表面活性剂0.5～1.5%，余量为灭活抗原液；

所述百分比为体积百分比。

2.根据权利要求1所述的水包油包水型佐剂疫苗，其特征在于：复合表面活性剂含有如下体积百分比的组分：40～60% Span-80、10～20%丙二醇，余量为油酸。

3.根据权利要求1或2所述的水包油包水型佐剂疫苗，其特征在于：复合表面活性剂的HLB值为9～15。

4.根据权利要求1或2所述的水包油包水型佐剂疫苗，其特征在于：外部水相和内部水相中的亲水性表面活性剂独立选自Tween-20、Tween-60、Tween-80中的至少一种。

5.根据权利要求1或2所述的水包油包水型佐剂疫苗，其特征在于：亲油性表面活性剂为Span-20、Span-60、Span-80中的至少一种。

6.根据权利要求1或2所述的水包油包水型佐剂疫苗，其特征在于：矿物质油为白油。

7.根据权利要求1或2所述的水包油包水型佐剂疫苗，其特征在于：稳定剂为硬酯酸铝。

8.根据权利要求1或2所述的水包油包水型佐剂疫苗，其特征在于：免疫增强剂溶液为黄芪多糖注射液或黄芪多糖粉水溶液。

9.根据权利要求1或2所述的水包油包水型佐剂疫苗，其特征在于：灭活抗原液中的抗原为传染性法氏囊病毒、腺病毒、新城疫病毒、禽流感病毒、禽多杀性巴氏杆菌、沙门氏菌中的至少一种。

10.权利要求1～9所述的水包油包水型佐剂疫苗的制备方法，包括以下步骤：

1）将灭活抗原液、内部水相组分中的亲水性表面活性剂充分混合，然后加入免疫增强剂溶液，混匀，得内部水相； 

3）将稳定剂溶解于矿物质油中，然后加入中间油相组分中的亲油性表面活性剂，混匀，得中间油相；

4）将内部水相加入到中间油相中， 15000～20000rpm的剪切速度下乳化，得稳定的内球初乳；

5）将生理盐水和外部水相组分中的亲水性表面活性剂充分混合，然后加入复合表面活性剂，混匀，得外部水相；

6）将内球初乳加入到外部水相中，800～1300rpm的剪切速度下乳化，得水包油包水型佐剂疫苗。

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