CN115216478B - 一种禽多杀性巴氏杆菌内毒素减毒灭活疫苗菌株的构建方法及应用 - Google Patents

一种禽多杀性巴氏杆菌内毒素减毒灭活疫苗菌株的构建方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种禽多杀性巴氏杆菌内毒素减毒灭活疫苗菌株的构建方法及应用。本发明通过构建表达LpxE基因的重组质粒，进行电击转化到禽多杀性巴氏杆菌中，成功获得内毒素减毒菌株。本发明采用优化后的LpxE基因特异性的去除也野生型菌株上部分类脂A1位上的磷酸基团，成功改造巴氏杆菌；且内毒素致凝活性显著高于野生型菌株，表明脂多糖结构改造后内毒素毒性下降；同时，能使细胞因子IL‑6，TNF‑α和趋化因子CXCL2的含量显著下降，减少MH‑S细胞促炎因子的产生。采用内毒素减毒菌株制备的灭活疫苗与野生型菌株灭活疫苗相比，保护效率更高，安全性也更好，能更好地应用于禽多杀性巴氏杆菌病的防治中。

Description

一种禽多杀性巴氏杆菌内毒素减毒灭活疫苗菌株的构建方法 及应用
技术领域
本发明属于生物技术领域。更具体地，涉及一种禽多杀性巴氏杆菌内毒素减毒灭活疫苗菌株的构建方法及应用。
背景技术
为保障食品安全，我国于2020年全面禁止在饲料中使用药物添加剂；在养殖环节则全面推行“减抗”和“限抗”模式。家禽的无抗养殖是指在家禽养殖过程中，饲料中不添加任何抗生素、激素以及其他外源性药物，将抗生素在家禽养殖中的使用严格限制在治疗疾病的范围，并完全遵循产品休药期，从而保证家禽产品中无抗生素残留。药物饲料添加剂全面退出家禽养殖行业带来的最大问题是发病率的上升，尤其是细菌性疾病，进而带来的养殖效益下降。家禽细菌性疾病中，多杀性巴氏杆菌病的流行和爆发不仅仅对动物健康产生极大的伤害，对养殖行业带来难以估量的财产损失，更大的潜在危险在于能威胁人的健康安全。
巴氏杆菌病(pasteurellosis)是由多杀性巴氏杆菌引起的一种急性、热性传染疾病。动物巴氏杆菌病的急性型常以败血症和出血性炎症为主要特征，所以过去又叫“出血性败血症”；慢性型常表现为皮下结缔组织，关节及各脏器的化脓性病灶，并多与其他疾病混合感染或继发，多杀性巴氏杆菌病在全国分布范围很广，对我国养殖业存在巨大的危害。多杀性巴氏杆菌病通常以慢性和急性形式存在，可导致显著的发病率，主要可表现为禽霍乱、猪肺疫、鼻甲骨萎缩、结膜型炎、气囊炎、关节炎和出血性红斑。在临床上，常用抗生素和疫苗来预防和治疗多杀性巴氏杆菌引起的疾病。
在国家禁抗的浪潮下，目前市面上用于预防该病的疫苗以灭活疫苗为主，但禽多杀性巴氏杆菌作为一种革兰氏阴性菌，含有大量内毒素，其灭活疫苗引起的应激反应较大，保护效果不佳。脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)也叫内毒素，是革兰氏阴性细菌细胞外膜的主要组成成分，主要由类脂A、核心多糖和O-抗原3部分组成。当病原性的革兰氏阴性细菌侵入宿主后，其表面LPS的释放并被免疫细胞表面的Toll样受体4(Toll Like Receptor4，TLR-4)识别，会引发细胞内一系列的生理生化反应，产生肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-1β和干扰素-γ等多种细胞因子。一方面，这些细胞因子的过量积累能够引起严重的内毒素休克，表现为炎症反应、凝血异常、血压过低、器官衰竭等症状；另一方面，部分细胞因子的适量产生可以激发宿主的免疫反应。脂多糖在禽多杀性巴氏杆菌致病过程中起有重要作用，为了降低禽多杀性巴氏杆菌疫苗的毒性，现有研究通过直接在禽多杀性巴氏杆菌基因组上缺失潜在毒力相关序列的缺失基因或进行突变，得到减毒菌株。如现有技术公开了采用天然O-抗原不完全的大肠杆菌J5疫苗株为原始出发菌株，利用λ-Red同源重组技术，导入外源弗朗西斯菌lpxE基因定向去除类脂A-C1位的磷酸基团，同时缺失大肠杆菌lpxM基因从而减少一条酰基链，将大肠杆菌J5改造成可以生产低毒性MPLA的工程菌株。由于该方法仅在大肠杆菌上改造成功，能否适用于其他菌株改造还未可知，因为并不是所有菌株含有 1位的磷酸基团，且不同菌株之间的差异较大，并且该方法还需要同时缺失lpxM 基因才能构建成功，其筛选过程繁琐，还可能存在毒力返强的风险；而采用lpxE 基因构建禽多杀性巴氏杆菌减毒菌株还鲜有研究。而在禽多杀性巴氏杆菌减毒菌株的构建基因敲除研究中，适用于基因敲除工具很少，导致多杀性巴氏杆菌基因工程弱毒菌株的开发存在一定的困难，加上市面上所用灭活疫苗存在免疫应激大的问题，因此，为了适应当前禁抗大环境下禽多杀性巴氏杆菌病预防的需要，需要对目前灭活疫苗存在的问题进行进一步的研究和开发，用于禽霍乱病的防治和应用。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服上述问题的缺陷和不足，提供一种禽多杀性巴氏杆菌内毒素减毒灭活疫苗菌株的构建方法及应用。
本发明的第一个目的是提供一种禽多杀性巴氏杆菌内毒素减毒菌株的构建方法。
本发明的第二个目的是提供禽多杀性巴氏杆菌内毒素减毒菌株。
本发明的第三个目的是提供所述减毒菌株的应用。
本发明的第四个目的是提供一种禽多杀性巴氏杆菌内毒素减毒灭活疫苗。
本发明的第五个目的是提供所述内毒素减毒灭活疫苗的应用。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
本发明通过对外源弗朗西斯菌LpxE基因(SEQ ID NO:1)进行密码子优化，得到优化后的LpxE基因(SEQ ID NO:2)后，分别构建两种LpxE基因重组质粒，分别转化野生型多杀性巴氏杆菌(C48-1株)；再分别提取野生型与两种内毒素减毒菌株(原始序列和优化序列构建的)的类脂A，经过类脂A的质谱分析表明采用优化后的LpxE基因能特异性的去除野生型菌株上部分类脂A1位上的磷酸基团，并能成功改造巴氏杆菌的脂多糖结构，且优化后的LpxE基因效果更好；脂多糖结构改造后与野生型杆菌相比内毒素的毒性显著下降；通过LPS刺激小鼠巨噬细胞并进行细胞因子测定，发现与野生型相比，内毒素减毒菌株刺激MH-S细胞产生的细胞因子IL-6，TNF-α以及趋化因子CXCL2三者含量均显著下降，能大幅减少MH-S细胞促炎因子产生。
本发明提供一种禽多杀性巴氏杆菌内毒素减毒菌株的构建方法，包括如下步骤：
S1.将SEQ ID NO:2所示的进行密码子优化后的LpxE基因序列克隆到T载体上，构建表达LpxE基因的重组质粒；
S2.将步骤S1的重组质粒转化到禽多杀性巴氏杆菌中；
S3.鉴定确认得到含有SEQ ID NO:2所示LpxE基因的禽多杀性巴氏杆菌内毒素减毒菌株。
优选地，采用SEQ ID NO:1所示的LpxE基因序列进行密码子优化得到SEQ ID NO:2所示的进行密码子优化后的LpxE基因序列。
优选地，步骤S1中克隆所用的扩增采用的引物序列如SEQ ID NO:3～4所示。
优选地，步骤S1中克隆所用的扩增条件为95℃10min；95℃15s、55℃20s、 72℃60s，40个循环；72℃7min。
优选地，步骤S1中克隆所用的扩增体系为ddH2O 20μL、2×Phanta Max MasterMix 25μL、上游引物和下游引物(10μM)各2μL、模板DNA1μL。
优选地，步骤S2中禽多杀性巴氏杆菌为鸡源血清型为A:1的多杀性巴氏杆菌CVCC44801株(C48-1株)。
本发明提供上述构建方法得到的禽多杀性巴氏杆菌内毒素减毒菌株，该菌株保存于华南农业大学人兽共患病防控制剂国家地方联合工程实验室。
本发明提供禽多杀性巴氏杆菌内毒素减毒菌株在防治禽多杀性巴氏杆菌病或制备禽多杀性巴氏杆菌疫苗中的应用。
本发明采用禽多杀性巴氏杆菌内毒素减毒菌株制备的禽多杀性巴氏杆菌内毒素减毒灭活疫苗，使用2倍剂量注射对蛋鸡免疫后，进行安全性检测表明，经过免疫注射后鸡群无明显应激反应，在二次免疫后，注射内毒素减毒菌株灭活疫苗的鸡群精神正常，而采用野生型多杀性巴氏杆菌疫苗(C48-1株)灭活疫苗注射的鸡群在三天内出现精神不振情况；采用LD50细菌剂量攻毒后，对照组鸡于攻菌24小时内全部死亡，且细菌分离结果全为阳性，说明攻毒成功；采用C48-1 株灭活疫苗的保护率为70％，而采用内毒素减毒灭活疫苗保护效率为100％，表明内毒素减毒灭活疫苗安全性更好而且保护效率更高。
因此，本发明提供一种禽多杀性巴氏杆菌内毒素减毒灭活疫苗，含禽多杀性巴氏杆菌内毒素减毒菌株。
本发明还提供所述内毒素减毒灭活疫苗在防治禽多杀性巴氏杆菌病中的应用。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供的禽多杀性巴氏杆菌内毒素减毒灭活疫苗菌株的构建方法，将 LpxE基因序列进行密码子优化后，通过将外源弗朗西斯菌LpxE基因转化到禽多杀性巴氏杆菌株中，成功获得了内毒素减毒菌株；经过类脂A的质谱分析表明，对LpxE基因原始序列优化得到的SEQ ID NO:2不仅能特异性的去除多杀性巴氏杆菌上部分类脂A1位上的磷酸基团，并能成功改造巴氏杆菌的脂多糖结构，还具有比原始序列SEQ ID NO:1更好的效果；本发明优化后的LpxE基因构建的内毒素减毒菌株的内毒素毒性相较于野生型多杀性巴氏杆菌显著下降；同时，禽多杀性巴氏杆菌内毒素减毒菌株能使细胞因子IL-6，TNF-α以及趋化因子CXCL2 三者含量显著下降，能大幅减少MH-S细胞促炎因子产生。本发明提供的构建方法简单、成本低、安全性好。
采用内毒素减毒菌株制备的灭活疫苗与野生型多杀性巴氏杆菌灭活疫苗相比，灭活后的内毒素减毒疫苗的残留量明显减少；在二次免疫后，内毒素减毒灭活疫苗鸡群精神正常；采用LD50细菌剂量攻毒后，采用野生型菌株灭活疫苗保护率为70％，内毒素减毒灭活疫苗保护效率为100％，表明内毒素减毒灭活疫苗安全性更好而且保护效率更高。因此，采用禽多杀性巴氏杆菌内毒素减毒灭活疫苗更能适应当前禁抗大环境下禽多杀性巴氏杆菌病预防的需要，用于禽霍乱病的防治和应用。
附图说明
图1为载体构建过程中的PCR图(注：a：M：Marker；1：M13引物扩增出的LpxE条带图；b：M：Marker；1：质粒pBackzero-lpxE完整跑胶图；c：M： Marker；1：质粒pBackzero-lpxE检测条带)；
图2质粒pBackzero-lpxE转化到禽多杀性巴氏杆菌后的检测PCR图(注： M：Marker；1：检测产物)；
图3为C48-1菌株与Ft菌株类脂A质谱图谱对比(注：A为采用菌株C48-1 提取的类脂A，B为采用原始LpxE基因SEQ ID NO:1所构建的质粒提取的类脂 A，C为优化后的LpxE基因SEQ ID NO:2所构建的质粒提取的类脂A)；
图4为提取脂多糖的SDS-PAGE及银染检测图；
图5为浓度均为10μg/mLC48-1株，Ft内毒素减毒菌株冻干脂多糖脂多糖刺激小鼠巨噬MH-S细胞后，用酶联免疫法(ELISA)测定白介素-6(IL-6)的含量；
图6为浓度均为10μg/mLC48-1株，Ft内毒素减毒菌株冻干脂多糖脂多糖刺激小鼠巨噬MH-S细胞后，用酶联免疫法(ELISA)测定肿瘤坏死因子α(TNF-α) 的含量；
图7为浓度均为10μg/mLC48-1株，Ft内毒素减毒菌株冻干脂多糖脂多糖刺激小鼠巨噬MH-S细胞后，用酶联免疫法(ELISA)测定促炎趋化因子(CXCL2) 的含量；
图8为C48-1与Ft内毒素减毒菌株灭活疫苗皮下注射50天后疫苗残留情况 (图8a、d、g：空白对照；图8b、e、h：C48-1灭活疫苗；图8c、f、i：Ft组为内毒素减毒灭活疫苗)。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
TSB培养基：1L去离子水中加入Tryptone 15g，Peptones soybean 5g，NaCl 5g，调节pH为中性，高压锅设置121℃，蒸汽灭菌后，放置4℃冰箱内保存。
多杀性巴氏杆菌CVCC44801株(简称C48-1株)为鸡源血清型为A:1的多杀性巴氏杆菌CVCC44801株，购自广州市华南农大生物药品有限公司。
小鼠肺泡巨噬MH-S细胞购自广州群贤科技有限公司。
优化后的LpxE基因序列如SEQ ID NO:2所示。
ATGCTCAAACAGACACTGCAGATCAATTTCCAAGGGTTCAAGGACATC TTCAAAAAAACGAAATTGCATAACCATAAGCTCCCTCGTTACCTGCAGCTCAAGTATACGTTCATCCCACTTCTGATCCTCGTGATTTTTGCATACTATAACCT CGACACGCCGGTAGAAAACTACATCAAACATAGTATGCCGAATATCGTGGG GGTTATTTTTGGGAAGATTACGGATGTCGGGAAGGCGGAATATATTCTCATTATCTGTGGTGTAATCGTCCTGGCGCGTTTATTCACTGATTCTCAGAAGTTAA GTGCCAACACACGTGCGATGTTCGACAAGGTGTCTGCGTATGCGGGTTTTATCCTTGCAACCGTCGCCATCTCAGGTATCCTCGGTCAGATTCTGAAAATGAT CATCGGGCGCGCTCGTCCTAAATTCTTTCTTGAATATGGCAGTCACTATTTC CAACATTTTCACGCTCCTGGGTACGATTTTGCGTCCATGCCGAGTGGTCACAGCATCACAGTAGGTGCGATGTTCATTGCTTTCTTTTACATTTTCCCTAAGTT ACGCTATTTCTGGTACTTGCTTATTGTCGTATTTGCAGGGAGCCGTATTATGGTGGGTTCCCATTATCCAAGCGATGTAATTTTCGGGGTAGCATTTGGGTGTTA TTGCACAGCGTATATTTACTATTGGATGCGTAACCGCGAAATCATTTAA
实施例1禽多杀性巴氏杆菌内毒素减毒疫苗菌株的构建
1、表达载体的构建
(1)获取目的基因：根据NCBI公布的序列WP_003041686.1，通过相关软件分析比较后，筛选弗朗西斯菌磷酸酶基因LpxE序列如SEQ ID NO:1，对LpxE 基因序列进行密码子优化，得到优化后的LpxE基因的序列如SEQ ID NO:2所示；设计质粒构建方案，利用全基因合成的方式，分别合成带有LpxE基因序列SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的重组质粒。
(2)分析表达载体：在M13引物的上游引物、下上游引物Primer的5’端加上TTTAA 5个碱基，扩增LpxE片段，克隆到pBackzero-T载体上；
上游引物F(SEQ ID NO:3)：TTTAAGTAAAACGACGGCCAGT；
下游引物R(SEQ ID NO:4)：TTTAACAGGAAACAGCTATGAC；
(3)获得目的片段条带：进行PCR扩增，PCR反应条件为：95℃10min； 95℃15s、55℃20s、72℃60s，40个循环；72℃7min；PCR反应体系为：ddH2O 20μL、2×Phanta Max MasterMix 25μL、上游引物和下游引物(10μM)各2μL、模板DNA1μL。将扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳后使用DNA胶回收试剂盒回收与纯化目的基因；
(4)检测凝胶回收结果：使用超微量分光光度计测定回收产物的浓度；
(5)在微量离心管中配制DNA溶液，全量为5μL，DNA溶液体系如下表 1所示；
表1配制DNA溶液的体系
试剂 使用量(μL)
pBackZero-T Vector 1
目的片段条带 1
灭菌水 3
(6)连接：在上述配制DNA溶液中加入等量5μL的Solution I，并置于 16℃反应30分钟；
(7)转化：从-80℃取出一管感受态DH5αE.coli，置于冰上，5min后加入 10μL(6)中连接产物，冰上反应25min后，热激45s，迅速插回冰上，静置3min 后加入无抗LB液体培养液700μL，37℃，200r/min摇床培养1h；
(8)测序鉴定：将100μL菌液涂布于卡那霉素LB琼脂板中，待菌长出，挑取单个菌落进行菌液PCR，PCR扩增反应条件及体系同上述步骤(3)。将阳性条带对应的菌液进行测序；
(9)提取质粒与保种：对于测序结果正确的菌液进行扩大培养，使用质粒提取试剂盒提取质粒pBackzero-lpxE，保存于-20℃，并用含有15-20％甘油的LB 液体培养基保存菌液于-80℃。
优化后的LpxE基因SEQ ID NO:2构建的载体PCR扩增结果如图1所示，由图1a所示扩增LpxE片段目的条带大小约750bp，表明成功获得目的条带LpxE；克隆到pBackzero-T载体后，由图1b所示克隆到pBackzero-T载体上后获得大小约5000bp的pBackzero-lpxE质粒；挑取pBackzero-lpxE-DH5α大肠杆菌单菌落检测结果由图1c所示检测目的条带大小约750bp，表明pBackzero-lpxE质粒中存在目的条带LpxE。
2、禽多杀性巴氏杆菌的电击感受态的制备
将上述构建得到的两种质粒pBackzero-lpxE(原始LpxE基因SEQ ID NO:1，和优化后的LpxE基因SEQ ID NO:2所构建的质粒)分别电击转化到野生型禽多杀性巴氏杆菌中(C48-1菌株)，多杀性巴氏杆菌电转化感受态细胞的制备具体方法如下：
(1)挑取巴氏杆菌C48-1株的单个菌落，接种于3～4mL TSB液体培养基中，37℃，200r/min摇床培养12～14h；
(2)按照1:100的接种比例，将C48-1株菌液接种到100mL新鲜的TSB 液体培养基中，37℃，200r/min摇床培养约2.5～3h，至OD600值达到0.4～0.6 时，按100U/mL的比例加入透明质酸酶，继续摇床培养30min；
(3)将菌液于冰上预冷15～30min(期间可不定期的摇晃，以加速菌液冷却速度)，将菌液分装到预冷的50mL离心管中，提前将离心机预冷至4℃，4000 r/min，离心10min，弃上清；
(4)用灭菌预冷的10％的甘油洗涤菌体4次，4℃，4000r/min，离心10min，弃上清；
(5)加入1.5mL～2mL灭菌预冷的10％甘油重悬菌体，然后按90μL/管分装于灭菌预冷的1.5mL离心管中，-80℃冰箱中保存。
3、过表达磷酸酶质粒的电击转化与鉴定
分别将上述两种质粒pBackzero-lpxE转化至多杀性巴氏杆菌感受态中，具体操作步骤如下：
(1)将上述制备的多杀性巴氏杆菌C48-1株感受态细胞从-80℃冰箱取出，置冰水混合物上融化；
(2)采用0.1cm电击杯和杯盖，从储存液中拿出倒置于干净的吸水纸上5 分钟，待其沥干水分，正置5分钟，使乙醇充分挥发，待乙醇挥发干净立即插入冰中，压实冰面，电极杯顶离冰面0.5cm以方便盖上杯盖，冰中静置5分钟充分降温；
(3)分别将5μL重组质粒pBackzero-lpxE加入到提前制备好的1.5mL离心管的感受态细胞C48-1株中，用手拨打管底混匀，立即插入冰中，冰水混合物上放置10分钟；用枪头将感受态与质粒混合物快速移到0.1cm冰浴过的电转化杯中，盖上杯盖，空管保留待用。电击感受态细胞加入电击杯时应避免产生气泡，气泡会增加弧光放电风险；
(4)设置电转仪的参数：电压1850V/cm，脉冲电阻200Ω，电容25μF，将电转化杯外面的水擦干后进行电击，电击完毕后，加入1mLTSB液体培养基将菌体混匀(电转后要快速加入TSB培养基)，转至1.5mL的EP管中。注意：加入质粒时体积不应大于感受态体积的1/10；质粒不纯或存在乙醇等有机物污染，转化效率急剧下降；质粒增大一倍，转化效率下降一个数量级。混入质粒时应轻柔操作。转化高浓度的质粒可相应减少最终用于涂板的菌量。平板上阳性克隆密度过大时，由于营养不足，阳性克隆生长变慢，菌落变小，为了获得大的菌落，应减少质粒用量；
(5)在37℃预热后转移至200r/min摇床培养活化2～3h(转化后预热能增加同源重组和菌体存活率)，使细菌充分活化；
(6)将菌体悬液涂布于含有Kan抗性的TSA琼脂平板上，每200μL涂布一块平板；
(7)将平板置于37℃恒温培养箱直至液体完全吸收，倒置平板，培养36～ 48h后观察结果；
(8)待菌长出，挑取单个菌落进行菌液PCR，将阳性条带对应的菌液进行测序；
(9)测序结果验证正确后得到禽多杀性巴氏杆菌内毒素减毒菌株，同时进行扩大培养，冻干保存菌于-80℃冰箱。
优化后的LpxE基因SEQ ID NO:2所构建的质粒pBackzero-lpxE转化到禽多杀性巴氏杆菌后PCR检测结果如图2所示，凝胶电泳检测条带大小约为750bp，与目的条带LpxE大小一致。最后得到的禽多杀性巴氏杆菌内毒素减毒菌株保存于华南农业大学人兽共患病防控制剂国家地方联合工程实验室，并采用该内毒素减毒菌株进行后续实验。
实施例2禽多杀性巴氏杆菌的类脂A的抽提与质谱分析
1、禽多杀性巴氏杆菌的类脂A的提取
(1)采用实施例1中构建得到的两种禽多杀性巴氏杆菌内毒素减毒菌株(由原始LpxE基因SEQ ID NO:1和优化后的LpxE基因SEQ ID NO:2所构建转化得到)和原始野生型菌株C48-1，提取类脂A，分别挑取单菌接种于10mL TSB培养基，37℃摇床培养16h；
(2)分别在300mL TSB培养基按1％的比例接入种子液扩大培养，于37℃， 180r/min过夜摇床培养24h；
(3)扩大培养的菌液经3500×g离心20min，收集菌体；
(4)然后分别将菌体沉淀用磷酸缓冲液(PBS)洗涤2次，5000r/min离心15min，再次收集菌体(为了把多余的培养基液体冲洗掉，防止对后续实验造成影响)；
(5)在沉淀下来的菌体中加入10mL双蒸水，用移液枪吹打混匀，让其充分重悬于双蒸水中，观察菌液状态为无明显菌团即可；
(6)取8mL菌液加入到100mL烧杯中，烧杯中放置一个磁力搅拌棒；
(7)将氯仿和甲醇以1:2:0.8的最终比例加入(氯仿:甲醇:水v/v)烧杯中，形成单相Bligh/Dyer混合物；
(8)将菌液和混合物的液体在室温磁力搅拌1h；
(9)将液体转移到Nalgene离心管中，2500×g离心20min；
(10)离心后有白色沉淀，弃去上清，将沉淀重新悬浮在19mL单相 Bligh/Dyer混合物中，洗涤一次；
(11)再次离心，弃上清液，稍微放置一会，待有机液体挥发，沉淀稍显干燥；
(12)加入13.5mL的12.5mM醋酸钠(pH 4.5)到干燥后的沉淀中，通过旋涡，让沉淀充分重悬；
(13)将重悬后的沉淀置于沸水中30分钟，从LPS中释放脂质A；
(14)冷却后加入15mL甲醇和15mL氯仿的1:1混合液(终比例2:2:1.8)；
(15)将混合液进行涡旋，使之充分裂解，充分提取脂质A；
(16)裂解结束后离心，2500×g离心20min，分离两相；
(17)利用移液器，小心将瓶子的下部即氯仿相地移到一个圆底烧瓶，并在旋转蒸发器上干燥30min，得到干燥的脂类A；
(18)将干燥的脂类A通过漩涡和超声溶解在氯仿:甲醇(2:1，v/v)中，转移到玻璃管，干燥，用特氟龙内衬帽密封，储存于-80℃；
2、类脂A的MALDI-TOF/TOF-MS质谱分析
类脂A的质谱分析在MALDI-TOF/TOF MS(基质辅助型激光解吸电离飞行时间串联质谱)负离子模式下进行。分别将提取到的三组(其中，A为采用野生菌株C48-1提取的类脂A，B为采用原始LpxE基因SEQ ID NO:1所转化的菌株提取的类脂A，C为优化后的LpxE基因SEQ ID NO:2所转化的菌株提取的类脂 A)将类脂A点样1μL至MALDI制样盘；接着加1μL溶解于氯仿/甲醇/水 (3:1.5:0.25，v/v/v)的基质液；调整激光的强度为500shots和50％laserpower 进行分析。
注意：对于MS/MS分析，在LIFT模式下进行。在MS质谱的基础上，选择母离子，在LIFT TOF/TOF模式下，进行MS/MS分析使用ES Tuning Mix (Agilent，Palo Alto，CA，USA)标准液进行仪器的校正。
类脂A质的质谱检测分析结果如图3所示，与B组相比C组采用的是优化后的LpxE基因，其中1500峰表达量急剧升高，表明优化后效果佳。同时表明，经过质谱分析确定在禽多杀性巴氏杆菌内毒素减毒菌株中LpxE特异性的去除了 C48-1菌株上部分类脂A1位上的磷酸基团，结果显示成功改造了巴氏杆菌的脂多糖结构，以下实施例均采用优化后的LpxE基因SEQ ID NO:2所构建的禽多杀性巴氏杆菌内毒素减毒菌株。
实施例3禽多杀性巴氏杆菌的脂多糖的抽提及分析
1、脂多糖的抽提
(1)根据实施2中优化结果的对比，采用实施例1中优化后的LpxE基因 SEQ ID NO:2所构建得到的禽多杀性巴氏杆菌内毒素减毒菌株和野生型菌株 C48-1提取脂多糖，分别接种于10mLTSB培养基，37℃摇床培养16小时；
(2)在100mL TSB培养基按1％的比例接入种子液，于37℃180r/min摇床培养48h；
(3)菌液经5000r/min离心5min，收集菌体；
(4)将菌体用磷酸缓冲液(PBS)洗涤2次，5000r/min离心15min，收集菌体后用无菌去离子水悬浮；
(5)菌悬液反复冻融4次后超声破碎，水浴加热至72℃，与等体积72℃的 88％的苯酚混合；
(6)在72℃水浴30min每隔数分钟剧烈搅拌一次，取出冷却至室温，3000g 离心20min；
(7)收集上层水相，下层酚相加等体积去离子水重复抽提1次，合并水相，流水透析24小时去酚；
(8)放烘箱8小时蒸发大部分水分，后加入蛋白酶k，Rnase，Dnase酶处理，后用去离子水透析一夜；
(9)收集后放烘箱8小时蒸发大部分水分，放冰箱冷冻，隔天冻干处理。
2、SDS-PAGE电泳及银染分析
(1)配制SDS-PAGE分离胶：采用垂直式电泳槽装置，配制10％和15％的分离胶。检查玻璃板的密封性，按照分离胶体系如表2和表3所示，配制分离胶混合液，并将混合液迅速倒入玻璃板间，倒入分离液之后，再加入1mL的异丙醇溶液，来平衡液面，等待30～60min完全凝固后配制层积胶；
表2 10％的PAGE分离胶
表3 15％的PAGE分离胶
(2)待分离胶完全凝固后，将异丙醇倒出，并用吸水纸吸去多余的异丙醇，按照层积胶的体系如表4所示配制层积胶。将混合均匀的层积胶迅速倒入玻璃板中，并且插入合适的梳子，等待30min左右，待层积胶凝固；
表4 SDS-PAGE层积胶
(3)蛋白胶处理：待30min左右层积胶完全凝固后，将配置好的SDS-PAGE 蛋白胶玻璃板固定在电泳槽上，加入电泳缓冲液，内槽电泳缓冲液没过玻璃板胶面，但是不溢出玻璃板，取出梳子，准备上样；
(4)样品处理：取出适量样品加入5×SDS上样缓冲液，混匀后，至沸水中煮10min，若加热后的样品有粘性产物，将样品进行瞬时离心后，取上清上样；
(5)上样：处理过的样品加入蛋白凝胶的样品孔中，同时加入等量的蛋白 Marker跑胶；
(6)电泳：上样后进行电泳，将电泳电压调节至80V，跑胶30min，待条带从层积胶跑至分离胶调节电压至120V，电泳时间由样品中的溴酚蓝到达玻璃板下端的时间而定；
(7)银染：将电泳后的蛋白胶取下，放入干净的容器内。加入30％的乙醇和10％的乙酸固定过夜，7g/L的高碘酸氧化10min；用去离子水洗涤凝胶3次，每次30min；用配置好的银氨溶液染色10min后，去离子水洗涤凝胶3次，每次10min；再用新配置好的0.05g/L的柠檬酸和0.002％的甲醛溶液显色10min (用前新配)，去离子水洗涤凝胶终止显色反应；
(8)用计算机成像系统进行拍照，凝胶保存于7％的冰醋酸中。
提取脂多糖的SDS-PAGE及银染检测图结果如图4所示，采用C48-1株及内毒素减毒菌株均可见明显条带，表明脂多糖提取成功。
实施例4脂多糖中内毒素含量检测及对细胞因子的刺激
1、脂多糖中内毒素含量检测
分别对野生型C48-1株及内毒素减毒菌株的脂多糖中内毒素含量进行检测，采用实施例3中提取的禽多杀性巴氏杆菌的脂多糖进行检测，脂多糖中内毒素含量检测使用鲎试剂0.5EU/mL以及内毒素含量小于0.003EU/mL的细菌内毒素检查用水，分别配制：样品溶液、样品阳性对照、阳性对照、阴性对照。
(1)样品溶液：冻干脂多糖称取10mg，加入10mL细菌内毒素检查用水，控制浓度均为1mg/mL，以5倍，10倍为梯度进行稀释；
(2)样品阳性对照：浓度1EU/mL的细菌内毒素工作标准和样品溶液1：1 比例混合溶液100μL；
(3)阳性对照：浓度1EU/mL的及细菌内毒素工作标准品和细菌内毒素检查用水1：1比例混合溶液100μL；
(4)阴性对照：100μL的细菌内毒素检查用水；
然后开启鲎试剂，加入0.65mL(按照标示规格)水复溶，将上述配制好的四组溶液后与已经复溶好的鲎试剂混匀后，以1:1比例加入无热原反应管 (8mm×50mm)中，终体积100μL，封闭管口，放入温度为37℃的水浴箱中，待60±2分钟后观察结果。
凝胶法的判定指标为：阳性：试管从恒温器中取出旋转180°时管内可形成凝胶并不会从管壁脱落或变形；阴性：试管从恒温器中取出旋转180°时管内无法形成凝胶或形成的凝胶发生从管壁脱落或变形的情况。注意：在拿取试管时要缓缓取出，避免因动作过大由于振动产生的假阴性结果。
利用鲎试剂对冻干脂多糖进行检测对比结果如下表5所示，表明C48-1株及内毒素减毒菌株的脂多糖利用鲎试剂凝胶法测得的内毒素致凝活性相差20倍，结果表明脂多糖结构改造后引起内毒素毒性下降。
表5利用鲎试剂对冻干脂多糖进行检测对比表
注：+：试管从恒温器中取出旋转180°时管内可形成凝胶并不会从管壁脱落或变形；
-：试管从恒温器中取出旋转180°时管内无法形成凝胶或形成的凝胶发生从管壁脱落或变形的情况。
2、脂多糖对小鼠巨噬细胞因子的刺激
采用优化后的LpxE基因SEQ ID NO:2所构建得到的禽多杀性巴氏杆菌内毒素减毒菌株和原始野生型菌株C48-1，刺激小鼠巨噬细胞，检测细胞经刺激后产生促炎因子含量，评估两者在细胞层面的毒力强弱。选取生长状况良好(对数生长期)的小鼠肺泡巨噬MH-S细胞，用0.5％胰酶消化后，采用细胞计数板用细胞完全培养液配成5×104个/mL的细胞悬液。
(1)培养瓶提前处理：准备100mL经高压灭菌处理的三蒸水，将多聚赖氨酸浓度稀释为0.01％，使用0.01％的多聚赖氨酸以50微升每平方厘米的量均匀涂于12孔培养板及培养瓶的培养表面进行包被处理，室温下静置5min，吸除多余液体，加入灭菌水，反复冲洗三次，处理后无菌晾干备用，回收后保持无菌的多聚赖氨酸可反复利用。
(2)将细胞悬液分为3个组分别为内毒素减毒菌株(Ft组)，C48-1株，空白组，接种于12孔培养板，每组设4个复孔，2mL/孔；用移液枪加入上述配好的细胞悬液，在5％CO2，37℃的细胞培养箱中培养。
(3)在72个小时后，弃去原有的细胞培养液，空白组加入细胞培养完全液，实验组分别加入含三种不同浓度的10μg/mL LPS的细胞培养完全液。
(4)将培养板在细胞培养箱孵育24小时后，收集各组细胞上清液，约1.5mL， 36个样品，各分装2管，每管700uL。备份存放-80℃冰箱。
3、鼠巨噬细胞经刺激后产生细胞因子的测量方式具体步骤如下
取上清进行系列的梯度稀释，然后用酶联免疫法(ELISA)测定相应细胞因子的含量。测定的细胞因子包括MH-S细胞产生的人白介素-6(IL-6)，肿瘤坏死因子α(TNF-α)以及促炎趋化因子(CXCL2)的含量。ELISA操作流程如下：
(1)加样：每孔各加入标准品或待测样品100uL，将反应板充分混匀后置37℃120分钟；
(2)洗板：用洗涤液将反应板充分洗涤4-6次，向滤纸上印干。每孔中加入第一抗体工作液100uL。将反应板充分混匀后置37℃60分钟；
(3)洗板：同前(2)；
(4)每孔加酶标抗体工作液100uL。将反应板置37℃30分钟；
(5)洗板：同前(2)；
(6)每孔加入底物工作液100uL，置37℃暗处反应15分钟；
(7)每孔加入100uL终止液混匀；
(8)30分钟内用酶标仪在450nm处测吸光值。
根据小鼠白介素-6ELISA试剂盒测定结果如图5所示，建立标准曲线如图 5A所示：y＝0.0022x+0.1973(R2＝0.9685)，与对照组相比，实验组产生细胞因子白介素6的含量显著下降，且差异显著(P<0.0001)如图5B所示；根据小鼠肿瘤坏死因子αELISA试剂盒测定结果如图6所示，建立标准曲线如图6A所示：y＝0.0021x+0.3815(R2＝0.9279)，与对照组相比，实验组产生细胞因子小鼠肿瘤坏死因子α的含量显著下降，且差异显著(P<0.0001)如图6B所示；根据小鼠趋化因子CXCL2试剂盒测定结果如图7所示，建立标准曲线如图7A所示：y＝0.0037x+0.0775(R2＝0.9992)，与对照组相比，实验组产生细胞因子小鼠趋化因子CXCL2的含量显著下降，且差异显著(P<0.0001)如图7B所示。
通过LPS刺激小鼠巨噬细胞并进行细胞因子测定，发现与C48-1组相比，内毒素减毒菌株刺激MH-S细胞产生的细胞因子IL-6，TNF-α以及趋化因子 CXCL2三者含量均显著下降，表明内毒素减毒菌株能大幅减少MH-S细胞促炎因子产生。
实施例5禽多杀性巴氏杆菌减毒疫苗株的制备及免疫
1、禽多杀性巴氏杆菌灭活疫苗的制备
分别制备原始野生型菌株C48-1与优化后LpxE基因SEQ ID NO:2所构建的禽多杀性巴氏杆菌灭活疫苗，以PBS加油佐剂乳化为空白对照组疫苗，制定免疫程序免疫实验动物，评估两者的安全性情况以及免疫保护力度。
(1)挑取转化好的优化后LpxE基因的禽多杀性巴氏杆菌内毒素减毒菌株和原始菌株C48-1的单菌落，接种到TSB培养溶液，在37℃摇菌过夜；
(2)以4000rpm/min离心10min，弃去上清液收集菌体；
(3)将沉淀重悬于PBS中，制备不少于109CFU/mL浓度的菌悬液(取100 μL做倍比稀释，最后取100μL涂TSB板计数)；
(4)在菌液中加入0.3mL/L的甲醛，37℃灭活48小时；经无菌试验后，制备油佐剂灭活疫苗，最终浓度约为1×109CFU/mL；
(5)制备对照组疫苗，采用PBS加油佐剂乳化制备得到空白对照组疫苗。
2、禽多杀性巴氏杆菌灭活疫苗的检验
(1)无菌检测：将上述制备的禽多杀性巴氏杆菌灭活疫苗和空白对照组疫苗分别接种到TSB培养溶液中，在37℃摇床摇菌48h，若培养基无细菌生长即为无菌检验合格。
(2)物理性状检查：采用离心加速分层法，将上述制备好的禽多杀性巴氏杆菌内毒素减毒菌株灭活疫苗和C48-1菌株灭活疫苗，以PBS加油佐剂乳化为空白对照组疫苗，在2000rpm离心10分钟，观察油水是否有分层现象发生；若无分层即为合格。
3、禽多杀性巴氏杆菌灭活疫苗的安全性评价
将上述制备的禽多杀性巴氏杆菌内毒素减毒灭活疫苗、C48-1灭活疫苗、空白对照组疫苗，三组分别注射到5只40日龄大小的蛋鸡上，注射的免疫剂量为 2mL，注射于每只鸡颈部皮下，注射后观察7-10天鸡群精神状态并于50天后剖检，观察疫苗残留情况。
4、禽多杀性巴氏杆菌灭活免疫程序
首免：40日龄，免疫剂量1mL·羽，颈部皮下注射；
二免：61日龄，免疫剂量1mL·羽，颈部皮下注射。
在进行二次免疫后第14天将试验鸡三组统一用禽多杀性巴氏杆菌C48-1株进行攻毒，肌肉注射活菌，攻毒后每天观察鸡的精神状态食欲，如果有死鸡将其解剖，观察病变并分离细菌连续观察7天并计算保护率。
疫苗皮下注射50天后疫苗残留情况如图8所示，结果表明采用空白对照疫苗无明显残留，如图8a、d、g所示；采用C48-1灭活疫苗均有少量残留，如图 8b、e、h所示；对比C48-1灭活疫苗，内毒素减毒灭活疫苗的残留量明显减少，如图8c、f、i所示。在使用2倍剂量注射对蛋鸡免疫，进行安全性检测，结果表明，经过免疫注射后鸡群无明显应激反应，在二次免疫后，采用内毒素减毒灭活疫苗的鸡群精神正常，而采用C48-1灭活疫苗注射的鸡群在三天内出现精神不振情况。
采用100LD50细菌剂量攻毒后，对照组鸡于攻菌24小时内全部死亡，且细菌分离结果全为阳性，说明攻毒成功；结果如下表6和7所示，而采用C48-1 灭活疫苗保护率为70％，内毒素减毒灭活疫苗保护效率为100％，表明内毒素减毒灭活疫苗安全性更好而且保护效率更高。
表6禽多杀性巴氏杆菌LD50测定结果
表7免疫保护情况
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<120> 一种禽多杀性巴氏杆菌内毒素减毒灭活疫苗菌株的构建方法及应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 720
<212> DNA
<213> LpxE基因(SIPOSequenceListing 1.0)
<400> 1
atgctcaaac agacattaca aacaaacttt caaggtttta aagatatttt taaaaaacca 60
aaactacaca atcataaatt gcctagatat ctacagttga aatatacgtt tataccatta 120
ttaattttgg taatttttgc atactataac ttagataccc cagttgagaa ctatatcaag 180
cattctatgc caaatattgt tggtgtaatt tttggtaaaa taactgatgt tggtaaggcc 240
gagtatattt tgataatttg cggtgtgata gtgttagcgc gtttatttac agatagccaa 300
aaattatctg ctaatactag agctatgttt gacaaggtgt cggcatatgc gggttttatc 360
ttagcaactg tagctattag tggtattttg ggacaaatac tcaagatgat aataggtaga 420
gcgcgtccta agtttttctt ggaatatggt tcgcattatt tccaacattt tcatgcacct 480
ggatatgatt ttgcaagtat gccgtcaggg cactcaatca cagttggagc aatgtttata 540
gcattttttt atattttccc taagctaaga tatttttggt atttgctgat agtggtattt 600
gctgggagta gaattatggt tggttcacat tatcctagtg atgtaatttt tggcgttgct 660
tttggttgtt actgtacagc atatatctac tattggatga gaaatagaga gattatttag 720
<210> 2
<211> 720
<212> DNA
<213> 优化后的LpxE基因(SIPOSequenceListing 1.0)
<400> 2
atgctcaaac agacactgca gatcaatttc caagggttca aggacatctt caaaaaaacg 60
aaattgcata accataagct ccctcgttac ctgcagctca agtatacgtt catcccactt 120
ctgatcctcg tgatttttgc atactataac ctcgacacgc cggtagaaaa ctacatcaaa 180
catagtatgc cgaatatcgt gggggttatt tttgggaaga ttacggatgt cgggaaggcg 240
gaatatattc tcattatctg tggtgtaatc gtcctggcgc gtttattcac tgattctcag 300
aagttaagtg ccaacacacg tgcgatgttc gacaaggtgt ctgcgtatgc gggttttatc 360
cttgcaaccg tcgccatctc aggtatcctc ggtcagattc tgaaaatgat catcgggcgc 420
gctcgtccta aattctttct tgaatatggc agtcactatt tccaacattt tcacgctcct 480
gggtacgatt ttgcgtccat gccgagtggt cacagcatca cagtaggtgc gatgttcatt 540
gctttctttt acattttccc taagttacgc tatttctggt acttgcttat tgtcgtattt 600
gcagggagcc gtattatggt gggttcccat tatccaagcg atgtaatttt cggggtagca 660
tttgggtgtt attgcacagc gtatatttac tattggatgc gtaaccgcga aatcatttaa 720

Claims (6)

1.一种禽多杀性巴氏杆菌内毒素减毒菌株的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1. 将进行密码子优化后的LpxE基因序列SEQ ID NO:2克隆到T载体上，构建表达LpxE基因的重组质粒，所述T载体为pBackZero-T Vector，克隆所用的扩增引物序列如SEQ IDNO:3～4所示；
S2. 将步骤S1的重组质粒转化到禽多杀性巴氏杆菌中，所述禽多杀性巴氏杆菌为鸡源血清型为A: 1的多杀性巴氏杆菌CVCC44801株；
S3. 鉴定确认得到含有SEQ ID NO:2所示LpxE基因的禽多杀性巴氏杆菌内毒素减毒菌株。
2. 根据权利要求1所述构建方法，其特征在于，步骤S1中克隆所用的扩增条件为：95℃10min；95℃ 15s、55℃ 20s、72℃ 60s，40个循环；72℃ 7min。
3. 根据权利要求1所述构建方法，其特征在于，步骤S1中克隆所用的扩增体系为：ddH2O20μL、2 × Phanta Max Master Mix 25μL、10 μM上游引物和下游引物各2μL、模板DNA 1μL。
4.一种禽多杀性巴氏杆菌内毒素减毒菌株，其特征在于，由权利要求1～3任一所述方法得到。
5.权利要求4所述内毒素减毒菌株在制备禽多杀性巴氏杆菌疫苗中的应用。
6.一种禽多杀性巴氏杆菌内毒素减毒灭活疫苗，其特征在于，含权利要求4所述减毒菌株。
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