CN104498418B - 一种基因调控延迟减毒和提高表达外源抗原猪霍乱沙门氏菌载体的构建方法 - Google Patents

一种基因调控延迟减毒和提高表达外源抗原猪霍乱沙门氏菌载体的构建方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种基因调控延迟减毒和提高表达外源抗原猪霍乱沙门氏菌载体的构建方法，将受体菌C78‑3与含有manA、crp、relA和asd缺失的自杀载体大肠杆菌供体菌结合，在野生型猪霍乱沙门氏菌C78‑3中分别引入突变ΔmanA，ΔPcrp::TT araC PBAD crp，ΔrelA::araC PBAD lacI TT和ΔasdA，引入这些突变后的猪霍乱沙门氏菌称为χ0011；并对四种突变进行表型鉴定。本发明可以使野生型猪霍乱沙门氏菌成为许多外源抗原的安全，有效的疫苗载体；为各种猪病，尤其是猪的许多细菌病提供由基因调控提高表达外源抗原猪霍乱沙门氏菌减毒载体，具有极大的市场应用性。

Description

一种基因调控延迟减毒和提高表达外源抗原猪霍乱沙门氏菌 载体的构建方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，特别涉及一种将野生型猪霍乱沙门氏菌毒力基因逐渐缺失的构建方法。
背景技术
沙门氏菌作为一种侵袭性胞内菌，其减毒后具有优先的侵袭能力，在体内生长缓慢，能够有效地持续刺激机体产生强有力的细胞免疫和体液免疫以及局部粘膜免疫。另外,沙门氏菌载体具有免疫佐剂作用,其LPS作为一种内在佐剂,可以刺激宿主细胞释放各种细胞因子。因此，减毒沙门氏菌在诱导体液和细胞免疫反应方面比灭活苗或者亚单位苗更有效。基因工程方法致弱的鼠伤寒沙门氏菌已被用作基因载体广泛表达外源基因,用于肿瘤、病毒病、细菌病、寄生虫病等的治疗研究,并取得良好效果。但是在许多研究报道中的沙门氏菌载体，要么使减毒载体过度减毒，失去了免疫原性；或者保留了良好的免疫原性，但是载体菌株却减毒不够，缺乏安全性而不能作为疫苗。因此迫切需要研制这样的一种疫苗载体，既要使疫苗载体足够减毒，保证动物完全的安全，又要使疫苗载体和其携带的外源抗原能够诱导出优秀的保护性抗体，抗击相关病原的感染。2008年，Curtiss R实验室首次使用pmi缺失和araC PBAD激活启动子技术使鼠伤寒沙门氏菌延迟减毒，使得疫苗株在体外培养时加入甘露糖和阿拉伯糖，接种小鼠时疫苗株没有减毒，而当细菌进入宿主体内，由于动物机体内没有甘露糖和阿拉伯糖，随着细菌的复制，毒力基因manA、crp、和relA就逐渐不能被表达使细菌减毒，达到疫苗株具备野生型菌株定居宿主淋巴组织的能力；araC PBAD对lacI基因表达的调控，可以提高外源基因的表达。另外为避免使用抗性基因质粒载体，保证减毒沙门氏菌中携带外源基因的质粒载体在宿主体内的稳定性，各种技术都被尝试。例如Red同源重组法和平衡-致死的细菌/载体系统法。其中平衡-致死的细菌/载体系统法是删除了细菌的asd基因，强制性地使细菌的生长需要人为加入二氨基庚二酸(是细菌细胞壁肽聚糖层的一种基本成分)，同时在表达外源抗原质粒载体上加入野生型细菌的asd基因。然后将asd+的质粒电转化到asd-的细菌载体上形成互补。但是以上都是关于鼠或人伤寒沙门氏菌的研究，以猪霍乱沙门氏菌为载体的研究，尤其是将manA(该基因等同于鼠伤寒的pmi基因)缺失和araC PBAD激活启动子技术应用于构建猪霍乱沙门氏菌减毒，在国内外还未见报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种基因调控延迟减毒和提高表达外源抗原猪霍乱沙门氏菌载体的构建方法，通过manA、araC PBAD激活启动子技术调控猪霍乱沙门氏菌毒力基因逐渐缺失，控制猪霍乱沙门氏菌毒力基因缺失的时机，使猪霍乱沙门氏菌在甘露糖和阿拉伯糖的调控下毒力逐渐减弱的同时，外源抗原的表达得以不断提高，最终使减毒株能够像野生型猪霍乱沙门氏菌那样高效率入侵宿主机体诱导优质的免疫原性后逐渐减毒，又能够高效率地表达外源抗原，获得理想的针对猪霍乱沙门氏菌和外源抗原的免疫原性。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种基因调控延迟减毒和提高表达外源抗原猪霍乱沙门氏菌载体的构建方法，包括以下步骤：(1)选择作为构建χ0011株的野生型猪霍乱沙门氏菌毒株C78-3作为受体菌；(2)构建基因、启动子缺失和插入araC PBAD结构的自杀载体，即ΔmanA，ΔPcrp::TT araCPBAD crp，ΔrelA::araC PBAD lacI TT和ΔasdA；(3)同源重组法将上一步的含有的基因或启动子缺失的自杀载体引入野生型猪霍乱沙门氏菌毒株C78-3中，引入这些突变后的猪霍乱沙门氏菌称为χ0011；(4)对四种突变进行表型鉴定。
本发明的猪霍乱沙门氏菌减毒突变株χ0011(ΔmanA，ΔPcrp::TT araC PBAD crp，ΔrelA::araC PBAD lacI TT和ΔasdA)，由本发明的发明人保藏在位于中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，保藏日为2014年11月14日，保藏编号为CGMCC NO.9968,该生物材料的分类命名为:猪霍乱沙门氏菌减毒株,拉丁文学名为:Salmonella Choleraesuis。
步骤(4)具体为：将猪链球菌II型菌株的6-PGD蛋白作为外源抗原插入原核表达载体pYA3493中，构建成表达外源抗原6-PGD的原核表达质粒pYA6-PGD；将原核表达载体pYA3493或pYA6-PGD电转化至减毒株χ0011，形成χ0011(pYA3493)或χ0011(pYA6-PGD)减毒株；测定中国商用猪霍乱沙门氏菌标准疫苗弱毒株C500、χ0011(pYA3493)或χ0011(pYA6-PGD)减毒株和野生型猪霍乱沙门氏菌C78-3的半数致死量，以及在BALB/c小鼠体内的定居水平，评价χ0011(pYA3493)或χ0011(pYA6-PGD)减毒株的减毒能力。
通过传代和PCR技术对χ0011(pYA6-PGD)减毒株携带外源抗原的质粒pYA6-PGD在体内外传代的稳定性进行检测。
使用BALB/c小鼠作为动物模型，猪链球菌II型野毒株作为攻毒株，评价χ0011(pYA6-PGD)减毒株的免疫效果。
本发明的有益效果是：
本发明以野生型猪霍乱沙门氏菌C78-3为母本，采用自杀载体，在C78-3猪霍乱沙门氏菌染色体上成功引入ΔmanA，ΔPcrp::TT araC PBAD crp，ΔrelA::araC PBAD lacI TT和ΔasdA四种基因改造，其中ΔmanA突变使沙门氏菌在不加甘露糖时manA基因不能表达而减毒，而araC PBAD结构是由阿拉伯糖调控毒力基因crp、relA和抑制原核表达载体pYA3493启动子表达的lacI；使经过基因改造的猪霍乱沙门氏菌C78-3在体外加入阿拉伯糖和甘露糖时可以像野生菌一样正常生长和入侵动物机体，并具备像野生菌一样的免疫原性；而当进入动物机体后，由于机体内缺乏阿拉伯糖和甘露糖，随着细菌的复制，外加的阿拉伯糖和甘露糖的浓度渐渐减弱直至消失，菌株的毒力基因manA，crp和lacI不能被表达，使猪霍乱沙门氏菌C78-3的毒力减弱；而随着lacI蛋白表达的减少，lacI基因抑制原核表达载体pYA3493的启动子的能力下降，从而使原核表达载体pYA3493表达外源抗原的能力逐渐提高，即使有免疫原性的外源基因表达的浓度不断地上升，以获得通过调控基因的表达，一方面使强毒株的毒力逐渐减弱，具备疫苗株良好的免疫原性和安全性的特性，另一方面可以提高外源抗原的表达，使疫苗株具备良好的保护效率。动物实验结果证明，本发明中的减毒株和现有弱毒疫苗株一样，它们的LD50比猪霍乱沙门氏菌强毒株要低10000倍，说明本发明中的减毒株具有与现有弱毒疫苗株一样的的安全性；通过比较定居能力，本发明减毒株在入侵宿主的肠道淋巴系统时比现有弱毒疫苗株强10-100倍的定居能力，并随着时间的延续，这种效应更加明显，这表明本发明中减毒株具有诱导更加持久和优质免疫的基础；为检测本发明减毒株的保护效率，我们以猪链球菌II型菌的6-PGD蛋白为对象，插入原核表达载体pYA3493中，然后转化到减毒株χ0011中，成为χ0011(pYA6-PGD)，经对BALB/c小鼠的免疫发现，携带6-PGD的χ0011可以100％抵抗野生型猪链球菌II型菌的攻击。
本发明在猪霍乱沙门氏菌C78-3染色体上构建的ΔmanA，ΔPcrp::TT araC PBADcrp，ΔrelA::araC PBAD lacI TT和ΔasdA四种基因缺失，可以使野生型猪霍乱沙门氏菌成为许多外源抗原的安全，有效的疫苗载体；为各种猪病，尤其是猪的许多细菌病提供由基因调控提高表达外源抗原的猪霍乱沙门氏菌减毒载体，具有极大的市场应用性，能够创造出显著的经济效益。
附图说明
本发明的猪霍乱沙门氏菌减毒突变株χ0011(ΔmanA，ΔPcrp::TT araC PBAD crp，ΔrelA::araC PBAD lacI TT和ΔasdA)，由本发明的发明人保藏在位于中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，保藏日为2014年11月14日，保藏编号为CGMCC NO.9968,该生物材料的分类命名为:猪霍乱沙门氏菌减毒株,拉丁文学名为:Salmonella Choleraesuis。
图1是ΔPcrp::TT araC PBAD crp基因缺失构建图；
图2是ΔPcrp::TT araC PBAD crp自杀载体图；
图3是ΔmanA基因缺失构建图；
图4是ΔmanA自杀载体图；
图5是ΔrelA::araC PBAD lacI TT基因缺失构建图；
图6是ΔrelA::araC PBAD lacI TT自杀载体图；
图7是Δasd基因缺失构建图；
图8是Δasd自杀载体图；
图9是ΔPcrp::TT araC PBAD crp缺失株阳性菌的PCR鉴定；
图10是ΔPcrp::TT araC PBAD crp缺失株阳性菌的表型鉴定；
图11是ΔmanA缺失株阳性菌的PCR鉴定；
图12是ΔmanA缺失株LPS表型鉴定；
图13是ΔrelA::araC PBAD lacI TT缺失株阳性菌的PCR鉴定；
图14是Western blot鉴定ΔrelA::araC PBAD lacI TT的表型；
图15是Δasd缺失株阳性菌的PCR鉴定；
图16是Δasd缺失株阳性菌的表型鉴定；
图17是asd+的未插入外源基因抗原的质粒pYA3493和插入6-PGD质粒pYA6-PGD的结构图；
图18是χ0011(pYA6-PGD)、C78-3和C500在猪肺巨噬细胞中的存活能力比较图；
图19是χ0011(pYA6-PGD)、χ0011(pYA3493)和C500在BALB/c小鼠中定居能力的比较图；
图20是pYA6-PGD质粒在χ0011(pYA6-PGD)中体外传代双酶切结果；
图21是pYA6-PGD质粒在χ0011(pYA6-PGD)中经口服BALB/c小鼠后不同时间段的双酶切图；
图22是动物保护效率实验图；
图23是ELISA检测χ0011(pYA6-PGD)诱导的抗6-PGD的IgG、IgA和抗沙门氏菌LPS的IgG抗体图。
具体实施方式
下面结合具体实施例子及附图对本发明做进一步说明。
实施例1
缺失manA、crp、relA和asd基因的自杀载体的构建
1.缺失crp基因的自杀载体的构建
在Genbank中搜索猪霍乱沙门氏菌的全基因序列，找到猪霍乱沙门氏菌的crp基因及其上游序列，在crp基因和上游基因中设计同源臂序列引物，删除crp基因启动子区的95个核苷酸，然后插入转录终止子(TT)和araC PBAD激活启动子序列1335bp，其删除和插入的系统为crp基因上游yhfA部分序列、删除crp基因启动子区的95个核苷酸、1335bp的转录终止子(TT)和araC PBAD激活启动子序列、删除95bp crp基因启动子后的crp序列，全称为ΔPcrp::TT araC PBAD crp(P表示启动子，TT表示转录终止子)(图1)；具体步骤是以猪霍乱沙门氏菌C78-3为模板，由引物P1和P2经PCR获得yhfA同源臂区，称为片段1(330bp)；由引物P3和P4经PCR获得删除crp基因启动子区的95个核苷酸后其余的crp基因中356bp同源臂称为片段2；由引物P5和P6经PCR获得TT araCPBAD结构序列，称为片段3；片段1与片段3经平端连接，连接产物转化至pGEM-T EasyVector克隆载体(商业购买)；将其连接序列酶切后补平，与片段2平端连接，连接产物转化至pGEM-T EasyVector克隆载体，产生ΔPcrp::TT araCPBAD crp结构序列，将阳性质粒送至Takara公司测序，获得正确的序列后，经SphI和SacI酶切，酶切产物连接至具有氯霉素和乳糖筛选标记的自杀载体pRE112中(图1，pRE112由美国Dr.Curtiss III惠赠)，通过酶切鉴定和序列测定，将正确的ΔPcrp::TT araC PBAD crp结构自杀载体电转化至工程菌大肠杆菌χ7213中，称为χ7213(pYAs001)，保存在-20℃冰箱中备用。
构建ΔPcrp::TT araC PBAD crp自杀载体的引物：
P1:5`-acatgcatgcATCTCCATCGGACTCGGCGCTTT-3`
P2:5-`catctgcagTTGTAGCCTGTAATGTGATGTCC-3`
P3:5`-ccgctcgagAGGATAACCGCGCATGGTGC-3`
P4:5`-tgcgagctcCAGAATATCCGGGTTGACCTG-3`
P5:
5`-GCCCTGCAGAGATCT
CCTGGTACCTAGGCCTCTAGATAAATAAAAGCAGTTTACAACTCCTAGAATTGTGAATATATTATCACAATTCTAGGATAGAATAATAAA-3`
P6:5`-AGAGGTACCCTCGAGGCTAGCCCAAAAAAACGGG-3`
2.缺失manA基因的自杀载体的构建
在Genbank中搜索猪霍乱沙门氏菌的全基因序列，找到猪霍乱沙门氏菌的manA基因及其上下游序列，在上下游基因中设计引物，以上下游基因的300bp左右为同源臂，删除manA基因，共计1176bp(图3)；具体步骤是以猪霍乱沙门氏菌C78-3为模板，由引物P1和P2经PCR获得ydgA同源臂基因序列，称为片段1(333bp)；由引物P3和P4经PCR获得fumA基因的同源臂序列，称为片段2(280bp)；将片段1和片段2补平后进行平端连接，连接转化至pGEM-TEasyVector克隆载体，提取阳性质粒，送至Takara公司进行序列测定；取正确序列的ΔmanA结构经KpnI和SacI酶切，连接至具有氯霉素和乳糖筛选标记的自杀载体pRE112中(图4)，通过酶切鉴定和序列测定，将正确缺失manA基因序列的pRE112载体电转化至工程菌大肠杆菌χ7213中，称为χ7213(pYAs002)。将鉴定正确的含有ΔmanA突变质粒的χ7213(pYAs002)保存在-20℃冰箱中备用。
P1:5`-GGGGAGCTCCGCTGGTAGTTTTGATAACTTAA-3`
P2:5`-CGGCCAACACAGCGCCGCGATTC-3`
P3:5`-CCATACCGAGCGGTAAGTGAG-3`
P4:5`-GGGGGTACCTTCGGCGACGGAAACATGTTCGCT-3`
3.构建ΔrelA::araC PBAD lacI TT基因突变自杀载体
在Genbank中搜索猪霍乱沙门氏菌的全基因序列，找到猪霍乱沙门氏菌的relA基因及其上下游序列(上游包括SCH2895，下游是ygcA基因)，在上下游基因中设计引物，以上下游基因的300bp左右为同源臂，删除relA基因的2247bp，然后插入araC PBAD lacI TT序列(图5)。具体步骤是以猪霍乱沙门氏菌C78-3为模板，由引物P1和P2经PCR获得ygcA同源臂区，称为片段1；由引物P3和P4经PCR获得relA2235前的SCH2895同源臂区，称为片段2；由引物P5和P6经PCR获得araC PBAD lacI TT结构序列，称为片段3；片段1经Bgl II酶切，片段2经Xbal酶切,片段3经Bgl II和Xbal双酶切；然后将片段1-3经连接酶连接，形成ΔrelA::araCPBAD lacI TT结构，将此连接产物转化至pGEM-T EasyVector克隆载体，提取阳性质粒，送至Takara公司进行序列测定；取正确序列的ΔrelA::araC PBAD lacI TT结构式经kpnI和SacI酶切，酶切产物连接至具有氯霉素和乳糖筛选标记的自杀载体pRE112中(图6)，通过酶切鉴定和序列测定，将正确的ΔrelA::araC PBAD lacI TT结构式自杀载体电转化至工程菌大肠杆菌χ7213中，称为χ7213(pYAs003)，保存在-20℃冰箱中备用。
P1:5`-CCCAAGCTTGAGCTCGAGGGCGTTCCGGCGCTGGTAGAA-3`
P2:5`-GAAGATCTAAGGGACCAGGCCTACCGAAG-3`
P3:5`-CGGAATTCACCCCAGACAGTAATCATGTAGCGGCT-3`
P4:5`-CGGGTACCCCAGATATTTTCCAGATCTTCAC-3`
P5:
5`-GCCCTGCAGAGATCTTTTATTATTCTATCCTAGAATTGTGATAATATATTCACAATTCTAGGAGTTGTAAACTGCTTTTATTTATCTAGAGGCCTAGGTACCAGG-3`
P6:5`-TGGTCTAGAGTCAAGCCGTCAATTGTCTGATTCG-3`
4.构建Δasd基因突变自杀载体
在Genbank中搜索猪霍乱沙门氏菌的全基因序列，找到猪霍乱沙门氏菌的asd基因及其上下游序列(上游包括glgB，下游是SCH3470和gntU基因)，在上下游基因中设计引物，以上下游基因各300bp左右为同源臂，删除asd基因的1104bp(图7)。具体步骤是以猪霍乱沙门氏菌C78-3为模板，由引物P1和P2经PCR获得SCH3470和gntU基因同源臂区，称为片段1(340bp)；由引物P3和P4经PCR获得asd基因前的glgB同源臂区，称为片段2(293bp)；将片段1和片段2酶切补平后进行平端连接，连接转化至pGEM-T EasyVector克隆载体，提取阳性质粒，送至Takara公司进行序列测定；取正确序列的Δasd结构经XbaI和XmaI酶切，连接至具有氯霉素和乳糖筛选标记的自杀载体pRE112中(图8)，通过酶切鉴定和序列测定，将正确的Δasd结构式自杀载体电转化至工程菌大肠杆菌χ7213中，称为χ7213(pYAs004)，保存在-20℃冰箱中备用。
P1：5`P1:5-TGCTCTAGA TGTGCATGGCAATCGCCCAAC-3`
P2：5`P2:5-GCATGC catagcgtttttttcctgcaa-3`
P3：5`P3:5-GAGCTC cgataagcgctgcaatagcca-3`
P4：5`P4:5-TCCCCCGGG TATCTGCGTCGTCCTACCTTC-3`
实施例2
猪霍乱沙门氏菌减毒株x0011的构建和鉴定
1.C78-3(ΔPcrp::TT araC PBAD crp)突变株的构建和鉴定
1.1C78-3(ΔPcrp::TT araC PBAD crp)突变株的构建
在1mLLB培养基中加入受体菌C78-3(野生型猪霍乱沙门氏菌强毒)，37℃培养过夜；同时在含有50mg/ml的2,6-二氨基庚二酸(2,6-diaminopimelic acid，DAP)，25mg/ml的氯霉素(chloramphenicol，Cm)的1mLLB培养液中加入供体菌χ7213(pYAs001)(ΔPcrp::TTaraC PBAD crp的自杀载体)，37℃培养过夜，使受体菌和供体菌发生结合。
1.2ΔPcrp::TT araC PBAD crp缺失株的筛选
将结合的菌落在含氯霉素的LB固体培养板上划单菌落；取生长的单菌落在1mLLB培养液中培养，37℃摇震培养至菌液浓度混浊；将菌液涂布于含5％蔗糖的LB固体培养板上，继续培养2～3d至在5％蔗糖的LB固体培养板上长出菌落。1.3C78-3(ΔmanAΔPcrp::TTaraC PBAD crp)突变株的PCR鉴定
将在5％蔗糖的LB固体培养板上长出的菌落，分别在LB固体培养板上和含氯霉素的LB固体培养板上划线；将在LB固体培养板上生长，但是在含氯霉素的LB固体培养板上不生长的菌落，
用引物P1(P1:acatgcatgcATCTCCATCGGACTCGGCGCTTT-3`)
和P4(5`-tgcgagctcCAGAATATCCGCGTTGACTTG-3`)进行PCR鉴定，ΔPcrp::TT araCPBAD crp缺失株阳性菌的PCR片段大小为2024bp，阴性菌的PCR片段大小为784bp(图9，图中，M：为DNA marker，DL2000；1-4:2024bp为阳性结果；5：为阴性对照)。
1.5ΔPcrp::TT araC PBAD crp突变株的表型鉴定
在含有阿拉伯糖和/或麦芽糖的麦康凯培养基上进行ΔPcrp::TT araC PBAD crp突变株的表型鉴定。由于crp基因能够利用麦芽糖发酵，使C78-3在没有缺失crp基因时在麦康凯上呈现红色菌落；当缺失crp基因时，菌落由于不能利用麦芽糖而使菌落呈现白色(图10左图)；而当在加入阿拉伯糖的麦康凯培养基上，由于阿拉伯糖调控crp基因的启动子能够进行工作，crp缺失株与野毒株C78-3一样能够利用阿拉伯糖，使之在含有阿拉伯糖的麦康凯上呈现红色(图10右左图，图中，A：加入麦芽糖的麦康凯培养基；左侧为野毒株C78-3、右侧为C78-3(ΔPcrp::TT araC PBAD crp)；B：加入麦芽糖和阿拉伯糖的麦康凯培养基，左侧为野毒株C78-3、右侧为C78-3(ΔPcrp::TT araC PBAD crp))。
2.C78-3(ΔPcrp::TT araC PBAD crp)+ΔmanA突变株的构建和鉴定
2.1供体菌和受体菌的结合
受体菌为C78-3(ΔPcrp::TT araC PBAD crp)突变株，供体菌为χ7213(pYAs002)(含ΔmanA自杀载体的大肠杆菌)。构建方法同实施1的1.1～1.2。2.2ΔmanA缺失株阳性菌的PCR鉴定
将在5％蔗糖的LB固体培养板上长出的菌落，分别在LB固体培养板上和含氯霉素的LB固体培养板上划线；将在LB固体培养板上生长，但是在含氯霉素的LB固体培养板上不生长的菌落，
用引物P1(5`-GGGGAGCTCCGCTGGTAGTTTTGATAACTTAA-3`)
和P4(5`-GGGGGTACCTTCGGCGACGGAAACATGTTCGCT-3`)进行PCR鉴定，ΔmanA缺失株阳性菌的PCR片段大小为613bp，阴性菌的PCR片段大小为1783bp(图11，图中，M:DL2000；1-4:阳性结果(613bp)；5：阴性对照(1783bp))。
2.3ΔmanA缺失株阳性菌的表型鉴定
manA基因缺失突变后，在6-磷酸果糖生成6-磷酸甘露糖的过程中缺少了磷酸甘露糖异构酶，突变菌就不能合成LPS o-抗原的侧链，在LPS中o-抗原就会变成光滑的条带；但是在体外培养时，人工加入甘露糖后，具有ΔmanA突变的细菌可以合成LPS o-抗原(见图12，图中，ΔmanA缺失株无甘露糖时失去o抗原：A：ΔmanA缺失株；B：C500弱毒株；C：C78-3强毒株)。
3.C78-3(ΔPcrp::TT araC PBAD crpΔmanA)+ΔrelA::araC PBAD lacI TT突变株的构建和鉴定
3.1C78-3(ΔPcrp::TT araC PBAD crpΔmanA)+ΔrelA::araC PBAD lacI TT突变株的构建
受体菌为C78-3(ΔPcrp::TT araC PBAD crpΔmanA)突变株，供体菌为χ7213(pYAs003)(含ΔrelA::araC PBAD lacI TT自杀载体的大肠杆菌)。构建方法同实施1的1.1～1.2。
3.2C78-3(ΔPcrp::TT araC PBAD crpΔmanA)+ΔrelA::araC PBAD lacI TT突变株的PCR鉴定
将5％蔗糖的LB固体培养板上长出的菌落，分别在LB固体培养板上和含氯霉素的LB固体培养板上划线；将在LB固体培养板上生长，但在含氯霉素的LB固体培养板上不生长的菌落，
用引物P1(5`-CCCAAGCTTGAGCTCGAGGGCGTTCCGGCGCTGGTAGAA-3`)
和P4(5`-CGGGTACCCCAGATATTTTCCAGATCTTCAC-3`)进行PCR鉴定，ΔrelA::araCPBAD lacI TT缺失株阳性菌的PCR片段大小为3307bp，阴性菌的PCR片段大小为3125bp(图13，图中，M：DL1000；1-2：阳性结果(3307bp))。
3.3C78-3(ΔPcrp::TT araC PBAD crp，ΔmanA，ΔrelA::araC PBAD lacI TT)突变株中ΔrelA::araC PBAD lacI TT的表型鉴定
在ΔrelA::araC PBAD lacI TT突变的结构中，由阿拉伯糖控制lacI基因的表达。即当有阿拉伯糖存在时，lacI基因被表达，表达的lacI蛋白就抑制沙门氏菌突变株携带的原核表达载体表达外源蛋白；反之，当在没有阿拉伯糖存在的动物机体内，lacI基因不能被表达，沙门氏菌突变株携带的原核表达载体就能更高效地表达外源蛋白。
由于本实验需要突变菌株携带的外源蛋白的配合，因此我们使用了表达猪链球菌II型的外源蛋白6-PGD的减毒株χ0011(pYA6-PGD)(ΔPcrp::TT araC PBAD crp，ΔmanA，ΔrelA::araC PBAD lacI TT，ΔasdA)作为验证ΔrelA::araC PBAD lacI TT表型的菌株。即在培养突变株χ0011(pYA6-PGD)第一代时，加入0.2％阿拉伯糖和0.2％甘露糖；从第二代培养开始，就不加阿拉伯糖和甘露糖，这样连续传代培养10代。随着传代代数的增加，细菌中阿拉伯糖的含量逐渐减少，lacI基因的表达就完全被抑制，沙门氏菌突变株携带的原核表达载体表达外源抗原6-PGD蛋白表达量就逐渐增高，由Western blot的实验结果证明随着传代代数的增加，6-PGD蛋白表达量逐渐增高，见图14，图中，1～10:χ0011(pYA6-PGD)在营养培养液中传的代次；6-PGD:53kD。
4.C78-3(ΔmanAΔPcrp::TT araC PBAD crpΔrelA::araC PBAD lacI TT)+Δasd突变株的构建和鉴定
4.1C78-3(ΔmanAΔPcrp::TT araC PBAD crpΔrelA::araC PBAD lacI TT)+Δasd突变株的构建
受体菌为C78-3(ΔmanAΔPcrp::TT araC PBAD crppΔrelA::araC PBAD lacI TT)突变株，供体菌为χ7213(pYAs004)(含Δasd自杀载体的大肠杆菌)。构建方法同实施1的1.1～1.3。
4.2C78-3(ΔmanAΔPcrp::TT araC PBAD crpΔrelA::araC PBAD lacI TT)+Δasd突变株的Δasd PCR鉴定。
将在5％蔗糖的LB固体培养板上长出的菌落，分别在含DAP的LB固体培养板上和同时含DAP和氯霉素的LB固体培养板上划线；将在含DAP的LB固体培养板上生长，但是在含DAP和氯霉素的LB固体培养板上不生长的菌落，用引物P1(5`-TGCTCTAGATGTGCATGGCAATCGCCCAAC-3`)和P4(5`-TCCCCCGGGTATCTGCGTCGTCCTACCTTC-3`)进行PCR鉴定，Δasd缺失株阳性菌的PCR片段大小为633bp，阴性菌的PCR片段大小为1719bp(图15，图中，M：DL10000；1-2：Δasd基因阳性菌(633bp))。将C78-3(ΔmanAΔPcrp::TT araC PBAD crpΔrelA::araC PBAD lacI TTΔasd)突变株命名为χ0011突变株。
4.3χ0011突变株的表型鉴定
asd基因是二氨基庚二酸(DAP)生物合成途径中的必须酶，Δasd突变株在无外源DAP条件下溶菌死亡。C78-3(ΔPcrp::TT araC PBAD crp，ΔmanA，ΔrelA::araC PBAD lacITT，ΔasdA)，即χ0011缺失株在含有外源DAP的LB中能生长，而在普通LB培养基中不能生长，见图16，A：χ0011在不含DAP的LB中不生长；B：χ0011在含DAP的LB中生长。
实施例3
猪霍乱沙门氏菌减毒株χ0011平衡-致死的细菌-载体系统的构建
为避免使用耐药或含抗性基因的质粒载体，保证减毒沙门氏菌中的质粒载体在宿主体内的稳定性，我们在猪霍乱沙门氏菌减毒株C78-3(ΔmanAΔPcrp::TT araC PBAD crpΔrelA::araC PBAD lacI TT)染色体上缺失了asd基因，依据本实验室的命名顺序，将此突变株命名为χ0011。当缺失asd基因的菌株在体外培养时可以通过加入二氨基庚二酸(diaminopimelic acid，DAP)，弥补由于缺失asd基因后细菌不能生长的缺陷。但是由于动物机体内没有二氨基庚二酸，缺失asd基因的沙门氏菌在动物体内就不能存活，因此，Dr.Curiss III实验室发明了在表达外源性抗原质粒载体上加入野生型细菌的asd基因,即质粒pYA3493asd+，或者是插入猪链球菌II型的6-PGD基因的质粒pYA6-PGD(见图17)，然后将asd+的原核表达载体质粒电转化到asd-的细菌载体上形成互补，使缺失asd基因的沙门氏菌在动物体内可以存活的同时，避免使用耐药或抗性基因质粒载体。
因此本实施首先将突变菌株χ0011[C78-3(ΔmanAΔPcrp::TT araC PBAD crpΔrelA::araC PBAD lacI TTΔasd)]制作成感受态。具体步骤是：挑取单菌落χ0011用含有50mg/ml DAP的2mL的LB培养液培养过夜；次日按1:100比例，将过夜培养的菌液接种至20mL的LB培养液继续培养，振荡培养至OD600≈0.6(3～4h)，冰浴10min，4℃、1500rpm离心10min收集细菌，沉淀细菌用冰浴预冷的10％甘油洗3遍，用25μl预冷的10％甘油重悬，即为χ0011的感受态细胞。获得χ0011的感受态细胞后，用氯化钙法，取1μL的质粒pYA3493(由Dr.Curiss III惠赠)或者pYA6-PGD转化至χ0011的感受态细胞中；将转化产物涂布于含有0.2％阿拉伯糖和0.2％甘露糖的LB固体培养板上培养过夜(不含DAP)；取长出的单个菌落继续培养提取质粒(pYA3493或者pYA6-PGD)，经EcoRI单酶切，获得3845bp条带的菌株即为携带质粒pYA3493的χ0011，称为χ0011(pYA3493)；或者单酶切后获得4541bp条带的菌株为携带pYA6-PGD的χ0011，成为χ0011(pYA6-PG)；χ0011(pYA3493)或χ0011(pYA6-PG)能够在不加DAP的培养条件或在没有DAP的动物体内生长。
实施例4
猪霍乱沙门氏菌减毒株χ0011(pYA6-PGD)与野毒株C78-3、弱毒疫苗株C500的毒力比较
1.减毒株半数致死量(LD50)的测定
为测定猪霍乱沙门氏菌减毒株χ0011的毒力，取野毒株C78-3，中国现用猪霍乱沙门氏菌弱毒疫苗株C500、表达6-PGD的猪霍乱沙门氏菌减毒株χ0011(pYA6-PGD)三株同时进行菌株半数致死量(LD50)的测定。
从-70℃超低温冰箱中取出实验菌株，无菌划线培养于LB固体培养平板上，37℃静置培养过夜；次日挑取菌落置于5mL的LB培养液中，37℃静置培养18h；取其中的2.5mL置于47.5mL的LB培养液中；用于培养突变株x0011(pYA6-PGD)的LB培养液加入0.2％的阿拉伯糖和0.2％甘露糖；等细菌浓度达到OD值为0.8～0.9时，取出菌株培养液，离心，将细菌浓度调节到1010CFU/ml后，用PBS 10倍稀释到不同的稀释浓度。
120只雌性6周龄BALB/c鼠随机分成12小组，每小组10只小鼠。4小组用于野毒株C78-3的LD50的测定，稀释度分别是100，10-1，10-2和10-3；4小组用于中国现用弱毒疫苗株C500的LD50的测定，稀释度分别是10-5，10-6，10-7和10-8；4小组用于猪霍乱沙门氏菌减毒株χ0011(pYA6-PGD)的LD50的测定，稀释度分别是10-5，10-6，10-7和10-8；每只小鼠用100ul细菌悬液腹腔注射，连续观察30日，计算小鼠的死亡数。实验结果显示野毒株C78-3的LD50是2.2×102；弱毒疫苗株C500的LD50是2.8×107；减毒株χ0011(pYA6-PGD)的LD50是1.4×107(见表1)。结果表明，减毒株的毒力比强毒株的毒力降低了1.57×105倍，与商用中国沙门氏菌弱毒疫苗株C500的毒力相似。证明猪霍乱沙门氏菌减毒株χ0011(pYA6-PGD)与中国现用弱毒疫苗株C500一样安全减毒。本实验共计做了2次，结果为2次试验的平均值。
表1突变株χ0011(pYA6-PGD)对6周龄BALB/c鼠的LD50
2.减毒株χ0011(pYA6-PGD)在猪肺巨噬细胞中的存活能力的比较
对野毒株C78-3、商用疫苗株C500和减毒沙门氏菌χ0011(pYA6-PGD)进行猪肺巨噬细胞的黏附与增殖实验，结果显示χ0011(pYA6-PGD)在猪肺巨噬细胞中的存活能力体现了逐渐减毒的特性，即在入侵猪肺巨噬细胞24h，χ0011(pYA6-PGD)在猪肺巨噬细胞中的存活能力与野毒株C78-3一致，而疫苗弱毒株C500已明显弱于χ0011(pYA6-PGD)(**:p<0.01)；在入侵猪肺巨噬细胞48h和72h，χ0011(pYA6-PGD)的存活能力明显弱于野毒株C78-3(##:p<0.01)，但是却明显强于疫苗弱毒株C500(##:p<0.01)。如图18，图中，**:p<0.01,χ0011(pYA6-PGD)在猪肺巨噬细胞中的存活能力显著高于C500；##:p<0.01,χ0011(pYA6-PGD)在猪肺巨噬细胞中的存活能力显著低于C78-3。
实施例5
猪霍乱沙门氏菌减毒株χ0011(pYA6-PGD)的定居能力评价
以减毒沙门氏菌作为粘膜免疫用基因工程疫苗活载体具有无可比拟的优越性。但是在病原菌对宿主的减毒力度与免疫效率之间的平衡是非常困难的。许多实验要么使细菌过度减毒，损伤了免疫原性；而当保留了较好的免疫原性，细菌却不够减毒，引起宿主的各种临床症状。本专利是专为解决这个难题设计的，即我们的目的是使用甘露糖和阿拉伯糖调控延迟减毒技术，对猪霍乱沙门氏菌染色体上的4个基因进行调控延迟减毒的遗传学的操作，使得病原菌在减毒前能具备像野生型菌株一样的定居宿主淋巴组织的能力，以保持高度的免疫原性；当病原菌进入宿主后，由于宿主体内没有甘乳糖和阿拉伯糖的提供，细菌呈现出高度减毒的特性，保证减毒菌株对动物的安全性。为检验本专利的有效性，我们检测了减毒株χ0011(pYA6-PGD)、χ0011(pYA3493)与中国商用弱毒疫苗株C500(弱毒的对照组)在BALB/c小鼠的肝脏、脾脏和肠道派伊尔小结(payer`s patches)的定居能力。
从-70℃超低温冰箱中取出实验菌株，无菌划线培养于LB固体培养平板上，37℃静置培养过夜；次日挑取菌落置于5mL的LB培养液中，37℃静置培养18h；取其中的2.5mL置于47.5mL的LB培养液中；用于培养χ0011(pYA6-PGD)和χ0011(pYA3493)突变株的LB培养液加入0.2％的阿拉伯糖和0.2％甘露糖；等细菌浓度达到OD值为0.8～0.9时，取出菌株培养液，离心，将细菌浓度调节到1010CFU/ml。
60只6周龄BALB/c小鼠随机分成20小组，每小组3只小鼠。5小组用于野毒株C78-3的定居实验；5小组用于疫苗株C500的定居实验；5小组用于猪霍乱沙门氏菌减毒株χ0011(pYA6-PGD)的定居实验；5小组用于猪霍乱沙门氏菌减毒株χ0011(pYA3493)的定居实验；每只小鼠口服20ul细菌悬液，细菌口服量为109；每株菌株分别在接种后第3d、7d、14d、21d和28d取3只小鼠的肝脏、脾脏和肠道的派伊尔小结(payer s patches)，经称重和无菌研磨，涂布于麦康凯培养基中分离细菌，计算分离的每mg的细菌量。实验结果显示，由于猪霍乱野毒株C78-3是强毒株，BALB/c小鼠在口服109的C78-3后的第3d就有大批小鼠死亡，无法将C78-3的定居实验进行下去；而疫苗株C500、减毒株χ0011(pYA6-PGD)和χ0011(pYA3493)在口服109菌量后28d的时间内，小鼠没有发生死亡；在肝脏和脾脏，口服疫苗株C500后第3d和第7d的细菌量明显低于减毒株χ0011(pYA6-PGD)和χ0011(pYA3493)(@:p<0.05；@@:p<0.01；*:p<0.05；**:p<0.01)，但是在第14d及其以后细菌的分离量与减毒株χ0011(pYA6-PGD)和χ0011(pYA3493)没有显著差异；但是在肠道的派伊尔淋巴小结中，减毒株χ0011(pYA6-PGD)和χ0011(pYA3493)在口服后第3d，细菌的定居能力与C500一样，没有区别；然而在口服后第7d开始，减毒株χ0011(pYA6-PGD)和χ0011(pYA3493)在派伊尔淋巴小结中的定居能力明显高于弱毒疫苗株C500，体现了超强的定居肠道相关淋巴结的能力(**：P<0.01；##:p<0.01；$$:p<0.01；&&:p<0.01),成为能提高免疫原性的有力依据。本实验重复3次，结果为3次实验的平均值。见图19，图中，@：P<0.05；在接种后第3d，C500与χ0011(pYA6-PGD)和χ0011(pYA3493)的定居能力比较,差异显著；*:P<0.05；**：P<0.01；在接种后第7d，C500与χ0011(pYA6-PGD)和χ0011(pYA3493)定居能力比较,差异显著；#：P<0.05；##:p<0.01；在接种后第14d，C500与χ0011(pYA6-PGD)和χ0011(pYA3493)的定居能力比较,差异显著；$$:p<0.01，在接种后第21d，C500与χ0011(pYA6-PGD)和χ0011(pYA3493)的定居能力比较，差异显著；&&:p<0.01，在接种后第28d，C500与χ0011(pYA6-PGD)和χ0011(pYA3493)的定居能力比较，差异显著。
实施例6
猪霍乱沙门氏菌减毒株中表达外源蛋白载体pYA6-PGD在体内外的稳定性实验
1.猪霍乱沙门氏菌减毒株中表达外源蛋白载体pYA6-PGD在体外的稳定性实验将含有表达外源蛋白载体pYA6-PGD的猪霍乱沙门氏菌减毒株χ0011(pYA6-PGD)培养于含0.2％的阿拉伯糖和0.2％甘露糖的LB培养基中，37℃过夜；次日按照1:100的比例将培养过夜的菌液接种到新的含0.2％的阿拉伯糖和0.2％甘露糖的LB培养基中，37℃培养过夜；如此重复χ0011(pYA6-PGD)进行传代培养；当传代培养60代后，将菌液离心，取沉淀，提取质粒；将质粒经双酶切,电泳后获得3845bp的pYA3493原核表达载体和外源蛋白1428bp的6-PGD目的片段后，经对6-PGD目的片段测序，证明表达外源蛋白载体pYA6-PGD稳定地存在于猪霍乱沙门氏菌减毒株χ0011中(图20，图中，M：DNA marker DL10000；10-60：χ0011(pYA6-PGD)传10-60代经双酶切后载体pYA3493和6-PGD目的片段)。
2.猪霍乱沙门氏菌减毒株中表达外源蛋白载体pYA6-PGD在体外的稳定性实验
用12只BALB/c小鼠分成4小组，每小组3只小鼠。每只小鼠口服20ul细菌χ0011(pYA6-PGD)悬液，细菌口服量为109CFU/mL；分别在接种后第7d、14d、21d和28d取3只小鼠的肝脏、脾脏和肠道的派伊尔小结(payer s patches)，经无菌研磨，涂布于麦康凯培养基中分离细菌。将在麦康凯培养基中生长的减毒株，每个时间段，每个器官挑取3个单菌落进行扩大培养后，提取质粒，将质粒经双酶切,电泳后获得3845bp的pYA3493原核表达载体和外源蛋白1428bp的6-PGD，证明表达外源蛋白载体pYA6-PGD的质粒稳定地存在于猪霍乱沙门氏菌减毒株χ0011中(图21，图中，M：DNA marker DL10000；口服BALB/c小鼠在第7d、14d、21d、28d后组织中，χ0011(pYA6-PGD)经双酶切获得的pYA3493和6-PGD目的片段)。
实施例7
猪霍乱沙门氏菌减毒株携带外源抗原的动物保护性实验
用30只BALB/c小鼠分成3组，每组10只小鼠。第一组小鼠口服免疫χ0011(pYA6-PGD)，细菌口服剂量为1.2×109；第二组小鼠口服免疫χ0011(pYA3493)，细菌口服剂量为1.6×109；第三组小鼠作为空白对照，口服BSG；在首次免疫后3周，对第一和第二组的小鼠用相应的减毒菌和剂量加强免疫一次。在首次免疫后3周和加强免疫后2周对小鼠的颌下静脉采血制备其血清，分别用于检测针对猪链球菌6-PGD蛋白和针对减毒沙门氏菌LPS的IgG抗体；对免疫小鼠收集阴道冲洗液，用于检测由χ0011(pYA6-PGD)诱导的针对猪链球菌6-PGD蛋白的黏膜免疫的IgA抗体；在加强免疫后2周，用10×LD50的猪链球菌II型菌对以上3个实验组进行攻毒，并对攻毒的小鼠观察4周。本实验重复3次，实验结果为3次实验的总结。
我们的结果表明，在χ0011(pYA6-PGD)接种组，经10×LD50的猪链球菌II型菌攻毒后，在攻毒后的96h内，有部分小鼠的皮毛蓬乱，但随后恢复正常，连续观察28天后，实验小鼠的存活率为100％，而空载体χ0011(pYA3493)试验组和空白对照组在攻毒后96小时内所有小鼠死亡(见图22)。同时对首免后3周，加强免疫后2周的实验小鼠的血清进行检测，结果显示，χ0011(pYA6-PGD)加强免疫后针对6-PGD产生的IgG和IgA抗体明显高于首免后产生的抗体(@:P<0.01)，首免和加强免疫诱导抗6-PGD的IgG和IgA抗体也都明显高于BSG对照组和χ0011(pYA3493)空载体组(**：p<0.01,首免3周后的比较；##：p<0.01,加强免疫2周后的比较)；χ0011(pYA6-PGD)和χ0011(pYA3493)在首免后3周和加免后2周产生了较高的针对沙门氏菌的LPS抗体，二者之间没有差异，但是空白对照组(BSG组)没有检测到LPS的抗体(&&：p<0.01,首免后3周，χ0011(pYA6-PGD)和χ0011(pYA3493)与BSG组比较；$$:p<0.01加免后2周，χ0011(pYA6-PGD)和χ0011(pYA3493)与BSG组比较)，如图23。
综上所述，本申请采用的一种基因调控延迟减毒和提高表达外源抗原猪霍乱沙门氏菌载体的构建方法，成功地获得了一株猪霍乱沙门氏菌减毒株。该减毒株和现有弱毒疫苗株一样，它们的LD50比猪霍乱沙门氏菌强毒株要低10000倍，说明本申请中的减毒株具有与现有弱毒疫苗株一样的的安全性；通过比较定居能力，本申请减毒株在入侵宿主的肠道淋巴系统时比现有弱毒疫苗株强10-100倍的定居能力，并随着时间的延续，这种效应更加明显，这表明本申请减毒株具有诱导更加持久和优质免疫的基础；为检测本申请减毒株的免疫原性，我们以猪链球菌II型的6-PGD蛋白为对象，插入原核表达载体pYA3493中，然后转化到减毒株χ0011中，成为χ0011(pYA6-PGD)，经对BALB/c小鼠的免疫发现，携带6-PGD的χ0011可以100％抵抗野生型猪链球菌II型菌的攻击。

Claims (1)

1.一种基因调控延迟减毒和提高表达外源抗原猪霍乱沙门氏菌载体的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：(1) 选择作为构建 χ0011 株的野生型猪霍乱沙门氏菌毒株 C78-3作为受体菌；(2) 构建基因、启动子缺失和插入 araC PBAD结构的自杀载体，即 ΔmanA， ΔPcrp::TT araC PBAD crp，ΔrelA::araC PBAD lacI TT 和 ΔasdA ；(3) 同源重组法将上一步的含有的基因或启动子缺失的自杀载体引入野生型猪霍乱沙门氏菌毒株 C78-3 中，引入这些突变后的猪霍乱沙门氏菌称为 χ0011 ；(4) 对四种突变进行表型鉴定；
所述猪霍乱沙门氏菌减毒突变株 χ0011，保藏在位于中国北京市朝阳区北辰西路 1号院 3 号的中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏日为 2014 年 11 月 14 日，保藏编号为 CGMCC NO.9968, 该生物材料的分类命名为 : 猪霍乱沙门氏菌减毒株 , 拉丁文学名为 :Salmonella Choleraesuis；
其中，步骤（2）具体包括：
1）缺失 crp 基因的自杀载体的构建
在 Genbank 中搜索猪霍乱沙门氏菌的全基因序列，找到猪霍乱沙门氏菌的 crp 基因及其上游序列，在 crp 基因和上游基因中设计同源臂序列引物，删除 crp 基因启动子区的 95 个核苷酸，然后插入转录终止子 TT和 araC PBAD激活启动子序列 1335bp，其删除和插入的系统为 crp 基因上游 yhfA 部分序列、删除 crp 基因启动子区的 95 个核苷酸、1335bp的转录终止子 TT 和 araC PBAD激活启动子序列、删除 95bp crp 基因启动子后的crp 序列，全称为 ΔPcrp::TT araC PBAD crp；具体步骤是以猪霍乱沙门氏菌 C78-3 为模板，由引物 P1 和 P2 经 PCR 获得 yhfA 同源臂区，称为片段 1；由引物 P3 和 P4 经PCR 获得删除 crp 基因启动子区的 95 个核苷酸后其余的 crp 基因中 356bp 同源臂称为片段 2 ；由引物 P5 和 P6 经 PCR 获得 TT araCPBAD结构序列，称为片段 3 ；片段 1与片段 3 经平端连接，连接产物转化至 pGEM-T EasyVector 克隆载体 ；将其连接序列酶切后补平，与片段 2 平端连接，连接产物转化至 pGEM-T EasyVector 克隆载体，产生 ΔPcrp::TT araC PBAD crp 结构序列，将阳性质粒送至 Takara 公司测序，获得正确的序列后，经 SphI 和 SacI 酶切，酶切产物连接至具有氯霉素和乳糖筛选标记的自杀载体pRE112 中 ，通过酶切鉴定和序列测定，将正确的 ΔPcrp::TT araC PBAD crp 结构自杀载体电转化至工程菌大肠杆菌 χ7213 中，称为χ7213(pYAs001)，保存在 -20℃冰箱中备用；
构建 ΔPcrp::TT araC PBAD crp 自杀载体的引物：
P1:5`-acatgcatgcATCTCCATCGGACTCGGCGCTTT-3`
P2:5-`catctgcagTTGTAGCCTGTAATGTGATGTCC-3`
P3:5`-ccgctcgagAGGATAACCGCGCATGGTGC-3`
P4:5`-tgcgagctcCAGAATATCCGGGTTGACCTG-3`
P5:5`-GCCCTGCAGAGATCTCCTGGTACCTAGGCCTCTAGATAAATAAAAGCAGTTTACAACTCCTAGAATTGTGAATATATTATCACAATTCTAGGATAGAATAATAAA-3`
P6:5`-AGAGGTACCCTCGAGGCTAGCCCAAAAAAACGGG-3`；
2）缺失 manA 基因的自杀载体的构建
在 Genbank 中搜索猪霍乱沙门氏菌的全基因序列，找到猪霍乱沙门氏菌的 manA 基因及其上下游序列，在上下游基因中设计引物，以上下游基因的 300bp 左右为同源臂，删除 manA 基因，共计 1176bp ；具体步骤是以猪霍乱沙门氏菌 C78-3 为模板，由引物 P1和 P2 经 PCR 获得 ydgA 同源臂基因序列，称为片段 1 ；由引物 P3 和 P4 经 PCR 获得fumA基因的同源臂序列，称为片段 2；将片段 1 和片段 2 补平后进行平端连接，连接转化至 pGEM-T EasyVector 克隆载体，提取阳性质粒，送至 Takara 公司进行序列测定；取正确序列的 ΔmanA 结构经 KpnI 和 SacI 酶切，连接至具有氯霉素和乳糖筛选标记的自杀载体 pRE112 中，通过酶切鉴定和序列测定，将正确缺失 manA 基因序列的 pRE112 载体电转化至工程菌大肠杆菌 χ7213 中，称为 χ7213(pYAs002)；将鉴定正确的含有 ΔmanA突变质粒的 χ7213(pYAs002)保存在 -20℃冰箱中备用；
P1:5`-GGGGAGCTCCGCTGGTAGTTTTGATAACTTAA-3`
P2:5`-CGGCCAACACAGCGCCGCGATTC-3`
P3:5`-CCATACCGAGCGGTAAGTGAG-3`
P4:5`-GGGGGTACCTTCGGCGACGGAAACATGTTCGCT-3`；
3）构建 ΔrelA::araC PBAD lacI TT 基因突变自杀载体
在 Genbank 中搜索猪霍乱沙门氏菌的全基因序列，找到猪霍乱沙门氏菌的 relA 基因及其上下游序列，在上下游基因中设计引物，以上下游基因的 300bp 左右为同源臂，删除 relA 基因的 2247bp，然后插入 araC PBAD lacI TT序列 ；具体步骤是以猪霍乱沙门氏菌 C78-3 为模板，由引物 P1 和 P2 经 PCR 获得 ygcA 同源臂区，称为片段 1 ；由引物P3 和 P4 经 PCR 获得 relA2235 前的 SCH2895 同源臂区，称为片段 2 ；由引物 P5 和P6 经 PCR 获得 araC PBAD lacI TT 结构序列，称为片段 3 ；片段 1 经 Bgl II 酶切，片段 2 经 Xbal 酶切 , 片段 3 经 Bgl II 和 Xbal 双酶切；然后将片段 1-3 经连接酶连接，形成 ΔrelA::araC PBAD lacI TT 结构，将此连接产物转化至 pGEM-T EasyVector 克隆载体，提取阳性质粒，送至 Takara 公司进行序列测定；取正确序列的 ΔrelA::araCPBAD lacI TT 结构式经 kpnI 和 SacI 酶切，酶切产物连接至具有氯霉素和乳糖筛选标记的自杀载体 pRE112 中 ，通过酶切鉴定和序列测定，将正确的 ΔrelA::araC PBAD lacITT 结构式自杀载体电转化至工程菌大肠杆菌 χ7213中，称为 χ7213(pYAs003)，保存在 -20℃冰箱中备用；
P1:5`-CCCAAGCTTGAGCTCGAGGGCGTTCCGGCGCTGGTAGAA-3`
P2:5`-GAAGATCTAAGGGACCAGGCCTACCGAAG-3`
P3:5`-CGGAATTCACCCCAGACAGTAATCATGTAGCGGCT-3`
P4:5`-CGGGTACCCCAGATATTTTCCAGATCTTCAC-3`
P5:5`-GCCCTGCAGAGATCTTTTATTATTCTATCCTAGAATTGTGATAATATATTCACAATTCTAGGAGTTGTAAACTGCTTTTATTTATCTAGAGGCCTAGGTACCAGG-3`
P6:5`-TGGTCTAGAGTCAAGCCGTCAATTGTCTGATTCG-3`；
4）构建 Δasd 基因突变自杀载体
在 Genbank 中搜索猪霍乱沙门氏菌的全基因序列，找到猪霍乱沙门氏菌
的 asd 基因及其上下游序列，在上下游基因中设计引物，以上下游基因各 300bp 左右为同源臂，删除 asd 基因的 1104bp；具体步骤是以猪霍乱沙门氏菌 C78-3 为模板，由引物 P1 和 P2 经 PCR 获得 SCH3470 和 gntU 基因同源臂区，称为片段 1；由引物 P3和 P4 经 PCR 获得 asd 基因前的 glgB 同源臂区，称为片段2 ；将片段 1 和片段 2 酶切补平后进行平端连接，连接转化至 pGEM-T EasyVector 克隆载体，提取阳性质粒，送至Takara 公司进行序列测定；取正确序列的 Δasd 结构经 XbaI 和 XmaI 酶切，连接至具有氯霉素和乳糖筛选标记的自杀载体 pRE112 中 ，通过酶切鉴定和序列测定，将正确的Δasd 结构式自杀载体电转化至工程菌大肠杆菌 χ7213中，称为χ7213(pYAs004) ，保存在-20℃冰箱中备用；
P1:5`P1:5-TGCTCTAGA TGTGCATGGCAATCGCCCAAC-3`
P2:5`P2:5-GCATGC catagcgtttttttcctgcaa-3`
P3:5`P3:5-GAGCTC cgataagcgctgcaatagcca-3`
P4:5`P4:5-TCCCCCGGG TATCTGCGTCGTCCTACCTTC-3`。
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猪霍乱沙门氏菌C500ΔcrpΔasd缺失平衡致死载体系统的构建及鉴定;徐引弟等;《生物工程学报》;20061231;第22卷(第3期);第366-372页 *
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