CN105624078B - 一株减毒猪霍乱沙门氏菌及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一株减毒猪霍乱沙门氏菌S.Choleraesuis S1209，其特征在于，所述减毒猪霍乱沙门氏菌S.Choleraesuis S1209缺失wzx基因，分类命名为S.Choleraesuis S1209，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC M 2015631，保藏时间为：2015年10月22日。本发明还提供了制备减毒猪霍乱沙门氏菌S.Choleraesuis S1209的方法及其在疫苗上的应用。

Description

一株减毒猪霍乱沙门氏菌及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一株减毒猪霍乱沙门氏菌及其制备方法和应用。

背景技术

随着新老传染病的不断流行，研究和开发有效防治传染病的方法显得极为迫切。在过去两百多年中，疫苗在防止细菌或病毒性传染病中发挥了巨大的作用。由于疫苗相对于大多数药物而言，具有使用成本低的优势，因此，不断的研究和开发疫苗是十分必要的。

在疫苗研究领域中，利用沙门氏菌作为载体已经得到了广泛的研究。然而，目前对沙门氏菌，特别是某种沙门氏菌(如猪霍乱沙门氏菌)的毒力基因，尚未完全研究清楚。在过去二十多年中，得到广泛认同的减毒沙门氏菌疫苗候选株为数不多，如营养缺陷型突变株(aroA、aroCD、purA)、压力反应缺陷株(htrA)、腺苷酸环化酶缺陷株(cya、crp)等。

造成有效的减毒菌株开发数量少并困扰研究人员的主要问题之一是：在众多已发现或可能的毒力基因中，并未得到哪些毒力基因一定适用于某类或某种减毒菌株的构建的确切认识。因而，对于具体某种细菌的减毒构建而言，需要进行大量实验确定相关的毒力因子，并寻求适用于该菌株的减毒构建方案。对于研究较少的细菌而言(如猪霍乱沙门氏菌)，减毒菌株的研究工作更显得十分困难。

在减毒猪霍乱沙门氏菌载体构建的研究领域中，有效的菌株主要为galE突变株、aroA突变株、cya/crp突变株、以及其它基于slyA、hilA等基因而构建的突变株。目前而言，对于是否还可以采取其它方法对猪霍乱沙门氏菌进行减毒构建，尚未十分清楚。因此亟待开发其它对猪霍乱沙门氏菌有效的减毒构建方法，以深化对减毒菌株构建乃至相关疫苗研究的认识。

发明内容

针对现有技术的缺点，本发明的目的之一在于提供一株减毒猪霍乱沙门氏菌S.Choleraesuis S1209，所述减毒猪霍乱沙门氏菌S.Choleraesuis S1209缺失wzx基因，分类命名为Salmonella Choleraesuis S1209，保藏于武汉市武昌珞珈山的中国典型培养物保藏中心(武汉大学)中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC M 2015631，保藏时间为：2015年10月22日。

本发明的发明人经过大量的实验发现wzx基因与猪霍乱沙门氏菌的毒力具有较强关系，通过敲除其wzx基因可以获得减毒效果好的减毒菌株。原因可能在于wzx基因构成沙门氏菌O抗原LPS结构的翻转酶，而LPS结构对于沙门菌的毒力具有重要作用。

需要指出的是，目前对于哪些是猪霍乱沙门氏菌的主要毒力基因尚未建立确切的理论指导，在其它沙门氏菌或者其它需要进行减毒设计的菌种中行之有效的减毒方案，对于猪霍乱沙门氏菌而言并不奏效或效果较差。如本发明的一个实施例所示，当进行wzy基因、wbaB基因、wbaC基因、manB基因、manC基因缺失处理时，所得处理后的猪霍乱沙门氏菌菌株要么不具备减毒效果、要么减毒效果不理想。

如本发明的实验例所示，本发明所得菌株具有非常良好的减毒效果。

本发明对本领域的贡献之一在于，发现了wzx基因与猪霍乱沙门氏菌毒力的关系，并构建了一株减毒效果优秀的猪霍乱沙门氏菌。

本发明的第二个目的在于提供制备上述减毒猪霍乱沙门氏菌S.CholeraesuisS1209的方法，该方法包括如下步骤：

1)对wzx基因的上同源臂和下同源臂进行扩增；

2)用猪霍乱沙门菌C3545基因组为模板，扩增wzx的下同源臂和下同源臂；

3)融合片段构建：以wzx基因片段的上同源臂和下同源臂为模板，扩增同源臂融合片段；

4)用AhdI酶切质粒pRE112，回收纯化酶切产物，用连接试剂盒连接pRE112大片段与同源臂融合片段，连接产物经转化和质粒抽提后，得到质粒pRE112-Δwzx；

5)将质粒pRE112-Δwzx转入c7232菌株感受态细胞，以含有质粒pRE112-Δwzx的c7213菌株为供体菌，以C3545菌株作为受体菌，进行结合转移，经PCR鉴定后，得到减毒猪霍乱沙门氏菌S.Choleraesuis S1209；

所述wzx基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

所述wzx基因片段的上同源臂的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；

所述wzx基因片段的下同源臂的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。

用于扩增wzx基因的上同源臂的引物为：

Dwzx-1F：CCGCTGATGGAAGTGCGAACG

Dwzx-1R：ggttaacttattttactttccggatgtaaac

用于扩增wzx基因的下同源臂的引物为：

Dwzx-2F：gtaaaataagttaaccaagcgggaaaatatc

Dwzx-2R：GATTCAACAAACTCTTTCACCG。

步骤1)中，对wzx基因的上同源臂进行扩增时，扩增片段大小为346bp；对wzx基因的下同源臂进行扩增时，扩增片段大小为333bp。

在步骤2)中进行扩增时，PCR反应体系为：于50μL反应体系中进行，具体反应体系为模板DNA 1μL，Takara高保真酶25μL，上、下游引物各1μL，ddH₂O 22μL；具体条件为：98℃变性2min后进入循环，循环参数为98℃10s，55℃15s，72℃30s，共循环30次；循环后72℃延伸10min。

在步骤3)中进行融合片段构建时，PCR反应体系为：于50μL反应体系中：上下游同源臂DNA各1μL，Takara高保真酶25μL，10μmol/L上、下游引物各1μL，ddH₂O 22μL；具体条件为：98℃变性5min后进入循环，循环参数为98℃10s，55℃15s，72℃30s，共循环30次；循环后72℃延伸10min。

步骤5)所述结合转移步骤为：用含DAP的液体LB培养基培养供体菌，用LB培养基培养受体菌，至OD₆₀₀为0.6左右，取供体菌500μL，受体菌300μL于含氯霉素抗性(25μg/mL)平板一侧混匀，平板斜放，正放培养24h，挑取菌苔，划线，37℃静止培养，直至得到单菌落，得到的单菌落进行蔗糖负筛。所述蔗糖负筛的步骤为：挑取单菌落加入无NaCl的LB液体培养基，于37℃，70rpm下，摇菌2h，取100μL菌液10倍倍比稀释1000倍后，再取100μL菌液涂含10％蔗糖的LB平板。

步骤5)所述PCR鉴定，步骤为：

对长出单菌落的蔗糖平板，选择一个区域进行挑菌，每个菌落同时分别划线于Cm板LB板，挑菌时沾到即可不要挑到菌落下方菌；

鉴定并存菌，在于挑取10～20个Cm不生长，LB生长的菌落，得到的阳性菌落再次划线LB板后，PCR鉴定，仍为阳性者，为缺失株构建成功；

PCR反应体系：up水4.4μL、模板DNA 0.2μL、上同源臂上游引物0.2μL、下同源臂下游引物0.2μL、Pfu PCR Master(KP201)5μL；PCR反应条件：94℃预变性5min、94℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸1min、72℃延伸10min、变性至延伸步骤重复30个循环。

本发明的另一个目的在于提供上述减毒猪霍乱沙门氏菌S.Choleraesuis S1209在疫苗上的应用。

本发明的有益效果：

本发明发现了wzx基因与猪霍乱沙门氏菌毒力之间的关系，所得菌株减毒效果好，可用于疫苗的制备。

附图说明

图1为本发明菌株进行银染的结果图，其中第1泳道为野生菌，第3泳道为本发明所得菌株。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明进行具体描述，有必要在此指出的是以下实施例只是用于对本发明进行进一步的说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员根据上述发明内容所做出的一些非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。

实施例1

1、引物设计(用于突变株的构建与鉴定)

参考猪霍乱沙门菌SC-67全基因组序列，设计2对引物分别用于缺失wzx基因(Dwzx-1F/DwbaD-1R，Dwzx-2F/Dwzx-2R)。从猪霍乱沙门菌C3545中分别扩增wzx基因的上下游片段：up-wzx(上同源臂)和down-wzx(下同源臂)，扩增片段大小分别为346bp和333bp。

Dwzx-1F：CCGCTGATGGAAGTGCGAACG

Dwzx-1R：ggttaacttattttactttccggatgtaaac

Dwzx-2F：gtaaaataagttaaccaagcgggaaaatatc

Dwzx-2R：GATTCAACAAACTCTTTCACCG

2、猪霍乱沙门菌C3545wzx突变株的构建

用已提取的猪霍乱沙门菌C3545基因组为模板，分别用引物Dwzx-1F/Dwzx-1R，Dwzx-2F/Dwzx-2R扩增wzx基因的上下游同源臂。

PCR反应体系为：50μL反应体系中进行，具体反应体系为模板DNA 1μL，25mmol/LMgCl₂0.5μL，buffer 10μL，10μmol/L上、下游引物各1μL，2mmol/L dNTPs 1μL，DNApolymerase 0.75μL，ddH₂O 34.75μL。具体条件为：98℃变性5min后进入循环，循环参数为94℃30s，55℃30s，72℃1min，共循环30次。循环后72℃延伸10min。扩增的产物经1％的琼脂糖凝胶电泳分析后，由DNA纯化回收试剂盒纯化PCR产物。

3、重组自杀质粒的构建

融合片段的构建：以纯化的wzx基因的上下同源臂为模板，用引物Dwzx-1F/Dwzx-2R扩增融合片段。PCR反应体系为：于50μL反应体系中：上下游同源臂DNA各1μL，25mmol/LMgCl₂0.5μL，buffer 10μL，10μmol/L上、下游引物各1μL，2mmol/LdNTPs，DNA polymerase0.2μL，ddH₂O 33.75μL。具体条件为：98℃变性5min后进入循环，循环参数为94℃30s，55℃30s，72℃1min，共循环30次。循环后72℃延伸10min。扩增的产物经1％的琼脂糖凝胶电泳分析后，由DNA纯化回收试剂盒纯化PCR产物。

自杀质粒pRE112-Δwzx的构建：用AhdⅠ酶切质粒pRE112载体，回收纯化酶切产物，用连接试剂盒连接pRE112大片段与同源臂融合片段。连接产物转化c7232感受态细胞，涂于含氯霉素抗性(25μg/mL)的LB固体平板，37℃培养16h，PCR鉴定阳性菌落。挑取阳性菌落到LB液体培养基，37℃、200r/min培养过夜，小量抽提质粒。

将构建成功的重组自杀质粒pRE112-Δwzx转化入c7213感受态细胞。以含有重组自杀质粒的c7213菌株为供体菌，C3545株为受体菌进行接合转移。接合转移步骤如下：用含DAP的液体LB培养供体菌，用LB培养受体菌，至OD₆₀₀为0.6左右，取供体菌500μL，受体菌300μL于含氯霉素抗性(25μg/mL)平板混匀，正放培养24h，挑取菌苔，划线，37℃静止培养，直至得到单菌落。得到的单菌落进行蔗糖负筛，具体步骤如下：挑取单菌落加入无NaclLB液体培养基，37℃，70rpm，摇菌2h，取100μL菌液10倍倍比稀释1000倍后，再取100μL菌液涂含10％蔗糖的LB平板。挑取单菌落分别划线于LB平板和含氯霉素抗性(25μg/mL)平板，选取LB平板生长，含氯霉素抗性(25μg/mL)平板不生长菌落，用Dwzx-1F/Dwzx-2R进行进一步鉴定，鉴定阳性的菌落命名为C3545Δwzx(即本发明所得菌株)。

实验例1基因缺失株的表型特征鉴定

我们将对实施例1所得菌株和野生株的脂多糖进行对比观察，它们是猪霍乱沙门菌重要的免疫原或毒力因子。

脂多糖的提取和银染观察：提取小量LPS用于银染观察，具体步骤为：取过夜培养的实施例1所得菌株和野生株菌液各2-3mL，1,2000×g离心1min，收集菌体；用PBS或超纯水洗菌体2到3次；取150μL裂解Buffer(1mL 0.5M Tris-cl pH＝6.8，0.8mL甘油，1.6mL 10％SDS，0.4mLβ-巯基乙醇，4.2mL超纯水)，混匀菌体后用沸水煮10min；样品冷却至室温，于1,2000×g，4℃离心10min；取上清液10μL加入到90μL上样Buffer中(1mL 0.5M Tris-cl pH＝6.8，0.8mL甘油，0.005g溴酚蓝，6.2mL超纯水)，加入1μL蛋白酶K，37℃消化1h。进行SDSPAGE电泳，银染观察。

结果见说明书附图1。

实验例2猪霍乱沙门菌wzx基因缺失株减毒效果测定

为测定构建的基因缺失株C3545Δwzx的减毒效果，采用了口服方式比较基因缺失株和亲本株对小鼠的毒力变化情况。本实验购买六周龄BALB/c雌鼠，饲养一周适应环境后进行口服途径攻毒，每组3只，共八组，其中六组为突变株，一组为口服BSG的空白组，一组为口服野生株C3545的阳性对照组。突变株口服剂量为1×10⁸CFU和1×10⁹CFU，阳性对照组口服剂量为1×10⁵CFU和1×10⁶CFU。攻毒后小鼠饲养4周，每日观察其生长状况，并记录。按照Reed and Muench法计算鸭子半数致死量(50％lethal dose,LD50)，评价基因缺失株较亲本株毒力减弱程度。

参照实施例1的思路，我们构建了缺失wzy基因、wbaB基因、wbaC基因、manB基因、manC基因的猪霍乱沙门氏菌，作为对照。

实验结果见表1和表2。

表1口服后小鼠死亡情况

表中，“wzy”代表给小鼠口服缺失了wzy基因的猪霍乱沙门氏菌，其余组别含义类同。

表2实验小鼠攻毒具体计量情况

序列表

SEQUENCE LISTING

<110> 四川农业大学

<120> 一株减毒猪霍乱沙门氏菌及其制备方法和应用

<130> 2015

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 2187

<212> DNA

<213> 减毒猪霍乱沙门氏菌S.Cholerasuis S1209

<400> 1

ccgctgatgg aagtgcgaac gaaagaaatt cttcagctac tcaattcata aaaagcagcc 60

cttctttatg gagggctaac ttttcggata ttctctaacc aattcgtagt ataaagccaa 120

taaatattaa gtgtgtttga ttgttgttgg tttccatttc taatagatat aaggctttcg 180

ctatgttctt ttcggacagt ataaataatc attgatatga ttatttattt taccttcctg 240

gtaatattaa ttattatggg gctaataata attgatgtaa tcctgtaact tcccacgaat 300

atttatttac tttaagttta catccggaaa gtaaaaatgc gaactataaa agcgattaac 360

aactttaaag ttgatttatt tattactttt tttcttattg cgctaggatt ttatcttcga 420

actatatttg tctctaagat gggcgctgat ttaacaggtg tgatgttgtt atttacacaa 480

ctgactgctt atttaaatct cgccgagctt ggcatagggg tagctgcggc aagcctttta 540

tacaagccgc tgagtgaggg ggattatgca aaaataaaat acttaacttt attgctgtct 600

acaatctata gatatatctc gtttttagtt ttattgatag gtatagtaat tggctttggt 660

atttactttt tcatcgattc tgttaatgca gtaagtcacg tttttattta ttgggcattt 720

tttgtaataa atacatcttt aacttattct tatgcaaagc attcaactct attaactgca 780

aatcagcaat attcagtagt ccgtaaaata cagggtggcg ggaaaatatt aattattgcg 840

ctgcaaatat tgctattagt caccacacat aatttcttac tctatttgct cgttgaaact 900

attggcgtga tagtacagta ttttatattt aaaaatatta ttaataacga catccatttt 960

aaggtagttc cacaatctat tagcgatgat gaaaaaacaa cattaaaaaa tgaattaaaa 1020

ataaaaataa aaaacatgtt ttttcataag attggtggtg tgttagtttt aaatactgat 1080

tatttgctag tttcaaaatt tcttaattta agctacgtca cgatttatgg aagttatatg 1140

atggtcttcc aggttgtgac tgtgcttatg tccagttttg ttaatgctat tacagctagt 1200

gtgggtaatt ttttaatcaa tcaaaatgat gatgaagtta ccagtattgc aaagcaattt 1260

aacacagtat ttatagcatt ggctaccttc atttctttga atatgtattt tttggttaat 1320

gactttatta ccagctggat aggcgaaaaa ttcatactag gtaatggtat tgttatatta 1380

atgcttgtta atgtatttat aagtgtcatt agaattcctt gtgatatttt taaaaacgca 1440

actggttttt ttggggatgt atattatcct ttgcttgagg gagtggttaa tttatttttt 1500

tccgcgctcc tggcttttta tattggtctt cccggtatta ttattggcac gattatatct 1560

aatgtattaa ttacattaat tgcaaagcca ttatatctat atggtaaaat gtttggtaga 1620

tttaatgcat taaaaaagta cttgtcattt gtactgaaac ctttaatatt ctcatttgtt 1680

attttggctg ttttttattt tacaagagaa caaataattt tctttaaagt ttccaactgg 1740

tttgacttta taagtaagct tactattgta tcgctggtaa gtatgattat agtttttgcg 1800

gttttttatg cagatgctaa ctttaggtct tttgttaaaa gaattttacg cgtggtattt 1860

taagttaacc aagcgggaaa atatccgccg aaccacaatg tgctattaat ggacaagtat 1920

ttaatatgct ttacgctgta aaatttgtag cacataatgg tgaaatatat gtaacttcca 1980

cacctgacag gagtatgtaa tgtccaagca acagatcggc gtcgtcggta tggcagtgat 2040

ggggcgcaac ctcgcgctca acatcgaaag ccgtggttat accgtctccg ttttcaaccg 2100

ctcccgtgaa aagaccgaag aagtgattgc cgagaatccc ggcaaaaagc tggtgcctta 2160

ttacacggtg aaagagtttg ttgaatc 2187

<210> 2

<211> 346

<212> DNA

<213> 减毒猪霍乱沙门氏菌S.Cholerasuis S1209

<400> 2

ccgctgatgg aagtgcgaac gaaagaaatt cttcagctac tcaattcata aaaagcagcc 60

cttctttatg gagggctaac ttttcggata ttctctaacc aattcgtagt ataaagccaa 120

taaatattaa gtgtgtttga ttgttgttgg tttccatttc taatagatat aaggctttcg 180

ctatgttctt ttcggacagt ataaataatc attgatatga ttatttattt taccttcctg 240

gtaatattaa ttattatggg gctaataata attgatgtaa tcctgtaact tcccacgaat 300

atttatttac tttaagttta catccggaaa gtaaaataag ttaacc 346

<210> 3

<211> 333

<212> DNA

<213> 减毒猪霍乱沙门氏菌S.Cholerasuis S1209

<400> 3

gtaaaataag ttaaccaagc gggaaaatat ccgccgaacc acaatgtgct attaatggac 60

aagtatttaa tatgctttac gctgtaaaat ttgtagcaca taatggtgaa atatatgtaa 120

cttccacacc tgacaggagt atgtaatgtc caagcaacag atcggcgtcg tcggtatggc 180

agtgatgggg cgcaacctcg cgctcaacat cgaaagccgt ggttataccg tctccgtttt 240

caaccgctcc cgtgaaaaga ccgaagaagt gattgccgag aatcccggca aaaagctggt 300

gccttattac acggtgaaag agtttgttga atc 333

Claims (2)

1.一株减毒猪霍乱沙门氏菌(S.Choleraesuis) S1209，其特征在于，所述减毒猪霍乱沙门氏菌(S.Choleraesuis) S1209缺失wzx基因，分类命名为(S.Choleraesuis) S1209，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC M 2015631，保藏时间为：2015年10月22日。

2.权利要求1所述减毒猪霍乱沙门氏菌(S.Choleraesuis) S1209在用于制备疫苗上的应用。