CN105002197A - 无抗性双功能dna疫苗载体、构建方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种无抗性双功能DNA疫苗载体、构建方法及应用，属于动物基因工程技术领域。本发明利用营养选择标志替代抗生素抗性基因作为无抗性双功能DNA疫苗载体的筛选标记，构建真核表达质粒pcD-asd，能从根本上阻断抗生素抗性基因的扩散传播，安全性好，并且具有高表达效率和高拷贝数。该DNA疫苗载体能够与asd基因缺陷的革兰氏阴性菌互补，构建染色体-质粒平衡致死系统，该系统在真核细胞内高效稳定表达外源基因，可用作核酸疫苗的表达载体，如利用减毒伤寒沙门氏菌为载体构建双价、多价活菌苗。

Description

无抗性双功能DNA疫苗载体、构建方法及应用

技术领域

本发明涉及一种无抗性双功能DNA疫苗载体，同时还涉及该DNA疫苗载体的构建方法和应用，属于动物基因工程技术领域。

背景技术

DNA疫苗(DNA vaccine)又称核酸疫苗或基因疫苗(genetic vaccine)，它的发现被誉为第三次疫苗革命。DNA疫苗可以诱导机体的细胞免疫和体液免疫，其制备简单，生产成本低，遗传背景清晰，便于构建多价苗和添加多种免疫佐剂分子等。目前大多数的质粒载体都以抗生素抗性基因作为其选择性标记，这一环境安全性问题严重制约着DNA疫苗的发展和应用。伴随着抗生素的广泛应用甚至是滥用，抗生素耐药性基因的扩散问题日益严重，现已成为全球共同关注的问题。耐药性基因不断向环境中漂移扩散，不仅破坏微生态平衡，还导致超级细菌的出现(如NDM-1)。近年来出现的多种超级细菌就是由抗性基因的扩散引起，在临床上无药可医，给社会带来极大恐慌。而无抗性DNA疫苗载体的构建能够避免抗性基因扩散所带来的一系列问题。

利用减毒沙门菌作为载体传递DNA疫苗是目前基因免疫研究的热点。减毒沙门菌拥有一个有效的运送重组抗原的系统，这些抗原可来自多种病原体，包括细菌、病毒和寄生虫的抗原，甚至肿瘤抗原(潘志明,唐丽华,黄金林等.作为疫苗和疫苗载体的减毒细菌.微生物学杂志,2005,25(5):78-82.)。应用基因工程技术对沙门菌减毒后，虽然其毒力降低，但其侵袭力并未发生明显的改变，可将DNA疫苗直接运送到抗原递呈细胞内，诱导机体产生体液免疫、黏膜免疫和细胞免疫应答，使机体不仅能抵抗相应外源病原的攻击，同时还能抵抗沙门菌的感染，这使得减毒沙门菌成为携带病毒或细菌DNA的有效载体(Li Y H,WangS F,Xin W,et al.A sopB Deletion Mutation Enhances the Immunogenicity and Protective Efficacyof a Heterologous Antigen Delivered by Live Attenuated Salmonella enterica Vaccines.InfectionAnd Immunity,2008,76(11):5238-5246.)。减毒沙门菌重组DNA疫苗免疫动物时，通过口服途径即可刺激黏膜免疫，操作简单方便，并且其向宿主免疫系统递呈抗原蛋白的方式与自然感染相似。同时，沙门菌脂多糖具有免疫佐剂的作用，能够增强免疫应答(闫凤英,卢士红,许自亮等.口服携带人PF4基因的减毒沙门氏菌对大剂量化疗小鼠的促造血重建作用.中国生物工程杂志,2005,25(2):12-18.)。减毒沙门菌重组DNA疫苗制备简单(只需培养细菌)，生产成本低，将为新型口服DNA疫苗的研制提供一条新的思路。目前，减毒沙门菌已广泛用于细菌、病毒、寄生虫、肿瘤等疫苗载体。实验结果证明多数减毒沙门菌株作为载体传递DNA疫苗具有良好的免疫原性，能够起到良好的免疫效果(李文桂,陈雅棠.细菌重组减毒鼠伤寒沙门氏菌疫苗研究进展.动物医学进展,2004,25(2):49-53.)。

因此，构建以营养选择标志基因asd代替抗性基因作为选择压力的沙门氏菌染色体-质粒平衡致死系统有着十分重要的意义，可用于研制新型无抗性口服DNA疫苗，具有巨大的市场价值和广阔的应用前景。

发明内容

本发明的目的是提供一种无抗性双功能DNA疫苗载体，以营养选择标志基因asd替代抗生素抗性基因，从根本上消除抗生素抗性基因扩散所带来的安全性问题。

同时，本发明还提供一种无抗性双功能DNA疫苗载体的构建方法。

最后，本发明还提供一种无抗性双功能DNA疫苗载体在制备无抗性DNA疫苗中的应用。

为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是：

无抗性双功能DNA疫苗载体，该载体为真核表达质粒，全长4058bp(图谱见图1，A、B分别展示不同的酶切位点)，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。其中，1732～2872bp为SD-asd基因片段，2873～3970bp为pUCori片段，其余为Pcmv-MCS-BGHpA-f1ori片段，。

无抗性双功能DNA疫苗载体的构建方法，包括以下步骤：

1)以平衡致死系统载体pYA3493质粒为模板，扩增SD-asd基因；

2)用BspHI和XmnI双酶切真核表达质粒pcDNA3.1-Zeo(+)，去除Amp抗性基因，回收1814bp的片段Pcmv-MCS-BGHpA-f1ori；

3)用XmnI和SalI双酶切真核表达质粒pcDNA3.1-Zeo(+)，去除Zeo抗性基因，回收1099bp的片段pUCori；

4)将SD-asd基因、Pcmv-MCS-BGHpA-f1ori、pUCori进行连接，构建长度为4058bp的无抗性双功能DNA疫苗载体。

步骤1)中扩增SD-asd基因的引物序列如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示。

无抗性双功能DNA疫苗载体在制备无抗性DNA疫苗中的应用。例如在无抗性双功能DNA疫苗载体的多克隆位点插入(人或动物疾病)外源保护性抗原基因，并将其应用到asd基因缺陷的革兰氏阴性菌群中，尤其是asd基因缺失的减毒沙门氏菌中，构建沙门氏菌染色体-质粒平衡致死系统，制备无抗性DNA疫苗。沙门氏菌asd基因缺失菌株如采用鼠伤寒沙门菌SL1344△crp△asd菌株(田芳华,程相朝等.鼠伤寒沙门菌SL1344株ΔcrpΔasd缺失株的构建及生物学特性初步研究,中国兽医学报,2013,11:1700-1706.)。

本发明的有益效果：

本发明利用营养选择标志替代抗生素抗性基因作为无抗性双功能DNA疫苗载体的筛选标记(抗生素抗性基因被完全切除)，构建真核表达质粒pcD-asd，能从根本上阻断抗生素抗性基因的扩散传播，安全性好，并且具有高表达效率和高拷贝数。这是由于DNA疫苗载体pcD-asd的SD-asd基因缺少相应的启动子，仅保留SD序列，搭配高效的复制起始点PUCori，能够增加该质粒的拷贝数。

本发明中无抗性双功能DNA疫苗载体能够与asd基因缺陷的革兰氏阴性菌(如减毒沙门氏菌鼠伤寒SL1344△crp△asd)互补，构建染色体-质粒平衡致死系统，该系统感染293T细胞后，可观察到较强的荧光，同时该系统可在普通的LB培养基上连续传70次，质粒不丢失，证实该系统在真核细胞内高效稳定表达外源基因，可用作核酸疫苗的表达载体。

本发明中真核表达质粒pcD-asd可利用减毒伤寒沙门氏菌为载体构建双价、多价活菌苗，该种疫苗无任何抗性标记，遗传背景清晰，性状稳定，制备简便，易于体外大规模培养，可经口服接种途径进行免疫，使用方便，安全性好，成本低，可发挥减毒沙门菌活载体的天然免疫佐剂效应及诱导机体产生强烈的特异性细胞免疫和粘膜免疫应答能力的优势，从而增强DNA疫苗的免疫效果，具有显著的经济和社会效益。同时，还能降低抗生素抗性基因扩散的潜在危险性，从根本上消除扩散所带来的安全性问题。

附图说明

图1为本发明无抗性双功能DNA疫苗载体的图谱；

图2为无抗性双功能DNA疫苗载体的构建示意图；

图3为SD-asd基因片段电泳图；

图4为HN基因PCR产物的电泳图；

图5为重组质粒pcD-asd-HN酶切电泳图；

图6为重组质粒pcD-asd酶切电泳图；

图7为重组质粒pcD-asd稳定性试验电泳图；

图8为重组质粒pcD-asd-EGFP酶切电泳图；

图9为质粒转染293T细胞荧光显微图；

图10为重组减毒沙门菌感染293T细胞的荧光显微图。

具体实施方式

下述实施例仅对本发明作进一步详细说明，但不构成对本发明的任何限制。

实施例1

本实施例中无抗性双功能DNA疫苗载体pcD-asd是基于pcDNA3.1-Zeo(+)改造构建的，构建示意图见图2，具体操作如下：

1)扩增非抗生素抗性基因天冬氨酸β-半乳糖脱氢酶(SD-asd)，以平衡致死系统载体pYA3493质粒(美国华盛顿大学Dr.Roy Curtiss III教授惠赠)为模板，根据已发表的平衡致死系统载体pYA3493质粒基因序列，设计一对分别引入XmnI、SalI限制性内切酶酶切位点的上、下游引物(分别如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示)：

上游引物：5′-CG GAATTAATTC gcacatctctttgcagg-3′(XmnI酶切位点)，

下游引物：5′-ACGC GTCGAC ctacgccaactggcgcag-3′(SalI酶切位点)，

用rTaq酶PCR扩增SD-asd基因。扩增体系为：10×PCR Buffer 2.5μL；dNTPs各(200umol/L)1μL；rTaq酶2U/μL；上游引物/下游引物各100pmol；Mg²⁺1.5mmol/L 0.5μL；模板(pYA3493)2ug；加ddH₂O至25μL。扩增程序为：94℃，5min；94℃，1min；56℃，1min；72℃，1min；30个循环；72℃，10min。扩增出的目的条带大小为1141bp(含酶切位点)(见图3，图中M：DL2000Mark；1：水对照；2，3：SD-asd基因片段)，连接pMD19-T载体。连接体系为：pMD19-T(50ng/ul)0.5μL；T4DNA连接酶2.5U/μL 5.0μL；SD-asd基因片段0.5pmol；加ddH₂O至10L。采用常规的热击法转化大肠杆菌JM109，挑选阳性单菌落送上海英骏生物技术有限公司进行测序；

2)pcDNA3.1-Zeo(+)载体氨卞基因(Amp抗性基因)的去除

a)BspHI、XmnⅠ双酶切pcDNA3.1-Zeo(+)载体，酶切反应体系如下：

37℃孵育4小时后，加入终止液混匀终止反应；

b)琼脂糖电泳，回收1800bp左右的大片段Pcmv-MCS-BGHpA-f1ori，4℃保存备用；

3)pcDNA3.1-Zeo(+)载体病毒复制相关部分SV40ori、SV40pA及博来霉素抗性基因的去除

a)BspHI酶切pcDNA3.1-Zeo(+)载体，酶切反应体系如下：

37℃孵育4小时后，加入终止液混匀终止反应；

b)琼脂糖电泳，回收4000bp左右pcDNA3.1-Zeo(+)-AmpR片段(“-”表示切除)，回收产物测定浓度，4℃保存备用；

c)SalI酶切pcDNA3.1-Zeo(+)-AmpR片段，酶切反应体系如下：

d)琼脂糖电泳，回收1100bp左右pUCori片段，4℃保存备用；

4)SD-asd基因片段、pUCori片段及Pcmv-MCS-BGHpA-f1ori片段的连接，反应体系如下：

在加入连接酶之前，混合液于45℃保温5min后立即冷却至0℃，再加入10×反应缓冲液和T4DNA连接酶混匀16℃连接过夜后加入终止液终止反应；

5)SD-asd基因片段、pUCori片段及Pcmv-MCS-BGHpA-f1ori片段的连接产物转化X6097

从-70℃冰箱内取出大肠杆菌X6097感受态细胞，于冰上融化，将10μL连接产物与100μL感受态细胞小心无菌混匀，之后转移至1个无菌试管中，冰浴30min，再42℃热激90s，立即放入冰水中静置2.5min(2～3min均可)，加入500μL预热的LB液体培养基，37℃150r/min振摇培2.5h(2～3h均可)，将培养液均匀涂布LB固体培养基(预热)，37℃培养过夜，挑选阳性转化子提取质粒进行PCR和酶切鉴定，并将鉴定正确的菌落扩大培养小量抽提质粒pcD-asd。

实施例2

本实施例中无抗性双功能DNA疫苗载体在制备无抗性DNA疫苗中的应用，包括以下步骤：

1)扩增新城疫HN全基因，以构建好的PMD18-T-HN为模板，根据Genbank中NDV的全基因序列(登录号：JF950510.1)，设计一对分别引入HindⅢ、BamH I限制性内切酶酶切位点的上、下游引物(分别如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5所示)：

上游引物：5′-CCCAAGCTTACCATGGACCGCGCCGTTAGC-3′(HindⅢ酶切位点)，

下游引物：5′-CGGGATCCCTAGCCAGACCTGGCTTC-3′(BamH I酶切位点)，

PCR扩增HN基因。扩增体系为：10×PCR Buffer 2.5μL；dNTPs各(200umol/L)1μL；rTaq酶2U/μL；上游引物/下游引物各100pmol；Mg²⁺1.5mmol/L 0.5μL；模板(PMD-18-T-HN)2ug；加ddH₂O至25μL。扩增程序为：94℃，5min；94℃，1min；69.5℃，1min30s；72℃，1min40s；30个循环；72℃，10min。扩增出的目的条带大小为1734bp(见图4，图中M:DL2000DNA Mark；1、2：质粒PMD18-T-HN；3：水对照)。连接pMD19-T载体。连接体系为：pMD19-T-HN 0.05pmol；T4DNA连接酶2.5U/μL 5.0μL；SD-asd基因片段0.5pmol；加ddH₂O至10L。采用常规的热击法转化大肠杆菌JM109，挑选阳性单菌落送上海英骏生物技术有限公司进行测序，测序结果见SEQ ID NO.6。

2)重组质粒pcD-asd-HN的构建与鉴定

把质粒pcD-asd和pMD19-T-HN用相同酶切体系(反应体系25μL，其中10×Buffer K2.5μL；质粒20.5μL；BamH I 1μL；HindⅢ1μL；37℃，4h)进行双酶切，回收目的基因片段，进行连接(连接体系为10μL，其中pcD-asd 3μL；T4DNA连接酶2μL；HN基因片段5μL；16℃，4h)，采用常规的热击法转化大肠杆菌χ6097，挑选阳性单菌落扩大培养提取质粒，进行PCR和酶切鉴定(见图5，图中M:DL5000DNA Mark；1：质粒pcD-asd-HN)。

3)重组菌株ΔcrpΔasdSL1344(pcD-asd-HN)构建及鉴定

将鉴定正确的重组质粒pcD-asd-HN电转化入(电转化参数为电压V 2000v，时间T5ms(4.6ms最宜)，脉冲电阻R 200Ω，电容C 25μF)减毒鼠伤寒沙门菌△crp△asdSL1344，构建减毒鼠伤寒沙门氏菌ΔcrpΔasdSL1344(pcD-asd-HN)菌株，进一步对其进行PCR、酶切鉴定。

试验例

1、确定pcD-asd中的Amp和Zeo抗性基因是否被彻底切除

用BspHI和SalI双酶切pcD-asd重组质粒，1％琼脂糖电泳出现约为1100bp和2900bp的两条片段，从分子量上说明Amp和Zeo抗性基因已被完全切除(见图6，图中M：DL5000Marker；1，2：质粒pcD-asd)。

2、重组载体pcD-asd耐药性试验

在含有Amp的LB培养基上对重组载体pcD-asd进行耐药性试验，结果显示其对Amp敏感，证实Amp抗性基因已被完全切除。

3、重组载体pcD-asd修复性试验及稳定性试验

将重组载体pcD-asd转入asd基因缺陷的大肠杆菌χ6097和鼠伤寒SL1344△crp△asd菌株后，发现其均可在普通的LB培养基上正常生长；在普通的LB培养基上连续传代培养，SD-asd基因的PCR鉴定结果显示在70代内菌株生长良好且pcD-asd质粒均未丢失(见图7，图中M：DL5000Marker；1：水对照；2～8分别为传代10次、20次、30次、40次、50次、60次、70次)，证实该重组载体pcD-asd具有良好的修复功能。

4、重组载体pcD-asd的应用型试验

(1)携带绿色荧光蛋白(EGFP)基因的pcD-asd-EGFP体外转染293T细胞试验

从携带绿色荧光蛋白(EGFP)基因的质粒pEGFP-N1(Invitrogen)上切下EGFP基因(HindIII和NotI)，插入到质粒pcD-asd和pcDNA3.1(+)相应的位点得到pcD-asd-EGFP(HindIII和NotI双酶切得到约为780bp和4000bp的两条带，见图8，图中M：DL5000Marker；1：质粒pcD-asd-EGFP)和pcDNA3.1(+)-EGFP(HindIII和NotI)，接着进行体外转染试验，每个质粒转染3个孔的293T细胞。

转染前一天将293T细胞培养于六孔板中，以转染时细胞密度在90％为宜。在转染前2小时，移除细胞上原有的培养基，换为新鲜的完全培养基，将2μg的质粒pcD-asd-EGFP、pEGFP、pcD-asd、pcDNA3.1-Zeo(+)用100μL无血清、无抗生素DMEM培养基稀释，然后直接加入2μL Ronfect^TM，轻柔混匀，室温静置20分钟，然后将其加入细胞培养基中，轻柔混匀，继续培养48小时，在荧光显微镜观察结果并拍照，结果显示质粒pcD-asd-EGFP和pEGFP均可以观察到较强的荧光，而空载体pcD-asd和pcDNA3.1-Zeo(+)转染后均无荧光(见图9，图中a：pcD-asd-EGFP；b：pEGFP；c：pcD-asd；d：pcDNA3.1-Zeo(+))。

(2)重组减毒鼠伤寒沙门菌SL1344△crp△asd(pcD-asd-EGFP)感染293T细胞试验

将重组质粒pcD-asd-EGFP和pcD-asd电转化入(电转化参数为电压V 2000v，时间T5ms(4.6ms最宜)，脉冲电阻R 200Ω，电容C 25μF)减毒鼠伤寒沙门菌△crp△asdSL1344，构建减毒鼠伤寒沙门氏菌ΔcrpΔasdSL1344(pcD-asd-EGFP)和ΔcrpΔasdSL1344(pcD-asd)菌株，进行PCR、酶切鉴定。

在6孔细胞培养板接种3×10⁵个293T细胞，营养液为DMEM完全培养基，5％CO₂培养箱37℃培养24h至细胞密度约为90％；转染前，用0.01mol/L PBS(pH7.4)洗涤293T细胞一次；5000rpm/min离心收集菌体，用0.01mol/LPBS重悬；将重组减毒鼠伤寒沙门菌SL1344△crp△asd(pcD-asd-EGFP)和鼠伤寒沙门菌SL1344△crp△asd(pcD-asd)感染细胞(数量为10:1)4h；用0.01mol/L PBS(pH7.4)洗涤细胞3次，再用含100mg/L庆大霉素的DMEM培养液培养2h；再换含10mg/L庆大霉素的DMEM继续培养72h后，可以观察到293T细胞发出绿色荧光，而对照组减毒鼠伤寒沙门菌SL1344△crp△asd(pcD-asd)感染293T细胞后无绿色荧光产生(见图10，图中a：△crp△asdSL1344(pcD-asd-EGFP)；b：△crp△asdSL1344(pcD-asd))。

(3)重组菌株SL1344ΔcrpΔasd(pcD-asd-HN)对鸡的免疫保护效力试验

选择SL1344ΔcrpΔasd(pcD-asd-HN)及PBS免疫组的鸡只，每组选择10只鸡，在免疫后第21天，用鼠伤寒沙门菌野生株SL1344对该两组鸡只进行攻毒，口服攻毒剂量为10⁸CFU/mL(100倍LD₅₀)；选择SL1344ΔcrpΔasd(pcD-asd-HN)、Ⅳ系、联合SL1344ΔcrpΔasd(pcD-asd-HN)+Ⅳ系及PBS免疫组的鸡只，每组选择10只鸡，在免疫后第21天，用NDV F₄₈E₈株纯化毒(20μg/mL，200μL/只)对该三组鸡只进行攻毒。攻毒后每天到鸡舍观察并记录鸡只的发病和死亡情况。

a)免疫鸡群对鼠伤寒沙门菌的免疫保护力

免疫后21天，以口服的方式进行攻毒鼠伤寒沙门菌SL1344，连续观察14天，评价重组菌免疫鸡群对鼠伤寒沙门菌的免疫保护作用。观察结果显示(见下表1)，重组菌株SL1344ΔcrpΔasd(pcD-asd-HN)能100％抵抗野生株的感染；PBS对照组的存活率为零，该重组菌株对野生株的攻毒感染起到了较高免疫保护作用。

b)免疫鸡群对新城疫病毒的免疫保护力

免疫后21天，以口服的方式进行攻毒NDV F₄₈E₈株，并连续观察30天，评价重组菌免疫鸡群对NDV感染的免疫保护作用。观察结果显示(见下表2)，PBS组不能抵抗NDVF₄₈E₈的攻击，该组鸡只死亡率高达80％；重组菌株SL1344ΔcrpΔasd(pYA-HN)、Ⅳ系、联合SL1344ΔcrpΔasd(pcD-asd-HN)+Ⅳ系的保护率分别为60％、80％和90％，说明该重组菌株对NDV感染具有一定的免疫保护，并且能够增强Ⅳ系疫苗的免疫保护效率。

表1 重组菌株SL1344ΔcrpΔasd(pcD-asd-HN)抵抗鼠伤寒沙门菌感染的免疫保护力

表2 重组菌株SL1344ΔcrpΔasd(pcD-asd-HN)抵抗NDV F₄₈E₈感染的免疫保护力

Claims (6)

1.无抗性双功能DNA疫苗载体，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.如权利要求1所述的无抗性双功能DNA疫苗载体的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：

1)以平衡致死系统载体pYA3493质粒为模板，扩增SD-asd基因；

2)用BspHI和XmnI双酶切真核表达质粒pcDNA3.1-Zeo(+)，回收片段Pcmv-MCS-BGHpA-f1ori；

3)用XmnI和SalI双酶切真核表达质粒pcDNA3.1-Zeo(+)，回收片段pUCori；

4)将SD-asd基因、Pcmv-MCS-BGHpA-f1ori、pUCori进行连接，即得。

3.根据权利要求2所述的无抗性双功能DNA疫苗载体的构建方法，其特征在于：步骤1)中扩增SD-asd基因的引物序列如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示。

4.如权利要求1所述的无抗性双功能DNA疫苗载体在制备无抗性DNA疫苗中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：在无抗性双功能DNA疫苗载体的多克隆位点插入人或动物疾病的外源保护性抗原基因，再将其转至asd基因缺陷的革兰氏阴性菌群中，即得。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：asd基因缺陷的革兰氏阴性菌群为asd基因缺陷的减毒沙门氏菌。