CN104726387B

CN104726387B - 一种猪胸膜肺炎放线杆菌减毒菌株及其制备的预防猪胸膜肺炎产品

Info

Publication number: CN104726387B
Application number: CN201510009370.6A
Authority: CN
Inventors: 徐福洲; 崔国林; 郭芳芳; 杨兵; 周宏专; 苏霞; 陈小玲; 王金洛; 刘爵
Original assignee: Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences
Current assignee: Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences
Priority date: 2015-01-08
Filing date: 2015-01-08
Publication date: 2017-12-26
Anticipated expiration: 2035-01-08
Also published as: CN104726387A

Abstract

本发明“一种猪胸膜肺炎放线杆菌减毒菌株及其制备的预防猪胸膜肺炎产品”，涉及微生物和免疫学领域，本发明在单突变菌株GS7C的基础上，进一步缺失基因组中ureC基因片段，并插入具有免疫原性的apxIII‑N基因片段，进而再利用sacB基因负向筛选系统，筛选到成功表达ApxIII‑N蛋白的apxIIC^‑/apxIA⁺、ureC^‑/apxIII⁺双突变菌株(GS7CA)，保藏号为CGMCC NO.10016。实验数据表明，该双突变菌株的溶血活性和尿素酶活性完全丧失，毒力大大降低，可稳定遗传，采用本发明的猪胸膜肺炎放线杆菌减毒菌株制成的减毒活疫苗，毒力低，具有交叉保护活性，生物安全性高，质量稳定。

Description

一种猪胸膜肺炎放线杆菌减毒菌株及其制备的预防猪胸膜肺炎产品

技术领域

本发明涉及微生物和免疫学领域，特别是一种猪胸膜肺炎放线杆菌减毒菌株及其制备的预防猪胸膜肺炎产品

背景技术

猪传染性胸膜肺炎是由胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)引起的一种猪的呼吸道疾病，本病主要临床特征表现为出血性和坏死性肺炎、纤维素性胸膜炎。通常认为，本菌通过呼吸道进入猪体内，然后直接通过气管和支气管进入肺泡。除宿主和环境因素外，各种毒力因子是本菌致病性的主要因素，它们包括荚膜、内毒素、外毒素、粘附素、转铁蛋白、外膜蛋白和分泌的酶类。

胸膜肺炎放线杆菌是引起猪传染性胸膜肺炎的主要病原，它是一种革兰氏阴性短杆菌，具有荚膜和菌毛，无运动性，不能形成芽孢。截止目前，根据APP表面可溶性抗原(主要为荚膜多糖和脂多糖)的差异性，通过血清学方法将APP分为15个血清型，不同血清型菌株毒力存在显著的差异。

APP毒力因子主要包括Apx毒素、尿素酶、外膜蛋白、荚膜和脂多糖等。研究证实，Apx毒素既是APP最重要的毒力因子之一，同时又是主要的免疫原性蛋白，在APP免疫保护方面发挥重要作用，根据溶血性和细胞毒性的差异将Apx毒素分成四种类型，分别为ApxI、ApxII、ApxIII和ApxIVA，每种毒素的基因组成及生物学活性存在明显差异。研究还显示，APP所有血清型菌株均可产生尿素酶，其活性有助于APP在猪呼吸道定殖感染，对APP的持续性感染也有重要作用，UreC是尿素酶的C蛋白，研究证实该蛋白在APP尿素酶活性中发挥重要作用，该基因失活后脲酶活性消失，APP毒力下降了四倍。

鉴于猪传染性胸膜肺炎在世界各地广泛流行和传播并造成较大的经济损失，采取积极防制措施控制该病极为必要。虽然加强饲养管理和抗生素药物防治对控制该病具有重要作用，但疫苗预防仍是控制该病的关键措施。目前APP全菌灭活疫苗是应用最广泛、最成熟的一种防治猪传染性胸膜肺炎的疫苗，但该疫苗缺乏交叉保护活性，对不同血清型菌株不能发挥保护作用。灭活疫苗和亚单位疫苗虽然可以降低患病猪的死亡率，但动物仍会出现亚临床症状并进一步发展为慢性感染。而研究发现野外感染任何一种血清型的康复猪可抵抗不同血清型菌株的再次感染，因而提示应用APP活疫苗可提供较强的交叉免疫保护。目前APP减毒活疫苗的研制仍处于实验室研制阶段，商品化的减毒活疫苗尚未出现。

发明内容

根据上述领域的不足和需求，本发明提供一种猪胸膜肺炎放线杆菌减毒菌株。本发明请求保护的技术方案如下：

一种猪胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)减毒菌株GS7CA，其保藏号为，CGMCC NO.10016。

所述猪胸膜肺炎放线杆菌减毒菌株在制备预防猪胸膜肺炎的产品中的用途。

一种预防猪胸膜肺炎的疫苗，其活性成分包含所述猪胸膜肺炎放线杆菌减毒菌株。

一种预防猪胸膜肺炎的疫苗，其活性成分为所述猪胸膜肺炎放线杆菌减毒菌株。

所述疫苗还包括用于制备疫苗的常规辅助成分。

一种经鼻腔接种的预防猪胸膜肺炎的活疫苗，是所述猪胸膜肺炎放线杆菌减毒菌株的单菌落接种于TSB+NAD培养基中培养12～16h后，按培养物：TSB+NAD培养液为1∶50比例接种于TSB+NAD培养液中培养至OD600达到0.8的产物。

一种预防猪胸膜肺炎的方法，其特征在于，使用以所述猪胸膜肺炎放线杆菌减毒菌株为活性成分的产品对猪进行免疫。

胸膜肺炎放线杆菌(APP)是引起猪传染性胸膜肺炎的呼吸道病原细菌，其中Apx毒素和尿素酶(Urease)均是其主要的毒力因子，且Apx毒素又是其主要的免疫原性蛋白。为构建APP减毒突变菌株，本发明首先利用仅表达ApxII毒素蛋白且毒力较弱的APP血清7型参考菌株(WF83)作为母源菌株，缺失apxIIC基因片段并插入具有免疫原性的apxIA-N基因片段，利用sacB基因负向筛选系统构建无抗生素抗性基因标记的apxIIC^-/apxIA⁺单突变菌株(GS7C)；在单突变菌株GS7C的基础上进一步缺失基因组中ureC基因片段，并插入具有免疫原性的apxIII-N基因片段，进而再利用sacB基因负向筛选系统构建成功表达ApxIII-N蛋白的apxIIC^-/apxIA⁺、ureC^-/apxIII⁺双突变菌株(GS7CA)。该双突变菌株生物学特性鉴定结果显示，双基因突变不影响细菌增殖能力，溶血活性和尿素酶活性完全丧失，可表达ApxII蛋白及插入的外源基因ApxIII-N蛋白，连续传代基因组中插入的外源基因可稳定遗传，对试验小鼠腹腔攻毒结果显示双突变菌株毒力较母源菌株降低9.2倍，对断奶仔猪攻毒试验显示双突变菌株对仔猪肺脏的损伤较母源菌株显著降低，对断奶仔猪的免疫攻毒保护试验显示双突变菌株对APP不同血清型菌株的攻毒具有一定的交叉保护能力。

本发明还提供一种预防猪胸膜肺炎的疫苗，所述疫苗的活性成分为上述猪胸膜肺炎放线杆菌减毒菌株。本发明提供的疫苗具有下述优点：(1)具有交叉保护活性：本发明的疫苗属于减毒活疫苗，对APP不同血清型菌株具有一定的交叉保护能力；(2)毒力低：所述疫苗的活性成分猪胸膜肺炎放线杆菌减毒菌株，其毒力较母源菌株降低9.2倍，对猪进行免疫后不会引起发病或死亡，安全性高；(3)质量稳定：生产疫苗所使用的猪胸膜肺炎放线杆菌减毒菌株，其具有免疫原性的外源基因ApxIII-N可稳定遗传，能够保证每批疫苗的质量；(4)生物安全性高：所述疫苗的活性成分猪胸膜肺炎放线杆菌减毒菌株，采用无抗性标记基因sacB基因负向筛选系统筛选而得，无生物安全风险，可用于疫苗的大量生产。

在本发明的一些实施例中，所述疫苗的活性成分除了本发明的猪胸膜肺炎放线杆菌减毒菌株外，还可以包含其它的本领域技术人员已知的具有猪胸膜肺炎免疫原性的成分，与本发明的猪胸膜肺炎放线杆菌减毒菌株一起发挥免疫作用，增强健康猪对APP不同血清型菌株的抵抗能力。

本发明还特别请求保护上述菌株制成的一种经鼻腔接种活疫苗，是所述猪胸膜肺炎放线杆菌减毒菌株的单菌落接种于TSB+NAD培养基中培养12～16h后，按培养物：TSB+NAD培养液为1∶50比例接种于TSB+NAD培养液中培养至OD600达到0.8的产物。

综上所述，本发明提供的猪胸膜肺炎放线杆菌减毒菌株，溶血活性和尿素酶活性完全丧失，毒力大大降低，可稳定遗传。采用本发明的猪胸膜肺炎放线杆菌减毒菌株制成的减毒活疫苗，毒力低，具有交叉保护活性，生物安全性高，质量稳定。

本发明提供的猪胸膜肺炎放线杆菌减毒菌株，已进行专利保藏，保藏信息如下：

生物保藏信息：

生物材料名称：GS7CA

分类命名：胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)

保藏日期：2014年11月20日

保藏号:CGMCC No.10016.

保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号

附图说明

图1.经两次单交换构建突变菌株GS7C的PCR鉴定结果，其中M为1kb plus Marker；A：1-10，第1次单交换突变菌株；B：1-2，GS7C，3，APP7，4，第1次单交换突变菌株。

图2.经两次单交换构建突变菌株GS7CA的PCR鉴定结果，其中M为1kb plusMarker；A：1-7，第1次单交换突变菌株；B：1，GS7CA，2，GS7C，C，阴性对照，P，阳性对照。

图3.母源菌株和突变菌株在培养基中增殖能力的比较。

图4.母源菌株与突变菌株溶血活性的比较，其中，中间垂直线为表皮葡萄球菌生长线，生长线两侧为APP菌落。

图5.细菌尿素酶活性检测结果。

图6.母源菌株与突变菌株表达ApxII蛋白(A)和ApxIII蛋白(B)的Western blot检测。

图7.突变菌株遗传稳定性的PCR检测结果，其中，M为1kb plus Marker；A：1-9，GS7C不同代次采样的检测结果，10，APP7；B：1-10，GS7CA不同代次采样的检测结果，11，APP7。

具体实施方式

以下通过具体实施例对本发明进行解释，需要理解的是，下述实施例仅作为对本发明的进一步说明，本发明的保护范围并不限于此。

实验材料和试剂：

(1)菌株和质粒

APP血清1型参考菌株(4074)、血清2型参考菌株(S1536)、血清3型参考菌株(S1421)和血清7型参考菌株(WF83)，由澳大利亚Pat Blackall博士惠赠，属于已知菌株，记载在(1)Nielsen.R..1990.New diagnostic techniques:A review of the HAP group ofbacteria.Can.J.Vet.Res.,54:68-71.和(2)Blackall PJ,Klaasen HL,Bosch H,etal.Proposal of a new serovar of Actinobacillus pleuropneumoniae:serovar15.Vet Microbiol,2002,84:47～52)两篇文献中。

大肠杆菌β2155(DAP依赖菌)及接合转移质粒pEMOC2，为已知材料，由华中农业大学陈焕春教授惠赠；大肠杆菌TOP10，pZeroBack克隆载体试剂盒购自天根生化公司；表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)，由本实验室保存。克隆质粒pUC19、pBluescriptSK(-)和原核表达质粒pET-32a由本实验室保存。

(2)培养基及添加成分

胰酶大豆琼脂(Tryptic soy agar,TSA)和胰酶大豆肉汤(Tryptic soy broth,TSB)购自BD Difco公司，按说明书配制后用于培养APP。

新生牛血清(Newborn Calf Serum)，购自兰州民海生物公司，按质量体积百分比5％加入到TSA或TSB中用于培养APP感受态细胞。

TSA+NAD:在TSA中按质量体积百分比加入0.005％烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(Nicotinamide Adenine Dinucleotide,NAD)，购自Roche公司，用于APP的培养。

TSB+NAD：在TSB中按质量体积百分比加入0.005％烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(Nicotinamide Adenine Dinucleotide,NAD)，购自Roche公司,用于APP的培养。

LB培养基(每1000ml中含胰蛋白胨10g；酵母抽提物5g；NaCl 10g)，按常规方法配制后用于E.coli的培养。

绵羊血琼脂培养平板，购自天津市金章科技发展有限公司。

氨苄青霉素(Ampicillin,Amp)，使用浓度为100μg/mL；

氯霉素(Chloramphenicol,Cm)，使用浓度分别为34μg/mL(重组质粒筛选)和5μg/mL(APP突变菌株筛选)；二氨基庚二酸(DAP)，均购自Sigma公司。

TNB液体培养基配方：胰蛋白陈10g，酵母浸出物5g，溶于ddH₂O中，完全溶解后用5mol/L NaOH调pH值至7.0-7.2，定容至1000mL，室温保存。

TNA培养基配方：在TNB液体培养基中加入1.5g/L的琼脂粉。

(3)血清抗体及二抗

ApxIA-N、ApxIIA-N和ApxIII-N基因片段分别自APP血清1型、血清7型和血清3型基因组DNA中PCR扩增获得，然后分别插入原核表达质粒pET-32a中进行原核表达，表达蛋白经纯化后免疫兔，从而获得三种表达蛋白的兔高免血清，由本实验室制备并保存。辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG购自Sigma公司。

(4)分子生物学试剂

细菌全基因组提取试剂盒购自Promega公司；PCR反应试剂Ex Taq DNA聚合酶、dNTPs、10×PCR缓冲液购自TaKaRa公司。限制性内切酶购自Thermo公司。质粒小量提取试剂盒、高纯度质粒提取试剂盒和琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购自QIAGEN公司。T₄DNA连接酶、预染蛋白Marker购自NEB公司。pGM-T Easy Vector Kit、Pfu PCR MasterMix、DNA Marker购自天根生化公司。Western-blot用Immobilon-P PVDF(polyvinylidene fluoride)膜购自Millipore公司。苯酚、氯仿、异戊醇及常用化学试剂购自北京市化学试剂公司。

(5)实验动物

Balb/C小鼠：清洁级，购自军事医学科学院实验动物中心。

6周龄断奶仔猪：购自京郊某养猪场，该猪场未使用任何APP相关的疫苗免疫猪，且利用IDEXX公司生产的胸膜肺炎放线杆菌抗体检测试剂盒对仔猪血清的APP抗体检测结果为阴性。

本发明未特别说明的实验试剂均属于本领域常规试剂，可商购获得，或采用本领域常规方法配制而得，规格为实验室纯级即可。

实施例1、APP血清7型减毒双突变菌株的获得

1、细菌培养

取冻干保存的APP不同血清型菌株，划线培养于添加5％新生牛血清和0.005％NAD的TSA平板上，于37℃温箱中培养约16～20h。自培养平板上挑取单菌落接种于5mL添加0.005％NAD的TSB培养基中，于37℃摇床中振摇培养约12～16h。

2、APP基因组DNA抽提

取TSB培养基中培养的APP培养液1mL加入1.5mL离心管中，经12,000g离心30s后弃去培养液，用1mL TE缓冲液洗涤1次，参照试剂盒说明书利用细菌全基因组提取试剂盒抽提基因组DNA，最后将基因组DNA溶于100μL TE缓冲液中冻存备用。

3、基因片段扩增、克隆和测序

(1)PCR扩增

参考GenBank中基因序列，利用Primer3软件设计引物用于扩增不同基因片段，所述基因片段及其引物序列见表1。建立50μL PCR反应体系：纯水35μL，10×PCR缓冲液5μL，Taq DNA聚合酶1μL，10mmol/L dNTPs 4μL，上游引物2μL，下游引物2μL，模板DNA 1 μL。PCR反应程序为：首先95℃变性5min，然后进行30个循环(94℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸时间按照1min扩增1kb计算)，最后72℃延伸10min。

(2)扩增片段的回收

PCR扩增产物于0.8％的琼脂糖凝胶中上样电泳检测扩增片段是否与预期相符，电泳检测后切下目的条带，利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行扩增片段的回收，具体操作步骤按照试剂盒说明书进行。利用核酸定量仪检测回收DNA片段的纯度和浓度。

(3)回收片段的克隆

利用pGEM-T Easy Vector Kit对回收的DNA片段进行克隆，具体操作过程参照试剂盒说明书进行，转化后挑取白色单菌落接种于5mL LB液体培养基，37℃振摇培养过夜，培养菌液经小量提取质粒DNA试剂盒进行抽提，提取的质粒DNA进行酶切电泳鉴定。

(4)序列测定

选取重组质粒酶切鉴定正确的阳性克隆进行序列测定，序列测定由生工生物公司完成，序列测定后与参考序列进行同源性比较和酶切位点等分析。

表1 本试验所用的PCR引物

4、转移载体的构建

首先构建重组转移质粒用于突变菌株的构建。

分别从APP7基因组DNA中扩增ApxIICN和ApxIICC基因片段，从APP1基因组DNA中扩增ApxIAN基因片段；分别将ApxIICN、ApxIICC和ApxIAN基因片段与零背景载体pZeroBack连接，获得的阳性克隆质粒分别用相应的双酶切，经胶回收获得目的片段；接合转移质粒pEMOC2采用SmaI/XbaI双酶切，然后将三个目的片段一起连接，获得重组转移质粒载体pEIICIAN。

自构建的APP7突变菌株GS7C基因组DNA中分别扩增UreCN和UreCC基因片段，同时从APP3基因组DNA中扩增ApxIII promoter和ApxIIIAN基因片段；ApxIII promoter和ApxIIIAN采用Overlap PCR进行连接，获得ApxIIIANP基因片段；分别将UreCN、UreCC和ApxIIIANP基因片段与零背景载体pZeroBack连接，获得的阳性克隆质粒分别用相应的双酶切获得目的片段；接合转移质粒pEMOC2采用SmaI/XbaI双酶切，然后将三个目的片段一起连接，获得重组转移质粒载体pEUCIIIAN。

5、重组转移质粒转化大肠杆菌β2155

利用常规CaCl₂法制备大肠杆菌β2155感受态细胞，然后通过热激转化将重组转移质粒DNA转入β2155感受态细胞，通过鉴别引物和Cm抗性鉴定阳性克隆。

6、突变菌株的筛选和鉴定

参考“Dehio C,Meyer M.Maintenance of broad-host-range incompatibilitygroup P and group Q plasmids and transposition of Tn5in Bartonella henselaefollowing conjugal plasmid transfer from Escherichia coli.Journal ofBacteriology.1997,179(2):538-540.”中所述的方法，将重组质粒pEIICIAN通过接合转移从大肠杆菌β2155转入受体菌APP7母源菌株中。供体菌和受体菌分别在各自的最适培养基培养，待其长满平板后，用TSB培养基将其洗下，洗涤两次后，调整供体菌和受体菌的OD600至1.0；供受比1:1混合后，将其滴加到贴有NC膜的TSA+NAD+DAP平板上(37℃预热)，37℃孵育8h，同时设置对照组；将孵育后平板上的细菌用TSB洗下，洗涤两次，适当稀释后均匀涂到TSA+NAD+Cm平板上，37℃孵育24h-48h。将长出的单个菌落分别影印TSA+NAD+Cm和TSA+NAD+15％Sucrose平板，37℃孵育24h后，筛选Cm抗性和Sucrose敏感克隆，并利用IICF2/IICR2和Cm1/Cm2引物进行鉴定，筛选得到第一次重组菌株。

将第一次筛选到的重组菌接种到TNB+NAD液体培养基，37℃振摇培养8h后涂布TNA+NAD+15％Sucrose平板，37℃孵育36h；将长出的单菌落分别影印TSA+NAD+15％Sucrose和TSA+NAD+Cm平板，37℃孵育24h后，筛选Cm敏感和Sucrose抗性的细菌克隆，并利用IICF2/IICR2和Cm1/Cm2引物进行鉴定，筛选得到重组菌株，将其命名为GS7C。

进而利用完全相同的方法将重组质粒pEUCIIIAN通过接合转移从大肠杆菌β2155转入受体菌GS7C菌株中，通过两次相同方法的筛选，并利用UreCF/UreCR和Cm1/Cm2引物进行鉴定，筛选得到重组菌株，其中一株命名为GS7CA。

实验结果：突变菌株通过两次单交换同源重组获得。构建的接合转移质粒pEIICIAN经测序正确后，热激转入大肠杆菌β2155，PCR鉴定正确；通过接合转移，β2155将自杀质粒pEIICIAN转移到APP7中，平板筛选Cm抗性和Sur敏感的菌落，然后将其通过PCR鉴定，获得784bp和1354bp两条目的带，得到第一次重组菌(图1A)；将第一次重组菌转接平板培养基TNB+NAD培养，然后平板筛选Sur抗性和Cm敏感的菌落，并将其通过PCR鉴定，获得1354bp的一条目的带，得到第二次重组菌GS7C(图1B)。

接着利用同样的方法将重组转移质粒pEUCIIIAN转移至GS7C菌株中，平板筛选Cm抗性和Sur敏感的菌落，然后将其通过PCR鉴定，获得1460bp和1723bp两条目的带，得到第一次重组菌(图2A)；将第一次重组菌转接贫瘠培养基TNB+NAD培养，然后平板筛选Sur抗性和Cm敏感的菌落，并将其通过PCR鉴定，获得1723bp的一条目的带，得到第二次重组菌GS7CA(图2B)。

实施例2、APP突变菌株的生物学特性检测

将筛选获得的APP7两种突变菌株GS7C和GS7CA，在鉴定的基础上，对其生物学特性及与母源菌株的差异性进行比较分析。

1、增殖能力

分别挑取突变菌株和母源菌株单菌落接种TSB+NAD培养液，37℃振摇培养过夜；然后分别以1:1000比例接种5mL TSB+NAD培养液，37℃振摇培养12h，每隔1h取样测定细菌的OD600值，绘制细菌生长曲线；同时对母源菌株进行活菌计数，统计获得细菌OD600与细胞CFU的关系。通过细菌生长曲线比较突变菌株和母源菌株增殖能力的差异性。

结果如图3所示，两菌株生长曲线大体一致均在3h左右进入对数期，6h左右进入平台期，并维持到12h。

2、溶血活性

母源菌株APP7和突变菌株(GS7C和GS7CA)分别于血琼脂平板上划线培养，同时在划线培养物上面用表皮葡萄球菌垂直接种一条线，37℃培养后观察突变菌株和母源菌株溶血性的差异以及菌落生长是否呈现典型的卫星现象(即APP菌落仅生长于葡萄球菌生长线的两边)。

结果如图4所示，母源菌株呈现弱溶血活性，而突变菌株无溶血性，提示ApxIIC基因缺失失活后APP7中的ApxII溶血活性已丧失，而且结果还显示，所有菌株在表皮葡萄球菌生长线两侧的生长均呈现典型的卫星现象，即菌落均出现在靠近葡萄球菌生长线的两侧。

3、尿素酶活性

将母源菌株APP7和突变菌株(GS7C和GS7CA)分别接种TSA+NAD平板，待细菌铺满平板后将其转移到NC膜，然后将附有细菌的NC膜置于空平板上，将配置好的指示剂(0.5％琼脂煮沸后冷却至50℃，加入20mg/mL Urea和100μg/mL的苯酚红)倒入平板，2-10min内观察显色结果。

结果如图5所示，母源菌株APP7和突变菌株GS7C均呈尿素酶阳性反应，而突变菌株GS7CA不能利用尿素，呈现尿素酶阴性反应，提示UreC基因失活造成细菌尿素酶丧失活性。

4、突变株表达蛋白的检测

挑取突变菌株和母源菌株单菌落分别接种5mL TSB+NAD培养基，于37℃振摇培养12～16h，取出培养物按1∶50比例接种于100mL TSB+NAD培养基中，37℃继续振摇培养至OD600达到0.8，取出培养菌液经12000g离心15min收集菌沉淀，菌沉淀适当稀释后进行超声破碎，收集超声上清进行SDS-PAGE电泳检测和Western blot分析，其中ApxIAN和ApxIIIAN经原核表达纯化蛋白并免疫兔制备的多抗分别作为一抗，使用前进行1:200稀释；HRP标记羊抗兔二抗经1:10000稀释后作为二抗进行反应。

利用Western blot检测母源菌株APP7和突变菌株(GS7C和GS7CA)表达ApxI、ApxII、ApxIII蛋白情况。结果显示，在ApxI蛋白表达检测中，虽然突变菌株GS7C和GS7CA均插入ApxIAN基因片段，但均未检测到相应的表达条带，提示ApxIAN基因可能未正确表达；在ApxII蛋白表达检测中，APP7、GS7C和GS7CA均能正常表达ApxII蛋白(图6A)，提示突变菌株GS7C和GS7CA中ApxIIC基因的缺失不影响ApxII蛋白的正常表达；在ApxIII蛋白表达检测中，APP7不能表达ApxIII，APP3参考菌株可表达一条120kD左右条带，突变菌株GS7C不能表达ApxIII相关蛋白，而突变菌株GS7CA中表达一条明显的37kD左右条带，与预测插入片段表达大小一致(图6B)，提示ApxIIIAN基因在突变菌株GS7CA中获得正确表达。

5、遗传稳定性

将突变菌株培养物在TSB中连续传不同代次，即按1:50比例接种TSB+NAD培养基，培养12～16h后再取培养物按1:50比例接种新鲜培养基，分别隔1代取培养菌液用于提取细菌基因组DNA，利用PCR检测插入的外源基因，其中突变菌株GS7C和GS7CA分别使用引物对IICF2/IICR2和UreCF/UreCR，鉴定突变菌株基因组DNA中外源基因的遗传稳定性。

突变菌株GS7C使用引物对IICF2/IICR2进行扩增，片段大小为1354bp，相应母源菌株APP7中扩增片段大小为784bp(图7A)；突变菌株GS7CA使用引物对UreCF/UreCR进行扩增，片段大小为1723bp，相应的母源菌株APP7中扩增片段大小为1460bp(图7B)。检测不同代次结果均一致，表明突变菌株可稳定遗传。

6、对小鼠的毒力

取80只6周龄雌性昆明小鼠，随机分为16组，每组5只，菌株APP7、GS7C和GS7CA分别按照5个攻毒剂量组进行攻毒，并设1个空白对照组。挑取APP7、GS7C和GS7CA单菌落分别接种5mL TSB+NAD培养基，于37℃振摇培养12～16h，取出培养物按1∶50比例接种于10mL TSB+NAD培养液中，37℃继续振摇培养至OD600达到0.8，此时细菌浓度约为1.0×10⁹CFU/mL。利用TSB培养液将菌液稀释至所需的攻毒剂量，对每组小鼠分别进行腹腔注射攻毒，空白对照组注射TSB+NAD培养液，腹腔注射200μL/只，观察各组小鼠死亡情况，统计小鼠的死亡率并计算细菌对小鼠的LD₅₀。

结果如表2所示，突变菌株GS7C和GS7CA对小鼠毒力的LD50值较母源菌株APP7分别增加5.2倍和9.2倍，因此突变菌株对小鼠的毒力较母源菌株降低相应的倍数。

表2 突变菌株和母源菌株对小鼠的毒力测定结果

7、对仔猪的毒力

自京郊某养猪场购买35头6周龄断奶仔猪，利用IDEXX公司胸膜肺炎放线杆菌抗体检测试剂盒检测APP抗体为阴性，随机分为7组，每组5头，散养于实验动物舍饲养笼内，菌株APP7和GS7CA分别按照低、中、高3个剂量组进行攻毒，并设1个空白对照组。分别挑取APP7和GS7CA单菌落接种5mL TSB+NAD培养基，于37℃振摇培养12～16h，取出培养物按1∶50比例接种于20mL TSB+NAD培养液中，37℃继续振摇培养至OD600达到0.8，培养物经鼻腔接种每头猪，攻毒剂量分别为0.5mL/头、1mL/头、2mL/头，对照组按同样方法接种TSB+NAD培养液，攻毒后逐日观察仔猪临床症状变化，至攻毒后第7天将猪全部剖杀，记录肺损伤情况，并计算肺损伤指数。

结果显示，攻毒1天后APP7不同剂量攻毒组多数猪只出现呼吸频率增加，部分猪只出现腹式呼吸，精神沉郁，食欲不振，3天后逐渐恢复正常；突变菌株GS7CA不同剂量攻毒组仅有少数猪只出现呼吸频率增加，3天后所有猪只恢复正常。攻毒7天后剖检结果显示，APP7对攻毒仔猪的肺损伤与GS7CA相比显著增强，t检验具有显著差异。两种菌株对仔猪的肺损伤指数测定结果如表3所示。

表3 突变菌株和母源菌株对仔猪的毒力测定结果

注：肺分7叶，每叶最高损伤分数5分，损伤越严重，分值越高，所有分值相加获得每头猪的肺损伤指数。

8、对仔猪的免疫保护力

自京郊某养猪场购回44头6周龄断奶仔猪，利用IDEXX公司胸膜肺炎放线杆菌抗体检测试剂盒检测APP抗体为阴性，随机分为两组(免疫组和非免疫组)，每组22头，散养于实验动物舍饲养笼内。挑取GS7CA单菌落接种5mL TSB+NAD培养液，于37℃振摇培养12～16h，取出培养物按1∶50比例接种于20mL TSB+NAD培养液中，37℃继续振摇培养至OD600达到0.8，该细菌培养物经鼻腔接种免疫组中每头猪，免疫剂量1mL/头，非免疫组按同样方法接种TSB+NAD培养液；两周后按同样方法进行第二次免疫，免疫剂量增加至2mL/头；再过两周以APP血清1型、血清2型和血清7型参考菌株进行攻毒保护试验。参考菌株培养方法同突变菌株，培养至OD600达到0.8作为攻毒用菌液；免疫组和非免疫组各分为四个亚组，每个亚组中仔猪头数分别为6、6、6、4，分别进行血清1型攻毒、血清2型攻毒、血清7型攻毒和不攻毒对照，攻毒后逐日观察仔猪临床症状变化及死亡情况，至攻毒后第7天将存活猪全部剖杀，记录肺损伤情况，并计算肺损伤指数。

利用突变菌株GS7CA作为弱毒活疫苗对仔猪进行鼻腔接种免疫，免疫两次后利用APP血清1、2、7型参考菌株进行攻毒，攻毒后通过每组死亡数和肺损伤指数的差异进行比较，从而判定GS7CA作为弱毒活疫苗的攻毒保护能力。结果显示，血清1型和2型攻毒后2-4天免疫和非免疫组均出现猪只的死亡，非免疫组死亡数多于免疫组；血清7型攻毒后未出现死亡猪只。在肺损伤指数方面，APP血清1、2、7型攻毒后免疫组猪只的肺损伤指数普遍低于非免疫组猪只，提示GS7CA作为弱毒活疫苗具有一定的攻毒保护效果。

表4 突变菌株GS7CA免疫仔猪后对APP不同血清型菌株的攻毒保护效果

Claims

1.一种猪胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)减毒菌株GS7CA，其保藏号为CGMCC NO.10016。

2.权利要求1所述的猪胸膜肺炎放线杆菌减毒菌株在制备预防猪胸膜肺炎的药品中的用途。

3.一种预防猪胸膜肺炎的疫苗，其活性成分包含权利要求1所述的猪胸膜肺炎放线杆菌减毒菌株。

4.一种预防猪胸膜肺炎的疫苗，其活性成分为权利要求1所述的猪胸膜肺炎放线杆菌减毒菌株。

5.根据权利要求3或4所述的疫苗，其特征在于，还包括用于制备疫苗的常规辅助成分。

6.一种经鼻腔给药的预防猪胸膜肺炎的活疫苗，是将权利要求1所述的猪胸膜肺炎放线杆菌减毒菌株的单菌落接种于TSB+NAD培养基中培养12～16h后，取出培养物，再以1∶50的比例将培养物接种于TSB+NAD培养液中培养至OD600达到0.8的产物。