CN101265457A - 区分疫苗免疫和野毒感染动物的猪胸膜肺炎放线杆菌血清7型双基因缺失突变株的疫苗及应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于动物细菌基因工程领域，具体涉及一种区分疫苗免疫和野毒感染动物的猪胸膜肺炎放线杆菌血清7型双基因缺失突变株的构建、疫苗及应用。本发明得到一株区分疫苗免疫动物和野毒感染动物的猪胸膜肺炎放线杆菌血清7型基因缺失突变株APP－7－mut01(保藏号为CCTCC NO：M207004)。该株缺失APP血清7型两个主要的毒力因子apxIIC和apxIVAN基因。突变株对猪安全，且具良好免疫原性的毒素ApxIIA和ApxIVAC蛋白，保证了疫苗的免疫效力。用突变株的疫苗免疫动物，动物体内不再产生针对Apx IVAN蛋白抗体，而野毒猪感染的产生针对ApxIVAN蛋白抗体。本发明还公开了利用该双基因缺失突变株构建，疫苗制备及应用。

Description

区分疫苗免疫和野毒感染动物的猪胸膜肺炎放线杆菌血清7型双基因缺失突变株的疫苗及应用

技术领域

本发明属于动物细菌基因工程技术领域，具体涉及一种区分疫苗免疫和野毒感染动物的猪胸膜肺炎放线杆菌血清7型基因缺失突变株的构建、疫苗制备及应用。

背景技术

猪传染性胸膜肺炎(porcine contagious pleuropneumonia，PCP)是由胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae，APP)引起的一种猪传染性呼吸道疾病，给世界养猪业造成了严重的经济损失。自我国发现PCP流行以来，广大兽医工作者对其病原学、流行病学、诊断及防制等方面都进行了一系列研究，取得了一定的成就。但目前该病在我国发病率仍逐年增长，有的猪场阳性率已达到70％以上，已经成为集约化猪场的主要传染病之一，严重危及到我国的养猪业。

APP是一种革兰氏阴性菌，分为2个生物型，共15种血清型(1-15型)，毒力因子有溶血外毒素(Apx)、脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)、荚膜多糖(Capsular Polysaccharide，CP)、外膜蛋白(Outer MembraneProtein，OMP)、尿素酶(Urease)等。但大量研究证实，溶血外毒素(Apx)是其主要毒力因子，同时也是很好的免疫保护性抗原。APP共产生四种不同的溶血外毒素，即ApxI、ApxII、ApxIII和ApxIV。不同的血清型产生的外毒素不同，除ApxIV外没有任何一种血清型APP能同时产生ApxI、ApxII、ApxIII三种毒素。各种血清型APP所产生毒素种类见表1。

表1：Apx毒素在不同APP血清型中的分布

*注：血清型15是最近提出的(Blackall，et al.2002)；血清型13、14所含的Apx尚不十分清楚，但已证实其存在ApxIVA(Bosse，et al.2002)。

目前在APP中已发现4种不同的Apx具有溶血活性或细胞毒性，即ApxI、ApxII、ApxIII和ApxIV(Frey等.Actinobacillus pleuropneumoniae RTX-toxins：uniform designation of haemolysins，cytolysins，pleurotoxin and their genes.J Gen Microbiol，1993，139(Pt 8)：1723-1728；Schaller A 等.Characterization of apxIVA，a new RTX determinant of Actinobacillus pleuropneumoniae.Microbiology，1999，8(Pt 8)：2105-2116)。如果要产生和分泌具有生物活性的Apx毒素，需要相邻的按一定顺序排列的四个基因CABD组成的操纵子调控，其中A基因编码毒素结构蛋白，C基因编码毒素激活蛋白，负责对毒素进行酰基化激活，B基因和D基因的翻译后蛋白产物形成跨膜通道，负责毒素由细胞内到细胞外的分泌。ApxI、ApxIII操纵子有完整的CABD基因，而ApxII操纵子只有C基因和A基因，其产物由ApxI的BD基因产物负责分泌到细胞外。

通过对APP其它毒力基因的缺失或插入失活，人们对一些毒力因子的结构、功能、免疫学意义有一定程度的了解，并获得了一系列有应用前景的突变株，动物实验结果表明：毒力基因缺失的突变株能诱导动物产生针对不同血清型APP攻击的交叉保护，展示了APP突变株制备的基因缺失疫苗良好的应用前景，同时也提示：通过对毒力因子的深入研究，是大有希望获得广谱、安全、高效的APP基因工程疫苗的。ApxI、ApxII具有溶血活性，ApxI溶血活性强于ApxII，ApxIII没有溶血活性但有很强的细胞毒性。ApxI、ApxII、ApxIII三种毒素对于疾病临床症状的出现以及典型的肺部病变是必需的，这三种毒素在体内外都能表达，对肺巨噬细胞、多形核白细胞、肺上皮细胞和内皮细胞都有不同程度的细胞毒性。除ApxII只含有ApxIICA基因外，ApxI和ApxIII均包括Apx CABD 4个基因。其中A基因编码毒素的结构蛋白，C基因编码毒素激活蛋白，激活A蛋白与靶细胞结合并发挥毒素活性，B和D基因产物为毒素分泌时所必需。在不分泌毒素ApxI的APP中同样有apxIBD基因存在，而apxIICA的分泌是在ApxIBD的作用下完成的。

在研究中人们还发现，编码毒素激活因子的C基因缺失或失活可导致A蛋白丧失溶血活性，从而使其毒力显著下降，但不具有溶血活性的A蛋白仍保持良好的免疫原性。此外，人们在临床上还观察到，曾经感染APP存活的猪获得了对所有血清型菌株再次感染的免疫力，其可能原因在于：一方面细菌诱导的呼吸道局部粘膜免疫反应发挥了交叉保护作用，这种局部免疫反应是常规疫苗经肌肉注射免疫时所不能达到的；另一方面，交叉保护力的产生还可能与定居在呼吸道局部的APP在繁殖过程中合成或分泌的其它物质刺激机体产生了广泛而完整的免疫应答。受这种现象的启发以及对Apx结构与功能的不断了解，国外学者构建了ApxIIC基因插入失活的基因工程突变株，经鼻腔内接种动物，不仅表现出毒力降低，而且能诱导动物产生针对不同血清型APP攻击的交叉保护，展示了APP基因缺失疫苗良好的应用前景(Prideaux C T等，Vaccination and protection of pigs against pleuropneumonia with a vaccine strain ofActinobacillus pleuropneumoniae produced by site-specific mutagenesis of the ApxII operon.Infect Immun，1999，67(4)：1962-1966)。申请人所在的华中农业大学动物传染病研究室也按同样的方法构建了以我国地方分离的APP血清7型菌株为亲本菌株(HB04)的apxIIC基因插入失活的基因工程突变株，并进一步构建了apxIIC单基因缺失的疫苗株HB04C(apxIIC)，免疫实验动物证实具有很好的免疫效果(贝为成(Bei W)等.Construction and characterization of a live，attenuated apxIICA inactivationmutant of Actinobacil lus pleuropneumoniae lacking a drug resistance marker.FEMS Microbiol Letter.2005，243：21-27)

1997年Anderson和Machnnes首先发现毒素ApxIV，它在结构上与其他的三种RTX毒素有相似处，也有独特处，特性上更有许多独特的鲜为人知的地方。apxIVA基因是位于APP LacZ基因上游的一段类似于RTX毒素家族成员脑膜炎奈瑟球菌铁调控外分泌蛋白FrpA和FrpC基因的序列。正如FrpA和FrpC，编码ApxIVA蛋白的操纵子在其上游包含有一段ORF(ORF1)基因，已经证实ORF(ORF1)与ApxIVA的激活有关，对于可见的溶血性和协同溶血表型是必需的，但具体作用机制并不清楚。它的大小与发现于FrpA和FrpC上游的不明功能的ORF相似，但却与它没有高的同源性。apxIVA包含有两个经典的赖氨酸酰化作用位点(GK)，它们相似于大肠杆菌的溶血素结构基因HlyA上的由HlyC介导激活的对象。同时，位于ORF1上游的是mrp基因，在apxIVA基因的下游是一个LacZ基因，该基因单独翻译。已证实apxIVA基因在感染时才表达，在体外培养时无论在什么样的培养条件下培养都无法检测到ApxIV毒素。这一特性说明对ApxIV抗体的检测可以鉴别PCP疫苗免疫猪和野毒感染猪，这对于我国出入境检疫提供了一个快速简便的检测方法，同时为养殖户根除该传染病提供了手段。ApxIV感染猪的免疫原性试验以及重组ApxIVA溶血活性试验表明：ApxIV在PCP致病和免疫中起着一定的作用。与ApxI、ApxII和ApxIII这三种毒素相比，毒素ApxIV的发现和研究起步较晚，目前对ApxIV的研究大多是基于诊断的目的进行ApxIV部分基因的克隆和表达研究，对它在APP致病与免疫中的作用及疫苗等方面的深入研究目前国内外都没有相关报道。

鉴于上述背景，构建在我国流行的APP血清7型菌毒素apxIIC和apxIVAN基因缺失突变株，研究其遗传特性、生长特性、毒力、对动物致病性和免疫原性等生物学特性，筛选既保留良好免疫原性又失去对动物致病性的不含抗性标记的基因缺失疫苗菌株并研制成有效预防并在我国乃至全球根除猪传染性胸膜肺炎基因缺失疫苗与应用乃当务之急。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术存在的缺陷，获得一种适用于猪胸膜肺炎放线杆菌血清7型的安全性更强、免疫原性更好且能区分疫苗免疫和野毒感染动物的猪胸膜肺炎放线杆菌血清7型双基因缺失突变菌株；

本发明的第二个目的是利用猪胸膜肺炎放线杆菌血清7型双基因缺失突变菌株制备可区分疫苗免疫动物和野毒感染动物的猪传染性胸膜肺炎双基因缺失疫苗；

本发明的第三个目的是猪胸膜肺炎放线杆菌血清7型双基因缺失突变菌株制备猪传染性胸膜肺炎基因缺失疫苗的应用，其中包括所制备的基因缺失疫苗动物(猪)临床中的应用。

本发明通过以下技术方案实现：

一种区分疫苗免疫和野毒感染动物的猪胸膜肺炎放线杆菌血清7型双基因缺失突变株(分类命名：Actinobacillus pleuropneumoniae)APP-7-mut01，于2007年1月19日保藏在中国典型培养物保藏中心(地址：湖北省武汉市武汉大学内)，保藏编号：CCTCC NO：M207004。所述的一株区分疫苗免疫动物和野毒感染动物的猪胸膜肺炎放线杆菌血清7型双基因缺失突变株缺失主要是APP血清7型apxIIC基因和apxIVAN基因，毒力基因缺失后一方面突变株对猪是安全的，同时可产生具有很好免疫原性的毒素ApxIIA蛋白和ApxIVAC蛋白，保证了疫苗的免疫效力；另一方面，用突变菌株制备成基因缺失疫苗后免疫动物，动物体内不再产生针对ApxIVAN蛋白抗体，而野毒猪感染动物后可以产生针对ApxIVAN蛋白抗体。一种区分疫苗免疫和野毒感染动物的猪胸膜肺炎放线杆菌血清7型单基因缺失突变株，所述的基因工程菌株它衍生于申请人申请日前已经公开报道的猪胸膜肺炎放线杆菌血清7型单基因工程菌株，菌株编号HB04C(贝为成(Bei W)等.Construction and characterization of a live，attenuated apxIICA inactivationmutant of Actinobacillus pleuropneumoniae lacking a drug resistance marker.FEMS Microbiol Letter.2005，243：21-27)。本发明制备的一种区分疫苗免疫和野毒感染动物的猪胸膜肺炎放线杆菌血清7型双基因缺失突变株主要毒力基因apxIIC缺失了480bp，apxIVAN缺失了602bp，导致毒力大大降低，细菌不再具有细胞毒性和溶血活性，因而具有很高的安全性。而且由于突变菌株仍然能表达无毒性的apxIIA和apxIVAC蛋白，因此具有很好的免疫保护力。最为重要的是，突变株研制成疫苗免疫动物后，动物体内不再产生针对ApxIVAN蛋白抗体，而野毒株感染动物后可以产生针对ApxIVAN蛋白抗体，配套鉴别诊断方法就可以在我国对猪传染性胸膜肺炎实行根除计划。

本发明的基本构建方法是：利用基因工程技术先将猪胸膜肺炎放线杆菌血清7型(简称APP-7，下同)一个主要的毒力因子apxII基因的激活因子apxIIC完全缺失后，因为要产生和分泌具有生物活性的Apx毒素，需要相邻的四个基因CABD组成的操纵子调控，其中A基因编码毒素结构蛋白，C基因编码毒素激活蛋白，负责对毒素进行酰基化激活，B基因和D基因的翻译后蛋白产物形成跨膜通道，负责毒素由细胞内到细胞外的分泌。ApxI、有完整的CABD基因，而毒素apxII基因操纵子只有C基因和A基因，其产物由ApxI的BD基因产物负责分泌到细胞外。因此，当毒力基因的激活因子apxIIC完全缺失后就不会产生具有毒性的毒素蛋白，由于A基因是结构蛋白，与免疫保护性相关，表达的ApxIIA蛋白的生物学特性没有改变。在apxIIC基因完全缺失的基础上，进一步构建毒素apxIV结构基因A的N端缺失，因为已经证实毒素apxIV基因的毒力主要与结构基因A的N端相关(apxIVAN)，而C端与其免疫原性相关。因此，当缺失apxIVAN基因后，突变株毒力大大降低同时又不影响免疫原性。最为重要的是，由于ApxIVA只在体内感染才能表达，而在体外培养时检测不到毒素ApxIVA基因表达，apxIVAN基因缺失的突变株研制成疫苗免疫动物，血清中检测不到针对apxIVAN抗体，而野毒株感染是可以检测apxIVAN抗体，配套apxIVAN-ELISA诊断方法可以区分疫苗免疫猪和野毒感染猪。通过大量的生物学实验数据证明，本发明制备的双基因缺失突变菌株可用于制备猪传染性胸膜肺炎放线杆菌血清7型双基因缺失疫苗及应用。

本发明的主要优点是：

1、本发明所用的材料为猪胸膜肺炎放线杆菌血清7型毒素apxIIC单基因缺失弱毒菌株，是本发明自行分离鉴定并构建，APP血清7型菌株是目前我国流行并严重导致猪发病的优势血清型。因此，用该突变菌株进一步构建的apxIVAN基因缺失突变菌株研制成疫苗对猪免疫具有很强的针对性，有广阔的市场应用前景。

2、本发明猪胸膜肺炎放线杆菌血清7型双基因缺失突变菌株不含抗性标记的疫苗菌株，完全符合在我们国家疫苗生物安全性要求。

3、猪胸膜肺炎放线杆菌血清7型两个主要毒力基因的apxIIC和apxIVAN完全缺失后，获得的双基因缺失突变株毒力大大降低而其免疫原性未发生改变，可以保护多种血清型野毒菌株攻击。

4、用本发明构建的双基因缺失突变株研制成疫苗后免疫动物，动物血清中检测不到针对apxIVAN抗体，而野毒株感染是可以检测apxIVAN抗体，配套已经建立的apxIVAN鉴别诊断方法，可区分疫苗免疫和野毒感染猪，达到对猪传染性胸膜肺炎实行根除计划。

附图说明

图1：是本发明中用于构建可区分疫苗免疫动物和野毒感染动物的猪胸膜肺炎放线杆菌血清7型基因缺失突变株的物理图谱。

图1A：apxIIC基因缺失的转移质粒构建示意图；图1B：apxIVAN基因缺失转移质粒构建流程示意图

图2：是本发明制备的转移质粒pEMΔIIC的鉴定结果。

图中M：DNA marker(DL 15000)1：pEMΔIIC/XbaI I+SmaI 2：pEMΔIIC/XbaI

图3：是本发明转移质粒pEΔIVAN鉴定结果。

图中M：DNA marker(DL 15000)1：pEΔIVAN/SalI I+NotI

图4：是本发明制备的pEΔIVAN转移质粒构建的流程图。

图5：是本发明的pEMΔIIC转移质粒构建的流程图。

图6：是本发明中可区分疫苗免疫动物和野毒感染动物的猪胸膜肺炎放线杆菌血清7型基因缺失突变株的PCR检测电泳图谱。

图6A：apxIIC一双交换PCR鉴定图，M：DL2000DNA分子量对照；7号为筛选的apxIIC一单基因缺失株

图6B：双基因缺失突变株PCR鉴定图，M：DL2000DNA；1-6号：双基因缺失株；7：单基因缺失株；8：阴性对照

图7：是本发明中的可区分疫苗免疫动物和野毒感染动物的猪胸膜肺炎放线杆菌血清7型基因缺失突变菌株的Southern-blotting分析结果。

图为apxIVAN缺失的突变株Southern-blotting分析结果：3是亲本株；4是突变株

图8：是本发明中的可区分疫苗免疫动物和野毒感染动物的猪胸膜肺炎放线杆菌血清7型基因缺失突变株的毒素ApxII的Western-blotting分析结果(注：毒素ApxIVA不能在体外分泌表达)。

图中1：亲本株；2：突变菌株

图9：是本发明中的区分疫苗免疫和野毒感染动物的猪胸膜肺炎放线杆菌血清7型双基因缺失突变菌株的生长特性实验结果。

图10：是本发明中的区分疫苗免疫和野毒感染动物的猪胸膜肺炎放线杆菌血清7型双基因缺失突变株株的遗传稳定性实验结果。

图11：是本发明的双基因缺失突变菌株与亲本菌株毒力比较试验结果。

图12：是本发明的双基因缺失疫苗对APP血清1型和7型攻击Balb/C小白鼠的保护效果

图13：重组转移质粒pSK-IVA构建流程图

具体实施方式

以下结合说明书附图对本发明作进一步的说明。

实施例1

1、毒素apxIIC引物设计和PCR扩增

根据已报道的APP-7株序列(参照GenBank登录号为AF315119的基因序列)设计两对引物分别扩增毒素apxII的激活基因apxIIC的上游臂和下游臂，扩增片段大小分别为1600bp和1800bp，上游臂两端分别设计PstI和EcoRI酶切位点，下游臂两端分别设计KpnI和XhoI酶切位点。上述引物均由上海生物工程公司合成。引物序列如下：

pII-1：5’GCCTGCAGATTAAACAGCACCCTAC-3’(PstI)

pII-2：5’-GTGAATTCGTAGCATCATCCCTCCC-3’(EcoRI)上臂1600bp

pII-3：5’-TCCTCGAGGGCAATTAGAATCTATC-3’(EcoRI)

pII-4：5’-GCGGTACCTTCACCTGGAGTTAGT-3’(KpnI)下臂1800bp

2.猪胸膜肺炎放线杆菌毒素apxII的激活基因apxIIC的上游臂和下游臂的克隆

将改良的TSA(即胰蛋白大豆琼脂培养基，购自美国GIBCO公司，以该培养基为基本成分，附加按体积比加1％的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(Nicotinamide Adenine Dinucleotide，NAD，又称V因子，购自中国上海化学试剂公司)和10％的小牛血清)融化，冷却至50℃，倒于平板中，待冷却凝固后，置37℃温箱2-3h至水汽烘干。将冻干的APP含有血清1型和血清7型的亲本株HB04(该菌株参见贝为成(Bei W)等.Construction and characterization of a live，attenuated apxIICA inactivation mutant ofActinobacillus pleuropneumoniae lacking a drug resistance marker.FEMS Microbiol Letter.2005，243：21-27)接至烘干平板中过夜培养。第二天挑取单菌落接种于改良TSB(即胰蛋白大豆琼脂培养基，购自美国GIBCO公司，以该培养基为基本成分，附加按体积比加1％的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和10％的小牛血清)培养基中，37℃200r/min培养7-10h提取细菌的基因组。

取1mL改良TSB培养基于EP管中，室温8000r/min离心5min，弃上清，沉淀悬浮于1mL TE溶液中。加入6μL 50mg/mL的溶菌酶，37℃作用2h后加2mol/L NaCl 50μL，10％十二烷基磺酸钠(SDS)110μL，20mg/mL的蛋白酶K3μL，50℃作用3h或37℃过夜。均分到两个EP管，加等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(100∶99∶1)抽提两次，用0.6V的异丙醇沉淀0.5h以上，离心后再用75％的乙醇洗涤，凉干后，溶于500μL ddH₂O中作PCR模板。

扩增反应在50μL的体系中进行，反应体系如下：模板DNA(1∶100质粒DNA)2μL，10×PCR缓冲液(购自武汉晶美生物工程有限公司)5μL，25mmol/LMgCl₂2.5μL，10μmol/L P₁ 0.5μL，10μmol/LP₂ 0.5μL，1mmol/L dNTPs 2μL，TaqE 1μL，ddH₂O 33.4μL。

扩增条件为：95℃变性5min后进入循环，循环参数为94℃1min，57℃1min，72℃40sec。35个循环后，72℃延伸10min。扩增的PCR产物经0.8％的琼脂糖凝胶电泳分析，扩增2个片段大小分别为1600bp和1800bp，与预期大小相当。将得到的目的基因克隆到pMD-18载体(购自大连宝生物工程有限公司)，送大连宝生物工程有限公司进行外源基因序列的测定，结果参见图1A所示。

3.pEMΔIIC转移质粒的构建

用PstI和EcoRI酶切大小为1600bp的apxIIC上游臂PCR扩增产物，用KpnI和XhoI酶切大小为1800bp的apxIIC下游臂PCR扩增产物，同时用PstI和XhoI酶切载体pEMOC2。回收上下游同源臂基因和载体pEMOC2，然后用T₄ DNA ligase连接，16℃水浴过夜，转化DH5α感受态细菌，37℃培养，挑菌，然后将连接产物转化DH₅。大肠杆菌，小量制备质粒、酶切鉴定，从而获得转移质粒pEMΔIIC。其物理图谱见图1A。鉴定结果证实构建的转移质粒pEMΔIIC是正确的(见图2)，转移质粒pEMΔIIC构建流程如图5所示。

4、毒素apxIVA引物设计(用于基因克隆和分子检测)及PCR扩增

根据已报道的APP-7株序列(GenBank登录号为AF315119)设计一对引物扩增毒素apxIVA基因，扩增片段大小为1572bp，并且两端分别设计SalI和NotI酶切位点。上述引物均由上海生物工程公司合成。引物序列如下：

PapxIVA1：5’-GCGGATCCATGCTTGGCAGTAACA-3’

PapxIVA2：5’-GCGAATTCTAAAGCATGCACATTGGTCGC-3’

扩增条件为：95℃交性5min后进入循环，循环参数为94℃1min，57℃1min，72℃40sec。35个循环后，72℃延伸10min。扩增的PCR产物经0.8％的琼脂糖凝胶电泳分析，扩增片段大小为1572bp，与预期大小相当。将得到的目的基因克隆到pMD-18载体(购自大连宝生物工程有限公司)中，并同时送大连宝生物工程有限公司进行外源基因序列的测定。参见图1B所示。

5.pEΔIVAN转移质粒的构建

用SalI和BamHI酶切大小为1000bp的apxIVAN上游臂，用BamHI和XhoI酶切大小为1600bp的apxIVAN下游臂，其物理图谱见图2，鉴定结果证实构建的转移质粒PCR扩增产物，同时用SalI和NotI酶切载体pEMOC2。回收apxIVAN上游臂基因、apxIVAN下游臂基因和载体pEMOC2，然后用T4 DNA ligase连接，16℃水浴过夜，转化DH5α感受态细菌，37℃培养，挑菌，然后将连接产物转化DH₅α大肠杆菌，小量制备质粒、酶切鉴定，获得转移质粒pEΔIVAN是正确的(见图3)，转移质粒pEΔapxIVAN构建流程如图4所示。

6.双基因缺失突变菌株的构建与鉴定

将构建的重组质粒pEΔIVAN转化至大肠杆菌Ecoliβ2155(德国汉若威大学Gerald-F.Gerlachprofessor赠送)，同时将以前构建的毒素apxIIC单基因缺失突变菌株作为亲本菌(Bei等，Constructionand characterization of a live，attenuated apxIICA inactivation mutant of Actinobacilluspleuropneumoniae lacking a drug resistance marker.FEMS Microbiology Letter.2005，243：21-270)，将携带有重组质粒pEΔIVAN大肠杆菌Ecoli β2155与APP血清7型毒素apxIIC单基因缺失株HB04C-进行转接，在氯霉素抗性TSA(购自美国GIBCO公司)平板(25ug/mL的氯霉素加入到温度为50-60℃灭菌的培养基中)上筛选阳性菌落，将阳性单菌落在不含氯霉素抗性TSB(1％的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和10％的小牛血清)培养增殖抗性菌落后，在5％蔗糖平板上筛选耐蔗糖菌落，挑取单菌落，命名 HB04C apxIIC-/apxIVAN-为实验编号进行PCR和Southern-blotting鉴定。

PCR鉴定：提取双基因缺失突变菌株HB04C apxIIC-/apxIVAN-基因组DNA，用PCR扩增apxIVAN基因，看是否能扩增出大小为600bp缺失特异性DNA片段。如果不能扩增出所述的DNA片段，表明结果与预期相符，可初步鉴定筛选的基因突变菌株是正确的，如图6B所示。

Southern-blotting鉴定：参照萨姆布鲁I，弗里奇E和曼尼阿蒂斯T.著，第二版，金冬雁等译校，《分子克隆实验指南》，科学出版社，北京，1998)中的方法进行Southern-blotting鉴定。提取双基因突变菌株HB04C apxIIC-/apxIVAN-的基因组DNA(参考文献：王柳等，人巨细胞病毒的分子克隆及其特异性DNA探针的制备，生物技术，1994，4：33-35)，用EcoRV酶切基因组DNA，在0.3％的琼脂糖凝胶上30伏电泳6小时后，按常规方法(萨姆布鲁I，弗里奇E和曼尼阿蒂斯T.著，《分子克隆实验指南》第二版，金冬雁等译校，科学出版社，北京，1998)转移到醋酸纤维素膜上，80℃烤膜后备用。以SalI/BamHI酶切重组转移质粒pSK-IVA(参见图13)，回收，采用DNA回收试剂盒(购自上海生工生物工程公司)回收1152bp的片段后，用地高辛标记与检测试剂盒(购自美国Roch公司产品)标记(具体方法按Roch公司提供的试剂盒说明书操作)，作为apxIVA基因的DNA探针，置于-20℃保存备用。最后将apxIVA基因的DNA探针与备用的醋酸纤维素膜杂交。杂交结果表明，亲本菌和突变株均有两条杂交带，但是一条在亲本菌中应为2.4kb的杂交带而在突变株中变成了1.8kb(如图7)，说明突变菌株中apxIVA缺失了约600bp(BamHI/SmaI片段)。

7.双基因缺失突变菌株生物学特性及鉴定

(1)双基因缺失突变菌株(实验编号为：HB04C apxIIC-/apxIVAN-)免疫学活性分析

以本发明的双基因缺失突变菌株培养后的上清液和离心后的溶菌液为样品进行SDS-PAGE(聚丙稀酰胺凝胶电泳)，按此方法进行蛋白表达和聚丙烯酰氨凝胶电泳(SDS-PAGE)凝胶转移至硝酸纤维素膜，用0.5％牛血清白蛋白(BSA)封闭30分钟后加入一抗1小时，兔抗猪IgG-HRP，37℃1h经TBS洗后3，3’二氨基联苯二胺盐酸盐(购自Sigma公司，整个实验操作按试剂盒说明书进行)显色。结果如图8所示：猪传染性胸膜肺炎放线杆菌血清7型双基因apxIIC、apxIVAN失活后仍能分泌大小约110KDa具有良好免疫原性的毒素蛋白ApxIIA。

(2)基因缺失突变菌株生长特性分析

分别挑取亲本菌(实验编号：HB04)和双基因缺失突变菌株(实验编号：HB04/apxIIC-/apxIVAN-)单菌落，接种入TSB培养基中培养，每间隔1小时取样，以分光光度计OD600读取其值，通过每一个相同时间段OD₆₀₀值大小来比较它们的生长快慢。结果如图9所示：apxIIC和apxIVAN基因的缺失对APP的生长没有影响。

(3)基因缺失突变菌株的遗传稳定性分析

将本发明制备的双基因缺失突变菌株在改良的TSA培养基连续传代10次，用PCR鉴定，看每一代的突变菌株是否都能扩增出约0.6kb的apxIVAN基因特异性片段。若不能，表明本发明的突变菌株是能够稳定遗传的。PCR操作方法：提取双基因缺失突变株基因组DNA，以其为模板进行PCR扩增。扩增反应在25μL的体系中进行，反应体系如下：模板基因组DNA(1∶100质粒DNA)1μL，10×PCR缓冲液2.5μL，25mmol/LMgCl₂ 1.25μL，10μmol/L P₁ 0.25μL，10μmol/L P₂ 0.25μL，1mmol/L dNTPs 1μL，TaqE 0.5μL，ddH₂O 16μL。扩增条件为：95℃变性5min后进入循环，循环参数为94℃1min，53℃1min，72℃30sec。32个循环后，72℃延伸7min。结果如图10所示：本发明制备的双基因缺失突变菌株能够稳定遗传。

经以上实验证实，本发明的猪胸膜肺炎放线杆菌血清7型双基因缺失突变菌株APP-7-mut01构建是成功的，于2007年1月19日送交中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏号为：CCTCCNO：M207004。

8、猪传染性胸膜肺炎双基因缺失疫苗的制备

将获得的猪胸膜肺炎放线杆菌基因缺失突变菌株(实验编号：HB04/apxIIC-/apxIVAN-)进行鉴定，每代接种于改良的TSA培养基上，该培养基以TSA培养基为基本成分，附加按体积比加1％的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和10％的小牛血清，利用胸膜肺炎放线杆菌的apxIC、apxIIC基因进行PCR检测鉴定重组细菌的遗传稳定性，经20次传代后发现仍然不能扩增出大小分别为602bp的apxIVAN和480bp的apxIIC基因，说明我们构建的双基因突变菌株具有遗传性稳定。经Western-blotting检测ApxIIA毒素蛋白可以在突变菌株中能够稳定的表达，并具有良好的生物学活性。该猪胸膜肺炎放线杆菌双基因缺失突变菌株在改良的TSA(按体积比计加1％的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和10％的小牛血清)固体培养基上培养，挑取单菌落于改良的TBS(以TBS培养基为基本培养基，附加按体积比为1％的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和10％的小牛血清)固体培养基上培养，直到活细菌浓度达到2×10⁸CFU/mL，将细菌液与明胶保护剂按体积比为7∶1(该明胶保护剂的配制方法是：每100ml去离子水中加蔗糖40g，明胶8g，充分融化后，置121℃下灭菌30min后保存备用)，于灭菌冻干瓶中按2.0mL/瓶分装，置-50℃冷冻干燥机中冻干，冻干36-40h后压盖，复苏后确定没有杂菌污染，置-20℃保存备用，作为研制双基因缺失疫苗的疫苗菌株。

9、猪传染性胸膜肺炎双基因缺失疫苗的安全性评价

将过夜培养的亲本菌株(HB04)和本发明的双基因缺失突变菌株分别按体积比1∶1000比例接种到20mlTSB培养基，培养至OD600约0.8，连续2倍稀释，每个稀释度腹腔注射(i.p)8只Balb/C小鼠，每只200μl，连续观察5天，记录小鼠死亡情况。

结果见表1：从小鼠存活情况看，本发明的双基因缺失突变菌株毒力有所降低，表明本发明的双基因缺失突变菌株毒力明显降低且对小鼠是安全的。

表2本发明的双基因缺失疫苗菌株与亲本株毒力比较试验

将本发明制备的双基因缺失疫苗按每头猪注射2mL(含2×10⁸CFU活菌数)接种6周龄的仔猪，部分接种仔猪出现轻度的一过性的发热、体温升高反应，两天后恢复正常，在此期间注射本发明制备的基因缺失疫苗的仔猪的精神食欲正常，未见异常变化，可以检测到胸膜肺炎放线杆菌间接血凝菌体抗体和毒素抗体。用亲本菌株(HB04)接种的仔猪(即对照1)，第二天全部呈现发热、体温升高、呼吸困难等反应，持续一周，并有一头死亡，剖检发现具有典型的猪传染性胸膜肺炎病理变化；而对照组2既没有体温升高，也没有异常临床表现。按每头猪注射2mL(含2×10⁸CFU活菌数)接种本发明的双基因缺失疫苗和未接种的妊娠母猪，窝产仔数基本相当，均没有出现死胎、木乃伊胎等，证实本发明制备的基因缺失疫苗对妊娠母猪也是安全的。

10.猪传染性胸膜肺炎双基因缺失疫苗免疫Balb/C小白鼠的保护性试验

将20克左右胸膜肺炎放线杆菌阴性Bab/c小鼠48只，平均分为三个大组(或6个小组)，即本发明制备的双基因缺失疫苗(HB04/apxIIC-/apxIVAN-)、单基因缺失疫苗(HB04/apxIIC-)组、TSB对照组。双、单基因缺失疫苗组以0.2mL(活菌含量1×107CFU)培养液通过腹腔注射Bab/C小鼠；TSB对照组只腹腔注射0.2mL TSB培养基。

免疫后第4周，TSB对照组、单基因缺失疫苗组和双基因缺失疫苗组分别用APP血清7型菌(活菌含量6.0×10⁷CFU)和APP血清1型(活菌含量1.8×10⁶CFU)对免疫小鼠进行攻毒。结果表明：单基因缺失疫苗组和双基因缺失疫苗组免疫的小鼠能对猪胸膜肺炎放线杆菌血清7型提供100％保护。但是，没有获得保护的单基因缺失疫苗免疫小鼠比双基因缺失疫苗免疫小鼠更快死亡，而TSB对照组不能提供任何保护(表2和图1)。结果说明我们研制的双基因缺失疫苗对小鼠能提供有效保护。

表3本发明制备的双基因缺失疫苗对APP攻击Balb/C小白鼠的保护性

11.猪传染性胸膜肺炎双基因缺失疫苗在仔猪体内的免疫效力检测

1)猪的免疫程序：

选择猪传染性胸膜肺炎阴性、40-50日龄的断奶仔猪14头，试验分3组，第一组为双基因缺失疫苗组，编号1～5，第二组为单基因缺失疫苗组，编号6～10，第三组为TSB对照组，编号11～13，14号为空白对照

TSB对照组每头猪注射1mL TSB培养基，单基因缺失疫苗免疫组通过气管注射培养液1mL(活菌含量1.3×10⁹CFU)，而本发明的双基因缺失疫苗免疫组通过气管注射培养液1mL(活菌含量1.3×10⁹CFU)，免疫2次，间隔2周。在一免后2周和二免后2周各采血一次，分别用ELISA方法检测毒素ApxII抗体水平(参照梁望旺等，猪胸膜肺炎放线杆菌毒素II蛋白的表达、纯化及其间接ELISA检测方法的建立与应用，中国兽医学报，25(2)：145-147，2005)和检测毒素ApxIVA、ApxIVAM(缺失突变)抗体水平(参照黄红量等，胸膜肺炎放线杆菌毒素apxIV基因的克隆与表达及间接ELISA方法的建立，生物工程学报，21(2)：294-298，2005)。

表4本发明的猪胸膜肺炎放线杆菌双基因缺失疫苗免疫仔猪试验动物分组设计

2)APP特异性毒素ApxIIA、ApxIVA、ApxIVAM的ELISA抗体水平检测

分别在第一次2周和第二次免疫猪后2周前腔静脉采血，分离血清，采用间接ELISA检测分别检测毒素ApxII抗体水平(参照梁望旺等，猪胸膜肺炎放线杆菌毒素II蛋白的表达、纯化及其间接ELISA检测方法的建立与应用，中国兽医学报，25(2)：145-147，2005)和检测毒素ApxIVA、ApxIVAM(缺失突变)抗体水平(参照黄红量等，胸膜肺炎放线杆菌毒素apxIV基因的克隆与表达及间接ELISA方法的建立，生物工程学报，21(2)：294-298，2005)，结果见表4，TSB对照组小于1∶40，表现为阴性；单基因缺失疫苗组免疫断奶仔猪攻毒前ApxIIA-ELISA抗体水平在1∶1280-1∶2560之间、ApxIVA-ELISA抗体水平在1∶320-1∶1280之间，ApxIVAM-ELISA抗体水平在1∶320-1∶640之间。而本发明的双基因缺失疫苗组免疫断奶仔猪，攻毒前毒素ApxIIA-ELISA抗体水平小于1∶640-1∶1280之间，ApxIVA-ELISA抗体水平在1∶320-1∶640之间，而ApxIVAM-ELISA抗体水平小于1∶20，为阴性。ApxIIA、ApxIVA和ApxIVAM的ELISA抗体水平总体情况见表4所示。结果表明：毒素ApxIVAN缺失后的双基因缺失疫苗免疫的断奶仔猪能产生针对ApxIIA、ApxIVA的ELISA抗体，但不能产生针对ApxIVAM的抗体，因此该疫苗配套ApxIVAM-ELISA鉴别诊断方法可以区分猪胸膜肺炎放线杆菌7型疫苗免疫动物和野毒感染动物。

3)免疫仔猪攻毒保护率试验

二免后2周以TSB对照组(11～13号)、单基因缺失疫苗组(6～10号)、本发明的双基因缺失疫苗组(1~5号)、猪通过气管用2.0mL(活菌含量1.0×10⁷CFU)APP血清1型菌标准菌株(菌株号S4074，由澳大利亚动物保健研究所Dr.Pat Blackall赠送)培养液攻毒。连续观察1周，观察临床症状并最后计算攻毒保护率情况。结果说明以HB04血清7型制备的双基因缺失疫苗免疫断奶仔猪可以完全保护同源血清1型攻击。优于传统的灭活疫苗。攻毒后保护率情况见表5。

表5本发明制备的双基因缺失疫苗免疫仔猪后抗体水平和攻毒保护结果

a食欲情况(36h内)：0，吃食；1，食欲降低；2，有点厌食；3不吃食

b呼吸困难：0，正常；1，轻微；2，中等程度；3，严重

c嗜睡程度：0，正常；1，轻微；2，中等程度；3，严重

d肺病变指数：＜10，基本正常；＞10发病

e胸膜炎百分比：＜25％，正常；25-50％轻微胸膜炎；50-75％，中等程度胸膜炎；＞75％，严重胸膜炎。

Claims (3)

1. 一种区分疫苗免疫和野毒感染动物的猪胸膜肺炎放线杆菌血清7型双基因缺失突变株，其特征在于，该菌株是猪胸膜肺炎放线杆菌Actinobacillus pleuropneumoniaeAPP-7-mut01，其保藏号为CCTCC NO：M207004。

2. 包含权利要求1所述的一种区分疫苗免疫和野毒感染动物的猪胸膜肺炎放线杆菌血清7型双基因缺失突变株的疫苗。

3. 权利要求1所述的一种区分疫苗免疫和野毒感染动物的猪胸膜肺炎放线杆菌血清7型双基因缺失突变株在制备猪传染性胸膜肺炎基因缺失疫苗中的应用。

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