CN102796679A - 血清5型猪胸膜肺炎放线杆菌Apx I C/Apx II C双基因缺失疫苗候选株 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株无药物抗性标记的血清5型猪胸膜肺炎放线杆菌(APP)Apx I C/Apx II C双基因缺失疫苗候选株SW1ΔI C/ΔII C的构建与鉴定，于2011年10月11日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号为：CCTCC NO：M2011343。该基因缺失株是用血清5型APP分离株(SW1)作为亲本株，利用基因工程技术将其溶血外毒素Apx I、Apx II的激活基因C(Apx I C/Apx II C)缺失，缺失的片段大小分别为475bp和451bp。本发明所构建的基因缺失株无药物抗性标记，符合生物安全要求，遗传稳定性好，不会返强，可作为疫苗候选株。

Description

血清5型猪胸膜肺炎放线杆菌Apx I C/Apx II C双基因缺失疫苗候选株

技术领域

本发明涉及一株无药物抗性标记的血清5型猪胸膜肺炎放线杆菌Apx I C/Apx II C双基因缺失疫苗候选株，属于动物细菌基因工程及兽医生物制品领域。 

背景技术

猪传染性胸膜肺炎是由胸膜肺炎放线杆菌(APP)引起的一种猪的高度传染性和致死性呼吸道疾病。广泛存在于全世界所有的养猪国家，尤以欧美各国流行严重，给养猪业造成了巨大的经济损失，严重地阻碍了世界养猪业的健康发展。由于胸膜肺炎放线杆菌血清型众多，且各个国家及地区流行的优势血清型各不相同，给该病的防制带来了极大的困难。目前该病在我国发病率仍逐年增长，有的猪场阳性率已达到70％以上，已经成为集约化猪场的主要传染病之一，严重危害到我国的养猪业。 

胸膜肺炎放线杆菌于1957年由Pattison等首次报道，最早分离于1961年，随后在1963年和1964年相继报道了该病原菌的分离，1990年我国的杨旭夫首次正式确认了国内大型集约化养猪场存在PCP，同时分离出致病菌株并确定了血清型。猪胸膜肺炎放线杆菌属于巴氏杆菌科，放线杆菌属，为革兰氏阴性多形态小球杆菌，兼性厌氧，有荚膜和菌毛，不形成芽抱，能产生4种RTX毒素。新鲜病料中的APP呈两极染色。多数菌株在绵羊鲜血平板上呈β溶血，它在金黄色葡萄球菌划线两侧，产生一种宽的加重溶血区(cAMP)和“卫星”现象。本菌需要的营养条件必须丰富，否则即使加入NAD也生长不出典型菌落，但经多次传代后在LB培养基上也能生长。APP专性寄生于猪的呼吸道，但也有从羔羊体内分离到的报道。 

APP是一种多毒力因子病原，如动物机体的免疫状况、病原的数量、病原的毒力因子及外界环境的影响等，其中病原的毒力因子在疾病的发生、发展过程中 起着举足轻重的作用。多年来，毒力因子与致病力之间的关系亦是国内外学者最为关注的问题，Bosse等(2002)详细地阐述APP感染的病理学及致病机理。APP的毒力因子主要包括溶血外毒素、荚膜多糖、脂多糖、外膜蛋白、转铁结合蛋白、蛋白酶、脲酶等，其中溶血外毒素是引起猪发病最重要的毒力因子。 

溶血外毒素也称为Apx毒素。APP产生的溶血外毒素(Apx)被认为是APP最重要的一个毒力因子。Devenish等(1990)研究发现Apx也是一种重要的免疫原，Apx刺激机体产生的抗体水平和保护力呈正相关。全部15个APP血清型中共分泌4种Apx毒素，分别为Apx I、Apx II、Apx III和Apx IV，四者都属于细胞孔形成毒素。前3种Apx毒素既是APP致病的主要毒力因子，又是APP主要的保护性抗原。Jansen R等(1995)发现不分泌或缺失Apx的APP菌株对小鼠和猪均不致病，缺失株补充了Apx的结构基因和分泌基因后可恢复原来的毒力，而且气管灌注可以直接引起动物的临诊症状和肺部病变。感染耐过猪可以抵抗其他血清型的再次感染，许多能产生毒素的弱毒活苗都具有交叉保护力，均是由于Apx毒素能诱导机体产生抗毒素的抗体。 

Apx I由Apx I操纵子编码，该操纵子包Apx I C、Apx I A、Apx I B、Apx I D 4个基因，A基因编码无活性的前体结构蛋白，C基因编码毒素激活蛋白，负责对毒素进行酰基化激活，B、D基因的翻译后蛋白产物形成跨膜通道，负责毒素由细胞内到细胞外的分泌。Apx I C、Apx I A、Apx I B、Apx I D基因的核甘酸序列在各种血清型中有高度相似性。Apx II由Apx II操纵子所编码，该操纵子仅包括结构基因Apx II A和激活基因Apx I C，而无分泌基因。Apx III由Apx III操纵子所编码，与Apx I一样具有完整的操纵子。Apx III虽然没有溶血活性，但与Apx I和Apx II一样，都具有协同溶血活性。Apx IV毒素Apx IV毒素是近几年在研究猪胸膜肺炎放线杆菌分泌的毒素中发现的，它在整个致病过程中的作用尚不清楚，因为缺少Apx I、Apx II，Apx III但仍能产生Apx IV的菌株不能引起病变或发病。研究表明，所有血清型的APP在体内均可产生Apx IV毒素。 

当前，用于预防猪传染性胸膜肺炎的商品化疫苗主要是传统细菌灭活疫苗和亚单位疫苗。灭活疫苗可以诱导产生免疫反应，但这种免疫反应不能保护动物免受APP的再次攻击和阻止慢性胸膜肺炎的发生。亚单位疫苗虽然具有较好的免疫效果，然而亚单位疫苗仅含单一或几种免疫原，因而免疫保护力也十分有限， 而且需要多次注射。另外，通过物理或化学方法提取、纯化来制备亚单位疫苗成本高，疫苗的价格昂贵，使亚单位疫苗难以在临床上得到广泛应用。猪传染性胸膜肺炎弱毒疫苗是一种新型疫苗，它可以激发良好的体液免疫、细胞免疫和粘膜免疫，具有良好的抗体反应和不同血清型菌感染的交叉保护，而且使用方便、成本低，是当前国内外研究的热点。而通过抗性标记基因插入目的基因后通过同源重组方法来构建弱毒突变株，虽然很容易在抗性选择性培养基筛选到突变株，但是这些突变株由于含有抗性标记，不符合生物安全要求，因此不能用于疫苗生产而只适合基础研究。在过去的几十年里对猪传染性胸膜肺炎的发病机理和与之有关毒力因子的研究越来越深入，但直到现在仍然没有一种安全、可靠并能够提供有效的交叉保护的疫苗。 

发明内容

一株无药物抗性标记的血清5型猪胸膜肺炎放线杆菌Apx I C/Apx II C双基因缺失疫苗候选株SW1ΔI C/ΔIIC，于2011年10月11日保藏在位于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号：CCTCC NO：M2011343，分类命名为：猪胸膜肺炎放线杆菌血清5型SW1ΔI C/ΔII C(Actinobacillus pleuropneumoniae Serotype 5 SW1ΔI C/ΔII C)。 

利用基因工程技术将两个毒素Apx I和Apx II的激活基因C(Apx I C/Apx II C)缺失，缺失的片段大小为475bp和451bp。该基因缺失后毒素Apx的蛋白前体不能被正常激活，无法发挥其毒性作用，其致病性明显降低，但与此同时该毒素蛋白前体仍保持着原有的免疫原性，突变菌株仍然能够表达无毒性的Apx I A和Apx II A蛋白，因此具有很好的免疫保护力。 

细胞毒性和溶血活性试验表明该缺失株的细胞毒性和溶血活性变得不显著，证明其毒力已经降低。 

昆明小鼠毒力试验表明，该基因缺失株对小鼠的半数致死量(LD₅₀)为5×10⁸CFU，而亲本株对小鼠的LD₅₀为5×10⁶CFU，表明该基因缺失株的毒力已显著降低。 

用该基因缺失株制备弱毒疫苗，对昆明小鼠进行免疫效力试验，经2-3次免疫后，用致死剂量的标准菌株(K17)进行攻毒，结果均能产生良好的免疫保护，提示该基因缺失株可以做为APP疫苗候选株。 

本发明所构建的血清5型猪胸膜肺炎放线杆菌双基因缺失疫苗候选株具有以下优点： 

①本发明所用的原始菌株SW1为APP血清5型，毒力较强，目前我国对该血清型的分离报道逐渐增多，表明该血清型已在我国流行并引起养猪业严重经济损失。所以用该菌株构建基因缺失株并以此制成弱毒疫苗对猪展开免疫具有较强的针对性，具有广阔的市场应用前景。 

②Apx I是引起猪发病的主要毒力因子，是APP所有毒力因子中毒性最强的一个，具有很强的细胞毒性和溶血活性，同时Apx II除血清型10外，其余血清型均能分泌此毒素，能够提供很好的交叉保护。本发明所构建的基因缺失株将编码Apx I和Apx II激活蛋白的C基因缺失，导致Apx I和Apx II激活失败，毒力减弱，但该毒素的免疫原性未发生改变，可以诱导机体产生抗感染免疫。 

③该基因缺失株不含抗性标记，符合疫苗的生物安全要求，动物试验表明，利用该基因缺失株制成的疫苗对易感动物安全，而且能诱导很好的免疫保护，表明该基因缺失株具备做为疫苗株的潜力。 

附图说明

图1：正负双向筛选表达盒的构建流程图； 

图2：单基因缺失株SW1ΔI C的构建流程图； 

图3：双基因缺失株SW1ΔI C/ΔII C的构建流程图； 

图4：单基因缺失株正向筛选的第一次突变株的PCR鉴定结果，M为DNA Marker，1为突变株sacB基因PCR扩增结果，2为突变株Kanr基因PCR扩增结果，3为突变株Apx I C基因PCR扩增结果，4为亲本株Apx I C基因PCR扩增结果； 

图5：单基因缺失株负向筛选的第二次突变株的PCR鉴定结果，M为DNA Marker，1为第二次突变株sacB基因PCR扩增结果，2为第二次突变株Kanr基因PCR扩增结果，3为第二次突变株Apx I C基因PCR扩增结果，4为亲本株Apx I C基因PCR扩增结果； 

图6：双基因缺失株正向筛选的第一次突变株的PCR鉴定结果，M为DNA Marker，1为突变株sacB基因PCR扩增结果，2为突变株Kanr基因PCR扩增 结果，3为突变株Apx II C基因PCR扩增结果，4为亲本株Apx II C基因PCR扩增结果； 

图7：双基因缺失株负向筛选的第二次突变株的PCR鉴定结果，M为DNA Marker，1为第二次突变株sacB基因PCR扩增结果，2为第二次突变株Kanr基因PCR扩增结果，3为第二次突变株Apx II C基因PCR扩增结果，4为亲本株Apx II C基因PCR扩增结果； 

图8：双基因缺失株SW1ΔI C/ΔII C和亲本株SW1生长曲线图； 

图9：双基因缺失株的遗传稳定性鉴定(1-10代)，M为DNA Marker，1-10为所传10代细菌的PCR鉴定结果； 

图10：仓鼠肾传代细胞-双基因突变株上清接毒后显微镜观察结果； 

图11：仓鼠肾传代细胞-亲本株上清接毒后显微镜观察结果； 

具体实施方式

以下结合说明书附图，对本发明进行详细说明。 

实施例1.双基因缺失株SW1ΔI C/ΔII C的构建(图3) 

SW1株、大肠杆菌DH5α、BL21、枯草芽孢杆菌PKC01株、传染性胸膜肺炎放线杆菌血清5型菌K17株购自中国兽医药品监察所。 

大肠杆菌在LB液体或固体培养基中培养，根据不同的需要别入终浓度为100μg/ml的氨苄青霉素(Amp)或卡那霉素(Kan)；传染性胸膜肺炎放线杆在TSB液体培养基或TSA固体培养基中培养，并加入终浓度为10μg/ml的NAD。 

pBluescrIpt II SK+、pVAX1、PCR产物克隆载体pMD19-TSimple购自宝生物工程(大连)有限公司。 

质粒小量抽提试剂盒、DNA胶回收试剂盒购自OMEGA公司。Taq DNA聚合酶、DNA Marker购自天根生化科技(北京)有限公司。各种限制性内切酶、DNA Ligation KIt Ver.2.0、IPTG、Xgl购自宝生物工程(大连)有限公司。烟酰胺腺嘌吟二核苷酸(NAD)购自上海生工。氨苄青霉素(Amp)、卡那霉素(Kan)购自AMRESCO公司。 

1、正负筛选表达盒的构建(图1) 

正负筛选表达盒包括：启动子、果聚糖蔗糖酶基因(sacB)和卡那霉素抗性基因(Kan^r)，其中启动子的作用主要是转录后面的两个基因，卡那霉素抗性基因(Kan^r)用于第一次基因重组的正向筛选，在细菌内表达后具有卡那抗性；果聚糖蔗糖酶基因(sacB)用于第二次的负向筛选，sacB在APP中表达后细菌对蔗糖敏感，在含有10％蔗糖的平板上细菌生长受到抑制。 

(1)APP血清5型外膜蛋白启动子序列(OmlaP)的扩增、TA克隆及鉴定 

根据已发表的APP-5株序列(Genbank，NC_009053)利用Premier 5设计引物Po-1和Po-2，以APP血清5型基因组DNA为模板，PCR扩增Omla基团上游的266bp启动子序列。其中上游引物Po-1含有Xho I位点，下游引物Po-2含有Bgl II和EcoR I位点，该引物由上海英潍捷基生物技术有限公司合成，引物序列如下： 

Po-1：5'-AAACTCGAGACTTTCAGTGCGTGCCTAT-3’    (Xho I) 

Po-2：5’-GAATTCAGATCTCCTTATACTTAAAATACAATAAAT-3’    (EcoR I and Bgl II) 

扩增条件为：95℃预变性5min；94℃30sec，55℃30sec，72℃20sec，35个循环；72℃10min，4℃保存。经琼脂糖凝胶电泳得到的片段大小约为266bp。将纯化的PCR扩增产物克隆到pMD19-T Simple载体上，获得重组质粒pMD19-OmlaP。 

(2)果聚糖蔗糖酶基因(sacB)的扩增、TA克隆及鉴定 

根据已发表序列(Genbank，NC_000964)利用Premier 5设计引物Ps-1和Ps-2，其中上游引物Ps-1含有APP的核糖体结合位点和Bgl II位点，下游引物Ps-2含有BamH I位点，以枯草芽孢杆菌基因组DNA为模板，PCR扩增sacB基团。该引物由上海英潍捷基生物技术有限公司合成，引物序列如下： 

Ps-1：5’-AGATCTTTAAGGAGACAACATGAACATCAAAAAGTTTGCA-3’(Bgl II) 

Ps-2：5’-CCGGATCCTTATTTGTTAACTGTTAATTGTCCT-3’(BamH I) 

扩增条件为：95℃预变性5min；94℃30sec，52℃30sec，72℃1.5min，31个循环；72℃10min，4℃保存。经琼脂糖凝胶电泳得到的片段大小约为1422bp。 将纯化的PCR扩增产物克隆到pMD19-T Simple载体上，获得重组质粒pMD19-sacB。 

(3)卡那霉素抗性基因(Kan^r)的扩增、TA克隆及鉴定 

根据已发表序列(Genbank，U55763.1)利用Premier 5设计引物Pk-1和Pk-2，其中上游引物Pk-1含有APP的核糖体结合位点和BamH I位点，下游引物Pk-2含有Kpn I位点，该引物由上海英潍捷基生物技术有限公司合成，引物序列如下： 

Pk-1：5’-GGATCCTAAGGAGACAACATGATTGAACAAGATGGATTG-3’(BamH I) 

Pk-2：5’-GGTACCTTAGAAGAACTCGTCAAGAAG-3’(Kpn I) 

以质粒pEGFP-N1DNA为模板，PCR扩增Kan^r基因，扩增条件为：95℃预变性5min；94℃30sec，52℃30sec，72℃40sec，32个循环；72℃10min，4℃保存。经琼脂糖凝胶电泳得到的片段大小约为795bp。将纯化的PCR扩增产物克隆到pMD19-T Simple载体上，获得重组质粒pMD19-Kan^r。 

(4)正负筛选表达盒(OSK)在pBluescriptII SK⁺载体中的构建 

①pVAX-OmlaP的构建：pVAX1经Xho I和EcoR I双酶切后回收大片段，pMD19-OmlAP经Xho I和EcoR I双酶切后回收小片段，回收的两个片段进行定向连接。将PCR和酶切鉴定都正确的质粒命名为pVAX-OmlaP。 

②pVAX-OK的构建：pVAX-OmlaP经BamH I和Kpn I双酶切后回收大片段，pMD19-Kan^r经BamH I和Kpn I双酶切后回收小片段，回收的两个片段进行定向连接。将PCR和酶切鉴定均正确的质粒命名为pVAX-OK。 

③pBS-OK的构建：pBluescriptII SK⁺经Xho I和Kpn I酶切后回收大片段，pVAX-OK经Xho I和Kpn I酶切后回收小片段，回收的两个片段进行定向连接。将PCR鉴定和酶切鉴定都正确的重组质粒命名为pBS-OK。 

④pBS-OKX的构建：pBS-OK经HindIII和Spe I双酶切后回收大片段，PVAX1经Hind III和Spe I双酶切后回收大小为662bp的小片段，回收的两个片段进行定向连接，用HindIII和Spe I进行酶切鉴定。将酶切鉴定正确的质粒命名为pBS-OKX，连入此片段的目的是利用PVAX 1上的小段消除pBS-OK载体多克隆位点上HindIII到Spe I之间的BamH I位点，以方便sacB连接到载体上，该片段将在后面连入右同源臂时被替换出去。 

⑤pBS-OSK的构建：pBS-OKX经Bgl II和BamH I双酶切后回收大片段，由于Bgl II和BamH I是同尾酶，连时会发生自载体身连接，载体酶后用去磷酸酶Alkaline Phosphatase(CIAP)处理，同时pMD19-sacB经Bgl II和BamH I双酶切后回收小片段。回收的两个片段连接后转化到大肠杆菌DH 5α中，以重组质粒为模板，以Ps-1、Ps-2为引物进行PCR鉴定。用Bgl II和BamH I消化重组质粒进行酶切鉴定。将PCR鉴定和酶切鉴定正确的命名为pBS-OSK，载体上的OmlaP、sacB、Kan^r三个片段结合在一起形成正负筛选表达盒。 

2、APP Apx I C基因缺失突变株的构建(图2) 

(1)左同源臂(L)的扩增及TA克隆 

根据已发表序列(Genbank，NC_009053)利用Premier 5设计引物Pl-1和Pl-2，其中上游引物Pl-1含有Sac I位点，下游引物Pl-2含有Spe I位点，该引物由上海英潍捷基生物技术有限公司合成，引物序列如下： 

Pl-1：5’-GTCAGAGCTCCCGAATAACATCGCATAGT-3’(Sac I) 

Pl-2：5’-CCCACTAGTCTCTCCTAAAACCTCAAATCCA-3’(Spe I) 

以APP血清5型株基因组DNA为模板，PCR扩增的Apx I C基团上游的2895bp序列。扩增条件为：95℃预变性5min；94℃45sec，55℃30see，72℃3min，28个循环；72℃10min，4℃保存。将PCR扩增结束后的产物进行琼脂糖凝胶电泳并用胶回收试剂盒回收目的片段。将纯化的PCR扩增产物克隆到pMD19-T Simple载体上，获得重组质粒pMD19-L，对重组质粒进行PCR鉴定和酶切鉴定。对经PCR鉴定和单双酶切鉴定正确的重组质粒pMD19-L进行测序分析。将测序结果与APP-5b L-20株相应序列进行比对，同源性最达到99.36％。 

(2)右同源臂(R)的扩增及TA克隆 

根据已发表序列(Genbank，NC_009053)利用Premier 5设计引物Pr-1和Pr-2，其中上游引物Pr-1含有Spe I位点，下游引物Pr-2含有Sal I位点，上述引物由上海英潍捷基生物技术有限公司合成，引物序列如下： 

Pr-1：5’-GAGACTAGTTAAGGAGACAACATGGCTAAC-3’(Spe I) 

Pr-2：5’-CAAGTCGACGACACGCTCTACCGAATACTC-3’(Sal I) 

以APP血清5型株基因组DNA为模板，PCR扩增的Apx I A基团上游的1434bp序列。扩增条件为：95℃预变性5min；94℃30sec，55℃30sec，72 ℃1.5min，31个循环；72℃10min，4℃保存。将PCR扩增结束后的产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收目的片段克隆到pMD19-T Simple载体上，获得重组质粒pMD19-R。对重组质粒进行PCR鉴定和酶切鉴定。对经PCR和单双酶切鉴定正确的重组质粒pMD19-R进行测序分析。将测序结果与APP-5b L-20株相应序列进行比对，同源性最达到99.93％。 

(3)左右同源臂连接到pBS-OSK载体中，构建最终载体pBOSKΔI C 

①pBOSKR的构建：pBS-OSK经Spe I和Sal I双酶切后回收大片段，pMD19-R经Spe I和Sal I双酶切后回收小片段，回收的两个片段进行定向连接。将PCR鉴定和酶切鉴定都正确的质粒命名为pBOSKR。 

②载体pBOSKR中氨苄抗性基因的消除：载体pBluescriptII SK⁺只具有氨苄抗性，在插入正负筛选表达盒(OSK)后，经卡那霉素抗性试验证明载体pBOSKR也具有了卡那霉素抗性，氨苄抗性基因在载体上已经没有什么作用，它的存在增加了载体大小，不利于在载体中连接入更多片段，并且Hasty等发现载体上的非同源序列对重组效率可能产生影响，所以应当尽量减少载体上的无关序列。用DNAMAN分析发现载体上卡那霉素抗性基因的两端各有一个Pvu I酶切位点，用Pvu I酶切可以将载体切成两段，大小分别约为5869bp和1045bp回收大片段，经连接后转化到大肠杆菌DH5α中，挑选在含有卡那霉素的LB平板生长，不能在含有氨苄的LB平板生长的菌落在含有卡那霉素的LB液体培养后提取质粒，用Pvu I酶切鉴定。将酶切鉴定都正确的质粒命名为pBOSKR(A^-)。 

③pBOSKΔI C的构建：pBOSKR(A-)经Sac I和Spe I双酶切后回收大片段，pMD19-L先用Pvu I酶切后回收大片段后再用Sac I和Spe I双酶切后回收2895bp的片段，将回收的两个片段进行定向连接，进行PCR鉴定和酶切鉴定并将PCR鉴定和酶切切鉴定都正确的质粒命名为pBOSKΔI C。 

(3)重组转移载体pBOSKΔI C的测序鉴定 

对所构建载体pBOSKΔI C上的多克隆位点之间的插入序列进行测序，以鉴定所插入片段的碱基序列是否正确。测序结果表明：插入的5个DNA片段的连接顺序、方向和酶切位点与之前设计的一致，碱基没有发生突变。 

(4)重组转移载体pBOSKΔI C的正负筛选活性鉴定 

①卡那霉素抗性实验 

分别将含有质粒pBS-OK、pBOSKΔI C和pBluescript II SK⁺的大肠杆菌划线接种到含有卡那霉素的LB平板上，观察在平板上的生长情况来验证质粒中的Kan^r基因是否在载体中表达。结果含有质粒pBOSKΔI C的大肠杆菌在平板上能够生长，含有有质粒pBluescript II SK⁺的大肠杆菌在平板上不能够生长，说明质粒中的Kan^r基因能够在载体中表达。 

②蔗糖敏感性实验 

再将含有质粒pBS-OK、pBS-OSK和pBOSKΔI C的大肠杆菌划线接种到含有卡那霉素的LB⁺10％S固体培养基上，如果质粒中的sacB表达了果聚糖蔗糖酶，则使大肠杆菌对蔗糖敏感，在含有10％蔗糖的LB上生长受到抑制。结果如下：含有质粒pBS-OSK和pBOSKΔI C的大肠杆菌在平板上不能够生长，含有有质粒pBS-OK的大肠杆菌在平板上能够生长，说明质粒pBS-OK在连入sacB基因后，表达了果聚糖蔗糖酶，使大肠杆菌对蔗糖敏感，在含有10％蔗糖的LB上生长受到抑制。 

(5)单基因缺失株SW1ΔI C的正向筛选 

将重组转移载体pBOSKΔI C电转化到亲本株，在含有Kan的TSA平板上筛选Kan抗性菌落，将Kan抗性菌落转印到含10％蔗糖的TSA平板上，通过与亲本菌SW1在平板上的生长情况对比，证实蔗糖对正向筛选到的菌落生长有明显抑制作用。 

在第一次突变后，重组转移载体通过同源重组，整合到了APP的基因组内，Apx I C两侧的序列有两个拷贝，一个是载体上缺失了Apx I C部分基因片段的，另一个是APP自身的，因此用Apx I C两侧的引物可以扩增两个条带，一个是含有完整Apx I C的878bp的和一个缺失Apx I C的403bp的条带，从筛选到的第一次突变株PCR分别扩增到了1422的sacB、795bp的Kan^r、878bp的Apx I C及两侧序列，缺失了Apx I C的扩增结果只包括其两侧403bp的序列，PCR鉴定结果正确(图4)。PCR鉴定引物如下： 

Pc-1：5`-CAAGTCAGAC AAACGGAAT-3` 

Pc-2：5`-TCGTTCCGAG AAACCTAATA-3`； 

扩增条件为：95℃预变性5min；94℃30sec，55℃30sec，72℃1min，31个循环；72℃10min，4℃保存。 

(6)单基因缺失株SW1ΔI C的负向筛选 

筛选出一个上一步鉴定正确的具有Kan抗性、蔗糖敏感的菌落，在没有Kan抗性的TSB培养基中培养过夜，促进第二次同源重组。培养至适当浓度时，将培养液涂布到含有10％蔗糖的TSA平板上，筛选蔗糖抗性菌落。再将具有蔗糖抗性的菌落转印到含有Kan的TSA的平板，鉴定对Kan的敏感性。筛选对Kan敏感、蔗糖抗性的菌落做PCR鉴定。 

结果不能从基因缺失株中扩增出Kan^r基因、sacB基因和Apx I C基因，能够扩增到一个大小为403bp缺失了Apx I C基因的的条带，表明在第二次突变时Apx I C基因已经从细菌基因组中敲除，PCR鉴定正确(图5)。 

3、双基因缺失株SW1ΔI C/ΔII C的构建 

(1)左同源臂(L)的扩增及TA克隆 

根据已发表序列(Genbank，NC_009053)利用Premier 5设计引物PL-1和PL-2，其中上游引物PR-1含有SalI位点，下游引物PR-2含有SacI和Aor13HI位点， 

该引物由上海英潍捷基生物技术有限公司合成，引物序列如下： 

PL-1：5`GAGCTC CTCAAGTGCCGCATCGGTAT-3`(SalI) 

PL-2：5`GTCGAC ACA TCCGGA TAGCATCATCCCTCCCATTCC-3`(SacI和Aor13HI)； 

以APP血清5型株基因组DNA为模板，PCR扩增的Apx II C基团上游的2654bp序列。扩增条件为：95℃预变性5min；94℃40sec，55℃30sec，72℃3min，30个循环；72℃10min，4℃保存。将PCR扩增结束后的产物进行琼脂糖凝胶电泳并用胶回收试剂盒回收目的片段。将纯化的PCR扩增产物克隆到pMD19-T Simple载体上，获得重组质粒pMD19-ΔII CL，对重组质粒进行PCR鉴定和酶切鉴定。对经PCR鉴定和单双酶切鉴定正确的重组质粒pMD19-ΔII C L进行测序分析。将测序结果与APP-5b L-20株相应序列进行比对，同源性最达到99.42％。 

(2)右同源臂(R)的扩增及TA克隆 

根据已发表序列(Genbank，NC_009053)利用Premier 5设计引物PR-1和PR-2，其中上游引物PR-1含有Aor13HI位点，下游引物PR-2含有SacI位点，上述引物由上海英潍捷基生物技术有限公司合成，引物序列如下： 

PR-1：5`-TCCGGA GAGCAAGAGTTAATAACAGCTCTAC-3`(Aor13HI) 

PR-2：5`-GTCGAC TGTCTCGGCTGTAGCATCA-3`(SacI) 

以APP血清5型株基因组DNA为模板，PCR扩增的Apx I A基团下游的2039bp序列。扩增条件为：95℃预变性5min；94℃30sec，55℃30sec，72℃2min，30个循环；72℃10min，4℃保存。将PCR扩增结束后的产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收目的片段克隆到pMD19-T Simple载体上，获得重组质粒pMD19-ΔII CR。对重组质粒进行PCR鉴定和酶切鉴定。对经PCR和单双酶切鉴定正确的重组质粒pMD19-ΔII CR进行测序分析。将测序结果与APP-5b L-20株相应序列进行比对，同源性最达到99.73％。 

(3)重组转移载体pBOSKΔIIC的构建 

①pBOSKΔIICL的构建：pBOSKΔI C经SacI和Sal I双酶切后回收大片段，pMD19-ΔII C L经SacI和Sal I双酶切后回收小片段，回收的两个片段进行定向连接。将PCR鉴定和酶切鉴定都正确的质粒命名为pBOSKΔII CL。 

②pBOSKΔII C的构建：pBOSKΔII CL经Sac I和Aor13HI双酶切后回收大片段，pMD19-ΔII CR经SacI和Aor13HI双酶切后回收小片段，将回收的两个片段进行定向连接，进行PCR鉴定和酶切鉴定并将PCR鉴定和酶切切鉴定都正确的质粒命名为pBOSKΔII C。 

(2)双基因缺失株SW1ΔI C/ΔII C的构建 

以电转化方法将重组转移质粒pBOSKΔII C转化到SW1ΔI C，在TSB中培养3-4h后将细菌均匀涂布在含卡那霉素TSA平板培养18-24h，从平板上筛选具有卡那霉素抗性的菌落，再将具有卡那霉素抗性菌落接种到5％-10％蔗糖的TSA平板鉴定对蔗糖的敏感性，在证实菌落Kan抗性、蔗糖敏感的菌做PCR鉴定(图6)。随机挑选一株鉴定正确的菌落接种于无卡那霉素的TSB培养基培养过夜，以促进第二次同源重组，把培养物稀释后涂布含5％-10％蔗糖不含卡那霉素的TSA琼脂平板，将筛选的蔗糖抗性菌落转印到5％-10％Sucrose-Kan平板，筛选对卡那霉素敏感、蔗糖抗性的菌落做PCR鉴定，能够扩增到一个大小为445bp缺失了Apx II C基因的的条带，鉴定引物如下： 

PC-1：5`-AGATAAAACTGATTGGCATGACA-3` 

PC-2：5`-CGTATGGAAAACGTTGTCTCA-3`； 

扩增条件为：95℃预变性5min；94℃30sec，55℃30sec，72℃1min，30个循环；72℃10min，4℃保存。 

鉴定表明在第二次突变时Apx II C基因已经从细菌基因组中敲除，将最终筛选到的AxpIC/II C双基因缺失突变株，命名为SW1ΔI C/ΔII C(图7)。 

结合之前鉴定最终表明，筛选得到的双基因缺失突变株(SW1ΔI C/ΔII C)成功缺失了APP SW1株两个主要的毒素基因激活基因Apx I C和Apx II C，大小分别为475bp和451bp。 

实施例2.双基因缺失株SW1ΔI C/ΔII C的生物学特性研究 

(1)生长特性试验 

分别将双基因缺失株(SW1ΔI C/ΔII C)和亲本株(SW1)的单菌落接种于TSB液体培养基中培养过夜，然后取50μL上述菌液接种50mL TSB液体培养基培养，待OD₆₀₀值都为0.13时开始测定，每隔1h取样，以核酸蛋白仪读取其OD₆₀₀值，通过每一时间点OD₆₀₀值大小比较它们的生长速度。根据OD₆₀₀值绘制亲本株和基因缺失株的生长曲线，对比两者的生长特性。 

双基因缺失株和亲本株的生长曲线如图8所示。从生长曲线可以看出基因缺失株和亲本株的生长基本保持一致，这表明Apx I C/Apx II C基因的缺失没有影响到该菌株的生长速度。 

(2)遗传稳定性试验 

将双基因缺失株涂布于含卡那霉素的TSA平板上37℃培养，挑取单菌落传代并保种，连续传10代。将每代的菌种接种TSB液体培养基观察细菌是否生长，同时对每代菌种的菌液进行基因组抽提，以Pj-1、Pj-2做为引物进行PCR鉴定，扩增条件为：95℃预变性5min；94℃30sec，55℃30sec，72℃1min，30个循环；72℃10min，4℃保存。将PCR扩增结束后的产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图9所示，每代PCR扩增的条带没有发生变化，这表明Apx I C/Apx II C基因缺失位点的DNA能够维持稳定状态。 

(3)溶血活性试验 

挑取双基因缺失株、单基因缺失株和亲本株接种于兔血TSA琼脂平皿，37℃培养过夜，观察它们的溶血情况。亲本株可分泌溶血素，菌落周围可产生透明 溶血环，作为阳性对照。结果显示，双基因缺失株菌落周围没有出现溶血环，单基因缺失株菌落周围也没有出现溶血环，亲本株菌落周围出现了2～3mm的透明溶血环，结果表明了激活了的Apx I A在APP5亲本株的溶血上起了主要作用，而本研究构建的双基因缺失株由于Apx I C和Apx II C的缺失导致Apx I A和Apx II C激活失败，因而丧失了溶血活性。 

(4)细胞毒性试验 

分别挑取亲本株和双基因缺失株单菌落接种TSB液体培养基，200r/min振荡培养至对数生长中晚期。取菌液12000r/min离心1min，取上清用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌。培养仓鼠肾传代细胞(BHK21)3瓶，待细胞长满，分别接种亲本株上清、基因缺失株上清和TSB液体培养基各3mL，接毒后48h在倒置显微镜下观察细胞形态。接基因缺失株菌液上清的两瓶和接TSB液体培养基的两瓶细胞彼此无显著差异，细胞形态正常，无明显细胞病变(图10)；接亲本株菌液上清的两瓶细胞病变明显，可见多处因细胞死亡脱落形成的空斑(图11)。结果表明基因缺失株上清对细胞毒性减弱，达到了预期目的。 

实施例3.双基因缺失株(SW1ΔI C/ΔII C)弱毒疫苗的制备 

将该基因缺失株接种至含5mL TSB培养液的试管中复苏6-8h后，划线接种到TSA平板上37℃恒温培养过夜，至第二天挑取生长良好的单菌落接种到100mL TSB培养基上扩大培养，当菌液的OD₆₀₀达到2.0左右时，活菌数约6×10⁹CFU/mL，此时在超净工作台中将菌液和20％脱脂乳(已灭菌)按1∶1的比例混合均匀，以2mL/瓶进行分装，用灭菌脱脂棉封口，置于-20℃冰箱中冻存24h后，在-50℃冷冻干燥机中进行冷冻真空干燥，然后取出、压盖，-20℃保存。同时做疫苗成品检验，检验内容包括物理性状检验、纯粹性检验，该批疫苗为海绵状疏松团块，色白略呈微黄，易于瓶壁脱离，加稀释液后能迅速溶解，将其无菌稀释后划线接种于TSA平板，37℃培养24h，未出现杂菌污染，实验结果符合要求，可作为研制基因缺失疫苗的候选菌株。 

实施例4.双基因缺失株弱毒疫苗对昆明小鼠的毒力实验 

将基因缺失株(SW1ΔI C/ΔII C)与亲本株(SW1)冻干菌接种到TSB培 养液中37℃培养12h，第二天以1∶100的比例接种于新制的TSB培养基中。37℃300rpm振荡培养3h后，用TSB洗涤菌体3次，恢复原体积，进行活菌计数，用TSB将菌液依次进行10倍系列稀释，每个稀释度作为一个实验组，腹腔注射到6只6周龄昆明小鼠，每只0.2mL。观察1周，记录小鼠死亡情况。结果如下所示，根据寇氏(Korbor)法计算LD₅₀。得出缺失株的LD₅₀为5×10⁸CFU，亲本株LD₅₀为5×10⁶CFU。结果表明本研究所构建的基因缺失株比亲本菌的毒力有明显降低。 

表1.双基因缺失株弱毒疫苗毒力实验结果 

实施例5.双基因缺失株疫苗对昆明小鼠的免疫效力试验 

(1)小鼠的免疫程序 

选择体重为20g左右的昆明小鼠48只，按实验要求分为6组，每组8只。1-3组小鼠腹腔注射200μL本研究制备的弱毒疫苗(含活菌数约为2×10⁷CFU)，4-6组小鼠腹腔注射200μL灭菌TSB培养液。分别于两周及四周后对1-3组小鼠以同样的剂量加强免疫，同时对4-6组小鼠也腹腔注射200μL灭菌TSB培养液。并分别于免疫前0天、首免后二周、二免后二周及三免后二周检测小鼠血清中Apx I/Apx II-ELISA的抗体水平。 

(2)免疫小鼠的Apx I和Apx II毒素抗体水平检测 

分别于免疫前0天、首免后二周(第14天)、二免后二周(第28天)及三免后二周(第42天)对小鼠尾静脉负压采血，分离血清，采用间接ELISA方法检测血清中Apx I和Apx II毒素的抗体水平。检测结果如下表，从表中可得，本发明制备的双基因缺失菌株能够有效的诱导小鼠产生Apx I和Apx II毒素的抗 体，而同步进行的TSB对照组的抗体水平均为阴性，而且在二免和三免后，毒素抗体水平均有一定程度的提升。 

表2.Apx I和Apx II毒素的ELISA检测结果 

(3)免疫小鼠的攻毒保护率实验 

根据前面小鼠毒力实验中所测得的亲本株的LD₅₀，以此作为参照确定第1、4组小鼠的攻毒剂量为10倍LD₅₀，攻毒剂量为200μL，接种途径为腹腔注射。为了确定该基因缺失疫苗对异源血清型是否也具有交叉免疫保护率，特选用毒力较强的APP血清1型和血清7型作为攻毒菌株。因此用APP血清1型作为第2、5组小鼠的攻毒菌株，APP血清7型作为第3、6组小鼠的攻毒菌株，攻毒剂量和接种途径同第1、4组小鼠(见表3)。结果表明，APP血清7型和1型攻击的TSB对照组在24小时之内小鼠全部死亡，本发明制备的双基因缺失疫苗株(SW1ΔI C/ΔII C)在小剂量的亲本株APP血清5型以及APP血清7型和1型菌攻毒的情况下，能够达到100％的保护，在大剂量的亲本株APP血清5型以及APP血清7型和1型菌攻毒的情况下，仍然能够提供有效的保护力，同时可以发现本发明制备的双基因缺失疫苗株(SW1ΔI C/ΔII C)不仅能够有效的保护亲本株APP血清5型菌攻击，同时也能够有效的保护异源血清型的攻击。 

表3.免疫小鼠的攻毒保护率实验结果 

Claims (3)

1.一株无药物抗性标记的血清5型猪胸膜肺炎放线杆菌Apx I C/Apx II C双基因缺失疫苗候选株，其保藏号为：CCTCC NO：M 2011343。

2.根据权利要求1所述的基因缺失株，其特征在于，该菌株缺失了APP SW1株两个主要的毒素基因激活基因Apx I C和Apx II C，其大小分别为475bp和451bp，其仍具有毒素Apx I A和Apx II A基因，使其丧失该毒素活性同时仍存有其毒素免疫原性。

3.根据权利要求1或2所述双基因缺失疫苗候选株鉴定方法，其特征在于，所用引物能够扩增出缺失了大小分别为475bp和451bp的Apx I C和Apx II C基因的目的条带。

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