CN113416666A - 猪胸膜肺炎放线杆菌血清10型突变菌株、ApxIA蛋白及应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于动物细菌基因工程技术领域。具体涉及猪胸膜肺炎放线杆菌血清10型突变菌株、ApxIA蛋白及应用。本发明获得的突变株为一种不含有抗性标记的猪胸膜肺炎放线杆菌血清10型突变菌株猪胸膜肺炎放线杆菌mApxIA‑2KA‑APP10；保藏编号为：CCTCC NO：M 2021378。该菌株含有apxIA基因点突变基因，突变菌株表达的外毒素ApxIA第560位和第686位的两个赖氨酸突变为丙氨酸残基，导致ApxIA溶血活性丧失毒力下降，但仍具有免疫原性。本发明中突变株表达的无溶血活性外毒素ApxIA可在猪传染性胸膜肺炎亚单位疫苗中应用。

Description

猪胸膜肺炎放线杆菌血清10型突变菌株、ApxIA蛋白及应用

技术领域

本发明属于动物细菌基因工程技术领域。具体涉及一种猪胸膜肺炎放线杆菌血清10型突变菌株、ApxIA蛋白及在猪传染性胸膜肺炎亚单位疫苗中的应用。

背景技术

猪传染性胸膜肺炎(porcine contagious pleuropneumonia，PCP)是由猪胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)感染引起的高度致死性猪呼吸道传染病，是危害世界养猪业最严重的细菌性传染病之一。主要表现为出血性、纤维素性、坏死性胸膜炎和肺炎，发病率和死亡率均很高。常引起大量种猪和育肥猪发病死亡，因而经济损失巨大。

1999年申请人首先在浙江杭州地区确诊了该病的爆发流行，导致了数万头种猪和肥猪的 发病死亡。随着诊断技术、药物和疫苗的防控技术的开发与应用，该病在本世纪的头十年得 到了较好控制。但近年来，该病在我国不同地区“卷头重来”，呈地方性流行，严重危及到 我国养猪业。

猪胸膜肺炎放线杆菌，属于巴氏杆菌科，放线杆菌属，是一种革兰氏阴性小球杆菌细菌，依据生长对烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(Nicotinamide Adenine Dincleotide,NAD)的需求可分为依赖NAD生长的生物I型和不依赖NAD生长的生物II型菌株，同时根据表面多糖抗原和包膜位点的差异分为18种血清型(Bossé,J.T.,Li,Y.,

R.,Gottschalk,M.,Angen,

Nedbalcova,K.,Rycroft,A.N.,Fodor,L.,Langford,P.R.,2018.BRaDP1Tconsortium, Comparative sequence analysis of the capsular polysaccharide lociof Actinobacillus pleuropneumoniae serovars 1-18,and development of twomultiplex PCRs for comprehensive capsule typing.Vet.Microbiol.220(2018),83–89.)。不同国家和地区、不同年代流行的主要血清型不同,在我国，十年前流行的血清型主要是血清1、2、3和7 型，近年来的持续监测发现，我国流行的优势血清型变为1、5、7型。APP血清型众多，不同血清型菌株的毒力和免疫原性不同，大多数血清型的菌株之间缺乏有效的交叉免疫保护，而不同地区和猪场流行的优势血清型又不尽相同，因此，具有良好交叉免疫保护率的该病疫苗开发比较困难。

目前对于猪传染性胸膜肺炎的防控主要依靠抗生素的使用和疫苗接种。现在由于耐药性的产生，导致药物治疗和预防的效果急剧下降；国际上能够商业化和临床应用的APP疫苗只有多价灭活菌苗和亚单位疫苗，但这两类疫苗均有其局限性(Ramjeet,Mahendrasingh； Deslandes,Vincent；Goure,Julien；Jacques,Mario.,2008.Actinobacillus pleuropneumoniae vaccines:from bacterins to new insightsinto vaccination strategies.Animal Health Research Review.Microbiol.9(1),25–45.)。多价灭活疫苗因包含有限种类血清型的APP而导致交叉免疫保护率低，同时发现猪免疫接种后出现发热、厌食、局部肿胀、疫苗难以吸收等副反应。亚单位疫苗虽然副反应小，但抗原含量低且种类有限，免疫保护率有限(Loera-Muro A,Angulo C.,2018.New trends ininnovative vaccine development against Actinobacillus pleuropneumoniae.VetMicrobiol. 217:66-75.)。

与APP致病性相关的毒力因子包括：荚膜多糖(CP)、脂多糖(LPS)、外膜蛋白(OMP)、转铁结合蛋白(TBP)、外毒素(Apx)、蛋白酶、渗透因子、菌毛和尿素酶等(Sassu EL,Boss éJT,Tobias TJ,Gottschalk M,Langford PR,Hennig-Pauka I.,2018.Update onActinobacillus pleuropneumoniae-knowledge,gaps and challenges.TransboundEmerg Dis.2018May；65Suppl 1:72-90)。其中RTX外毒素是APP最重要的毒力因子和抗原蛋白，属于穿孔RTX外毒素家族，包括ApxI、ApxII、ApxIII和ApxIV，其中ApxI是有强毒株(血清1、 5、9、10和11)分泌的，具有很强的溶血和细胞毒活性，Apx毒素一般由apxCABD操纵子编码， A基因编码毒素结构蛋白；C基因编码一种蛋白质脂酰基转移酶负责对毒素蛋白进行酰基化激活；B和D基因编码一种转运子，负责毒素蛋白的分泌(BosséJT,Janson H,SheehanBJ, Beddek AJ,Rycroft AN,Kroll JS,Langford PR.,2002.Actinobacilluspleuropneumoniae: pathobiology and pathogenesis of infection.MicrobesInfect.4(2):225-35.)。结构上主要有N端疏水结构域、甘氨酸赖氨酸酯酰化位点(GK位点)、富含甘氨酸、Ca2+结合和串联在毒素C端第三个非肽重复序列的特征相似。已报道的大肠杆菌溶血素HlyA和ApxIA同源性达75％，pro-HlyA由酰基转移酶HlyC和酰基载体蛋白(ACP)共同酯酰化激活，并且通过质谱和同位素自显影方法鉴定了HlyA内部第564位和第690位的赖氨酸残基发生棕榈酰化，也证实这两个位点的酯酰化是HlyA毒素活性的必需条件(Stanley P,Packman LC,Koronakis V, Hughes C.,1994.Fatty acylation of twointernal lysine residues required for the toxic activity of Escherichia colihemolysin.Science.266(5193):1992-6)。经溶血素HlyA 和ApxIA序列比对预测ApxIA毒素内部第560位和第686位的赖氨酸残基疑似为酯酰化位点即溶血活性位点，预测该位点突变后不能激活ApxIA即不具有溶血活性。另一方面，N端结构域是外毒素ApxI的主要抗原片段，并产生中和保护抗体(Seah JN,Frey J,Kwang J.,2002.The N-terminal domain of RTXtoxin ApxI of Actinobacillus pleuropneumoniae elicits protective immunity inmice.Infect Immun.70(11):6464-7.)。研究发现，无溶血活性的 ApxIA外毒素也是一种很重要的免疫保护性抗原，利用插入失活的方法将含有apxIA基因的表达质粒插入到已经分离的天然缺失apxIICA基因但保留apxIBD基因的APP血清型7型APP菌株中，成功构建了表达无活性ApxI蛋白的弱毒菌株，免疫后小鼠致弱且能诱导产生ApxI特异性抗体，能抵抗APP血清型7型的攻击，能对异源血清型1型APP提供较好的保护力。进一步证实了无活性的ApxIA蛋白是很好的候选抗原。(Prideaux CT,Pierce L,Krywult J,Hodgson AL.,1998.Protection of mice against challenge with homologous and heterologousserovars of Actinobacillus pleuropneumoniae after live vaccination.CurrMicrobiol.1998Nov；37(5):324-32.)。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，其第一个目的是提供一种不含有抗性标记的猪胸膜肺炎放线杆菌血清10型突变的菌株。

本发明的第二个目的是利用猪胸膜肺炎放线杆菌外毒素apxIA基因点突变菌株提取无溶血活性的ApxIA蛋白。

本发明的第三个目的是无溶血活性ApxIA蛋白在制备防治猪传染性胸膜肺炎的亚单位疫苗中的应用。

本发明通过以下技术方案实现：

本发明通过基因工程技术制备得到一种不含有抗性标记的猪胸膜肺炎放线杆菌血清10型突变菌株，所述突变菌株为猪胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacilluspleuropneumoniae) mApxIA-2KA-APP10；保藏在中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO:M 2021378。

所述的猪胸膜肺炎放线杆菌血清10型突变菌株含有apxIA基因点突变基因，突变菌株中的 apxIA基因碱基序列上第1678至第1680的碱基序列为GCA，第2056至2058的碱基序列为GCA，该突变菌株表达的外毒素ApxIA第560位和第686的两个赖氨酸突变为丙氨酸残基，导致ApxIA 溶血活性丧失毒力下降，但仍具有免疫原性。

本发明的猪胸膜肺炎放线杆菌血清10型突变菌株可制备成一种防治猪胸膜肺炎的疫苗，优选为亚单位疫苗。

本发明的猪胸膜肺炎放线杆菌血清10型突变菌株可在制备防治猪传染性胸膜肺炎疫苗中应用，所述突变菌株为猪胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacilluspleuropneumoniae)mApxIA- 2KA-APP10，该突变株的保藏编号为：CCTCC NO:M 2021378。

本发明构建得到一种猪胸膜肺炎放线杆菌10型外毒素apxIA基因点突变株，申请人将该突变菌株命名为猪胸膜肺炎放线杆菌，mApxIA-2KA-APP10；Actinobacilluspleuropneumoniae mApxIA-2KA-APP10，于2021年4月15日送交中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏编号为：CCTCC NO:M 2021378

本发明的猪胸膜肺炎放线杆菌10型外毒素apxIA基因点突变株，该突变株是一种基因工程菌株，衍生于湖北某猪场分离鉴定的猪胸膜肺炎放线杆菌血清型10型菌株HB-14(参见：达来宝力格等,胸膜肺炎放线杆菌地方分离株和参考菌株的生物被膜形成，中国兽医学报，2009,29 (11)：1411-1414)作为亲本菌株，本发明中命名为APP10。所述猪胸膜肺炎放线杆菌突变菌株mApxIA-2KA-APP10其外毒素apxIA基因的溶血活性位点发生突变，导致表达的ApxIA毒力降低，不具有溶血活性，因而具有很高的安全性，但具有很好的免疫保护力。

本发明的突变株mApxIA-2KA-APP10具体突变序列为，猪胸膜肺炎放线杆菌APP10外毒素 apxIA基因碱基序列上1678至1680的碱基序列由突变前的AAA突变为GCA,2056至2058位的碱基序列由突变前的AAA突变为GCA，这两处突变后的核苷酸序列见图19,apxIA基因的ORF序列。。相应表达的外毒素ApxIA氨基酸序列的第560位和第686的两个赖氨酸L突变为丙氨酸残基A，序列见图20，外毒素ApxIA蛋白氨基酸序列。

本发明的APP10外毒素apxIA基因溶血活性位点突变株的构建方案是：先在亲本株APP APP10的基因组上缺失掉apxIA基因，再将活性位点突变后的apxIA基因补回到染色体，突变株 mApxIA-2KA-APP10分泌的外毒素ApxIA的溶血位点突变后导致不能被酰基转移酶ApxIC激活而失活，但保留完整序列的ApxIA能发挥很好免疫保护性。利用硫酸铵盐析法提纯亲本菌株溶血活性的ApxIA和突变菌株分泌无活性的ApxIA制备成亚单位疫苗，以Balb/c小鼠作为免疫-攻毒模型，比较溶血活性的ApxIA和无活性的ApxIA刺激产生的特异ApxIA抗体水平及免疫保护力。

本发明的主要优点是：

本发明构建的APP10外毒素apxIA基因溶血活性位点突变菌株，不含有抗性标记，完全符合生物安全性要求。在猪传染性胸膜肺炎亚单位疫苗中的应用，结合亚单位疫苗和毒力因子免疫保护研究的优点。该突变菌株能表达完整的ApxIA蛋白，但是表达的ApxIA缺失溶血活性毒力降低，不需灭活制备的亚单位疫苗能激活机体产生ApxIA特异性抗体，具有很好的保护原性。

附图说明

图1：本发明中利用RTX毒素同源性比对，预测APP10菌株外毒素ApxIA溶血活性的位点。

图2：本发明中pEMOC2质粒图谱。

图3：本发明制备的pEMΔIA转移质粒构建的流程图。

图4：本发明制备的pEMIA-2KA转移质粒构建的流程图。

图5：本发明中APP10外毒素apxIA基因缺失突变菌株APP10：ΔapxIA构建的技术路线图。

图6：本发明中APP10外毒素apxIA基因溶血活性位点突变菌株mApxIA-2KA-APP10构建技术路线图。

图7：本发明制备的转移质粒pEMΔIA的SacI/NotI双酶切鉴定结果。

附图标记说明：图7中1：pEMOC2，M:DNA marker(DL5000),2-4：pEMΔIA；

图8：利用APP10：ΔapxIA缺失突变株的PCR鉴定结果。

附图标记说明：图8中的M：DNA marker(DL5000)，1-2：APP10：ΔapxIA，3：亲本菌株APP10， 4：pEMIA-2KA。

图9：本发明制备的转移质粒pEMIA-2KA的PCR鉴定结果。

附图标记说明：图9中的标记M：DNA marker(DL5000)，1-7：pEMIA-2KA，8：亲本株APP10。图10：mApxIA-2KA-APP10点突变菌株外毒素apxIA全长基因PCR鉴定结果。

附图标记说明：图10中的标记M：DNA marker(DL5000)，1-5：mApxIA-2KA-APP10，6：野生型菌株APP10，7：APP10：ΔapxIA。

图11：mApxIA-2KA-APP10点突变菌株外毒素apxIA全长基因测序和比对结果。

图12：mApxIA-2KA-APP10点突变菌株遗传20代PCR鉴定结果。

附图标记说明：图12中的标记M：DNA marker(DL5000)，2-20：突变株连续传代从第2代到20 代菌株，

图13：mApxIA-2KA-APP10，APP10：ΔapxIA突变菌株和亲本株APP10的溶血活性比较。

图14：外毒素ApxIA在亲本菌株和突变株中表达的SDS-PAGE图和western-blotting分析结果。

附图标记说明：图14中的A图：SDS-PAGE图；图14中的B图：western-blotting分析图；图 14中的A图和B图中的标记M:蛋白marker 190kDa；1:亲本菌株APP10；2:缺失突变株APP10：ΔapxIA,3-4:点突变株mApxIA-2KA-APP10。

图15：外毒素蛋白ApxIA和ApxIA^2KA溶血活性分析。附图标记说明：

图15中的A图：APP10表达的ApxIA。附图标记说明：图15中的B图：APP10：ΔapxIA缺失株表达的ΔApxIA；图15中的C图：mApxIA-2KA-APP10突变菌株表达的ApxIA^2KA。

图16：外毒素ApxIA和ApxIA^2KA、免疫小鼠后ApxIA特异性抗体水平变化。

图17：不同试验组免疫小鼠后攻毒72小时内日增重变化。

图18：不同试验组免疫小鼠后攻毒72小时肺组织载菌量。

图19：本发明的apxIA基因的ORF序列。附图标记说明：图19序列的1678位至第1680位的aaa 突变为GCA(括号内的序列是突变后的序列)，第2056位至2058位的序列aaa突变为GCA(括号内的序列是突变后的序列)。

图20：外毒素ApxIA蛋白氨基酸序列。附图标记说明：图20的下划线部分：即ApxIA基因的第 560位的赖氨酸K突变为丙氨酸A,第686位的两个赖氨酸K突变为丙氨酸A。

具体实施方式

对核苷酸序列表的说明：

SEQ ID NO:1是本发明apxIA基因的ORF序列。

SEQ ID NO:2是本发明外毒素ApxIA蛋白氨基酸序列。

SEQ ID NO:3是本发明的正向引物序列，命名为IA-LF1。斜体所示序列为上游pEMOC2载体同源序列，下划线序列为BlpI酶切位点序列。

具体序列：

SEQ ID NO:4是本发明的反向引物序列，命名为IA-LR1。斜体所示序列为基因R同源臂5’端同源序列。

具体序列：TTAAAAATAATTATCGTTGTCTCCTTAGCTATTTACTAATGAAA

SEQ ID NO:5是本发明的正向引物序列，命名为IA-RF1。下划线序列为基因L同源臂3’端同源序列。

具体序列：

SEQ ID NO:6是本发明的反向引物序列，命名为IA-RR1。斜体所示的序列为下游pEMOC2载体同源序列，下划线所示序列为MfeI酶切位点序列。

具体序列：

SEQ ID NO:7是本发明的正向引物序列，命名为L-F1。

具体序列：GACAGTGCCGCATTATACAAACATATG。

SEQ ID NO:8是本发明的反向引物序列，命名为L-R1。

具体序列：TATTCGTATGCACCGGTTTGCTTACGCTC。

SEQ ID NO:9是本发明的正向引物序列，命名为IA-F2。

具体序列：AAACCGGTGCATACGAATATATGACCGAATTATTCG。

SEQ ID NO:10是本发明的反向引物序列，命名为IA-R2。

具体序列：TCACTGCGTGCTCCAACTGAAATATCCTGAGTTTT。

SEQ ID NO:11是本发明的正向引物序列，命名为R-F3。

具体序列：CAGTTGGAGCACGCAGTGAAAAATTAGAATATCG

引物R-R3的序列同SEQ ID NO:6所示的序列。

实施例1.猪胸膜肺炎放线杆菌APP10外毒素apxIA基因点突变菌株构建

1.引物设计(用于基因克隆和分子检测)

根据已报道的APP血清型10型菌株序列(参照GenBank，登录号为NZ_ADOJ01000000的基因序列)设计引物(见表1)，引物LF1和LR1用于扩增外毒素apxIA结构基因的上游同源臂同时引入BlpI酶切位点序列和质粒上同源序列(片段大小为1051bp)，用RF1引物和RR1引物扩增外毒素apxIA结构基因下游同源臂，同时引入MfeI酶切位点序列和质粒同源序列(片段大小为 1038bp)。利用F1和R1引物扩增第一个片段即包含apxIA上游同源臂基因延伸至560位点Lys 突变为Ala密码子序列(片段大小1919bp)；利用F2引物和R2因为苏扩增第二个片段，该片段包含apxIA基因560位点Lys突变为Ala密码子序列和686位点Lys突变为Ala密码子序列，同时引入 NdeI酶切位点序列(片段大小397bp)，利用引物F3和引物R3扩增第三个片段，该片段包含apxIA 基因686位点Lys突变为Ala密码子序列延伸至下游同源臂和质粒同源序列，同时引入MfeI酶切位点序列(片段大小1762bp)。上述引物设计均由相关生物公司合成。

表1.引物序列表

2.猪胸膜肺炎放线杆菌APP10外毒素apxIA基因上游L同源臂和下游R同源臂的扩增，从APP10 菌株提取基因组(登录号Genbenk:NZ_ADOJ01000000)，并以该基因组为模板，用IA-LF1和 IA-LR1引物PCR扩增apxIA基因(片段大小为3069bp)上游L同源臂，用IA-RF1和IA-RR1引物 PCR扩增apxIA基因下游R同源臂，同时引入了BlpI和MfeI酶切位点序列以及与酶切位点相连的 pEMOC2质粒(德国汉诺威大学Gerald-F.Gerlach赠送，质粒图谱见图2,oriT，oriV，Cmr， SacB,traJ)上下游同源序列。

PCR反应体系：Primer star 0.5μL,5*PS buffer 10μL,dNTP 4μL,扩增L同源臂引物 IA-LF1/IA-LR1各1μL，扩增R同源臂引物IA-RF1/IA-RR1各1μL,基因组模板4μL，双蒸水(ddH₂O)29.5μL

PCR反应条件：94℃变性5min后进入循环，循环参数为95℃30s,56℃30s,72℃1min30s,35个循环数后，至72℃延伸7min.。PCR产物经0.8％的琼脂凝胶电泳分析，扩增的两个片段均为1000bp，与预期大小一致，并将PCR产物送相关生物工程测序公司测序。

3.重组穿梭质粒pEMΔIA的构建

用BlpI和MfeI将自杀性穿梭载体pEMOC2(德国汉诺威大学Gerald-F.Gerlach赠送，质粒图谱见图2)进行双酶切，纯化回收两段PCR产物和线化的载体pEMOC2。将线性化的载体pEMOC2 和apxIA基因的上下游同源臂在Exnase Multis(购自诺唯赞公司)作用下通过重组反应连接在一起，将连接产物转化到Escherichia coli DH5α感受态细胞，并涂布氯霉素抗性LB固体平板(成分：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L和15g/L琼脂，另加入终浓度为 5μg/mL氯霉素Chl,)(流程图见图3)。37℃培养过夜，挑取阳性克隆子，转入加了氯霉素的LB(氯霉素终浓度为5μg/mL)液体培养基，提取重组质粒pEMΔIA，经SacI/NotI双酶切鉴定(结果见图7)。

4.猪胸膜肺炎放线杆菌APP10apxIA基因缺失突变株的构建

复苏培养Escherichia coliβ2155(德国汉诺威大学Gerald-F.Gerlach赠送)并制备其感受态，将pEMΔIA转化进入Ecoli.β2155感受态细胞。然后将携带有重组质粒的Ecoli.β2155(作为质粒供体)与本发明的猪胸膜肺炎放线杆菌APP10(作为质粒受体)进行转接，在氯霉素抗性的TSA固体培养基(即胰蛋白大豆琼脂培养基，购自美国GIBICO公司，以该培养基为基本成分，附加终浓度为10μg/mL的烟酰胺嘌呤二核苷酸NAD和体积比5％的新生牛血清，另加5μg/mL Chl)筛选Cm^r单交换子，在无抗性低营养的TNB液体培养基(成分：1％胰蛋白胨，0.5％酵母粉，10μg/mL NAD)连续传代，从第3代开始涂布TSA固体培养基，然后挑取单菌落分别影印到无氯霉素抗性和有氯霉素抗性的TSA平板，进行负筛选(构建流程图见图 5)。挑取Cm^s单菌落进行PCR鉴定,检测到缺失3069bp的条带(见图8)，PCR产物送相关商业生物技术公司测序，将所得序列与基因组序列比对，再次确定缺失了apxIA基因序列，筛选得到菌株即为apxIA基因缺失突变株，被命名为APP10：ΔapxIA。

5.猪胸膜肺炎放线杆菌外毒素apxI结构基因apxIA上游同源臂,560位点和686位点Lys密码子突变为Ala密码子序列的片段和下游同源臂的扩增

以APP10菌株的基因组为模板，用L-F1和L-R1引物扩增第一个片段包含apxIA上游同源臂基因延伸至560位点Lys突变为Ala密码子序列(即L片段)，IA-F2和IA-R2扩增第二个片段包含apxIA基因560位点Lys突变为Ala密码子序列和686位点Lys突变为Ala密码子序列同时引入 NdeI酶切位点序列(即A片段)，R-F3和R-R3扩增第三个片段包含apxIA基因686位点Lys突变为 Ala密码子序列延伸至下游同源臂和质粒同源序列同时引入MfeI酶切位点序列(即R片段)，同时引入了NdeI和MfeI酶切位点序列以及与酶切位点相连的质粒上下游同源序列，L片段3’末端和A片段5’末端序列同源，A片段3’末端和R片段5’末端序列同源。

PCR反应体系：Primer star 0.5μL,5*PS buffer 10μL,dNTP 4μL,扩增所述的L片段的引物L-F1/L-R1各1μL，扩增所述的A片段的引物IA-F2/IA-R2各1μL，扩增R同源臂引物R-F3/R-R3各1μL,基因组模板4μL，ddH₂O,29.5μL。

扩增L片段的PCR反应条件：94℃变性5min后进入循环，循环参数为95℃30s,56℃30s,72℃2min,35个循环数后，72℃延伸7min。

扩增A片段的PCR反应条件：94℃变性5min后进入循环，循环参数为95℃30s,56℃30s,72℃30s,35个循环数后，72℃延伸7min。

扩增R片段的PCR反应条件：94℃变性5min后进入循环，循环参数为95℃30s,56℃30s,72℃1min40s,35个循环数后，72℃延伸7min。

PCR产物经0.8％的琼脂凝胶电泳分析，扩增的三个片段依次约为2000bp；400bp；1800bp，与预期大小一致，并将PCR产物送相关商业生物技术公司测序。

6.重组穿梭质粒pEMIA-2KA的构建

用NdeI和MfeI将上述重组质粒pEMΔIA进行双酶切，纯化回收以上三段PCR产物和线化的质粒pEMΔIA。重复上述3的步骤，将上述线化的质粒pEMΔIA和三个片段通过重组反应连接在一起，将连接产物转化到E.coli DH5α感受态细胞，并在氯霉素抗性平板挑取阳性克隆子(构建流程图见图4)。用LF1和RR3引物进行PCR检测仅有一条大于3000bp以上的条带(见图9)，扩增产物送生物工程公司测序，序列结果与亲本菌株的apxIA基因进行比对，比对结果显示在正确的地方发生了突变(见图11)，从筛选的菌株中获得重组质粒pEMIA-2KA。

7.猪胸膜肺炎放线杆菌外毒素apxIA基因点突变菌株的构建方法

重复上述步骤4，将pEMIA-2KA质粒转化进入Ecoli.β2155感受态细胞。然后将携带有重组质粒的Ecoli.β2155(作为质粒供体)与本发明的基因缺失突变株APP10：ΔapxIA(作为质粒受体)进行转接，在氯霉素抗性平板筛选Cmr单交换子，在无抗性低营养的TNB液体培养基连续传代，从第1代开始涂布TSA固体培养基，然后挑取单菌落分别影印到无氯霉素抗性和有氯霉素抗性的TSA平板，进行负筛选(构建流程图见图6)，筛选Cm^s单菌落用用LF1和RR3引物进行PCR检测仅有一条大于3000bp以上的条带(见图10)，扩增产物送相关商业生物技术公司测序，将测序的序列与亲本菌株APP10的apxIA基因序列进行比对(见图11)，将所得菌株即为外毒素ApxIA溶血活性位点突变株命名为Actinobacillus pleuropneumoniae10-mApxIA-2KA(第560位和第686位的赖氨酸K残基突变为丙氨酸A残基)(以下简称为mApxIA-2KA-APP10)。

8.猪胸膜肺炎放线杆菌突变菌株mApxIA-2KA-APP10的遗传稳定性试验

将本发明构建的猪胸膜肺炎放线杆菌突变菌株mApxIA-2KA-APP10在TSA的固体培养基(即胰蛋白大豆琼脂培养基，购自美国GIBICO公司，以该培养基为基本成分，附加终浓度为 10μg/mL的烟酰胺嘌呤二核苷酸和体积比5％的新生牛血清)上连续传代20代，用常规PCR方法鉴定每一代的突变菌株是否都能扩增出大约3000bp大小的apxIA基因片段(见图12)，且将第 5代，第10代，第15代和第20代的PCR产物送相关商业技术公司测序，将测序后的序列与亲本菌株的apxIA基因的序列进行比对，如发生一样的突变，表明本发明APP的apxIA基因点突变菌株能够稳定地遗传。

9.本发明的猪胸膜肺炎放线杆菌突变菌株mApxIA-2KA-APP10溶血活性分析

挑取亲本菌株APP10和点突变菌株mApxIA-2KA-APP10,同时挑取基因缺失菌株APP10：ΔapxIA作为对照,分别接种于绵羊血琼脂平板(按常规方法)，37℃培养过夜，观察它们的溶血情况，结果显示亲本株APP10有明显的溶血，和点突变菌株mApxIA-2KA-APP10没有溶血反应,对照缺失突变株APP10：ΔapxIA无溶血反应(见图13)。

实施例2.溶血素ApxI和无溶血活性ApxI的生物学特性分析

1.溶血素ApxI和无溶血活性ApxI的提取和纯化

分别复苏菌株APP10，APP10：ΔapxIA和mApxIA-2KA-APP10，挑取单菌落转入8mL含1.0 mmol/L CaCl₂的TSB(即胰蛋白大豆肉汤培养基，购自美国GIBICO公司，以该培养基为基本成分加入体积比5％新生牛血清和终浓度10μg/mLNAD)液体培养基中于37℃震荡培养过夜。次日按照体积比为1：100菌液转入800ml的含有CaCl₂的TSB液体培养基(含有终浓度1mM CaCl₂)， 37℃振荡培养4h-5h至对数生长中后期(OD₆₀₀＝0.6-0.8)，在17000g，4℃离心收集上清液， 0.22μm过滤后，上清放置4℃，以32.5g/100mL的比例边加边搅拌，缓慢加入(NH4)₂SO₄，在 4℃沉降1h，10000g 20min离心收集沉淀，用16ml的Dialysis buffer重悬沉淀，转入14KWM 的透析袋，在透析液Dialysis buffer中透析，每6h-8h换液一次，共计换液3次。溶液经17000g 离心5min去沉淀，接着在105000g超高速离心1h,收集上清液。上清液经规格100kDamillipore 超滤管浓缩蛋白至15-20倍，置换PBS buffer 2次。浓缩后蛋白质用BCA法测定浓度，4℃待用。以同样步骤下缺失菌株APP10：ΔapxIA作为对照，将提取的蛋白质命名为ΔApxIA。

将浓缩蛋白稀释后经SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)电泳，同时将电泳后的凝胶转移至硝酸纤维素膜，用0.5％牛血清蛋白(BSA)封闭30min后加入一抗anti-rApxIA(重组表达的ApxIA 蛋白制备的鼠源多克隆抗体)孵育1h，加入羊抗鼠IgG-HRP孵育1h，以上操作均在37℃下进行，每步骤均用TSBT洗脱5次。随后加入DAB显色液避光显色底物，在BioradECL显色拍照。结果如图14所示：从APP10菌株中能分泌大小约110kDa的外毒素蛋白ApxIA，从突变菌株 mApxIA-2KA-APP10能分泌大小约110kDa的外毒素蛋白，本发明将该蛋白命名为ApxIA^2KA，且均具有良好的免疫原性(见图14)。

2.外毒素蛋白ApxIA和ApxIA^2KA溶血活性分析

将上述纯化的外毒素蛋白ApxIA，ApxIA^2KA和ΔApxIA(作为对照)测定浓度之后，以3mg/ml 蛋白为起始浓度，倍比稀释后各取100μL蛋白和2％绵羊血红细胞100μL，37℃孵育2h后，余4 ℃过夜之后观察溶血结果(见图15)，结果显示亲本株的ApxIA蛋白质溶血明显，随着ApxIA 蛋白质浓度降低，溶血反应降低。ApxIA^2KA和ΔApxIA蛋白质完全丧失了溶血活性。

实施例3.外毒素ApxIA和ApxIA^2KA免疫原性检测

1.ApxIA^2KA制备成亚单位疫苗免疫小鼠后抗体水平评价

分别将20μg ApxIA^2KA和ApxIA，各50μL和50μL佐剂(quick antibody-mouse3W)快速乳化制备成亚单位疫苗，以PBS佐剂为对照。将4周龄雌性Balb/c小鼠18只，分为亚单位疫苗 ApxIA^2KA试验组和亚单位疫苗ApxIA试验组，PBS佐剂对照组；每组6只小鼠。小鼠免疫程序： 100ul亚单位和PBS佐剂分别免疫小鼠，第14天同样加强免疫一次，免疫方式均为小鼠后腿肌肉注射。分别在首免前，首免后7天，14天，21天和28天分别小鼠断尾取血，分离到的血清，用包被有rApxIA(1.8μg/孔)的ELISA板进行抗体效价的检测。小鼠血清从20倍稀释倍开始倍比稀释后检测抗体效价。结果显示(见图16)，首免后14天开始，试验组的抗体水平持续上升，且在首免后21天和28天，ApxIA2KA组小鼠抗体水平显著高于ApxIA组的小鼠。

2.ApxIA^2KA对APP10感染保护力的检测

将二免后第14天对试验组和对照免疫小鼠进行APP10感染试验。采用腹腔注射的方法，向每组小鼠注射1.9×10⁷CFU(LD₅₀)的处于对数生长中期APP10菌株，攻毒后连续观察72天，亚单位疫苗ApxIA^2KA和ApxIA均能提供100％的免疫保护。攻毒48小时ApxIA亚单位试验组和PBS 对照组的小鼠表现出较严重的临床症状，例如毛被粗糙，呼吸困难，行动迟缓和食欲不振， 48小时后症状有所缓解。ApxIA^2KA亚单位试验组小鼠临床症状不明显。攻毒3天(72小时)小鼠日增重统计(见图17)，结果显示，ApxIA亚单位试验组和PBS对照组的小鼠明显下降， ApxIA^2KA亚单位疫苗试验组小鼠体重呈增长趋势。攻毒72小时后，对小鼠解剖统计小鼠肺部载菌量(图18)，结果显示，与ApxIA亚单位疫苗试验组和PBS，ApxIA^2KA亚单位疫苗试验组小鼠肺部细菌部分被清除。综合以上试验结果，表明ApxIA^2KA具有很好的免疫原性，可以作为防控猪传染性胸膜肺炎亚单位疫苗的候选抗原。

序列表

<110> 华中农业大学

<120> 猪胸膜肺炎放线杆菌突变菌株、ApxIA蛋白及应用

<141> 2021-04-27

<160> 11

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 3069

<212> DNA

<213> 放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)

<220>

<221> gene

<222> (1)..(3070)

<220>

<221> mutation

<222> (2056)..(2058)

<220>

<221> mutation

<222> (1678)..(1680)

<400> 1

atggctaact ctcagctcga tagagtcaaa ggattgattg attcacttaa tcaacataca 60

aaaagtgcag ctaaatcagg tgccggcgca ttaaaaaatg gtttgggaca ggtgaagcaa 120

gcagggcaga aattaatttt atatattccg aaagattatc aagctagtac cggctcaagt 180

cttaatgatt tagtgaaagc ggcggaggct ttagggatcg aagtacatcg ctcggaaaaa 240

aacggtaccg cactagcgaa agaattattc ggtacaacgg aaaaactatt aggtttctcg 300

gaacgaggca tcgcattatt tgcacctcag tttgataagt tactgaataa gaaccaaaaa 360

ttaagtaaat cgctcggcgg ttcatcggaa gcattaggac aacgtttaaa taaaacgcaa 420

acggcacttt cagccttaca aagtttctta ggtacggcta ttgcgggtat ggatcttgat 480

agcctgcttc gtcgccgtag aaacggtgag gacgtcagtg gttcggaatt agctaaagca 540

ggtgtggatc tagccgctca gttagtggat aacattgcaa gtgcaacggg tacggtggat 600

gcgtttgccg aacaattagg taaattgggc aatgccttat ctaacactcg cttaagcggt 660

ttagcaagta agttaaataa ccttccagat ttaagccttg caggacctgg gtttgatgcc 720

gtatcaggta tcttatctgt tgtttcggct tcattcattt taagtaataa agatgccgat 780

gcaggtacaa aagcggcggc aggtattgaa atctcaacta aaatcttagg caatatcggt 840

aaagcggttt ctcaatatat tattgcgcaa cgtgtggcgg caggcttatc cacaactgcg 900

gcaaccggtg gtttaatcgg ttcggtcgta gcattagcga ttagcccgct ttcgttctta 960

aatgttgcgg ataagtttga acgtgcgaaa cagcttgaac aatattcgga gcgctttaaa 1020

aagttcggtt atgaaggtga tagtttatta gcttcattct accgtgaaac cggtgcgatt 1080

gaagcggcat taaccacgat taacagtgtg ttaagtgcgg cttccgcagg tgttggggct 1140

gctgcaaccg gctcattagt cggtgcgccg gtagcagctt tagttagtgc aatcaccggt 1200

attatttcag gtattttaga tgcttctaaa caggcaatct tcgaacgagt tgcaacgaaa 1260

ttagcgaata agattgacga atgggagaaa aaacacggta aaaactattt tgaaaacggt 1320

tatgacgccc gccattccgc attcttagaa gatacctttg aattgttatc acaatacaat 1380

aaagagtatt cggtagagcg tgtcgttgct attacgcaac aacgttggga tgtcaatatc 1440

ggggaacttg ccggtatcac gcgtaaaggt gcggatgcga aaagcggtaa ggcttatgtc 1500

gatttctttg aagaaggaaa attgttagag aaagatccgg atcgttttga taaaaaagtg 1560

tttgatccgc ttgaaggcaa aatcgacctt tcttcaatta acaaaaccac tttattgaaa 1620

tttattacac cggtttttac cgcaggtgaa gagattcgtg agcgtaagca aaccggtgca 1680

tacgaatata tgaccgaatt attcgttaaa ggtaaagaaa aatgggtggt aaccggtgtg 1740

cagtcacata atgcgattta tgactatacg aatcttatcc aattagcgat agataaaaaa 1800

ggtgaaaaac gtcaagtgac cattgaatct catttgggtg agaaaaatga tcgtatatat 1860

ctttcatccg gttcatctat cgtatatgcg ggtaacggac atgatgtagc atattacgat 1920

aaaaccgata caggttactt aacatttgac ggacaaagtg cacagaaagc cggtgaatat 1980

attgtcacta aagaacttaa agctgatgta aaagttttaa aagaagtggt taaaactcag 2040

gatatttcag ttggagcacg cagtgaaaaa ttagaatatc gtgattatga gttaagccca 2100

ttcgaacttg ggaacggtat cagagctaaa gatgaattac attctgttga agaaattatc 2160

ggtagtaatc gtaaagacaa attctttggt agtcgcttta ccgatatttt ccatggtgcg 2220

aaaggcgatg atgaaatcta cggtaatgac ggccacgata tcttatacgg agacgacggt 2280

aatgatgtaa tccatggcgg tgacggtaac gaccatcttg ttggtggtaa cggaaacgac 2340

cgattaatcg gcggaaaagg taataatttc cttaatggcg gtgatggtga cgatgagttg 2400

caggtctttg agggtcaata caacgtatta ttaggtggtg cgggtaatga cattctgtat 2460

ggcagcgatg gtactaactt atttgacggt ggtgtaggca atgacaaaat ctacggtggt 2520

ttaggtaagg atatttatcg ctacagtaag gagtacggtc gtcatatcat tattgagaaa 2580

ggcggtgatg atgatacgtt attgttatcg gatcttagtt ttaaagatgt aggatttatc 2640

agaatcggtg atgatcttct tgtgaataaa agaatcggag gaacactgta ttaccatgaa 2700

gattacaatg ggaatgcgct cacgattaaa gattggttca aggaaggtaa agaaggacaa 2760

aataataaaa ttgaaaaaat cgttgataaa gatggagctt atgttttaag ccaatatctg 2820

actgaactga cagctcctgg aagaggtatc aattacttta atgggttaga agaaaaattg 2880

tattatggag aaggatataa tgcacttcct caactcagaa aagatattga acaaatcatt 2940

tcatctactg gtgcacttac cggtgaacac ggacaagttt tagtgggagc aggcggtcca 3000

ttagcttaca gcaattcacc gaatagcata ccgaatgctt tcagtaatta tttaacacaa 3060

tctgcttaa 3069

<210> 2

<211> 1022

<212> PRT

<213> 放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)

<220>

<221> BINDING

<222> (1)..(1022)

<400> 2

Met Ala Asn Ser Gln Leu Asp Arg Val Lys Gly Leu Ile Asp Ser Leu

1 5 10 15

Asn Gln His Thr Lys Ser Ala Ala Lys Ser Gly Ala Gly Ala Leu Lys

20 25 30

Asn Gly Leu Gly Gln Val Lys Gln Ala Gly Gln Lys Leu Ile Leu Tyr

35 40 45

Ile Pro Lys Asp Tyr Gln Ala Ser Thr Gly Ser Ser Leu Asn Asp Leu

50 55 60

Val Lys Ala Ala Glu Ala Leu Gly Ile Glu Val His Arg Ser Glu Lys

65 70 75 80

Asn Gly Thr Ala Leu Ala Lys Glu Leu Phe Gly Thr Thr Glu Lys Leu

85 90 95

Leu Gly Phe Ser Glu Arg Gly Ile Ala Leu Phe Ala Pro Gln Phe Asp

100 105 110

Lys Leu Leu Asn Lys Asn Gln Lys Leu Ser Lys Ser Leu Gly Gly Ser

115 120 125

Ser Glu Ala Leu Gly Gln Arg Leu Asn Lys Thr Gln Thr Ala Leu Ser

130 135 140

Ala Leu Gln Ser Phe Leu Gly Thr Ala Ile Ala Gly Met Asp Leu Asp

145 150 155 160

Ser Leu Leu Arg Arg Arg Arg Asn Gly Glu Asp Val Ser Gly Ser Glu

165 170 175

Leu Ala Lys Ala Gly Val Asp Leu Ala Ala Gln Leu Val Asp Asn Ile

180 185 190

Ala Ser Ala Thr Gly Thr Val Asp Ala Phe Ala Glu Gln Leu Gly Lys

195 200 205

Leu Gly Asn Ala Leu Ser Asn Thr Arg Leu Ser Gly Leu Ala Ser Lys

210 215 220

Leu Asn Asn Leu Pro Asp Leu Ser Leu Ala Gly Pro Gly Phe Asp Ala

225 230 235 240

Val Ser Gly Ile Leu Ser Val Val Ser Ala Ser Phe Ile Leu Ser Asn

245 250 255

Lys Asp Ala Asp Ala Gly Thr Lys Ala Ala Ala Gly Ile Glu Ile Ser

260 265 270

Thr Lys Ile Leu Gly Asn Ile Gly Lys Ala Val Ser Gln Tyr Ile Ile

275 280 285

Ala Gln Arg Val Ala Ala Gly Leu Ser Thr Thr Ala Ala Thr Gly Gly

290 295 300

Leu Ile Gly Ser Val Val Ala Leu Ala Ile Ser Pro Leu Ser Phe Leu

305 310 315 320

Asn Val Ala Asp Lys Phe Glu Arg Ala Lys Gln Leu Glu Gln Tyr Ser

325 330 335

Glu Arg Phe Lys Lys Phe Gly Tyr Glu Gly Asp Ser Leu Leu Ala Ser

340 345 350

Phe Tyr Arg Glu Thr Gly Ala Ile Glu Ala Ala Leu Thr Thr Ile Asn

355 360 365

Ser Val Leu Ser Ala Ala Ser Ala Gly Val Gly Ala Ala Ala Thr Gly

370 375 380

Ser Leu Val Gly Ala Pro Val Ala Ala Leu Val Ser Ala Ile Thr Gly

385 390 395 400

Ile Ile Ser Gly Ile Leu Asp Ala Ser Lys Gln Ala Ile Phe Glu Arg

405 410 415

Val Ala Thr Lys Leu Ala Asn Lys Ile Asp Glu Trp Glu Lys Lys His

420 425 430

Gly Lys Asn Tyr Phe Glu Asn Gly Tyr Asp Ala Arg His Ser Ala Phe

435 440 445

Leu Glu Asp Thr Phe Glu Leu Leu Ser Gln Tyr Asn Lys Glu Tyr Ser

450 455 460

Val Glu Arg Val Val Ala Ile Thr Gln Gln Arg Trp Asp Val Asn Ile

465 470 475 480

Gly Glu Leu Ala Gly Ile Thr Arg Lys Gly Ala Asp Ala Lys Ser Gly

485 490 495

Lys Ala Tyr Val Asp Phe Phe Glu Glu Gly Lys Leu Leu Glu Lys Asp

500 505 510

Pro Asp Arg Phe Asp Lys Lys Val Phe Asp Pro Leu Glu Gly Lys Ile

515 520 525

Asp Leu Ser Ser Ile Asn Lys Thr Thr Leu Leu Lys Phe Ile Thr Pro

530 535 540

Val Phe Thr Ala Gly Glu Glu Ile Arg Glu Arg Lys Gln Thr Gly Ala

545 550 555 560

Tyr Glu Tyr Met Thr Glu Leu Phe Val Lys Gly Lys Glu Lys Trp Val

565 570 575

Val Thr Gly Val Gln Ser His Asn Ala Ile Tyr Asp Tyr Thr Asn Leu

580 585 590

Ile Gln Leu Ala Ile Asp Lys Lys Gly Glu Lys Arg Gln Val Thr Ile

595 600 605

Glu Ser His Leu Gly Glu Lys Asn Asp Arg Ile Tyr Leu Ser Ser Gly

610 615 620

Ser Ser Ile Val Tyr Ala Gly Asn Gly His Asp Val Ala Tyr Tyr Asp

625 630 635 640

Lys Thr Asp Thr Gly Tyr Leu Thr Phe Asp Gly Gln Ser Ala Gln Lys

645 650 655

Ala Gly Glu Tyr Ile Val Thr Lys Glu Leu Lys Ala Asp Val Lys Val

660 665 670

Leu Lys Glu Val Val Lys Thr Gln Asp Ile Ser Val Gly Ala Arg Ser

675 680 685

Glu Lys Leu Glu Tyr Arg Asp Tyr Glu Leu Ser Pro Phe Glu Leu Gly

690 695 700

Asn Gly Ile Arg Ala Lys Asp Glu Leu His Ser Val Glu Glu Ile Ile

705 710 715 720

Gly Ser Asn Arg Lys Asp Lys Phe Phe Gly Ser Arg Phe Thr Asp Ile

725 730 735

Phe His Gly Ala Lys Gly Asp Asp Glu Ile Tyr Gly Asn Asp Gly His

740 745 750

Asp Ile Leu Tyr Gly Asp Asp Gly Asn Asp Val Ile His Gly Gly Asp

755 760 765

Gly Asn Asp His Leu Val Gly Gly Asn Gly Asn Asp Arg Leu Ile Gly

770 775 780

Gly Lys Gly Asn Asn Phe Leu Asn Gly Gly Asp Gly Asp Asp Glu Leu

785 790 795 800

Gln Val Phe Glu Gly Gln Tyr Asn Val Leu Leu Gly Gly Ala Gly Asn

805 810 815

Asp Ile Leu Tyr Gly Ser Asp Gly Thr Asn Leu Phe Asp Gly Gly Val

820 825 830

Gly Asn Asp Lys Ile Tyr Gly Gly Leu Gly Lys Asp Ile Tyr Arg Tyr

835 840 845

Ser Lys Glu Tyr Gly Arg His Ile Ile Ile Glu Lys Gly Gly Asp Asp

850 855 860

Asp Thr Leu Leu Leu Ser Asp Leu Ser Phe Lys Asp Val Gly Phe Ile

865 870 875 880

Arg Ile Gly Asp Asp Leu Leu Val Asn Lys Arg Ile Gly Gly Thr Leu

885 890 895

Tyr Tyr His Glu Asp Tyr Asn Gly Asn Ala Leu Thr Ile Lys Asp Trp

900 905 910

Phe Lys Glu Gly Lys Glu Gly Gln Asn Asn Lys Ile Glu Lys Ile Val

915 920 925

Asp Lys Asp Gly Ala Tyr Val Leu Ser Gln Tyr Leu Thr Glu Leu Thr

930 935 940

Ala Pro Gly Arg Gly Ile Asn Tyr Phe Asn Gly Leu Glu Glu Lys Leu

945 950 955 960

Tyr Tyr Gly Glu Gly Tyr Asn Ala Leu Pro Gln Leu Arg Lys Asp Ile

965 970 975

Glu Gln Ile Ile Ser Ser Thr Gly Ala Leu Thr Gly Glu His Gly Gln

980 985 990

Val Leu Val Gly Ala Gly Gly Pro Leu Ala Tyr Ser Asn Ser Pro Asn

995 1000 1005

Ser Ile Pro Asn Ala Phe Ser Asn Tyr Leu Thr Gln Ser Ala

1010 1015 1020

<210> 3

<211> 44

<212> DNA

<213> 放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(44)

<400> 3

tctgattagc cttgctctgc ttagcttgca aaggtactgc cgga 44

<210> 4

<211> 44

<212> DNA

<213> 放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)

<220>

<221> protein_bind

<222> (1)..(44)

<400> 4

ttaaaaataa ttatcgttgt ctccttagct atttactaat gaaa 44

<210> 5

<211> 47

<212> DNA

<213> 放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(47)

<400> 5

agctaaggag acaacgataa ttatttttaa atgattaata gcaatcc 47

<210> 6

<211> 43

<212> DNA

<213> 放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(43)

<400> 6

tgtgacataa acatcgttca attgtgataa aaatcgacca ccc 43

<210> 7

<211> 27

<212> DNA

<213> 放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(27)

<400> 7

gacagtgccg cattatacaa acatatg 27

<210> 8

<211> 29

<212> DNA

<213> 放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(29)

<400> 8

tattcgtatg caccggtttg cttacgctc 29

<210> 9

<211> 36

<212> DNA

<213> 放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(36)

<400> 9

aaaccggtgc atacgaatat atgaccgaat tattcg 36

<210> 10

<211> 35

<212> DNA

<213> 放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(35)

<400> 10

tcactgcgtg ctccaactga aatatcctga gtttt 35

<210> 11

<211> 34

<212> DNA

<213> 放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(34)

<400> 11

cagttggagc acgcagtgaa aaattagaat atcg 34

Claims (4)

1.一种不含有抗性标记的猪胸膜肺炎放线杆菌血清10型突变菌株，其特征在于：所述突变菌株为猪胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)mApxIA-2KA-APP10；保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO:M 2021378。

2.如权利要求1所述的猪胸膜肺炎放线杆菌血清10型突变菌株，其特征在于：所述的菌株含有apxIA基因点突变基因，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示，突变菌株中的apxIA基因碱基序列中第1678位至第1680位的碱基序列为GCA，第2056位至2058位的碱基序列为GCA，该突变菌株表达的外毒素ApxIA的第560位和第686的两个赖氨酸突变为丙氨酸残基，其蛋白质的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:2所示，导致ApxIA溶血活性丧失毒力下降，但仍具有免疫原性。

3.包含权利要求1所述的一种猪胸膜肺炎放线杆菌血清10型突变菌株的亚单位疫苗。

4.一种猪胸膜肺炎放线杆菌血清10型突变菌株在制备防治猪传染性胸膜肺炎亚单位疫苗中应用，其特征在于，所述突变菌株为猪胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacilluspleuropneumoniae)mApxIA-2KA-APP10，保藏编号为：CCT CC NO:M 2021378。

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