CN108671227B - 一种预防猪链球菌感染的广谱多联亚单位疫苗 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种预防猪链球菌感染的疫苗。本发明提供的疫苗，其活性成分由成分甲、成分乙、成分丙、成分丁和成分戊组成；所述成分甲为分选酶或具有所述分选酶的融合蛋白；所述成分乙为SSPA或具有所述SSPA的融合蛋白；所述成分丙为MRP或具有所述MRP的融合蛋白；所述成分丁为SCPC或具有所述SCPC的融合蛋白；所述成分戊为SLY或具有所述SLY的融合蛋白；所述疫苗还包括免疫佐剂，所述免疫佐剂为粘膜免疫佐剂CpG或其他粘膜免疫佐剂。本发明提供的疫苗具有高效、广谱、和低价的优越性。同时本发明提供的疫苗采用粘膜免疫的途径，具有无组织损伤、无局部副作用和使用简便的特点，易于推广使用。

Description

一种预防猪链球菌感染的广谱多联亚单位疫苗

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种预防猪链球菌感染的广谱多联亚单位疫苗。

背景技术

猪链球菌(Streptococcus suis，S.suis)是引起猪链球菌病的病原菌，根据细菌表面荚膜多糖(CPS)可以将猪链球菌分为35个血清型(1-34和1/2)，其中猪链球菌2型(SS2)毒力最强，流行广。SS2是一种人畜共患病原体，能够引起猪脑膜炎、脑炎、肺炎、心内膜炎、多发性浆膜炎、关节炎、败血症和流产等疾病；人类感染SS2可导致脑膜炎、败血型休克、永久性耳聋和心内膜炎甚至死亡。猪链球菌病给世界各国的猪养殖、加工行业带来严重的经济损失，同时对与猪的养殖、加工密切接触的人员造成感染的风险，1998年及2005年在中国暴发了两次大规模人感染猪链球菌疫情，绝大多数病人表现链球菌毒性休克综合征，病程短，死亡率极高，严重危害生命健康。

猪是猪链球菌的天然宿主，研究发现健康猪的上呼吸道如鼻腔和扁桃体携带不同血清型的猪链球菌。猪链球菌在猪之间的传播包括垂直传播和水平传播，垂直传播是指猪链球菌携带状态的母猪在产仔时通过生殖道传播，水平传播是指猪之间面对面的接触导致猪链球菌的传播。猪链球菌在人之间的传播主要是通过皮肤损伤和口服进入(食用受污染的猪肉产品)，脑膜炎和败血型休克是最常见的症状；目前没有发现猪链球菌在人上呼吸道的感染，但是不排除这种可能性。

目前用于预防猪链球菌病的市售疫苗多为细菌减毒或灭活疫苗，其保护作用是基于抗体的体液免疫。虽然目前市售疫苗在一定程度降低了猪链球菌病的发病率，但是存在明显的弱点，如免疫引起的高水平的血清抗体不都是保护性抗体，而能够提供保护性抗体的抗原表达或暴露有限，不足以诱导和提供有效的保护效果。此外，现有研究结果证实单一猪链球菌亚单位成分不能对多种血清型猪链球菌提供全面有效的保护，市售疫苗只能对少数血清型猪链球菌提供交叉保护作用并且效果不佳。因此，迫切需要开发安全、有效、广谱的猪链球菌疫苗。

粘膜系统遍布全身，包括呼吸系统、消化系统、泌尿系统、生殖系统或皮肤，粘膜免疫不仅能够诱导粘膜系统分泌型的IgA和系统性的IgG，还可以诱导能够提供交叉保护作用的Th17。通过粘膜免疫的方式，选择猪链球菌高度保守的保护性抗原免疫，在保证安全性的同时，可以提供对不同血清型猪链球菌有效的交叉保护作用。

SrtA(Sortase A，分选酶A)是普遍存在于革兰氏阳性菌中的成分，其功能是介导细菌的毒力蛋白锚定在细菌表面，缺失分选酶A的细菌致病力显著降低。经粘膜途径免疫分选酶A能够诱导以Th17为主的免疫反应，在抗粘膜细菌感染中有重要作用。

SSPA(surface-associated subtilisin-like protease，表面相关枯草杆菌蛋白酶样蛋白酶)是猪链球菌表面的毒力蛋白，在所有的猪链球菌血清型中普遍存在，SSPA可以降解CCL5和IL-6来发挥其致病力，研究表明SSPA可诱导高水平的中和抗体并发挥很好的保护作用。

MRP(Muramidase-released protein，溶菌酶释放蛋白)是一种纤维蛋白原结合蛋白，其与人纤维蛋白原结合促进了猪链球菌对中性粒细胞的抗吞噬作用，同时与猪链球菌突破血脑屏障造成宿主脑膜炎有关。作为一种表面抗原，MRP抗原性强，能诱导高水平的中和抗体，粘膜免疫诱导产生Th17，提供有效的保护作用。

SCPC(streptococcal chemokine protease，链球菌趋化因子蛋白酶)是表达于各种血清型的猪链球菌株表面的保守蛋白，通过降解IL-8抑制中性粒细胞在感染部位的迁移，抑制宿主对猪链球菌的清除。已证明SCPC免疫诱导抗体产生，并对猪链球菌提供免疫保护。

SLY(suilysin，溶血素)是猪链球菌分泌型的毒力蛋白，属于胆固醇依赖的细胞溶素家族，可以在包含胆固醇成分的细胞膜形成穿孔造成细胞裂解。另外可以激活血小板并发生血小板凝集，形成血栓。SLY在所有猪链球菌中普遍存在，免疫SLY可诱导抗体生成，对猪链球菌提供免疫保护。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种预防猪链球菌感染的疫苗。

本发明提供的预防猪链球菌感染的疫苗的活性成分由成分甲、成分乙、成分丙、成分丁和成分戊组成；

所述成分甲为分选酶A(SrtA)、具有所述分选酶A全长或部分氨基酸序列的融合蛋白、所述分选酶A全长或部分氨基酸序列与佐剂蛋白共轭连接的蛋白、所述分选酶A全长或部分氨基酸序列与多糖的连接复合物或携带所述分选酶A全长或部分编码基因的DNA表达载体；

所述成分乙为表面相关枯草杆菌蛋白酶样蛋白酶(SSPA)、具有所述表面相关枯草杆菌蛋白酶样蛋白酶全长或部分氨基酸序列的融合蛋白、所述表面相关枯草杆菌蛋白酶样蛋白酶全长或部分氨基酸序列与佐剂蛋白共轭连接的蛋白、所述表面相关枯草杆菌蛋白酶样蛋白酶全长或部分氨基酸序列与多糖的连接复合物或携带所述表面相关枯草杆菌蛋白酶样蛋白酶全长或部分编码基因的DNA表达载体；

所述成分丙为溶菌酶释放蛋白(MRP)、具有所述溶菌酶释放蛋白全长或部分氨基酸序列的融合蛋白、所述溶菌酶释放蛋白全长或部分氨基酸序列与佐剂蛋白共轭连接的蛋白、所述溶菌酶释放蛋白全长或部分氨基酸序列与多糖的连接复合物或携带所述溶菌酶释放蛋白全长或部分编码基因的DNA表达载体；

所述成分丁为链球菌趋化因子蛋白酶(SCPC)、具有所述链球菌趋化因子蛋白酶全长或部分氨基酸序列的融合蛋白、所述链球菌趋化因子蛋白酶全长或部分氨基酸序列与佐剂蛋白共轭连接的蛋白、所述链球菌趋化因子蛋白酶全长或部分氨基酸序列与多糖的连接复合物或携带所述链球菌趋化因子蛋白酶全长或部分编码基因的DNA表达载体；

所述成分戊为溶血素(SLY)、具有所述溶血素全长或部分氨基酸序列的融合蛋白、所述溶血素全长或部分氨基酸序列与佐剂蛋白共轭连接的蛋白、所述溶血素全长或部分氨基酸序列与多糖的连接复合物或携带所述溶血素全长或部分编码基因的DNA表达载体。

上述疫苗中，所述分选酶A为如下(a1)或(a2)或(a3)：

(a1)由序列表中序列3自N末端第50至249位氨基酸残基组成的蛋白质；

(a2)将(a1)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同活性的由其衍生的蛋白质；

(a3)与序列3自N末端第50至249位所示的氨基酸序列具有75％或75％以上的同源性且具有相同功能的蛋白质；

所述具有所述分选酶A全长或部分氨基酸序列的融合蛋白为如下(a4)或(a5)或(a6)：

(a4)由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(a5)将(a4)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同活性的由其衍生的蛋白质；

(a6)与序列3所示的氨基酸序列具有75％或75％以上的同源性且具有相同功能的蛋白质；

所述表面相关枯草杆菌蛋白酶样蛋白酶为如下(b1)或(b2)或(b3)：

(b1)由序列表中序列6自N末端第41至852位氨基酸残基组成的蛋白质；

(b2)将(b1)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同活性的由其衍生的蛋白质；

(b3)与序列6自N末端第41至852位所示的氨基酸序列具有75％或75％以上的同源性且具有相同功能的蛋白质；

所述具有所述表面相关枯草杆菌蛋白酶样蛋白酶全长或部分氨基酸序列的融合蛋白为如下(b4)或(b5)或(b6)：

(b4)由序列表中序列6所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b5)将(b4)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同活性的由其衍生的蛋白质；

(b6)与序列6所示的氨基酸序列具有75％或75％以上的同源性且具有相同功能的蛋白质；

所述溶菌酶释放蛋白为如下(c1)或(c2)或(c3)：

(c1)由序列表中序列9自N末端第283至721位氨基酸残基组成的蛋白质；

(c2)将(c1)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同活性的由其衍生的蛋白质；

(c3)与序列9自N末端第283至721位所示的氨基酸序列具有75％或75％以上的同源性且具有相同功能的蛋白质；

所述具有所述溶菌酶释放蛋白全长或部分氨基酸序列的融合蛋白为如下(c4)或(c5)或(c6)：

(c4)由序列表中序列9所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(c5)将(c4)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同活性的由其衍生的蛋白质；

(c6)与序列9所示的氨基酸序列具有75％或75％以上的同源性且具有相同功能的蛋白质；

所述链球菌趋化因子蛋白酶为如下(d1)或(d2)或(d3)：

(d1)由序列表中序列12自N末端第36至535位氨基酸残基组成的蛋白质；

(d2)将(d1)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同活性的由其衍生的蛋白质；

(d3)与序列12自N末端第36至535位所示的氨基酸序列具有75％或75％以上的同源性且具有相同功能的蛋白质；

所述具有所述链球菌趋化因子蛋白酶全长或部分氨基酸序列的融合蛋白为如下(d4)或(d5)或(d6)：

(d4)由序列表中序列12所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(d5)将(d4)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同活性的由其衍生的蛋白质；

(d6)与序列12所示的氨基酸序列具有75％或75％以上的同源性且具有相同功能的蛋白质；

所述溶血素为如下(e1)或(e2)或(e3)：

(e1)由序列表中序列15自N末端第28至497位氨基酸残基组成的蛋白质；

(e2)将(e1)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同活性的由其衍生的蛋白质；

(e3)与序列15自N末端第28至497位所示的氨基酸序列具有75％或75％以上的同源性且具有相同功能的蛋白质；

所述具有所述溶血素全长或部分氨基酸序列的融合蛋白为如下(e4)或(e5)或(e6)：

(e4)由序列表中序列15所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(e5)将(e4)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同活性的由其衍生的蛋白质；

(e6)与序列15所示的氨基酸序列具有75％或75％以上的同源性且具有相同功能的蛋白质。

上述疫苗中，所述分选酶A、所述表面相关枯草杆菌蛋白酶样蛋白酶、所述溶菌酶释放蛋白、所述链球菌趋化因子蛋白酶和所述溶血素可为从链球菌中提取的分选酶A、表面相关枯草杆菌蛋白酶样蛋白酶、溶菌酶释放蛋白、链球菌趋化因子蛋白酶和溶血素；也可为大肠杆菌或酵母或哺乳动物细胞表达的分选酶A、表面相关枯草杆菌蛋白酶样蛋白酶、溶菌酶释放蛋白、链球菌趋化因子蛋白酶和溶血素。

进一步的，本发明的分选酶A、表面相关枯草杆菌蛋白酶样蛋白酶、溶菌酶释放蛋白、链球菌趋化因子蛋白酶和溶血素均为大肠杆菌表达的分选酶A重组蛋白、表面相关枯草杆菌蛋白酶样蛋白酶重组蛋白、溶菌酶释放蛋白重组蛋白、链球菌趋化因子蛋白酶重组蛋白和溶血素重组蛋白。

上述疫苗中，所述成分甲、所述成分乙、所述成分丙、所述成分丁和所述成分戊的质量比为1:1:1:1:1。

上述疫苗中，所述疫苗还包括免疫佐剂。进一步的，所述免疫佐剂可为粘膜免疫佐剂。更进一步的，所述粘膜免疫佐剂具体可为CpG。

上述疫苗中，所述成分甲、所述成分乙、所述成分丙、所述成分丁、所述成分戊和所述CpG的质量比为1:1:1:1:1:1。

上述疫苗中，所述疫苗的免疫方式可为鼻腔吸入、口服、皮下注射、皮内注射、生殖道注入或肛内注入；优选为鼻腔吸入。所述疫苗的免疫次数为3次，每次间隔一周。所述疫苗的免疫剂量为成分甲、成分乙、成分丙、成分丁、成分戊为10μg/次，免疫佐剂CpG为10μg/次。

本发明的另一个目的是提供上述疫苗的制备方法。

本发明提供的上述疫苗的制备方法包括将上述成分甲、成分乙、成分丙、成分丁、成分戊、免疫佐剂和缓冲液混匀的步骤。

上述方法中，所述缓冲液可为PBS缓冲液；所述免疫佐剂可为CpG。

上述方法中，所述成分甲、所述成分乙、所述成分丙、所述成分丁、所述成分戊、所述CpG和所述PBS缓冲液的配比为1μg:1μg:1μg:1μg:1μg:1μg:1μl。进一步的，本发明的疫苗是将10μg成分甲、10μg成分乙、10μg成分丙、10μg成分丁、10μg成分戊、10μg CpG和10μl PBS缓冲液混匀得到的。

本发明的最后一个目的是提供上述疫苗或上述方法制备的疫苗的新用途。

本发明提供了上述疫苗或上述方法制备的疫苗在如下(A1)-(A10)中任一种中的应用：

(A1)预防猪链球菌感染；

(A2)制备预防猪链球菌感染的产品；

(A3)预防猪链球菌导致的粘膜系统感染；

(A4)制备预防猪链球菌导致的粘膜系统感染的产品；

(A5)降低或防止猪链球菌在粘膜系统的定居和感染；

(A6)制备降低或防止猪链球菌在粘膜系统的定居和感染的产品；

(A7)提高Th17细胞活化水平；

(A8)制备提高Th17细胞活化水平的产品；

(A9)提高保护性抗体水平；

(A10)制备提高保护性抗体水平的产品。

上述应用中，所述猪链球菌可为不同血清型的猪链球菌，如猪链球菌2型和/或猪链球菌7型和/或猪链球菌3型和/或猪链球菌9型和/或猪链球菌1/2型。在本发明中，所述猪链球菌为猪链球菌2型和/或猪链球菌7型和/或猪链球菌3型。

上述应用中，所述保护性抗体为抗猪链球菌的IgG和分泌型IgA。

上述应用中，所述粘膜系统为猪粘膜系统；所述粘膜系统具体为呼吸系统、消化系统、泌尿系统、生殖系统或皮肤。

上述应用中，所述产品为药物。

本发明的有益效果：

1)本发明提供的多联重组蛋白疫苗所采用的抗原分选酶A和SSPA、MRP、SCPC、SLY在不同血清型的S.suis高度保守，同源性达90％以上，因此联合使用具有广谱的保护作用。

2)本发明提供的多联重组蛋白疫苗粘膜免疫后产生的免疫记忆Th17细胞能迅速迁移到感染的粘膜部位，在抗粘膜细菌感染中起重要作用。与B细胞提供的免疫不同，T细胞提供的免疫具有耐受抗原变异的特点，能提供对同种异型细菌的交叉免疫保护，是新型疫苗构建的理论基础。Th17细胞活化后释放的细胞因子IL-17激活中性粒细胞和巨噬细胞吞噬杀伤病原菌。分选酶A诱导以Th17细胞为主的免疫反应，清除感染部位的病原菌。

3)本发明提供的多联重组蛋白疫苗所采用的抗原SSPA、MRP、SCPC、SLY位于猪链球菌表面或分泌到胞外，粘膜免疫可诱导保护性抗体，从而对猪链球菌起到有效的保护作用，具有无组织损伤、无局部副作用和使用简便的特点，易于推广使用。

4)本发明提供的多联重组蛋白疫苗使用粘膜免疫佐剂CpG，可促进疫苗亚单位在粘膜部位被抗原加工细胞摄取，显著增强其免疫原性和免疫效果，同时避免肌肉或皮下免疫因佐剂会引起的局部组织反应。

本发明经过长期深入研究发现联合使用分选酶A和SSPA、MRP、SCPC和SLY制备的多联重组蛋白疫苗(以下简称V5)既可诱导Th17细胞的活化反应，又可诱导保护性抗体反应，从而对猪链球菌起到有效的保护作用。通过充分利用各种抗原在链球菌中的普遍性和同源性、粘膜途径免疫、粘膜免疫佐剂增强抗原免疫原性，显著提高了Th17细胞活化水平和保护性抗体水平，达到阻止病原菌定居和迅速清除病原菌的目的，并对致死剂量的不同血清型猪链球菌感染提供有效的保护作用，具有高效、广谱和低价的优越性。

附图说明

图1为制备过程中的聚丙烯酰胺凝胶电泳图。其中：SS2重组蛋白SrtA(Mw≈23kd)，SSPA(Mw≈88kd)，MRP(Mw≈48kd)，SCPC(Mw≈53kd)，SLY(Mw≈52kd)。

图2为V5免疫诱导小鼠产生对猪链球菌的Th17免疫记忆反应图。

图3为V5免疫诱导小鼠产生对猪链球菌的中和抗体反应图。

图4为V5免疫诱导小鼠产生的抗原特异性血清IgG反应。

图5为V5免疫诱导小鼠产生的抗原特异性分泌型IgA反应。

图6为V5免疫诱导小鼠产生对猪链球菌感染的交叉免疫保护图。

图7为V5免疫诱导小鼠产生对猪链球菌感染的致死保护图。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

猪链球菌2型A7：来源于华中农业大学牧医学院，参考文献：Hu,P.,Yang,M.,Zhang,A.,Wu,J.,Chen,B.,Hua,Y.,Yu,J.,Chen,H.,Xiao,J.,&Jin,M.2011.Comparativegenomics study of multi-drug-resistance mechanisms in the antibiotic-resistant Streptococcus suis R61strain.PLoS One,6(9):e24988。

猪链球菌2型SC19、3型SS3、7型SS7、9型SS9和1/2型SS1/2：来源于华中农业大学牧医学院，参考文献:Zhang A,Chen B,Mu X et al(2009)Identification andcharacterization of a novel protective antigen,Enolase of Streptococcus suisserotype 2.Vaccine 27:1348-1353,Chen L,Song Y,Wei Z et al(2013)Antimicrobialsusceptibility,tetracycline and erythromycin resistance genes,and multilocussequence typing of Streptococcus suis isolates from diseased pigs inChina.The Journal of veterinary medical science 75:583-587,Wei Z,Li R,Zhang Aet al(2009)Characterization of Streptococcus suis isolates from the diseasedpigs in China between 2003 and 2007.Vet Microbiol 137:196-201。

CpG：参考文献:Iho S,Maeyama J,Suzuki F.CpG oligodeoxynucleotides asmucosal adjuvants.Hum Vaccin Immunother.2015；11(3):755-60。

PBS缓冲液：0.01mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)：氯化钠(NaCl)2g，磷酸二氢钾(KH₂PO₄)0.24g，磷酸二氢钠(NaH₂PO₄)1.44g，氯化钾(KCl)0.2g，定容至l000ml，调PH值为7.2-7.4，高温高压灭菌后备用。

载体pET28a(+)：Novagen公司，Cat.No.69846-3。大肠杆菌BL21gold(DE3)plysS：购自北京康为试剂生物技术有限公司，产品编号:CW0810A。C57BL/6JCnc(B6)小鼠：购自北京维通利华实验动物有限公司；品系代码：219。

实施例1、多联重组蛋白疫苗V5的制备

(一)重组蛋白的制备

一、分选酶A(SrtA)的制备

1、以猪链球菌2型(A7)的基因组DNA为模板，用F1和R1组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

F1：5’-CATGCCATGGCCAGCAATGTTACGACAGA-3’；

R1：5’-CCGCTCGAGTTGTCCATAATCATACTGAT-3’。

2、用限制性内切酶NcoI和XhoI，双酶切步骤1的PCR扩增产物，回收酶切产物。

3、用限制性内切酶NcoI和XhoI，双酶切载体pET28a(+)，回收约5400bp的载体骨架。

4、将步骤2的酶切产物和步骤3的载体骨架连接，得到重组质粒pET28a-SrtA。根据测序结果，对重组质粒pET28a-SrtA进行结果描述如下：在载体pET28a(+)的NcoI和XhoI酶切位点之间插入了序列表的序列1自5’末端第151-747位核苷酸所示的双链DNA分子。插入的双链DNA分子与载体骨架上的部分DNA形成序列表的序列2所示的融合基因，表达序列表的序列3所示的融合蛋白。

5、将重组质粒pET28a-SrtA导入大肠杆菌BL21gold(DE3)plysS，得到重组菌。

6、将步骤5得到的重组菌接种于含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基，37℃、220rpm振荡培养至OD_560nm＝0.6时加入IPTG诱导并使其浓度为40μg/mL，16℃、150rpm振荡培养过夜。

7、取步骤6的培养体系，4℃、6000rpm离心10分钟收集菌体沉淀，用pH8.0的Tris缓冲液(含300mM NaCl)悬浮菌体沉淀并进行超声破碎(功率为200W，每工作4秒间歇8秒，循环99次)，然后12000rpm离心20分钟，收集上清液。

8、将步骤7得到的上清液上样于GE公司Ni Sepharose 6 Fast Flow，先用5个柱体积Tris缓冲液平衡柱子，然后用含20、50、100、300mM咪唑的Tris缓冲液进行5个柱体积的洗脱以获得目的蛋白，收集采用含100mM咪唑Tris缓冲液洗脱时的过柱后溶液，将其命名为SrtA蛋白。SrtA蛋白的SDS-PAGE检测结果如图1所示。每升步骤6的培养体系可获得90％纯度以上的SrtA蛋白40毫克。

二、SSPA的制备

1、以猪链球菌2型(A7)的基因组DNA为模板，用F1和R1组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

F1：5′-CATGCATATGGATACTAGTGGAGAAGGATT-3′；

R1：5′-CATGCTCGAGAAAATAAGGTATGCTGAT-3′。

2、使用PCR的方法进行点突变将活性中心的Asp255和Ser651突变为Ala，以获得保留免疫原性但失去催化活性的SSPA，分别使用如下引物进行点突变：

Asp-Ala(255)：

F1：5′-GGTGATTGCAGTCATTGCCTCCGGTTTGGATATTA-3′；

R1：5′-TAATATCCAAACCGGAGGCAATGACTGCAATCACC-3′；

Ser-Ala(651)：

F1：5′-CTCCATGTCAGGGACTGCGATGGCTTCGCCAATTG-3′；

R1：5′-CAATTGGCGAAGCCATCGCAGTCCCTGACATGGAG-3′。

3、用限制性内切酶NdeI和XhoI双酶切步骤1的PCR扩增产物，回收酶切产物。

4、用限制性内切酶NdeI和XhoI双酶切载体Pet30a(+)。

5、将步骤3的酶切产物和步骤4的载体骨架连接，得到重组质粒pET30a-SSPA。根据测序结果，对重组质粒pET30a-SSPA进行结果描述如下：在载体Pet30a(+)的NdeI和XhoI酶切位点之间插入了序列表的序列4自5’末端第121-2256位核苷酸所示的双链DNA分子。插入的双链DNA分子与载体骨架上的部分DNA形成序列表的序列5所示的融合基因，表达序列表的序列6所示的融合蛋白。

6、将重组质粒pET30a-SSPA导入大肠杆菌BL21gold(DE3)plysS，得到重组菌。

7、将步骤5得到的重组菌接种于含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基，37℃、220rpm振荡约3h培养至OD_560nm＝0.6时加入IPTG诱导并使其浓度为40μg/mL，16℃、150rpm振荡培养过夜。

8、取步骤7的培养体系，4℃、6000rpm离心10分钟收集菌体沉淀，用pH8.0的Tris缓冲液(含300mM NaCl)悬浮菌体沉淀并进行超声破碎(功率为200W，每工作4秒间歇8秒，循环99次)，然后12000rpm离心20分钟，收集上清液。。

9、将步骤8得到的上清液上样于Ni Sepharose 6Fast Flow，先用5个柱体积Tris缓冲液平衡柱子，然后用含25mM咪唑的Tris缓冲液进行5个柱体积的洗杂，再用含300mM咪唑的Tris缓冲液洗脱以获得目的蛋白，浓缩后获得蛋白将其命名为SSPA蛋白。SSPA蛋白的SDS-PAGE检测结果如图1所示。每升步骤7的培养体系可获得90％纯度以上的SSPA蛋白30毫克。

三、MRP的制备

1、以猪链球菌2型(A7)的基因组DNA为模板，用F1和R1组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

F1：5’-GGAATTCATATGGATGATAGAGCCTCAGGAGAAACGAA-3’；

R1：5’-ACGCGGATCCCTATCTTTGAGTACTTTCATCAACATCAGA-3’。

2、用限制性内切酶NcoI和XhoI，双酶切步骤1的PCR扩增产物，回收酶切产物。

3、用限制性内切酶NcoI和XhoI，双酶切载体pET28a(+)，回收约5400bp的载体骨架。

4、将步骤2的酶切产物和步骤3的载体骨架连接，得到重组质粒pET28a-MRP。根据测序结果，对重组质粒pET28a-MRP进行结果描述如下：在载体pET28a(+)的NcoI和XhoI酶切位点之间插入了序列表的序列7自5’末端第847-2163位核苷酸所示的双链DNA分子。插入的双链DNA分子与载体骨架上的部分DNA形成序列表的序列8所示的融合基因，表达序列表的序列9所示的融合蛋白。

5、将重组质粒pET28a-MRP导入大肠杆菌BL21gold(DE3)plysS，得到重组菌。

6、将步骤5得到的重组菌接种于含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基，37℃、220rpm振荡培养至OD_560nm＝0.6时加入IPTG诱导并使其浓度为40μg/mL，16℃、150rpm振荡培养过夜。

7、取步骤6的培养体系，4℃、6000rpm离心10分钟收集菌体沉淀，用pH8.0的Tris缓冲液(含300mM NaCl)悬浮菌体沉淀并进行超声破碎(功率为200W，每工作4秒间歇8秒，循环99次)，然后12000rpm离心20分钟，收集上清液。

8、将步骤7得到的上清液上样于GE公司Ni Sepharose 6Fast Flow，先用5个柱体积Tris缓冲液平衡柱子，然后用含20mM咪唑的Tris缓冲液进行5个柱体积的洗杂，再用含300mM咪唑的Tris缓冲液洗脱以获得目的蛋白，浓缩后获得蛋白将其命名为MRP蛋白。MRP蛋白的SDS-PAGE检测结果如图1所示。每升步骤6的培养体系可获得90％纯度以上的MRP蛋白300毫克。

四、SCPC的制备

1、以猪链球菌2型(A7)的基因组DNA为模板，用F1和R1组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

F1：5’-CATGCCATGGCCGATGAATTGACAAGCCTTGT-3’；

R1：5’-CATGCTCGAGTAGACCCCAACTTGAAAAAT-3’。

2、用限制性内切酶NcoI和XhoI双酶切步骤1的PCR扩增产物，回收酶切产物。

3、用限制性内切酶NcoI和XhoI双酶切载体pET28a(+)，回收约5400bp的载体骨架。

4、将步骤2的酶切产物和步骤3的载体骨架连接，得到重组质粒pET28a-SCPC。测序结果，对重组质粒pET28a-SCPC进行结果描述如下：在载体pET28a(+)的NcoI和XhoI酶切位点之间插入了序列表10的序列自5’末端第106-1605位核苷酸所示的双链DNA分子。插入的双链DNA分子与载体骨架上的部分DNA形成序列表的序列11所示的融合基因，表达序列表的序列12所示的融合蛋白

5、将重组质粒pET28a-SCPC导入大肠杆菌BL21gold(DE3)plysS，得到重组菌。

6、将步骤5得到的重组菌接种于含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基，37℃、220rpm振荡培养至OD_560nm＝0.6时加入IPTG诱导并使其浓度为40μg/mL，16℃、150rpm振荡培养过夜。

7、取步骤6的培养体系，4℃、6000rpm离心10分钟收集菌体沉淀，用pH8.0的Tris缓冲液(含300mM NaCl)悬浮菌体沉淀并进行超声破碎(功率为200W，每工作4秒间歇8秒，循环99次)，然后12000rpm离心20分钟，收集上清液。

8、将步骤7得到的上清液上样于GE公司Ni Sepharose 6Fast Flow，先用5个柱体积Tris缓冲液平衡柱子，然后用含25mM咪唑的Tris缓冲液进行5个柱体积的洗杂，再用含100mM咪唑的Tris缓冲液洗脱以获得目的蛋白，浓缩后获得蛋白将其命名为SCPC蛋白。SCPC蛋白的SDS-PAGE检测结果如图1所示。每升步骤6的培养体系可获得90％纯度以上的SCPC蛋白50毫克。

五、SLY的制备

1、以猪链球菌2型(A7)的基因组DNA为模板，用F1和R1组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

F1：5′-CATGCCATGGCCGATTCCAAACAAGATATTAATCAGT-3′；

R1：5′-CATGCTCGAGCTCTATCACCTCATCCGCATACT-3′。

2、使用PCR的方法进行点突变将活性中心的P353突变为V，以获得保留免疫原性但失去活性的SLY，分别使用如下引物进行点突变：

P353V：

F1：5′-AAGATACGGAAAACTCAATGTAGGTGTTCCGATTTCGTATTC-3′；

R1：5′-GAATACGAAATCGGAACACCTACATTGAGTTTTCCGTATCTT-3′。

3、用限制性内切酶NcoI和XhoI双酶切步骤1的PCR扩增产物，回收酶切产物。

4、用限制性内切酶NcoI和XhoI双酶切载体pET28a(+),回收约5400bp的载体骨架。

5、将步骤3的酶切产物和步骤4的载体骨架连接，在载体pET28a(+)的NcoI和XhoI酶切位点之间插入了序列表13的序列自5’末端第82-1491位核苷酸所示的双链DNA分子，得到重组质粒pET28a-SLY。插入的双链DNA分子与载体骨架上的部分DNA形成序列表的序列14所示的融合基因，表达序列表的序列15所示的融合蛋白。

6、将重组质粒pET28a-SLY导入大肠杆菌BL21gold(DE3)plysS，得到重组菌。

7、将步骤6得到的重组菌接种于含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基，37℃、220rpm振荡培养至OD_560nm＝0.6时加入IPTG诱导并使其浓度为40μg/mL，16℃、150rpm振荡培养过夜。

8、取步骤7的培养体系，4℃、6000rpm离心10分钟收集菌体沉淀，用pH8.0的Tris缓冲液(含300mM NaCl)悬浮菌体沉淀并进行超声破碎(功率为200W，每工作4秒间歇8秒，循环99次)，然后12000rpm离心20分钟，收集上清液。

9、将步骤8得到的上清液上样于Ni Sepharose 6Fast Flow，先用5个柱体积Tris缓冲液平衡柱子，然后用含25mM咪唑的Tris缓冲液进行5个柱体积的洗杂，再用含300mM咪唑的Tris缓冲液洗脱以获得目的蛋白，浓缩后获得蛋白将其命名为SLY蛋白。SLY蛋白的SDS-PAGE检测结果如图1所示。每升步骤7的培养体系可获得90％纯度以上的SLY蛋白200毫克。

(二)多联重组蛋白疫苗V5的制备

将步骤(一)制备的SrtA蛋白、SSPA蛋白、MRP蛋白、SCPC蛋白、SLY蛋白、CpG与缓冲液混匀，得到多联重组蛋白疫苗，将其命名为V5。

实施例2、鼻腔免疫V5诱导Th17细胞反应

将4周龄的雌性C57BL/6J小鼠随机分为三组，分组处理如下：

PBS组：实验第0天、第7天和第14天分别经鼻腔滴入PBS缓冲液10μl，每只小鼠每次给予10μl。

V5组：实验第0天、第7天和第14天分别经鼻腔滴入V5疫苗液，每只小鼠每次给予V5疫苗液(V5疫苗液是将5种重组蛋白各10μg、10μg CpG和10μl PBS缓冲液混匀得到的)。

KQ组：实验第0天、第7天和第14天分别经肌肉注射市售科前灭活疫苗(简称KQ)，菌液的浓度为1.5×10⁸CFU/100μl，每只小鼠注射100μl(两腿单侧各50μl)。

实验第19天，处死小鼠，取鼻相关淋巴组织(Nasal Associated LymphoidTissue，简称NALT)流式细胞术检测Th17细胞(CD4+，CD3+，IL-17A+的淋巴细胞)，取脾脏细胞ELISot检测分泌IL-17A的细胞。

结果见图2。流式细胞术结果显示，与PBS组和KQ组相比，V5组显著诱导NALT中Th17细胞的比例，表明V5鼻腔免疫小鼠诱导Th17细胞的反应；ELISPot结果表明诱导的Th17是抗原特异性的。

实施例3、V5免疫诱导小鼠产生的抗体反应

将4周龄的雌性C57BL/6小鼠随机分为三组，分组处理如下：

PBS滴鼻组：实验第0天、第7天和第14天分别经鼻腔滴入PBS缓冲液，每只小鼠每次给予10μl。

V5组：实验第0天、第7天和第14天分别经鼻腔滴入V5疫苗液，每只小鼠每次给予V5疫苗液(V5疫苗液是将5种重组蛋白各10μg、10μg CpG和10μl PBS缓冲液混匀得到的)。

KQ组：实验第0天、第7天和第14天分别经肌肉注射市售科前灭活疫苗(简称KQ)，菌液的浓度为1.5×10⁸CFU/100μl，每只小鼠注射100μl(两腿单侧各50μl)。

实验第24天，处死小鼠，ELISA检测血清IgG和NALT匀浆上清中IgA。

结果表明：V5免疫诱导小鼠产生抗体反应。与PBS组相比，V5组显著诱导产生抗猪链球菌的IgG和分泌型IgA(抗不同血清型猪链球菌的血清IgG，抗不同血清型的分泌型IgA)，结果见图3。与PBS组相比，V5组显著诱导产生抗原特异性血清IgG，KQ组仅诱导抗MRP特异性IgG抗体，结果见图4。与PBS组和KQ组相比，V5组显著诱导产生抗原特异性分泌型IgA，结果见图5。

实施例4、V5免疫诱导小鼠产生对猪链球菌黏膜感染的交叉免疫保护

将4周龄的雌性C57BL/6J小鼠随机分为三组，分组处理如下：

PBS滴鼻组：实验第0天、第7天和第14天分别经鼻腔滴入PBS缓冲液，每只小鼠每次给予10μl。

V5组：实验第0天、第7天和第14天分别经鼻腔滴入V5疫苗液，每只小鼠每次给予V5疫苗液(V5疫苗液是将5种重组蛋白各10μg、10μg CpG和10μl PBS缓冲液混匀得到的)。

KQ组：实验第0天、第7天和第14天分别经肌肉注射KQ疫苗，菌液的浓度为1.5×10⁸CFU/100μl，每只小鼠注射100μl(两腿单侧各50μl)。

实验第24天，用含1％乙酸的PBS处理小鼠鼻腔1小时(乙酸PH＝4，每只小鼠滴注10μl)，之后用活菌菌液通过鼻腔滴注对小鼠进行攻毒(菌液的浓度:猪链球菌2型SS2为(2-3)×10⁹CFU/10μl，猪链球菌7型SS7为1×10⁹CFU/10μl，猪链球菌3型SS3为3×10⁹CFU/10μl，每只小鼠滴注10μl)，攻毒24小时后处死小鼠，分离NALT制成单细胞悬液，用血平板培养检测NALT中的猪链球菌活菌数。

结果见图6，每个黑点代表1只小鼠(纵坐标指的是每只小鼠的整个NALT中猪链球菌的CFU数量)。猪链球菌攻击后，V5组小鼠NALT中的活菌数显著低于PBS组，KQ疫苗组与PBS组无差异，表明本发明提供的疫苗经呼吸道粘膜免疫能有效地清除感染部位的猪链球菌。

实施例5、V5免疫诱导小鼠产生对猪链球菌感染的免疫保护

将4周龄的雌性C57BL/6J小鼠随机分为三组，每组10只，分组处理如下：

PBS滴鼻组：实验第0天、第7天和第14天分别经鼻腔滴入PBS缓冲液，每只小鼠每次给予10μl。

V5组：实验第0天、第7天和第14天分别经鼻腔滴入V5疫苗液，每只小鼠每次给予V5疫苗液(V5疫苗液是将5种重组蛋白各10μg、10μg CpG和10μl PBS缓冲液混匀得到的)。

KQ组：实验第0天、第7天和第14天分别经肌肉注射KQ疫苗，菌液的浓度为1.5×10⁸CFU/100μl，每只小鼠注射100μl(两腿单侧各50μl)。

实验第24天，用猪链球菌2型SC19活菌通过尾静脉注射对小鼠(菌液浓度：高剂量6×10⁹CFU/100μl，低剂量4×10⁹CFU/100μl)进行致死剂量攻毒，攻毒后观察10天小鼠存活情况。

结果见图7。与PBS组相比，V5组显著提高了小鼠的生存率；同时，相比KQ组，V5没有出现神经症状，表明V5免疫诱导小鼠产生对猪链球菌感染的免疫保护。

序列表

<110>中国科学院微生物研究所

<120>一种预防猪链球菌感染的广谱多联亚单位疫苗

<160>15

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>750

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>1

atgtcaaaac gtgaaaaaaa gaagaagcgt aaaggctctt tttggcgcaa ttttttaaca 60

gttgtattga tactgatttc cttggcattg atatttaata cctctatccg taattttatt 120

atcggctgga atacgaataa ataccagatt agcaatgtta cgacagagga tatcgaaaag 180

aataaacagg ctgaaacaac atttgatttc gatcaggttc agtctatttc tacagaggct 240

attttagcag ctcagtggga tgcacaacgc ttacctgtaa ttggtgggat tgcggttccc 300

gagcttggta tcaaccttcc tatttttaaa ggggtcttca atacttcgct catgtatgga 360

gctggtacca tgaaggaaaa ccaagagatg gggaaaggaa attatgcgtt ggccagccac 420

catatttttg gtgtaactgg tgcggcagat gttctctttt caccgcttga tcgtgctaaa 480

aacggcatga aaatctatat tactgacaag accaatgttt acacctacgt tattgatagt 540

gtggaaattg tttcgcctga aagtgtctat gtcattgatg atgtagaagg acgtacagaa 600

gttacgttag tgacatgtac ggactattat gctacgcaac gtattgttgt aaaaggagtt 660

cttgaatcaa ccactccata taatgaaacg gcaaaagaca tcttagattc cttcaataag 720

agttataatc agtatgatta tggacaataa 750

<210>2

<211>627

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>2

atggccagca atgttacgac agaggatatc gaaaagaata aacaggctga aacaacattt 60

gatttcgatc aggttcagtc tatttctaca gaggctattt tagcagctca gtgggatgca 120

caacgcttac ctgtaattgg tgggattgcg gttcccgagc ttggtatcaa ccttcctatt 180

tttaaagggg tcttcaatac ttcgctcatg tatggagctg gtaccatgaa ggaaaaccaa 240

gagatgggga aaggaaatta tgcgttggcc agccaccata tttttggtgt aactggtgcg 300

gcagatgttc tcttttcacc gcttgatcgt gctaaaaacg gcatgaaaat ctatattact 360

gacaagacca atgtttacac ctacgttatt gatagtgtgg aaattgtttc gcctgaaagt 420

gtctatgtca ttgatgatgt agaaggacgt acagaagtta cgttagtgac atgtacggac 480

tattatgcta cgcaacgtat tgttgtaaaa ggagttcttg aatcaaccac tccatataat 540

gaaacggcaa aagacatctt agattccttc aataagagtt ataatcagta tgattatgga 600

caactcgagc accaccacca ccaccac 627

<210>3

<211>209

<212>PRT

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>3

Met Ala Ser Asn Val Thr Thr Glu Asp Ile Glu Lys Asn Lys Gln Ala

1 5 10 15

Glu Thr Thr Phe Asp Phe Glu Gln Val Gln Ser Ile Ser Thr Glu Ala

20 25 30

Ile Leu Ala Ala Gln Trp Asp Ala Gln Arg Leu Pro Val Ile Gly Gly

35 40 45

Ile Ala Val Pro Glu Leu Gly Ile Asn Leu Pro Ile Phe Lys Gly Val

50 55 60

Phe Asn Thr Ser Leu Met Tyr Gly Ala Gly Thr Met Lys Glu Asn Gln

65 70 75 80

Glu Met Gly Lys Gly Asn Tyr Ala Leu Ala Ser His His Ile Phe Gly

85 90 95

Val Thr Gly Ala Ala Asp Val Leu Phe Ser Pro Leu Asp Arg Ala Lys

100 105 110

Asn Gly Met Lys Ile Tyr Ile Thr Asp Lys Thr Asn Val Tyr Thr Tyr

115 120 125

Val Ile Asp Ser Val Glu Ile Val Ser Pro Glu Ser Val Tyr Val Ile

130 135 140

Asp Asp Val Glu Gly Arg Thr Glu Val Thr Leu Val Thr Cys Thr Asp

145 150 155 160

Tyr Tyr Ala Thr Gln Arg Ile Val Val Lys Gly Val Leu Glu Ser Thr

165 170 175

Thr Pro Tyr Asn Glu Thr Ala Lys Asp Ile Leu Asp Ser Phe Asn Lys

180 185 190

Ser Tyr Asn Gln Tyr Asp Tyr Gly Gln Leu Glu His His His His His

195 200 205

His

<210>4

<211>5079

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>4

atgaaacaga agtggtctca gattgagaat aaacaacgct ttagtatcaa gaagttaagt 60

gtcggtgtgg catcggtatc aataggattt tttatcacgg gtgttccgat ggttcaagca 120

gatactagtg gagaaggatt ggagtctaca gttgcggtcg caacagatat ggatagtagg 180

caaaattctg cggtagagaa aatagaagat ggaccattat cagatgatcc agttaaaacg 240

gagcaggtgg atgaaccagt tgctgaagag ggagtggtcg aagaagttgt agatacagag 300

gcgggtgaag aatcaggtct tctcacagat caagctgcga ccgagataga aactacagct 360

ggtaagacaa cagatgagtc aaaggaaaaa gaagacatta gcggaaaaga agctagtgct 420

cctcaaacaa tcccgcagga atcacagctt gagccagaag aggtgacaac agggcgctat 480

attttacaat tttccgaaga gaaccgaaat cttgtattgg ataaattaaa gaaaattgat 540

ggcgttaaaa ttgttcatga gtataaggag gttttaacgg gagcatcagt agaggtaggg 600

aaagaaagtt tgtctgatgt gaaggcaatt accgaattaa cctctttaga agagagtcgc 660

cgtatccgac cgactcttca tactgctaaa cagctggttg gtgccttaaa agcaagttct 720

aaatatcaga cagatggtcg cggaatggtg attgcagtca ttgactccgg tttggatatt 780

aagcacaaag acatgaggtt ggatgatggt gtcattccta aaattaagga cattactcca 840

tctacgacag ggacatacac attgaaagtt ccccatggct ataattatgt atctggcaac 900

gataatctct acgatgatac ccacgaacca catggtatgc acatagcagg aactctggct 960

ggaaatgcaa cagacgaaga agttgcgtct aaaaagggag ttgatgggat tgctcccaac 1020

gcacaactgc tagtctacaa gattttttca aatgacccta aaaattataa agctgagacg 1080

gaggatgctg cttatgctgc tattgaagat gctatcaaac acggggcaga tgtcatcagc 1140

ttgagtgttg gttattatga tagcgggcta ccagggaatg cttactacac gattgctaag 1200

agggcagcag aaaagggaat tatcattaca gcggctattg gtaatgctgg tgcctcctct 1260

tcagacacct cctttgacct gcatacaaat aatgccttag gagctgtgga tacggcaaca 1320

acagttggtg tagcagcgac tcccgcagtt atcgcggttg gttcggcgag aaatacccat 1380

cttgttcaac gagaatttat gctgaatgga cagtcttttg gttactatcc tattggctat 1440

acaacgctta cagagggaaa atatgaattt gtagatgctg gaaatggtca ttgggaagaa 1500

gtgcaagggc ttgatttggc tggtaaagta gcggttatca aaaaagataa gtttgacttg 1560

aaagatgctg ttcgtaattt gaaattcaag gatgttgctg gaattattgt gataaatact 1620

gatcagggat ggaacaagga ttattatagg acccatcagt tgttggtaga tgataagact 1680

ttgctttcct actcctctat ctggggaatt agtcttagcg gggaagatgg aaggcgatta 1740

ttagaagttg ccaaccaatc gcaaggcaac actggtttgg ttcttaaacc tacaattgga 1800

atgaagaagt tgattgaagt gccgactgta tcaggctttt ctagttgggg acctacggtc 1860

aacttagaat tgaagccaga gattgtggcg ccgggagagg atgtttatgc aaccttgaat 1920

gacaatcgtt atggctccat gtcagggact tcgatggctt cgccaattgt ggcgggtgcc 1980

agcgcacttt tattgccacg gattcgccaa atgacaccac cagaaggcat gactaggatg 2040

gatttgctga gaatcatttt gatgaatact gctacccctt tggttgatgt tctagattca 2100

tctgggcatg ctttggaaaa ttctccgaga caacaaggtg ctggtctgtt gcagattgat 2160

agagcctttg aaacagatgt gattcttcac caccgtctaa aaggaggggt ggaattaaaa 2220

gaaatagggc gtgagacaga atttgaggta accttggaaa atctgggaaa ccaacaaaga 2280

agctttgcta tttcagctgg gaaagtgttg actagtcaag atgttcctgt tgatagaata 2340

ggacgttctg gaaaagtagt taaagagatt catgcgacag aaatcaaggg gtcgagtatt 2400

catctttctg agcaatccat tcaactaggt ccaaaagaga agagaaccat tcgcctgaaa 2460

ttggatgcag gagaagcgaa agaccagttt gcagaagggt atatttactt caaatcattg 2520

acggaggggc agtctgacat cagcatacct tattttggct ttgttggtga ctggtcaaaa 2580

gaaaggattg ttgatgcacc ggcttgggaa accagttcta aattgaaact gacctcagtt 2640

ttatctagct ataaacacaa taagtctggg cgctatattg aacttgggcg tgaaaagatt 2700

caagataatc aatcgcctct caatccagac aatatcgcaa ttcaaaacca gcattcggac 2760

agtcagattg ggaatgcctt tgttcgattt gcgctattga gggatattac caactatgat 2820

ttggatattg taaaagaagc tacagaagat gctcctgttt taaggcgaat tgatacagga 2880

accatgctgt ctcgtgttcg ctatgtagat tattttgaaa gtctatcgga gtattccaag 2940

cttcgtactc cgatagaatt gcaccgttgg gatgggaaag tgtacgatgc aagcaatgat 3000

gaaaatatac cagcaccgga aggacaatat ttctttagat tgcgggtaaa aaataaagaa 3060

aatggggcct atcagtatac ctatctgcca gtcaaaattg ataatcaaaa gccagagatt 3120

gtcgcgattg ataccaatcg tctatccagc catagagaac tggtcgtcac agccaaggat 3180

aataataaag tttgggaggt tcgagctaat ctaaatggag aagatcttct tgttgaaaag 3240

gttgtagatg atgcaggtca actacattac catctcaaag aagtggaact gccactcgat 3300

gctaaaaatc atctccgtgt tgaggtgatg gatatagcgg gtaatgtggt tgctgttgaa 3360

aaagatttga tggcgcctgt aatccagttt aaaaatttgg aagatttgat ggcaattcgc 3420

agtaagaaaa ctgtagaaat taaagcgaac gtctcagcgc aagtttccga tgtacaggct 3480

aacttggatg ctcaggctgt gaattactct cttgagaatg gtcaactatc tctccagatt 3540

ccagagcaat cagatggacg tcatagtttt gaattaatct tgaaagataa ggatggcaac 3600

cttatttaca ctaaaacctt gaattatttg gtagataatg aaaagccgac gattgatctt 3660

gatattgaaa aagatgaaga ggatgaagag gttatccaga ttggtaaaaa tgggcgtttt 3720

acattgaaag ggaaagtgag tgataatgtt agtcttccta aggacatcaa actttactat 3780

tccaatctag acattggtaa gggagagcgg aaaatcatag atgtaaaaga agacggcagt 3840

tttgagcaag acttctttaa atctgatttt cctagagcca tcatgttaac tgcggtagat 3900

gagaagggaa ataaattaaa ggaccttcgt atcaatacaa gtccagagag tctggatgag 3960

gaggaggaaa cagaagttcc gattactgtc aataactggc tgattgaccc aattcgtttc 4020

aataaagaaa gtcttggtcg tgagctagat agcgggttgg tcgacttcaa aaagcaagaa 4080

gatgggactt atctatttac atttgaaata gaagcagaaa ccgaacaagc tcattctgtg 4140

cgcatcaatg gtggtgaaaa acgctatttt gaggatggga agttgaccta tccagttact 4200

ctgattgaag agggaaatgt tgtggatata agtgtgtaca atgaggcaga tgagttgact 4260

tacacgaaga aatatcagat gttggttgat acagaaaacc ctgttttaca gctggaaaat 4320

gaggtgctac cattggaaag acaggtagtg gatagtgaag aagatgaaga cgaggaaaat 4380

cagtatgcag gagtcctcct ggcagatgct gatgggcact tgacacttac cggaagcgcc 4440

aaggataatg gaatttattg gtccttgaag atcaacgaag attttgtagc tcgaggaggc 4500

ttctggaggc agtatggaaa taatgaaaaa gcctttcgct atgagctaca tagtctgaaa 4560

gacggggata cagtcaaact tgatttgagt gacagttttg gaaatgctgt tgtgaagaaa 4620

tataaggtac ggttaaatga caaggaagta tctgagcagg ttcctgaaaa agaccttcat 4680

gtggagcgat cagataagga tcaaacccct agcattccta ttctgaaatc ggaagcgcat 4740

ataccaatgc caaaagaaga gaattcactt gctccgcaaa caggatccac tgaaatcgcg 4800

ctgttaactg gcgatacaag agaagatggt gtggagcatt tggggaaact tacaaaacat 4860

gaggagccac taggaatttc tgacgagaga atagaagtgt ccgtacctca cagagaattc 4920

tttgaaagaa gcggaatagg agagacaggt gcattagcgg cggatactag tgggaaactg 4980

cctcaaactg gggatagcct gggaagtgtc tttataagta ctttgttagg tctatttggt 5040

ggagctatgg ccctcggaaa tttgaagcga aaagaatag 5079

<210>5

<211>2463

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>5

atggatacta gtggagaagg attggagtct acagttgcgg tcgcaacaga tatggatagt 60

aggcaaaatt ctgcggtaga gaaaatagaa gatggaccat tatcagatga tccagttaaa 120

acggagcagg tggatgaacc agttgctgaa gagggagtgg tcgaagaagt tgtagataca 180

gaggcgggtg aagaatcagg tcttctcaca gatcaagctg cgaccgagat agaaactaca 240

gctggtaaga caacagatga gtcaaaggaa aaagaagaca ttagcggaaa agaagctagt 300

gctcctcaaa caatcccgca ggaatcacag cttgagccag aagaggtgac aacagggcgc 360

tatattttac aattttccga agagaaccga aatcttgtat tggataaatt aaagaaaatt 420

gatggcgtta aaattgttca tgagtataag gaggttttaa cgggagcatc agtagaggta 480

gggaaagaaa gtttgtctga tgtgaaggca attaccgaat taacctcttt agaagagagt 540

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tacgttggtt tccgtgggga attccaaaat ctagccgttc tagaagagcc gatttacaat 2340

cttattgccg atggtaaggg gggcttctac tttgaacctg ttacagcaca accagatact 2400

gttgacatca gccatcacta cacaggtctt gttacaggaa gtacggagtt aatctattct 2460

acagacaaac gatctgactt tgcgatcaag acacttggta catttaaaaa tgaagcagga 2520

tattttgttt tagagcttga tgagtctggt aagcctcatt tagctatctc gccaaatggg 2580

gatgacaacc aagattcgct cgctttcaaa ggtgtcttct tgagaaatta tacggattta 2640

gtcgcaagcg tctatgctgc agatgatacc gaacgaacaa atccactttg ggaaagtcaa 2700

ccacagtcag gcaataagaa cttctatagt ggtgatccta aaaatccaaa atcaagcatt 2760

atttacccta ctgaatggaa tgggacagac agcgagggaa atgctttagc agatggtaag 2820

tatcaatacg ttttgaccta ctcatctgaa gttccaggtg cagcagtaca aactatgatt 2880

ttcgacgtta tcatcgatag agaatcacca gttatcacca cagctaccta tgatgaaaca 2940

aactttacat ttaaccctcg tccagccatt gaaaaaggag aatccgggct atatcgcgag 3000

caagtattct atcttgtagc agatgcaagc ggtatgacaa ctattccttc cttattagaa 3060

aatggtgatg taaccgtttc tgataacaag gtatttgtgg cacaaaacga cgatggctcc 3120

tttacattgc ctcttgacct tgcagatatt tcaaaattct actacacagt agaggattat 3180

gctggtaaca tcagctatga aaaagtagag aatctgatca gtatcggcaa tgaaaaaggg 3240

ttggtaactg tcaatattct tgataaagat acaaatagtc ctgtaccaat acttttctct 3300

tactcagtca cagatgaaac aggcaagatt gttgcagaat taccacgata tgccggcgat 3360

actagcgttc ttaagctacc atttggtact tacacctttg atttattctt atatgataca 3420

gaatggtcaa gcctagcagg tgaaacaaaa gcagtcgtga cgatttcgga agaaaatagc 3480

actgccgagg tgaatttcta tgtgactttg aaagataagg ccaacttgct ggtagatatt 3540

gatgcattac taccttctgg ttcaaccatc caactggtaa ctgctgatgg ccagactatt 3600

cagctaccaa atgctaaata ttctaagacc gattatggta aatttgtacc agttggtacc 3660

tacactatcc ttccaaccct cccagaaggc tatgaatttt tggaagaatt agacgtagca 3720

gtacttgcaa accagtcaaa tgttaagaaa ttaaccttga ttaataaagt tgctttgaaa 3780

gaactgattg ctgaacttgc gggacttgaa gaaacagcgc gttattacaa tgctagtcca 3840

gaacttcaaa ctgcctatga taaagcatta gaagatgcca atgcagtata tgccaacaaa 3900

cacaatcagg cacaagtaga ttcagcagtt gccagtcttg tggcggcgag agaacagcta 3960

aacggtcagg ctaccgatac ggaaaaacta attgctgaag tatcaaacta cacaccgact 4020

caggcaaact ttatttatta caatgctgaa aataccaaac aaattgccta tgatacagct 4080

gttcgttcag cacaacttgt attgaaccaa gagaatgtaa cacaggcagt tgtcaaccaa 4140

gcgttggcgg acttgttagc ggcgaaagcc aacttagatg gtcaaaagac tgatatttca 4200

gcccttcgta gcgcagtatc cgtttcttcc gtattaaaag cgacagatgc taagtatctc 4260

aatgcatctg aaaacgtgaa acaagcttat gaccaggcag ttgaagcagc gaaagcgatt 4320

ctagctgatg aatctgcaag ccaagcaagt gtcgatcaag ctctagccgt tctgacaagc 4380

gctcaggcag aactggatgg tgttgctact tcaacaaatg atgccaaaga gccagcaaat 4440

actgccactg acaaaaaaga tgaaggcact gtaacgcctc cacctataga ctcagaaaaa 4500

gttgatgtac aggcacctcc tgtaaaagat actgggaatt cagggcatgt accgataggt 4560

cagaagccaa accctcaacc aactttacct cgtccggtca ctttgcaagc tagtctatct 4620

agccctaatc aagaaaaaca ggtgactcaa ctaccaaata ctggagacaa tgatacgaga 4680

tactatcttg ttcttggtgt cattattggg ctagggactc tgttggtaag caaacgacgt 4740

cataaagaag aagtctaa 4758

<210>11

<211>1530

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>11

atggccgatg aattgacaag ccttgtagag actaaggtgg aagcaactgt tcctgacgta 60

atcgtcagcg aatcagcctc agaaagtccc gtagtcgagg agttagttga cacttctgtg 120

gaggctaccc caactgatgt aaccactaca gataatgtag aggaaacact tggctcagaa 180

gctcttgaaa acatcacaaa tacagaagta gaagcgactc aaccagctgt agaaactcca 240

gctatttcag agaaaaaagt agaagaagat gagaagcttg ccgtagcaga tgagactact 300

gctattacta atcaggaaga agcaaaacca caaaacattg atagcaatac gatcattaca 360

gtacctaaag tttgggatag tggttacaag ggcgaaggaa cagtagttgc aatcatagat 420

tcaggtcttg acgttgacca cgatgtattg catatttcag atctctcaac tgcaaaatat 480

aaatcagaaa aagagataga agcagctaaa gaagcagcag gaattaccta cggtgaatgg 540

tttaacgata aggttgtatt tggttataac tatgttgatg tgaatactgt cttgaaagaa 600

gaagacaaac gctcacacgg tatgcacgta acgagtattg ccacaggaaa tccgacacaa 660

ccagtcgctg aacaattaat gtatggtgta gctcctgaag cgcaagtcat gtttatgcgt 720

gtattctcag acctcaaagc tacaacaggc gcagcattgt acgtaaaggc gattgaagat 780

gctgtaaaat taggtgcaga tagcatcaac ctcagcctgg gaggagctaa tggctctgtt 840

gttaacatga atgaaaatgt gactgcagca atcgaggctg ctcgtcgtgc aggggtttct 900

gttgttattg cagctggtaa tgatggaaca tttggttccg gtcattctaa tccgtcagcc 960

gattatccag attatggctt ggtcggtaca tcttcaacag ctcgcgatgc aatttctgtc 1020

gcttcttaca ataacacaac ggttggtagt aaagtaatta atatcattgg cttagaaaac 1080

aatgctgact tgaattacgg taaaagttcg tttgataatc cagagaaaag ttccgtacca 1140

tttgaaatcg ggaaagaata tgaatatgtc tatgcgggaa tcggtcaagc ttcggatttt 1200

gatggtttaa atttgactgg aaaacttgcg cttattaaac gaggaaccat cagtttctca 1260

gaaaaaatag ccaatgcaac agctgcaggg gcagtagggg tcgttatttt caatagccgc 1320

ccaggtgaag ccaatgtgag catgcaactg gatgatacag ctatcgcaat tccatctatc 1380

ttcattccat tggaattcgg tgaagcttta gcggctaaac catataagat tgcgttcaat 1440

aacgaaacag acattcgtcc taaccccaaa gcaggtcttc tttcagattt ttcaagttgg 1500

ggtctactcg agcaccacca ccaccaccac 1530

<210>12

<211>510

<212>PRT

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>12

Met Ala Asp Glu Leu Thr Ser Leu Val Glu Thr Lys Val Glu Ala Thr

1 5 10 15

Val Pro Asp Val Ile Val Ser Glu Ser Ala Ser Glu Ser Pro Val Val

20 25 30

Glu Glu Leu Val Asp Thr Ser Val Glu Ala Thr Pro Thr Asp Val Thr

35 40 45

Thr Thr Asp Asn Val Glu Glu Thr Leu Gly Ser Glu Ala Leu Glu Asn

50 55 60

Ile Thr Asn Thr Glu Val Glu Ala Thr Gln Pro Ala Val Glu Thr Pro

65 70 75 80

Ala Ile Ser Glu Lys Lys Val Glu Glu Asp Glu Lys Leu Ala Val Ala

85 90 95

Asp Glu Thr Thr Ala Ile Thr Asn Gln Glu Glu Ala Lys Pro Gln Asn

100 105 110

Ile Asp Ser Asn Thr Ile Ile Thr Val Pro Lys Val Trp Asp Ser Gly

115 120 125

Tyr Lys Gly Glu Gly Thr Val Val Ala Ile Ile Asp Ser Gly Leu Asp

130 135 140

Val Asp His Asp Val Leu His Ile Ser Asp Leu Ser Thr Ala Lys Tyr

145 150 155 160

Lys Ser Glu Lys Glu Ile Glu Ala Ala Lys Glu Ala Ala Gly Ile Thr

165 170 175

Tyr Gly Glu Trp Phe Asn Asp Lys Val Val Phe Gly Tyr Asn Tyr Val

180 185 190

Asp Val Asn Thr Val Leu Lys Glu Glu Asp Lys Arg Ser His Gly Met

195 200 205

His Val Thr Ser Ile Ala Thr Gly Asn Pro Thr Gln Pro Val Ala Glu

210 215 220

Gln Leu Met Tyr Gly Val Ala Pro Glu Ala Gln Val Met Phe Met Arg

225 230 235 240

Val Phe Ser Asp Leu Lys Ala Thr Thr Gly Ala Ala Leu Tyr Val Lys

245 250 255

Ala Ile Glu Asp Ala Val Lys Leu Gly Ala Asp Ser Ile Asn Leu Ser

260 265 270

Leu Gly Gly Ala Asn Gly Ser Val Val Asn Met Asn Glu Asn Val Thr

275 280 285

Ala Ala Ile Glu Ala Ala Arg Arg Ala Gly Val Ser Val Val Ile Ala

290 295 300

Ala Gly Asn Asp Gly Thr Phe Gly Ser Gly His Ser Asn Pro Ser Ala

305 310 315 320

Asp Tyr Pro Asp Tyr Gly Leu Val Gly Thr Ser Ser Thr Ala Arg Asp

325 330 335

Ala Ile Ser Val Ala Ser Tyr Asn Asn Thr Thr Val Gly Ser Lys Val

340 345 350

Ile Asn Ile Ile Gly Leu Glu Asn Asn Ala Asp Leu Asn Tyr Gly Lys

355 360 365

Ser Ser Phe Asp Asn Pro Glu Lys Ser Ser Val Pro Phe Glu Ile Gly

370 375 380

Lys Glu Tyr Glu Tyr Val Tyr Ala Gly Ile Gly Gln Ala Ser Asp Phe

385 390 395 400

Asp Gly Leu Asn Leu Thr Gly Lys Leu Ala Leu Ile Lys Arg Gly Thr

405 410 415

Ile Ser Phe Ser Glu Lys Ile Ala Asn Ala Thr Ala Ala Gly Ala Val

420 425 430

Gly Val Val Ile Phe Asn Ser Arg Pro Gly Glu Ala Asn Val Ser Met

435 440 445

Gln Leu Asp Asp Thr Ala Ile Ala Ile Pro Ser Ile Phe Ile Pro Leu

450 455 460

Glu Phe Gly Glu Ala Leu Ala Ala Lys Pro Tyr Lys Ile Ala Phe Asn

465 470 475 480

Asn Glu Thr Asp Ile Arg Pro Asn Pro Lys Ala Gly Leu Leu Ser Asp

485 490 495

Phe Ser Ser Trp Gly Leu Leu Glu His His His His His His

500 505 510

<210>13

<211>1494

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>13

atgagaaaaa gttcgcactt gattttaagc tcaatagtca gtttggcact cgtaggggtc 60

acaccattga gtgttcttgc agattccaaa caagatatta atcagtattt tcaaagcttg 120

acttacgagc cacaagagat tcttacaaat gagggagaat acattgataa tccgccagca 180

acaactggta tgttagaaaa cggacgtttt gtagtacttc gcagagaaaa gaagaatatt 240

acgaacaata gtgcagatat tgctgttatt gatgctaagg ctgcaaatat ttatccaggt 300

gctttattgc gtgctgacca aaatcttctg gataataatc caacgcttat cagtattgcg 360

cggggagatc tgacgcttag tttgaattta cctggtttgg ccaatgggga tagccacact 420

gttgtaaatt ctccaacaag aagtactgtt cgaacagggg tgaataacct tctgtctaaa 480

tggaataata cgtatgctgg agagtatggc aatacccaag cagagcttca atatgatgaa 540

acaatggcat acagtatgtc acaattgaaa acgaagttcg gaacctcttt tgaaaaaatt 600

gctgtaccat tagatatcaa ttttgatgcc gtgaattcgg gtgaaaaaca ggttcagatt 660

gttaacttta aacaaattta ttatacagtt agtgttgatg aaccagaatc tccaagcaag 720

ctttttgcag aagggacaac tgtagaagat ttgaaacgaa atgggataac agatgaggta 780

cctcctgttt atgtttccag cgtttcttat ggacgctcta tgttcatcaa gttagaaact 840

agcagtagga gtacccaagt tcaagccgca tttaaagcag ccatcaaagg cgttgatatt 900

agtggcaatg ctgagtatca agacattctg aaaaatactt cattctctgc ttatattttt 960

ggtggggatg caggtagcgc ggctactgtt gtgagcggaa atattgaaac actgaagaag 1020

attattgaag aaggtgcaag atacggaaaa ctcaatccag gtgttccgat ttcgtattca 1080

accaactttg tcaaagacaa tagacctgct cagattttga gcaattcaga gtacatagaa 1140

acaacttcaa cagtccataa tagcagtgca ttgacattgg atcattcagg tgcttatgtt 1200

gcgaaataca acattacttg ggaagaagta tcttacaatg aagctggaga agaagtttgg 1260

gaaccaaaag cttgggataa gaatggtgta aatctgacct cacactggag tgaaaccatt 1320

caaattccag gaaatgctcg caatcttcat gtcaatattc aagaatgtac aggattagca 1380

tgggagtggt ggagaacagt ttatgacaaa gatttaccac ttgttggtca acgtaaaata 1440

accatctggg gaacaacgtt atacccacag tatgcggatg aggtgataga gtaa 1494

<210>14

<211>1440

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>14

atggccgatt ccaaacaaga tattaatcag tattttcaaa gcttgactta cgagccacaa 60

gagattctta caaatgaggg agaatacatt gataatccgc cagcaacaac tggtatgtta 120

gaaaacggac gttttgtagt acttcgcaga gaaaagaaga atattacgaa caatagtgca 180

gatattgctg ttattgatgc taaggctgca aatatttatc caggtgcttt attgcgtgct 240

gaccaaaatc ttctggataa taatccaacg cttatcagta ttgcgcgggg agatctgacg 300

cttagtttga atttacctgg tttggccaat ggggatagcc acactgttgt aaattctcca 360

acaagaagta ctgttcgaac aggggtgaat aaccttctgt ctaaatggaa taatacgtat 420

gctggagagt atggcaatac ccaagcagag cttcaatatg atgaaacaat ggcatacagt 480

atgtcacaat tgaaaacgaa gttcggaacc tcttttgaaa aaattgctgt accattagat 540

atcaattttg atgccgtgaa ttcgggtgaa aaacaggttc agattgttaa ctttaaacaa 600

atttattata cagttagtgt tgatgaacca gaatctccaa gcaagctttt tgcagaaggg 660

acaactgtag aagatttgaa acgaaatggg ataacagatg aggtacctcc tgtttatgtt 720

tccagcgttt cttatggacg ctctatgttc atcaagttag aaactagcag taggagtacc 780

caagttcaag ccgcatttaa agcagccatc aaaggcgttg atattagtgg caatgctgag 840

tatcaagaca ttctgaaaaa tacttcattc tctgcttata tttttggtgg ggatgcaggt 900

agcgcggcta ctgttgtgag cggaaatatt gaaacactga agaagattat tgaagaaggt 960

gcaagatacg gaaaactcaa tgtaggtgtt ccgatttcgt attcaaccaa ctttgtcaaa 1020

gacaatagac ctgctcagat tttgagcaat tcagagtaca tagaaacaac ttcaacagtc 1080

cataatagca gtgcattgac attggatcat tcaggtgctt atgttgcgaa atacaacatt 1140

acttgggaag aagtatctta caatgaagct ggagaagaag tttgggaacc aaaagcttgg 1200

gataagaatg gtgtaaatct gacctcacac tggagtgaaa ccattcaaat tccaggaaat 1260

gctcgcaatc ttcatgtcaa tattcaagaa tgtacaggat tagcatggga gtggtggaga 1320

acagtttatg acaaagattt accacttgtt ggtcaacgta aaataaccat ctggggaaca 1380

acgttatacc cacagtatgc ggatgaggtg atagagctcg agcaccacca ccaccaccac 1440

<210>15

<211>480

<212>PRT

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>15

Met Ala Asp Ser Lys Gln Asp Ile Asn Gln Tyr Phe Gln Ser Leu Thr

1 5 10 15

Tyr Glu Pro Gln Glu Ile Leu Thr Asn Glu Gly Glu Tyr Ile Asp Asn

20 25 30

Pro Pro Ala Thr Thr Gly Met Leu Glu Asn Gly Arg Phe Val Val Leu

35 40 45

Arg Arg Glu Lys Lys Asn Ile Thr Asn Asn Ser Ala Asp Ile Ala Val

50 55 60

Ile Asp Ala Lys Ala Ala Asn Ile Tyr Pro Gly Ala Leu Leu Arg Ala

65 70 75 80

Asp Gln Asn Leu Leu Asp Asn Asn Pro Thr Leu Ile Ser Ile Ala Arg

85 90 95

Gly Asp Leu Thr Leu Ser Leu Asn Leu Pro Gly Leu Ala Asn Gly Asp

100 105 110

Ser His Thr Val Val Asn Ser Pro Thr Arg Ser Thr Val Arg Thr Gly

115 120 125

Val Asn Asn Leu Leu Ser Lys Trp Asn Asn Thr Tyr Ala Gly Glu Tyr

130 135 140

Gly Asn Thr Gln Ala Glu Leu Gln Tyr Asp Glu Thr Met Ala Tyr Ser

145 150 155 160

Met Ser Gln Leu Lys Thr Lys Phe Gly Thr Ser Phe Glu Lys Ile Ala

165 170 175

Val Pro Leu Asp Ile Asn Phe Asp Ala Val Asn Ser Gly Glu Lys Gln

180 185 190

Val Gln Ile Val Asn Phe Lys Gln Ile Tyr Tyr Thr Val Ser Val Asp

195 200 205

Glu Pro Glu Ser Pro Ser Lys Leu Phe Ala Glu Gly Thr Thr Val Glu

210 215 220

Asp Leu Lys Arg Asn Gly Ile Thr Asp Glu Val Pro Pro Val Tyr Val

225 230 235 240

Ser Ser Val Ser Tyr Gly Arg Ser Met Phe Ile Lys Leu Glu Thr Ser

245 250 255

Ser Arg Ser Thr Gln Val Gln Ala Ala Phe Lys Ala Ala Ile Lys Gly

260 265 270

Val Asp Ile Ser Gly Asn Ala Glu Tyr Gln Asp Ile Leu Lys Asn Thr

275 280 285

Ser Phe Ser Ala Tyr Ile Phe Gly Gly Asp Ala Gly Ser Ala Ala Thr

290 295 300

Val Val Ser Gly Asn Ile Glu Thr Leu Lys Lys Ile Ile Glu Glu Gly

305 310 315 320

Ala Arg Tyr Gly Lys Leu Asn Val Gly Val Pro Ile Ser Tyr Ser Thr

325 330 335

Asn Phe Val Lys Asp Asn Arg Pro Ala Gln Ile Leu Ser Asn Ser Glu

340 345 350

Tyr Ile Glu Thr Thr Ser Thr Val His Asn Ser Ser Ala Leu Thr Leu

355 360 365

Asp His Ser Gly Ala Tyr Val Ala Lys Tyr Asn Ile Thr Trp Glu Glu

370 375 380

Val Ser Tyr Asn Glu Ala Gly Glu Glu Val Trp Glu Pro Lys Ala Trp

385 390 395 400

Asp Lys Asn Gly Val Asn Leu Thr Ser His Trp Ser Glu Thr Ile Gln

405 410 415

Ile Pro Gly Asn Ala Arg Asn Leu His Val Asn Ile Gln Glu Cys Thr

420 425 430

Gly Leu Ala Trp Glu Trp Trp Arg Thr Val Tyr Asp Lys Asp Leu Pro

435 440 445

Leu Val Gly Gln Arg Lys Ile Thr Ile Trp Gly Thr Thr Leu Tyr Pro

450 455 460

Gln Tyr Ala Asp Glu Val Ile Glu Leu Glu His His His His His His

465 470 475 480

Claims (6)

1.一种疫苗，其活性成分由成分甲、成分乙、成分丙、成分丁和成分戊组成；

所述成分甲为具有分选酶A全长或部分氨基酸序列的融合蛋白；

所述成分乙为具有表面相关枯草杆菌蛋白酶样蛋白酶全长或部分氨基酸序列的融合蛋白；

所述成分丙为具有溶菌酶释放蛋白全长或部分氨基酸序列的融合蛋白；

所述成分丁为具有链球菌趋化因子蛋白酶全长或部分氨基酸序列的融合蛋白；

所述成分戊为具有溶血素全长或部分氨基酸序列的融合蛋白；

所述具有分选酶A全长或部分氨基酸序列的融合蛋白为由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

所述具有表面相关枯草杆菌蛋白酶样蛋白酶全长或部分氨基酸序列的融合蛋白为由序列表中序列6所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

所述具有溶菌酶释放蛋白全长或部分氨基酸序列的融合蛋白为由序列表中序列9所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

所述具有链球菌趋化因子蛋白酶全长或部分氨基酸序列的融合蛋白为由序列表中序列12所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

所述具有溶血素全长或部分氨基酸序列的融合蛋白为由序列表中序列15所示的氨基酸序列组成的蛋白质。

2.如权利要求1所述的疫苗，其特征在于：所述成分甲、所述成分乙、所述成分丙、所述成分丁和所述成分戊的质量比为1:1:1:1:1。

3.如权利要求1或2所述的疫苗，其特征在于：所述疫苗的免疫方式为鼻腔吸入。

4.权利要求1或2所述的疫苗的制备方法，包括将权利要求1或2中所述的成分甲、权利要求1或2中所述的成分乙、权利要求1或2中所述的成分丙、权利要求1或2中所述的成分丁、权利要求1或2中所述的成分戊、免疫佐剂和缓冲液混匀的步骤。

5.权利要求1-3任一所述的疫苗或权利要求4所述的方法制备的疫苗在如下（A1）-（A5）中任一种中的应用：

（A1）制备预防猪链球菌感染的药物；

（A2）制备预防猪链球菌导致的粘膜系统感染的药物；

（A3）制备降低或防止猪链球菌在粘膜系统的定居和感染的药物；

（A4）制备提高Th17细胞活化水平的药物；

（A5）制备提高保护性抗体水平的药物。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述粘膜系统为猪粘膜系统。

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