CN111925452B

CN111925452B - 猪肺炎支原体基因工程亚单位疫苗、其制备方法及应用

Info

Publication number: CN111925452B
Application number: CN202011114349.XA
Authority: CN
Inventors: 曹文龙; 孔迪; 滕小锘; 张大鹤
Original assignee: Suzhou Midi Biotechnology Co ltd; Suzhou Shinuo Biotechnology Co ltd
Current assignee: Suzhou Womei Biology Co ltd
Priority date: 2020-10-19
Filing date: 2020-10-19
Publication date: 2020-12-18
Anticipated expiration: 2040-10-19
Also published as: CN111925452A

Abstract

本发明揭示了一种猪肺炎支原体基因工程亚单位疫苗、其制备方法及应用。所述疫苗包含蛋白组合物以及医药学上可接受的载剂，所述蛋白组合物包含分别具有SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:6所示序列的两种融合蛋白。本发明提供的所述疫苗无任何毒性，安全性高，免疫原性好，能够在猪体内产生较强的体液免疫，免疫后的动物能够抵御强毒攻毒，并获得全面保护，且所述疫苗还可以使用生物反应器大规模无血清悬浮培养制备，具有质控容易、批次间稳定、生产成本低等优点。

Description

猪肺炎支原体基因工程亚单位疫苗、其制备方法及应用

技术领域

本发明涉及一种基因工程疫苗，具体涉及一种猪肺炎支原体基因工程亚单位疫苗、其制备方法及应用，属于动物免疫药物技术领域。

背景技术

猪支原体肺炎（Mycoplasmal pneumonia of swine，MPS）又称猪喘气病、猪地方流行性肺炎（Swine enzootic pneumoniae，SEP），是由猪肺炎支原体（Mycoplasmahyopneumoniae，Mhp）引起的一种接触性和慢性呼吸道传染病，其临床症状表现为咳嗽、气喘、发育迟缓以及料肉比低等。该病主要通过带菌猪和患病猪传染，不同品种、年龄、性别的猪均能感染，其传播途径为直接接触和空气传播，当患病猪和健康猪混合饲养时，常会引发大规模的感染传播。MPS属于免疫抑制性疾病，其感染后往往造成猪支气管纤毛、肺泡巨噬细胞的损伤，降低机体清除外来病原的能力，导致其他病原如猪圆环病毒（Porcinecircovirus，PCV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratorysyndrome virus，PRRSV）和胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropneumoniae）等的继发感染，引起猪呼吸道疾病综合征（Porcine respiratory disease complex，PRDC）的发生，这不但增大了猪诊断和防控的难度，也造成了非常严重的经济损失。因此MPS成为当前最常发生、最广流行、最难净化的重要疫病之一，被喻为全球养猪业的“隐形杀手”。

Mhp是一种介于细菌和病毒之间的、最简单且能够自主复制的原核微生物，大小在200nm~400nm之间，没有细胞壁，仅有三层界限膜，呈点状、球状、两级状等多种形态。Mhp主要有以下几种免疫抗原：细胞质蛋白（胞内具乳酸脱氢酶活性的蛋白P36）、膜蛋白（P46、P65和P74）、黏附因子（主要为P97、P101、P216、P159、P116、Mhp107和Mhp271七种蛋白）以及核苷酸还原酶等。P97蛋白是Mhp发现较早且研究非常多的黏附蛋白，是一种重要的毒力因子，它含有R1和R2两个重复区域，在Mhp黏附宿主上皮细胞过程中起到了非常重要的作用。P97蛋白也是Mhp感染猪后最早产生抗体的抗原之一，其中R1区（P97R1）具有很强的免疫原性，在体内能刺激机体产生很强的抗体免疫应答反应，是目前发现的具有开发潜力的抗原区。P36蛋白是一种乳酸脱氢酶，也是Mhp的种特异性蛋白，带有种属特异性的抗原决定簇，主要在Mhp的感染后期发挥作用。研究发现，P36蛋白在自然和人工感染的猪体内均能诱导产生较好的天然免疫应答，是一种免疫优势性蛋白，与其它抗原相比其产生抗体的时间相对较晚，但产生的特异性抗体能维持较长时间。P46蛋白是一种表面脂蛋白，能引起宿主的早期免疫反应，具有高度的种内保守性和较好的特异性和免疫保护力，重组P46蛋白可以诱发机体产生强烈的体液免疫和细胞免疫反应，可成为新型Mhp疫苗的候选基因。热休克蛋白（Heatshock proteins，HSPs）是生物细胞在受到理化、生物等因素刺激后，发生热休克反应时所合成的一类最保守的伴侣细胞蛋白。经基因序列分析发现Mhp中的热休克蛋白有DnaK（Mhp072）、DnaJ（Mhp073）、ClpB（Mhp278）、GrpE（Mhp011）以及Lon（Mhp541）等。DnaK蛋白也被称为热休克蛋白70（HSP70），是HSPs家族中最重要的蛋白之一。DnaK蛋白的C-末端主要作用为免疫原和免疫佐剂，可诱导和增强机体的免疫反应；其N-末端则主要表现分子伴侣作用。DnaJ蛋白是刺激DnaK蛋白的ATP酶和蛋白折叠活性的辅助分子伴侣，在整个活体细胞和组织中有活性，纠正或清除细胞内错误折叠并使蛋白失活，指导蛋白质的正确生物活性。信号识别颗粒（Signal Recognition Particle，SRP）途径是一个高度保守的蛋白靶向途径，先后在真核生物、原核生物和古细菌中被发现。原核生物中SRP途径主要由ffh、 FtsY和scRNA组成，其中ffh蛋白具有在各个功能域的协调作用，能够识别结合新生蛋白。

由于Mhp没有细胞壁，对常规抗生素不敏感，加之耐药性和免疫保护特殊性等问题，疫苗免疫成为主要预防和控制Mhp感染的手段。目前国内外用于防控Mhp的疫苗主要包括灭活疫苗、弱毒疫苗以及基因工程亚单位疫苗等。灭活疫苗能够降低肺部病理损伤，激发机体的体液免疫，但几乎不产生细胞免疫，也不能阻止猪群中Mhp的感染和传播；弱毒疫苗存在操作难度系数大，产量低，毒力返强等问题。Mhp对培养基的条件要求非常苛刻，是动物支原体中较难培养的一种，培养过程中极易被其他细菌和支原体污染，也使上述两种疫苗生产成本居高不下。因此，为了更有效地防治MPS，免疫原性强、安全性高的新型猪肺炎支原体基因工程亚单位疫苗的研制极为重要，但目前仍鲜见相关报道。

发明内容

本发明的主要目的在于提供一种猪肺炎支原体基因工程亚单位疫苗、其制备方法及应用，以克服现有技术中的不足。

为实现前述发明目的，本发明采用的技术方案包括：

本发明实施例提供了一种蛋白组合物，包含：具有SEQ ID NO:2所示序列或者与SEQ ID NO:2的全长序列95％以上相同的序列的第一融合蛋白，具有SEQ ID NO:6所示序列或者与SEQ ID NO:6的全长序列95％以上相同的序列的第二融合蛋白。

即，本发明实施例提供的各融合蛋白的氨基酸序列可以是原始序列，增加或截短的序列。

本发明实施例还提供了一种基因组合物，包含分别用于编码所述蛋白组合物中第一融合蛋白、第二融合蛋白的编码基因。

在一些实施方式中，所述的基因组合物包含：具有SEQ ID NO:1所示序列或者与SEQ ID NO:1的全长序列95％以上相同的序列的第一核酸分子，具有SEQ ID NO:5所示序列或者与SEQ ID NO:5的全长序列95％以上相同的序列的第二核酸分子。

本发明实施例还提供了一种重组载体组合物，包括：

包含所述蛋白组合物中第一融合蛋白的编码基因的第一重组载体，以及

包含所述蛋白组合物中第二融合蛋白的编码基因的第二重组载体。

在一些实施方式中，所述第一重组载体、第二重组载体包括但不限于pFastBac 1、pVL1393、pFastBac dual，并优选采用pFastBac 1。

本发明实施例还提供了一种宿主细胞组合物，包括：

包含所述蛋白组合物中第一融合蛋白的编码基因的第一宿主细胞，以及

包含所述蛋白组合物中第二融合蛋白的编码基因的第二宿主细胞。

在一些实施方式中，所述第一宿主细胞、第二宿主细胞选自昆虫细胞，例如Sf9细胞系，优选的，所述Sf9细胞系包括但不限于Sf9、High Five或 Sf21细胞，更优选为Sf9细胞。

本发明实施例还提供了一种免疫组合物，其包括：所述的蛋白组合物；以及，医药学上可接受的载剂。

在一些实施方式中，所述医药学上可接受的载剂包括但不限于MONTANIDE ISA206 VG、MONTANIDE ISA 201 VG、MONTANIDE ISA 15 VG、液体石蜡、樟脑油、植物细胞凝集素之中的任意一种或者两种以上的组合，优选为MONTANIDE ISA 201 VG。

本发明实施例还提供了一种蛋白组合物的制备方法，其包括：

提供所述蛋白组合物中第一融合蛋白、第二融合蛋白的编码基因；

分别将所述第一融合蛋白的编码基因、第二融合蛋白的编码基因克隆到穿梭载体中，分别获得含有相应目的基因的第一重组穿梭载体、第二重组穿梭载体；

分别将所述第一重组穿梭载体、第二重组穿梭载体转化感受态细胞，并分离获得分别含有相应目的基因表达框的第一重组杆状病毒基因组质粒、第二重组杆状病毒基因组质粒；

分别以所述第一重组杆状病毒基因组质粒、第二重组杆状病毒基因组质粒转染昆虫细胞，并分别获得相应的第一重组杆状病毒、第二重组杆状病毒；

分别将所述第一重组杆状病毒、第二重组杆状病毒接种昆虫细胞并进行培养，之后分离获得所述第一融合蛋白、第二融合蛋白。

在一些实施方式中，所述穿梭载体包括但不限于pFastBac 1、pVL1393、pFastBacdual等，优选为pFastBac1。

在一些实施方式中，所述昆虫细胞选自Sf9细胞系等，例如可以包括但不限于Sf9、High Five或 Sf21细胞等，优选为Sf9细胞。

本发明实施例还提供了一种猪肺炎支原体基因工程亚单位疫苗的制备方法，其包括：采用前述的任一种方法制备第一融合蛋白、第二融合蛋白，并将所述第一融合蛋白、第二融合蛋白与医药学上可接受的载剂混合。

本发明实施例还提供了所述蛋白组合物或所述免疫组合物在制备猪肺炎支原体检测试剂，在生产用于在受试动物中诱导针对猪肺炎支原体抗原的免疫反应的药剂，或者，在生产用于预防动物受猪肺炎支原体感染的药剂中的用途。

本发明实施例还提供了所述蛋白组合物或所述免疫组合物在制备猪肺炎支原体基因工程亚单位疫苗中的用途。

本发明实施例提供了一种猪肺炎支原体基因工程亚单位疫苗，其包含前述的任一种免疫组合物。进一步的，所述疫苗还可包含医药学上可接受的载剂。

本发明实施例还提供了包含所述蛋白组合物中各融合蛋白的编码基因的重组载体或宿主细胞在生产用于检测动物受猪肺炎支原体感染的试剂的用途。

本发明实施例还提供了包含所述蛋白组合物中各融合蛋白的编码基因的重组载体或宿主细胞在生产用于在受试动物中诱导针对猪肺炎支原体抗原的免疫反应的药剂的用途。

本发明实施例还提供了包含所述蛋白组合物中各融合蛋白的编码基因的重组载体或宿主细胞在生产用于预防动物受猪肺炎支原体感染的药剂的用途。

本发明实施例还提供了一种诱导针对猪肺炎支原体抗原的免疫反应的方法，所述方法包括向受试动物施用所述猪肺炎支原体基因工程亚单位疫苗。

本发明实施例还提供了一种保护受试动物免受猪肺炎支原体感染的方法，所述方法包括向受试动物施用所述猪肺炎支原体基因工程亚单位疫苗。

本发明实施例还提供了一种适用于在受试动物中产生针对猪肺炎支原体感染的免疫反应的疫苗，所述疫苗包含：本发明的蛋白组合物以及佐剂分子。

如本说明书所述的“佐剂”意指被添加到本说明书所述的疫苗中来增强由下文所述编码核酸序列的所编码的抗原的免疫原性的任何分子。例如，所述佐剂可为IL-12、IL-15、IL-28、CTACK、TECK、血小板源性生长因子(PDGF)、TNFα、TNFβ、GM-CSF、表皮生长因子(EGF)、IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-18、IL-21、IL-31、IL-33或其组合；并且在一些实施方式中，可为IL-12、IL-15、IL-28或RANTES。进一步的，所述佐剂可以优选采用苏州世诺生物技术有限公司生产的相关佐剂，以提高疫苗效果。

较之现有技术，本发明实施例通过选取猪肺炎支原体的P36、P46、P97、DnaK、ffh、DnaJ等蛋白中的抗原片段，并对其中来源于P97的抗原片段进行优化，再将这些抗原融合表达，获得了第一、第二融合蛋白（分别定义为P36-DnaK-ffh、P97-P46-DnaJ），该两种融合蛋白均可以利用杆状病毒昆虫细胞表达系统，使用悬浮培养Sf9细胞等进行表达和大规模无血清悬浮培养制备，大大降低了疫苗生产成本，同时所获产品的抗原性、免疫原性和功能与天然蛋白质相似，表达水平较高，免疫原性强，包含该两种融合蛋白的Mhp疫苗只需要很少量就能提供很好的免疫效果和全面的保护，对猪没有致病性，具有很好的应用前景。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施方式的技术方案，下面将对实施方式中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1是实施例1中密码子优化后的P36-DnaK-ffh基因PCR扩增产物的凝胶电泳图，其中在1.6kbp位置出现目的条带。

图2是实施例1中菌落PCR扩增产物的凝胶电泳图，其中在1.6kbp位置出现目的条带。

图3是实施例1中转移载体pF-P36-DnaK-ffh的结构示意图。

图4是实施例2中密码子优化后的P97-P46-DnaJ基因PCR扩增产物的凝胶电泳图，其中在1.6kbp位置出现目的条带。

图5是实施例2中菌落PCR扩增产物的凝胶电泳图，其中在1.6kbp位置出现目的条带。

图6是实施例2中转移载体pF-P97-P46-DnaJ的结构示意图。

图7是实施例5所获细胞培养物的SDS-PAGE检测图谱。

图8是实施例5所获各SDS-PAGE电泳后产物的Western Blot检测结果图。

图9是实施例7中接种空杆状病毒、重组杆状病毒的Sf9细胞的荧光检测图。

图10是实施例9所获的各纯化后融合蛋白的灰度扫描图。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本说明书使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

本发明实施例一方面提供的第一融合蛋白具有SEQ ID NO:2所示序列或者与SEQID NO:2的全长序列95％以上相同的序列的。

该第一融合蛋白定义为P36-DnaK-ffh，其中P36、DnaK、ffh是精选的抗原片段，而不是全长蛋白，使该融合蛋白表达量高，免疫原性好。

本发明实施例另一方面提供的第二融合蛋白具有SEQ ID NO:6所示序列或者与SEQ ID NO:6的全长序列95％以上相同的序列。

该第二融合蛋白定义为P97-P46-DnaJ中，其中P97、P46以及DnaJ蛋白也是精选的抗原片段，而不是全长蛋白，且P97黏附蛋白抗原片段去掉了如下疏水片段：

VFLELVHQSEYEEQEIIKELDKTVLNLQYQFQEVK，使该融合蛋白表达量显著提高。

本发明实施例主要通过精选猪肺炎支原体P36、P46、P97、DnaK、ffh、DnaJ蛋白中的抗原片段，并对其中来源于P97的抗原片段进行优化，再将这些抗原融合表达，获得了P36-DnaK-ffh、P97-P46-DnaJ这两种融合蛋白，其可以利用杆状病毒昆虫细胞表达系统，使用悬浮培养Sf9细胞等进行表达，其不仅表达水平较高，而且蛋白免疫原性好。

进一步的，前述P36-DnaK-ffh、P97-P46-DnaJ融合蛋白可以用于制备猪肺炎支原体基因工程亚单位疫苗，其只需要很少量就能提供很好的免疫效果和全面的保护，且非常安全。

例如，在本发明实施例的一个具体实施方案中，一种猪肺炎支原体基因工程亚单位疫苗的制备方法具体可以包括：

（1）分别制备用于编码P36-DnaK-ffh、P97-P46-DnaJ融合蛋白的核酸分子；

（2）分别将步骤（1）中制备的各核酸分子克隆到穿梭载体中，得到相应的含有目的基因的重组穿梭载体；

（3）将步骤（2）获得的各重组穿梭载体分别转化DH10Bac菌，挑选重组菌，抽提基因组转染Sf9细胞（或前述的其它昆虫细胞），获得重组杆状病毒；

（4）培育所述Sf9细胞（或前述的其它昆虫细胞）进而重组表达产生P36-DnaK-ffh、P97-P46-DnaJ融合蛋白；

（5）将所述P36-DnaK-ffh、P97-P46-DnaJ融合蛋白混合加入到佐剂中，得到所述疫苗。

本发明实施例的该具体实施方案中，使用Sf9细胞表达融合蛋白P36-DnaK-ffh、P97-P46-DnaJ，产品的抗原性、免疫原性和功能与天然蛋白质相似，表达水平较高，免疫原性强，对猪没有致病性，并且疫苗可以使用生物反应器大规模无血清悬浮培养制备，也大大降低了疫苗生产成本。

本发明实施例提供的猪肺炎支原体基因工程亚单位疫苗无任何毒性，安全性高，免疫原性好，能够在动物体内产生较强的体液免疫，免疫后的动物能够抵御强毒攻毒，且还具有可以大规模批量生产、质控容易、批次间稳定、生产成本低等一系列优点。

本发明实施例提供的猪肺炎支原体基因工程亚单位疫苗在应用时，只需将有效量接种于猪。如本文中所使用的，术语“有效量”是指足以获得或至少部分获得期望的效果的量。例如，预防疾病有效量是指，足以预防，阻止，或延迟疾病的发生的量；治疗疾病有效量是指，足以治愈或至少部分阻止已患有疾病的患者的疾病和其并发症的量。测定这样的有效量完全在本领域技术人员的能力范围之内。

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中所用试剂和原料均市售可得，而其中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或者按照各制造商所建议的条件。又及，除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULAR CLONING：A LABORATORYMANUAL，Second edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989and Thirdedition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987 and periodic updates；the series METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION，Thirdedition，Academic Press，San Diego，1998；METHODS IN ENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，Academic Press，San Diego，1999；和METHODSIN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，Chromatin Protocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。

实施例1 转移载体pF-P36-DnaK-ffh构建与鉴定

1．P36-DnaK-ffh基因扩增与纯化

在南京金斯瑞生物科技有限公司合成了密码子优化后的P36-DnaK-ffh基因（SEQID NO:1）并克隆到pUC17载体上，得到pUC-P36-DnaK-ffh质粒载体。以pUC-P36-DnaK-ffh质粒作为模板，P36-DnaK-ffh-F、P36-DnaK-ffh-R作为上下游引物进行PCR扩增（P36-DnaK-ffh-F、P36-DnaK-ffh-R的基因序列如SEQ ID NO:3、4所示），扩增体系见表1。

表1 P36-DnaK-ffh基因扩增体系

反应条件为：95℃预变性5分钟；94℃变性45秒，54℃退火45秒，72℃延伸1分钟，35个循环；72℃延伸10分钟。

将PCR产物进行凝胶电泳验证目的基因大小，如图1所示，在1.6kbp的位置出现目的条带，目的基因扩增成功，用凝胶回收纯化试剂盒进行回收纯化。

2．酶切与纯化

将pFastBac 1质粒和P36-DnaK-ffh基因PCR扩增产物使用BamH Ⅰ、Hind Ⅲ 37℃双酶切3小时，具体酶切反应体系见表2、表3。

将酶切产物进行凝胶电泳，分别使用凝胶回收纯化试剂盒纯化酶切的pFastBac 1质粒以及P36-DnaK-ffh基因片段。

表2 P36-DnaK-ffh基因酶切反应体系

表3 pFastBac 1质粒酶切反应体系

3．连接

将酶切过的pFastBac 1质粒和P36-DnaK-ffh基因酶切产物使用T4 DNA连接酶16℃水浴连接过夜，连接体系见表4。

表4 P36-DnaK-ffh基因与pFastBac 1质粒连接体系

4．转化

取10μL连接产物加入100μL的DH5α感受态细胞，混匀，42℃热休克90秒，冰浴2分钟，加入900μL不含Amp的LB培养基，37℃培养1小时。取1.0 mL菌液离心浓缩成100 μL涂布于含有Amp的LB固体培养基上，37℃培养16小时。

5．菌落PCR和测序鉴定

挑取平板上的单菌落分别接种LB液体培养基，37℃培养2小时，以菌液作为模板，P36-DnaK-ffh-F和P36-DnaK-ffh-R作为引物进行菌落PCR。将PCR产物进行凝胶电泳验证目的基因大小，如图2所示，出现1.6kbp附近条带的样品为阳性样品。将菌落PCR鉴定阳性的菌液送测序公司测序，选择测序正确的菌液进行保存。构建的含有目的基因的转移载体pF-P36-DnaK-ffh其示意图如图3。

实施例2 转移载体pF-P97-P46-DnaJ构建与鉴定

1．P97-P46-DnaJ基因扩增与纯化

在南京金斯瑞生物科技有限公司合成了密码子优化后的P97-P46-DnaJ基因（SEQID NO:5）并克隆到pUC17载体上，得到pUC-P97-P46-DnaJ质粒载体。以pUC-P97-P46-DnaJ质粒作为模板，P97-P46-DnaJ-F、P97-P46-DnaJ-R作为上下游引物进行PCR扩增（P97-P46-DnaJ-F、P97-P46-DnaJ-R的基因序列如SEQ ID NO:7、8所示），扩增体系见表5。

表5 P97-P46-DnaJ基因扩增体系

将PCR产物进行凝胶电泳验证目的基因大小，如图4所示，在1.6kbp的位置出现目的条带，目的基因扩增成功，用凝胶回收纯化试剂盒进行回收纯化。

2．酶切与纯化

将pFastBac 1质粒和P97-P46-DnaJ基因PCR扩增产物使用BamH Ⅰ、Hind Ⅲ 37℃双酶切3小时，具体酶切反应体系见表6、表7。

将酶切产物进行凝胶电泳，分别使用凝胶回收纯化试剂盒纯化酶切的pFastBac 1质粒以及P97-P46-DnaJ基因片段。

表6 P97-P46-DnaJ基因酶切反应体系

表7 pFastBac 1质粒酶切反应体系

3．连接

将酶切过的pFastBac 1质粒和P97-P46-DnaJ基因酶切产物使用T4 DNA连接酶16℃水浴连接过夜，连接体系见表8。

表8 P97-P46-DnaJ基因与pFastBac 1质粒连接体系

4．转化

5．菌落PCR和测序鉴定

挑取平板上的单菌落分别接种LB液体培养基，37℃培养2小时，以菌液作为模板，P97-P46-DnaJ-F和P97-P46-DnaJ-R作为引物进行菌落PCR。将PCR产物进行凝胶电泳验证目的基因大小，如图5所示，出现1.6kbp附近条带的样品为阳性样品。将菌落PCR鉴定阳性的菌液送测序公司测序，选择测序正确的菌液进行保存。构建的含有目的基因的转移载体pF-P97-P46-DnaJ其示意图如图6。

实施例3 重组杆状病毒基因组Bac-P36-DnaK-ffh和Bac-P97-P46-DnaJ构建

1．DH10Bac菌转化

分别取实施例1和实施例2中pF-P36-DnaK-ffh质粒、pF-P97-P46-DnaJ质粒各1μL加入100μL的DH10Bac感受态细胞中混匀，冰浴30分钟，42℃水浴热休克90秒，再冰浴2分钟，加入900μL不含Amp的LB液体培养基，37℃培养5小时。取100μL菌液稀释81倍后，取100μL稀释的菌液涂布到含有庆大霉素、卡那霉素、四环素、X-gal以及IPTG的LB固体培养基上，37℃培养48小时。

2．挑选单克隆

使用接种针挑取大的白色菌落，然后在含有庆大霉素、卡那霉素、四环素、X-gal以及IPTG的LB固体培养基上划线，37℃培养48小时，然后挑取单菌落接种含有庆大霉素、卡那霉素、四环素的LB液体培养基培养，保存菌种，抽提质粒。分别获得重组质粒Bacmid-P36-DnaK-ffh和Bacmid-P97-P46-DnaJ。

实施例4重组杆状病毒转染

六孔板中每个孔接种0.8×10⁶个Sf9细胞，细胞汇合度为50~70%。对于每一个孔制备以下的复合物：用100μL转染培养基T1稀释4μL的Cellfectin转染试剂，短暂的漩涡震荡；用100μL转染培养T1基分别稀释3μg实施例3中的重组Bacmid-P36-DnaK-ffh质粒和重组Bacmid-P97-P46-DnaJ质粒，分别将稀释的转染试剂和质粒混合，轻轻吹匀，制备转染混合物。待细胞贴壁后加入上述的转染复合物，27℃孵育5小时，移除上清，添加2mLSF-SFM新鲜培养基，27℃培养4～5日收获上清。分别获得重组杆状病毒rBac-P36-DnaK-ffh和rBac-P97-P46-DnaJ，对收获的P1代重组杆状病毒使用MTT相对效力法检测病毒滴度，rBac-P36-DnaK-ffh种毒病毒滴度为7.5×10^8.3 pfu/mL，rBac-P97-P46-DnaJ种毒病毒滴度为3.7×10^8.5 pfu/mL。扩增重组杆状病毒rBac-P36-DnaK-ffh和rBac-P97-P46-DnaJ作为种毒备用。

另外按照上面的实施例方法构建表达如下（表9）对照组的重组杆状病毒：

表9

实施例5 SDS-PAGE检测

将实施例4中收获的rBac-P36-DnaK-ffh、rBac-P97-P46-DnaJ和对照组1的细胞培养物进行SDS-PAGE检测，同时使用感染空杆状病毒的Sf9细胞作为阴性对照。具体操作如下：取40μL收获的细胞培养物，加入10μL的5×loading buffer，沸水浴5分钟，12000r/min离心1分钟，取上清进行SDS-PAGE凝胶（12%浓度凝胶）电泳，电泳后取凝胶经染色、脱色后观察目的条带。结果如图7所示，说明本实施例两组融合蛋白表达量较高。

实施例6 Western Blot检测

将实施例5中SDS-PAGE电泳后的产物转印到NC（硝酸纤维素）膜上，用5%脱脂牛奶封闭2小时，猪源抗Mhp阳性血清孵育2小时，漂洗，HRP标记的羊抗猪多克隆抗体二抗孵育2小时，漂洗，然后滴加增强型化学发光荧光底物，使用化学发光成像仪拍照。结果如图8所示，重组杆状病毒表达样品有目的条带，阴性对照没有目的条带，说明目的蛋白在Sf9细胞中得到正确表达。

实施例7 间接免疫荧光检测

分别向96孔细胞培养板中加入转染过rBac-P36-DnaK-ffh和rBacP97-P46-DnaJ的Sf9细胞悬液，100µL/孔（细胞浓度为2.5×10⁵～4.0×10⁵个/mL），接种4孔，27℃静置15分钟，使Sf9细胞贴于培养板底壁，然后每孔加入10µL稀释10倍的毒种。同时设空白细胞对照。接种后细胞置27℃恒温培养箱中培养72~96小时，弃培养液，冷甲醇/丙酮（1:1）固定。首先与猪源抗MPS多抗血清反应，然后与FITC标记的羊抗猪IgG反应，倒置荧光显微镜观察结果。如图9所示，接种空杆状病毒Sf9细胞不能观察到荧光，而接种了重组杆状病毒Sf9细胞能够观察到荧光，说明目的抗原蛋在Sf9细胞中得到正确表达，重组杆状病毒构建正确。

实施例8昆虫细胞的生物反应器无血清悬浮培养

在1000mL摇瓶中无菌培养Sf9昆虫细胞3-4天，待浓度长到3-5×10⁶cell/mL，活力大于95%时，将细胞接种到5L的生物反应器中，接种浓度为3-8×10⁵cell/mL。当细胞浓度达到3-55×10⁶cell/mL时，将细胞接种到50L生物反应器中，待细胞长至浓度为3-55×10⁶cell/mL，接种到500L生物反应器中，待细胞浓度达到2-85×10⁶cell/mL时，接种rBac-P36-DnaK-ffh，反应器培养条件为pH值6.0-6.5、温度25-27℃、溶氧30-80%、搅拌速度100-180rpm。考虑到细胞培养的最适条件，优选的pH6.2、细胞培养阶段温度设定27℃、溶氧50%、搅拌速度100-180rpm。在感染之后继续培养5-9天后，加入千分之一终浓度BEI，37℃作用48h后，加千分之二终浓度Na₂S₂O₃终止灭活。通过离心或中空纤维过滤的方法收获细胞培养上清，置2-8℃保存P36-DnaK-ffh蛋白原液。同时以同样的方法制备表达P97-P46-DnaJ和各对照组的蛋白原液。

实施例9蛋白纯化

1．将收获的原液使用阳离子交换层析法进行纯化

使用强阳离子层析填料POROS 50HS进行离子交换层析，填料使用前使用0.5MNaOH进行消毒。然后用微滤缓冲液在室温平衡，然后将疫苗原液以125 mL/min的速率上柱，然后用漂洗buffer A（0.05 M MOPS(钠盐)，pH=7.0，0.5M NaCl）洗脱8个柱体积。然后以buffer A和buffer B线性梯度进行洗脱，从0% buffer B（此时buffer A为100%）到100%buffer B(0.05 M MOPS(钠盐)，pH=7.0，1.5M NaCl)（此时buffer A为0%），其中线性洗脱一共洗脱了10个柱体积，然后平均分别收获这10个柱体积的洗脱物。线性洗脱完后，再用buffer B洗脱2个柱体积，并分别收集。将收集的样品放在2 L的无菌的塑料瓶中放置在4℃。然后将最后一个洗脱峰（A280）下收集的组份无菌过滤储存在4℃。

2．羟基磷灰石疏水层析

使用预装羟基磷灰石柱（CHT™ Ceramic Hydroxyapatite Type II Media），首先使用50 mM MOPS(钠盐)，pH=7.0，1.25M NaCl进行平衡，然后将上面初步纯化的样品以90cm/h进行上样，上完样后使用8体积的平衡液进行洗脱直至UV值为零。然后使用洗脱液（0.2M 磷酸盐，pH=7.0，1.25 M NaCl）进行梯度洗脱，洗脱液浓度从0%到100%，速度仍然是90cm/h，洗脱体积是4个柱体积。纯化得到目的蛋白。

将纯化的目的蛋白使用BCA总蛋白定量，然后结合灰度扫描确定目的蛋白纯度，纯化后的蛋白如图10所示，P36-DnaK-ffh蛋白浓度为320 μg/mL，纯度为92%；P97-P46-DnaJ蛋白浓度为312 μg/mL，纯度为95%。

实施例10琼扩检测

使用琼扩方法检测表达的P36-DnaK-ffh蛋白和P97-P46-DnaJ蛋白效价。在琼脂糖凝胶板上打梅花孔，在梅花孔中间加入Mhp琼扩检测标准血清，周围分别加入稀释了2的0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10次方的表达抗原。倒置孵育72 h后观察沉淀线。出现沉淀线的最大稀释比例为其琼扩效价。琼扩效价检测结果如下：P36-DnaK-ffh蛋白琼扩效价为1：256，P97-P46-DnaJ蛋白琼扩效价为1：128。

实施例11 疫苗制备

将实施例9中所收获的重组蛋白原液按表10分组所示制备成疫苗，具体操作如下：将每组适量重组蛋白原液等比例混合加入到MONTANIDE ISA 201 VG佐剂中（体积比为46：54），使得最终乳化好的疫苗中蛋白浓度为100µg/mL，乳化、质检合格后置于4℃保存。

表10

实施例12 免疫实验

试验一：非靶动物安全性试验

选用16～18g健康小鼠20只，随机分为4组，分别为实施例11中试验组3组，另设空白对照组，每组5只。试验组组小鼠各颈部皮下注射对应组分疫苗1.0mL，空白注射同等剂量佐剂，连续观察14天，各组小鼠均不出现死亡及不良反应，无临床异常表现，证明本发明疫苗对非靶动物使用安全。

试验二：效力检验

1）抗体水平检测：取14~21日龄仔猪70头，随机分为4组，前3组分别颈部肌肉注射本实施例免疫组、对照组A、对照组B疫苗2mL，第4组设为阴性对照组，颈部肌肉注射MONTANIDE ISA 201 VG佐剂2mL，同条件下隔离饲养，在首次免疫3周后同种剂量相同途径加强免疫一次。分别于首免前和首免后14、28、42日前腔静脉采血，分离血清，用ELISA方法检测各组的抗体水平，结果如表11所示。

表11

判定：S/P<0.3，血清中Mhp抗体阴性；S/P>0.4，血清中Mhp抗体阳性。

2）免疫攻毒保护试验：采血完成后，对免疫组和对照组仔猪用CVCC354株（购自中国兽医药品检查所，该菌株为中国兽医药品监察所保藏的Mhp疫苗效力检验用毒株）气管注射5mL/头（100MID）进行攻毒，攻毒后30天，称取并记录各组猪免疫前后的体重，观察各组猪存活情况并剖杀各组试验猪，对各组试验猪进行肺病变分析，肺脏的尖叶、心叶、中间叶或膈叶前缘呈“胰样变”或“肉样变”，视为病变。按28分计分法记录猪肺炎病变分数，对每只猪的肺病变进行评分，按公式计算肺炎病变减少率。结果如表12所示。

表12

应当理解，以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

序列表

<110> 苏州世诺生物技术有限公司、苏州米迪生物技术有限公司

<120> 猪肺炎支原体基因工程亚单位疫苗、其制备方法及应用

<160> 15

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1608

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 1

atgagcggca ccgtgctgga taccgcgcgc ctgcagtttg cgattgcgaa acgcgcgaaa 60

gtgagcccga acagcgtgca ggcgtatgtg atgggcgaac atggcgatag cagctttgtg 120

gcgtatagca acattaaaat tgcgggcgaa tgcttttgcg cgtatagcaa actgaccggc 180

attgatagca gcaactatga aaaagaactg gaatatccgg tgagccgccg cgcgtatgaa 240

attattaacc gcaaacgcgc gaccttttat ggcattggcg cggcgattgc gaaaattgtg 300

agcaacatta ttaaagatac caaaaacatt atgattgcgg gcgcgaacct gcgcggcgaa 360

tatggctttc atggcgtgaa cattggcgtg ccggtggtgc tgggcgcgaa cggcattgaa 420

aaaattattg aaattagcct gaacgataaa gaaaaagaaa aatttgcgaa aagcgtggcg 480

attattgata aaatttatca ggatgcgatt aaaaacatta ttattgaaaa ccagaaaccg 540

gtggtgctgg aaaacccgaa cggcaaacgc accaccccga gcgtggtggc gtttaaaaac 600

aacgaagaaa ttgtgggcga tgcggcgaaa cgccagctgg aaaccaaccc ggaagcgatt 660

gcgagcatta aacgcctgat gggcaccgat aaaaccgtgc gcgcgaacga acgcgattat 720

aaaccggaag aaattagcgc gaaaattctg gcgtatctga aagaatatgc ggaaaaaaaa 780

attggccata aagtgaccaa agcggtgatt accgtgccgg cgtattttga taacgcgcag 840

cgcgaagcga ccaaaaacgc gggcaaaatt gcgggcctgc aggtggaacg cattattaac 900

gaaccgaccg cggcggcgct ggcgtttggc ctggataaaa ccgaaaaaga aatgaaagtg 960

ctggtgtatg atctgggcgg cggcaccttt gatgtgagcg tgctggaact gagcggcggc 1020

acctttgaag tgctgagcac cagcggcgat aaccatctgg gcggcgatga ttgggataac 1080

gaatatgtgg aaaaaagccc ggtgcagatt gcgaaagaag cgctgattta tagcaaaaac 1140

aacgattttg atctggtgat ttttgatacc gcgggccgcc tgagcattaa cgaagaactg 1200

atgaacgaac tgagcgaaat taaagaaaac attaaaccgg atcagattct gtttattctg 1260

gatgcgctga gcggccagga tattattaac gtggcgcaga tttttaacca gaaaattaac 1320

ctgaccggcg cgattattac caaactggat agcaacgcgc gcgcgggcgc ggcgctgagc 1380

attacccatc tgctgaaaat tccggtgctg ctggtgggca ccggcgaaaa aattagcgcg 1440

ctggaactgt ttcatccgaa ccgcatggcg gatcgcattc tgggcatggg cgatgtgcgc 1500

agcctgctgg aacaggcgga agaaaacatt gataaaaaaa ccgtgaaaaa actgagccat 1560

cgcatgttta gcggccagtt tgatctgaac gatctgctga acagctaa 1608

<210> 2

<211> 535

<212> PRT

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 2

Met Ser Gly Thr Val Leu Asp Thr Ala Arg Leu Gln Phe Ala Ile Ala

1 5 10 15

Lys Arg Ala Lys Val Ser Pro Asn Ser Val Gln Ala Tyr Val Met Gly

20 25 30

Glu His Gly Asp Ser Ser Phe Val Ala Tyr Ser Asn Ile Lys Ile Ala

35 40 45

Gly Glu Cys Phe Cys Ala Tyr Ser Lys Leu Thr Gly Ile Asp Ser Ser

50 55 60

Asn Tyr Glu Lys Glu Leu Glu Tyr Pro Val Ser Arg Arg Ala Tyr Glu

65 70 75 80

Ile Ile Asn Arg Lys Arg Ala Thr Phe Tyr Gly Ile Gly Ala Ala Ile

85 90 95

Ala Lys Ile Val Ser Asn Ile Ile Lys Asp Thr Lys Asn Ile Met Ile

100 105 110

Ala Gly Ala Asn Leu Arg Gly Glu Tyr Gly Phe His Gly Val Asn Ile

115 120 125

Gly Val Pro Val Val Leu Gly Ala Asn Gly Ile Glu Lys Ile Ile Glu

130 135 140

Ile Ser Leu Asn Asp Lys Glu Lys Glu Lys Phe Ala Lys Ser Val Ala

145 150 155 160

Ile Ile Asp Lys Ile Tyr Gln Asp Ala Ile Lys Asn Ile Ile Ile Glu

165 170 175

Asn Gln Lys Pro Val Val Leu Glu Asn Pro Asn Gly Lys Arg Thr Thr

180 185 190

Pro Ser Val Val Ala Phe Lys Asn Asn Glu Glu Ile Val Gly Asp Ala

195 200 205

Ala Lys Arg Gln Leu Glu Thr Asn Pro Glu Ala Ile Ala Ser Ile Lys

210 215 220

Arg Leu Met Gly Thr Asp Lys Thr Val Arg Ala Asn Glu Arg Asp Tyr

225 230 235 240

Lys Pro Glu Glu Ile Ser Ala Lys Ile Leu Ala Tyr Leu Lys Glu Tyr

245 250 255

Ala Glu Lys Lys Ile Gly His Lys Val Thr Lys Ala Val Ile Thr Val

260 265 270

Pro Ala Tyr Phe Asp Asn Ala Gln Arg Glu Ala Thr Lys Asn Ala Gly

275 280 285

Lys Ile Ala Gly Leu Gln Val Glu Arg Ile Ile Asn Glu Pro Thr Ala

290 295 300

Ala Ala Leu Ala Phe Gly Leu Asp Lys Thr Glu Lys Glu Met Lys Val

305 310 315 320

Leu Val Tyr Asp Leu Gly Gly Gly Thr Phe Asp Val Ser Val Leu Glu

325 330 335

Leu Ser Gly Gly Thr Phe Glu Val Leu Ser Thr Ser Gly Asp Asn His

340 345 350

Leu Gly Gly Asp Asp Trp Asp Asn Glu Tyr Val Glu Lys Ser Pro Val

355 360 365

Gln Ile Ala Lys Glu Ala Leu Ile Tyr Ser Lys Asn Asn Asp Phe Asp

370 375 380

Leu Val Ile Phe Asp Thr Ala Gly Arg Leu Ser Ile Asn Glu Glu Leu

385 390 395 400

Met Asn Glu Leu Ser Glu Ile Lys Glu Asn Ile Lys Pro Asp Gln Ile

405 410 415

Leu Phe Ile Leu Asp Ala Leu Ser Gly Gln Asp Ile Ile Asn Val Ala

420 425 430

Gln Ile Phe Asn Gln Lys Ile Asn Leu Thr Gly Ala Ile Ile Thr Lys

435 440 445

Leu Asp Ser Asn Ala Arg Ala Gly Ala Ala Leu Ser Ile Thr His Leu

450 455 460

Leu Lys Ile Pro Val Leu Leu Val Gly Thr Gly Glu Lys Ile Ser Ala

465 470 475 480

Leu Glu Leu Phe His Pro Asn Arg Met Ala Asp Arg Ile Leu Gly Met

485 490 495

Gly Asp Val Arg Ser Leu Leu Glu Gln Ala Glu Glu Asn Ile Asp Lys

500 505 510

Lys Thr Val Lys Lys Leu Ser His Arg Met Phe Ser Gly Gln Phe Asp

515 520 525

Leu Asn Asp Leu Leu Asn Ser

530 535

<210> 3

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 3

ataggatcca tgagcggcac cgtgctggat acc 33

<210> 4

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 4

ataaagcttt tagctgttca gcagatcgtt cagatc 36

<210> 5

<211> 1647

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 5

atggaaacca ccaaagaagg caaacgcgaa gaagtggata aaaaagtgaa agaactggat 60

aacaaaatta aaggcattct gccgcagccg ccggcggcga aaccggaagc ggcgaaaccg 120

gtggcggcga aaccggaaac caccaaaccg gtggcggcga aaccggaagc ggcgaaaccg 180

gaagcggcga aaccggtggc ggcgaaaccg gaagcggcga aaccggtggc ggcgaaaccg 240

gaagcggcga aaccggtggc ggcgaaaccg gaagcggcga aaccggtggc ggcgaaaccg 300

gaagcggcga aaccggtggc gaccaacacc ggctttagcc tgaccaacaa accgaaagaa 360

gattattttc cgatggcgtt tagctataaa ctggaatata ccgatgaaaa caaactgagc 420

ctgaaaaccc cggaaattaa cgtgaccagc gatcagtatc agaaactgag ccatccgatg 480

atgaccgaag gcagcagcaa ccagggcaaa aaaagcgaag gcaccccgaa ccagggcaaa 540

aaagcggaag gcgcgccgaa ccagggcaaa aaagcggaag gcaccccgaa ccagggcaaa 600

aaagcggaaa tgaaaaacag cgaaaacaaa attattgatc tgagcccgga tggcgaaaac 660

gcggtgtatg tgccgggctg gaactatggc accgcgggcc agcgcattca gagctttctg 720

accattaaca aagatccggc gggcggcaac aaaattaaag cggtgggcag caaaccggcg 780

agcattttta aaggctttct ggcgccgaac gatggcatgg cggaacaggc gattaccaaa 840

ctgaaactgg aaggctttga tacccagaaa atttttgtga ccggccagga ttataacgat 900

aaagcgaaaa cctttattaa agatggcgat cagaacatga ccatttataa accggataaa 960

gtgctgggca aagtggcggt ggaagtgctg cgcgtgctga ttgcgaaaaa aaacaaagcg 1020

agccgcagcg aagtggaaaa cgaactgaaa gcgaaactgc cgaacattag ctttaaatat 1080

gataaccaga cctataaagt gcagggcaaa aacattaaca ccattctggt gagcccggtg 1140

attgtgacca aagcgaacgt ggataacccg gatgcggtgg aaaccaaaga agaagtgacc 1200

attaaaattc cggcgggcat tcaggatggc atgtttattc gcgtggcggg ctttggcggc 1260

ccgggccata aaggcggccc gagcggcgat ctgcatctgg aaattaacgt gcgccagcat 1320

aaacatttta cccgcagcgg caacgatatt catgtgaaca tgccggtgag cattattgat 1380

attattaacc agaacaccgt ggaagtgccg agcccgaccg gcctgaaaaa agtgcgcctg 1440

tatgattatt ataaaagcgg ccagattgtg aacgtgctgc gcgcgggcgc gccggatccg 1500

aaaaacccgc gcattattgg cgatctgaaa gtgcatctga ttttttatat tccggaattt 1560

agcccgcgcc agaaagatga actgaaccag gtgtttgcgc agattaacga taaaaccaaa 1620

gcgaaatggc tgaaagaatt tcagtaa 1647

<210> 6

<211> 548

<212> PRT

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 6

Met Glu Thr Thr Lys Glu Gly Lys Arg Glu Glu Val Asp Lys Lys Val

1 5 10 15

Lys Glu Leu Asp Asn Lys Ile Lys Gly Ile Leu Pro Gln Pro Pro Ala

20 25 30

Ala Lys Pro Glu Ala Ala Lys Pro Val Ala Ala Lys Pro Glu Thr Thr

35 40 45

Lys Pro Val Ala Ala Lys Pro Glu Ala Ala Lys Pro Glu Ala Ala Lys

50 55 60

Pro Val Ala Ala Lys Pro Glu Ala Ala Lys Pro Val Ala Ala Lys Pro

65 70 75 80

Glu Ala Ala Lys Pro Val Ala Ala Lys Pro Glu Ala Ala Lys Pro Val

85 90 95

Ala Ala Lys Pro Glu Ala Ala Lys Pro Val Ala Thr Asn Thr Gly Phe

100 105 110

Ser Leu Thr Asn Lys Pro Lys Glu Asp Tyr Phe Pro Met Ala Phe Ser

115 120 125

Tyr Lys Leu Glu Tyr Thr Asp Glu Asn Lys Leu Ser Leu Lys Thr Pro

130 135 140

Glu Ile Asn Val Thr Ser Asp Gln Tyr Gln Lys Leu Ser His Pro Met

145 150 155 160

Met Thr Glu Gly Ser Ser Asn Gln Gly Lys Lys Ser Glu Gly Thr Pro

165 170 175

Asn Gln Gly Lys Lys Ala Glu Gly Ala Pro Asn Gln Gly Lys Lys Ala

180 185 190

Glu Gly Thr Pro Asn Gln Gly Lys Lys Ala Glu Met Lys Asn Ser Glu

195 200 205

Asn Lys Ile Ile Asp Leu Ser Pro Asp Gly Glu Asn Ala Val Tyr Val

210 215 220

Pro Gly Trp Asn Tyr Gly Thr Ala Gly Gln Arg Ile Gln Ser Phe Leu

225 230 235 240

Thr Ile Asn Lys Asp Pro Ala Gly Gly Asn Lys Ile Lys Ala Val Gly

245 250 255

Ser Lys Pro Ala Ser Ile Phe Lys Gly Phe Leu Ala Pro Asn Asp Gly

260 265 270

Met Ala Glu Gln Ala Ile Thr Lys Leu Lys Leu Glu Gly Phe Asp Thr

275 280 285

Gln Lys Ile Phe Val Thr Gly Gln Asp Tyr Asn Asp Lys Ala Lys Thr

290 295 300

Phe Ile Lys Asp Gly Asp Gln Asn Met Thr Ile Tyr Lys Pro Asp Lys

305 310 315 320

Val Leu Gly Lys Val Ala Val Glu Val Leu Arg Val Leu Ile Ala Lys

325 330 335

Lys Asn Lys Ala Ser Arg Ser Glu Val Glu Asn Glu Leu Lys Ala Lys

340 345 350

Leu Pro Asn Ile Ser Phe Lys Tyr Asp Asn Gln Thr Tyr Lys Val Gln

355 360 365

Gly Lys Asn Ile Asn Thr Ile Leu Val Ser Pro Val Ile Val Thr Lys

370 375 380

Ala Asn Val Asp Asn Pro Asp Ala Val Glu Thr Lys Glu Glu Val Thr

385 390 395 400

Ile Lys Ile Pro Ala Gly Ile Gln Asp Gly Met Phe Ile Arg Val Ala

405 410 415

Gly Phe Gly Gly Pro Gly His Lys Gly Gly Pro Ser Gly Asp Leu His

420 425 430

Leu Glu Ile Asn Val Arg Gln His Lys His Phe Thr Arg Ser Gly Asn

435 440 445

Asp Ile His Val Asn Met Pro Val Ser Ile Ile Asp Ile Ile Asn Gln

450 455 460

Asn Thr Val Glu Val Pro Ser Pro Thr Gly Leu Lys Lys Val Arg Leu

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Tyr Asp Tyr Tyr Lys Ser Gly Gln Ile Val Asn Val Leu Arg Ala Gly

485 490 495

Ala Pro Asp Pro Lys Asn Pro Arg Ile Ile Gly Asp Leu Lys Val His

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Leu Ile Phe Tyr Ile Pro Glu Phe Ser Pro Arg Gln Lys Asp Glu Leu

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Asn Gln Val Phe Ala Gln Ile Asn Asp Lys Thr Lys Ala Lys Trp Leu

530 535 540

Lys Glu Phe Gln

545

<210> 7

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 7

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<210> 8

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 8

ataaagcttt tactgaaatt ctttcagcca ttt 33

<210> 9

<211> 1749

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 9

atggaaacca ccaaagaagg caaacgcgaa gaagtggata aaaaagtgaa agaactggat 60

aacaaaatta aaggcattct gccgcagccg ccggcggcga aaccggaagc ggcgaaaccg 120

gtggcggcga aaccggaaac caccaaaccg gtggcggcga aaccggaagc ggcgaaaccg 180

gaagcggcga aaccggtggc ggcgaaaccg gaagcggcga aaccggtggc ggcgaaaccg 240

gaagcggcga aaccggtggc ggcgaaaccg gaagcggcga aaccggtggc ggcgaaaccg 300

gaagcggcga aaccggtggc gaccaacacc ggctttagcc tgaccaacaa accgaaagaa 360

gattattttc cgatggcgtt tagctataaa ctggaatata ccgatgaaaa caaactgagc 420

ctgaaaaccc cggaaattaa cgtgtttctg gaactggtgc atcagagcga atatgaagaa 480

caggaaatta ttaaagaact ggataaaacc gtgctgaacc tgcagtatca gtttcaggaa 540

gtgaaagtga ccagcgatca gtatcagaaa ctgagccatc cgatgatgac cgaaggcagc 600

agcaaccagg gcaaaaaaag cgaaggcacc ccgaaccagg gcaaaaaagc ggaaggcgcg 660

ccgaaccagg gcaaaaaagc ggaaggcacc ccgaaccagg gcaaaaaagc ggaaatgaaa 720

aacagcgaaa acaaaattat tgatctgagc ccggatggcg aaaacgcggt gtatgtgccg 780

ggctggaact atggcaccgc gggccagcgc attcagagct ttctgaccat taacaaagat 840

ccggcgggcg gcaacaaaat taaagcggtg ggcagcaaac cggcgagcat ttttaaaggc 900

tttctggcgc cgaacgatgg catggcggaa caggcgatta ccaaactgaa actggaaggc 960

tttgataccc agaaaatttt tgtgaccggc caggattata acgataaagc gaaaaccttt 1020

attaaagatg gcgatcagaa catgaccatt tataaaccgg ataaagtgct gggcaaagtg 1080

gcggtggaag tgctgcgcgt gctgattgcg aaaaaaaaca aagcgagccg cagcgaagtg 1140

gaaaacgaac tgaaagcgaa actgccgaac attagcttta aatatgataa ccagacctat 1200

aaagtgcagg gcaaaaacat taacaccatt ctggtgagcc cggtgattgt gaccaaagcg 1260

aacgtggata acccggatgc ggtggaaacc aaagaagaag tgaccattaa aattccggcg 1320

ggcattcagg atggcatgtt tattcgcgtg gcgggctttg gcggcccggg ccataaaggc 1380

ggcccgagcg gcgatctgca tctggaaatt aacgtgcgcc agcataaaca ttttacccgc 1440

agcggcaacg atattcatgt gaacatgccg gtgagcatta ttgatattat taaccagaac 1500

accgtggaag tgccgagccc gaccggcctg aaaaaagtgc gcctgtatga ttattataaa 1560

agcggccaga ttgtgaacgt gctgcgcgcg ggcgcgccgg atccgaaaaa cccgcgcatt 1620

attggcgatc tgaaagtgca tctgattttt tatattccgg aatttagccc gcgccagaaa 1680

gatgaactga accaggtgtt tgcgcagatt aacgataaaa ccaaagcgaa atggctgaaa 1740

gaatttcag 1749

<210> 10

<211> 711

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 10

gaaaccacca aagaaggcaa acgcgaagaa gtggataaaa aagtgaaaga actggataac 60

aaaattaaag gcattctgcc gcagccgccg gcggcgaaac cggaagcggc gaaaccggtg 120

gcggcgaaac cggaaaccac caaaccggtg gcggcgaaac cggaagcggc gaaaccggaa 180

gcggcgaaac cggtggcggc gaaaccggaa gcggcgaaac cggtggcggc gaaaccggaa 240

gcggcgaaac cggtggcggc gaaaccggaa gcggcgaaac cggtggcggc gaaaccggaa 300

gcggcgaaac cggtggcgac caacaccggc tttagcctga ccaacaaacc gaaagaagat 360

tattttccga tggcgtttag ctataaactg gaatataccg atgaaaacaa actgagcctg 420

aaaaccccgg aaattaacgt gtttctggaa ctggtgcatc agagcgaata tgaagaacag 480

gaaattatta aagaactgga taaaaccgtg ctgaacctgc agtatcagtt tcaggaagtg 540

aaagtgacca gcgatcagta tcagaaactg agccatccga tgatgaccga aggcagcagc 600

aaccagggca aaaaaagcga aggcaccccg aaccagggca aaaaagcgga aggcgcgccg 660

aaccagggca aaaaagcgga aggcaccccg aaccagggca aaaaagcgga a 711

<210> 11

<211> 567

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 11

atgaaaaaca gcgaaaacaa aattattgat ctgagcccgg atggcgaaaa cgcggtgtat 60

gtgccgggct ggaactatgg caccgcgggc cagcgcattc agagctttct gaccattaac 120

aaagatccgg cgggcggcaa caaaattaaa gcggtgggca gcaaaccggc gagcattttt 180

aaaggctttc tggcgccgaa cgatggcatg gcggaacagg cgattaccaa actgaaactg 240

gaaggctttg atacccagaa aatttttgtg accggccagg attataacga taaagcgaaa 300

acctttatta aagatggcga tcagaacatg accatttata aaccggataa agtgctgggc 360

aaagtggcgg tggaagtgct gcgcgtgctg attgcgaaaa aaaacaaagc gagccgcagc 420

gaagtggaaa acgaactgaa agcgaaactg ccgaacatta gctttaaata tgataaccag 480

acctataaag tgcagggcaa aaacattaac accattctgg tgagcccggt gattgtgacc 540

aaagcgaacg tggataaccc ggatgcg 567

<210> 12

<211> 468

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 12

gtggaaacca aagaagaagt gaccattaaa attccggcgg gcattcagga tggcatgttt 60

attcgcgtgg cgggctttgg cggcccgggc cataaaggcg gcccgagcgg cgatctgcat 120

ctggaaatta acgtgcgcca gcataaacat tttacccgca gcggcaacga tattcatgtg 180

aacatgccgg tgagcattat tgatattatt aaccagaaca ccgtggaagt gccgagcccg 240

accggcctga aaaaagtgcg cctgtatgat tattataaaa gcggccagat tgtgaacgtg 300

ctgcgcgcgg gcgcgccgga tccgaaaaac ccgcgcatta ttggcgatct gaaagtgcat 360

ctgatttttt atattccgga atttagcccg cgccagaaag atgaactgaa ccaggtgttt 420

gcgcagatta acgataaaac caaagcgaaa tggctgaaag aatttcag 468

<210> 13

<211> 516

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 13

agcggcaccg tgctggatac cgcgcgcctg cagtttgcga ttgcgaaacg cgcgaaagtg 60

agcccgaaca gcgtgcaggc gtatgtgatg ggcgaacatg gcgatagcag ctttgtggcg 120

tatagcaaca ttaaaattgc gggcgaatgc ttttgcgcgt atagcaaact gaccggcatt 180

gatagcagca actatgaaaa agaactggaa tatccggtga gccgccgcgc gtatgaaatt 240

attaaccgca aacgcgcgac cttttatggc attggcgcgg cgattgcgaa aattgtgagc 300

aacattatta aagataccaa aaacattatg attgcgggcg cgaacctgcg cggcgaatat 360

ggctttcatg gcgtgaacat tggcgtgccg gtggtgctgg gcgcgaacgg cattgaaaaa 420

attattgaaa ttagcctgaa cgataaagaa aaagaaaaat ttgcgaaaag cgtggcgatt 480

attgataaaa tttatcagga tgcgattaaa aacatt 516

<210> 14

<211> 564

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 14

attattgaaa accagaaacc ggtggtgctg gaaaacccga acggcaaacg caccaccccg 60

agcgtggtgg cgtttaaaaa caacgaagaa attgtgggcg atgcggcgaa acgccagctg 120

gaaaccaacc cggaagcgat tgcgagcatt aaacgcctga tgggcaccga taaaaccgtg 180

cgcgcgaacg aacgcgatta taaaccggaa gaaattagcg cgaaaattct ggcgtatctg 240

aaagaatatg cggaaaaaaa aattggccat aaagtgacca aagcggtgat taccgtgccg 300

gcgtattttg ataacgcgca gcgcgaagcg accaaaaacg cgggcaaaat tgcgggcctg 360

caggtggaac gcattattaa cgaaccgacc gcggcggcgc tggcgtttgg cctggataaa 420

accgaaaaag aaatgaaagt gctggtgtat gatctgggcg gcggcacctt tgatgtgagc 480

gtgctggaac tgagcggcgg cacctttgaa gtgctgagca ccagcggcga taaccatctg 540

ggcggcgatg attgggataa cgaa 564

<210> 15

<211> 522

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 15

tatgtggaaa aaagcccggt gcagattgcg aaagaagcgc tgatttatag caaaaacaac 60

gattttgatc tggtgatttt tgataccgcg ggccgcctga gcattaacga agaactgatg 120

aacgaactga gcgaaattaa agaaaacatt aaaccggatc agattctgtt tattctggat 180

gcgctgagcg gccaggatat tattaacgtg gcgcagattt ttaaccagaa aattaacctg 240

accggcgcga ttattaccaa actggatagc aacgcgcgcg cgggcgcggc gctgagcatt 300

acccatctgc tgaaaattcc ggtgctgctg gtgggcaccg gcgaaaaaat tagcgcgctg 360

gaactgtttc atccgaaccg catggcggat cgcattctgg gcatgggcga tgtgcgcagc 420

ctgctggaac aggcggaaga aaacattgat aaaaaaaccg tgaaaaaact gagccatcgc 480

atgtttagcg gccagtttga tctgaacgat ctgctgaaca gc 522

Claims

1.蛋白组合物，包含：

序列如SEQ ID NO:2所示的第一融合蛋白，以及

序列如SEQ ID NO:6所示的第二融合蛋白。

2.基因组合物，包含分别用于编码权利要求1所述蛋白组合物中第一融合蛋白、第二融合蛋白的基因。

3.如权利要求2所述的基因组合物，其特征在于包含：

序列如SEQ ID NO:1所示的第一核酸分子，以及

序列如SEQ ID NO:5所示的第二核酸分子。

4.重组载体组合物，包括：

包含权利要求1所述蛋白组合物中第一融合蛋白的编码基因的第一重组载体，以及

5.如权利要求4所述的重组载体组合物，其特征在于：所述第一重组载体、第二重组载体包括pFastBac 1、pVL1393或pFastBac dual。

6.宿主细胞组合物，包括：

包含权利要求1所述蛋白组合物中第一融合蛋白的编码基因的第一宿主细胞，以及

7.如权利要求6所述的宿主细胞组合物，其特征在于：所述第一宿主细胞、第二宿主细胞选自昆虫细胞，所述昆虫细胞包括Sf9、High Five或 Sf21细胞。

8.一种免疫组合物，其特征在于包括：权利要求1所述的蛋白组合物；以及，医药学上可接受的载体。

9.如权利要求8所述的免疫组合物，其特征在于：所述医药学上可接受的载体包括MONTANIDE ISA 206 VG、MONTANIDE ISA 201 VG、液体石蜡、樟脑油、植物细胞凝集素之中的任意一种或者两种以上的组合。

10.一种蛋白组合物的制备方法，其特征在于包括：

提供权利要求1所述蛋白组合物中第一融合蛋白、第二融合蛋白的编码基因；

11.如权利要求10所述的制备方法，其特征在于：所述穿梭载体包括pFastBac 1、pVL1393或pFastBac dual；和/或，所述昆虫细胞包括Sf9、High Five或 Sf21细胞。

12.一种猪肺炎支原体基因工程亚单位疫苗的制备方法，其特征在于包括：采用权利要求10-11中任一项所述的方法制备第一融合蛋白、第二融合蛋白，并将所述第一融合蛋白、第二融合蛋白与医药学上可接受的载体混合。

13.如权利要求1所述蛋白组合物或权利要求8或9所述免疫组合物在生产用于在受试动物中诱导针对猪肺炎支原体抗原的免疫反应的药剂，或者，在生产用于预防动物受猪肺炎支原体感染的药剂中的用途。

14.如权利要求1所述蛋白组合物或权利要求8或9所述免疫组合物在制备猪肺炎支原体基因工程亚单位疫苗中的用途。