CN109678968A - 猪肺炎支原体亚单位疫苗及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供猪肺炎支原体亚单位疫苗及其制备方法与应用。本发明将支原体的多个抗原蛋白通过柔性Linker连接，表达为一个嵌合蛋白，并使得各个蛋白互不影响，均能保留各自的免疫原性。通过给嵌合蛋白添加大肠杆菌不耐热性肠毒素B亚基和树突状细胞诱导肽，大大增强疫苗的粘膜免疫保护效果。本发明还涉及猪肺炎支原体嵌合抗原的制备方法及其在预防猪肺炎支原体感染的亚单位疫苗中的应用。将本发明的支原体嵌合抗原在巨大芽孢杆菌中表达，可用于工业化制备安全的猪肺炎支原体亚单位疫苗。

Description

猪肺炎支原体亚单位疫苗及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于兽用疫苗领域，具体地说，涉及猪肺炎支原体亚单位疫苗及其制备方法与应用。
背景技术
猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp)可引起猪支原体肺炎，又称地方流行性肺炎，是猪的一种慢性消耗性呼吸道病，临床感染率极高。其主要症状为咳嗽和气喘，以高发病率和低死亡率为特点。猪群一旦感染Mhp，便难以清除，不仅严重影响猪群的生长发育，用药量增加，而且容易继发感染PRRSV、PCV等，从而导致多种疫苗接种失败。猪支原体肺炎在我国发病率为50％～80％，新疫区死亡率5％～15％(多为乳猪和断奶仔猪)，患病猪生长率平均下降15.9％左右，饲料利用率下降14％左右，平均推迟出栏时间20d左右。猪肺炎支原体作为猪呼吸道病综合征的重要病原之一，多呈地方性流行，直接或间接对养猪业造成了巨大的经济损失。因此，在临床上控制猪肺炎支原体病不仅对该病本身而且对其它疾病的控制都十分重要，为提高猪群整体健康水平提供了保障。
由于猪肺炎支原体对培养基的营养条件要求非常苛刻，在一般的培养基中很难生长，是动物支原体中较难培养的一种，并且培养周期长，培养过程中极易污染猪鼻支原体，猪絮状支原体等，使得肺炎支原体全菌灭活苗生产成本居高不下。虽然杆状病毒表达系统表达蛋白具有翻译后修饰系统，利用杆状病毒在昆虫细胞中表达外源基因，能进行翻译后的修饰、蛋白质的正确折叠和糖基化，对表达的真核基因产物能更好地进行磷酸化、酰胺化、切割信号肽以及形成三级或四级结构等优点，但其存在生产成本高，步骤多，周期长，生产质量不易控制等缺点。大肠杆菌表达系统虽然系统简单易操作，但存在内毒素污染及不能分泌表达等问题。
发明内容
本发明的目的是提供猪肺炎支原体亚单位疫苗及其制备方法与应用。
为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种猪肺炎支原体嵌合蛋白，所述嵌合蛋白的结构为LTB-P36-P65-P46-Dcpep或LTB-P97-LpptM-P146-Dcpep。
其中，LTB为大肠杆菌不耐热性肠毒素B亚基，Dcpep为树突状细胞诱导肽，P36、P46、P65、P97、LpptM、P146来自猪肺炎支原体膜蛋白，且各单元之间通过柔性Linker连接。
优选地，所述柔性Linker的氨基酸序列可以是GGGGSGGGGSGGGGS、VPGVGVPGVG或AEAAAKEAAAKEAAAKA。
本发明中，LTB、Dcpep、P36、P46、P65、P97(P97C)、LpptM、P146(P146N)的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:3-10所示。
优选地，嵌合蛋白LTB-P36-P65-P46-Dcpep的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
嵌合蛋白LTB-P97-LpptM-P146-Dcpep的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
第二方面，本发明提供编码所述嵌合蛋白的基因。
第三方面，本发明提供含有编码所述嵌合蛋白的基因的生物材料，所述生物材料包括但不限于重组DNA、表达盒、转座子、质粒载体、噬菌体载体、病毒载体或工程菌。
第四方面，本发明提供所述嵌合蛋白或其编码基因或含有所述编码基因的生物材料在制备猪肺炎支原体亚单位疫苗中的应用。
第五方面，本发明提供猪肺炎支原体亚单位疫苗，有效成分为所述嵌合蛋白LTB-P36-P65-P46-Dcpep和LTB-P97-LpptM-P146-Dcpep。
第六方面，本发明提供所述亚单位疫苗的制备方法：将所述嵌合蛋白LTB-P36-P65-P46-Dcpep和LTB-P97-LpptM-P146-Dcpep与适量佐剂混合，即得。
所述亚单位疫苗中LTB-P36-P65-P46-Dcpep、LTB-P97-LpptM-P146-Dcpep的终浓度均为150ug/mL。
优选地，所述佐剂选自Gel01、Montanide ISA 51VG。
本发明所述嵌合蛋白的制备方法如下：根据GenBank中公布的LTB、Dcpep、P36、P46、P65、P97、LpptM、P146基因序列(参照Mhp J株NC_007295.1)，分别按照宿主菌(真核表达系统)密码子的偏爱性进行优化，然后将优化后的基因序列依次串联连接，人工合成编码LTB-P36-P65-P46-Dcpep、LTB-P97-LpptM-P146-Dcpep的嵌合基因，然后按照以下方案①或②进行目的蛋白的表达；
方案①：将两个嵌合基因构建到不同的表达载体上，分别导入宿主菌中进行表达；
方案②：将两个嵌合基因构建到同一表达载体上，且两个嵌合基因分别位于不同的表达盒中，将携带两个嵌合基因的表达载体导入宿主菌中进行表达。
可选地，所述宿主菌为巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、毕赤酵母(Pichiapastoris)。
在本发明的一个具体实施方式中，所述嵌合蛋白的制备方法如下：
根据GenBank中公布的LTB、Dcpep、P36、P46、P65、P97、LpptM、P146基因序列(参照Mhp J株NC_007295.1)，分别按照巨大芽孢杆菌密码子的偏爱性进行优化，然后将优化后的基因序列依次串联连接，人工合成编码LTB-P36-P65-P46-Dcpep、LTB-P97-LpptM-P146-Dcpep的嵌合基因，然后按照以下方案I或II进行目的蛋白的表达；
方案I：将两个嵌合基因构建到不同的表达载体上，分别导入巨大芽孢杆菌中进行表达；
方案II：将两个嵌合基因构建到同一表达载体上，且两个嵌合基因分别位于不同的表达盒中，将携带两个嵌合基因的表达载体导入巨大芽孢杆菌中进行表达。
优选地，所述表达载体为pHIS1522。
本发明的工作流程示意图见图1。
第七方面，本发明提供所述亚单位疫苗的以下任一应用：
1)在制备基因工程疫苗中的应用；
2)在预防猪肺炎支原体感染中的应用。
借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：
(一)本发明将支原体的多个抗原蛋白通过柔性Linker连接，表达为一个嵌合蛋白，并使得各个蛋白互不影响，均能保留各自的免疫原性。具体地，将猪肺炎支原体的多个抗原蛋白通过柔性Linker(Gly4Ser)，如GGGGSGGGGSGGGGS连接。Linker较长且柔软，在复性时能够降低嵌合蛋白的两组份间的空间位阻，从而更有利于嵌合蛋白各个结构域的正确折叠，表达为一个嵌合蛋白，使得各个蛋白互不影响，均能保留各自的免疫原性。
(二)利用基因工程手段，在基因水平上将猪肺炎支原体的3个抗原基因进行密码子优化，并进行融合，在巨大芽孢杆菌取得有效的分泌表达，使一个嵌合蛋白可以同时发挥3个抗原蛋白的作用，大大缩短生长周期和降低生产成本。
(三)本发明给嵌合蛋白添加小分子大肠杆菌肠毒素粘膜免疫佐剂LTB(De HL etal.,2010)和树突状细胞诱导肽DCpep(Tyler J.Curiel et al.,2004)，大大增强疫苗的粘膜免疫保护效果。
(四)用巨大芽孢杆菌表达系统来代替大肠杆菌表达系统，解决内毒素问题，并能进行目的蛋白的分泌表达。
(五)目前市面上商品化的猪肺炎支原体疫苗大多为全菌灭活苗，尚无亚单位疫苗，对于猪支原体肺炎来说，灭活苗的效果往往优于亚单位苗。本发明中猪肺炎支原体亚单位疫苗的效果接近于商品化灭活苗，是极具应用前景的亚单位疫苗。
附图说明
图1为本发明的工作流程示意图。
图2为本发明实施例1中重组质粒pHIS1522-fusion1、pHIS1522-fusion2的构建流程图。
图3为本发明实施例1中重组质粒pHIS1522-fusion1、pHIS1522-fusion2的PCR鉴定结果。其中，M1：15000DNA marker；M2：2000Plus DNA marker；1：P36；2：P65；3：P46；4：Fusion1；5：LTB；6：P97C；7：LpptM；8：P146N；9：Fusion2。
图4为本发明实施例1中嵌合蛋白fusion1、fusion2的SDS-PAGE检测结果。其中，M：Protein stander；1：Fusion1蛋白SDS-PAGE检测；2：Fusion2蛋白SDS-PAGE检测。
图5为本发明实施例2中Western blot检测fusion1、fusion2蛋白对小鼠的免疫原性试验结果。
图6为本发明实施例2中ELISA法检测嵌合蛋白fusion1、fusion2亚单位疫苗对小鼠的免疫原性试验结果。如图所示，P36、P46、P97、P146、LpptM、Dank、Cap蛋白在小鼠中具有良好的免疫原性。
图7为本发明实施例2中ELISA法检测嵌合蛋白中大肠杆菌不耐热肠毒素B亚基(LTB)对神经节苷脂GM1的结合作用。如图所示，嵌合蛋白Fusion1、Fusion2中大肠杆菌不耐热肠毒素B亚基(LTB)对神经节苷脂GM1的结合作用跟单体LTB相比差异不明显。
图8为本发明实施例2中外周血单核细胞增殖实验评价DCpep效果。如图所示，Dcpep(嵌合蛋白Fusion2)能有效引起淋巴细胞增殖。
图9为本发明实施例2中嵌合蛋白fusion1、fusion2亚单位疫苗猪中消长规律试验结果。如图所示，P36、P46、P65、P97、P146、LpptM蛋白在猪中具有良好的免疫原性，并在二免后达到最大值，P146蛋白的抗水平值相对来说最低，在70天后开始下降，P46和LpptM的抗体水平较高，并在84天后还维持高抗体水平，P36、P97等抗体水平在70天后也有下降趋势。
图10为本发明实施例2中免疫组织化学染色结果。如图所示，免疫组效果和猪肺炎支原体商品普泰克组不相上下，明显好于对照组。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
实施例1基于巨大芽孢杆菌表达系统的支原体抗原嵌合蛋白表达载体的构建
(一)表达载体构建和鉴定
1、大肠杆菌不耐热性肠毒素LTB基因的获得
参照大肠杆菌LTB基因序列(WP_012846869.1)，根据巨大芽孢杆菌密码子的偏爱性人工合成390bp的LTB基因序列。
2、支原体嵌合蛋白LTB-P36-P65-P46-Dcpep和LTB-P97-LpptM-P146-Dcpep基因的获得及载体构建。
参照Mhp(J株NC_007295.1)的基因组序列，根据P36、P46、P65、P97C、P146N、LpptM等免疫原性蛋白的氨基酸序列，根据巨大芽孢杆菌密码子的偏爱性人工合成LTB-P36-P65-P46-Dcpep和LTB-P97-LpptM-P146-Dcpep嵌合蛋白的基因，并在基因的两端加上相应的酶切位点以便连接载体。在基因片段的上下游引入BamHⅠ和SpelⅠ酶切位点，同时在N端引物6×His标签序列，将上述序列克隆入巨大枯草芽孢杆菌载体pHIS1522中获得重组质粒分别命名为pHIS1522-fusion1、pHIS1522-fusion2。重组质粒的构建流程见图2。
3、重组质粒pHIS1522-fusion1、pHIS1522-fusion2的PCR鉴定
将获得的载体通过首位引物进行PCR鉴定，PCR反应体系见表1。
表1 PCR反应体系
相关的正向引物和反向引物为融合基因的首尾引物(fusion1-F：ccccagtctattacagaactatgt，fusion1-R：tggacgttgtggtgtagagtggtaaga；fusion2-F：cagcccccagcagcaaaaccagaagcag，fusion2-R：agctgacacacttgctttaacttg)。模板为重组质粒。PCR反应条件为：98℃预变性5min，98℃变性15Sec，58℃退火15Sec，72℃延伸25Sec，25个循环；4℃∞1个循环。
PCR结束后，取2μL PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。PCR电泳结果(图3)显示，PCR得到预期的嵌合基因LTB-P36-P65-P46-Dcpep(4422bp)片段和嵌合基因LTB-P97-LpptM-P146-Dcpep(3420bp)片段，大小与预期大小一致，表明嵌合基因LTB-P36-P65-P46-Dcpep，LTB-P97-LpptM-P146-Dcpep已经成功插入pHIS1522中。
(二)目的蛋白的表达、纯化及检测
1、转化巨大芽孢杆菌菌株MS941
重组质粒pHIS1522-fusion1、pHIS1522-fusion2转化巨大芽孢杆菌菌株MS941。在冰上放置5min的EP管内加巨大芽孢杆菌菌株MS941感受态细胞50μL，轻柔混匀，冰浴30min。42℃热击45s，迅速冰浴2-3min。加入200μLNZY液体培养基，37℃，250rpm摇床培养1h。取菌液涂于添加了四环素的LB平板，37℃倒置培养。
2、嵌合蛋白fusion1、fusion2的表达
新鲜活化的平板上挑单菌落接于5ml/25ml LB+tet 50μg/mL，37℃180rpm震荡培养15h，此为一级种子。取一级种子4mL接种于200mL LB加四环素(tet)的培养基(1000mL锥形瓶，四环素终浓度为50μg/mL)，37℃，180rpm培养1.5-2h至菌体OD＝0.5-0.6.加木糖至终浓度为0.2mM，37℃，160rpm诱导培养5h。
3、嵌合蛋白fusion1、fusion2的纯化和检测
6000rpm离心5min收集上清，取上清经Ni柱纯化后用Bradford法进行蛋白浓度测定并进行SDS-PAGE检测。检测结果见图4。
嵌合蛋白fusion1(LTB-P36-P65-P46-Dcpep)、fusion2(LTB-P97-LpptM-P146-Dcpep)的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1-2所示。
实施例2嵌合蛋白fusion1、fusion2亚单位疫苗的配制与动物实验
1、本发明的嵌合蛋白fusion1、fusion2制备的亚单位疫苗
将纯化的fusion1、fusion2测定浓度后与MontanideTM Gel01佐剂(购自SEPPIC)乳化制备成亚单位疫苗，使每毫升中蛋白浓度均为150微克，用于以下实施例，放置4℃存储。
2、本发明的嵌合蛋白fusion1、fusion2制备的亚单位疫苗技术指标的检验
(1)物理性状
外观本品为乳白色均匀乳剂。剂型为单向剂型(水包油)，取一清洁吸管吸取少量疫苗滴于冷水中，水面和水内都有。粘度用出口径为1.2mm吸管吸取疫苗1ml在25℃左右的室温下，令其垂直流出，在8秒钟内流出0.5ml，检测合格。
(2)无菌检验
按照《中国兽药典》附录169-171页进行，结果表明没有细菌生长。
(3)安全检验
接种16-18克左右的小白鼠5只，每只皮下注射0.3ml，观察14天，结果表明该疫苗对小鼠是安全的。
接种1.5-2.0kg健康家兔2只，每只臀部皮下注射5ml，观察14天，结果显示该疫苗对家兔是安全的，无不良反应。
3、嵌合蛋白fusion1、fusion2亚单位疫苗对小鼠的免疫原性试验
为了检测fusion1、fusion2嵌合蛋白是否仍然具有其各自的P36、P46、P65、P97、P146、LpptM蛋白所具有的的免疫原性，购买6-8周龄的雌性小鼠20只，随机分成9组，每组2只。P36、P46、P65、P97、P146、LpptM、fusion1、fusion2等8个抗原蛋白各2只，PBS负对照2只。每只小鼠背部皮下注射200微升，2周后加强免疫一次。加强免疫2周后，断尾采血。用P36、P46、P65、P97、P146、LpptM蛋白进行包被做ELISA，用P36、P46、P65、P97、P146、LpptM、fusion1、fusion2等8个抗原蛋白及负对照PBS免疫的血清100稀释后作为一抗，羊抗鼠IgG-HRP(1:5000稀释)作为二抗，检测小鼠体内的抗体反应。并用同样的血清进行Western blot来验证目的蛋白免疫原性。结果如图5、图6所示。
4、ELISA验证嵌合蛋白中大肠杆菌不耐热肠毒素B亚基(LTB)对神经节苷脂GM1的结合作用
LTB通过其上的神经节苷脂(Gan4ioside，GMl)结合受体而使全毒素黏附于真核细胞上，产生强烈的免疫反应，从而发挥其佐剂功能。参考Grassmann AA,S R,dosSantos C X,et al.2012.的方法。首先用100ng/孔的牛神经节苷脂GM1包板，BSA封闭后，100ng/孔的LTB、无关对照蛋白及嵌合蛋白fusion1、fusion2孵育，然后用鼠源抗6×His单克隆抗体(1:5000)孵育，后用羊抗鼠IgG-HRP(1:5000)孵育，最后进行显色反应。结果如图7所示。
5、嵌合蛋白中DCpep效果评价
在表达Fusion2蛋白(LTB-P97-LpptM-P146-Dcpep)的同时表达了不含DCpep的蛋白Fusion2B(LTB-P97-LpptM-P146)。Fusion2蛋白和Fusion2B蛋白配苗二免肺炎支原体阴性猪21天后，采血进行外周血单核细胞的分离并模拟了淋巴细胞增殖试验，具体步骤参考Jin Y B,Yang W T,Shi C W,et al.Applied Microbiology&Biotechnology,2018。结果如图8所示。
6、嵌合蛋白fusion1、fusion2亚单位疫苗对猪的抗体反应及攻毒保护试验
为了进一步评价上述制备亚单位疫苗对本动物猪的免疫效力，选取约2月龄肺炎支原体阴性猪25头，随机分成5组，每组5头。如表2所示。分别为fusion1、fusion2亚单位疫苗组1，普泰克商品化疫苗组2，空白对照组3，fusion2亚单位疫苗组4，fusion2B亚单位疫苗组5。每头猪免疫1头份，颈部肌肉注射，3周后加强免疫一次。首免后14、28、42天进行前腔静脉采血，评价其免疫效果。首免42d，组1、2和3分别进行猪支原体攻毒试验。并对该亚单位疫苗对猪的抗体反应及攻毒保护进行评价，组4和组5用来评价佐剂小分子DCpep的免疫增强效果。
7、嵌合蛋白fusion1、fusion2对猪的抗体消长规律试验
为进一步评价上述制备亚单位疫苗对本动物猪的抗体消长规律，选取约2月龄支原体阴性猪10头，随机分成2组，每组5头。分别为fusion1、fusion2亚单位疫苗组，空白对照组疫苗。每头猪免疫1头份，颈部肌肉注射，3周后加强免疫一次。首免后14、28、42、56、70、84天进行前腔静脉采血，ELISA测其每个抗原蛋白引起的抗体水平，评价其抗体持续期及消长规律，结果如图9所示。
(1)ELISA法评价抗体反应
首免后14、28、42、56、70、84天进行前腔静脉采血，37℃放置2h，后4℃静置2h，5000rpm离心5min取上清置于-20℃保存备用。P36、P46、P65、P97、P146、LpptM等6个抗原蛋白200ng/孔包被96孔板，猪血清(1:100)作为一抗37℃孵育2h，PBST洗3遍后，羊抗猪IgG-HRP(1:5000)作为二抗37℃孵育2h，PBST洗3遍后进行显色反应。
(2)猪支原体攻毒试验
采血完成后，进行猪肺炎支原体进行攻毒试验，免疫组和对照组仔猪用CVCC354株(购自中国兽医药品监察所，该菌株为中国兽医药品监察所保藏的猪支原体肺炎疫苗效力检验用毒株)气管注射5ml/头(100MID)，攻毒后观察30天，剖杀试验猪按根据猪支原体肺炎肺病变指数记分标准对试验猪的肺病变进行记分。免疫组与对照组进行肺病变指数差异分析。
(3)猪支原体肺炎判定标准
攻毒后，全部猪每天都要监测和检查疾病的临床症状。在攻毒第1天后的特定时间，无痛处死全部猪并作尸检。取出肺并进行评测。尸检测定包括评估支原体呼吸系统疾病相关的病理程度。每一片肺叶都要检测，并画出病灶的草图以评估其占每片肺叶的百分比。并记录总的病灶程度。根据猪肺炎支原体感染的典型肺病灶百分比来评估功效。每片肺叶的百分数用下面的单个肺叶与肺总质量的比例来加权平均：左头叶10％，左中叶10％，左尾叶25％。右头叶10％，右中叶10％，右尾叶25％，其他为10％。然后将加权的肺叶值相加即可得出总病变肺百分率(Pointon等,1992)。
(4)为了从组织水平观察肺部病变情况，我们取肺部病变组织进行了免疫组织化学检测(SABC染色)，具体步骤参考文献(陈志忠,陈小岩,陈冰.免疫组化染色流程四阶段分法及其要点简介[J].诊断病理学杂志,2015.)。结果如图10所示。
实施例3嵌合蛋白fusion1、fusion2制备的亚单位攻毒保护效果
1、fusion1、fusion2亚单位疫苗制备和免疫
在无菌烧杯中依次加入实施例1制备的fusion1、fusion2。然后加入pH为7.2的PBS液38ml，最后加入Gel01佐剂10ml(法国赛比克SEPPIC公司生产)，使两种抗原蛋白的含量分别为150μg/ml,37℃，500rpm搅拌10分钟，即得疫苗100ml。
免疫及攻毒情况见表2。
表2疫苗免疫及攻毒分组
2、猪肺炎支原体攻毒结果
猪肺炎支原体攻毒后肺病变指数结果见表3。结果表明，疫苗1、疫苗2平均肺病变指数分别为4.0、4.2，疫苗3对照组攻毒后仔猪肺病变比疫苗1、疫苗2免疫组仔猪肺病变明显；攻毒后到观察结束时疫苗1、疫苗2免疫仔猪的平均日增重显著高于疫苗3空白组仔猪(表4)。疫苗1、疫苗2免疫后攻毒达5/5和4/5的免疫保护效果，疫苗3空白组免疫后攻毒保护效果均为0/5。
表3猪肺炎支原体攻毒各试验组猪肺损伤得分情况
疫苗组别 仔猪头数 平均肺病变指数±标准差
1 5 4.00±0.54<sup>Bb</sup>
2 5 4.20±0.49<sup>Bb</sup>
3 5 16.00±0.69<sup>Aa</sup>
注:差异性统计分析中，组间比较，字母相同者表示差异不显著，大写字母不同者表示差异极显著(P＜0.01)，小写字母不同表示差异显著(P＜0.05)
表4猪肺炎支原体攻毒保护情况
注:差异性统计分析中，组间比较，字母相同者表示差异不显著，大写字母不同者表示差异极显著(P＜0.01)，小写字母不同表示差异显著(P＜0.05)
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 武汉科前生物股份有限公司
<120> 猪肺炎支原体亚单位疫苗及其制备方法与应用
<130> KHP181118738.8
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1481
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Met His His His His His His Pro Gln Ser Ile Thr Glu Leu Cys Ser
1 5 10 15
Glu Tyr Arg Asn Thr Gln Ile Tyr Thr Ile Asn Asp Lys Ile Leu Ser
20 25 30
Tyr Thr Glu Ser Met Ala Gly Lys Arg Glu Met Val Ile Ile Thr Phe
35 40 45
Lys Ser Gly Ala Thr Phe Gln Val Glu Val Pro Gly Ser Gln His Ile
50 55 60
Asp Ser Gln Lys Lys Ala Ile Glu Arg Met Lys Asp Thr Leu Arg Ile
65 70 75 80
Thr Tyr Leu Thr Glu Thr Lys Ile Asp Lys Leu Cys Val Trp Asn Asn
85 90 95
Lys Thr Pro Asn Ser Ile Ala Ala Ile Ser Met Glu Asn Lys Pro Ile
100 105 110
Lys Ile Ala Leu Ile Gly Ala Gly Asn Val Gly Asn Ser Phe Leu Tyr
115 120 125
Ala Ala Met Asn Gln Gly Leu Ala Ser Glu Tyr Gly Ile Ile Asp Ile
130 135 140
Asn Pro Asp Phe Ala Asp Gly Asn Ala Phe Asp Phe Glu Asp Ala Ser
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Ala Ser Leu Pro Phe Pro Ile Ser Val Ser Arg Tyr Glu Tyr Lys Asp
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Leu Lys Asp Ala Asp Phe Ile Val Ile Thr Ala Gly Arg Pro Gln Lys
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Pro Gly Glu Thr Arg Leu Glu Leu Val Ala Asp Asn Ile Arg Ile Ile
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Ile Ile Val Ala Asn Pro Val Asp Ile Ile Thr Arg Ala Tyr Arg Asp
225 230 235 240
Ala Ser Gly Phe Ser Asp Gln Lys Val Ile Gly Ser Gly Thr Val Leu
245 250 255
Asp Thr Ala Arg Leu Gln Phe Ala Ile Ala Lys Arg Ala Lys Val Ser
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Pro Asn Ser Val Gln Ala Tyr Val Met Gly Glu His Gly Asp Ser Ser
275 280 285
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Glu Tyr Pro Val Ser Arg Arg Ala Tyr Glu Ile Ile Asn Arg Lys Arg
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Ala Thr Phe Tyr Gly Ile Gly Ala Ala Ile Ala Lys Ile Val Ser Asn
340 345 350
Ile Ile Lys Asp Thr Lys Asn Ile Met Ile Ala Gly Ala Asn Leu Arg
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Gly Glu Tyr Gly Phe His Gly Val Asn Ile Gly Val Pro Val Val Leu
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Gly Ala Asn Gly Ile Glu Lys Ile Ile Glu Ile Ser Leu Asn Asp Lys
385 390 395 400
Glu Lys Glu Lys Phe Ala Lys Ser Val Ala Ile Ile Asp Lys Ile Tyr
405 410 415
Gln Asp Ala Ile Lys Asn Ile Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
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Ser Gly Gly Gly Gly Ser Cys Leu Gln Lys Asn Ser Leu Leu Ser Glu
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Val Asn Tyr Leu Ala Leu Gly Asp Ser Leu Thr Ala Gly Phe Asn Glu
450 455 460
Glu Thr Tyr Arg Asp Phe Gln Gly Thr Leu Asp Lys Asp Gly Asn Leu
465 470 475 480
Ser Gly Gln Ser Tyr Pro Ala Tyr Phe Ala Tyr Tyr Leu Gln Lys Leu
485 490 495
Asn Lys Asn Ser Leu Val Ser Tyr Asp Asn Leu Ala Ile Ser Gly Thr
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Gly Lys Met Ser Asp Asn Pro Leu Val Thr Asn Tyr Ser Gly Asn Glu
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Lys Tyr Asn Glu Ile Gly Ser Val Phe Gly Asp Phe Asn Lys Asp Ser
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Tyr Pro Gly Leu Val Glu Lys Val Lys Lys Ala Asn Leu Leu Thr Met
565 570 575
Ser Val Gly Ala Asn Asp Pro Phe Leu Ala Ile Phe Asn Glu Phe Lys
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595 600 605
Leu Asp Pro Asn Glu Arg Ala Asn Phe Leu Ala Glu Lys Gly Met Leu
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Leu Lys Ala Glu Val Asn Lys Lys Ile Glu Glu Ile Asn Thr Asn Leu
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Asp Asn Leu Ile Lys Glu Leu Lys Ala Leu Asn Pro Lys Leu Ser Ile
645 650 655
Asn Leu Val Gly Tyr Lys Leu Pro Asn Ser Gly Phe Ile Lys Ile Leu
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Lys Tyr Leu Leu Tyr Thr Tyr Ala Lys Ile Glu Thr Asp Phe Ile Asn
675 680 685
Glu Ile Pro Glu Lys Ile Asn Lys Ile Ile Arg Glu Thr Ala Ile Lys
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Asn Lys Val Asn Tyr Ile Asp Val Tyr Asp Lys Ser Ile Trp Asn Asp
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Ser Asp Lys Asn Leu Met Ala Lys Asn Phe Asp Phe His Pro Ser Ile
725 730 735
Gln Gly Tyr Lys Lys Ile Ala His Gln Leu Leu Leu Lys Leu Thr Leu
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Asp Gln Glu Glu Lys Asp Asp Ser Asn Ala Glu Glu Leu Lys Asn Thr
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Thr Asn Phe Asp Asp Phe Asp Glu Asn Lys Pro Thr Tyr Ser Lys Val
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Ile Asp Leu Ser Val Phe Ala Lys Ser Asn Lys Glu Phe Leu Glu Lys
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Leu Asn Glu Asn Lys Gln Thr Ser Glu Phe Ile Ala Gln Lys Ser Thr
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Gly Asn Ile Val Arg Glu Ile Val Ser Leu Pro Ile Phe Asp Asn Phe
835 840 845
Asp Phe Arg Glu Leu Ile Pro Val Lys Asn Pro Phe Val Lys Ala Ile
850 855 860
Ile Asn Ser Tyr Leu Gly Lys Pro Ala Gly Ser Leu Ile Lys Asp Ile
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Glu Gln Leu Glu Asn Lys Val Lys Asp Tyr Ala Arg Pro Asn Ile Lys
885 890 895
Ile Phe Asp Thr Ile Ile Asp Ser Phe Ile Arg Lys Met Val Ala Phe
900 905 910
Phe Ala Glu Leu Asn Thr Asp Gln Glu Ile Lys Glu Phe Lys Met Ser
915 920 925
Pro Gln Ile Leu Phe Leu Thr Leu Arg Asn Ala Ile Leu Ser Pro Phe
930 935 940
Asp Leu Thr Lys Leu Lys Asp Ser Ala Thr Phe Lys Ile Leu Met Asn
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Leu Lys Pro Glu Gln Ile Leu Thr Leu Leu Gly Leu Gly Lys Thr Pro
965 970 975
Ser Val Pro Lys Pro Glu Lys Pro Lys Asp Gln Gly Ser Met Pro Gln
980 985 990
Thr Asp Thr Ser Ser Gln Lys Gln Glu Ser Gly Thr Gly Ser Thr Asp
995 1000 1005
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Ser Ser Glu Gln Ser Ser Thr Asp Ser Lys Ser Asn Gly Gly Gly Gly
1025 1030 1035 1040
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Lys Lys Met Leu Arg
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Lys Lys Phe Leu Tyr Ser Ser Ala Ile Tyr Ala Thr Ser Leu Ala Ser
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Ile Ile Ala Phe Val Ala Ala Gly Cys Gly Gln Thr Glu Ser Gly Ser
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Asn Asp Ser Ile Arg Ile Ala Leu Thr Asp Pro Asp Asn Pro Arg Trp
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Ile Ser Ala Gln Lys Asp Ile Ile Ser Tyr Val Asp Glu Thr Glu Ala
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Pro Glu Asn Gly Ser Gly Val Gly Thr Ala Val Asn Thr Ile Ala Asp
1170 1175 1180
Lys Gly Ile Pro Ile Val Ala Tyr Asp Arg Leu Ile Thr Gly Ser Asp
1185 1190 1195 1200
Lys Tyr Asp Trp Tyr Val Ser Phe Asp Asn Glu Lys Val Gly Glu Leu
1205 1210 1215
Gln Gly Leu Ser Leu Ala Ala Gly Leu Leu Gly Lys Glu Asp Gly Ala
1220 1225 1230
Phe Asp Ser Ile Asp Gln Met Asn Glu Tyr Leu Lys Ser His Met Pro
1235 1240 1245
Gln Glu Thr Ile Ser Phe Tyr Thr Ile Ala Gly Ser Gln Asp Asp Asn
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Asn Ser Gln Tyr Phe Tyr Asn Gly Ala Met Lys Val Leu Lys Glu Leu
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Asn Ala Val Tyr Val Pro Gly Trp Asn Tyr Gly Thr Ala Gly Gln Arg
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Ile Lys Ala Val Gly Ser Lys Pro Ala Ser Ile Phe Lys Gly Phe Leu
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1475 1480
<210> 2
<211> 1147
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Met His His His His His His Pro Gln Ser Ile Thr Glu Leu Cys Ser
1 5 10 15
Glu Tyr Arg Asn Thr Gln Ile Tyr Thr Ile Asn Asp Lys Ile Leu Ser
20 25 30
Tyr Thr Glu Ser Met Ala Gly Lys Arg Glu Met Val Ile Ile Thr Phe
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Lys Ser Gly Ala Thr Phe Gln Val Glu Val Pro Gly Ser Gln His Ile
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355 360 365
Gly Leu Ile Pro Asn Phe Glu Ala Lys Lys Ala Ala Phe Leu Val Lys
370 375 380
Lys Pro Glu Lys Val Ser Gln Asn Lys Asn Leu Leu Thr Ile Asn Leu
385 390 395 400
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595 600 605
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675 680 685
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705 710 715 720
Glu Asn Ser Ser Gln Glu Gln Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
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Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Lys Asn Asn Lys Asn Ser Leu Leu
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<210> 3
<211> 102
<212> PRT
<213> 大肠杆菌(Escherichia blattae)
<400> 3
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<213> 树突状细胞(Dendritic cell)
<400> 4
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1 5 10
<210> 5
<211> 314
<212> PRT
<213> 猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae)
<400> 5
Lys Pro Ile Lys Ile Ala Leu Ile Gly Ala Gly Asn Val Gly Asn Ser
1 5 10 15
Phe Leu Tyr Ala Ala Met Asn Gln Gly Leu Ala Ser Glu Tyr Gly Ile
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Asp Ala Ser Ala Ser Leu Pro Phe Pro Ile Ser Val Ser Arg Tyr Glu
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Pro Gln Lys Pro Gly Glu Thr Arg Leu Glu Leu Val Ala Asp Asn Ile
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Arg Ile Ile Arg Glu Ile Ala Leu Lys Val Lys Glu Ser Gly Phe Ser
100 105 110
Gly Ile Ser Ile Ile Val Ala Asn Pro Val Asp Ile Ile Thr Arg Ala
115 120 125
Tyr Arg Asp Ala Ser Gly Phe Ser Asp Gln Lys Val Ile Gly Ser Gly
130 135 140
Thr Val Leu Asp Thr Ala Arg Leu Gln Phe Ala Ile Ala Lys Arg Ala
145 150 155 160
Lys Val Ser Pro Asn Ser Val Gln Ala Tyr Val Met Gly Glu His Gly
165 170 175
Asp Ser Ser Phe Val Ala Tyr Ser Asn Ile Lys Ile Ala Gly Glu Cys
180 185 190
Phe Cys Ala Tyr Ser Lys Leu Thr Gly Ile Asp Ser Ser Asn Tyr Glu
195 200 205
Lys Glu Leu Glu Tyr Pro Val Ser Arg Arg Ala Tyr Glu Ile Ile Asn
210 215 220
Arg Lys Arg Ala Thr Phe Tyr Gly Ile Gly Ala Ala Ile Ala Lys Ile
225 230 235 240
Val Ser Asn Ile Ile Lys Asp Thr Lys Asn Ile Met Ile Ala Gly Ala
245 250 255
Asn Leu Arg Gly Glu Tyr Gly Phe His Gly Val Asn Ile Gly Val Pro
260 265 270
Val Val Leu Gly Ala Asn Gly Ile Glu Lys Ile Ile Glu Ile Ser Leu
275 280 285
Asn Asp Lys Glu Lys Glu Lys Phe Ala Lys Ser Val Ala Ile Ile Asp
290 295 300
Lys Ile Tyr Gln Asp Ala Ile Lys Asn Ile
305 310
<210> 6
<211> 418
<212> PRT
<213> 猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae)
<400> 6
Lys Lys Met Leu Arg Lys Lys Phe Leu Tyr Ser Ser Ala Ile Tyr Ala
1 5 10 15
Thr Ser Leu Ala Ser Ile Ile Ala Phe Val Ala Ala Gly Cys Gly Gln
20 25 30
Thr Glu Ser Gly Ser Thr Ser Asp Ser Lys Pro Gln Ala Glu Thr Leu
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Lys His Lys Val Ser Asn Asp Ser Ile Arg Ile Ala Leu Thr Asp Pro
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Asp Asn Pro Arg Trp Ile Ser Ala Gln Lys Asp Ile Ile Ser Tyr Val
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Asp Glu Thr Glu Ala Ala Thr Ser Thr Ile Thr Lys Asn Gln Asp Ala
85 90 95
Gln Asn Asn Trp Leu Thr Gln Gln Ala Asn Leu Ser Pro Ala Pro Lys
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Gly Phe Ile Ile Ala Pro Glu Asn Gly Ser Gly Val Gly Thr Ala Val
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Asn Thr Ile Ala Asp Lys Gly Ile Pro Ile Val Ala Tyr Asp Arg Leu
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Ile Thr Gly Ser Asp Lys Tyr Asp Trp Tyr Val Ser Phe Asp Asn Glu
145 150 155 160
Lys Val Gly Glu Leu Gln Gly Leu Ser Leu Ala Ala Gly Leu Leu Gly
165 170 175
Lys Glu Asp Gly Ala Phe Asp Ser Ile Asp Gln Met Asn Glu Tyr Leu
180 185 190
Lys Ser His Met Pro Gln Glu Thr Ile Ser Phe Tyr Thr Ile Ala Gly
195 200 205
Ser Gln Asp Asp Asn Asn Ser Gln Tyr Phe Tyr Asn Gly Ala Met Lys
210 215 220
Val Leu Lys Glu Leu Met Lys Asn Ser Glu Asn Lys Ile Ile Asp Leu
225 230 235 240
Ser Pro Asp Gly Glu Asn Ala Val Tyr Val Pro Gly Trp Asn Tyr Gly
245 250 255
Thr Ala Gly Gln Arg Ile Gln Ser Phe Leu Thr Ile Asn Lys Asp Pro
260 265 270
Ala Gly Gly Asn Lys Ile Lys Ala Val Gly Ser Lys Pro Ala Ser Ile
275 280 285
Phe Lys Gly Phe Leu Ala Pro Asn Asp Gly Met Ala Glu Gln Ala Ile
290 295 300
Thr Lys Leu Lys Leu Glu Gly Phe Asp Thr Gln Lys Ile Phe Val Thr
305 310 315 320
Gly Gln Asp Tyr Asn Asp Lys Ala Lys Thr Phe Ile Lys Asp Gly Asp
325 330 335
Gln Asn Met Thr Ile Tyr Lys Pro Asp Lys Val Leu Gly Lys Val Ala
340 345 350
Val Glu Val Leu Arg Val Leu Ile Ala Lys Lys Asn Lys Ala Ser Arg
355 360 365
Ser Glu Val Glu Asn Glu Leu Lys Ala Lys Leu Pro Asn Ile Ser Phe
370 375 380
Lys Tyr Asp Asn Gln Thr Tyr Lys Val Gln Gly Lys Asn Ile Asn Thr
385 390 395 400
Ile Leu Val Ser Pro Val Ile Val Thr Lys Ala Asn Val Asp Asn Pro
405 410 415
Asp Ala
<210> 7
<211> 598
<212> PRT
<213> 猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae)
<400> 7
Cys Leu Gln Lys Asn Ser Leu Leu Ser Glu Val Asn Tyr Leu Ala Leu
1 5 10 15
Gly Asp Ser Leu Thr Ala Gly Phe Asn Glu Glu Thr Tyr Arg Asp Phe
20 25 30
Gln Gly Thr Leu Asp Lys Asp Gly Asn Leu Ser Gly Gln Ser Tyr Pro
35 40 45
Ala Tyr Phe Ala Tyr Tyr Leu Gln Lys Leu Asn Lys Asn Ser Leu Val
50 55 60
Ser Tyr Asp Asn Leu Ala Ile Ser Gly Thr Thr Thr Glu Asn Trp Leu
65 70 75 80
Tyr Leu Leu Asn Pro Thr Lys Tyr Pro Asn Gly Lys Met Ser Asp Asn
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Pro Leu Val Thr Asn Tyr Ser Gly Asn Glu Lys Tyr Asn Glu Ile Gly
100 105 110
Ser Val Phe Gly Asp Phe Asn Lys Asp Ser Tyr Pro Gly Leu Val Glu
115 120 125
Lys Val Lys Lys Ala Asn Leu Leu Thr Met Ser Val Gly Ala Asn Asp
130 135 140
Pro Phe Leu Ala Ile Phe Asn Glu Phe Lys Lys Trp Ala Ser Ile Ile
145 150 155 160
Lys Pro Lys Ser Glu Glu Ala Lys Lys Leu Leu Asp Pro Asn Glu Arg
165 170 175
Ala Asn Phe Leu Ala Glu Lys Gly Met Leu Leu Lys Ala Glu Val Asn
180 185 190
Lys Lys Ile Glu Glu Ile Asn Thr Asn Leu Asp Asn Leu Ile Lys Glu
195 200 205
Leu Lys Ala Leu Asn Pro Lys Leu Ser Ile Asn Leu Val Gly Tyr Lys
210 215 220
Leu Pro Asn Ser Gly Phe Ile Lys Ile Leu Lys Tyr Leu Leu Tyr Thr
225 230 235 240
Tyr Ala Lys Ile Glu Thr Asp Phe Ile Asn Glu Ile Pro Glu Lys Ile
245 250 255
Asn Lys Ile Ile Arg Glu Thr Ala Ile Lys Asn Lys Val Asn Tyr Ile
260 265 270
Asp Val Tyr Asp Lys Ser Ile Trp Asn Asp Ser Asp Lys Asn Leu Met
275 280 285
Ala Lys Asn Phe Asp Phe His Pro Ser Ile Gln Gly Tyr Lys Lys Ile
290 295 300
Ala His Gln Leu Leu Leu Lys Leu Thr Leu Asp Gln Glu Glu Lys Asp
305 310 315 320
Asp Ser Asn Ala Glu Glu Leu Lys Asn Thr Thr Asn Phe Asp Asp Phe
325 330 335
Asp Glu Asn Lys Pro Thr Tyr Ser Lys Val Ile Asp Leu Ser Val Phe
340 345 350
Ala Lys Ser Asn Lys Glu Phe Leu Glu Lys Leu Asn Glu Asn Lys Gln
355 360 365
Thr Ser Glu Phe Ile Ala Gln Lys Ser Thr Phe Asp Thr Asp Gln Glu
370 375 380
Ala Ala Ile Lys Asp Asp Lys Arg Thr Phe Gly Asn Ile Val Arg Glu
385 390 395 400
Ile Val Ser Leu Pro Ile Phe Asp Asn Phe Asp Phe Arg Glu Leu Ile
405 410 415
Pro Val Lys Asn Pro Phe Val Lys Ala Ile Ile Asn Ser Tyr Leu Gly
420 425 430
Lys Pro Ala Gly Ser Leu Ile Lys Asp Ile Glu Gln Leu Glu Asn Lys
435 440 445
Val Lys Asp Tyr Ala Arg Pro Asn Ile Lys Ile Phe Asp Thr Ile Ile
450 455 460
Asp Ser Phe Ile Arg Lys Met Val Ala Phe Phe Ala Glu Leu Asn Thr
465 470 475 480
Asp Gln Glu Ile Lys Glu Phe Lys Met Ser Pro Gln Ile Leu Phe Leu
485 490 495
Thr Leu Arg Asn Ala Ile Leu Ser Pro Phe Asp Leu Thr Lys Leu Lys
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Asp Ser Ala Thr Phe Lys Ile Leu Met Asn Leu Lys Pro Glu Gln Ile
515 520 525
Leu Thr Leu Leu Gly Leu Gly Lys Thr Pro Ser Val Pro Lys Pro Glu
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Lys Pro Lys Asp Gln Gly Ser Met Pro Gln Thr Asp Thr Ser Ser Gln
545 550 555 560
Lys Gln Glu Ser Gly Thr Gly Ser Thr Asp Ser Thr Lys Ala Thr Thr
565 570 575
Glu Asn Gln Lys Pro Ala Glu Gln Thr Asn Ser Ser Glu Gln Ser Ser
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Thr Asp Ser Lys Ser Asn
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<213> 猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae)
<400> 8
Gln Pro Pro Ala Ala Lys Pro Glu Ala Ala Lys Pro Val Ala Ala Lys
1 5 10 15
Pro Glu Thr Thr Lys Pro Val Ala Ala Lys Pro Glu Ala Ala Lys Pro
20 25 30
Glu Ala Ala Lys Pro Val Ala Ala Lys Pro Glu Ala Ala Lys Pro Val
35 40 45
Ala Ala Lys Pro Glu Ala Ala Lys Pro Val Ala Ala Lys Pro Glu Ala
50 55 60
Ala Lys Pro Val Ala Ala Lys Pro Glu Ala Ala Lys Pro Val Ala Thr
65 70 75 80
Asn Thr Gly Phe Ser Leu Thr Asn Lys Pro Lys Glu Asp Tyr Phe Pro
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115 120 125
Glu Tyr Glu Glu Gln Glu Ile Ile Lys Glu Leu Asp Lys Thr Val Leu
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Gln Lys Leu Ser His Pro Met Met Thr Glu Gly Ser Ser Asn Gln Gly
165 170 175
Lys Lys Ser Glu Gly Thr Pro Asn Gln Gly Lys Lys Ala Glu Gly Ala
180 185 190
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195 200 205
Ala Glu Gly Ala Pro Ser Gln Gln Ser Pro Thr Thr Glu Leu Thr Asn
210 215 220
Tyr Leu Pro Asp
225
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<212> PRT
<213> 猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae)
<400> 9
Phe Ile Gln Lys Ser Val Pro Asn Thr Thr Phe Phe Ala Asp Ile Lys
1 5 10 15
Gly Leu Ile Pro Asn Phe Glu Ala Lys Lys Ala Ala Phe Leu Val Lys
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Lys Pro Glu Lys Val Ser Gln Asn Lys Asn Leu Leu Thr Ile Asn Leu
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Lys Leu Glu Gly Thr Phe Leu Val Asn Asp Gln Val Pro Ala Gly Leu
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Asp Ala Thr Gln Glu Ile Tyr Ser Gly Tyr Phe Arg Asn Ala Leu Glu
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Val Lys Ser Tyr Leu Pro Val Thr Val Phe Ala Ser Thr Ile Asn Thr
115 120 125
Lys Ile Ala His Leu Leu Asn Lys Pro Leu Glu Leu Lys Gly Ile Thr
130 135 140
Lys Lys Met Ser Pro Leu Phe Asp Phe Leu Asn Phe Ser Thr Ser Lys
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Asn Glu Lys Leu Glu Thr Lys Met Ala Pro Pro Asn Gly Lys Met Gln
165 170 175
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180 185 190
Gln Glu Lys Gly Gln Ala Lys Glu Glu Lys Ser Ser Lys Asp Ser Gln
195 200 205
Ser Glu Gln Thr Asp Gln Ser Glu Gln Val Pro Lys Val Glu Thr Lys
210 215 220
Thr Ile Gln Ala Glu Asn Gly Gly Thr Tyr Leu Ser Lys Leu Phe Glu
225 230 235 240
Asn Leu Glu Lys Thr Ser Phe Pro Thr Asn Thr Leu Leu Tyr Leu Ser
245 250 255
Thr Phe Tyr Arg Asp Lys Phe Ile Leu Lys Leu Glu Leu Lys Val Glu
260 265 270
Gly Ile Thr Lys Glu Thr Leu Glu Ile Lys Ile Asp Lys Val Ala Pro
275 280 285
Asp Asn Lys Ala Tyr Gln Ala Leu Val Gln Ser Thr Asn Thr Asp Leu
290 295 300
Phe Leu Asp Trp Arg Ser Asn Ile Thr Thr Thr Thr Glu Lys Tyr Gln
305 310 315 320
Asn Lys Pro Val Leu Ala Ser Ile Ser Ala Leu Asn Asn Pro Asn Leu
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355 360 365
Glu Asn Ser Ser Gln Glu Gln Ser
370 375
<210> 10
<211> 392
<212> PRT
<213> 猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae)
<400> 10
Ala Lys Asn Asn Lys Asn Ser Leu Leu Val Thr Ala Thr Ala Ile Val
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Gly Val Ala Val Phe Ala Thr Thr Val Gly Leu Val Thr Arg Ile Arg
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Tyr Lys Gly Glu Asn Pro Arg Ala Glu Leu Glu Ser Leu Val Ser Lys
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65 70 75 80
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85 90 95
Ser Lys Ile Gln Lys Phe Glu Val Ser Phe Ala Pro Asn Lys Pro Phe
100 105 110
Phe Glu Phe Ile Asn Leu Ile Pro Asp Asp Lys Asn Gln Thr Phe Thr
115 120 125
Leu Gln Phe Arg Ala Lys His Gln Leu Asp Asn Asn Tyr Thr Ala Tyr
130 135 140
Ser Ser Ile Leu Ser Lys Lys Ile Ala Tyr Ala Gln Arg Ser Gln Phe
145 150 155 160
Ala Leu Ala Asp Phe Asn Ala Asn His Arg Lys Ile Thr Lys Ser Phe
165 170 175
Gln Thr Asn Ile Gln Asn Leu Arg Glu Thr Asp Phe Ser Val Asp Phe
180 185 190
Ser Ser Ser Gln Thr Ser Leu Ala Ser Gln Lys Ile Pro Phe Leu Thr
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Arg Val Glu Asp Phe Ala Ala Asp Ile Asn Lys Ser Gly Asn Gln Glu
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Glu Ala Ile Ser Arg Ile Ser Lys Tyr Phe Pro Asp Phe Gln Arg Tyr
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Ile His Glu Leu Lys Asp Asp Pro Asn Asn Val Leu Pro Phe Lys Lys
245 250 255
Gly Lys Ile Phe Asp Phe Ser Ile Thr Arg Arg Ala Gly Thr Asn Asp
260 265 270
Phe Ile Ser Leu Ser Ala Asn Ser Glu Pro Ser Phe Leu Ile Lys Ala
275 280 285
Arg Leu Thr Asn Glu Ala Lys Phe Glu Leu Arg Gly Leu Asn Ile Glu
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Glu Ala Glu Met Leu Glu Glu Ile Lys Leu Val Pro Val Asp Gln Phe
305 310 315 320
Val Val Asn Leu Glu Thr Asp Leu Lys Pro Gly Gln Ala Pro Glu Lys
325 330 335
Ser Gln Lys Pro Gln Ser Glu Gln Thr Glu Ile Lys Lys Thr Tyr Phe
340 345 350
Ala Glu Ile Asp Lys Ile Leu Ser Lys Ile Thr Met Arg Lys Leu Gln
355 360 365
Leu Ser Asp Phe Lys Val Ala Pro Gln Thr Ser Ser Ser Gln Pro Lys
370 375 380
Gln Val Lys Ala Ser Val Ser Ala
385 390

Claims (10)

1.猪肺炎支原体嵌合蛋白，其特征在于，所述嵌合蛋白的结构为LTB-P36-P65-P46-Dcpep或LTB-P97-LpptM-P146-Dcpep；
其中，LTB为大肠杆菌不耐热性肠毒素B亚基，Dcpep为树突状细胞诱导肽，P36、P46、P65、P97、LpptM、P146来自猪肺炎支原体膜蛋白，且各单元之间通过柔性Linker连接。
2.根据权利要求1所述的嵌合蛋白，其特征在于，LTB、Dcpep、P36、P46、P65、P97、LpptM、P146的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:3-10所示。
3.根据权利要求1所述的嵌合蛋白，其特征在于，LTB-P36-P65-P46-Dcpep的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；和/或
LTB-P97-LpptM-P146-Dcpep的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
4.编码权利要求1-3任一项所述嵌合蛋白的基因。
5.含有权利要求4所述基因的生物材料，所述生物材料包括重组DNA、表达盒、转座子、质粒载体、噬菌体载体、病毒载体或工程菌。
6.权利要求1-3任一项所述嵌合蛋白或权利要求4所述基因或权利要求5所述生物材料在制备猪肺炎支原体亚单位疫苗中的应用。
7.猪肺炎支原体亚单位疫苗，其特征在于，有效成分为权利要求1-3任一项所述的嵌合蛋白LTB-P36-P65-P46-Dcpep和LTB-P97-LpptM-P146-Dcpep。
8.权利要求7所述亚单位疫苗的制备方法，其特征在于，将所述嵌合蛋白LTB-P36-P65-P46-Dcpep和LTB-P97-LpptM-P146-Dcpep与适量佐剂混合，即得。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述嵌合蛋白的制备方法如下：根据GenBank中公布的LTB、Dcpep、P36、P46、P65、P97、LpptM、P146基因序列，分别按照巨大芽孢杆菌密码子的偏爱性进行优化，然后将优化后的基因序列依次串联连接，人工合成编码LTB-P36-P65-P46-Dcpep、LTB-P97-LpptM-P146-Dcpep的嵌合基因，然后按照以下方案I或II进行目的蛋白的表达；
方案I：将两个嵌合基因构建到不同的表达载体上，分别导入巨大芽孢杆菌中进行表达；
方案II：将两个嵌合基因构建到同一表达载体上，且两个嵌合基因分别位于不同的表达盒中，将携带两个嵌合基因的表达载体导入巨大芽孢杆菌中进行表达。
10.权利要求7所述亚单位疫苗在制备基因工程疫苗中的应用。
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