CN101565707A - 编码猪肺炎支原体p102蛋白的dna及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了编码猪肺炎支原体P102蛋白的DNA及其制备方法和用途。本发明利用体外诱变技术将猪肺炎支原体表面蛋白P102基因的阅读框架C端500个核苷酸的其中1个UGA诱变为UGG，得到SEQ ID NO：1所示的序列；将诱变后的SEQ IDNO：1序列与表达载体连接后转化宿主细胞进行体外表达，重组表达的p102蛋白C端可以作为抗原用于血清学诊断，将所表达的蛋白质作为包被抗原用间接ELISA方法检测猪地方性支原体肺炎，结果表明该抗原具有非常好的特异性和敏感性，用该抗原建立的间接ELISA方法操作非常简单，容易推广应用，适合进行大规模血清学调查，特异性、敏感性均符合要求。

Description

编码猪肺炎支原体P102蛋白的DNA及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及一种DNA，尤其涉及一种编码猪肺炎支原体P102蛋白的DNA及其制备方法，本发明还涉及由该DNA所编码的重组蛋白以及该重组蛋白在猪地方性支原体肺炎的血清学诊断中的用途，属于猪肺炎支原体的诊断领域。

背景技术

猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae，Mhp)是猪支原体肺炎(MPS)的主要病原体，该病又称猪地方流行性肺炎(EPP)，本病在我国流行范围广，对猪业造成了严重的危害。MPS以接触性、高度传染性、慢性、高发病率和低死亡率为特点，主要表现为咳嗽、呼吸困难。解剖可见肺组织肉变或大理石样病变。其主要危害是引起猪的生长受阻和饲料转化率大幅下降。

国内外多年的研究成果表明，Mhp与猪呼吸道纤毛的特异性黏附是引起猪支原体肺炎发生的先决条件，而Mhp表面的黏着素(黏附因子)在Mhp致病中起关键作用。目前.已阐明的Mhp粘附因子共有3种，即P97(232株)、Mhp1(P5722株)和J株的一个分子量为94kDa的蛋白，其中研究最为深入的是P97蛋白。1995年张启敬利用单克隆抗体F2G5抑制Mhp对猪呼吸道纤毛细胞的粘附作用，免疫印迹结果显示F2G5主要识别一个约97kDa的蛋白(P97)。电子显微镜观察发现F2G5识别的蛋白质随机分布于Mhp的表面。这些结果显示P97的功能是作为Mhp的粘附因子。在P97下游有一段与之相邻的基因P102。由于它与P97相邻且经分析预测它也有细胞黏附或辅助P97的细胞黏附作用。

由于Mhp与猪鼻支原体(Mh)、猪絮状支原体(Mf)等存在共同抗原，目前Mhp的ELISA等血清学诊断方法有交叉反应。针对该病，人们一直在努力研究快速、方便、准确的早期诊断方法，P97黏附因子是猪肺炎支原体的特异性外膜蛋白，Mhp感染时P97引发的免疫反应远远早于其它抗原蛋白所引发的免疫反应，抗P97的IgA和IgM较针对其它抗原的抗体早出现35-60天，这对于Mhp的诊断与检测方面具有重要意义。苏锐等(猪肺炎支原体P97基因原核表达产物单抗的制备，中国人畜共患病杂志，2005，3)利用P97蛋白C端的R1区是其主要的抗原决定簇，以大肠杆菌表达的P97黏附因子R1融合蛋白作为免疫原免疫BALB/c鼠，通过酶联免疫吸附实验(ELISA)平行筛选，获得两株单克隆抗体杂交瘤细胞株A₉-H₇、H₁₁-E₇。两株细胞经体外连续传代1个月并冻存复苏后均能分泌高效价的抗融合蛋白抗体，并能在小鼠体内形成肿瘤，有效诱导产生高效价的腹水抗体，且均与天然Mhp168毒株显示出较强的反应特性，从而制备出了针对识别单一抗原决定簇的特异性单抗，为进一步研究和建立Mhp快速、灵敏、准确的诊断及检测方法提供了基础。

李颖平等(猪肺炎支原体黏附因子P97基因抗原区的克隆与表达，猪业科学，2006.3)根据Genbank中猪肺炎支原体J株模式株(ATCC 25934或NCTC 10110)，设计一对特异性引物，通过PCR扩增出猪肺炎支原体168株P97基因序列的R1R2区序列，经测序确认后，克隆入原核表达载体PET-32a(+)的EcoR I和Xho I位点之间，转化宿主菌BL21，将筛选出的阳性克隆用PTG诱导，从而使P97蛋白基因获得了表达。这为猪肺炎支原体免疫检测与诊断以及新型疫苗的研制提供了重要条件。此外Kim T J(Serodiagnostic comparison between two methods，ELISA and surface plasmonresonance for the detection of antibody titres of Mycoplasma hyopneumoniae.J Vet MedB Infect Dis Vet Public Health.2006 Mar；53(2)：87-90.)利用P97蛋白中的分子量为30KDa的蛋白为抗原建立了检测猪肺炎支原体抗体滴度的表面细胞质基因组共振实验，该实验与传统ELISA方法具有正相关性，且具有很高的特异性和敏感性。

猪肺炎支原体全长1070kb，G+C％为28％。由于支原体中A+T含量高，偏爱含A、T较多的密码子。猪肺炎支原体是以TGA编码Trp，而不是大肠杆菌常用的TGG。猪肺炎支原体P102基因序列全长2700bp，编码900个氨基酸(102kDa)。P102蛋白序列中有7个编码Trp密码子TGA。由于TGA在大肠杆菌和真核细胞中为终止子，因此，P102基因要想在大肠杆菌和真核细胞中表达有两种办法。一种是把P102基因中编码Trp的TGA突变为TGG，另一种办法就是构建能通读UGA的表达系统。Brenda等构建了携带乳白抑制子tRNA(Trp176)的载体和释放因子2(Rf2)基因prfB突变的大肠杆菌表达系统，使核糖体能够通读含有UGA的肺炎支原体粘附因子P1和mRNA序列，同时不被Rf2解离，从而表达完整的P1蛋白。Kanna等试图在枯草杆菌中表达含一个TGA的肺炎支原体粘附因子P30的基因，在野生型枯草杆菌中P30的表达效率是把序列中TGA突变为TGG，在大肠杆菌中表达效率的6％；在柘草杆菌释放因子2基因突变株中表达效率为后者的19％～54％。由于Mhp和许多支原体都被证实用UAA编码色氨酸，而一般细菌以UGA编码色氨酸，UAA作终止子。如果编码基因中含编码色氨酸的UAA，则此基因在大肠杆菌或真核表达系统中不能正确表达，因此要获得正确的表达需要通过体外突变才能完成。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种新的编码猪肺炎支原体P102蛋白的DNA；

本发明目的是之二是提供一种制备上述编码猪肺炎支原体P102蛋白的DNA的方法；

本发明目的之三是提供一种含有上述DNA的表达载体；

本发明目的之四是提供一种由上述DNA所编码的重组蛋白；

本发明目的之五是将上述重组蛋白应用于猪地方性支原体肺炎的血清学诊断。

本发明上述目的是通过以下技术方案来实现的：

本发明采用体外诱变技术将表面蛋白P102基因阅读框架C端510个核苷酸其中1个UGA核苷酸诱变为UGG，其诱变后的核苷酸序列见序列表SEQ ID NO：1所示；

一种制备上述DNA(SEQ ID NO：1)的方法，包括：

(1)提取支原体的基因组DNA；以SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3为引物，以支原体的基因组DNA为模板进行PCR扩增，得到扩增产物1；以SEQ ID NO：4和SEQ IDNO：5为引物，以支原体的基因组DNA为模板进行PCR扩增，得到扩增产物2；

(2)以SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：5为引物，以扩增产物1和扩增产物2为模板进行PCR扩增，收集扩增到的特异性片段，即得。

将SEQ ID NO：1所示的序列可操作的与表达载体连接后，得到重组表达载体；其中所述的表达载体可以是Pet22b、Pet 30a、Pet28a、pMAL-c4X、pMAL-p4X、PGEX-6p-1或Pet 32a载体，优选为Pet 32a载体；将所得到的重组表达载体转化宿主细胞进行体外表达，将所表达的重组蛋白(其氨基酸序列见序列表SEQ ID NO.6所示)；收集纯化后作为抗原用于猪地方性支原体肺炎的血清学诊断。

本发明的详细描述：

本发明首先提取支原体的基因组DNA，设计两对突变用引物，以所提取的支原体基因组DNA为模板进行PCR扩增，回收扩增到的特异性片段，以回收的两段DNA片段为模板和引物进行扩增，收集扩增到的特异性片段经酶切后将该突变目的片断定向克隆到表达载体(Pet28a载体)中并进行核苷酸序列测定，经序列测定后证实所扩增的特异性片段为所需的突变片段。同时，在IPTG诱导下对特异性片段进行表达，SDS-PAGE显示表达蛋白质分子量为26Kda，利用亲和层析技术对该蛋白质进行纯化，将纯化后的蛋白质作为包被抗原利用间接ELISA方法检测猪地方性支原体肺炎，结果表明该抗原具有非常好的特异性和敏感性。

目前国内对猪肺炎支原体没有标准的检测方法，对猪肺炎支原体引起的猪地方性支原体肺炎的血清学检测只有利用进口的IDEXX公司的猪肺炎支原体抗体诊断试剂盒来进行，进口试剂盒不仅价格昂贵，而且订购时间较长。本发明利用体外定点诱变技术对猪肺炎支原体的p102蛋白进行了体外表达，在国际上也属首次。重组表达的p102蛋白C端可以作为抗原用于血清学诊断，将所表达的蛋白质作为包被抗原用间接ELISA方法检测猪地方性支原体肺炎，结果表明该抗原具有非常好的特异性和敏感性，用该抗原建立的间接ELISA方法操作非常简单，容易推广应用，适合进行大规模血清学调查，与国外技术相比价格低廉，特异性、敏感性均符合要求。

附图说明

图1P102C基因的PCR扩增；M：DNA分子质量标准1：P102C的扩增产物。

图2重组质粒P102C-pET-28a的酶切鉴定；M：DNA分子质量标准；1：P102C-pET-28a的BamH I+Sa1I酶切产物；2：pET-28a的BamH I+Sa1I酶切产物。

图3重组表达蛋白SDS-PAGE电泳结果；M：未预染蛋白质分子质量标准；1：诱导的pET-28a；2：未诱导的pET-28a；3：诱导的P102C-pET-28a；4：未诱导的P102C-pET-28a。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。实施例1编码猪肺炎支原体p102蛋白突变DNA的制备

首先提取猪肺炎支原体J株(购买自美国ATCC)的基因组DNA，设计两对突变用引物：

A1：5’CAGGGATCCGCAGAAGAAGCTAAG 3’(SEQ ID NO：2)；

A2：5’GTCCAAATGCTTGTCCCAAATTTT TC 3’(SEQ ID NO：3)；

A3：5’ACAAGCATTTGGACAGCTTTTAATTTT 3’(SEQ ID NO：4)；

A4：5’CCGGGTCGACTTACTTTTTAACATAGTTTC 3’(SEQ ID NO：5)；分两轮进行PCR扩增，同时完成突变和克隆。

第一轮PCR分别进行两组PCR反应，均以所提取的猪肺炎支原体基因组DNA为模板。一组以A1与A2为引物，另一组引物为A3与A4。反应体系为10×Taqbuffer 5.0μL，2.5mM dNTP 4μL，两条引物各3.5μL，Taq酶0.5μL，模板0.5μL，蒸馏水33μL，反应体系为50μL；混匀后进行PCR扩增，循环参数相同，均为95℃预变性5min；94℃变性45s，52℃退火45s，72℃延伸45s，30个循环后，72℃延伸10min。产物于10g/L琼脂糖凝胶中电泳30min(100V)，回收目的片段。A1与A2扩增到的特异性片段大小为177bp，A3与A4扩增到的特异性片段大小为349bp。

第二轮PCR以回收的两段DNA片段为模板，以A1与A4为引物进行扩增，反应体系为10×Taq buffer 5.0μL，2.5mM dNTP 4μL，引物(A1与A4)各3.5μL，Taq酶0.5μL，第1轮PCR回收的两份产物各0.5μL做为第2轮PCR扩增模板，蒸馏水32.5μL，反应体系为50μL；混匀后进行PCR扩增，循环参数：95℃预变性5min；94℃变性45s，52℃退火45s，72℃延伸45s，35个循环后，72℃延伸10min，再4℃保存。产物于10g/L琼脂糖凝胶中电泳30min(100V)，回收目的片段大小为510bp。

收集扩增到的特异性片段经酶切后将该突变目的片断定向克隆到载体质粒，进行核苷酸序列测定，经序列测定后证实所扩增的特异性片段为所需的突变片段。目的基因A段序列鉴定将回收的目的片断A连接到T载体上，转化DH5a，挑出阳性克隆送上海生工生物工程技术服务有限公司测序。测序后的序列为SEQ ID NO：1所示。

实施例2重组编码丝状支原体丝状亚种N端脂蛋白的突变DNA的表达

重组表达质粒的构建：将实施例1所扩增到的PCR产物用上海华舜公司的胶回收试剂盒回收。经突变后的P102C末端基因和Pet28a载体(购自Navagen公司)用BamHI和Sa1 I酶切，胶回收酶切片段，用T₄DNA连接酶于16℃过夜连接，连接产物转化BL21(DE3)感受态细胞，转化后的细菌涂布于含50μg/ml的卡那霉素LB细菌培养基平板上。挑取白色菌落，接种于LB(含50μg/ml卡那霉素)液体培养基内，37℃摇床培养16h后，提取质粒DNA。用PCR及限制性内切酶鉴定重组质粒，重组转化子命名为P102C-pET-28a。利用PCR(以P102C-1，P102C-2为引物)和酶切(BamH I和Sa1 I)鉴定重组载体质粒，经电泳分析得到阳性克隆。结果显示，PCR产物及双酶切片段的大小与预测结果一致，为500bp左右的条带(见图2)。利用pET-28a载体的T-7启动子引物对重组质粒进行测序，结果表明P102C基因插入的位置、大小和读码框均正确(图2)。

得到阳性菌，以10ml/L接种LB培养基，摇床内37℃220r/min增菌培养，然后加入IPTG进行诱导。阳性重组质粒在大肠杆菌中诱导后，出现目的融合蛋白，大小约26ku，而非诱导对照在26ku附近未出现蛋白条带。为了获得理想的表达量，分别以不同菌液浓度(OD_600nm值为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2)、不同IPTG浓度(0.2、0.4、0.8、1.0、1.2mmol/L)以及不同诱导时间(2h、3h、4h、5h、6h、过夜)对诱导条件进行优化。通过对表达条件进行优化，SDS-PAGE电泳结果经薄层扫描分析表明，菌液浓度OD600nm为0.7、诱导时间为5h、IPTG浓度为1.0mmol/L时，目的蛋白的表达量最大，经薄层扫描测算可知目的蛋白占菌体总蛋白的28％。

将培养液以16000g离心10min，离心收集菌体，经超声波破菌后，离心收集上清液，用BugBuster^TM Ni-NTA His·Bind纯化试剂盒在自然条件下对目的蛋白进行纯化，按纯化试剂盒操作手册说明进行。收集到的蛋白进行SDS-PAGE电泳，其蛋白质SDS-PAGE电泳图谱与Western blotting结果分别见图3和图4。由此可见，构建的重组表达载体转化BL21(DE3)菌，并经诱导后能高效表达pET-28a-P102C基因编码的蛋白(见图3)。

试验例1利用IDEXX的猪肺炎支原体抗体检测试剂盒进行猪肺炎支原体血清学检测

一、试验材料：

1、供试样品：检测样品来源自辽宁吉林黑龙江三省的养猪场送检的有呼吸道症状的发病猪。阳性对照、阴性对照由该试剂盒提供。试剂盒自带的猪肺炎支原体包被抗原。空白对照为100μl底物溶液加50μl终止液。

2、试剂：辣根过氧化物酶标记的抗猪抗体(庆大霉素做保护剂)，样品稀释液(磷酸盐缓冲液，含蛋白质稳定剂，用叠氮钠做保护剂)，10倍浓缩的洗涤液(庆大霉素做保护剂)，TMB底物溶液，终止液，以上由IDEXX试剂盒提供。

二、试验方法

具体试验程序如下：

1、样品准备：用样品稀释液(Sample Diluent)将被检血清样品稀释40倍(1∶40，如10μl血清加入390μl稀释液中)。对照血清不稀释。

2、取出Mhyo抗原包被板，加对照和被检血清，每孔加100μl。室温孵育30min，甩干后每孔用300μl稀释后的洗涤液洗涤3-5次，每次洗涤后，甩掉孔内的液体。

3、加100μl酶标抗猪抗体，室温孵育30min甩干后同上洗涤。

4、每孔加入100μl TMB底物溶液，室温孵育15min。

6、每孔加入100μl终止液，终止反应。

7、测定光密度值(OD)：以650nm测量和记录样品和对照的吸光值。

在每次试验中均设标准阳性、标准阴性和底物终止液空白对照孔。

三、判定标准：

阳性对照平均值(PC)减去阴性对照平均值(NC)，其差必须大于等于0.15；阴性对照平均值必须小于等于0.15。

s/p＜0.3，判为血清肺炎支原体(Mhyo)抗体阴性。

s/p等于0.3至0.4，判为血清肺炎支原体(Mhyo)抗体可疑。

s/p＞0.4，判为血清肺炎支原体(Mhyo)抗体阳性。

四、试验结果

表1应用IDEXX抗体检测试剂盒对自然感染猪肺炎支原体的猪血清检测结果

	样品名称	OD值	s/p值
				1	阳性血清1	0.580
2	阳性血清2	0.576
				3	阴性血清1	0.012
4	阴性血清2	0.008
				5	Liao-1	0.456	0.785
6	Liao-2	0.376	0.644
				7	Liao-3	0.512	0.883
8	Liao-4	0.404	0.694
				9	Liao-5	0.285	0.484
10	Liao-6	0.489	0.843
				11	Ji-1	0.341	0.583
12	Ji-2	0.486	0.838
				13	Ji-3	0.332	0.567
14	Ji-4	0.299	0.509
				15	Ji-5	0.375	0.643
16	Ji-6	0.278	0.472
				17	Hei-1	0.445	0.766
18	Hei-2	0.378	0.648
				19	Hei-3	0.216	0.363
20	Hei-4	0.415	0.713
				21	Hei-5	0.405	0.695
22	Hei-6	0.365	0.625
				23	Hei-7	0.225	0.379
24	Hei-8	0.406	0.697
				25	Hei-9	0.399	0.685
26	Hei-10	0.375	0.643

结果表明：采用商品化的IDEXX公司的抗体检测试剂盒，检测猪支原体肺炎，可用于猪地方性支原体肺炎的血清学诊断。

试验例2利用重组表达的突变猪肺炎支原体P102基因C末端的蛋白进行猪支原体肺炎血清学检测。

一、试验材料：

1、供试样品：检测样品来源自辽宁吉林黑龙江三省的养猪场送检的有呼吸道症状的发病猪。用本发明实施例2所表达的重组蛋白质作为包被抗原，阳性对照、阴性对照来自中国中国兽医药品监察所。空白对照为100μl底物溶液加50μl终止液。

3、试剂：鱼明胶、吐温20、辣根过氧化物酶标记的羊抗猪抗体均购自美国sigma公司，包被液(pH 9.6，0.05M2M H₂SO₄)，终止液(2M H₂SO₄)。

二、试验方法

将实施例2所纯化的重组蛋白以1μg/ml包被96孔平底聚苯乙烯酶标板，具体试验程序如下：

1、包被抗原：用pH 9.6，0.05M的碳酸盐缓冲液将抗原稀释到工作浓度，用微量加样器每孔加入100μl，覆上石蜡封口膜，4℃包被过夜。次日倾去包被液，用Stat Fax 2600型全自动洗板机洗涤。

2、封闭：每孔加入100μl 3％鱼明胶，置湿盒中37℃孵育90min，甩干后同上洗涤。

3、加被检血清：用含0.05％吐温20的PBS(PBST)将血清以1∶80倍稀释，每孔加100μl。置湿盒中37℃孵育30min，甩干后同上洗涤。

4、加酶结合物：用PBST(磷酸盐缓冲液)将酶结合物以1∶2000倍稀释，每孔加100μl，置湿盒中37℃孵育1h，甩干后同上洗涤。

5、加底物溶液：每孔加入OPD(邻苯二胺)溶液100μl，置暗盒中室温放置30min。

6、加终止液：每孔加入2M H₂SO₄ 50μl，终止反应。

7、测定光密度值(OD)：终止反应后，用Stat Fax 2600型全自动酶标仪以492nm测定各孔OD值。

在每次试验中均设标准阳性、标准阴性和底物终止液空白对照孔。

三、判定标准：

阳性对照平均值(PC)减去阴性对照平均值(NC)，其差必须大于等于0.5；阴性对照平均值必须小于等于0.15。

如果s/p≤0.4时，样品判定为阴性；

如果s/p≥0.5时，样品判定为阳性；

如果0.4≤s/p≤0.5时，样品判定为可疑。

(例如：有一样品OD值S＝0.635，那么s/p＝(0.635-0.2475)/(1.2475-0.2475)s/p＝0.388，s/p＜0.4判断此样品为阴性)。

四、试验结果

从表2中可见以突变后重组的猪肺炎支原体P102基因表达的蛋白质作为抗原建立的间接ELISA检测方法，与国外进口的商品化试剂盒的实验结果比较符合。

表2

试验结果表明：采用本发明重组表达的蛋白质作为抗原运用间接ELISA试验方法检测猪支原体肺炎，检测结果准确率高，说明该抗原具有很高的特异性和敏感性，可用于猪地方性支原体肺炎的血清学诊断。

附录

ELISA数值计算方法

1、阴性对照均值NC＝[A1孔(650)+B1(650)]/2

2、阳性对照均值PC＝[C1孔(650)+D1(650)]/2

3、s/p值

s/p＝[样品OD值(650)-(NC)]/[(PC)-(NC)]

4、终点抗体滴度(1∶40)与s/p的关系式：

Log₁₀滴度＝1.09(Log₁₀s/p)+3.36

序列表

<110>中国农业科学院哈尔滨兽医研究所

<120>编码猪肺炎支原体P102蛋白的DNA及其制备方法和用途

<130>KLPI05678

<160>6

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>504

<212>DNA

<213>Mycoplasma hyopneumoniae

<400>1

ggatccgcag aagaaggcaa gagtcaaagt caaagtcagc aaacacagtc agtttccact    60

tcatcgcctc aaactagtca aaatttgaat tctaattcca caaccagtac gaatttagcc    120

ttagaaaatg aaaaatttgg gacaagcatt tggacagctt ttaattttgc taatatttat    180

aatcttgaaa atacaaaaag cgaatatgag atctcaactt taggaaataa gctatttttt    240

gattttaaat tagttgataa aactaatcaa aatctaattt tggctcagtc caaaattagt    300

cttaataata ttattaattc taataaatct gcctatgata taattaagaa attcaatccc    360

gatgtatttt tagatggaac aattaattat caagatcaag gaaaagataa aaaagaattt    420

atcctaaaag atttaagtga taataaatta atatttaaat cagaagatgc aattcaaact    480

gatcaaggtt tagagctaaa gtaa                                           504

<210>2

<211>24

<212>DNA

<213>artifica

<400>2

cagggatccg cagaagaagc taag                                           24

<210>3

<211>26

<212>DNA

<213>artifica

<400>3

gtccaaatgc ttgtcccaaa tttttc        26

<210>4

<211>27

<212>DNA

<213>artifica

<400>4

acaagcattt ggacagcttt taatttt       27

<210>5

<211>30

<212>DNA

<213>artifica

<400>5

ccgggtcgac ttacttttta acatagtttc    30

<210>6

<211>167

<212>PRT

<213>Mycoplasma hyopneumoniae

<400>6

Gly Ser Ala Glu Glu Gly Lys Ser Gln Ser Gln Ser Gln Gln Thr Gln

1               5                   10                  15

Ser Val Ser Thr Ser Ser Pro Gln Thr Ser Gln Asn Leu Asn Ser Asn

            20                  25                  30

Ser Thr Thr Ser Thr Asn Leu Ala Leu Glu Asn Glu Lys Phe Gly Thr

        35                  40                  45

Ser Ile Trp Thr Ala Phe Asn Phe Ala Asn Ile Tyr Asn Leu Glu Asn

    50                  55                  60

Thr Lys Ser Glu Tyr Glu Ile Ser Thr Leu Gly Asn Lys Leu Phe Phe

65                  70                  75                  80

Asp Phe Lys Leu Val Asp Lys Thr Asn Gln Asn Leu Ile Leu Ala Gln

                85                  90                  95

Ser Lys Ile Ser Leu Asn Asn Ile Ile Asn Ser Asn Lys Ser Ala Tyr

            100                 105                 110

Asp Ile Ile Lys Lys Phe Asn Pro Asp Val Phe Leu Asp Gly Thr Ile

        115                 120                 125

Asn Tyr Gln Asp Gln Gly Lys Asp Lys Lys Glu Phe Ile Leu Lys Asp

    130                 135                 140

Leu Ser Asp Asn Lys Leu Ile Phe Lys Ser Glu Asp Ala Ile Gln Thr

145                 150                 155                 160

Asp Gln Gly Leu Glu Leu Lys

                165

Claims (8)

1、一种编码猪肺炎支原体P102蛋白的DNA，其特征在于：其为SEQ ID NO：1所示的序列。

2、一种制备权利要求1所述DNA的方法，包括：

(1)提取支原体的基因组DNA；以SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3为引物，以支原体的基因组DNA为模板进行PCR扩增，得到扩增产物1；以SEQ ID NO：4和SEQ IDNO：5为引物，以支原体的基因组DNA为模板进行PCR扩增，得到扩增产物2；

(2)以SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：5为引物，以扩增产物1和扩增产物2为模板进行PCR扩增，收集扩增到的特异性片段，即得。

3、一种重组表达质粒，由权利要求1所述DNA和表达载体所组成。

4、按照权利要求3所述的重组表达质粒，其特征在于，所述的表达载体包括Pet22b、Pet 30a、Pet28a、pMAL-c4X、pMAL-p4X、PGEX-6p-1或Pet 32a载体。

5、含有权利要求3或4所述的重组表达质粒的细胞系。

6、权利要求1的DNA所编码的蛋白质，其特征在于：其为SEQ ID NO：6所示的序列。

7、权利要求1所述的DNA在制备诊断或检测猪地方性支原体肺炎试剂中的用途。

8、权利要求6所述的蛋白质在制备诊断或检测猪地方性支原体肺炎试剂中的用途。

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