CN101691396A - 一种猪胸膜肺炎放线杆菌的重组外膜蛋白、编码基因、表达载体及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种猪胸膜肺炎放线杆菌的重组外膜蛋白、编码基因、表达载体及其制备方法，具有(a)或(b)的重组外膜蛋白：(a)由SEQ NO.2所示氨基酸序列的蛋白质；(b)在(a)中的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具免疫活性的由(a)衍生的蛋白质。其编码基因，是下列核苷酸序列之一：(1)SEQ NO.1所示的DNA序列；(2)SEQ NO.1限定的DNA序列具有90％以上的同源性，且编码相同功能的蛋白质的DNA系列。利用本发明提供的基因，可以得到较高的表达产物收获率，每100mlLB培养基可收获重组蛋白13mg，该重组蛋白具有较好的抗原性。
Description
技术领域
本发明涉及猪胸膜肺炎放线杆菌，尤其是一种猪胸膜肺炎放线杆菌的重组外膜蛋白、编码基因、表达载体及其制备方法。
背景技术
猪胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae，APP)引起猪传染性胸膜肺炎(Porcine contagious pleuropneumoniae，PCP)，该病以肺出血、坏死和纤维素性渗出为主要病变的接触性传染病。PCP在世界各地广泛流行，常常造成巨大的经济损失，是国际公认的危害现代养猪业的五大疾病之一。英国的Paffison于1957年首次报道了该病，Maffhews和Paffison于1961年从阿根廷爆发猪传染性胸膜肺炎的猪群中分离到此菌，至20世纪80年代已在世界广泛流行，且有逐年增长趋势，近年来国际公认为危害现代养猪业的重要传染病之一(Nicolet J.Taxonomy and serological identification ofActinobacillus pleuropneumoniae[J].Can Vet J，1988，29：578-580。APP是革兰氏阴性，有荚膜的多形性小球杆菌，在血液琼脂平板上呈不透明扁平的圆形菌落，其大小为1～1.5mm，周围呈β溶血，用白金耳触之有粘性感，金黄色葡萄球菌可增强其溶血性(CAMP实验阳性)，兼性厌氧，无运动力，生长需要V因子。目前由于该病致病菌的血清型多、分布地域广，加上其易产生抗药性及传统的灭活疫苗来防治该病仍不是很成功等原因给该病的防制工作带来很大困难。
APP可产生多种毒力因子，如Apx、菌毛和LPS等。Apx是APP分泌的一类溶血毒素，也是APP主要的毒力因子，不同菌株血清型毒力的强弱与Apx毒素种类有关。目前，发现的APP的15个血清型共产生四种Apx，Apx I、ApxII、ApxIII、ApxIV。它们都属于RTX(repeating structure toxin，RTX)。四种毒素都具有CAMP效应，即与金黄色葡萄球菌共培养时，其溶血效应会加强。不同APP血清型产生的毒素不同。其中产Apx I和ApxII毒素的血清型毒力最强。在APP的致病过程中Apx毒素的作用是溶解红细胞，还具有调节白细胞活性的功能。ApxII有较弱的溶血活性，它对肺泡巨噬细胞和嗜中性白血球也具有细胞毒性作用，ApxIII毒素没有溶血活性，但是它对肺泡巨噬细胞和嗜中性白细胞毒性很强。Apx具有强免疫原性，业已有许多关于Apx作为疫苗潜在成分的研究报道。Zhang(Y.Zhang，J.M.Tennent，A.Ingham et al.Identification of type4 fimbriae in Actinobacilluspleuropneumoniae[J]FEMS Microbiol.Lett.189(2000)15-18.)等人鉴定出血清1、2、7及12型APP的完整菌毛及菌毛亚单位，其他血清型是否产生菌毛尚未见报道。许多革兰氏阴性菌的LPS在其发病过程中起重要作用细菌粘附宿主细胞后，感染的建立取决于细菌获得生长必需的营养的能力。在呼吸道内，能获得足够的碳水化合物和其他养分受到限制。这种能够在宿主内克服营养的限制是感染发病的前提，此外克服铁离子限制是对许多细菌至关重要的。APP表达许多涉及铁离子摄取的蛋白因子，利用猪的铁转移蛋白作为铁的唯一来源。在铁离子限制的条件下，APP可产生两种结合铁转移蛋白的蛋白因子，TbpA和TpbB。TbpA分子量约为100kDa，可能形成铁离子转运通过外膜的跨膜通道；TbpB是一个脂蛋白，分子量为60kDa左右，结合在外膜上；这两个蛋白存在于细菌表面，主要结合于猪铁转运蛋白的C叶区。TbpA和TpbB的基因tpbA和tpbB已被克隆出，与exbBD基因连锁和共转录。ExbB和ExbD与TonB结合形成内膜蛋白复合物，为铁离子跨越外膜提供能量。Tonpitak等证实ExbB和ExbD是APP摄取铁所必需的。对含溶血素和转铁蛋白亚单位疫苗的免疫功能进行了研究。结果表明，含溶血素和转铁蛋白结合蛋白亚单位疫苗对攻毒提供部分保护(Janine T.Bossé，
Janson，Brian J.Sheehan etal.Actinobacillus pleuropneumoniae：pathobiology andpathogenesis of infection[J].Microbes and Infection 4(2002)225-235)。因此，对猪胸膜肺炎放线杆菌的研究，有助于进一步了解该病的发病机制，可更好的诊断并预防此病，具有十分重要的意义。
猪胸膜肺炎放线杆菌对培养条件要求严格，培养相对困难，因此通过成熟的基因工程方法表达猪胸膜肺炎放线杆菌的天然抗原作为疫苗或检测试剂成为越来越多的选择。胸膜肺炎放线杆菌一种外膜蛋白(OMP1)是APP重要的毒力因子。OMP1基因全长1395bp，编码1395核甘酸，共编码465个氨基酸。经过序列分析发现，该蛋白含有23氨基酸的信号肽分析结果见图1，预计成熟的蛋白分子量为48.766KD。(H van den Bosch，J Frey Interference ofouter membrane protein PalA with protective immunity against Actinobacilluspleuropneumoniae infections in vaccinated pigs Vaccine，2003 V21，Issues25-26，8，3601-3607)本研究显示OMP1具有一定的免疫原性，可介导保护性免疫反应。目前，国内还没有该蛋白的商品化产品。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，提供一种可以得到较高的表达产物收获率，并具有较好的抗原性的猪胸膜肺炎放线杆菌的重组外膜蛋白、编码基因、表达载体及其制备方法。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种猪胸膜肺炎放线杆菌的重组外膜蛋白，具有(a)或(b)的重组外膜蛋白：
(a)由SEQ NO.2所示氨基酸序列的蛋白质；
(b)在(a)中的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具免疫活性的由(a)衍生的蛋白质。
所述的猪胸膜肺炎放线杆菌的重组外膜蛋白的编码基因，是下列核苷酸序列之一：
(1)SEQ NO.1所示的DNA序列；
(2)SEQ NO.1限定的DNA序列具有90％以上的同源性，且编码相同功能的蛋白质的DNA系列。
含有上述的基因表达载体。
一种猪胸膜肺炎放线杆菌的重组外膜蛋白的制备方法，包括以下步骤：扩增SEQ NO.1中的基因；将目的片段与载体相连转入大肠杆菌；诱导表达目的得到目的蛋白；重组蛋白的纯化与复性。
扩增序列外膜基因所用的引物是，上游引物5’TTACTCGAGGGACGGTTCGCTTGAACAAG3’，下游引物；5’-CCCGGATCCCTATCTTCTATATTTACCCGCC-3’；得到目的片段与载体pET15b经酶切后连接，转入大肠杆菌，提取质粒经鉴定后转入表达型菌体(BL21(DE3)；挑取阳性菌落，经IPTG诱导表达得到目的蛋白；收集诱导的菌体经超声波裂解后经过Talon试剂盒纯化，储存8M的尿素中。
本发明的有益效果是：利用本发明提供的基因，可以得到较高的表达产物收获率，每100mlLB培养基可收获重组蛋白13mg，该重组蛋白具有较好的抗原性。因此，利用该重组蛋白作为抗原，可以建立APP免疫诊断方法，或制备有效的亚单位疫苗。
附图说明
图1为猪胸膜肺炎放线杆菌OMP1的蛋白Western blot结果。
图2为本发明猪胸膜肺炎放线杆菌OMP1的蛋白诱导纯化结果(1：蛋白maker，2：诱导全菌，3：未诱导的全菌，4和5：纯化复性的蛋白)。
具体实施方式
下面结合具体例对本发明作进一步详细说明：
本发明提供的猪胸膜肺炎放线杆菌的一种外膜蛋白(OMP1)，是具有SEQ NO.2氨基酸的蛋白质，或者是将SEQ NO.2的氨基酸或者将SEQ NO.2的氨基酸残基经过一个或几个氨基酸的取代、缺失或添加且具有与SEQ NO.2的氨基酸残基相同的活性的由SEQ NO.2衍生的蛋白质。猪胸膜肺炎放线杆菌7型菌的这种重组外膜蛋白编码基因，是下列核苷酸序列之一：1)序列表中的SEQ NO.1的DNA序列；2)与序列表中SEQ NO.1限定的DNA序列具有90％以上的同源性，且编码相同功能的蛋白质的DNA系列。
序列表中SEQ NO.2的蛋白质是含有465个氨基酸残基组成。
APP一个重组外膜蛋白(OMP1)
APP OMP1的编码基因，是下列核苷酸序列之一；
1)序列表中的SEQ NO.1的DNA序列；
2)与序列表中SEQ NO.1限定的DNA序列具有90％以上的同源性，且编码相同功能的蛋白质的DNA系列.
序列表中SEQ NO.1编码OMP1的基因由1738个核苷酸组成，其中1～69为信号肽序列，70～1395为该基因的读码框。
制备APP重组OMP1，包括以下步骤：
1)扩增序列1中的基因；
2)将目的片段与载体相连转入大肠杆菌；
3)诱导表达目的得到目的蛋白；
4)重组蛋白的纯化与复性
扩增序列外膜基因所用的引物是，上游引物5’TTACTCGAGGGACGGTTCGCTTGAACAAG3’，下游引物；5’-CCCGGATCCCTATCTTCTATATTTACCCGCC-3’；得到目的片段与载体pET15b经酶切后连接，转入大肠杆菌，提取质粒经鉴定后转入表达型菌体BL21(DE3)；挑取阳性菌落，经IPTG诱导表达得到目的蛋白；收集诱导的菌体经超声波裂解后经过Talon试剂盒纯化，储存8M的尿素中。
实施例一、APP OMP1的制备
1主要材料
1.1菌株APP血清1型由Donahule教授提供，编号为ATCC33415(CCM5586)
1.2质粒和感受态
原核表达载体pET15b由天津农学院动物科学系预防兽医学实验室保存。
感受态DH5a和BL21(DE3)购自普博欣公司。
2.方法
下述实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。
下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量。2.1利用PCR方法对猪胸膜肺炎OMP1基因SEQ NO.1中自5’端第70位到1395位核苷酸)进行扩增，其中上游引物为5’TTACTCGAGGGACGGTTCGCTTGAACAAG 3’含有Xho I酶切位点引物，P2(5’-CCCGGATCCCTATCTTCTATATTTACCCGCC-3’)为3’引物，BamHI酶切位点PCR反应体系：TaqDNA0.5μl，10×buffer 5μl，2.5mM的dNTP4μl，上下游引物各2μl，提取的APP1基因组DNA2μl，25mMCaCl2 2μl，纯水32.5μl，共50μl。
反应条件：94℃预变性3min，92℃变性1min，57℃退火30s，72℃延伸1min 20s，反应进行30个循环，72℃延伸10min。
2.2表达重组OMP1菌株的构建
由于PCR产物的两端含有酶切位点，将PCR产物及pET15b用XhoI和BamHI酶切后回收，按载体与片段比为1∶3的比例进行连接，转化DH5α感受态细胞。
2.3重组质粒的筛选与鉴定
挑转化子若干个，在3ml LB液体培养基中培养12h-16h，质粒小抽提后经1％凝胶电泳，根据DNA分子量的大小，初步筛选阳性质粒；取初步筛选的阳性质粒进行；Xho I和BamH I酶切，1％的琼脂糖凝胶电泳分析，进一步筛选阳性质粒；将重组质粒进行PCR反应，比较PCR产物与酶切产物的大小。
2.4重组OMP1的诱导表达
将鉴定为阳性的重组质粒载体转化在BL21(DE3)，在1mM IPTG诱导下表达，收集菌体。然后扩大培养。1000mlLB培养基(Amp浓度为100毫克/毫升)接种50ml过夜培养的菌液，200r/m，37℃培养1.8h，至菌液浓度OD6000.7～0.8，加入IPTG至终浓度1mM，200r/m，37℃诱导4h，离心收菌。
2.5表达蛋白的纯化
用超声波缓冲液(50mM的NaH2PO4，300mMNaCl)重悬菌体至适当浓度，超声波裂解15分钟，10秒间歇5秒，功率40％。
采用Talon试剂盒提纯融合蛋白，用8M的尿素洗脱蛋白。纯化的蛋白加等量1倍上样缓冲液100℃煮5min，SDS-PAGE电泳后染色观察。
2.6重组OMP1的复性
将含有重组OMP1的缓冲液至6M的尿素的0.02MTris-Cl(pH8.0)的缓冲液透析6个小时以上。
转至4M的尿素的0.02MTris-Cl(pH8.0)的缓冲液透析6个小时以上。
转至2M的尿素的0.02MTris-Cl(pH8.0)的缓冲液透析6个小时以上。
转至0.02MTris-Cl(pH8.0)的缓冲液透析6个小时以上
3.收率
获得的APP重组OMP1，生产量为1000mlLB培养基可获得重组蛋白130mg。
该蛋白具有免疫学活性，可以刺激机体产生抗体，因此可以用于免疫诊断或免疫预防。用纯化的OMP1蛋白包被ELISA板，以制备的兔阳性血清为一抗(1∶100)，HRP标记的羊抗兔抗体(1∶4000)，分析该融合蛋白的免疫原性。结果表明，纯化的OMP1蛋白与兔阳性血清反应明显，当包被浓度为6μg/mL时，OD490nm值达2.7，随着包被浓度的降低，OD490nm值逐渐下降。同时，该蛋白与兔的阴性血清及空白对照反应的OD490nm值则均在0.3以下，这说明该蛋白具有很好的免疫学活性。
实施例二
1.主要材料
一抗：猪抗APP多克隆抗体，天津农学院动物科学系预防兽医学实验室制备制备。
二抗：HRP标记的羊抗猪IgG，购自西美杰公司
2.方法
实施例一所得的APP重组OMP1进行10％SDS-PAGE，230mA将凝胶上的蛋白转移至硝酸素纤维膜，膜经过PBST漂洗后，用3％BSA封闭过夜，与一抗(1∶100稀释)反应2h，PBST充分漂洗后，与二抗(1∶4000稀释)反应2h，PBST充分漂洗后，进行显色，其结果见图2，说明表达的重组OMP1具有良好的抗原性。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表(SEQUENCE LISTING)
<110>天津农学院
<120>一种猪胸膜肺炎放线杆菌的重组外膜蛋白、编码基因、表达载体及其制备方法
<160>2
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>1395
<212>DNA
<213>猪胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)
<220>
<221>gene
<222>(1)..(1395)
<400>1
atgaaacttt caaaattagc tttaacactc tccgttgtac ttgccttatc ggcttgttca 60
accacaaaat taagtgcgga cggttcgctt gaacaagcgc aggcgacata tcaacaatat 120
gaagaaatta ccaaacagtt ccaaattaat gagcaatggt ggcaaggtta taatgacagc 180
cagttaaatt cgttagttga gcaagcgatt gccaataact tggatttagc taaaagcgcc 240
attgcagtaa accgagcgct ttataatgcg aatttagtcg gcgcgaatct agtaccgacg 300
tttagcggat caggttcttc atctgcagcg aaaggtgtcg gttccacatc gaatcaaatt 360
tcaaccggca tatcgactat ttcacatacg gcaagtttta agttaagtta tacgcttgat 420
ttatggcaac gtttggctga tgcggcaagt gcggcggaat gggagcataa agctacggtt 480
gaagatttaa aagcgacacg tctttcatta ttaaattcgg tcgtttctac ttactaccaa 540
attgcttatt ataaagatgc catcgcagtg attgagcgta ccattaataa ttatcagcaa 600
atctcaacga ttttaaataa taaatatgcc gcaggtgcaa tcgatcgttt agcggtggaa 660
caagctcagc aggcaacatt aaacgcgcgt aatagtttaa tttcggagcg taccaatctt 720
aaaacggcag agcagacatt gcgtaatttg ttaaatttaa aaccgaatca agcgttacct 780
actcgttatc cgagtatttt aggtgttaaa ttgcaaggaa tcgatttaaa cgtaccggta 840
tcggcaatcg caaatcgccc ggatgttgta gcccgtttaa accgtttaca aagcgcattt 900
aaatcgctta ccgcaacaga aaaaagttgg ttcccgacag ttacgcttgg cggttcgatt 960
tcggcaagcg cctcaaaagt cgcaaatatt agcgataatc cggtcggtaa cggtgtgatt 1020
tcatttgatt taccgttttt agattggaat cgtgtgaaaa ataacgtgaa aatttccgag 1080
tcggattata tgacggcgaa attaaattat gaacagacgg tgaccagcgc attaaatgaa 1140
attgatcagc actactacgc ttatcaacaa tcactcagca gttatgcgac cctacaacaa 1200
gcatacgagc atgataaacg tatcagtaac tattataaaa atcgttatga acaaggcgta 1260
tccgagttcc gtgaatggat tagcgcacta aatacggaat taaattccca gctttctatt 1320
ttgaatcaga aatatatgat tctatcgaat gaaaatacgg tgtatcagtc tatggcgggt 1380
aaatatagaa gatag 1395
<210>2
<211>464
<212>PRT
<213>猪胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)
<400>2
Met Lys Leu Ser Lys Leu Ala Leu Thr Leu Ser Val Val Leu Ala Leu
1 5 10 15
Ser Ala Cys Ser Thr Thr Lys Leu Ser Ala Asp Gly Ser Leu Glu Gln
20 25 30
Ala Gln Ala Thr Tyr Gln Gln Tyr Glu Glu Ile Thr Lys Gln Phe Gln
35 40 45
Ile Asn Glu Gln Trp Trp Gln Gly Tyr Asn Asp Ser Gln Leu Asn Ser
50 55 60
Leu Val Glu Gln Ala Ile Ala Asn Asn Leu Asp Leu Ala Lys Ser Ala
65 70 75 80
Ile Ala Val Asn Arg Ala Leu Tyr Asn Ala Asn Leu Val Gly Ala Asn
85 90 95
Leu Val Pro Thr Phe Ser Gly Ser Gly Ser Ser Ser Ala Ala Lys Gly
100 105 110
Val Gly Ser Thr Ser Asn Gln Ile Ser Thr Gly Ile Ser Thr Ile Ser
115 120 125
His Thr Ala Ser Phe Lys Leu Ser Tyr Thr Leu Asp Leu Trp Gln Arg
130 135 140
Leu Ala Asp Ala Ala Ser Ala Ala Glu Trp Glu His Lys Ala Thr Val
145 150 155 160
Glu Asp Leu Lys Ala Thr Arg Leu Ser Leu Leu Asn Ser Val Val Ser
165 170 175
Thr Tyr Tyr Gln Ile Ala Tyr Tyr Lys Asp Ala Ile Ala Val Ile Glu
180 185 190
Arg Thr Ile Asn Asn Tyr Gln Gln Ile Ser Thr Ile Leu Asn Asn Lys
195 200 205
Tyr Ala Ala Gly Ala Ile Asp Arg Leu Ala Val Glu Gln Ala Gln Gln
210 215 220
Ala Thr Leu Asn Ala Arg Asn Ser Leu Ile Ser Glu Arg Thr Asn Leu
225 230 235 240
Lys Thr Ala Glu Gln Thr Leu Arg Asn Leu Leu Asn Leu Lys Pro Asn
245 250 255
Gln Ala Leu Pro Thr Arg Tyr Pro Ser Ile Leu Gly Val Lys Leu Gln
260 265 270
Gly Ile Asp Leu Asn Val Pro Val Ser Ala Ile Ala Asn Arg Pro Asp
275 280 285
Val Val Ala Arg Leu Asn Arg Leu Gln Ser Ala Phe Lys Ser Leu Thr
290 295 300
Ala Thr Glu Lys Ser Trp Phe Pro Thr Val Thr Leu Gly Gly Ser Ile
305 310 315 320
Ser Ala Ser Ala Ser Lys Val Ala Asn Ile Ser Asp Asn Pro Val Gly
325 330 335
Asn Gly Val Ile Ser Phe Asp Leu Pro Phe Leu Asp Trp Asn Arg Val
340 345 350
Lys Asn Asn Val Lys Ile Ser Glu Ser Asp Tyr Met Thr Ala Lys Leu
355 360 365
Asn Tyr Glu Gln Thr Val Thr Ser Ala Leu Asn Glu Ile Asp Gln His
370 375 380
Tyr Tyr Ala Tyr Gln Gln Ser Leu Ser Ser Tyr Ala Thr Leu Gln Gln
385 390 395 400
Ala Tyr Glu His Asp Lys Arg Ile Ser Asn Tyr Tyr Lys Asn Arg Tyr
405 410 415
Glu Gln Gly Val Ser Glu Phe Arg Glu Trp Ile Ser Ala Leu Asn Thr
420 425 430
Glu Leu Asn Ser Gln Leu Ser Ile Leu Asn Gln Lys Tyr Met Ile Leu
435 440 445
Ser Asn Glu Asn Thr Val Tyr Gln Ser Met Ala Gly Lys Tyr Arg Arg
450 455 460
Claims (5)
1.一种猪胸膜肺炎放线杆菌的重组外膜蛋白，其特征在于，具有(a)或(b)的重组外膜蛋白：
(a)由SEQ NO.2所示氨基酸序列的蛋白质；
(b)在(a)中的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具免疫活性的由(a)衍生的蛋白质。
2.如权利要求1所述的猪胸膜肺炎放线杆菌的重组外膜蛋白的编码基因，其特征在于，是下列核苷酸序列之一：
(1)SEQ NO.1所示的DNA序列；
(2)SEQ NO.1限定的DNA序列具有90％以上的同源性，且编码相同功能的蛋白质的DNA系列。
3.含有权利要求2所述的基因表达载体。
4.如权利要求1所述的猪胸膜肺炎放线杆菌的重组外膜蛋白的制备方法，包括以下步骤：扩增SEQ NO.1中的基因；将目的片段与载体相连转入大肠杆菌；诱导表达目的得到目的蛋白；重组蛋白的纯化与复性。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：扩增序列外膜基因所用的引物是，上游引物5’TTACTCGAGGGACGGTTCGCTTGAACAAG3’，下游引物；5，-CCCGGATCCCTATCTTCTATATTTACCCGCC-3’；得到目的片段与载体pET15b经酶切后连接，转入大肠杆菌，提取质粒经鉴定后转入表达型菌体BL21(DE3)；挑取阳性菌落，经IPTG诱导表达得到目的蛋白；收集诱导的菌体经超声波裂解后经过Talon试剂盒纯化，储存8M的尿素中。
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| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Open date: 20100407 |