CN108794613A - 一种具有抑菌活性的香港牡蛎LysM蛋白及其编码基因和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种具有抑菌活性的香港牡蛎LysM蛋白及其编码基因和应用。本发明首次从香港牡蛎中分离获得一种LysM蛋白，可以有效的识别PGN，并且对溶藻弧菌、溶血葡萄球菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的生长都具有显著的抑菌作用。本发明的LysM蛋白在香港牡蛎免疫识别和抗菌活性中发挥重要的作用，为开发广谱抗菌药物和筛选免疫增强剂提供依据，同时可以为贝类的抗病育种提供应用指导。

Description

一种具有抑菌活性的香港牡蛎LysM蛋白及其编码基因和应用

技术领域：

本发明属于应用海洋生物技术领域，具体涉及一种具有抑菌活性的香港牡蛎LysM蛋白及其编码基因和应用。

背景技术：

香港牡蛎Crassostrea hongkongensis，是我国华南沿海养殖的主要经济种，喜欢生活在近河口或附近有淡水注入的地方，主要分布在广东、广西等地，年产量在130多万吨，产值在60-80亿元。香港牡蛎与其它牡蛎种类相比较，其价值主要体现在体大肉肥、味道鲜美，另外其市场价值远高于其它种类牡蛎，深受广东、广西、港澳地区、东南亚一些国家消费者青睐。但自上世纪九十年代以来，养殖牡蛎陆续爆发大规模死亡现象，不但造成了巨大的经济损失，而且严重威胁到了现有产业的可持续发展。

香港牡蛎属于无脊椎动物的软体动物门，只存在原始的非特异性免疫系统。非特异性免疫形成了一种有效的识别模式：宿主基因编码的相应模式识别受体(patternrecognition receptor，PRR)可以识别病原微生物的保守结构，即病原相关分子模式(pathogen associated molecular pattern，PAMP)。当完成病原识别后，这些PRRs可以通过激活细胞内的信号转导途径并最终引起免疫应答。

发明内容：

本发明的目的在于提供一种具有抑菌活性的香港牡蛎LysM蛋白及其编码基因和应用。

本发明的第一个目的是提供一种香港牡蛎LysM蛋白，其氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。

本发明的第二个目的是提供一种编码所述的香港牡蛎LysM蛋白的基因。

优选，所述的基因其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明的第三个目的是提供一种含有所述的基因的表达载体。

本发明的第四个目的是提供一种含有所述的表达载体的基因工程菌。

所述的基因工程菌优选为大肠杆菌BL21(DE3)。

本发明的第五个目的是提供所述的香港牡蛎LysM蛋白在识别肽聚糖中的应用。

本发明的第六个目的是提供所述的香港牡蛎LysM蛋白在制备抗菌药物中的应用。

所述的抗菌药物优选为抗溶藻弧菌、抗溶血葡萄球菌、抗金黄色葡萄球菌、抗大肠杆菌的药物。

本发明首次从香港牡蛎中分离获得一种LysM蛋白，可以有效的识别PGN，并且对溶藻弧菌、溶血葡萄球菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的生长都具有显著的抑菌作用。本发明的 LysM蛋白在香港牡蛎免疫识别和抗菌活性中发挥重要的作用，为开发广谱抗菌药物和筛选免疫增强剂提供依据，同时可以为贝类的抗病育种提供应用指导。

附图说明：

图1是表达和纯化的ChLysM重组蛋白(即香港牡蛎LysM蛋白)；M：蛋白Marker；Lane1：未诱导的ChLysM重组蛋白；Lane2：诱导的ChLysM重组蛋白；Lane3：纯化后的ChLysM重组蛋白。

图2是ELISA分析不同浓度梯度的ChLysM重组蛋白对多种肽聚糖(PGN)的结合能力；其中A为不同浓度梯度的ChLysM重组蛋白对来源于S.aureus的肽聚糖(PGN)的结合能力； B为不同浓度梯度的ChLysM重组蛋白对来源于B.subtilis的肽聚糖(PGN)的结合能力；C 为不同浓度梯度的ChLysM重组蛋白对来源于S.cerevisiae的肽聚糖(PGN)的结合能力。

图3是ChLysM重组蛋白对不同细菌的抑菌效果；其中A为ChLysM重组蛋白对S.aureus 的抑菌效果；B为ChLysM重组蛋白对S.haemolyticus的抑菌效果；C为ChLysM重组蛋白对 E.coli的抑菌效果；D为ChLysM重组蛋白对V.alginolyticus的抑菌效果。

具体实施方式：

下面的实施例中将对本发明作进一步的阐述，但本发明不限于此。

实施例1：

香港牡蛎LysM蛋白的体外重组表达和纯化

香港牡蛎LysM蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示：

MSSRKSRQDANNKPYSYQQLGAEVQNSKKSRVYVFGNADVQEDEVVEFEMSDVRSRKGGPKPTQKDEDEQLYYERELTEGDTLRSLSLQYGCPVAEIKRINNMIQDQDFYAYRKIKVPIKKYSFLTETLKTETKSDKPQFNGITVVDETDTENTETDSESVCNMSDPETQRLMIKKSLSIRSQTGLQSKEARRFLRSMDKDLVKICKSAKMRHESLDEVVSLLTNRSIQPIPPPRRKFFGHDCGLTWCSMIGVIVVLAILIPLGILSYLWFTGHFSTHSSAGQNNG

长度：286个氨基酸

类型：蛋白

链型：单链

拓扑结构：线形

特性：分子量为32.7kDa，等电点为8.16，其编码序列具有一个保守的LysM结构域

来源：香港牡蛎(Crassostrea hongkongensis)

1.香港牡蛎LysM基因原核表达载体的构建：(1)设计一对涵盖ChLysM(香港牡蛎LysM 基因)ORF(其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)的引物F1： 5’-ACGTGGATCCATGAGTTCAAGAAAGTCCAG-3’(其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示) 和R1：5’-TCGAGTCGACTCATCCATTATTCTGACCTGC-3’(其核苷酸序列如SEQ ID NO.4 所示)(下划线部分为酶切位点)，引物的两端分别加入BamH-I和SalI酶切位点和保护碱基； (2)以香港牡蛎的cDNA为模板，使用上述引物进行PCR扩增；(3)PCR产物和pET28a 载体分别使用BamH-I和SalI进行双酶切，并回收纯化酶切产物；(4)连接酶切后的PCR片段和pET28a载体；(5)转化，挑取阳性克隆，测序验证载体正确无误(即得到ChLsyM-pET28a 原核表达载体)，进行后续试验。

2.ChLysM重组蛋白的原核表达和纯化

(1)把构建好的ChLsyM-pET28a原核表达载体转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞； (2)挑选单克隆并培养至OD＝0.6，加入IPTG至终浓度为0.1mM，22℃，180rpm的条件下诱导表达；(3)6h后收集菌液，4℃，12,000×g离心10min；(4)加入Lysozyme至终浓度2mg/mL，然后超声破碎；(5)使用Glutathione Sepharose 4B(GE Healthcare)纯化ChLysM 重组蛋白(即香港牡蛎LysM蛋白)，在12％SDS-PAGE胶分析纯化产物(见图1)。

实施例2：

香港牡蛎LysM蛋白识别不同来源的肽聚糖(PGN)

(1)将staphylococcus aureus(Sigma,77140)，Bacillus subtilis(Sigma,69554)，and Saccharomyces cerevisiae(Sigma,72789)三种来源的PGN分别溶解在双蒸水(40mg/ml)中；(2)分别吸取50μl至96-孔板(Costar)，室温放置，直至蒸干；(3)60℃，半小时，固定 PGN；(4)加入200μl含有BSA的Tris Buffer，37℃，2h；(5)弃上清，Tris Bufferwash 4 次，每次2min；(6)加入不同浓度纯化好ChLysM重组蛋白，室温孵育3h；(7)弃上清，Tris Buffer wash 4次，每次2min；(8)加入mouse anti-GST antibody(Abmat,1:5000)，孵育2 h；(9)弃上清，Tris Buffer wash 4次，每次2min；(10)加入HRP偶联的goat anti-mouse IgG (Abmat,1:3000)，孵育2h；(11)加入HRP底物TMB(Tiangen)进行显色，405nm光吸收测量结果(见图2)。

从图2中可以看出，ChLysM重组蛋白对多种肽聚糖(PGN)都具有强结合能力。

实施例3：

香港牡蛎LysM蛋白的抑菌活性

(1)溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)、溶血葡萄球菌(staphylococcushaemolyticus)、金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)和大肠杆菌(EscherichiaColi)四种细菌用LB培养基在各自适合的温度，220rpm，培养到对数生长期时；(2)用Tris-HCl(50mmol L-1,pH＝8.0) 稀释菌体，使其每毫升菌液中的菌落数约为1×10⁴CFU；(3)50μL的香港牡蛎LysM蛋白 (100ng/μL)与50μL上述细菌稀释液在30℃孵育3h。(4)取20μL上述混合物于平底96- 孔板(Costar)中，每孔加入200μL LB液体培养基，继续培养，每隔1h分别检测记录各孔 OD600值。(5)设立BSA蛋白对照组和PBS空白对照组。每个样品设三个重复，根据3次测定结果取平均值作图(参见图3)。

从图3中可知，香港牡蛎LysM蛋白对溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)、溶血葡萄球菌(staphylococcus haemolyticus)、金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)和大肠杆菌 (Escherichia Coli)这4种细菌均有显著的抑菌作用，对溶血葡萄球菌(staphylococcus haemolyticus)的抑菌作用最强。

序列表

<110> 中国科学院南海海洋研究所

<120> 一种具有抑菌活性的香港牡蛎LysM蛋白及其编码基因和应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 286

<212> PRT

<213> 香港牡蛎(Crassostrea hongkongensis)

<400> 1

Met Ser Ser Arg Lys Ser Arg Gln Asp Ala Asn Asn Lys Pro Tyr Ser

1 5 10 15

Tyr Gln Gln Leu Gly Ala Glu Val Gln Asn Ser Lys Lys Ser Arg Val

20 25 30

Tyr Val Phe Gly Asn Ala Asp Val Gln Glu Asp Glu Val Val Glu Phe

35 40 45

Glu Met Ser Asp Val Arg Ser Arg Lys Gly Gly Pro Lys Pro Thr Gln

50 55 60

Lys Asp Glu Asp Glu Gln Leu Tyr Tyr Glu Arg Glu Leu Thr Glu Gly

65 70 75 80

Asp Thr Leu Arg Ser Leu Ser Leu Gln Tyr Gly Cys Pro Val Ala Glu

85 90 95

Ile Lys Arg Ile Asn Asn Met Ile Gln Asp Gln Asp Phe Tyr Ala Tyr

100 105 110

Arg Lys Ile Lys Val Pro Ile Lys Lys Tyr Ser Phe Leu Thr Glu Thr

115 120 125

Leu Lys Thr Glu Thr Lys Ser Asp Lys Pro Gln Phe Asn Gly Ile Thr

130 135 140

Val Val Asp Glu Thr Asp Thr Glu Asn Thr Glu Thr Asp Ser Glu Ser

145 150 155 160

Val Cys Asn Met Ser Asp Pro Glu Thr Gln Arg Leu Met Ile Lys Lys

165 170 175

Ser Leu Ser Ile Arg Ser Gln Thr Gly Leu Gln Ser Lys Glu Ala Arg

180 185 190

Arg Phe Leu Arg Ser Met Asp Lys Asp Leu Val Lys Ile Cys Lys Ser

195 200 205

Ala Lys Met Arg His Glu Ser Leu Asp Glu Val Val Ser Leu Leu Thr

210 215 220

Asn Arg Ser Ile Gln Pro Ile Pro Pro Pro Arg Arg Lys Phe Phe Gly

225 230 235 240

His Asp Cys Gly Leu Thr Trp Cys Ser Met Ile Gly Val Ile Val Val

245 250 255

Leu Ala Ile Leu Ile Pro Leu Gly Ile Leu Ser Tyr Leu Trp Phe Thr

260 265 270

Gly His Phe Ser Thr His Ser Ser Ala Gly Gln Asn Asn Gly

275 280 285

<210> 2

<211> 861

<212> DNA

<213> 香港牡蛎(Crassostrea hongkongensis)

<400> 2

atgagttcaa gaaagtccag acaggatgcc aacaacaaac cttacagcta ccagcaacta 60

ggcgcagagg ttcaaaactc caagaagtcc agagtgtatg tgtttggtaa tgctgatgtt 120

caagaagatg aagttgtgga atttgaaatg tctgatgtgc gatcccgtaa agggggacca 180

aaacctacac agaaggatga agatgaacaa ctgtactatg aaagagaact tacggagggt 240

gatacattac gcagtctttc attacagtat ggatgtccgg tggctgagat caagagaatt 300

aataatatga tccaggacca agatttttat gcttatagga agattaaagt gccaatcaaa 360

aagtattctt ttctaacaga aactctcaaa acggaaacaa aatctgacaa acctcaattt 420

aatggcatta cagtggtgga cgaaactgac acagagaaca cagaaacaga ctccgaatcg 480

gtgtgtaata tgagtgaccc agaaacacag cggctcatga ttaaaaaatc tctaagcatt 540

agaagtcaga caggtctcca gtccaaagaa gccagaagat ttctgcgcag catggataaa 600

gacttggtga aaatttgtaa atctgccaaa atgcgtcatg agtctctgga cgaggttgtg 660

tctctgttga ccaacaggtc aatacaacct attccacctc cgagacggaa gttctttggc 720

cacgactgtg gattaacctg gtgttcgatg attggtgtca tagtggtcct tgcaattttg 780

attccattag gaattttaag ttatttatgg ttcactggtc atttttctac ccacagttct 840

gcaggtcaga ataatggatg a 861

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

acgtggatcc atgagttcaa gaaagtccag 30

<210> 4

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tcgagtcgac tcatccatta ttctgacctg c 31

Claims (9)

1.一种香港牡蛎LysM蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种编码权利要求1所述的香港牡蛎LysM蛋白的基因。

3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

4.一种含有权利要求2或3所述的基因的表达载体。

5.一种含有权利要求4所述的表达载体的基因工程菌。

6.根据权利要求5所述的基因工程菌，其特征在于，所述的基因工程菌为大肠杆菌BL21(DE3)。

7.权利要求1所述的香港牡蛎LysM蛋白在识别肽聚糖中的应用。

8.权利要求1所述的香港牡蛎LysM蛋白在制备抗菌药物中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的抗菌药物为抗溶藻弧菌、抗溶血葡萄球菌、抗金黄色葡萄球菌、抗大肠杆菌的药物。