CN103233017B

CN103233017B - 毒害艾美耳球虫的配子体抗原gam22基因及其应用

Info

Publication number: CN103233017B
Application number: CN201310162739.8A
Authority: CN
Inventors: 陶建平; 刘丹丹; 曹李琴; 许金俊
Original assignee: Yangzhou University
Current assignee: Yangzhou University
Priority date: 2013-05-06
Filing date: 2013-05-06
Publication date: 2014-11-05
Anticipated expiration: 2033-05-06
Also published as: CN103233017A

Abstract

本发明属于基因工程疫苗领域，具体涉及一种鸡毒害艾美耳球虫配子体抗原基因、表达及其表达产物的应用。该基因的开放阅读框大小为561bp。将其构建为原核表达载体pET28a-Engam22，转化BL21宿主菌后诱导表达。表达产物能被鸡康复血清所识别，显示重组蛋白有免疫原性。该基因构建的重组真核表达质粒pcDNA3.1-Engam22免疫雏鸡，能诱导产生体液免疫与细胞免疫，显示该基因能用于鸡球虫基因工程疫苗的研制。

Description

毒害艾美耳球虫的配子体抗原gam22基因及其应用

技术领域

本发明涉及毒害艾美耳球虫（Eimeria necatrix）的配子体抗原基因，由所述基因编码的多肽，含有所述基因的载体以及所述基因的获取方法和多肽的体外表达方法以及功能鉴定。具体地，本发明的基因来自于鸡毒害艾美耳球虫有性生殖阶段的配子体。

背景技术

鸡球虫病是由艾美耳属的一种或数种球虫寄生在鸡小肠或盲肠黏膜内引起的严重危害养鸡业的原虫病，估计每年全球因球虫病的损失为30亿美元。我国每年仅抗球虫药的年消费就约6～18亿元人民币，由鸡球虫病造成的直接和间接经济损失则难以估计。长期以来，鸡球虫病的防治主要依赖药物。但由于球虫对药物普遍产生了耐药性，引起药效下降。而且在鸡饲养周期中长期添加药物还导致药物残留肉蛋，直接危害人类健康，并污染环境。为此，鸡球虫病的防治方法由化学预防转向了免疫预防。

目前，临床上用于免疫预防鸡球虫病的疫苗有活虫苗和由天然蛋白组成的亚单位疫苗两大类。虽然鸡球虫病活疫苗有着较强的免疫效果，但存在着如扩散病原的风险、球虫虫株的抗原变异、致弱虫株毒力易返强、疫苗接种剂量难以控制、疫苗影响饲料报酬、生产成本高、免疫程序繁琐、操作和免疫后的监测和管理技术要求高等一些突出的问题。

商品化的鸡球虫病亚单位疫苗是由来源于巨型艾美耳球虫配子体的三种纯化抗原（分子质量分别为230、82、56kDa）配制而成，用于干扰卵囊壁的形成，即阻断艾美耳球虫的有性生殖阶段，从而降低卵囊的产生与传播。由于该类疫苗的抗原需从配子体蛋白中经亲和柱分离纯化，配子体又需从感染鸡体的肠道上皮细胞中分离纯化，因此生产工艺复杂，成本高，难易满足生产需求。而利用基因工程技术大量生产该类抗原，可能是解决这一问题的最佳策略。但巨型艾美耳球虫配子体抗原gam82和gam56基因已受到专利保护。

毒害艾美耳球虫是鸡球虫病的重要病原之一，主要发生在60日龄以上的鸡。由于在鸡球虫不同种间缺乏交叉保护性，毒害与柔嫩和巨型艾美耳球虫在寄生部位的竞争性，以及毒害艾美耳球虫繁殖力低等原因，因此在育雏阶段用疫苗免疫预防，往往不能控制鸡饲养后期由毒害艾美耳球虫引发的球虫病。从毒害艾美耳球虫配子体克隆配子体抗原基因，构建原核表达载体表达重组抗原。用毒害艾美耳球重组配子体抗原免疫饲养后期的鸡，防治毒害艾美耳球虫引发的球虫病。但迄今为止，国内外还没有相关基因序列及其重组表达的报道。

发明内容

本发明利用基因工程技术，克隆毒害艾美耳球虫配子体抗原基因Engam22，并将该基因转入工程菌进行表达，获得大量的重组抗原，并对重组抗原的特异性、免疫原性等进行深入研究，旨为研制鸡球虫重组配子体抗原疫苗奠定基础。

本发明涉及毒害艾美耳球虫的一种配子体抗原基因，其中，所述的基因全长为713bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

其中包含的开放阅读框大小为561bp（79-639bp），其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

去除信号肽（前19个氨基酸）以后的序列如SEQ ID NO.3所示。：

本发明涉及到一种表达载体pET28a，其含有所述配子体抗原基因。将分离得到的配子体抗原基因插入酶切位点，连接到原核表达载体pET28a中，常规转化肠杆菌BL21（DE3），构建基因工程菌，并诱导表达，对表达产物进行分离、纯化和复性。

另外，本发明涉及到一种真核表达载体pcDNA3.1，其含有所述配子体抗原基因。将分离得到的配子体抗原基因插入酶切位点，连接到pcDNA3.1中，构建成核酸疫苗，并用淋巴细胞增殖试验和ELISA方法来评价免疫后鸡体的细胞免疫和体液免疫水平。

作为优选的方案，具体操作是：

1）从毒害艾美耳球虫配子体基因中分离gam22基因：

常规方法分离纯化毒害艾美耳球虫配子体，用RNA提取试剂盒提取总RNA。设计特异性引物：

上游引物：5’-ACCCCAAAATAAAATCAAAGGC-3’（SEQ ID NO.4）；

下游引物：5’-CCATGAAGATCTCAGACGTAGC-3’（SEQ ID NO.5）。

以配子体总RNA反转录得到的cDNA为模板，经过PCR条件的反复优化后，成功扩增出与预期结果相符且大小为713bp左右的特异性片段（图1），命名为Engam22。将含有目的片段PCR产物经试剂盒纯化回收后，克隆到pGEM-T-easy载体中，得到pGEM-T-easy-Engam22。

2）原核表达载体的构建

根据毒害艾美耳球虫gam22基因的ORF序列和质粒pET-28a酶切位点，去除gam22基因的信号肽后，设计1对特异性引物：

上游引物F：5’-TCGGAATTCGACGGAGCACCTGAG-3’（SEQ ID NO.6），含EcoR I酶切位点和3个保护性碱基，

下游引物R：5’-GCGAAGCTTTTAGTTGATGTCGGT-3’（SEQ ID NO.7），含HindⅢ酶切位点和3个保护性碱基。

以构建的pGEM-T-easy-Engam22载体为模板，成功扩增出与预期结果相符且大小为522bp左右的特异性片段（图2），并将此片段连接到原核表达载体pET28a中，得到pET28a-Engam22。

3）毒害艾美耳球虫gam22基因的高效表达，纯化，复性

将构建好的原核表达载体pET28a-Engam22转化BL21宿主菌，IPTG诱导表达后，经过可溶性分析，发现此体外重组表达的蛋白以包涵体形式存在（图3）。重组蛋白的大量表达时，超生裂解释放包涵体后，尿素变性。变性蛋白通过含有HIS标签的Ni-NTA亲和层析纯化后，分别在含有6M、4M、2M、1M尿素的透析液和0M尿素的PBS中各复性8h，最终通过PEG8000浓缩，收集蛋白，12%SDS-PAGE分析（图4），4℃保存。

4）体外重组表达蛋白的特异性和免疫原性检测

将重组表达的蛋白经过western-blot分析，分别以抗HIS的单克隆抗体（图5）、鼠抗gam22的多克隆抗体（图6）和毒害艾美耳球虫卵囊三次免疫后鸡的康复血清（图7）为一抗，以检测重组蛋白的特异性和免疫原性。

本发明还公开了所述Engam22基因在构建核酸疫苗中的应用。

所述核酸疫苗的构建如下：

根据Engam22基因的ORF序列和质粒pcDNA3.1的特性，设计1对特异性引物：

上游引物F1：5’-CCCAAGCTTATGAGGGCTATCCTAACCAC-3’（SEQ ID NO.8），含HindⅢ酶切位点和3个保护性碱基，

下游引物R1：5’-GCGGAATTCTTAGTTGATGTCGGTAAGCT-3’（SEQ ID NO.9），含EcoR I酶切位点和3个保护性碱基。

以构建的pGEM-T-easy-Engam22载体为模板，成功扩增出与预期结果相符且大小为579bp左右的特异性片段（图8），并将此片段连接到质粒pcDNA3.1中，得到pcDNA3.1-Engam22。

将构建好的重组质粒pcDNA3.1-Engam22进行HindⅢ和EcoR I双酶切鉴定（图9），选取阳性克隆测序，确定阅读框架正确后大量克隆重组质粒用于后续试验。

对构建的核酸疫苗进行免疫原性分析，评价核酸疫苗免疫后鸡的细胞免疫与体液免疫水平，结果表明：免疫后pcDNA3.1-Engam22组的抗体水平显著高于未免疫组对照组和空质粒组；pcDNA3.1-Engam22组的T淋巴细胞增殖水平显著高于未免疫组对照组和空质粒组。

附图说明

图1是毒害艾美耳球虫gam22基因整个ORF扩增结果。泳道1为标准分子量；泳道2和3为扩增得到的目的片段，大小为713bp。

图2是毒害艾美耳球虫gam22基因祛除信号肽，加入酶切位点后的扩增结果。泳道1为标准分子量；泳道2和3为扩增得到的目的片段，大小为522bp。

图3是毒害艾美耳球虫gam22基因体外重组表达蛋白可溶性分析结果，其中1：标准蛋白质分子量标记；2：菌体裂解后的上清；3：菌体裂解后的包涵体。

图4是毒害艾美耳球虫gam22基因的纯化和复性结果分析，其中1：标准蛋白质分子量标记；2：重组菌超生后上清；3：包涵体尿素裂解后沉淀；4：包涵体尿素裂解后上清；5：结合缓冲液作用下裂解液与Ni-NTA结合后的流出液；6：洗涤缓冲液的第一次洗脱液；7：洗涤缓冲液的第三次洗脱液；8：Ni-NTA亲和纯化后的目的蛋白；9：透析复性后的目的蛋白。

图5是Western-blot鉴定体外重组表达蛋白特异性的结果，其中1：预染蛋白质分子量标记；2：pET-28a/BL21IPTG诱导；3：pET-28a-Engam22/BL21IPTG诱导。

图6是鼠抗毒害艾美耳球虫gam22体外重组表达蛋白的多克隆抗体Western-blot检测结果，其中1：预染蛋白质分子量标记；2：pET-28a/BL21IPTG诱导；3：pET-28a-Engam22/BL21IPTG诱导。

图7是毒害艾美耳球虫三次免疫鸡的康复血清Western-blot检测结果，其中1：预染蛋白质分子量标记；2：pET-28a/BL21IPTG诱导；3：pET-28a-Engam22/BL21IPTG诱导。

图8是构建核酸疫苗用Engam22基因扩增结果：泳道1为标准分子量；泳道2和3为扩增得到的目的片段，大小为579bp。

图9是重组质粒pcDNA3.1-Engam22酶切鉴定结果：泳道1为标准分子量；泳道2、3和4为酶切结果，其中质粒片段大小为5387bp，目的片段大小为571bp。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。

实施例1：从毒害艾美耳球虫配子体基因中分离gam22基因

常规方法分离纯化毒害艾美耳球虫配子体，用RNA提取试剂盒提取总RNA。

RT-PCR钓取gam22基因：

参照TaKaRa公司的（TaKaRa RNA LA PCR^TMKit(AMV)Ver.1.1）提供的方法：两步法RT-PCR试剂盒扩增gam22基因。

Engam22基因的钓取采用上游引物(5’-ACCCCAAAATAAAATCAAAGGC-3’)和下游引物(5’-CCATGAAGATCTCAGACGTAGC-3’)。

第一步：反转录反应，总体系为10μl：0.5μl的总RNA（≤500ng total RNA），25mM的MgCl₂2μl，10×RNA PCR Buffer1μl，RNase Free dH₂O4.25μl，浓度为10mM的dNTP1μl，RNase Inhibitor0.25μl,5u/μl AMV逆转录酶0.5μl和Oligo dT接头引物0.5μl。反应步骤：42°C逆转录反应30min；99°C变性5min；5°C冷却5min。

第二步：PCR反应，总体积为50μl：25mM的MgCl₂3μl，10×LA PCR BufferⅡ（Mg²⁺Free）4μl，灭菌蒸馏水31.75μl，TaKaRa LA Taq0.25μl，上游引物（10μM）0.5μl，下游引物（10μM）0.5μl，然后把第一步反转录反应中的产物10μl加入到此体系中。PCR反应步骤：94°C预变性3min；94°C变性30s；56°C退火30s；72°C延伸1.5min，共28个循环。反应结束后，1.2%琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1。将得到的Engam22基因克隆到pGEM-T-easy载体（购自Promeqa公司）中，送往华大基因公司测序。（重组载体命名为：pGEM-T-Easy-Engam22。）

实施例2：表达片段Engam22的扩增

根据毒害艾美耳球虫gam22基因的ORF序列和质粒pET28a（购自Invitrogen公司）的酶切位点，祛除信号肽后，设计特异性引物，扩增表达用的基因片段。

根据质粒pET28a上具备的酶切位点，对Engam22基因进行序列分析后，祛除信号肽，选取EcoR I和HindⅢ两个酶切位点，设计得到的特异性引物为：上游引物（5’-TCGGAATTCGACGGAGCACCTGAG-3’）含EcoR I酶切位点和3个保护性碱基，下游引物（5’-GCGAAGCTTTTAGTTGATGTCGGT-3’）含HindⅢ酶切位点和3个保护性碱基。

50μl PCR反应体系如下：5μl的10×反应缓冲液；浓度为10μM的上、下游引物各1μl，4μl dNTP（10mM）；35μl H₂O；0.5μl TaKaRa LA Taq酶，1μl模板pGEM-T-Easy-Engam22。95°C变性5min;95°C变性30s，55°C退火30s，72°C延伸1min，共30个循环；72°C，延伸10min。反应结束后，1.2%琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图2。扩大反应体系后，将得到的PCR产物纯化回收，-20℃保存备用。

实施例3：原核表达载体的构建

双酶切pET28a：

EcoRI和HindⅢ为Fermentas产品。50μl酶切体系为：5μl10×FastDigest Green Buffer，20μl载体pET28a，FastDigest EcoRI和FastDigest HindⅢ各2.5μl，20μl ddH₂O。37°C反应2h，1.2%琼脂糖凝胶电泳,胶回收产物。

双酶切实施例2中纯化的PCR产物：

EcoRI和HindⅢ为Fermentas产品。100μl酶切体系：10μl10×FastDigest Green Buffer；20μl纯化PCR（Engam22）产物；FastDigest EcoRI和FastDigest HindⅢ各5μl；60μl ddH₂O。37°C反应2h，1.2%琼脂糖凝胶电泳，胶回收酶切产物。

连接反应：

SolutionⅠ为TaKaRa产品。8μl双酶切载体pET28a，2μl双酶切PCR产物，10μl solutionⅠ，16℃连接过夜。

取10μl连接产物转化感受态细胞DH5α。涂布到含有卡那霉素抗性的LB平板,第二天挑取单克隆，过夜培养后，提取质粒，采用双酶切鉴定法挑选阳性克隆（重组载体命名为：pET28a-Engam22），并送交华大基因公司测序。

实施例4：gamEXP22基因在大肠杆菌中的诱导表达

挑取测序正确的克隆转化感受态BL21(DE3)。挑取单个菌落接种到3ml LB培养液(含100μg/ml卡那霉素)中,37°C，200rpm振荡培养过夜，按1∶100转接种到10ml含相同浓度抗生素LB中，37°C200rpm振荡培养4h，加入终浓度为1mM的IPTG，37°C200rpm诱导4h，12%SDS-PAGE检测表达情况。结果如图3，清楚表明表达的蛋白分子量在29kDa左右，而且主要存在于包涵体内。

实施例5：表达产物的纯化和复性

4°C12000rpm离心5min收集菌体,以0.1M PBS重悬沉淀，然后冰浴超声（超声2s，间隙3s，25min）。4℃12000rpm离心10min，收集包涵体沉淀。沉淀中加入10ml Lysis EquilibriumBuffer(100mM NaH2PO4，10mM Tris·Cl，8M urea，pH8.0)，超声（超声2s，间隙3s，15min）辅助包涵体的裂解，4°C12000rpm离心10min，收集上清加入到预先用LE Buffer平衡处理的Ni-NTA柱中，4℃作用30min，期间要不断的摇晃。按照GenScript公司提供的操作手册纯化蛋白。

收集Elution Buffer（100mM NaH₂PO₄，10mM Tris·Cl,500mM Imidazole，8M urea，pH8.0）洗脱的蛋白，装入透析袋,在复性缓冲液(50mmol/L Tris-HCl，0.15mol/L NaCl，pH8.0)分别加入6M、4M、2M、1M尿素进行梯度透析复性，每个浓度的尿素，4℃透析复性8h，最后在含有0M尿素的PBS（pH8.0）中透析复性8h。PEG8000浓缩蛋白，12%SDS-PAGE检测，蛋白-20°C保存。重组蛋白的纯化和复性结果如图4。

实施例6：表达产物的特异性检测

将诱导的阳性重组菌和空质粒转化菌蛋白20μl，12%SDS-PAGE电泳，并转移到硝酸纤维素膜上，转印结束后将NC膜置在含3%BSA的TBS缓冲液中室温封闭1.5h，随后用一抗为鼠抗HIS标签单克隆抗体（BBI，USA）（用封闭液稀释至1μg/ml，共15ml），37℃下作用1.5h，TBST洗涤5min，重复3次；接着用HRP标记的兔抗鼠IgG为二抗，用封闭液1∶2000稀释，室温下作用1.5h，TBST洗涤5min，重复3次；最后用TMB缓冲液显色1min，去离子水漂洗终止反应后室温干燥，结果如图5。

实施例7：表达产物的免疫原性检测

将诱导的阳性重组菌和空质粒转化菌蛋白20μl，12%SDS-PAGE电泳，并转移到硝酸纤维素膜上，转印结束后将NC膜置在含3%BSA的TBS缓冲液中室温封闭1.5h，随后用一抗为本实验室制备的鼠抗gam22抗原多克隆抗体，用封闭液1∶200稀释，37℃下作用1.5h；TBST洗涤5min，重复3次，接着用HRP标记的兔抗鼠IgG为二抗，用封闭液1∶1000稀释，室温下作用1.5h；TBST洗涤5min，重复3次；最后用TMB缓冲液显色1min，去离子水漂洗终止反应后室温干燥，结果如图6。

将诱导的阳性重组菌和空质粒转化菌蛋白20μl，12%SDS-PAGE电泳，并转移到硝酸纤维素膜上，转印结束后将NC膜置在含3%BSA的TBS缓冲液中室温封闭1.5h，随后一抗为本实验室制备免疫E.necatrix后鸡的康复血清，用封闭液1∶100稀释，37℃下作用1.5h；TBST洗涤5min，重复3次，接着用HRP标记的兔抗鸡IgY（IgG）为二抗，用封闭液1∶1000稀释，室温下作用1.5h；TBST洗涤5min，重复5次；最后用TMB缓冲液显色1min，去离子水漂洗终止反应后室温干燥，结果如图7。

实施例8：核酸疫苗的构建

PCR钓取构建核酸疫苗用的Engam22基因：

根据Engam22基因的ORF序列和质粒pcDNA3.1（购自Invitrogen公司）的特性，设计特异性引物，扩增目的片段。

根据质粒pcDNA3.1的特征，选取HindⅢ和EcoR I两个酶切位点，设计得到的特异性引物为：上游引物（5’-CCCAAGCTTATGAGGGCTATCCTAACCAC-3’，）含HindⅢ酶切位点和3个保护性碱基，下游引物（5’-GCGGAATTCTTAGTTGATGTCGGTAAGCT-3’）含EcoRI酶切位点和3个保护性碱基。

50μl PCR反应体系如下：5μl的10×反应缓冲液；浓度为10μM的上、下游引物各1μl，4μl dNTP（10mM）；35μl H2O；0.5μl TaKaRa LA Taq酶，1μl模板pcDNA3.1-Engam22。95°C变性5min；95°C变性30s，55°C退火30s，72°C延伸1min，共30个循环；72°C，延伸10min。反应结束后，1.2%琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图8。扩大反应体系后，将得到的PCR产物纯化回收，-20℃保存备用。

双酶切纯化的PCR产物：

HindⅢ和EcoRI为Fermentas产品。100μl酶切体系：10μl10×FastDigest Green Buffer；20μl纯化PCR（Engam22）产物；FastDigest EcoRI和FastDigest HindⅢ各5μl；60μl ddH2O。37°C反应2h，1.2%琼脂糖凝胶电泳,胶回收酶切产物。

双酶切pcDNA3.1:

HindⅢ和EcoRI为Fermentas产品。50μl酶切体系为：5μl10×FastDigest Green Buffer，20μl载体pcDNA3.1，FastDigest EcoRI和FastDigest HindⅢ各2.5μl，20μl ddH2O。37°C反应2h，1.2%琼脂糖凝胶电泳，胶回收产物。

连接反应:

SolutionⅠ为TaKaRa产品。8μl双酶切载体pcDNA3.1，2μl双酶切PCR产物，10μl solutionⅠ，16℃连接过夜。

取10μl连接产物转化感受态细胞DH5α。涂布到含有氨苄抗性的LB平板,第二天挑取单克隆，过夜培养后，提取质粒，采用双酶切鉴定法挑选阳性克隆（重组质粒命名为：pcDNA3.1-Engam22），并送交华大基因公司测序。

实施例9：核酸疫苗的免疫原性分析

抗体水平：

血清获取：将6日龄雏鸡随机分为4组，即核酸疫苗免疫组、pcDNA3.1空质粒组、卵囊免疫组、空白对照组，每组12羽。常规方法获取重组质粒，测定质粒浓度，质粒组每鸡胸肌注射25%高渗蔗糖溶液并按摩辅助扩散，再于相同位置纵向肌肉注射质粒溶液（含质粒100μg），卵囊免疫组的免疫剂量为5000个/羽孢子化卵囊。在7日龄（1免前）、14日龄（2免前）、21日龄时，分别在每组中随机取4只鸡，采血2ml，分离血清，用于抗体水平检测，评价核酸疫苗的体液免疫水平。

间接ELISA法检测：将纯化复性后的pET28a-Engam22重组蛋白用碳酸盐缓冲液（pH9.6）稀释后，按每孔1μg/100μl包被ELISA板，4℃过夜；PBST洗板3次，每次5min，加入含1%BSA的封闭液（200μl/孔），37℃封闭2h；PBST洗板3次，每次5min，加入1∶200稀释的待检血清（100μl/孔），每个样品均设三个重复孔，37℃温育1h；PBST洗板3次，每次5min，加入1∶2000稀释的HRP标记的兔抗鸡IgG（100μl/孔），37℃温育1h；PBST洗涤5次，每次5min，加入100μl新鲜配制的TMB底物显色液，37℃温育10min；显色后立即加入50μl2MH₂SO₄溶液终止反应，酶标仪测定每孔样品的OD₄₅₀值。

表1是各试验组鸡的抗体水平间接ELISA法检测结果：在试验前各组鸡的抗体水平相近。免疫后第1周，pcDNA3.1-Engam22组的抗体水平较未免疫组对照组和空质粒组的要高，相比差异显著（P<0.05），与卵囊免疫组相比要低，但两者间差异不显著（P>0.05）。在免疫后第2周，卵囊免疫组抗体水平升到最高，与pcDNA3.1-Engam22组有显著差异（P<0.05），但后者的抗体水平仍然显著高于未免疫组对照组和空质粒组（P<0.05）。

表1免疫对抗体水平的影响（OD₄₅₀）

组别	7日龄	14日龄	21日龄
				pcDNA3.1-Engam22组	0.131±0.047^a	0.304±0.087^b	0.293±0.059^b
pcDNA3.1空质粒组	0.132±0.029^a	0.136±0.029^a	0.135±0.041^a
				卵囊免疫组	0.127±0.039^a	0.293±0.054^b	0.367±0.022^c
空白对照组	0.122±0.022^a	0.131±0.041^a	0.132±0.031^a

注：表中同列不同字母数值间差异显著（P<0.05）。

T淋巴细胞活性：

淋巴细胞获取：将肝素抗凝血用不含钙、镁的Hank's液1∶1稀释后，沿管壁缓慢加入贮有4ml淋巴细胞分离液的试管中，以3000rpm离心30min后，吸取淋巴细胞层转10ml离心管中，再加入5倍体积不含钙、镁的Hank's液洗涤。洗涤2次后对淋巴细胞进行计数，并用RPMI1640培养基稀释淋巴细胞至1×10⁷个/ml备用。

MTT法检测：在96孔培养板第1排各孔中分别加入50μl培养基做对照，从第二排开始各孔加入10μl ConA溶液、100μl待测定的淋巴细胞悬液，混匀。每个样品做3个重复。将培养板置CO₂培养箱，37℃培养66h。随后加样孔每孔吸弃70μl上清液，加入0.5%MTT溶液10μl，混匀后继续培养4h，每孔再加入100μl二甲基亚砜、振荡5min后，用酶标仪测定各孔的OD₅₇₀值。

表2是各试验组鸡的T淋巴细胞增殖水平及变化。在试验前各组鸡的T淋巴细胞增殖水平相近。免疫后第1周，pcDNA3.1-Engam22组的T淋巴细胞增殖水平较未免疫组对照组和空质粒组的要高，相比差异显著（P<0.05），但增殖水平与卵囊免疫组相比要低，两者间有显著差异（P<0.05）。免疫后第2周（第2次免疫后1周）的T淋巴细胞增殖水平在各组间的比较情况与第1周的相似。

表2各试验组鸡T淋巴细胞活性（OD₅₇₀）

组别	7日龄	14日龄	21日龄
				pcDNA3.1-Engam22组	0.204±0.016^a	0.279±0.047^b	0.366±0.043^b
pcDNA3.1空质粒组	0.212±0.039^a	0.232±0.043^a	0.248±0.028^a
				卵囊免疫组	0.221±0.038^a	0.339±0.029^c	0.465±0.036^c
空白对照	0.212±0.033^a	0.207±0.053^a	0.245±0.029^a

注：表中同列不同字母数值间差异显著（P<0.05）。

Claims

1.一种鸡毒害艾美耳球虫配子体抗原基因Engam22，其基因全长为713bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种鸡毒害艾美耳球虫配子体抗原，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.重组鸡毒害艾美耳球虫配子体抗原的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1)从毒害艾美耳球虫配子体基因中分离Engam22基因：

引物序列如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示，以配子体总RNA反转录得到的cDNA为模板，扩增713bp的特异性片段，命名为Engam22，将含有目的片段PCR产物经试剂盒纯化回收后，克隆到pGEM-T-easy载体中，得到pGEM-T-easy-Engam22；

2)原核表达载体的构建:

特异性引物序列如SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7，以构建的pGEM-T-easy-Engam22载体为模板，扩增522bp的特异性片段，并将此片段连接到原核表达载体pET28a中，得到pET28a-Engam22；

3)毒害艾美耳球虫Engam22基因的高效表达，纯化，复性:

将构建好的原核表达载体pET28a-Engam22转化BL21宿主菌，IPTG诱导表达后，超声裂解释放包涵体后，尿素变性；变性蛋白通过含有HIS标签的Ni-NTA亲和层析纯化后，分别在含有6M、4M、2M、1M尿素的透析液和0M尿素的PBS中各复性8h，最终通过PEG8000浓缩，收集蛋白，12％SDS-PAGE分析，4℃保存。

4.权利要求1所述的基因Engam22在构建防治鸡毒害艾美耳球虫核酸疫苗中的应用。