CN103421832B - 包含氟苯尼考耐药基因蛋白的卵黄抗体及制备与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种氟苯尼考耐药基因蛋白（FloR）的卵黄抗体及其制备方法与应用。从临床病死鸭分离氟苯尼考耐药鸭疫里默氏杆菌（CCTCC NO：M208128），采用PCR扩增耐药基因(floR）部分片段，并克隆到表达质粒pET28a（+）上，转染宿主菌BL21（DE3）。该重组菌株经诱导表达，制备了带HIS标签的含目的基因片段的融合蛋白，该融合蛋白以包涵体形式存在，提取该包涵体，制备免疫原。将该免疫原免疫开产蛋鸡，获得了能有效提高耐药菌株对氟苯尼考敏感性的卵黄抗体，该卵黄抗体与氟苯尼考联合应用，能显著提高鸭疫里默氏杆菌耐药菌株感染鸭的治疗效果。由于其他氟苯尼考耐药菌株也主要由floR基因介导，因此，该卵黄抗体也可用于兽医临床上畜禽氟苯尼考耐药菌株感染的治疗。

Description

包含氟苯尼考耐药基因蛋白的卵黄抗体及制备与应用

技术领域

本发明属于生物制品和畜禽疾病防控技术领域。具体涉及一种抗氟苯尼考耐药基因蛋白（FloR）的卵黄抗体、其制备方法及应用。

背景技术

氟苯尼考是一种广谱、高效，动物专用抗菌药。中国也在1999年批准该药上市，已广泛用于治疗牛、猪、鸡、鸭及鱼类的细菌性疾病。但随着用药的增多，临床上细菌对此药的耐药性问题也日渐突出，耐药率逐年升高。近年来，由于鸭场广泛使用该药，使得鸭疫里默氏杆菌和致病性大肠杆菌对其耐药的问题非常严重。

细菌对氟苯尼考耐药主要由floR基因介导，携带floR基因的菌株对氟苯尼考高度耐药（Singer R,Patterson S,Meier A,Gibson J,Lee H,Maddox C.Relationship betweenphenotypic and genotypic florfenicol resistance in Escherichia coli.AntimicrobialAgents Chemotherapy,2004,48:4047–4049），且氟苯尼考耐药菌株中基本上可检测到floR基因。自Kim等首次从鱼巴氏杆菌质粒中发现氟苯尼考耐药基因以来（Kim E,Aoki T.Sequence analysis of the florfenicol resistance gene encoded in the transferableR-plasmid of a fish pathogen,Pasteurella piscicida.Microbiology Immunology,1996,40:665-669），相继从沙门氏菌、大肠杆菌、波氏杆菌、鸭疫里默氏杆菌等病原菌中克隆到floR基因，且这些菌株携带的floR基因高度同源。

floR基因主要存在于细菌质粒中，部分存在于染色体上。floR基因转录、翻译的蛋白FloR蛋白位于菌体细胞膜中，含有12个疏水跨膜区，属于主要易化子（MF）超家族。FloR蛋白为氯霉素类（氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考）药物特异的转运泵，通过质子动力介导药物从菌体内外排（Braibant M,Chevalier J,Chaslus-Dancla E,Pagès J,Cloeckaert A.Structural and functional study of the Phenicol-specific efflux pump FloR belongingto the major facilitator superfamily.Antimicrobial Agents Chemotherapy,2005,49:2965–2971）。Du等将floR基因的开放读码框和启动子克隆到pGEM-T载体中，通过质粒转化构建的floR基因重组大肠杆菌能显著抑制氟苯尼考在胞内聚集（Du X,Xia C,Shen J,WuB,Shen Z.Characterization of florfenicol resistance among calf pathogenicEscherichia coli.FEMS Microbiology Letters,2004,236:183–189）。

另外，检索到Wu等发表文献与本发明主题相关，该文献将floR基因部分基因片段插入pGEX-4T-2原核表达载体，经诱导表达后获得了含谷胱甘肽-S-转移酶（GST）标签的融合蛋白，再将纯化的融合蛋白免疫小鼠，获得了多克隆抗体，该抗体与氟苯尼考耐药大肠杆菌共孵育，可抑制该耐药菌对氟苯尼考的外排（Wu B,Xia C,Du X,CaoX,Shen J.Influence ofanti-FloR antibody on florfenicol accumulation in florfenicol-resistant Escherichiacoli and enzyme-linked immunosorbent assay for detection of florfenicol-resistantE.coli isolates.Journal of Clinical Microbiology,2006,44:378–382）。该文献说明了针对floR蛋白的抗体能够使其功能失活，从而提高氟苯尼考耐药菌株对氟苯尼考的敏感性。但该文献的融合蛋白GST标签分子量较大（约26kd），而目的基因片段对应的蛋白较小（约为8kd），GST标签的存在干扰了目的蛋白诱导抗体的产生。本发明采用的表达载体是pET-28a(+)，经诱导表达后获得了含组氨酸标签（HIS）融合蛋白，HIS标签的分子量较小，约为6kd，利于目的蛋白诱导抗体的产生。特别地，该文献未涉及氟苯尼考耐药蛋白（FloR蛋白）卵黄抗体的制备及其在动物疾病防控中的重要应用。

基于以上的发现，我们利用PCR技术扩增floR基因片段，并构建表达携带短标签融合蛋白的重组菌株，该融合蛋白以包涵体形式存在，经过简单纯化，直接以包涵体形式制备免疫原，免疫蛋鸡制备卵黄抗体，并将该卵黄抗体应用于临床上畜禽氟苯尼考耐药菌株感染的治疗。

发明内容

本发明的目的在于构建表达floR基因的重组菌株，获得一种免疫原性更好的重组蛋白抗原。

本发明的第二个目的是制备一种特异性卵黄抗体，它能有效提高氟苯尼考耐药菌株对氟苯尼考的敏感性。并提供一种制备抗氟苯尼考耐药基因蛋白（FloR）特异性卵黄抗体的方法。

本发明的第三个目的是制备的抗氟苯尼考耐药基因蛋白（FloR）特异性卵黄抗体在兽医临床上的应用，用于畜禽氟苯尼考耐药菌株感染的治疗，提高氟苯尼考的治疗效果。

本发明是通过以下技术方案实现：

一种表达含floR基因部分基因片段的重组菌株是将PCR扩增获得的floR基因部分基因片段（其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示）插入到原核表达载体pET-28a(+)的BamH I与Xho I酶切位点，转染大肠杆菌（Esherichia coli）BL21而获得，该菌株被命名为大肠杆菌BL21/pET-28a(+)-floR，Escherichia coli BL21/pET-28a(+)-floR，已于2012年9月25日递交中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心（CCTCC）保藏，其保藏号为CCTCC NO：M2012370。

申请人获得一种含floR基因部分基因片段（其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示）的融合蛋白，是由保藏号为CCTCC NO：M2012370的大肠杆菌所表达的产物。

本发明的技术方案如下：

下列技术步骤中涉及到基因克隆及表达部分未经特别说明的方法均参照《分子克隆实验指南》第三版（J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔等著，黄培堂等译，北京：科学出版社，2002年）。

一、表达floR基因部分基因片段的重组质粒的构建

根据NCBI数据库中已报道的floR基因序列（登录号：NC_012692）设计带有限制性内切酶酶切位点的引物。以临床上分离的对氟苯尼考耐药的鸭疫里默氏杆菌（该菌株命名为：鸭疫里默氏杆菌RA-1，Riemerella anatipestifer RA-1，已于2008年9月10日递交中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCC NO：M208128）的质粒为模板，通过PCR扩增的方法获得floR基因部分基因片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所述。

将用琼脂糖凝胶电泳纯化回收的PCR扩增产物经BamH I与XhoI酶切后，与用同样酶切的表达载体pET28a(+)质粒连接，获得原核表达质粒（或称重组质粒），将该重组质粒命名为pET-28a(+)-floR。

二、融合蛋白的诱导表达及提取

将测序正确的重组质粒pET-28a(+)-floR，转化至大肠杆菌BL21中，构建重组大肠杆菌菌（Escherichia coli）BL21/pET-28a(+)-floR，并利用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside，IPTG）进行诱导表达。通过对Escherichia coliBL21/pET-28a(+)-floR表达产物的可溶性分析发现：诱导表达产物以包涵体形式存在，采用超声波破碎法提取所述的包涵体，该包涵体经3次洗涤后，离心收集，冻干保存。

三、卵黄抗体的制备工艺

将冻干保存的以包涵体形式存在的融合蛋白用生理盐水配制成浓度为4mg/mL包涵体悬液，与等量弗氏完全佐剂或不完全佐剂混合后，并充分乳化制成油乳苗。在刚开产蛋鸡胸部两侧皮下分别多点注射上述油乳苗1mL，以间隔两周用同样方法加强免疫两至三次。四免后5天开始收集鸡蛋，每间隔5天收集一次。采用间接酶联免疫吸附试验（ELISA）方法监测卵黄抗体效价。收集免疫合格的鸡蛋，无菌采集卵黄，并用9倍体积的蒸馏水稀释，用0.1M的盐酸调节pH值5.0，4℃静置过夜，取水层，经0.45μm微孔滤膜过滤除菌，获得卵黄抗体液。

四、融合蛋白免疫制备的卵黄抗体应用效果评价

通过卵黄抗体与氟苯尼考联用在体外抑菌效果试验，验证本发明制备的卵黄抗体具有增加氟苯尼考耐药菌株对氟苯尼考敏感性的作用。选择60只15日龄大小均匀的健康樱桃谷鸭进行鸭疫里默氏杆菌攻毒保护试验，随机分为3组，每组20只。第一组为氟苯尼考单独给药治疗组，第二组为卵黄抗体联合氟苯尼考治疗组，第三组为生理盐水对照组。结果表明，卵黄抗体联合氟苯尼考治疗组对鸭疫里默氏杆菌氟苯尼考耐药菌株感染的治愈率为80%，显著高于氟苯尼考单独给药组（治愈率为25%）。

本发明的特点：

（1）本发明以pET-28a(+)作为表达载体，获得的融合蛋白包含的HIS标签分子量较小，减少了标签对目的蛋白片段诱导抗体产生的影响。

（2）构建的融合蛋白是以包涵体形式存在，经过简单纯化步骤后，直接以包涵体形式制备免疫原，在免疫原制备上省去了融合蛋白纯化的繁琐步骤，操作更加简便。

（3）直接以包涵体形式制备的免疫原具有良好的免疫原性，可以诱导产蛋鸡产生针对FloR蛋白目的片段的特异性抗体。

（4）制备的卵黄抗体能够显著提高鸭疫里默氏杆菌氟苯尼考耐药菌株对氟苯尼考的敏感性，由于其他氟苯尼考耐药菌株也主要由floR基因介导，因此，该卵黄抗体也可用于兽医临床上畜禽氟苯尼考耐药菌株感染的治疗。

更详细技术方案参见“具体实施方式”部分。

附图说明

序列表SEQ ID NO：1是本发明克隆的FloR基因片段的核苷酸序列，其中137位的碱基由t突变为a。序列长度为216bp。

序列表SEQ ID NO：2是本发明克隆的FloR基因片段编码的氨基酸序列，编码72个氨基酸。

图1为本发明的技术路线图。

图2显示了表达floR基因部分基因片段的重组质粒pET-28a(+)-floR构建图。

图3为本发明中PCR扩增出的目的DNA片段的琼脂糖凝胶电泳图谱，显示了该片段大小约为220bp，与理论值一致，图中M为DNA marker，1为PCR产物。

图4为本发明中重组大肠杆菌Escherichia coli BL21/pET-28a(+)-floR全菌体蛋白免疫印迹（Western Blot）图谱，显示了目的蛋白条带，其大小（14kD）与理论值一致，图中M为protein marker，1为表达产物。

图5为本发明重组大肠杆菌Escherichia coli BL21/pET-28a(+)-floR诱导表达的SDS-PAGE电泳图谱，显示了目的蛋白条带，其大小（14kD）与理论值一致，图中M为protein marker，1为重组大肠杆菌诱导表达6h后超声破碎的上清液，2-4分别为重组大肠杆菌诱导表达4h、5h、6h后超声破碎提取的包涵体。

具体实施方式

实施例1 floR基因部分基因片段的克隆表达

1.1主要材料、试剂及配制

大肠杆菌BL(DE3)、质粒载体pET-28a(+)、protein marker、兔源anti-HIS抗体（即一抗）及羊抗兔IgG HRP标记抗体（即二抗）购自武汉三鹰生物技术有限公司。

鸭疫里默氏杆菌（RA-1）：由武汉市畜牧兽医科学研究所保存，并于2008年9月10日递交中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCC NO：M208128；本发明利用Kirby-Barer法（徐叔云，卞如濂，陈修.药理实验方法学，第三版.北京：人民卫生出版社，2001）测定氟苯尼考对该菌的抑菌圈为7.5mm，判定为氟苯尼考耐药菌株。

树脂型质粒DNA小量提取试剂盒购自上海赛百盛基因技术有限公司产品（按该试剂盒的说明书操作）。

Taq DNA聚合酶、dNTPs、Taq Buffer、T4DNA连接酶均为Fermentas公司产品。

胰蛋白胨、酵母提取物为OXOID公司产品。

小牛血清为浙江天杭生物科技有限公司产品。

DNA marker为广州东盛生物科技有限公司产品。

ECL化学发光试剂为上海闪晶分子生物科技有限公司产品。

LB肉汤：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，用蒸馏水定容至1000mL，调节pH值至pH7.0，121℃高压蒸汽灭菌20min，4℃保存备用。

LB营养琼脂：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，用蒸馏水定容至1000mL，调节pH值至7.0，另加15g琼脂粉，121℃高压蒸汽灭菌15min。倾倒平板，待培养基凝固后倒置于4℃保存备用。若制备卡那霉素抗性LB琼脂，则待培养基温度降至50℃左右时，加入卡那霉素，使终浓度为60μg/mL，后倾倒平板，待培养基凝固后倒置于4℃保存备用。

10%小牛血清胰蛋白胨大豆琼脂（TSA）：称取TSA（美国Becton，Dickinson and Company公司产品）干粉40g，用蒸馏水定容至900ml，调节pH值至7.4，121℃高压蒸汽灭菌20min，待培养基温度降至50℃左右时，加入回温至37℃的小牛血清100mL，混匀后立即倾倒平板，待培养基凝固后倒置于4℃保存备用。

CaCl₂-MgCl₂溶液：80mmol/L MgCl₂，20mmol/L CaCl₂。

SOB培养基：胰蛋白胨20g，酵母提取物5g，NaCl 0.5g，用蒸馏水定容至1000mL，调节pH值至pH7.0，121℃高压蒸汽灭菌20min，室温保存备用。

1.2引物设计

根据NCBI数据库中公布的大肠杆菌floR基因序列（登录号：NC_012692）设计扩增该基因部分片段的引物，其上游引物（floR-U）为：5’-TTTT GGA TCC CTC CTA AAT GCG GGT TTCAGG-3’，下游引物（floR-D）为：5’-TTTT CTC GAG TGA GAA GGC AAA GCT GAA TCC-3’，分别含有BamH I和Xho I酶切位点（引物序列中的下划线为酶切位点）。引物由上海赛百盛基因技术有限公司合成。

1.3质粒提取

将氟苯尼考耐药鸭疫里默氏杆菌（CCTCC NO：M208128）接种于10%小牛血清TSA琼脂。37℃培养24h，收集菌体，用树脂型质粒DNA小量提取试剂盒提取耐药质粒（按照该试剂盒提供的使用说明书进行操作）。

1.4目的片段PCR扩增

PCR反应体系为：Taq Buffer 10μL，MgCl₂（25mM）10μL，dNTP（2.0mM）10μL，上游引物（floR-U）2μL，下游引物（floR-D）2μL，上述提取的质粒DNA 2μL，Taq DNA聚合酶（5U/μL）0.2μL，ddH₂O 65μL。

反应条件：94℃预变性2min；94℃变性lmin，50℃退火1min，72℃延伸2min，25个循环；72℃延伸5min。

1.5PCR产物纯化

采用1%琼脂糖凝胶电泳，电泳完毕，紫外光下切下约220bp处的特异条带，用上海赛百盛基因技术有限公司的PCR产物纯化试剂盒纯化PCR产物（按照该试剂盒提供的使用说明书进行操作）。

1.6纯化产物酶切及回收

将纯化的PCR产物用BamHI和XhoI双酶切，37℃酶切9h后，用上海赛百盛基因技术有限公司的PCR产物纯化试剂盒纯化酶切产物（按照该试剂盒提供的使用说明书进行操作）。

1.7表达载体的构建

分别将纯化的酶切产物和用BamHI和XhoI双酶切、形成粘性末端的表达载体pET28a(+)混合，加入T4DNA连接酶，22℃连接4h，构建成pET28a(+)-floR表达载体（或称为重组质粒）（见图2）。

1.8感受态细胞的制备

感受态细胞的制备参考《分子克隆实验指南》第三版（J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔等著，黄培堂等译，北京：科学出版社，2002年）所述的氯化钙法制备感受态大肠杆菌的方法。

挑取LB琼脂培养过夜的大肠杆菌BL21（DE3）单菌落接种于LB液体培养基，37℃培养3小时。将菌液置冰上10分钟，4℃ 4100rpm离心10min，收集菌体。用CaCl₂-MgCl₂溶液重悬菌体，冰浴，4℃以4100rpm离心10min，收集菌体，用冰预冷的0.1mol/L CaCl₂溶液重悬菌体，得感受态细胞。

1.9表达载体的转化及阳性重组菌株挑选

将构建的表达载体pET28a(+)-floR与感受态细胞混合冰浴30min，取出42℃水浴90s，快速转移至冰浴中，使细胞冷却2min，加入SOB培养基，放入摇床中，150rpm培养50min，将已转化的感受态细胞涂布于卡那霉素（60μg/mL）抗性的LB琼脂，37℃培养过夜。

挑选单克隆菌落，做好标记，以全菌体DNA作为模板，用步骤1.2设计的引物（floR-U，floR-D）进行PCR扩增。用1%琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行凝胶电泳，紫外光下约220bp处有特异性条带（见图3），说明本发明的重组质粒转化成功，将转化成功的阳性重组大肠杆菌命名为Escherichia coli BL21/pET-28a(+)-floR。用上海赛百盛基因技术有限公司的树脂型质粒DNA小量提取试剂盒提取重组质粒，送上海生工生物工程股份有限公司进行测序，测序结果表明，扩增片段长度为216bp，与参考序列仅有一个碱基发生突变（见序列表SEQ IDNO：1）。

1.10融合蛋白鉴定

将转化成功的阳性重组大肠杆菌BL21/pET-28a(+)-floR接种于LB液体培养基，经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（Isopropyl-D-β-thiogalactopyranoside，IPTG）诱导表达后，用Western Blot鉴定表达产物：全菌体SDS-PAGE电泳后，电转移到PVDF膜，然后先后用一抗（兔源anti-HIS抗体）和二抗（羊抗兔IgG HRP标记抗体）孵育，再在暗室中加入ECL化学发光试剂（按照产品提供的使用说明书进行操作），最后用X-光片显影、定影，有明显的特异表达产物条带存在，其大小与理论值14kD相符（见图4）。

实施例2免疫原的制备

2.1主要材料、试剂及配制

弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂为美国Sigma公司产品。

LB肉汤：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，用蒸馏水定容至1000mL，调节pH值至pH7.0，121℃高压蒸汽灭菌20min，4℃保存备用。若制备卡那霉素抗性LB肉汤，则待培养基温度降至50℃左右时，加入卡那霉素，使终浓度为60μg/mL，4℃保存备用。

磷酸盐缓冲液（PBS）：称取NaCl 8g，KCl 0.2g，Na₂HPO₄ 1.44g，KH₂PO₄ 0.24g，溶于ddH₂O800mL中，调pH至7.4，用双蒸水定容至1000mL。

包涵体洗涤液：称取NaCl 8g、KCl 0.2g、Na₂HPO₄ 1.44g、Triton-X 10mL，用双蒸水定容至1000mL。

包涵体溶解和重折叠缓冲液：

缓冲液A：8mol/L尿素；0.5mol/L NaCl；20mmol/L Tris-Cl；1mmol/L EDTA；pH 8.0。

缓冲液B：6mol/L尿素；0.5mol/L NaCl；20mmol/L Tris-Cl；1mmol/L EDTA；pH 8.0。

缓冲液C：4mol/L尿素；0.5mol/L NaCl；20mmol/L Tris-Cl；1mmol/L EDTA；pH 8.0。

缓冲液D：2mol/L尿素；0.5mol/L NaCl；20mmol/L Tris-Cl；1mmol/L EDTA；pH 8.0。

缓冲液E：0.5mol/L NaCl；20mmol/L Tris-Cl；1mmol/L EDTA；pH 8.0。

2.2重组菌株最佳诱导表达条件的确定

挑取重组大肠杆菌Escherichia coli BL21/pET-28a(+)-floR单菌落接种于卡那霉素（60μg/mL）抗性LB肉汤，37℃，250rpm摇床振荡培养过夜，将培养过夜的菌液按体积比1:100比例加入到新鲜的卡那霉素（60μg/mL）抗性LB肉汤中，37℃，250rpm摇床振荡培养3.5h，加入IPTG至终浓度为1.0mM，37℃培养诱导表达，诱导表达时间分别为4h、5h、6h，离心收集菌体，经超声波破碎（破碎功率420w，破碎总时间15min、工作15s、停15s）后，分别收集上清液和包涵体，用SDS-PAGE电泳鉴定。结果表明最佳诱导时间为6h，融合蛋白主要以包涵体的形式存在（见图5）。

2.3包涵体的提取

重组菌Escherichia coli BL21/pET-28a(+)-floR用最佳诱导表达条件大容量培养后，离心收集菌体，按每g湿菌加入10mL PBS悬浮。冰浴超声破碎（破碎功率420w，破碎总时间15min、工作15s、停15s），显微镜检查细菌破碎完全。超声破碎完全的菌体于12000rpm离心10min，收集包涵体。每g湿菌获得的包涵体加入包涵体洗涤液5mL，充分振摇后，12000rpm离心10min，收集包涵体；该包涵体重复洗涤一次，获得的包涵体冷冻干燥，-20℃保存备用。

2.4包涵体溶解和重折叠

参考《分子克隆实验指南》第三版（J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔等著，黄培堂等译，北京：科学出版社，2002年）包涵体溶解和重折叠的方法，将实施例2.3中制备的包涵体用缓冲液A溶解，起始浓度为1mg/mL，将溶解的包涵体溶液置于透析袋中，4℃条件下，依次在缓冲液B、C、D、E中透析一次，每次透析时间为6-10h；然后置于PBS中透析4次，每次透析时间为6-10h。透析完毕后，12000rpm离心10min，取上清，采用Folin-酚法测定蛋白质浓度为0.2mg/mL。用微孔滤膜过滤除菌后分装置-20℃冻存。

2.5免疫原的制备

取实施例2.3制备的冻干保存的包涵体，用生理盐水配制4mg/mL包涵体混悬液，与等量的弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂充分混匀匀浆后得免疫原。

实施例3抗体的制备及生物活性测定

3.1主要材料、试剂及配制

鸭疫里默氏杆菌：保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M208128。

大肠杆菌（ATCC25922）由华中农业大学兽医药理学实验室惠赠（购于北京，中国兽药监察所）。

氟苯尼考药物由湖北中牧安达药业有限公司惠赠。

鼠抗鸡IgG酶标二抗为武汉三鹰生物技术有限公司产品。

磷酸盐缓冲液（PBS）：称取NaCl 8g，KCl 0.2g，Na₂HPO₄ 1.44g，KH₂PO₄ 0.24g，溶于ddH₂O800mL中，调pH至7.4，定容至1000mL。

包被液：NaHCO₃ 2.93g；Na₂CO₃ 1.95g；溶于900mL蒸馏水中，10mol/L NaOH调pH至9.6，用蒸馏水定容至1000mL。

封闭液：含1%牛血清白蛋白的PBS。

洗涤液：含0.05%吐温-20的PBS。

底物液A：3,3’,5,5’-四甲基联苯二胺200mg，无水乙醇100mL，加ddH₂O至1000mL。

底物液B：Na₂HPO₄ 14.6g，柠檬酸9.3g，0.75%过氧化氢脲6.4mL，加ddH₂O至1000mL。

底物混合液：将底物液A和底物液B按体积比1:1混合即得，现配现用。

终止液（2mol/L H₂SO₄溶液）：浓硫酸22.2mL，蒸馏水177.8mL，混匀即可。

10%小牛血清胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）：称取TSB（美国Becton，Dickinson and Company公司产品）干粉20g，用蒸馏水定容至900ml，调节pH值至7.4，121℃高压蒸汽灭菌20min，待培养基温度降至50℃左右时，加入回温至37℃的小牛血清100mL,混匀后置于4℃保存备用。

3.2产蛋鸡免疫及鸡蛋收集

选取刚开产“海兰褐”蛋鸡（为常规蛋鸡品种）10只，用上述制备的免疫原每只胸部多点皮下注射1mL，首免用弗氏完全佐剂制备的免疫原，加强免疫用弗氏不完全佐剂制备的免疫原。每次免疫间隔时间为2周。于第4次免疫后第5天开始收集鸡蛋，每间隔5天收集一次，共收集7批次。每批随机抽取3枚鸡蛋，取卵黄，采用常规的ELISA方法（朱立平、陈学清.免疫学常用试验方法.北京：人民军医出版社，2000）测定其抗体效价。

3.3卵黄抗体提取

根据抗体效价测定的结果，收集免疫合格鸡蛋，用于卵黄抗体的制备。鸡蛋用70%酒精浸泡消毒后，无菌取卵黄，将卵黄用9倍体积的蒸馏水稀释，用0.1M的盐酸调节pH值至5.0，4℃静置过夜，取水层，经0.45μm微孔滤膜过滤除菌，即得卵黄抗体液。

3.4卵黄抗体ELISA效价测定

按照文献方法（朱立平、陈学清.免疫学常用试验方法.北京：人民军医出版社，2000），采用ELISA方法检测卵黄抗体效价。包被原为实施例2.4制备的包涵体溶解重折叠的融合蛋白（浓度为0.2mg/mL），用包被液稀释成8μg/mL包被酶标板，4℃过夜，用洗涤液洗涤3次，拍干；用封闭液37℃封闭1h，洗涤液洗涤3次，拍干。卵黄抗体溶液用PBS按体积比1:6400、1:12800、1:25600、1:51200、1:102400、1:204800作倍比稀释，同时设置阴性对照组（未用免疫原免疫鸡所产的蛋制备的卵黄抗体），用PBS按体积比1:2000稀释。将稀释好的卵黄抗体加入到已包被的酶标板中，每孔100μL，于37℃孵育1h，洗涤3次，每孔加入1:5000倍稀释鼠抗鸡IgG酶标二抗100μL，于37℃孵育1h，洗涤3次，最后每孔加入底物混合液100μL，37℃避光孵育15min，加入终止液终止反应。用酶标仪测定OD值，以卵黄抗体溶液OD值大于3倍阴性对照OD值的最大稀释度为卵黄抗体效价。结果见表1，结果表明：经过4次免疫后，本发明制备的卵黄抗体效价介于1:51200和204800之间，抗体效价维持在1:51200之上的时间为35d及以上。

表1第4次免疫后本发明制备的卵黄抗体的效价

3.5本发明制备的卵黄抗体与氟苯尼考联用在体外抑菌效果试验

参考徐叔云等的《药理实验方法学》第三版（徐叔云，卞如濂，陈修.北京：人民卫生出版社，2001），采用二倍管稀释法测定氟苯尼考联合卵黄抗体对鸭疫里默氏杆菌（CCTCC NO：M208128）的最低抑菌浓度（MIC）。具体方法及结果为：

（1）氟苯尼考原液配制：

用二甲亚砜配制浓度为5120μg／mL的氟苯尼考原液备用。

（2）菌液配制：

将鸭疫里默氏杆菌和质控菌株大肠杆菌ATCC25922分别接种于10%小牛血清TSB肉汤，37℃培养过夜，用10%小牛血清TSB肉汤稀释成浓度为10⁷CFU/mL备用。

（3）含卵黄抗体的TSB肉汤配制：

取本实施例3.3步骤制备的卵黄抗体（ELISA测定效价为1:102400）1份，取10%小牛血清TSB肉汤99份，无菌条件下充分混匀后备用（卵黄抗体的最终稀释度为1:1000）。

（4）试验组设置：

取13mm×100mm试管36支，排成3排，每排12支，第一排为卵黄抗体试验组，第二排为卵黄抗体阴性对照组，第三排为质控菌株（ATCC25922）对照组。另取3支同样试管，分别标记上“TSB肉汤对照”，“检测菌生长对照”和“质控菌生长对照”。第一排除第一支试管外，每支试管加入含卵黄抗体的TSB肉汤2mL；然后用含卵黄抗体的TSB肉汤稀释氟苯尼考原液至浓度为512μg/mL，分别在第一和第二支试管中加2mL；第二管混匀后吸出2mL加入到第三管中，依次对倍稀释到第12管，从第12管中吸出2mL弃去。第二排和第三排操作方法同第一排，只是将含卵黄抗体的TSB肉汤换成10%小牛血清TSB肉汤。这样每管抗菌药物的最终浓度依次为512、256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25μg/mL。

（5）接种：

用微量加样器取0.1mL鸭疫里默氏杆菌菌液（10⁷CFU/mL）依次由低浓度到高浓度加到第一排和第二排每支试管中；用微量加样器取0.1mL大肠杆菌（ATCC25922）菌液（10⁷CFU/mL）依次由低浓度到高浓度加到第三排每支试管中。最终接种菌量约5×10⁷CFU/mL。加样时加样器的吸头必须插到管内液面下加菌，并注意避免与管内壁接触，加好菌液后的试管应避免晃动。“TSB肉汤对照”仅加入2mL卵黄抗体的TSB肉汤，不接种任何细菌；“检测菌生长对照”和“质控菌生长对照”分别用鸭疫里默氏杆菌和大肠杆菌ATCC25922接种于10%TSB肉汤。置于35℃培养24h后判定MIC（氟苯尼考药物敏感性判定标准：MIC≤4μg/mL为敏感、MIC=8μg/mL为中介、MIC≥16μg/mL为耐药）。

（6）结果：

“TSB肉汤对照”无细菌生长；“检测菌生长对照”和“质控菌生长对照”细菌生长良好；质控大肠杆菌（ATCC25922）MIC为2μg/mL，符合质控菌株MIC≤2μg/mL。对照组和质控菌株条件均成立，卵黄抗体试验组和卵黄抗体阴性对照组MIC测定结果有效。

卵黄抗体阴性对照组MIC为32μg/mL，卵黄抗体试验组MIC为2μg/mL，结果表明，本发明制备的卵黄抗体可显著提高鸭疫里默氏杆菌耐药菌株对氟苯尼考的敏感性。

实施例4本发明制备的卵黄抗体联合氟苯尼考治疗鸭疫里默氏杆菌耐药菌株感染效果试验

4.1鸭疫里默氏杆菌最低致死剂量测定

参考徐叔云等的《药理实验方法学》第三版（徐叔云，卞如濂，陈修.北京：人民卫生出版社，2001）中的方法，测定鸭疫里默氏杆菌（CCTCC NO：M208128）的最低致死量。

（1）预试验：

选择15日龄健康樱桃谷肉鸭40只，平均分为4组。将用TSA琼脂培养过夜的鸭疫里默氏杆菌用生理盐水分别稀释成10⁸CFU/mL、10⁷CFU/mL、10⁶CFU/mL，每个菌液浓度为一个处理组，每组每只鸭腿部肌肉注射鸭疫里默氏杆菌菌液0.5mL；同时设置一个空白对照组，每只鸭腿部肌肉注射生理盐水0.5mL。攻毒后观察5d。结果表明，鸭死亡主要集中在攻毒后第2-3天，各组死亡率分别为：空白对照组为0，10⁸CFU/mL剂量组为100%，10⁷CFU/mL剂量组为70%，10⁶CFU/mL剂量组为0，因此，最低致死剂量介于10⁸CFU/mL和10⁷CFU/mL之间。

（2）正式测定：

选择15日龄健康樱桃谷肉鸭40只，平均分为4组。将用TSA琼脂培养过夜的鸭疫里默氏杆菌用生理盐水分别稀释成10⁸CFU/mL、5×10⁷CFU/mL、2.5×10⁷CFU/mL，每个菌液浓度为一个处理组，每组每只鸭腿部肌肉注射菌液0.5mL；同时设置一个空白对照组，每只鸭腿部肌肉注射生理盐水0.5mL。攻毒后观察5d。结果表明，鸭死亡主要集中在攻毒后第2-3天，各组死亡率分别为：空白对照组为0、10⁸CFU/mL剂量组为100%、5×10⁷CFU/mL剂量组为100%、2.5×10⁷CFU/mL剂量组为90%。因此确定鸭疫里默氏杆菌最低致死剂量为5×10⁷CFU/mL。

4.2本发明制备的卵黄抗体联合氟苯尼考治疗效果测定

选择15日龄健康樱桃谷肉鸭60只，按最低致死剂量（5×10⁷CFU/mL）攻毒，每只腿部肌肉注射0.5mL。然后平均分成3组，第一组为氟苯尼考单独给药治疗组，给药剂量为30mg/kg体重，腿部肌肉注射，每天注射一次，连续3d；第二组为本发明制备的卵黄抗体联合氟苯尼考治疗组，其中：氟苯尼考给药剂量为30mg/kg体重，腿部肌肉注射，本发明制备的卵黄抗体（实施例3.3制备）给药剂量为2mL/kg体重，对侧腿部肌肉注射，每天给药一次，连续3d。第三组为生理盐水对照组，按每kg体重腿部肌肉注射生理盐水2mL，每天一次，连续3d。攻毒后观察5d。结果表明，鸭死亡主要集中在攻毒后第2-3天，5天后未死亡鸭均恢复采食和饮水，精神状况恢复正常。统计不同处理组死亡率和治愈率（以鸭恢复采食和饮水、精神状况恢复正常为治愈），结果见表2。

表2不同处理组鸭死亡率和治愈率

Claims (1)

1.一种保藏号为CCTCC NO：M2012370的重组大肠杆菌(Escherichia coli)BL21/pET-28a(+)-floR在制备抗氟苯尼考耐药蛋白卵黄抗体中的应用，其特征在于，直接以包涵体形式制备免疫原。