CN102153632A

CN102153632A - 抗大肠杆菌TolC二十三肽的抗体及应用

Info

Publication number: CN102153632A
Application number: CN2011100022632A
Authority: CN
Inventors: 彭宣宪; 李惠; 张丹凤; 张炳文; 吴丽娜
Original assignee: National Sun Yat Sen University
Current assignee: Sun Yat Sen University; National Sun Yat Sen University
Priority date: 2011-01-06
Filing date: 2011-01-06
Publication date: 2011-08-17

Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种大肠杆菌TolC二十三肽抗原及抗体，该抗体具有特异性针对SEQIDNO:1所示的序列。发明同时提供了编码该大肠杆菌TolC二十三抗原的基因序列；以及该抗体在制备抑制细菌耐药性药物中的应用。本发明所提供的抗TolC片段SDTSYSGSKTRGAAGTQYDDSNM的抗体，提高了细菌对抗生素的敏感度，可以特异而有效地抑制大肠杆菌的耐药外膜蛋白TolC的功能，从而克服细菌耐药性问题。本发明所提供的抗体，比现有的抗体在作为抗细菌耐药性药物的应用上，具有更高的安全性和操作性。

Description

抗大肠杆菌TolC二十三肽的抗体及应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种抗大肠杆菌TolC片段的抗体。

背景技术

近年来细菌耐药日趋严峻, 成为医药界倍受关注的问题。由于抗生素滥用造成细菌耐药性问题尤为突出。我国临床分离的一些细菌对某些药物的耐药性已居世界首位。除耐青霉素的肺炎链球菌、耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌、肠球菌、真菌等多种耐药菌外，进入我国仅20多年的喹诺酮类抗生素的耐药率已经达60%－70%。据报道，包括广州在内的国内一些大城市人群感染的金黄色葡萄球菌中，80%已经产生了对青霉素G的耐药性。凯福隆、头孢三嗪等第三代的头孢类菌抗生素的应用已日趋普遍，抗生素品种的选用明显超前。抗生素的滥用主要是由于抗生素生产和销售管理薄弱、临床的误用和滥用、以及将抗生素作为生长促进剂在动物养殖中广泛使用所导致。由于在抗生素使用与病原菌耐药水平之间存在着一种宏观的量化关系，即一定范围内的抗生素使用可以导致病原菌整体耐药水平以及耐药菌感染率的变化。由此，人和动物的肠道正常菌群暴露于抗生素而普遍产生耐药性，并通过粪便直接污染环境、水、食品，导致耐药菌不断增加，也使人体接触耐药菌的机会不断增加。因此耐药菌的种类非常广泛。这样一来，人体如果再获得耐药菌的感染治疗起来就比较困难。因此，控制目前已经广泛存在的耐药菌已成为一个重要的社会和科学问题。

耐药菌的防制尚不能完全寄托在新抗生素的发现和发明，因为抗生素的生产与发展伴随着细菌耐药性的不断发展，一种新的抗生素投入使用后，很快就发现有相应的抗性菌株出现。在细菌中普遍存在的抗药性是对抗菌药物的生产开发及对细菌性疾病防治的一个巨大挑战，直接危害食品安全和人类健康。对细菌耐药机理的深入研究，发现其作用靶点是解决这一难题的关键。

业已报道，大肠杆菌外膜蛋白TolC是耐药关键蛋白，是AcrAB-TolC药物外排系统中重要组成组分。我们先前证明，采用抗TolC可以负调TolC的耐药作用，起到靶向抑制耐药菌生长的目的，但其作用的靶序列不清楚。我们先前采用的抗TolC的抗体，是针对整个TolC蛋白。根据生物信息分析，整个TolC蛋白具有线性B细胞表位27个，此外还有非线性B细胞表位。由于每个表位均能够刺激机体产生免疫应答，故针对整个TolC蛋白至少可以产生27个各自表位特异性的抗体。由于各表位氨基酸序列不同，其生物学功能亦具有差异，抗体作用后产生的效应亦存在差异。此外，抗体也存在一定的交叉反应，可以跨物种进行反应，即所谓的抗体异嗜性现象。因此，采用针对整个蛋白的特异性抗体，具有靶序列特异性不明确、副反应不清楚的不足，不利于其有关成药特性的研究。

发明内容

本发明的目的是在于针对现有技术的不足，提供一种针对TolC耐药关键结构域的抗体，以克服目前的抗体具有靶序列特异性不明确、副反应不清楚的的缺陷，提高抗体的有效性和安全性。

本发明通过以下技术方案实现上述目的：

发明提供了一种大肠杆菌（E. coli）TolC抗原，包括如SEQ ID NO:1（SEQ ID NO:1：SDTSYSGSKT RGAAGTQYDD SNM）所示的序列。

本发明也提供了一种抗原，由上述大肠杆菌TolC抗原与血蓝蛋白偶连。

同时发明保护了编码如权利要求1所述大肠杆菌TolC抗原的基因片段，具有SEQ ID NO:2所示的序列。SEQ ID NO:2：5’-TCT GAC ACC TCT TAT AGC GGT TCG AAA ACC CGT GGT GCC GCT GGT ACC CAG TAT GAC GAT AGC AAT ATG -3’。

上述两种抗原可用于制备抗体，所产生的抗体可以与大肠杆菌外膜蛋白TolC特异结合，从而抑制细菌的耐药性。该抗体具有针对SEQ ID NO:1氨基酸序列的多肽，由以下方法获得：根据NCBI公布的E. coli K-12 TolC氨基酸序列，合成SEQ ID NO:1：SDTSYSGSKT RGAAGTQYDD SNM片段（命名为TolC-二十三肽），合成多肽产物与血蓝蛋白偶连以提高免疫原性。将人工合成SEQ ID NO:1：SDTSYSGSKT RGAAGTQYDD SNM片段和血蓝蛋白的偶连物与福氏完全佐剂混合均匀形成油包水乳剂，注射免疫动物，注射量100微克-1毫克/只；其后采用福氏不完全佐剂；每次间隔10-20周，第3-5次免疫后的第7-10天取血，于低温下静置，使血清自然析出。可以优选以下方法制备：将人工合成SEQ ID NO:1：SDTSYSGSKT RGAAGTQYDD SNM片段即TolC-二十三肽和血蓝蛋白的偶连物500μg用水溶解成终体积500μL作用，与福氏完全佐剂按照1:1（v/v）混合均匀形成油包水，采用背部多点注射免疫动物家兔，注射量每千克动物体注射为500μg/只（以偶连物的重量计算）；其后采用福氏不完全佐剂，每次间隔2周，第3次免疫后的第10天，心脏取血，摆成最大斜面后在4℃冰箱中静置过夜，使血清自然析出。以未与血蓝蛋白偶连的合成多肽产物为抗原，采用Dot-ELISA技术测定效价为1:10000。本发明提供的抗体，可用于制备抑制细菌耐药性药物；所述的细菌为大肠杆菌、痢疾杆菌、沙门氏菌、克氏柠檬酸杆菌、戴阿利斯特杆菌属、肺炎克雷伯菌或链霉菌。

通过大量的试验证明，本发明的针对SEQ ID NO:1氨基酸序列的多肽特异性抗体（即抗TolC-二十三肽），可以与大肠杆菌TolC基因编码蛋白TolC的关键耐药结构域结合，具有非常特异、稳定的靶向性作用，从而抑制耐药菌的耐药性。

为了进一步验证发明的有效性和抗耐药机理，本发明采用基因突变技术，构建了大肠杆菌TolC片段SEQ ID NO:1：SDTSYSGSKT RGAAGTQYDD SNM的突变体TolC2。通过抑菌试验，证明该突变体的耐药功能较野生型明显下降。这些结果表明，TolC片段SEQ ID NO:1：SDTSYSGSKT RGAAGTQYDD SNM对TolC的耐药功能至关重要。

接着制备了TolC片段SEQ ID NO:1：SDTSYSGSKT RGAAGTQYDD SNM的抗体（抗TolC-二十三肽），采用体外抗体靶向疗法，证明抗TolC-二十三肽能够在含四环素的培养基中明显抑制包括耐药大肠杆菌在内的该种细菌的生长。经抗TolC-二十三肽处理后的细菌，其生长被抑制的程度与同条件培养下抗TolC处理的生长情况一致。此结果说明TolC片段SEQ ID NO:1：SDTSYSGSKT RGAAGTQYDD SNM是抗TolC负调TolC耐药功能的作用靶点。

进一步建立了大肠埃希菌外阴感染小鼠模型，通过抗TolC-二十三肽配合低浓度庆大霉素可以明显抑制小鼠外阴细菌感染的试验，进一步证明TolC片段SEQ ID NO:1：SDTSYSGSKT RGAAGTQYDD SNM是抗TolC负调TolC作用的靶点。

研究结果表明，抗TolC-二十三肽靶向疗法能够明显抑制耐药菌的生长，为耐药菌抗体靶向疗法提供了一个有效的作用靶点。

本发明通过构建TolC片段的突变体TolC2，以及制备针对此片段即SEQ ID NO:1：SDTSYSGSKT RGAAGTQYDD SNM的抗血清，寻找到最为关键的TolC抗体靶向抑制耐药菌生长的作用靶点——SEQ ID NO:1：SDTSYSGSKT RGAAGTQYDD SNM，从而建立针对性强、目标明确的抗体靶向作用提高耐药菌对抗生素敏感性的技术方法。同时针对该结果，提供了抗TolC-二十三肽，作为抗大肠杆菌TolC的抗体，该抗体所针对的氨基酸序列仅为23个氨基酸，经预测不含有B细胞表位。我们制备的针对该序列的特异性抗体可灵敏而特异地结合到靶向位点上，从而克服了现有技术中的多个B细胞表位容易产生抗体异嗜性、靶序列特异性不明确、副反应不清楚等缺陷，使用更安全。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

（1）本发明经过大量实验的摸索和筛选，发现抗TolC片段SEQ ID NO:1：SDTSYSGSKT RGAAGTQYDD SNM的抗体对抑制细菌耐药性有重要的作用，其特异性非常强，效价高，在抑菌应用中可以大大降低抗生素的使用量；

（2）明确了所作用的靶序列位点，消除了原有针对整个蛋白质所有位点抗体可能存在的副作用，可以特异而有效地抑制细菌的耐药性蛋白的耐药功能，从而克服细菌耐药性问题；

（3）本发明所提供的抗体，比现有的抗体在作为药物的应用上，具有更高的安全性和操作性。

附图说明

图1为大肠杆菌K12的 tolC基因PCR扩增（A）、重组子双酶切（B）及其诱导表达（C）。

图2为大肠杆菌K12 tolC2基因PCR扩增（A、B）、重组子双酶切（C）及其诱导表达（D）。

图3为TolC2基因在基因补救菌株（△tolC-pET-28a-tolC2）中的表达研究，A为聚丙烯凝胶电泳分析，B为Western blotting分析。

图4为最低抑菌浓度分析，其中E.coli K-12为大肠杆菌k-12菌株，△tolC为tolC基因缺失菌株，△tolC-pET-28a-tolC为△tolC的补救菌株，△tolC-pET-28a为△tolC的空载菌株，△tolC-pET-28a-tolC2为△tolC的长片段突变补救菌株。

图5为生存率分析，其中E.coli K-12为大肠杆菌k-12菌株，△tolC为tolC基因缺失菌株，△tolC-pET-28a-tolC为△tolC的补救菌株，△tolC-pET-28a为△tolC的空载菌株，△tolC-pET-28a-tolC2为△tolC的长片段突变补救菌株。

图6为免疫前血清、抗TolC和抗TolC-二十三肽对不同菌株生长的影响。

图7为免疫前血清、抗TolC和抗TolC-二十三肽对不同菌株生长的抑制率。

图8为抗TolC-二十三肽对小鼠外阴感染的治疗作用。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆实验室手册(2001 by Cold Spring Harbor Laboratory Press)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

TolC基因的克隆、原核表达、蛋白纯化及兔抗血清的制备

在该实施例中，将全长的大肠杆菌TolC编码序列或片段构建入大肠杆菌蛋白质原核表达载体之中，以达到表达和提纯目的蛋白。

基因编码序列如SEQ ID NO:3所示。

SEQ ID NO:3：

1 atgaagaaat tgctccccat tcttatcggc ctgagccttt ctgggttcag ttcgttgagc

61 caggccgaga acctgatgca agtttatcag caagcacgcc ttagtaaccc ggaattgcgt

121 aagtctgccg ccgatcgtga tgctgccttt gaaaaaatta atgaagcgcg cagtccatta

181 ctgccacagc taggtttagg tgcagattac acctatagca acggctaccg cgacgcgaac

241 ggcatcaact ctaacgcgac cagtgcgtcc ttgcagttaa ctcaatccat ttttgatatg

301 tcgaaatggc gtgcgttaac gctgcaggaa aaagcagcag ggattcagga cgtcacgtat

361 cagaccgatc agcaaacctt gatcctcaac accgcgaccg cttatttcaa cgtgttgaat

421 gctattgacg ttctttccta tacacaggca caaaaagaag cgatctaccg tcaattagat

481 caaaccaccc aacgttttaa cgtgggcctg gtagcgatca ccgacgtgca gaacgcccgc

541 gcacagtacg ataccgtgct ggcgaacgaa gtgaccgcac gtaataacct tgataacgcg

601 gtagagcagc tgcgccagat caccggtaac tactatccgg aactggctgc gctgaatgtc

661 gaaaacttta aaaccgacaa accacagccg gttaacgcgc tgctgaaaga agccgaaaaa

721 cgcaacctgt cgctgttaca ggcacgcttg agccaggacc tggcgcgcga gcaaattcgc

781 caggcgcagg atggtcactt accgactctg gatttaacgg cttctaccgg gatttctgac

841 acctcttata gcggttcgaa aacccgtggt gccgctggta cccagtatga cgatagcaat

901 atgggccaga acaaagttgg cctgagcttc tcgctgccga tttatcaggg cggaatggtt

961 aactcgcagg tgaaacaggc acagtacaac tttgtcggtg ccagcgagca actggaaagt

1021 gcccatcgta gcgtcgtgca gaccgtgcgt tcctccttca acaacattaa tgcatctatc

1081 agtagcatta acgcctacaa acaagccgta gtttccgctc aaagctcatt agacgcgatg

1141 gaagcgggct actcggtcgg tacgcgtacc attgttgatg tgttggatgc gaccaccacg

1201 ttgtacaacg ccaagcaaga gctggcgaat gcgcgttata actacctgat taatcagctg

1261 aatattaagt cagctctggg tacgttgaac gagcaggatc tgctggcact gaacaatgcg

1321 ctgagcaaac cggtttccac taatccggaa aacgttgcac cgcaaacgcc ggaacagaat

1381 gctattgctg atggttatgc gcctgatagc ccggcaccag tcgttcagca aacatccgca

1441 cgcactacca ccagtaacgg tcataaccct ttccgtaact ga。

TolC氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。

SEQ ID NO:4：

1 mkkllpilig lslsgfssls qaenlmqvyq qarlsnpelr ksaadrdaaf ekinearspl

61 lpqlglgady tysngyrdan ginsnatsas lqltqsifdm skwraltlqe kaagiqdvty

121 qtdqqtliln tatayfnvln aidvlsytqa qkeaiyrqld qttqrfnvgl vaitdvqnar

181 aqydtvlane vtarnnldna veqlrqitgn yypelaalnv enfktdkpqp vnallkeaek

241 rnlsllqarl sqdlareqir qaqdghlptl dltastgisd tsysgsktrg aagtqyddsn

301 mgqnkvglsf slpiyqggmv nsqvkqaqyn fvgaseqles ahrsvvqtvr ssfnninasi

361 ssinaykqav vsaqssldam eagysvgtrt ivdvldattt lynakqelan arynylinql

421 niksalgtln eqdllalnna lskpvstnpe nvapqtpeqn aiadgyapds papvvqqtsa

481 rtttsnghnp frn。

．TolC基因的克隆

根据NCBI公布的大肠杆菌K12的基因序列，设计一对引物。引物序列如下：正义引物（SEQ ID NO:5）: 5’-CGA GAA TTC ATG CAA ATG AAG AAA-3’，反义引物（SEQ ID NO:6）: 5’-GGT AAG CTT TCA GTT ACG GAA AGG G-3’。为便于克隆和表达载体的构建，在引物上分别引入限制性内酶位点EcoR I和HindIII。引物由大连宝生物工程公司合成。以热变性法获得的大肠杆菌K12全基因组为模板，通过PCR 反应获得目的条带（图1A,泳道1为DNA分子量标准，泳道2为目的条带）。用限制性内酶EcoR I和HindIII分别酶切回收的DNA片断和pET-His (Novagen) 表达载体, 参照Takara公司的使用说明书进行连接反应，连接产物转化E. coli DH5α感受态，通过双酶切（图1B，泳道1为DNA分子量标准，泳道2为目的条带）和序列测定重组子的正确性，结果证明与数据库公布序列完全一致。

．TolC基因的表达

将正确的重组质粒以热激法转化大肠杆菌BL21表达菌，37℃培养12-16小时。接种单菌落于含氨苄青霉素（Amp）的LB液体培养基中, 同时接种含有pET-HIS质粒的BL21作为对照, 于30℃培养至OD（600nm）值0.6，加入IPTG 100 μg/ mL 35℃诱导2个小时，离心收集菌体，用SDS－PAGE检测插入片段是否表达蛋白，以及表达蛋白的分子量大小。接着，进行蛋白表达产物为可溶组分抑或是不溶组分（包涵体）的鉴定。具体过程如下：将离心后沉淀重悬于1/10体积的PBS或50mmol/L Tris缓冲液（pH8.0）中；加入溶菌酶至100μg/mL，保温30分钟；反复冻融数次以破坏细胞壁，用超声波处理剪切DNA（超声波的强度以不能产生气泡为适宜；裂解的时间根据实际情况掌握，一般将云雾状的细菌悬浮物裂解至比较清朗即可）；离心（12,000rpm）15分钟后将培养物分为可溶部分和不溶部分；将15 μL上清与4 μL 4×SDS样品缓冲液混合，将沉淀物重悬于1×SDS样品缓冲液；将表达样品（上清及沉淀）和非表达对照物进行SDS－PAGE电泳并以考马斯亮蓝染色以便在预计分子量范围内观察表达蛋白带。经鉴定表达产物为可溶蛋白。

表达后的图谱如图1C（泳道1为蛋白质分子量标准，泳道2和3分别为pET-28a和目的基因诱导表达）所示。由图可见，E.coli K-12 tolC基因确实已经连接到pET-28a载体上，并能在E. coli BL21中成功表达，其重组蛋白大小约为53.9kDa，与其实际分子量相符。

．TolC基因产物的纯化

大量培育菌体，离心后超声处理，离心收集上清用Ni-NTA His亲和柱纯化。采用pH5.9(buffer F)和pH4.5(buffer G)两个不同pH值的缓冲液纯化蛋白。用冲洗缓冲液buffer E(8mol/L尿素，0.1mol/L NaH₂PO₄，10mmol/LTris-Hcl，pH 6.3)洗涤5次，每次1mL;用洗脱缓冲液buffer F (8 mol/L尿素，0.1mol/L NaH₂PO₄， 10mmol/LTris-HCl, pH 5.9)洗脱目的蛋白4次，每次1mL，收集洗脱液；用洗脱缓冲液buffer G(8M尿素，0.1mol/L NaH₂PO₄，10mmol/LTris-HCl，pH 4.5)洗脱蛋白4次，每次1mL, 收集洗脱液。取收集液进行SDS-PAGE分析。纯化蛋白进行紫外检测，测定蛋白含量。

．兔抗血清的制备

将纯化蛋白溶液与福氏完全佐剂1:1（v/v）混合均匀形成油包水，采用背部多点注射免疫家兔，注射量为500μg/只；其后采用福氏不完全佐剂，每次间隔2周，第3次免疫后的第10天，心脏取血，将得到的血摆成最大斜面后在4℃冰箱中静置过夜，使血清自然析出。通过Dot-ELISA测定效价为1:8000。分装，-80℃保存。

实施例2

TolC片段SDTSYSGSKT RGAAGTQYDD SNM突变基因(tolC2)的克隆

1．TolC片段突变基因tolC2引物的设计

以疏水氨基酸替换为其它疏水氨基酸、亲水氨基酸替换为其它亲水氨基酸为原则，对TolC氨基酸序列中片段SDTSYSGSKT RGAAGTQYDD SNM进行氨基酸替换，替换结果为：KRHQLRCTDE SCWVCSRPKT DQF。在tolC基因的核苷酸序列中，找到该氨基酸序列相应的核苷酸序列（SEQ ID NO:2）：5’-TCT GAC ACC TCT TAT AGC GGT TCG AAA ACC CGT GGT GCC GCT GGT ACC CAG TAT GAC GAT AGC AAT ATG -3’，根据氨基酸的密码子，该核苷酸序列相应地被替换为（SEQ ID NO:7）：5’-AAG CGT CAT CAG CTT CGC TGC ACG CAT GAA AGC TGT TGG GTT TGT AGT CGT CCT AAG ACC CAT CAG TTT-3’。因此，根据tolC基因的核苷酸序列进行此片段突变tolC基因（命名为tolC2）5’端和3’端两对引物的设计（表1），同时分别在5’正向引物及3’端反向引物中引入EcoRI和HindIII酶切位点（横线所示），以进行融合PCR。tolC2-5’端反向引物的3’端从815位核苷酸处开始，tolC2-3’端正向引物5’端从859位核苷酸处开始，因此tolC2-5’端和tolC2-3’端两条引物共有25个核苷酸的重叠，以利于融合PCR的进行。

表1 tolC2引物序列

引物名称	引物序列	酶切位点
			tolC2-5’端正向引物	(SEQ IDNO:8) 5’- CGA GAA TTC ATG AAG AAA TTG CTC CCC ATT CTT ATC GGC CTG AGC CTT TCTGGG TTC -3’	EcoRI
tolC2-5’端反向引物	(SEQ IDNO:9) 5’- ACT ACA AAC CCA ACA GCT TTC ATG CGT GCA GCG AAG CTG ATG ACG CTT AATCCC GGT AGA AGC CGT TA -3’
			tolC2-3’端正向引物	(SEQ IDNO:10) 5’- GCA TGA AAG CTG TTG GGT TTG TAG TCG TCC TAA GAC CCA TCA GTT TGGCCA GAA CAA AGT TGG CCT GAG -3’
tolC2-3’端反向引物	(SEQ IDNO:11) 5’- GGT AAG CTT TCA GTT ACG GAA AGG GTT ATG ACC GTT ACT GGT GGT AGTGCG TGC GGA TG -3’	HindIII

2．片段突变tolC2基因PCR

用tolC2-5’端和tolC2-3’端的引物分别对E.coli K-12基因组进行PCR扩增，扩增结果如图2A所示：tolC2-5’端和tolC2-3’端均扩增得到特异的单一片段，并且片段大小分别与预计的882bp(泳道1)、624bp(泳道2)大小相当。分别回收片段，并各取50μg的回收产物进行50μL融合PCR，其中不添加任何引物。取2μL第一轮融合PCR产物进行第二轮PCR，并在PCR体系中加入tolC2-5’端正向引物和tolC2-3’端反向引物进行PCR，电泳结果表明得到了tolC2基因（见图2B，泳道2）。

3．tolC2基因克隆及序列测定

将tolC2基因融合PCR产物进行胶回收，采用限制性内切酶EcoRI和HindIII对tolC2产物与pET-28a载体进行了双酶切，分别进行乙醇沉淀及胶回收，16℃体外连接，最后转化E.coli DH5α。挑取抗卡那霉素单克隆细菌菌落，并提取它们的质粒进行双酶切鉴定，结果如图2C(泳道2)所示。从图可见，阳性重组子双酶切得到与1,482bp大小一致的目的片段。

挑取含有tolC2基因的重组子送往上海生工进行测序，由于上海生工每个测序反应的有效长度为600bp，除了进行正、反各一次反应之外，还根据正向的测序结果，在中间设计一条引物进行第三次反应，将三次测序的结果进行拼接，并运用Vector NTI软件分析，获得其完整的ORF，其核苷酸序列如表2所示（SEQ ID NO:12）：框住部位的核苷酸分别表示起始密码子与终止密码子，下划线标识的核苷酸片段为tolC2相对于正常E.coli K-12和tolC基因发生改变的核苷酸部位，该核苷酸序列与预先设计的核苷酸序列完全一致，其它部位的核苷酸序列都与正常tolC基因一致，说明成功克隆得到突变的tolC2基因。

表2 tolC2基因测序结果

1 ATGAAGAAAT TGCTCCCCAT TCTTATCGGC CTGAGCCTTT CTGGGTTCAG

51 TTCGTTGAGC CAGGCCGAGA ACCTGATGCA AGTTTATCAG CAAGCACGCC

101 TTAGTAACCC GGAATTGCGT AAGTCTGCCG CCGATCGTGA TGCTGCCTTT

151 GAAAAAATTA ATGAAGCGCG CAGTCCATTA CTGCCACAGC TAGGTTTAGG

201 TGCAGATTAC ACCTATAGCA ACGGCTACCG CGACGCGAAC GGCATCAACT

251 CTAACGCGAC CAGTGCGTCC TTGCAGTTAA CTCAATCCAT TTTTGATATG

301 TCGAAATGGC GTGCGTTAAC GCTGCAGGAA AAAGCAGCAG GGATTCAGGA

351 CGTCACGTAT CAGACCGATC AGCAAACCTT GATCCTCAAC ACCGCGACCG

401 CTTATTTCAA CGTGTTGAAT GCTATTGACG TTCTTTCCTA TACACAGGCA

451 CAAAAAGAAG CGATCTACCG TCAATTAGAT CAAACCACCC AACGTTTTAA

501 CGTGGGCCTG GTAGCGATCA CCGACGTGCA GAACGCCCGC GCACAGTACG

551 ATACCGTGCT GGCGAACGAA GTGACCGCAC GTAATAACCT TGATAACGCG

601 GTAGAGCAGC TGCGCCAGAT CACCGGTAAC TACTATCCGG AACTGGCTGC

651 GCTGAATGTC GAAAACTTTA AAACCGACAA ACCACAGCCG GTTAACGCGC

701 TGCTGAAAGA AGCCGAAAAA CGCAACCTGT CGCTGTTACA GGCACGCTTG

751 AGCCAGGACC TGGCGCGCGA GCAAATTCGC CAGGCGCAGG ATGGTCACTT

801 ACCGACTCTG GATTTAACGG CTTCTACCGG GATTAAGCGTCATCAGCTTC

851 GCTGCACGCATGAAAGCTGTTGGGTTTGTAGTCGTCCTAAGACCCATCAG

901 TTTGGCCAGA ACAAAGTTGG CCTGAGCTTC TCGCTGCCGA TTTATCAGGG

951 CGGAATGGTT AACTCGCAGG TGAAACAGGC ACAGTACAAC TTTGTCGGTG

1001 CCAGCGAGCA ACTGGAAAGT GCCCATCGTA GCGTCGTGCA GACCGTGCGT

1051 TCCTCCTTCA ACAACATTAA TGCATCTATC AGTAGCATTA ACGCCTACAA

1101 ACAAGCCGTA GTTTCCGCTC AAAGCTCATT AGACGCGATG GAAGCGGGCT

1151 ACTCGGTCGG TACGCGTACC ATTGTTGATG TGTTGGATGC GACCACCACG

1201 TTGTACAACG CCAAGCAAGA GCTGGCGAAT GCGCGTTATA ACTACCTGAT

1251 TAATCAGCTG AATATTAAGT CAGCTCTGGG TACGTTGAAC GAGCAGGATC

1301 TGCTGGCACT GAACAATGCG CTGAGCAAAC CGGTTTCCAC TAATCCGGAA

1351 AACGTTGCAC CGCAAACGCC GGAACAGAAT GCTATTGCTG ATGGTTATGC

1401 GCCTGATAGC CCGGCACCAG TCGTTCAGCA AACATCCGCA CGCACTACCA

1451 CCAGTAACGG TCATAACCCT TTCCGTAACT GA。

3. 突变tolC2基因的原核表达

将重组质粒转化E.coli BL21，进行IPTG诱导表达，SDS-PAGE结果如图2D（泳道3）所示。突变tolC2基因成功地连接到pET-28a载体上，在E.coli BL21中大量表达，重组蛋白的分子量与预计的53.9kDa大小相当。

实施例3

大肠杆菌tolC基因缺失株及其相应其他菌株的构建过程

1.大肠杆菌tolC基因缺失株构建过程：

首先制作含有pKD46质粒（普度大学 Purdue University 的Barry L. Wanner教授惠赠）的BW25113 菌株的感受态。接种含有pKD46 质粒的BW25113 菌株于5mL LB培养基中，30℃培养过夜，次日1:50 接种至100 mL含70 mg/mL氨苄青霉素的 LB 培养基，30℃培养至0.25（OD600）时，加入L-阿拉伯糖至30 mmol/L，诱导1小时( OD600不能超过0.6)，使pKD46质粒上的Red重组酶（Exo、Bet和Gam蛋白）充分表达。冰上预冷10分钟后，4℃离心收集沉淀，用预冷10 %甘油洗涤3 次，浓缩100倍成1 mL的感受态细胞，储于-80℃冰箱备用。

根据TolC基因序列和pKD4质粒中卡那霉素抗性基因序列，设计一对扩增卡那霉素基因的引物。引物序列为：sense（SEQ ID NO:13）: 5`-ATGCAAATGAAGAAATTGCTCCCCATTCTTATCGGCCTGAGCCTTTCTGGTTGAGCGATTGTGTAG-3`，Antisense（SEQ ID NO:14）：5`- TCAGTTACGGAAAGGG TTATG ACCGTTACTGGTGGTAGTGCGTGCGGATGATGGTCCATATGAATATCCT-3`。其5`端为TolC基因序列，3`端为卡那霉素基因序列。以pKD4质粒为模板，用常规PCR方法扩增出卡那霉素抗性基因，经琼脂糖凝胶电泳后用试剂盒回收目的片段。

将适量的卡那霉素抗性基因（约200ng）加入含有pKD46质粒的BW25113感受态细胞中，混匀，加入0.2 cm 电击杯中，用BioRad 电击仪进行电转化。电击条件：200Ω，25mF，电击电压213 kV，电击时间为4-5毫秒，电击后迅速加入1毫升的LB液体培养液，7℃培养1小时，涂布于含50μg/ml的卡那霉素平板上，12 小时后用链式聚合酶反应鉴定出正确的克隆。

2. 大肠杆菌tolC基因缺失菌株的补救菌株及其质粒对照菌株的构建过程

按照常规的CaCI2法制作△tolC感受态细胞，然后用热激法将pET-28a、pET-28a-tolC及pET-28a-tolC2质粒转化△tolC感受态细胞，获得相应的菌株△tolC-pET-28a、△tolC-pET-28a-tolC和△tolC-pET-28a-tolC2。

实施例4

突变基因tolC2功能研究（△tolC-pET-28a-tolC2）

1．△tolC-pET-28a-tolC2以及相关菌株膜蛋白提取

为了验证TolC和TolC2蛋白在△tolC菌株中能否表达，并且能否表达到细胞膜上，提取了△tolC-pET-28a、△tolC-pET-28a-tolC、△tolC-pET-28a-tolC2、△tolC和E.coli K-12的膜蛋白，进行SDS-PAGE分析。膜蛋白提取过程如下：挑取细菌单菌落于LB培养基培养过夜后，再按1：100接种于LB培养基，培养至OD1.0，离心获得细菌，称菌体湿重，按1:3（w/v）的比例加入超声波破碎缓冲液（50 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5；5 mmol/L MgCl₂；1 mmol/L PMSF）悬浮菌体，冰浴下进行超声破碎，输出功率50％，15s每次，间隔30s，超声3次。超声破碎后的菌液，5000g 4℃离心15分钟，收集上清。上清液超速离心100,000g，4℃离心40分钟，弃上清。沉淀溶于适当体积超声缓冲液中。

进一步以兔抗TolC血清为一抗，进行Western blotting对TolC蛋白的表达进行验证。具体操作程序如下：SDS电泳结束后，进行电转，恒压70V电转1小时；电转结束后，用丽春红染色检测电转的效果；洗去丽春红，加封闭液封闭，室温孵育1小时；TNT洗膜，3次(每次5分钟)；加入一抗（用封闭液配制），室温孵育1小时；取出膜，TNT洗膜3次(每次10分钟；加入酶标二抗（用封闭液配制），室温孵育1小时；取出膜，TNT洗膜3次(每次10分钟)；DAB显色；终止反应，扫描，封好膜，保存。

SDS电泳结果和Western blotting结果分别见图3A和3B。结果显示：除了△tolC-pET-28a（泳道1）和△tolC（泳道5）没有显出阳性带之外，E.coli K-12（泳道2）、△tolC-pET-28a-tolC（泳道3）和△tolC-pET-28a-tolC2（泳道4）膜蛋白在53.9kDa处均显出条带单一的阳性带。此结果表明克隆在pET-28a载体上的tolC和tolC2基因在△tolC基因敲除菌株中能够分别表达出目的蛋白TolC和TolC2，同时能准确地表达到细胞膜上，以执行相应的功能。

2．突变基因tolC2对四环素耐药分析

2.1 △tolC-pET-28a-tolC2 最低抑菌浓度即MIC值测定

根据NCCLS程序，用微量肉汤两倍稀释法测定△tolC-pET-28a-tolC2的最低抑菌浓度，即抑制细菌生长的最低浓度（MIC）。试验中以△tolC-pET-28a与△tolC为阴性对照，E.coli K-12与△tolC-pET-28a-tolC为阳性对照，四环素浓度范围为0.78mg/mL－25mg/mL。MICs结果如图4所示，其中tolC-pET-28a-tolC2的MIC值为3.125mg/mL，E.coli K-12与△tolC-pET-28a-tolC对四环素的MIC值比△tolC-pET-28a-tolC1和两株阴性对照菌株△tolC-pET-28a、△tolC都高一倍，说明发生改变的TolC的药物外排通道的膜内和跨膜区虽然存在，但是TolC片段（SEQ ID NO:1：SDTSYSGSKT RGAAGTQYDD SNM）发生改变，导致△tolC-pET-28a-tolC2与△tolC-pET-28a和△tolC一样不表现出TolC的功能。其原因可能是TolC的片段（SEQ ID NO:1：SDTSYSGSKT RGAAGTQYDDSNM）具有感知外界四环素等环境因素的作用，也可能此区与药物外排功能相关。

最小抑菌浓度测定过程为：挑取单克隆于LB培养基中，37℃过夜培养。 1:100（v/v）接种于另一试管中，培养至OD600=0.5，用MH培养基1:100进行稀释。在96孔细胞板中用MH培养基倍比稀释链霉素溶液，每孔90mL。取10 mL上述稀释好的细菌至含有相应抗生素MH培养基中，约10⁵CFU/mL，37℃培养16h，观察其最低抑菌浓度。

2.2 △tolC-pET-28a-tolC2抑制率测定

为进一步探讨TolC片段（SEQ ID NO:1：SDTSYSGSKT RGAAGTQYDD SNM）的作用，在△tolC-pET-28a-tolC2次抑菌浓度即1.56μg/mL四环素下，测定△tolC-pET-28a-tolC2的生存情况，同时以△tolC-pET-28a与△tolC为阴性对照，E.coli K-12与△tolC-pET-28a-tolC为阳性对照。具体操作过程如下：分别挑取细菌单菌落过夜培养，饱和后1:1,000（v/v）稀释到不含四环素和含有1.56μg/mL四环素浓度的5mL LB培养液中，每个浓度重复3次，37℃200转/分钟培养8h后，在600nm波长处测定OD值。分别用在加入四环素的OD值除以不加四环素的OD值，即为菌株在此抗生素浓度下的生存率。图5结果表明：经SPSS软件分析，抑制率在E.coli K-12与△tolC、△tolC-pET-28a和△tolC-pET-28a-tolC2之间具有十分显著的差异；而抑制率在E.coli K-12与△tolC-pET-28a-tolC之间差异不明显，△tolC-pET-28a-tolC2的抑制率与△tolC-pET-28a、△tolC之间差异不明显。这些结果表明TolC片段SEQ ID NO:1：（SDTSYSGSKTRG AAGTQYDDSNM）具有对外界抗生素的感知能力或影响外排的功能。

实施例5

E.coli K12 BW25113的耐药菌株的筛选过程

1．细菌菌株来源：E.coli K12 BW25113来源于Nara Institute of Science and Technology，Japan。

2. 四环素耐药菌株的筛选过程：四环素（tetracycline，TC）购买于上海生物工程有限公司。耐药菌株的获得采用传代法，具体操作步骤如下：

1) 用倍比稀释法检测出发菌株即E.coli K12 BW25113对四环素的最低抑菌浓度即MIC值为6.25mg/mL。

2) 将出发菌株培养12h，以1:10比例转接于含出发菌株 1/2 MIC 四环素浓度的新鲜LB培养基中培养12h；然后以上述相同方法转接，连续培养10代。同时将大肠杆菌出发菌株在无四环素的新鲜LB培养基中同步培养10代作为对照。

3) 将获得的10代菌株划线于LB平板，过夜培养后，挑取单菌落测定MIC值，为25mg/mL，比值等于4，则表明获得了四环素的耐药菌株（TC-R）。

4) 将获得的耐药菌株保种，并贮存于-80℃冰箱中。

实施例6

TolC-二十三肽的合成和多克隆抗体制备

1 TolC-二十三肽的合成：根据NCBI公布的E. coli K-12 TolC氨基酸序列，其片段为SEQ ID NO:1：SDTSYSGSKT RGAAGTQYDD SNM。合成多肽产物与血蓝蛋白偶连以提高免疫原性。上述由上海基康公司负责完成。

二十三肽多克隆抗体的制备：将人工合成TolC-二十三肽和血蓝蛋白的偶连物与福氏完全佐剂1:1（v/v）混合均匀形成油包水，采用背部多点注射免疫家兔，注射量为500μg/只；其后采用福氏不完全佐剂，每次间隔2周，第3次免疫后的第10天，心脏取血，摆成最大斜面后在4℃冰箱中静置过夜，使血清自然析出。以未与血蓝蛋白偶连的合成多肽产物为抗原，采用Dot－ELISA技术测定效价为1:10000。

实施例7

抗TolC-二十三肽抑制耐药菌研究

1 饱和硫酸铵法纯化血清

抗TolC-二十三肽、抗TolC和免疫前血清各取2mL，分别加入10mL烧杯中，置于磁力搅拌器上搅拌。分别缓慢滴入2mL的饱和硫酸铵溶液。4℃放置2h。4000rpm，10min离心，沉淀用2mL生理盐水重悬，再分别加入10mL烧杯中，置于磁力搅拌器上搅拌。分别缓慢滴入1mL的饱和硫酸铵溶液。4℃放置2h。4000rpm，10min离心，沉淀用2mL PBS缓冲液重悬。透析袋沸水浴10min，透析袋的一边用夹子夹紧，从另一边加入经PBS缓冲液重悬的粗提取后的抗体，两边用夹子夹紧后，透析袋浸泡在PBS缓冲液中，4℃过夜透析。吸取透析后的抗体至1.5mL EP管中，各加生理盐水补至2mL。通过Western Blotting测定效价，采用相同效价进行以下试验。

2.抗体靶向抑制耐药菌的体外试验

以△tolC菌株、四环素耐药菌株（TC-R）及出发菌株（E.coli K12 BW25113,TC-R-O）作为实验材料，将培养至OD（光密度）0.5的细菌分别用免疫前血清、TolC抗血清和抗TolC-二十三肽抗体处理，稀释1000倍后，加上1/8 最低抑菌浓度的四环素，同时以不加四环素为对照，37℃培养10小时，测定其OD值（600nm）。结果发现，采用免疫前血清处理后，TC-R-O的OD值从不加四环素的1.97下降为加入四环素的1.23，抑制率为37.56%；TC-R从1.93降至1.19，抑制率为38.34%；△tolC从1.86降至0.01，抑制率为99.46%；而用TolC抗血清处理后，TC-R-O的OD值从1.71降为0.16，抑制率为91.22%；

TC-R从1.78降至0.16，抑制率为91.01%；△tolC从1.79降至0.14，抑制率为92.17%；用TolC-二十三肽抗血清处理后，TC-R-O的OD值从1.71降为0.15，抑制率91.23%；TC-R从1.70降至0.18，抑制率为89.09%；△tolC从1.65降至0.15，抑制率为90.91%，结果见图6和7。重要的是，当用免疫前血清处理时，△tolC的抑制率明显高于TC-R-O和TC-R，而用TolC抗体和TolC-二十三肽抗体处理后，三者的抑制率无明显差异。这些结果表明，当TolC抗体靶向至细菌外膜的TolC后，可以使该蛋白的功能发生明显负调，致使TC-R-O和TC-R对四环素的敏感性明显提高，与缺失该蛋白的表现结果相似。而TolC-二十三肽抗体对耐药菌的抑制作用与TolC抗体类似的作用，证明TolC片段（SEQ ID NO:1：SDTSYSGSKT RGAAGTQYDD SNM）是TolC抗体的作用靶点。由于TolC-二十三肽抗体的效价高，用量少，而且可以大大降低抗生素的用量。

3. 抗体靶向治疗的体内试验

3.1 试验菌

试验菌Y6菌株来自厦门市中山医院检验科，为临床分离的感染耐药菌株。其对庆大霉素的MIC为200mg/mL。

3.2 大肠埃希菌性外阴感染小鼠模型的建立

实验鼠为SPF级昆明小鼠，体重为18-24g，购买于中山大学动物饲养中心。外阴感染小鼠模型的建立过程如下：用微量移液器取20μL的PBS液（pH=7.4）进行小鼠阴道清洗处理。取大肠埃希菌Y6菌液（10⁹CFU/mL）20μl接种到小鼠阴道内，6小时后再接种一次。24小时后，在灭菌的1.5mLepperdorf管中加入1mL无菌生理盐水，取20μL反复冲洗小鼠阴道3-5次，洗液重新放回1mL生理盐水中，重复3次，混匀后稀释点于含有庆大霉素（浓度为50μg/mL）LB平板，置37℃恒温培养14小时左右进行活菌计数。结果发现每只小鼠细菌数量约10⁵CFU/mL。同时观察小鼠外阴，结果发现这些小鼠外阴红肿严重，阴道分泌物多，表明感染成功。

3.3 小鼠分组及给药方法

将这些感染成功的雌性小鼠，随机分成5组：生理盐水组、庆大霉素（1mg/mL）组、庆大霉素+免疫前血清组、庆大霉素+抗TolC组和庆大霉素+抗TolC-二十三肽组。每组10只小鼠。生理盐水组每只给予20μL生理盐水，庆大霉素组每只给予10μL庆大霉素，庆大霉素+抗体组每只给予10μL庆大霉素+适量抗体。每6h给药一次，共三次。给药结束后4h，用上述同样方法从小鼠阴道取样，检测活菌数量。计数结果去对数（图8）显示感染小鼠经庆大霉素+抗TolC组合和庆大霉素+抗TolC-二十三肽组治疗后，其阴道内的细菌数量明显减少，表明抗TolC-二十三肽具有抗TolC同样的效果，能抑制小鼠体内耐药菌的生长繁殖。

在试验过程中同时对外阴感染情况观察。发现经过TolC抗体和TolC-二十三肽抗体治疗的小鼠，在加入低剂量抗生素配合的情况下，其外阴红肿很快消退，而且没有发现炎症复发情况。而经免疫前抗体治疗的小鼠，在刚开始外阴红肿有些消退，但由于阴道内尚有残留活菌细胞，所以很快复发，导致外阴炎症复发；生理盐水对照组小鼠阴道内残留致病菌活细胞会在小鼠体内发生各个组织器官间的交叉感染，可能会进入尿道，从而引发尿路感染，从外部观察整个阴道红肿。单给抗生素组实验小鼠由于剂量远远低于耐药菌MIC（200mg/mL），因此表现与生理盐水对照组类似。

3.4对小鼠和大鼠阴道刺激性研究

将16只小鼠和10只大鼠分别随机分成抗TolC-二十三肽组和对照组，于阴道给药。前者给予抗TolC-二十三肽抗体，后者给予生理盐水。每次给药20μl，8h后再次给药，每天给药2次，连续给药3天。在24小时内，每8小时观察1次；以后每天观察1次。每次记录全身状况，肠胃、呼吸、中枢神经系统及四肢活动等变化。7天后处死小鼠，观察阴道的充血、水肿情况。结果发现，试验组和对照组之间无论以小鼠还是大鼠为试验对象，均表现正常，未观察到异常情况。这些结果表明，抗TolC-二十三肽对大小鼠阴道黏膜无刺激性和过敏性，安全性好。

3.5 透皮试验

对上述小鼠和大鼠，每次给药后1小时取血，自然分离血清。然后以纯化TolC为抗原，加入分离的血清，酶标抗兔抗体为二抗，进行Dot-ELISA技术测定。结果发现，试验组和对照组均为阴性，而仅为进行Dot-ELISA设立的阳性对照（不加分离血清，直接加入兔抗TolC-二十三肽）为阳性。这些结果表明，抗TolC-二十三肽阴道给药不会透过皮肤进入血流，安全性好。

Claims

1.大肠杆菌TolC抗原，其特征在于包括如SEQ ID NO:1所示的序列。

2.一种抗原，其特征在于由权利要求1所述的抗原与血蓝蛋白偶连。

3.编码如权利要求1所述大肠杆菌TolC抗原的基因片段。

4.如权利要求3所述的基因片段，其特征在于具有SEQ ID NO:2所示的序列。

5.如权利要求1或2所述的抗原在制备抗体方面的应用，所述抗体用于抑制细菌耐药性。

6.与权利要求1所述的大肠杆菌TolC抗原特异结合的抗体。

7.如权利要求6所述的抗体，其特征在于由以下方法获得：根据NCBI公布的E. coli K-12 TolC氨基酸序列，合成SDTSYSGSKT RGAAGTQYDD SNM片段，合成多肽产物与血蓝蛋白偶连以提高免疫原性；将人工合成SDTSYSGSKT RGAAGTQYDD SNM片段和血蓝蛋白的偶连物与福氏完全佐剂混合均匀形成油包水乳剂，注射免疫动物，注射量100微克-1毫克/只；其后采用福氏不完全佐剂；每次间隔10-20周，第3-5次免疫后的第7-10天取血，于低温下静置，使血清自然析出。

8.如权利要求6所述的抗体在制备抑制细菌耐药性药物中的应用。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于所述的细菌为大肠杆菌、痢疾杆菌、沙门氏菌、克氏柠檬酸杆菌、戴阿利斯特杆菌属、肺炎克雷伯菌或链霉菌。