CN104789576B - 鼠疫耶尔森菌毒力调控子TyrR及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了鼠疫耶尔森菌毒力调控子TyrR及其应用。本发明发现鼠疫耶尔森菌TyrR缺失株的毒力较野生株下降约1万倍，缺失TyrR不影响该菌的体外生长，且TyrR能负调控五种芳香簇氨基酸代谢基因aroF‑tyrA,aroP,aroL和tyrP的转录及正调控2个酸应答基因hdeB和hdeD，证实TyrR是鼠疫耶尔森菌的一个毒力调控子。在pH5.0环境中，鼠疫耶尔森菌TyrR突变株的生存率和生长速度较野生株降低，说明TyrR突变株抗酸能力下降，证实TyrR调控子跟菌的抗酸性密切相关。本发明提供了鼠疫耶尔森菌毒力调控子TyrR在制备预防鼠疫疫苗中的应用，以及在制备以TyrR为靶标的药物中的应用。

Description

鼠疫耶尔森菌毒力调控子TyrR及其应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及鼠疫耶尔森菌毒力调控子的发现，特别是涉及鼠疫耶尔森菌毒力调控子TyrR及其应用。

背景技术

鼠疫是由鼠疫耶尔森菌(Yersinia pestis，简称鼠疫菌)引起的一种自然疫源性疾病。主要通过蚤类为传播媒介在啮齿动物间传播，偶尔会通过带菌跳蚤叮咬或接触病畜侵入人体，引发腺鼠疫、肺鼠疫和败血症型鼠疫。鼠疫发病急、传播快和病死率高。历史上曾发生过3次鼠疫的世界性大流行，至少造成一亿六千万人死亡。自1980至1999年间，在内蒙古、云南、西藏、甘肃、青海、新疆和四川等西部7个省区发生了人间鼠疫473例，死亡104例。自上世纪90年代以来，鼠疫的发病呈上升趋势，2000年是近年来我国发生人间鼠疫最多的一年，共213例。2009年，青海再次爆发人间鼠疫，导致3人死亡。2000年被WHO列为重新抬头的传染病(Reemerging disease)。此外鼠疫菌是标准的细菌性生物战剂，如湖南常德曾遭受日军的细菌战，还可用于生物恐怖。因此对鼠疫病原体及致病机制进行深入研究，对国家的经济发展、人民健康和社会安全有着深远的影响。

在鼠疫菌致病过程中，有多种机制能帮助鼠疫菌完成蚤体内生存、形成菌栓、在宿主体内粘附、侵袭、抗吞噬以及宿主细胞毒性等功能。鼠疫菌为胞内致病菌，鼠疫菌在感染早期主要在巨噬细胞中繁殖，而后期以胞外生存为主，因此鼠疫菌需要各种毒力因子抵御细胞内与细胞外宿主免疫清除机制的作用以维持其在宿主体内的生存。目前已知的毒力因子由鼠疫菌染色体或质粒编码产生。染色体编码的毒力因子包括：pgm位点(血红素贮存系统和耶氏杆菌素系统)、pH6抗原(PsaA基因编码)、脂多糖、Phop/Q二元调控系统、铁调节摄取系统(Yfe操纵子)、压力反应蛋白(HtrA)、过氧化氢酶活性、侵袭素和黏附素等。此外染色体外的三种质粒也能编码产生毒力因子：如pCD1质粒编码的T3SS(III型分泌系统)，由4个成簇基因构成的操纵子和效应蛋白及其伴侣分子构成。该系统通过改变宿主细胞骨架结构、抵抗吞噬作用、干扰信号转导通路，从而抑制宿主正常的免疫反应。pPCP1质粒编码血浆酶原激活因子(Pla蛋白酶)，pMT1质粒编码F1荚膜蛋白和鼠毒素。此外，细菌的抗酸性跟毒力密切相关，也是其赖以生存的重要机制。在巨噬细胞内生存和繁殖是鼠疫菌感染机体早期的关键环节。而巨噬细胞的吞噬溶酶体的pH在5.0左右酸性环境，面对巨噬细胞内的酸性选择压力，鼠疫菌需进化多种抗酸机制才能更好的生存和繁殖。然而，目前对鼠疫菌抗酸性研究鲜有报道。

目前认为巨噬细胞内存活与繁殖获得致病能力是鼠疫菌得以最终致病的关键阶段。鼠疫菌感染机体早期能在巨噬细胞内存活并繁殖，不可避免地遭遇巨噬细胞内多个环境信号(如酸、过氧化物、高渗透压、多种溶酶体和多种抗菌肽等)的协同刺激，鼠疫菌能感应这种复杂的信号刺激并自我调节，合成一系列毒力因子主动攻击宿主或对宿主具有毒性以实现其在宿主体内的繁殖和扩散，最终使鼠疫菌适应环境得以存活。从分子水平来说，病原菌从感应信号刺激到表达毒力因子，是个紧密调控的过程，其中，毒力调控子在转录水平上的调控至关重要。目前鼠疫CO92和91001等菌株已完成全基因组测序，这为鼠疫菌的毒力调控研究提供了非常有用的信息；而基因组学和蛋白质组学技术则为毒力调控提供了新的技术手段。2004年，Flashner等通过信号标签突变技术筛选出参与鼠疫菌毒力调控的转录调控子(LcrF)和一些毒力因子。但是，目前有关鼠疫菌的毒力调控机制研究主要集中一些重要的毒力调控子上(包括PhoP/PhoQ、CRP、Fur、RovA、OxyR、Zur、LcrF等)。因此发现毒力调控子及进行研究，对阐明鼠疫菌的致病机制具有重要的作用。

TyrR作为一种大肠埃希菌芳香族氨基酸合成代谢中的全局性调控蛋白质，包括N末端、中央区和C末端等三个功能区。N末端含有配体结合区域ACT、PAS和DIM(二聚体化基序)3个区，主要参与芳香族氨基酸代谢基因的转录激活；中央区主要参与对基因转录的抑制；C末端含DIM和HTH(helix–turn–helix)基序。TyrR控制着包括自身编码基因tyrR在内，涉及苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸合成与运输的8个转录单元的转录。这些转录单元的共同特征是在其转录调控区内存在数量为1～3个不等的，保守结构为TGTAAAN6TTTACA的22bp茎环结构，称为TyrR盒。当TyrR蛋白与转录单元的TyrR盒结合，可实现对8个转录单元调控。总之，TyrR作为一个很典型的调控子，其调控受到ATP、TyrR蛋白类型和浓度、TyrR盒的组成和位置及芳香族氨基酸种类等的影响，可参与对芳香族氨基酸代谢基因转录激活或抑制的调控，国内外尚未见TyrR调控毒力的报道。

目前对鼠疫菌基因表达调控的认识，还仅限于部分特定环境调控的毒力因子，对鼠疫菌致病性的认识还不全面，因此寻找新的毒力调控因子有助于了解鼠疫菌的致病机制，为制备鼠疫菌减毒活疫苗和药物治疗靶点提供基础。

发明内容

本发明的目的在于提供鼠疫耶尔森菌毒力调控子TyrR及其应用。

本发明在工作中发现鼠疫耶尔森菌47kb大片段缺失后毒力较野生株降低约10万倍，并产生高滴度的F1抗体及免疫保护效果好。通过采取分段敲除并结合LD₅₀试验，发现鼠疫耶尔森菌△tyrR缺失株毒力较野生株下降近万倍，通过构建△tyrR突变株的互补株后发现毒力恢复，最终确认TyrR调控子基因敲除是导致47kb大片段减毒最主要的原因。

本发明提供了鼠疫耶尔森菌毒力调控子TyrR，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供了鼠疫耶尔森菌毒力调控子TyrR的氨基酸序列，如SEQ ID NO.2所示。

本发明提供了含有鼠疫耶尔森菌毒力调控子TyrR的载体或表达盒。

本发明提供了鼠疫耶尔森菌毒力调控子TyrR在调控鼠疫耶尔森菌毒力中的用途。

本发明提供了鼠疫耶尔森菌毒力调控子TyrR在制备鼠疫疫苗中的应用。

本发明提供了鼠疫耶尔森菌毒力调控子TyrR在制备以TyrR为靶标的药物中的应用。

本发明还提供了一种TyrR基因缺失或突变的鼠疫疫苗，所述TyrR基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

根据本发明提供的鼠疫耶尔森菌毒力调控子TyrR在调控鼠疫菌毒力中的用途，本领域技术人员能够合理预期，一种针对鼠疫耶尔森菌毒力调控子TyrR的单克隆抗体也属于本申请的保护范围，该单克隆抗体对应的抗原表位含有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。

因此，分泌上述单克隆抗体的杂交瘤细胞株也属于本发明的保护范围。

本发明还提供了一种检测试剂盒，其含有对应的抗原表位含有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的单克隆抗体。

鼠疫菌毒力调控和致病机制研究，是目前研究的热点领域。TyrR作为一个全局性的转录调控蛋白，在大肠埃希菌中仅调控芳香族氨基酸代谢，但在鼠疫菌中功能不明。本发明发现鼠疫菌△tyrR缺失株毒力较野生株下降近万倍，通过构建△tyrR突变株的互补株后发现毒力恢复，最终确认TyrR调控子基因敲除是导致47kb大片段减毒最主要的原因。RNA-seq和Real-time PCR证实鼠疫菌TyrR能调控8个基因，其中包括负调控五个芳香簇氨基酸代谢基因(aroF-tyrA,aroP,aroL和tyrP)的转录及正调控2个酸应答基因(hdeB和hdeD)。综上所述，既然TyrR影响鼠疫菌毒力又能调控芳香族氨基酸代谢及抗酸基因的转录，因此TyrR是鼠疫菌的一个毒力调控子。

此外TyrR基因缺失后在体外不影响鼠疫菌生长，而在小鼠体内鼠疫菌△tyrR和野生株竞争试验表明：在小鼠感染48h或72h后，在肝脏或脾脏中鼠疫野生株201载菌量达到10⁷CFU，而△tyrR突变株在肝脾中的载菌量较少，生存能力较野生株显著减少并导致毒力明显下降，进一步证实TyrR是鼠疫菌在体内生存和感染所必需的调控子。

抗酸性是鼠疫菌重要的毒力相关表型。在极酸环境(pH5.0左右)，△tyrR突变株生存率和生长速度较野生株降低，此外TyrR能下调抗酸基因hdeD和hdeB的表达。以上结果说明△tyrR突变株抗酸能力下降，影响鼠疫菌的存活和生长，证实了TyrR调控子能调控细菌的抗酸性。

总之，本发明发现TyrR是一种毒力调控子，并从转录水平验证TyrR作用的靶基因，结合表型和分子生物学技术，初步研究TyrR调控关键毒力(如抗酸性等)分子机制，这对阐明鼠疫菌的致病机制具有十分重要的意义，并为鼠疫菌减毒活疫苗的研制和抗菌药物作用靶点提供依据。

附图说明

图1为鼠疫菌47kb大片段缺失的PCR鉴定电泳图，其中1为47kb缺失的鼠疫株；2为阳性对照(鼠疫野生201株)；3为阴性对照(不加模板DNA)。图中，tnp_20外侧鉴定引物rstA鉴定为阳性，tnp_22内侧鉴定引物rhsA1、dalD、tpx和pspA均为阴性，说明47kb大片段缺失。

图2为鼠疫菌缺失株和EV76活疫苗的F1抗体滴度测定示意图。F1抗原为鼠疫一种重要保护性抗原，测其抗体可测定体液免疫的效果，EV76活疫苗为标准的鼠疫减毒活疫苗，47kb缺失株为鼠疫菌201株47kb缺失株。

图3为鼠疫菌缺失株和EV76活疫苗的免疫保护效果测定示意图。其中A图为滴鼻感染的保护效果；B图为皮下感染的保护效果。

图4为47kb大片段分段敲除示意图。

图5为47kb分段敲除株、tyrR敲除及回补株构建的PCR鉴定示意图，图中“+”为阳性对照(鼠疫野生201株)，“-”为阴性对照，是不加模板DNA的试剂对照。其中：A图为47-2敲除鉴定电泳图，其中hrpA(1-3)：1为△47-2,2为阳性对照，3为阴性对照；dalD(4-6)：4为△47-2,5为阳性对照，6为阴性对照；IdhA(7-9):7为△47-2,8为阳性对照，9为阴性对照；hrpA是47-2外侧鉴定引物，dalD和IdhA1是内侧鉴定引物，PCR鉴定为阳性，说明47-2敲除成功。

B图为47-3敲除鉴定电泳图，其中IdhA1(1-3):1为△47-3，2为阳性对照，3为阴性对照；tyrR(4-6):4为△47-3，5为阳性对照，6为阴性对照；nifJ(7-9):7为△47-3,8为阳性对照，9为阴性对照；IdhA1是47-3外侧鉴定引物，PCR鉴定为阳性，tyrR和nifJ是内侧鉴定引物，PCR鉴定为阴性，说明47-3敲除成功。

C图为47-3a敲除鉴定电泳图，其中1-4：△47-3a敲除株。“+”为阳性对照，“-”为阴性对照。hslJ和YP_2127是47-3a外侧鉴定引物，PCR鉴定为阳性。nifJ和aesS2是内侧鉴定引物，PCR鉴定为阴性，说明47-3a敲除成功。

D图为47-3b敲除鉴定电泳图，其中1-4为△47-3b敲除株；“+”为阳性对照，“-”为阴性对照。aesS2和tyrR是47-3b外侧鉴定引物，PCR鉴定为阳性。soxR2和YP_2127是内侧鉴定引物，PCR鉴定为阴性，说明47-3b敲除成功。

E图为tyrR敲除鉴定电泳图，1-3(上游基因和卡那盒交叉鉴定引物tyrR-交-I-K-F和tyrR-交-I-K-R)：1为△tyrR敲除株,2为阳性对照，3为阴性对照；4-6(tyrR内部鉴定引物tyrR-F/R)：4为△tyrR敲除株,5为阳性对照，6为阴性对照。敲除株交叉鉴定引物PCR鉴定为阳性，证明抗性盒已替换目的基因，而内侧鉴定引物为阴性，说明tyrR敲除成功。

F图为△tyrR回补株的鉴定电泳图，1-4:△tyrR回补株，片段大小约2.1kb(鉴定引物为tyrR-C-F/R)，将tyrR基因及上游约500bp的回补片段连接到pACYC184质粒，再转化到△tyrR株，PCR鉴定目的带与预期相符，说明成功构建了△tyrR的回补株。

图6为鼠疫菌tyrR敲除株和野生株在体外生长示意图，其中WT代表鼠疫野生株201株。OD₆₂₀为波长620nm时的吸光度值。

图7为鼠疫菌tyrR敲除株和野生株(201株)在体内竞争生长示意图，其中，CI表示竞争指数(用tyrR敲除株/野生株菌落数对数的比值表示)。图7A表示小鼠经静脉感染48h或72h后在脾脏中tyrR敲除株和野生株的竞争指数；图7B表示小鼠经静脉感染48h或72h后在肝脏中的tyrR敲除株和野生株的竞争指数。

图8为鼠疫菌tyrR敲除株和野生株在不同pH(4.8、5.2和7.2)条件下的生长示意图，其中WT代表鼠疫野生株201株。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

本发明使用的鼠疫耶尔森菌(简称鼠疫菌)为野生株201株。鼠疫菌野生株201株分离自内蒙古布氏田鼠疫源地，根据鼠疫的生物型分型标准，鼠疫菌201株及鼠疫菌91001株均属于属于田鼠型菌株。其中鼠疫菌91001株基因测序已公布，鼠疫菌201株基因组与已测序的鼠疫菌91001株相同，由军事医学科学院微生物与流行病研究所保存。其主要表型为F1+(可以形成荚膜)，LcrV+(合成V抗原)，Pst+(产生鼠毒素)以及Pgm+，包括一条染色体和四个质粒。pPCP1质粒长度为9609bp；pCD1质粒是编码III型分泌系统的质粒，长度为70159bp；pMT1质粒长度为106642bp；pCRY质粒是新发现的质粒，这一质粒长度为21742bp，具有独立复制能力，有一群编码IV型分泌系统的基因。91001菌株的染色体长度为4,595,065bp，有4,037个CDS，其中141个是假基因。布氏田鼠疫源地菌株具有独特的致病特点：对小鼠有很强的特异性毒力；而对豚鼠、新西兰兔、绵羊以及猕猴等大动物和人低毒或者完全不致病。

实施例1 47kb毒力大片段的发现和鉴定

RyhB是跟铁代谢相关的小RNA，鼠疫菌有2个拷贝小RNA(RyhB1和RyhB2)，长度约为100bp。在构建鼠疫菌RyhB突变株时，应用传统的一步法基因突变技术未能成功，本实施例采用二步法PCR成功构建△ryhB1和△ryhB2单缺失株，而在△ryhB1缺失株的基础上构建的△ryhB1::ryhB2双缺失株LD₅₀高达1.5×10⁶CFU(见表1)，毒力较野生株下降约10万倍，而RyhB1和RyhB2单突变株LD₅₀＜8CFU，不引起毒力下降。

1、二步法PCR敲除基因的方法如下：

(1)PCR扩增目的敲除基因的上、下游同源臂及卡那盒针对待敲除的目的基因上下游500～900bp的染色体基因序列，用prime 3软件设计引物。如要扩增上游同源臂，则其下游引物5’端含与卡那盒同源的18～25bp序列，3’端含与上游同源臂同源的序列；扩增下游同源臂的上游引物5’端应含与卡那盒同源的18～25bp的序列，3’端含与下游同源臂同源的序列，最终扩增上、下游同源臂均含有卡那盒的产物。

PCR扩增用TaKaRa高保真酶PrimeSTARTM HS DNA Polymerase，反应体系为50μl。PCR扩增条件：98℃10s，56℃15s，72℃1min扩增30个循环，72℃5min。收集PCR产物，使用QIAquick PCR Purification Kit(Qiagen)PCR产物试剂盒纯化上下游同源臂、卡那盒PCR产物，-20℃保存。

(2)融合PCR扩增含卡那盒的线性突变盒将目的基因上、下游同源臂及卡那盒等摩尔混合，以此混合产物为DNA模板，用上游同源臂的的上游引物及下游同源臂的下游引物扩增，扩增上游同源臂-卡那盒-下游同源臂的长同源臂作为线性突变盒。

PCR用TaKaRa高保真酶PrimeSTARTM HS DNA Polymerase扩增，反应体系为50μl。扩增条件：98℃10sec，56℃15sec，72℃3.5min扩增30个循环，72℃5min。使用QIAquick GelExtration Kit(Qiagen)胶回收试剂回收含卡那盒的线性突变盒的PCR产物，产物测浓度后-20℃保存。

(3)电转化将直径为2mm的电击杯放冰上预冷。取出冻存的感受态细胞，于冰上放置10min。取500ng的PCR产物加入感受态细胞中，轻微混匀，于冰上继续放置15min。吸取DNA与感受态的混合物，加入到电击杯，于25μF，200Ω，2.5kv的电击参数下电击(一般电击时间为4.6～5.2s)，电击完后，立即加入800μl的LB培养基悬浮细胞。将电击细胞转入到离心管中，于26℃培养2～4h。细胞5000g离心7min后，用150μl悬浮细胞，并涂LB平板(卡那抗性)，26℃培养48h后观察结果。

(4)重组克隆的筛选鉴定挑取在LB平板(卡那抗性)上生长的鼠疫菌的单克隆菌落，加100μl水后95℃变性10min，10000g室温离心2min，取5μl作为模板用目的基因内部鉴定引物及卡那盒与敲除基因上下游的交叉引物进行PCR鉴定，并以野生株的DNA和水作为对照。若目的基因的内部鉴定引物为阴性，而卡那盒与敲除基因上游或下游的交叉引物鉴定为阳性，可证实目的基因敲除成功。

仔细分析RyhB1单缺失株基础上构建RyhB2缺失株时同源臂情况，为增加同源重组效率，将RyhB2的上下游同源臂增加到500～900bp。RyhB2位于染色体的反义链上，在其下游跟一个tnp_22基因紧密相邻，tnp基因含有类似IS200插入序列的转座酶，染色体基因组共含有44个同源的tnp序列。当时在设计RyhB2下游同源臂时刚好包含了tnp重复序列，而在距RyhB2约47kb处有一跟tnp_22高度同源的tnp_20序列。根据同源重组原理可以推测：含下游同源臂的抗性突变盒与tnp_20基因发生同源重组时，意外的将tnp_20和tnp_22之间的47kb大片段缺失，并造成毒力的减弱。

在tnp_20外侧是一个多操纵子基因，故外侧鉴定引物设计为操纵子第一个基因rstA，内侧鉴定引物为紧邻tnp_20的rhsA1基因。在紧靠tnp_22内侧设计pspA引物，其余的dalD和tpx引物均是内侧引物，引物序列见表2。图1结果显示：tnp_20外侧的rstA鉴定为阳性，而介于tnp_20内侧的rhsA1为阴性，其余的内侧鉴定引物dalD、tpx和pspA均为阴性，说明在tnp_20和tnp_22之间缺失一段约47kb大片段，是引起△ryhB1::ryhB2双缺失株毒力下降的重要原因。

2、LD₅₀试验将鼠疫野生株与各敲除株培养48h至静止期，取150μl接种到新鲜BHI中过夜孵育到对数中期，37℃1h，用PBS洗涤后，用生理盐水从10^-1稀释到10^-7(取4.5ml生理盐水加0.5ml菌液)，再取10^-5、10^-6、10^-7每个稀释度各取200μl接种3块赫氏固体培养基上，用L棒均匀涂抹，26℃培养2天后计数实际攻击菌量。每个菌株取30只BALB/c雌性小鼠，随机分为6个组。腹腔注射0.6％戊巴比妥麻醉小鼠，取10^-1到10^-6共6个稀释度的菌液10μl，注射到BALB/c雌性小鼠，每个组注射5只小鼠，攻毒后连续观察14天，统计各组小鼠的存活情况，并用Reed-Muench方法计算LD₅₀。

表1△47kb分段敲除株及△tyrR的LD₅₀试验

实施例2鼠疫菌47kb缺失株的F1抗体和免疫保护效果测定

1.鼠疫菌47kb缺失株F1抗体测定：F1抗原是鼠疫菌的一种重要中和抗原，通过测定F1中和抗体来反映疫苗体液免疫应答能力。鼠疫菌47kb大片段缺失株(和EV76活疫苗两个剂量组之间的产生的F1抗体滴度均值分别为761.3±1.53和656.3±1.77差异无统计学意义(t＝0.44，P＞0.05)，说明鼠疫菌47kb大片段缺失后产生体液免疫应答能力较好，效果类似传统的EV76活疫苗(见图2)。

具体方法如下：三组BALB/c小鼠(每组十只)，分别皮下免疫EV76活疫苗(1.6×10⁴CFU)、鼠疫菌47kb大片段缺失株(1.5×10⁴CFU)和PBS，免疫6周后尾静脉采血。ELISA测定F1抗体滴度。包被F1抗原，每孔50ng(100μl)，置4℃过夜。1.5％干酪素溶液15倍稀释后封闭，置37℃孵箱2小时。以对照组小鼠血清作阴性对照，加系列稀释的实验动物血清(100μl/孔),置37℃孵箱内湿盒中30分钟。取出用洗液洗5遍后加入对应的二抗(羊抗鼠IgG，辣根过氧化物酶标记)，37℃置湿盒中20分钟。加显色液(50μl/孔)，置湿盒中37℃放10分钟，取出直接加入终止液(50μl/孔)，最后置酶标仪中测定OD值。

2.鼠疫菌47kb缺失株免疫保护效果测定：免疫后第6周，分别用1.2×10⁶CFU鼠疫耶尔森氏菌141强毒株皮下和滴鼻攻毒,观察14天。其间记录死亡数和死亡天数。图3结果表明：已免疫EV76活疫苗或47kb大片段缺失株的小鼠，都产生了高滴度的F1抗体，当鼠疫菌强毒株141经皮下或滴鼻感染小鼠后，对照组小鼠全部死亡，而EV76活疫苗和47kb大片段缺失株这两种疫苗组小鼠存活率高达90％以上，说明鼠疫菌47kb缺失株疫苗免疫保护效果好。

实施例3鼠疫菌毒力调控子TyrR的发现

由实施例1的结果可知，本发明基于Red同源重组的基因敲除技术将鼠疫菌的47kb大片段缺失，47kb缺失后LD₅₀为1.5×10⁶CFU，毒力较野生株下降约十万倍，并且能产生F1抗体且免疫保护效果好，可用于疫苗的制备。

为进一步确定47kb大片段缺失后减毒的基因，本发明采取分段敲除和LD₅₀试验相结合的策略。本实施例的分段敲除基因方法分别采用一步法基因敲除和二步法基因敲除。其中一步法基因敲除方法是直接使用PCR扩增线性突变盒，利用λRed系统促进由PCR介导的线性突变盒与染色体基因组发生同源重组，用突变盒中的抗性盒基因替换染色体基因而达到快速、简单和定点敲除的目的。该方法所需的同源臂短(35～60bp)、对于过短或过长的基因同源重组效率低而导致敲除困难。仅适用于少于2kb的基因敲除，如鼠疫菌△tpx,△YP_2132-2135和△tyrR等，所用引物序列见表2。具体方法参见以下参考文献【Datsenko KA,Wanner BL.One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12using PCR products.Proc Natl Acad Sci.2000Jun 6；97(12):6640-5】。

二步法敲除技术可提高同源臂长度(500～900bp)，先扩增上下游同源臂和卡那盒，并使用融合PCR得到线性突变盒，可提高同源重组效率。可用于大片段的基因敲除。对于大于2kb的大片段可用二步法PCR进行敲除，如△47，△47-1，△47-2，△47-3，△47-3a，△47-3b等，使用的引物序列见表2。具体方法可参见实施例1。

如图4所示，47kb片段可分为47-1、47-2和47-3三个部分。分段敲除结果显示(见表1)：47-1和47-2片段缺失的鼠疫菌株，其LD₅₀＜8CFU，说明47-1和47-2片段缺失并不能使鼠疫菌的毒力下降，47-1和47-2片段跟毒力无关。而47-3缺失株的LD₅₀为1.0×10⁵CFU，说明此片段可能含有鼠疫菌毒力基因；接下来将47-3分为a、b和c三部分再分段敲除(见图4)，结果表明：47-3a和47-3b片段的缺失并不能使鼠疫菌的毒力下降，它们跟鼠疫菌的毒力无关，而剩下的47-3b可能含有毒力基因。具体的分段敲除鉴定电泳结果见图5，分段敲除所用的引物序列见表2。

表2基因敲除和Real-time PCR鉴定引物序列

通过对47-3c采取分段敲除，发现△tyrR突变株的LD₅₀＞8.4×10⁴，毒力较野生株降低约一万倍。为排除插入的极性突变，本实施例还构建了△tyrR突变株的回补株，将tyrR基因及上游约500bp的回补片段连接到pACYC184质粒，再转化到△tyrR株，构建了△tyrR的回补株(图5F图)。LD₅₀实验结果显示，△tyrR回补株毒力恢复(LD₅₀＜8CFU)，说明插入突变是非极性的。结果证实：tyrR基因缺失是导致47kb大片段缺失所致毒力下降的主要原因。结合鼠疫菌TyrR有调控芳香族氨基酸代谢及抗酸基因的功能(见表3)，证实TyrR是鼠疫菌的一个跟毒力相关的调控子。

实施例4TyrR调控子对鼠疫菌生存能力的影响

TyrR基因敲除后的鼠疫菌生长速度跟鼠疫菌野生株一致，说明TyrR调控子在体外不影响鼠疫菌的生长。而鼠疫菌△tyrR敲除株引起小鼠毒力的减弱肯定跟宿主体内的生存条件有关。结果见图6。

1、鼠疫野生株和TyrR突变株在体外生长曲线的测定

将鼠疫菌野生株201和△tyrR敲除株接种到5ml BHI液体培养基中，26℃预培养48h达平台期，1:40稀释过夜培养，当细菌长到对数中期OD₆₂₀＝1.0～1.2左右，4℃4000g离心5min，收集菌体，用PBS调OD₆₂₀＝1.0。将OD₆₂₀为1.0的两种菌1:30接种于含15ml BHI培养基锥形瓶中(1个菌接3瓶)，26℃培养，并每隔3h用无菌吸管吸100μl菌液加入含10μl甲醛的1.5ml无菌离心管，并检测OD₆₂₀值，并绘制生长曲线，观察TyrR对鼠疫菌生长的影响。结果见图6。

2、鼠疫野生株和TyrR突变株在体内生长竞争

菌株准备：将鼠疫菌野生株201和△tyrR敲除株的斜面培养物接种到5ml BHI液体培养基中，26℃培养48h。取200μl接到新鲜BHI中过夜孵育到对数中期，调节OD₆₂₀nm＝0.8-1.0左右，转移到37℃继续培养1h。

动物攻毒：六周龄雌性BALB/c小鼠16只，随机分为2组，每组8只小鼠。将鼠疫菌野生株201株和△tyrR突变株离心收集菌体，PBS洗涤两次后重悬菌体，将两株菌等量混合，每只小鼠注射0.1ml菌体，采用静脉感染的方式攻毒。

脏器竞争指数(CI)计数：感染后48h及72h两个时间点，分别处死鼠疫菌野生株201株组和△tyrR突变株组，每组8只小鼠。处死后分别取小鼠的肝和脾，研磨脏器并进行倍比稀释后涂板计数菌落，并计算竞争指数(competitive index,CI)。(即△tyrR敲除株/野生株菌落数比值)，数据用Student’s t-test检验，P<0.05差异显著。

鼠疫菌△tyrR和野生株和竞争试验表明：在小鼠感染48h或72h后，在肝脏或脾脏中鼠疫野生株201载菌量达到10⁷CFU，而△tyrR敲除株的载菌量很少。在脾脏中48h和72h的竞争指数(CI)分别为0.043和0.003，见图7A。而在肝脏中出现类似的结果，各自为0.017和0.005，见图7B。以上结果表明：像跟鼠疫菌许多的毒力调控子如CRP、Fur一样，鼠疫菌△tyrR敲除后在宿主体内的生存能力降低导致毒力明显下降。证实TyrR是鼠疫菌在体内感染所必需的调控子。

实施例5鼠疫菌TyrR调控的靶基因

1、RNA-seq挑鼠疫菌野生株201株和△tyrR缺失株斜面培养物接种于BHI培养基，26℃培养至对数中期，37℃继续培养3hr，用TRIzol(Invitrogen)提取总RNA，用Ambion’sDNA-free^TM kit去除RNA中的DNA污染后送美国LC公司测序。RNA测序参照(Yan Y，2013)等报道的方法，由美国LC公司构建CDNA文库并进行深度测序。RPKM用来评估鼠疫菌染色体和质粒转录水平的表达。若两个样品中覆盖度低于20的基因不予分析，最终计算△tyrR突变株和野生株mRNA表达水平的变化倍数，若变化超过2倍认为基因表达有差异。具体方法见参考文献：Yan Y.Determination of sRNA expressions by RNA-seq in Yersinia pestisgrown in vitro and during infection.PLoS One,8(9),e74495,2013。

2、Real-Time PCR验证取用于RNA测序的10μg RNA样品，先用Ambion’s DNA-free^TMkit去DNA污染再用于逆转录反应。将去DNA污染的5μg RNA，加入N6随机引物(3μg/μl)，补水至24μl，70℃作用10min，-20℃冰箱内放置5min后加入1μl RNase inhibitor(40U/μl)，1μl200U/μl SuperscriptⅢ逆转录酶等进行逆转录反应。反应条件为25℃10min，50℃1h，70℃15min终止反应，4℃保温。

定量PCR将SYBR Green I作为通用染料，在20μl定量PCR的反应体系中，加入10μlSYBR Green Realtme PCR Master Mix(2×)，0.4μM上下游引物Mix。引物序列见表2，PCR程序为95℃30s预变性后,95℃5s，56℃10s，72℃15s(三步法)，45个循环。95℃0s，65℃30s，95℃0s，绘制熔解曲线(用于判定扩增产物的特异性)，最后进行数据分析及归一。

转录组分析结果表明(见表3)：TyrR调控的基因有29个，其中11个基因上调，18个基因下调。测序结果经定量PCR验证(相关系数达到R²＝0.988)，确定TyrR调控八个靶基因，其中下调五个参与芳香族代谢的基因(aroF-tyrA,aroP,aroL和tyrP)，另外上调两个酸应答基因(hdeB和hdeD)。TyrR对抗酸基因的调控，使得鼠疫菌△tyrR敲除株在酸性条件下，对酸耐受能力下降，生存率也随之降低，更一步证实TyrR能调控鼠疫菌的抗酸性。

表3鼠疫菌TyrR调控的靶基因

注：aroF-tyrA同属一个操纵子。

实施例6TyrR调控子对鼠疫菌抗酸性的影响

1、在不同pH条件下TyrR对鼠疫菌生长的影响

将鼠疫野生株201菌、△tyrR突变株接种到TMH培养基，26℃培养48h到达平台期后1:20稀释过夜，连续传2代，最后用TMH培养基调整细菌浓度到1.0，再1:20分别接种到对应pH值是4.8、5.2、7.2的15ml TMH(每个pH条件接3个平行样)。在26℃培养箱(200r/min转速)震荡培养3、6、9、12、15、18、21、24、27h，各点采100μl培养液后加甲醛固定4℃保存最后测定OD₆₂₀，并比较鼠疫野生株201菌和△tyrR突变株生长曲线，观察在酸性条件下TyrR对鼠疫菌生长的影响。

结果发现在营养丰富的BHI培养基中，tyrR敲除后在体外不影响鼠疫菌生长，而在pH为7.2的营养限制性培养基(TMH)中，tyrR也不影响鼠疫菌的生长(见图8)，说明体外的营养条件不影响鼠疫菌的生长。但当鼠疫菌处在在pH5.2的酸性环境下，△tyrR突变株较野生株的生长速度变慢。图8结果表明：在极酸环境条件下，将TyrR调控子敲除后，鼠疫菌对酸适应性下降，从而影响鼠疫菌的生存和繁殖能力。

2、体外酸耐受试验

将WT和△tyrR接种到TMH培养基，26℃培养2天到达平台期后1:20稀释过夜，再取过夜培养物(OD₆₂₀＝1.0左右)1:20稀释，连续传1～2代，最后调整细菌浓度到OD₆₂₀为1.0，取0.1ml菌液加入到5ml pH5.0的TMH中(接种量约为5×10⁷)。以37℃孵育pH5.0静置1h后，取200μl取10^-3、10^-4涂板计数，每稀释度取4个重复。26℃培养48h后观察。

体外酸耐受试验表明：鼠疫菌在pH 5.0极酸条件刺激1h的条件下，野生株201的生存率为12.21±0.35％，而△tyrR敲除株的生存率下降为4.54±0.42％(t＝14.01,P＜0.05)，说明在pH5.0极酸条件下，△tyrR敲除株对酸耐受能力下降，生存率下降。

Real-time PCR也证实TyrR能下调抗酸蛋白hdeD和hdeB基因的表达。抗酸性是鼠疫菌适应胞内环境的毒力相关表型，TyrR能影响鼠疫菌对酸的耐受性，进一步证实TyrR调控子跟鼠疫菌抗酸性密切相关。

虽然，上文已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做出一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (3)

1.鼠疫耶尔森菌毒力调控子TyrR在调控鼠疫耶尔森菌毒力中的用途，所述鼠疫耶尔森菌毒力调控子TyrR的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.毒力调控子TyrR完全缺失的鼠疫耶尔森菌在制备鼠疫疫苗中的应用，所述毒力调控子TyrR的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.一种鼠疫耶尔森菌全菌减毒活疫苗，其特征在于，抗原中TyrR基因完全缺失，所述TyrR基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。