CN109628361B - 整合双拷贝功能性f4菌毛操纵子基因猪源益生菌ep1克隆株、构建方法及应用 - Google Patents

整合双拷贝功能性f4菌毛操纵子基因猪源益生菌ep1克隆株、构建方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及到生物技术领域，具体涉及整合双拷贝功能性F4菌毛操纵子基因猪源益生菌EP1克隆株、构建方法及应用，包括如下步骤：pTargetT‑maeB::PtetF4和pTargetT‑nth/tppB::PtetF4重组质粒的构建；通过整合双拷贝功能性F4菌毛操纵子基因的益生菌克隆株的构建，得到无抗性的双拷贝F4菌毛基因整合克隆株。该益生菌克隆株作为益生菌活疫苗候选株和仔猪断奶后腹泻和水肿病的治疗用药物。相对于现有技术，本发明的有益效果为：猪源益生菌NY10(EP1)，无抗性基因的存在；该重组菌能够有效提高对猪肠道传代上皮细胞的粘附性能；体外细胞感染抑制实验表明，预孵育重组菌和IPEC‑J2细胞可竞争抑制F4菌毛阳性大肠杆菌病原3030‑2对IPEC‑J2细胞的感染并显著降低其黏附数量。

Description

整合双拷贝功能性F4菌毛操纵子基因猪源益生菌EP1克隆株、 构建方法及应用
技术领域
本发明涉及到生物技术应用领域，具体涉及到大肠杆菌的染色体稳定遗传表达外源功能性F4菌毛蛋白。
背景技术
大肠杆菌NY10(EP1)是由本实验室上世纪50年代从腹泻严重的猪场中无腹泻猪只粪便中分离出的对猪腹泻病有很好预防作用，是一种猪源性大肠杆菌益生菌，该大肠杆菌益生菌对猪肠道有益生作用，至今并未发现对宿主有已知的不益影响，并且申请人实验室对该猪源大肠杆菌益生菌通过全基因组测序，分析验证了其益生菌的基因背景。
为了实现微生物中同源或异源蛋白或化合物的过量表达生产，大多利用质粒的过表达，这种方法易于操作和调控的表达而被广泛使用，但存在遗传不稳定性。质粒的复制，抗生素抗性基因，过量表达以及其他异源基因等问题所带来的代谢负担会导致宿主细胞耗尽，产量损失甚至导致宿主细胞原始功能丧失。此外，为了维持细菌细胞中质粒的存在，须使用抗生素或其他选择性药剂，这增加了整个生物加工的成本，同时也增加了耐药基因传播的几率。近年来，细菌染色体表达同源或异源基因在合成生物学和生物医学中越来越受青睐。
在细菌染色体组整合同源或外源的DNA基因分子，常用的分子生物学方法包括使用转座子、噬菌体、、核酸内切酶以及重组酶系统，常规的分子生物学方法在细菌染色体整合基因上具有一定的优势，但也都存在着自身的局限性，如长片段基因难以整合，效率低，脱靶率高等。本专利所使用的方法为CRISPR/cas9双质粒系统对益生菌NY10(EP1)染色体进行外源大片段DNA基因片段(F4菌毛操纵子编码基因长约8Kb)的整合。
仔猪断奶后腹泻(PWD)为养猪业临床上常见的疾病，主要病原菌为F4菌毛阳性产肠毒素大肠杆菌ETEC，通过菌毛黏附、定植易感仔猪后感染发病，导致仔猪高死亡率，体重降低，生长缓慢，药物治疗费用昂贵等。临床上防治该疾病主要运用抗生素治疗，但随着养殖业生产中耐药菌的产生和累积，急需研究新的防控措施。本专利所构建的多种重组益生菌NY10(EP1)稳定携带遗传表达F4菌毛，有望为断奶仔猪腹泻的防控提供新思路和策略。
发明内容
为了克服上述缺陷，本发明为利用益生菌NY10(EP1)无质粒克隆菌NY10(EP1)菌株染色体中非必需基因(maeB和nth/tppB)内的位点整合并稳定表达双拷贝F4(K88)菌毛，有望作为抗仔猪断奶后腹泻益生菌活性疫苗候选株。
为了实现上述发明目的，本发明所采用的技术方案为：整合双拷贝功能性F4菌毛操纵子基因猪源益生菌EP1克隆株，其特征在于，该益生菌克隆株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期为2018.7.2，保藏编号为CGMCC No.16048。
整合双拷贝功能性F4菌毛操纵子基因猪源益生菌EP1克隆株的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)pTargetT-maeB::PtetF4和pTargetT-nth/tppB::PtetF4重组质粒的构建；
2)通过整合双拷贝功能性F4菌毛操纵子基因的益生菌克隆株的构建，得到无抗性的双拷贝F4菌毛基因整合克隆株。
步骤1)具体为：所用的引物及含有PAM的N20序列如表2，表3所示。用
Figure GDA0001977016020000021
超高保真DNA聚合酶(Vazyme,P501)进行PCR扩增反应。利用pB032-X/pB033扩增引物从pTargetF质粒DNA模板中反向PCR扩增含有靶标位点X的N20序列的pTargetF-X线性化片段，随后对所得的线性化片段环化得到第一环化产物，第一环化产物转化入感受态细胞DH5α中以构建pTargetT-X重组质粒(maeB和nth/tppB位点各对应一个重组质粒)；XupsteamHA-F/XupsteamHA-R和XdownsteamHA-F/XdownsteamHA-R扩增引物来从Nissle1917基因组模板中扩增靶标位点的上游同源臂和下游同源臂；ptetFWD/ptetF4REV-X扩增引物用于从pBR322-F4DNA模板中扩增带有Ptet启动子的F4菌毛操纵子基因；IPCRpTargetF-F(HindIII)/IPCRpTargetF-R(PstI)用来线性化pTargetT-X质粒；使用
Figure GDA0001977016020000022
MultiS一步克隆试剂盒将靶标位点上下游同源臂、含Ptet启动子的F4菌毛操纵子基因片段、线性化的pTargetT-X片段一起环化得到第二环化产物；第二环化产物随后转化进感受态细胞DH5α中以构建pTargetT-X::PtetF4系列重组质粒；X代表EP1染色体上特定基因的靶标位点，特定基因包括maeB和nth/tppB；第二环化产物中，上述四个片段的环化连接排列的顺序为：靶标位点上游同源臂片段、含ptet启动子的F4菌毛操纵子片段、靶标位点下游同源臂片段、线性化的pTargetT-X片段。
步骤2)具体为：pCas质粒电转化入益生菌EP1中以构建EP1/pCas重组菌株；制备EP1/pCas感受态(在第一轮待插入maeB位点时选择EP1/pCas感受态；而第二轮开始，制备插入了maeB位点的EP1/pCas感受态以使得第二轮再插入nth/tppB位点)，取EP1/pCas感受态细胞(此为第一轮所用的感受态细胞，第二轮，此感受态细胞替换为已经插入了maeB位点的EP1/pCas感受态细胞)与pTargetT-X::PtetF18重组质粒(X表示maeB和nth/tppB位点)混合，对感受态细胞和pTargetT-X::PtetF4重组质粒组成的混合物进行电转化，电击产物置于冰冻的LB培养基孵育，之后于30℃摇床复苏，涂布于含卡那霉素和壮观霉素的LB平板中于30℃培养过夜；挑取抗性平板上生长的可疑阳性克隆株病利用菌落PCR鉴定，若出现大于8000bp的条带，则证明整合成功，测序并确定是否获得了阳性整合株；使用IPTG诱导切割pTargetT-X::PtetF4质粒复制起始位点pMB1，消除pTargetT-X::PtetF4质粒，同时消除壮观霉素sp+抗性，而后进行下一轮(下一位点)的整合插入试验。当上述两个位点都已整合重组完毕后，去除最后一轮的pTargetT-X::PtetF4质粒后，最终于42℃传代培养消除pCas质粒(温度敏感性质粒)，直至该重组菌丢失卡那霉素Kan+抗性，筛选出无抗性四拷贝整合F4菌毛操纵子基因的重组菌株。即先电转化入pTargetT-maeB::PtetF18重组质粒，再去除该重组质粒；再电转化入pTargetT-nth/tppB::PtetF18重组质粒，再去除该质粒，最后去除pCas质粒。
本发明还提供上述的构建方法得到的整合双拷贝功能性F4菌毛操纵子基因表达展示猪源益生菌克隆株菌体表面。整合双拷贝功能性F4菌毛操纵子基因表达展示猪源益生菌克隆株作为猪源益生菌活疫苗候选株的应用。整合双拷贝功能性F4菌毛操纵子基因的猪源益生菌克隆株菌体表面作为仔猪断奶后腹泻和水肿病的预防治疗用生物制剂。
一种大肠杆菌染色体基因组整合插入功能性大片段外源基因的生物学技术，对宿主菌基因组无任何抗性遗传修饰。其外源基因片段于益生菌NY10(EP1)细菌染色体基因组的两个非必需基因X(maeB和nth/tppB)位点内插入的生物学技术，是基于使用CRISPR/cas9双质粒系统的基因编辑技术。CRISPR/cas9双质粒系统中的一个重组质粒pTargetT-X::PtetF4构建的生物学技术，基于使用高保真PCR扩增DNA聚合酶，质粒环化，线性化和多片段拼接克隆DNA重组技术将CRISPR/cas9系统质粒pTargetT质粒构建成重组质粒pTargetT-X::PtetF4。
该重组质粒，保留pTargetT质粒的基本特性，包括壮观霉素抗性筛选标签aadA基因，复制起始位点pMB1，调控转录的合成启动子pJ23119和sgRNA特征序列等特性。该重组质粒，其特征在于重组质粒同时携带能介导cas9蛋白切割靶标位点的N20-X-sgRNA与两侧带有插入位点同源臂的F4操纵子基因序列。EP1/pCas重组菌导入重组质粒pTargetT-X::PtetF4后，在L-阿拉伯糖诱导的pCas质粒上的Gam，Bet和Exo三种酶的活性作用和抗性选择压力的存在下，实施同源重组而获得整合进F4操纵子基因的NY10(EP1)重组菌株。使用IPTG诱导切割pTargetT-F4质粒复制起始位点pMB1，消除pTargetT-X::PtetF4质粒，从而消除壮观霉素sp+抗性，而后进行下一轮(下一靶向位点)的整合插入试验。当上述两个位点都已整合重组完毕后，去除最后一轮的pTargetT-X::PtetF4质粒后，最终于42℃传代培养消除pCas质粒(温度敏感性质粒)，直至该重组菌丢失卡那霉素Kan+抗性，获得无抗性双拷贝整合F4菌毛操纵子的重组菌株。
本发明利用CRISPR/cas9双质粒系统具有高效编辑细菌基因组(包括整合插入，敲除，点突变)的特性，且该CRISPR/cas9双质粒系统具有自身质粒去除简便和不残留抗性基因的机制。完成构建大肠杆菌益生菌NY10(EP1)稳定携带双拷贝F4菌毛操纵子基因并稳定遗传表达F4菌毛，并不影响宿主菌NY10(EP1)的自身生物学性状，该整合重组菌株制备有望成为构建抗F4+菌株引起的仔猪断奶后腹泻益生菌活疫苗候选株的方法，实现新型益生菌活疫苗候选株的制备。
相对于现有技术，本发明的有益效果为：1、不引入新的外源质粒，无抗性基因的存在。2、该重组菌不存在需使用抗生素才能长期维持外源基因的表达。3、经多次传代，仍稳定持久遗传菌体表面表达展示外源菌毛蛋白(F4菌毛)。4、多功能重组益生菌候选株的成功构建不会对该益生菌宿主菌已知的如生长性能等生物学特性。5、相对于亲本株，该重组整合菌能够有效提高对肠道上皮细胞(IPEC-J2)的粘附性能。6、体外预孵育重组整合菌于IPEC-J2细胞可竞争抑制F4菌毛阳性大肠杆菌病原3030-2对IPEC-J2细胞的感染并显著降低其黏附数量。
附图说明
图1为双拷贝F4菌毛益生菌NY10(EP1)整合重组菌株的构建过程大致示意图解；
图2为双拷贝F4操纵子基因整合菌体外粘附实验结果图；
EP1:Escherichia coli EP1,DCF4IS:Double Copies of F4IntegrationStrain,EP1ΔmaeB::PtetF4Δnth/tppB::PtetF4；
该图表明相对于EP菌株，整合菌对猪源肠道细胞的粘附能力的百分比变化情况，图所用的细胞为IPEC-J2细胞，所用ETEC细菌为F4阳性大肠杆菌3030-2；
图3为体外细胞感染实验结果；
EP1:Escherichia coli EP1,DCF4IS:Double Copies of F4IntegrationStrain,EP1ΔmaeB::PtetF4Δnth/tppB::PtetF4；
将NY10(EP1)，NY10(EP1)和DCF4IS分别预孵育IPEC-J2细胞30分钟，而后孵育致病菌F4阳性大肠杆菌病原3030-2株30分钟，验证重组整合重组菌株对F4+ETEC对猪源肠道细胞的竞争抑制粘附百分比变化情况；
该图表明相比于直接孵育3030-2株，预先对于IPEC-J2细胞孵育重组整合株30min后孵育3030-2致病菌30min，重组整合株可竞争抑制3030-2对IPEC-J2细胞的粘附并显著降低其对于IPEC-J2的黏附数量；
本发明的益生菌克隆株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期为2018.7.2，保藏编号为CGMCC No.16048；分类命名为大肠埃希式菌Escherichia coli。
具体实施方式
以下通过具体实施例对本发明作进一步详细说明。
NY10(EP1)为本实验室分离保存的非致病性的大肠杆菌益生菌，并且对其通过全基因组测序验证，大肠杆菌NY10(EP1)是一株无致病性，能给予猪只肠道健康益处，并无发现对猪有已知的害处影响。
本试验利用益生菌NY10(EP1)为疫苗载体构建稳定表达F4菌毛的重组益生菌，以此作为日常饲料添加剂免疫仔猪以防控仔猪断奶后腹泻(PWD)。该F4菌毛整合益生菌能够特异性的结合到猪肠道细胞的F4菌毛受体上，优先占据受体位点，并诱导抗F4大肠杆菌病原的粘膜免疫，从而阻断F4+ETEC对仔猪肠道的粘附，旨在高效直接预防仔猪断奶后腹泻的作用。
1、pTargetT-X::PtetF4F4重组质粒的构建
所用的引物及含有PAM的N20序列如表2，表3所示。用
Figure GDA0001977016020000051
超高保真DNA聚合酶(Vazyme,P501)进行PCR反应(反应体系及反应程序如表1)。
表1质粒构建时的PCR扩增反应体系
Figure GDA0001977016020000061
其中PCR循环参数为：95℃预变性2min；95℃变性10sec，45℃～72℃(根据不同引物而定)退火30sec，72℃延伸25sec/kb(根据不同PCR产物长度而定)，35个循环，72℃最后延伸10min。PCR反应结束后，产物通过1.0％～1.5％浓度(视扩增出来的产物片段长度而定)的琼脂糖凝胶电泳后切胶回收纯化对应的PCR产物进行下一步的试验。
本申请书上，X代表EP1染色体上的靶标位点，即在靶基因maeB和nth/tppB。
首先，利用pB032-X/pB033引物从pTargetF质粒DNA模板中反向PCR扩增含有靶标位点X的N20序列的pTargetF-X线性化片段(PCR反应体系和PCR循环参数如上述表1所示进行)，随后所得的线性化片段利用
Figure GDA0001977016020000062
Ⅱ一步克隆试剂盒(Vazyme,C112)环化PCR产物,转化进感受态细胞DH5α中以构建pTargetT-X重组质粒。XupsteamHA-F/XupsteamHA-R和XdownsteamHA-F/XdownsteamHA-R扩增引物用来从EP1基因组中扩增靶标位点的上游同源臂和下游同源臂(PCR反应体系和PCR循环参数如上述表1所示进行)。PtetFWD/PtetF4REV-X用于从pBR322F4中扩增带有Ptet启动子的F4菌毛操纵子基因(PCR反应体系和PCR循环参数如上述表1所示进行)。IPCRpTargetF-F(HindIII)/IPCRpTargetF-R(PstI)用来线性化pTargetT-X(PCR反应体系和PCR循环参数如上述表1所示进行)。使用
Figure GDA0001977016020000063
MultiS一步克隆试剂盒(Vazyme,C113)将上述四段PCR产物片段进行环化，包括靶标位点上下游同源臂，含ptet启动子的F4菌毛操纵子片段，线性化的pTargetT-X片段。随后转化进感受态细胞DH5α中以构建pTargetT-X::PtetF4系列重组质粒。
2、双拷贝F4菌毛益生菌EP1整合株的构建
整合株构建的过程参见附图1图解。pCas质粒电转化进EP中构建EP/pCas重组菌株。制备EP/pCas感受态时,10mM终浓度的L-阿拉伯糖加入其中以助于后期λ-Red同源重组的诱导。取50μl感受态细胞与约100ng pTargetT-X::PtetF4系列DNA混合；混合物放于0.1-cm的电极杯(Bio-Rad)中1.8kV进行电转化，点击产物置于1.5ml指形管并加入1ml冰冻的LB培养基孵育约5min，之后于30℃摇床复苏1小时，随后涂布于含卡那霉素(50mg/liter)和壮观霉素(50mg/liter)的LB平板中于30℃培养过夜。挑取抗性平板上的克隆株利用菌落PCR鉴定(鉴定引物为YZptetF4Xup-F/YZptetF4Xup-R和YZptetF4Xdown-F/YZptetF4Xdown-R，上述两队引物PCR结果若有阳性条带，则证明整合成功；外加一对鉴定引物，YZptetF4Xup-F/YZptetF4Xdown-R，该引物PCR产物若只有约600bp，则证明整合失败，若有大于8000bp的条带，则证明整合成功)，随后选取阳性整合株送测序再次鉴定。
在获得阳性整合株后，须去除抗性质粒。将含有pCas和pTargetT-X::Ptet/F4质粒的EP菌株至于约5ml含卡那霉素(50mg/liter)和IPTG(0.5mM)的LB培养基中30℃摇床中培养长于14小时，之后挑取小许菌液于含卡那霉素(50mg/liter)的LB平板上划线，得出的单菌落于壮观霉素(50mg/liter)LB平板上划线以验证其对壮观霉素的敏感性，以证明去除了pTargetT-X::PtetF4质粒。去除pTargetT-X::PtetF4质粒后，再进行下一轮(另外一个位点)的整合重组反应，当完成两个位点的整合插入重组反应后，最后须对pCas质粒进行去除，将该克隆株至于无抗性的LB培养基中于42℃中传代，直到最终得到无抗性的双拷贝F4菌毛基因整合克隆株。
表2中引物从上至下为SEQ ID No.1-24。表3中引物从上至下为SEQ ID No.25-26。
表2本试验所用引物
Figure GDA0001977016020000071
Figure GDA0001977016020000081
备注：X代表NY10(EP1)染色体上的靶标位点，如maeB，nth/tppB。
表3该试验所用的NY10(EP1)染色体上靶标位点序列外加PAM三碱基
Figure GDA0001977016020000082
图2为双拷贝整合重组菌DCF4IS体外粘附实验结果图。该图表明相对于EP1菌株，双拷贝整合菌DCF4IS对猪源肠道传代上皮细胞的粘附能力的百分比变化情况，所用的细胞为IPEC-J2细胞。从图2可知，重组益生菌对猪源肠道传代上皮细胞IPEC-J2的粘附能力有显著性的提高(174.46％)，进一步证明该重组菌能够表面功能性表达并展示F4菌毛。图2中，EP1的粘附指数设定为100％。数据表示为三次重复实验的平均值的标准误差(SEM)。EP1:Escherichia coli EP1,DCF4IS:Double Copies of F4Integration Strain,EP1ΔmaeB::PtetF4Δnth/tppB::PtetF4。
图3为体外细胞感染实验结果。将NY10(EP1)，NY10(EP1)和DCF4IS分别预孵育IPEC-J2细胞30分钟，而后孵育致病菌F4阳性大肠杆菌病原3030-2株30分钟，验证重组整合重组菌株对F4+ETEC对猪源肠道细胞的竞争抑制粘附百分比变化情况。该图表明相比于直接孵育3030-2株，预先对于IPEC-J2细胞孵育重组整合株30min后孵育3030-2致病菌30min，重组整合株可竞争抑制3030-2对IPEC-J2细胞的粘附并显著降低其对于IPEC-J2的黏附数量。EP1:Escherichia coli EP1,DCF4IS:Double Copies of F4Integration Strain,EP1ΔmaeB::PtetF4Δnth/tppB::PtetF4。图3中，F4阳性大肠杆菌病原3030-2株的粘附指数设定为100％，而孵育EP1和重组菌DCF4IS后致病菌3030-2对IPEC-J2细胞的粘附百分比分别为83.53％和21.34％。
本发明建立在猪源大肠杆菌益生菌NY10(EP1)细菌基因组序列背景清晰的基础上，选择其基因组上两个非必需基因X(maeB和nth/tppB)内的位点作为F4菌毛操纵子基因插入的位点，使用CRISPR/cas9双质粒系统构建含大肠杆菌F4菌毛操纵子基因，其两侧带有插入位点同源臂的CRISPR/cas9重组质粒pTargetT-X::PtetF4。进一步将重组质粒pTargetT-X::PtetF4转化入表达cas9蛋白的重组菌NY10(EP1)/pCas，鉴于pCas质粒上表达cas9蛋白，结合重组质粒pTargetT-X::PtetF4上的利用sgRNA靶向指导cas9切割酶特异性切割靶标位点和同源重组酶(Gam、Exo、Bet)活性作用，以导入的同源片段为模板实施同源重组，完成F4(又称K88)菌毛操纵子基因整合进NY10(EP1)基因组对应的位点。而后使用IPTG诱导启动pCas质粒上IPTG诱导依赖性启动子(Ptrc)，从而启动Ptrc启动子下游的靶向于pTargetT-X::PtetF4质粒上的pMB1复制子的sgRNA(sgRNApMB1)，高效切割pTargetT质粒上复制起始位点(pMB1)，从而消除上一轮的pTargetT-X::PtetF4质粒，同时消除壮观霉素抗生素筛选标志，最后，在完成两轮的整合同源重组后，在42℃培养，消除温度敏感性pCas质粒，且最终获得不含任何抗生素抗性基因且表达F4菌毛的重组菌NY10(EP1)大肠杆菌。本方法所构建的重组菌株通过无抗性培养基多代(至少30代)连续培养后，凝集实验验证重组菌能凝集抗F4菌毛多抗血清，生长周期曲线与亲本株一致，且该方法不会影响宿主菌已知的如生长速度等生物学特性。通过体外细胞粘附实验该双拷贝F4操纵子基因整合重组菌能够有效提高其对肠道上皮细胞(IPEC-J2)的粘附性能，体外细胞感染抑制实验表明，预孵育重组菌和IPEC-J2细胞可竞争抑制F4阳性大肠杆菌病原3030-2对IPEC-J2细胞的感染并显著降低其黏附数量，该重组整合菌株制备有望成为构建抗仔猪断奶后腹泻益生菌活疫苗候选株的方法。
以上显示描述了本发明的基本原理、主要特征以及优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落进要求保护本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
序列表
<110> 扬州大学
<120> 整合双拷贝功能性F4菌毛操纵子基因猪源益生菌EP1克隆株、构建方法及应用
<130> xhx2018112603
<141> 2018-11-26
<160> 26
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 60
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 1
agtcctaggt ataatactag tacgcgcgcc tcttcccctt cgttttagag ctagaaatag 60
<210> 2
<211> 60
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 2
agtcctaggt ataatactag tatattactg gaacaacata agttttagag ctagaaatag 60
<210> 3
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<212> DNA
<213> Escherichia coli
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<212> DNA
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gacgtctaag aaaccattat tatca 25
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ttctctagag tcgacctgca gatggcccgt gcgccaatga tc 42
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<213> Escherichia coli
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ataatggttt cttagacgtc gcgcttcggc gctttgcgag c 41
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cagggtaata gatctaagct ttaccaaaac gacgaacagt tt 42
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<212> DNA
<213> Escherichia coli
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gttaccagtt cctgagtggc tcagaaatac accaccaccg gtgtc 45
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ttctctagag tcgacctgca gttcgccgcc aaaaaaggtc cg 42
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ataatggttt cttagacgtc ttcgccgtcg ccttattaac a 41
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cagggtaata gatctaagct tcgtgtgtaa atttaaatga tt 42
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ctgcaggtcg actctagaga a 21
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gcagcttcca tgttcggcat 20
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cactggacgc ccgccgagat 20
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cgcagagcaa ccctgaaccg 20
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<213> Escherichia coli
<400> 26
atattactgg aacaacataa tgg 23

Claims (3)

1.整合双拷贝功能性F4菌毛操纵子基因猪源益生菌EP1克隆株，其特征在于，该益生菌克隆株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期为2018.7.2，保藏编号为CGMCC No.16048。
2.权利要求1所述的整合双拷贝功能性F4菌毛操纵子基因猪源益生菌EP1克隆株在制备益生菌活疫苗候选株的应用。
3.权利要求1所述的整合双拷贝功能性F4菌毛操纵子基因猪源益生菌EP1克隆株在制备仔猪断奶后腹泻和水肿病的治疗用药物中的应用。
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