CN110591994B - 一种基于氢氧化钠刺激的哈维弧菌同源重组基因敲除的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于氢氧化钠刺激的哈维弧菌同源重组基因敲除的方法。将哈维弧菌作为受体菌，与供体菌进行接合转移，经同源重组实行哈维弧菌的基因敲除，所述的哈维弧菌是经过氢氧化钠刺激处理的哈维弧菌。本发明基于氢氧化钠刺激的哈维弧菌同源重组基因敲除的方法，该方法在传统的接合转移法的技术基础上，通过对接合受体菌哈维弧菌进行氢氧化钠刺激处理，使得哈维弧菌的接合转化效率从无到有，发生质变，并对其加以应用，成功进行哈维弧菌同源重组基因敲除，这对未来哈维弧菌基因工程改造，研究其致病机制等，具有十分重要的意义。

Description

一种基于氢氧化钠刺激的哈维弧菌同源重组基因敲除的方法

技术领域

本发明属于微生物领域，具体涉及一种基于氢氧化钠刺激的哈维弧菌同源重组基因敲除的方法。

背景技术

哈维弧菌(Vibrio harveyi)是海水养殖动物的重要条件致病菌，其可通过口或伤口感染，致使伤口肌肉溃烂化脓以及内脏器官的严重病变而导致鱼的死亡，给海水养殖业造成巨大的经济损失。在近几年对我国南方养殖海水鱼病害调查中发现，海水鱼类弧菌病约90％为哈维弧菌所致，哈维弧菌的危害范围和程度已逐渐取代了溶藻弧菌和创伤弧菌，成为主要的病原弧菌。因此，阐明哈维弧菌致病机制对于深入解析其感染致病途径，发掘新的疾病控制技术手段有着重要的意义。

致病机制研究通常涉及基因敲除、基因回补以及基因过表达等基因工程操作，而这些方法通常通过基因接合转移法进行。目前，对于哈维弧菌的基因敲除工作，Teo JW、Bassler BL、Rattanama P等大多数研究者采用转座突变，转座突变的优点是可以对基因组上的任意基因位点进行随机突变，但是其缺点是具有随机性、工作量大、不能定向突变某一确定基因，并且易产生极性效应。传统的操作方法更多使用大肠杆菌宿主细菌携带外源基因，通过其与受体菌细胞的接合转移从而实现外源载体进入细胞内，该方法具有定向突变且不易产生极性效应等优点。但是在对转化子的筛选中，发现这种直接转移的方法通常在哈维弧菌中转移成功率极低甚至不能成功转移。

发明内容

本发明针对因哈维弧菌的接合转化不成功从而难以进行基因敲除的难题，通过对接合受体菌哈维弧菌进行氢氧化钠处理，使得哈维弧菌的接合转化效率从无到有，成功对哈维弧菌进行基因敲除，从而建立了一种提高哈维弧菌遗传转化的方法和基于氢氧化钠刺激的哈维弧菌同源重组基因敲除的方法。

本发明的第一个目的是提供一种提高哈维弧菌遗传转化的方法，其是将哈维弧菌经过氢氧化钠刺激处理后再用于遗传转化的受体菌。

所述的哈维弧菌是对数生长期早期的哈维弧菌。

所述的经过氢氧化钠刺激处理是在含有哈维弧菌的培养液中加入氢氧化钠进行刺激。

所述在含有哈维弧菌的培养液中加入氢氧化钠进行刺激，氢氧化钠的终浓度为0.01M以上，优选为0.02M或0.04～0.05M，刺激处理5～20min。

本发明的第二个目的是提供一种基于氢氧化钠刺激的哈维弧菌同源重组基因敲除的方法，将哈维弧菌作为受体菌，与供体菌进行结合转移，经同源重组实行哈维弧菌的基因敲除，其特征在于，所述的哈维弧菌是经过氢氧化钠刺激处理的哈维弧菌。

优选，是将培养至对数早期的哈维弧菌受体菌经氢氧化钠刺激处理后，用新鲜培养基洗涤后与培养至对数生长期早期的供体菌进行混匀，离心去上清，菌沉淀后重悬，点种至固体平板上，接合过夜，对哈维弧菌进行基因敲除。通过对接合受体菌哈维弧菌进行氢氧化钠刺激处理，使得哈维弧菌的接合转化效率从无到有，从而对哈维弧菌进行基因敲除。

所述的经过氢氧化钠刺激处理是在含有哈维弧菌的培养液中加入氢氧化钠进行刺激。

所述在含有哈维弧菌的培养液中加入氢氧化钠进行刺激，氢氧化钠的终浓度为0.01M以上，优选为0.04～0.05M，刺激处理5～20min。

所述的结合转移是在28℃接合过夜。

所述的供体菌优选为携带有待缺失片段上下游同源臂的重组自杀质粒的供体菌。

本发明具有以下优点：

(1)本发明基于氢氧化钠刺激的哈维弧菌同源重组基因敲除的方法，该方法在传统的接合转移法的技术基础上，通过对接合受体菌哈维弧菌进行氢氧化钠刺激处理，使得哈维弧菌的接合转化效率从无到有，发生质变，并对其加以应用，成功进行哈维弧菌同源重组基因敲除，这对未来哈维弧菌基因工程改造，研究其致病机制等，具有十分重要的意义。

(2)本发明基于两次同源重组原理进行哈维弧菌的基因敲除，操作简单，在接合转化过程对受体菌进行氢氧化钠刺激处理，使得接合转化效率从无到有，发生质变，开辟了哈维弧菌同源重组基因敲除平台，同时，该方法不同于传统的转座插入突变，该方法目的明确，不易产生极性效应，且不引入外源基因，使对目的基因的功能分析更为准确。

附图说明

图1为实施例2中以hsdM(CU052_17245)为例的哈维弧菌基于氢氧化钠处理的基因敲除流程图；

图2为实施例2中hsdM(CU052_17245)上下游同源臂的电泳检测结果图，其中泳道M为DL2000 DNA marker，泳道1为hsdM(CU052_17245)上游同源臂扩增结果，泳道2为hsdM(CU052_17245)下游同源臂扩增结果；

图3为实施例2中pSW7848线性化片段的电泳检测结果图，其中泳道M为DL10000DNAmarker，泳道1为pSW7848线性化扩增结果；

图4为实施例2中重组子电泳检测结果图，其中泳道M为DL10000 DNA marker，泳道1为重组子PCR检测结果；

图5为实施例2中哈维弧菌hsdM(CU052_17245)突变株电泳检测结果图，其中泳道M为DL5000 DNA marker，泳道1为野生株PCR检测结果，泳道2为突变株扩增结果。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步阐述，但本发明所保护范围不限于此。

生物材料来源：

本发明所述重组子中间宿主E.coli Π3813(其可编码pir蛋白，且为2’-Deoxythymidine(Thy)营养缺陷型)及自杀质粒pSW7848(为低拷贝质粒，携带氯霉素抗性，具有需要pir蛋白的R6K复制起始点，转移起始点oriT，以及受阿拉伯糖诱导的毒性基因ccdB)来自法国国家科学研究院巴斯德研究所Didier Mazel教授馈赠，供体菌E.coliGEB883(其可编码pir蛋白，且为2,6-Diaminopimelic acid(DAP)营养缺陷型，并且可编码RP4，用于接合转移)来自巴黎十一大学Annick JACQ教授馈赠；具有氯霉素抗性的表达质粒pSCT32由青岛农业大学陈师勇教授赠送；

(1)E.coli Π3813的来源参见文献:Le Roux,F.,Binesse,J.,Saulnier D,MazelD.,2007.Construction of a Vibrio splendidus mutant lacking themetalloprotease gene vsm by use of a novel counterselectable suicidevector.Appl Environ Microbiol.73,777-784.

(2)自杀质粒pSW7848的来源参见文献:Val,M-E.,Skovgaard,O.,Ducos-Galand,M.,Bland,M.J.,Mazel,D.,2012.Genome engineering in Vibrio cholerae:a feasibleapproach to address biological issues.PLoS Genet.8,e1002472.

(3)E.coli GEB883的来源参见文献:Nguyen,A.N.,Disconzi,E.,Charrière,G.M.,Destoumieux-Garzón,D.,Bouloc,P.,Le Roux,F.,Jacq,A.,2018.csrB geneduplication drives the evolution of redundant regulatory pathways controllingexpression of the major toxic secreted metalloproteases in Vibriotasmaniensis LGP32.mSphere.3,e00582-00518.

(4)表达质粒pSCT32的来源参见文献:Zhang,Y.J.,Chen,G.,Lin,H.,Wang,P.,Kuang,B.,Liu,J.,Chen,S.,2017.Development of a regulatable expression systemfor the functional study of Vibrio vulnificus essential genes.Antonie vanLeeuwenhoek,110(4),607-614.

同源臂及质粒线性化扩增所用DNA聚合酶为Takara公司的高保真酶PrimeMax DNA Polymerase，重组子及突变检测用DNA聚合酶为Takara公司的Premix Taq^TMDNAPolymerase；细菌基因组和质粒提取试剂盒购自天根生化科技有限公司；胶回收试剂盒购自Axygen公司；无缝克隆试剂盒购自南京诺唯赞生物科技有限公司。

以下实施例用到的培养基具体如下：

所述的配置添加有20μg/mL氯霉素和0.3mM DAP(2,6-Diaminopimelic acid)的LB固体平板是含有酵母提取物5g/L、蛋白胨10g/L、NaCl 10g/L、琼脂粉15g/L、溶剂为水，将各组分按其含量混合均匀，灭菌，然后再加入20μg/mL氯霉素(终浓度)以及0.3mM DAP(终浓度)。

所述的添加有20μg/mL氯霉素和0.3mM DAP的LB液体培养基是含有酵母提取物5g/L、蛋白胨10g/L、NaCl 10g/L、溶剂为水，将各组分按其含量混合均匀，灭菌，然后再加入20μg/mL氯霉素(终浓度)以及0.3mM DAP(终浓度)。

所述的配置LBS固体平板是含有酵母提取物5g/L、蛋白胨10g/L、NaCl 30g/L、琼脂粉15g/L，其余为水，其配制方法是将各组分按其含量混合均匀，灭菌即得。

所述的LBS液体培养基是含有酵母提取物5g/L、蛋白胨10g/L、NaCl 30g/L，其余为水，其配制方法是将各组分按其含量混合均匀，灭菌即得；

所述的LBS+0.3mM DAP固体平板中是含有酵母提取物5g/L、蛋白胨10g/L、NaCl30g/L、琼脂粉15g/L，溶剂为水，将各组分按其含量混合均匀，灭菌，然后再加入DAP，使其终浓度为0.3mM DAP。

所述的LBS+34μg/mL Cm+0.2％D-glμcose固体平板中是含有酵母提取物5g/L、蛋白胨10g/L、NaCl 30g/L、琼脂粉15g/L、溶剂为水，将各组分按其含量混合均匀，灭菌，然后再加入34μg/ml氯霉素(终浓度)以及0.2％D-glμcose(终浓度，质量分数)。

所述的LBS+0.2％arabinose固体平板中含有酵母提取物5g/L、蛋白胨10g/L、NaCl30g/L、琼脂粉15g/L，溶剂为水，将各组分按其含量混合均匀，灭菌，然后再加入0.2％arabinose(终浓度，质量分数)。

所述的LBS+34μg/mL Cm+0.2％arabinose固体平板中是含有酵母提取物5g/L、蛋白胨10g/L、NaCl 30g/L、琼脂粉15g/L、溶剂为水，将各组分按其含量混合均匀，灭菌，然后再加入34μg/mL氯霉素以及0.2％arabinose(终浓度，质量分数)。

一般性说明：

一、大肠杆菌E.coli Π3813或者E.coli GEB883感受态细胞的制备

(1)E.coli Π3813或者E.coli GEB883划线至添加0.3mM Thy或者0.3mM DAP的LB固体平板上，于37℃培养过夜；

(2)挑取E.coli Π3813或者E.coli GEB883单克隆至添加0.3mM Thy或者0.3mMDAP的LB液体培养基中，于37℃、200rpm培养过夜；

(3)1mL过夜菌液稀释至100mL添加0.3mM Thy或者0.3mM DAP的LB液体培养基，于37℃、200rpm培养至OD600nm＝0.6～0.8；

(4)菌液置于冰上冷却10min，于4℃，4000rpm离心15min；

(5)去上清，菌沉淀用50mL灭菌冷却的50mM的CaCl₂重悬，置于冰上20min；

(6)菌液于4℃，4000rpm离心15min；

(7)去上清，菌沉淀用2.5mL灭菌冷却的含有25％甘油的50mM的CaCl₂重悬；

(8)重悬的细胞用灭菌的1.5mL离心管分装100μL/管，置于-80℃，待用，由此得到大肠杆菌E.coli Π3813或者E.coli GEB883感受态细胞。

二、等温组装液(见实施例2的步骤(4))或者阳性重组质粒(实施例2的阳性重组质粒pSW7848-△hsdM)转化入大肠杆菌E.coli Π3813或者E.coli GEB883感受态细胞以及表达质粒pSCT32转化入大肠杆菌E.coli GEB883感受态细胞

(1)取100μL E.coli Π3813或者E.coli GEB883感受态细胞于冰上融化；

(2)5.0μL等温组装液或阳性重组质粒或表达质粒pSCT32加入到100μL感受态细胞中，轻柔混匀，冰上孵育20min；

(3)42℃热击2min，立即置于冰上孵育2min；

(4)加入1mL添加0.3mM Thy或者0.3mM DAP的LB液体培养基，于37℃、150rpm振摇培养1h；

(5)取100μL菌液涂布在添加有20μg/mL氯霉素和0.3mM Thy或者0.3mM DAP的LB固体平板上，37℃倒置培养过夜，直至克隆长出；

(6)用牙签挑取单克隆培养至添加有20μg/mL氯霉素和0.3mMThy或者0.3mM DAP的LB液体培养基中，待菌体长出后，PCR检测，并用灭菌的15％的甘油冻存阳性克隆在灭菌冻存管中，-80℃保存待用。

实施例1

对对数早期受体菌菌液进行不同氢氧化钠浓度以及不同时间的刺激处理，说明氢氧化钠刺激对哈维弧菌接合转移效率的提高(表1)。

一、供体菌E.coli GEB883的制备

(1)将保存在甘油中的含有表达质粒pSCT32的E.coli GEB883划线于含20μg/mL氯霉素和0.3mM DAP的LB固体平板上，37℃过夜培养；

(2)挑取(1)中活化菌体所形成的单克隆菌落，接种于添加有20μg/mL氯霉素和0.3mM DAP的LB液体培养基中，37℃、200rpm培养至对数早期OD600nm＝0.3～0.7；

二、受体菌哈维弧菌的制备

(1)配置LBS固体平板，对哈维弧菌进行28℃下过夜培养活化；

(2)挑取(1)中活化菌体所形成的单克隆菌落，接种于LBS液体培养基中，28℃、200rpm培养至对数生长期早期OD600nm＝0.3～0.7，由此得到哈维弧菌受体菌；

三、受体菌哈维弧菌氢氧化钠刺激处理

(1)将步骤二中准备好的受体菌菌液用1.5mL无菌离心管分装500μL每管，共分装21管；

(2)向各500μL对数早期(OD600nm＝0.3～0.7)的受体菌菌液中分别加入1μL、2μL、3μL、4μL和5μL初始浓度为5M的氢氧化钠，使得氢氧化钠终浓度分别为0.01M、0.02M、0.03M、0.04M和0.05M；

(3)每个氢氧化钠浓度均分别刺激5min、10min、15min和20min，并设置不刺激的一组作为刺激0min的对照组，刺激处理后受体菌用新鲜的LBS液体培养基洗涤2次，于6000rpm、室温离心3min。

四、细菌接合转化体系

(1)将步骤三中氢氧化钠刺激处理并洗涤后的各受体菌分别与500μL供体菌混匀，于6,000rpm、室温离心3min；

(2)去上清后，菌沉淀用50μL LBS液体培养基重悬，点种到LBS+0.3mM DAP固体平板，于28℃培养过夜；

(3)用接菌环刮取接合菌斑，重悬于1mL LBS液体培养基中；

(4)11,000g、2min离心，去上清，菌体沉淀用1mL LBS液体培养基重悬，重复此步骤一次；

(5)菌体用100μL LBS新鲜培养基重悬后涂布于添加34μg/mL氯霉素的LBS固体平板中用于计数接合转化成功克隆数(表1)。结果表明，受体菌哈维弧菌不进行氢氧化钠刺激处理，不能成功接合；经过不同浓度和不同时间的氢氧化钠处理后，接合子数量从无到有，发生质变，并且同一刺激时间，随着刺激浓度的增加，接合子数量呈现增加的趋势，最高可达1464个。随机挑取氯霉素平板上的接合子，用pSCT32质粒的特异性引物，pSCT32 over-check-F：CTGCATAATTCGTGTCGCTCAAGG；pSCT32 over-check-R：CCTTGGAGCCGTACTGGAACTG，进行菌落PCR鉴定，阳性率均为100％，说明过表达质粒pSCT32成功转移到哈维弧菌345中。

表1 V.harveyi345菌株氢氧化钠刺激前后的接合子统计

‘-代表没有进行检测。

实施例2

针对实施例1的结果，以基因hsdM(type I restriction enzyme,M subunit)为例说明一种基于氢氧化钠刺激方法对哈维弧菌实现同源重组基因敲除的步骤(具体操作流程如图1所示)。

hsdM基因(其核苷酸序列如SEQ ID NO.1的第798位到第2717位碱基)ORF全长1920bp，可编码639个氨基酸组成的I型限制修饰系统M亚基HsdM。HsdM是I型限制修饰系统的特异性决定簇(host specificity determinant，hsd)之一，负责对非甲基化核苷酸序列进行甲基化修饰酶切(Modification subunit，M)，被报道对细菌水平基因转移具有一定的调控作用。

本研究中获得的hsdM基因敲除株为深入研究hsdM基因功能提供了前提，而该基因功能的阐明有助于进一步分析哈维弧菌的水平基因转移调控机制，同时可能作为进一步提高哈维弧菌接合转移效率的潜在靶点。

(1)确定待突变基因hsdM的上下游序列以及自杀质粒pSW7848的插入位点，利用NEB在线软件(http://nebuilder.neb.com/)设计无缝克隆法重组子载体构建引物，得到上游同源臂扩增引物对hsdM-UP-F/R、下游同源臂扩增引物对hsdM-DOWN-F/R，自杀质粒线性化引物对pSW7848-F/R，重组子质粒检测引物对pSW7848-check-F/R及待突变基因缺失检测引物对hsdM-Del-check-F/R；

所述的PCR引物序列如下：

hsdM-UP-F：aagcttgatatcgaattcgaagaaacacagtataaaattgtttc

hsdM-UP-R：actcttgcattttgtgaaagattatccagc

hsdM-DOWN-F：ttcacaaaatgcaagagtaagatacaaagtctgttag

hsdM-DOWN-R：ttggtaacgaatcagacgcgttatcagcgatggac

pSW7848-F：gtctgattcgttaccaattatgacaac

pSW7848-R：gaattcgatatcaagcttatcgatac

pSW7848-check-F：tcactgtcccttattcgcacc

pSW7848-check-R：ctgcttttgagcactacccg

hsdM-Del-check-F：ctggctaagcatccatcaagttc

hsdM-Del-check-R：cgattaagtgcccttccattac

(2)提取哈维弧菌基因组为模板，基于引物对hsdM-UP-F/R和hsdM-DOWN-F/R，利用PCR技术获取1001bp的上游同源臂片段UP(SEQ ID NO.1的第1位到第1001位碱基，如图2所示)及1007bp下游同源臂片段DOWN(SEQ ID NO.1的第2623位到第3629位碱基，如图2所示)，琼脂糖电泳检测后切胶回收，回收产物-20℃保存，备用；

所述的PCR扩增体系如下：

2×PrimeSTAR Max Premix 25.0μL，上游引物F(10μM)2.0μL，下游引物R(10μM)2.0μL，基因组模板(20ng/μL)2.0μL，用ddH₂O补足50μL；

所述的PCR扩增程序如下：

98℃预变性30sec；98℃变性10sec，51℃(UP)or 55℃(DOWN)5sec，72℃5sec，35个循环；72℃延伸7min。

(3)提取自杀质粒(自杀质粒pSW7848)为模板，基于引物对pSW7848-F/R，利用PCR技术获取长度为3309bp的质粒线性化片段(如图3所示)，琼脂糖电泳检测后切胶回收，回收产物-20℃保存，备用；

PCR扩增体系如下：

2×PrimeSTAR Max Premix 25.0μL，上游引物F(10μM)2.0μL，下游引物R(10μM)2.0μL，质粒模板(1ng/μL)2.0μL，用ddH₂O补足50μL；

PCR扩增程序如下：

98℃预变性30sec；98℃变性10sec，53℃15sec，72℃17sec，35个循环；72℃延伸7min。

(4)利用商品化多片段无缝克隆试剂盒将步骤(2)获得的上下游同源臂与步骤(3)获得的质粒片段进行等温组装，得到等温组装液；

(5)将等温组装液转化入大肠杆菌Escherichia coli Π3813感受态细胞，基于引物对pSW7848-check-F/R，利用PCR检测后获得阳性重组子pSW7848-△hsdM，琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，长度为2293bp(SEQ ID NO.2包括了上、下游同源臂片段和质粒片段，如图4所示)；

PCR扩增体系如下：

2×Premix Taq^TM(DNA Polymerase、Buffer、dNTP Mixture)25.0μL，上游引物F(10μM)2.0μL，下游引物R(10μM)2.0μL，菌液模板2.0μL，用ddH₂O补足50μL；

PCR扩增程序如下：

95℃预变性5min；94℃变性30sec，57℃30sec，72℃2.5min，35个循环；72℃延伸10min。

(6)从阳性重组子pSW7848-△hsdM中提取阳性重组质粒pSW7848-△hsdM转化入大肠杆菌E.coli GEB883感受态细胞中，得到携带了重组子的pSW7848-△hsdM-E.coliGEB883，并以其作为接合供体菌；

(7)将供体菌pSW7848-△hsdM-E.coli GEB883划线于添加有20μg/mL氯霉素和0.3mM DAP(2,6-Diaminopimelic acid)的LB固体平板上，于37℃过夜培养活化；

(8)挑取(7)中活化菌体所形成的单克隆菌落，接种于添加有20μg/mL氯霉素和0.3mM DAP的LB液体培养基中，37℃、200rpm培养至对数早期OD600nm＝0.3～0.7；

(9)配置LBS固体平板，对受体菌哈维弧菌进行28℃下过夜培养活化；

(10)挑取(9)中活化菌体所形成的单克隆菌落，接种于添加LBS液体培养基中，28℃、200rpm培养至对数早期OD600nm＝0.3～0.7；

(11)移液器移取0.5mL(10)中准备好的受体菌至1.5mL无菌离心管中，加入终浓度为0.04M的氢氧化钠，处理10min，并用新鲜的LBS液体培养基洗涤2次后与(8)中准备好的0.5mL供体菌混匀，于6000rpm、室温离心3min；

(12)去上清后，菌沉淀用50μL LBS液体培养基重悬，点种到LBS+0.3mM DAP固体平板，于28℃培养过夜；

(13)用接菌环刮取过夜接合菌斑，重悬于1mL LBS液体培养基中，11,000rpm、室温离心2min离心，去上清，菌体沉淀用1mL LBS液体培养基重悬；

(14)11,000rpm、2min离心，去上清，菌体沉淀用0.1mL LBS液体培养基重悬，并涂布在LBS+34μg/mL Cm+0.2％D-glucose平板上，28℃倒置培养至克隆长出；

(15)发生第一次同源重组的接合克隆在相同平板上纯化两次；

(16)接合克隆划线至LBS+0.2％arabinose固体平板上，接合克隆发生第二次同源重组，载体离开受体菌染色体，从而离开受体菌；

(17)重组克隆在LBS+0.2％arabinose平板上纯化，同时划线至LBS+34μg/ml Cm+0.2％arabinose平板上检测其是否具有Cm抗性；

(18)基于引物对hsdM-Del-check-F/R对阿拉伯糖抗性，氯霉素敏感性克隆进行PCR检测，获得突变株△hsdM-哈维弧菌，同时以野生株V.harveyi345的DNA为模板，PCR扩增进行对照，琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，野生株长度为2169bp，突变株长度为548bp(如图5所示)。由此可见，野生株的hsdM基因敲除成功。

PCR扩增体系如下：

2×Premix Taq^TM(DNA Polymerase、Buffer、dNTP Mixture)25.0μL，上游引物F(10μM)2.0μL，下游引物R(10μM)2.0μL，菌液模板2.0μL，用ddH₂O补足50μL；

PCR扩增程序如下：

95℃预变性5min；94℃变性30sec，56℃30sec，72℃2.0min，35个循环；72℃延伸10min。

本发明可用其他的不违背本发明的精神或主要特征的具体形式来概述。本发明的上述实施例都只能认为是对本发明的说明而不是限制。如可对受体菌哈维弧菌在0.01M～0.05M的氢氧化钠范围内热击处理5～20min，以对哈维弧菌中任何基因或者核苷酸片段进行敲除。因此凡是依据本发明的实质技术对以上实施例所作的任何细微修改、等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。

序列表

<110> 中国水产科学研究院南海水产研究所

<120> 一种基于氢氧化钠刺激的哈维弧菌同源重组基因敲除的方法

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 3629

<212> DNA

<213> 哈维弧菌(Vibrio harveyi)

<400> 1

gaagaaacac agtataaaat tgtttctatg tataaaaatg tcgtagttat ggatcatgca 60

catgactggg aaatttttaa gttgttactt aagagaaaac tatctattga tgaagaatat 120

tcagatgaaa tgattgaaga tagtctatct gatttcattt gcttgagtat ttcttctggg 180

tttgttgagg ggcaagataa aaatacattt ggtgacaata aaataaactg gttaaaaaat 240

tacgaaaggt ttttaacgac tttaaaaaca ttgaaaaaac tgaaagctaa aaccgaaaga 300

gtattcatga tatgcgatgc tgatgaatac cctaataatc tgattggtac aactgaaaat 360

ccatttttag ttaagggcca ctcgtttaag cctacagagc cccctaagcc ttctaaaaaa 420

aatactaaac aaaaaactga aaaagattca aagccattga aaaaagtggt gttattgtct 480

tggagaagaa gagagattaa gcactatcta ctgtcttata ctgctttagg ggctgcatgt 540

aatgaaatca ataggcacta cgtagaagat tgccagttaa aagtaggcaa aaatggagat 600

attggaattg atggtaagtt caatagttac ctggctaagc atccatcaag ttcagttaag 660

aaaatcgttg acccttatat aaatgttgat ggtaaagggt tttgtatcga aaaagctcaa 720

aagtatgtta acaaaataat tcctgaagag atcagtaatg atatcgtaga tatgtataaa 780

tacttggtga gaaagtaatg aataataata gattgacaga tatcattgaa ctcttaagaa 840

aggatactgg cataaataat gctattgatg ccgtcgagca attgtcactg ctactattaa 900

ttaaatatat cgacaaggcg gcctcaatag aattactaaa tgaaaagcat gttggttcgt 960

ttccgatctt atttaccgag ctggataatc tttcacaaaa tggttcggta attgattgtt 1020

atactttaat agatagatta attcagattg aaactaatat tatttttagt gaagatgaat 1080

tatctcatag aattttctct cgccataact ggaaaaaaat cgaaaacata tttgagcaga 1140

taccttttag aataaggtca aataaaatat tatatttggt tatacataaa ctggaagaga 1200

tagatttatt tgaagatatt gaagttgatt ttgactatct actgcttaat atgattaagg 1260

attctggttc atcaggtgca tattattcac caagaccgtt gattaaggca atggtcagtg 1320

ctctaaatcc tgagccacta actacagttt acgatcctgc tatgggaaca ggtggttttt 1380

ttgttgaggc aatcaaacac gtaaagaata agagctactt taatgattta aatattattg 1440

gtaatgatct aagtccattc gcgcatttga taggaatgtt gaacttactt ctcaacgata 1500

tcgacattag tggtgtatcg atatccgact cattgctaaa tagagattgt cagcagtacg 1560

attttgtcat ttctggagtg ccatttggaa aagttaacga gttaactaag tatgaatatt 1620

actatcacgg ttatagcggc agtcttgaag ctatgtttct taagcatacg atggataagc 1680

tggcaaaagg gggacgggct gcgatagtta ttccagatgg cattttgttc ggtaatgcat 1740

cacatctaga tgaactaaag cgacagttgc taacgcaatt taatctgcac accgttctga 1800

gccttcctaa aggtacgtta gcaccatact ctggagttaa agttagtgtt ttgttttttg 1860

ataataccgt gtcagaaaaa gacatatggt tctatgagct aagaacggat aaacctttga 1920

gtaagttaaa ctcaattact gattctgact ttgaagactt tacgtcattg tacgaacgta 1980

gagaagttag tgagcattct tgcttaataa gtaaggagtc tttactacaa gataagacac 2040

ttaacctttc attttcttta cctaagaaag aagcgggctt gaagttcgac aaacagaaaa 2100

tgatcgcctc attaaaaagc gaacagttag ctttggtgac atcaattgaa aagcactttg 2160

atactatgtc tcgcaatttc gagttagagt acatacatca tgtagcgtta aaagatgtgt 2220

gtaaacttag aagtggaaag aatctcaata aagatgacgt cgaaaacaag ggagaattcc 2280

ctgtgtatgg gggaaatgga ataataggat attacctaga cgctaataga cccggagagt 2340

cagtcataat tggaaaggtt ggtgcacact gcggaaacat acacttttca tctaaaccat 2400

attggttaac taccaacgcg ataagcttgg aactattgga cacgactagg gtgtatttac 2460

cttacttagc tcatgtttta aaaagcttag acttgaacaa tttggcaaca ggcaccgcac 2520

aaaaatttgt ttctatcaat cagttatatg aagtggaagt ttctttacct agtctagaaa 2580

aacaaaagga actgagtgac tggtttactt cgattgaaga aagcaagagt aagatacaaa 2640

gtctgttaga aggtttcagc aaagatattg gagctatctc aacggaatca attcatgaaa 2700

aggcgctgaa aggatagaaa gctatagcga ttcataacat gaaatttcag atttagggtc 2760

gagtaaccag gcttaaagta atggaagggc acttaatcga tacctttcta ttcaatggat 2820

tttattaagt aatacctgta gtgtcagcgc cgatgtaaaa atgggtcttc cgcaactaag 2880

gtgcataaaa tcacgccaga ggactcatta ctctacatct caatagttcg aaacccgcgc 2940

ggccatacat ttggcgcttt aacatcttca aacgatttac gtgcccttca acgacaccat 3000

tgctccaatg actaatgaca gcttcattaa ccgcaggtaa gtctgcctcc atccctttag 3060

caactcgttg aaggtcgatc agtccactat cgctaacact ttcgaaccat cggtgtaatg 3120

accttttgtt ctttgttttg agtatcttgt agaactctaa agctagtttc tgcgctaatt 3180

tgagctgagg ctctttgtca cacatccgac ttataaatct tgatgcataa ctttcttctc 3240

ctcgtattat tctccaaggt gtaagccagc gactgattcg ggatgctaat ggtatacgtg 3300

taggaacaat aactggatag accttgcctt ttctgagcct ggttacttca tacctcactg 3360

tactaacact gcctgtaaac ccagcttcga ccatttcttg ccatagctga cttgcattgc 3420

agtaaccgct ttgcagctgt ttttctagcc aatcactcca tgaatcgatg agcttaggtc 3480

taggtggttt acttgatatt tcaggaaaag tcttcgactg tatccatcgt cgaactgtta 3540

ctcgtgacag tccagttgcc ctcgatattt ccctgatacc atgccctttt ttatagaggt 3600

cattcacttg agtccatcgc tgataacgc 3629

<210> 2

<211> 5317

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

caattgatat cgcgcgcgta atacgactca ctatagggcg aattgggtac cagcgctttt 60

ccgctgcata accctgcttc ggggtcatta tagcgatttt ttcggtatat ccatcctttt 120

tcgcacgata tacaggattt tgccaaaggg ttcgtgtaga ctttccttgg tgtatccaac 180

ggcgtcagcc gggcaggata ggtgaagtag gcccacccgc gagcgggtgt tccttcttca 240

ctgtccctta ttcgcacctg gcggtgctca acgggaatcc tgctctgcga ggctggccgg 300

cgtcgacggt atcgataagc ttgatatcga attcgaagaa acacagtata aaattgtttc 360

tatgtataaa aatgtcgtag ttatggatca tgcacatgac tgggaaattt ttaagttgtt 420

acttaagaga aaactatcta ttgatgaaga atattcagat gaaatgattg aagatagtct 480

atctgatttc atttgcttga gtatttcttc tgggtttgtt gaggggcaag ataaaaatac 540

atttggtgac aataaaataa actggttaaa aaattacgaa aggtttttaa cgactttaaa 600

aacattgaaa aaactgaaag ctaaaaccga aagagtattc atgatatgcg atgctgatga 660

ataccctaat aatctgattg gtacaactga aaatccattt ttagttaagg gccactcgtt 720

taagcctaca gagcccccta agccttctaa aaaaaatact aaacaaaaaa ctgaaaaaga 780

ttcaaagcca ttgaaaaaag tggtgttatt gtcttggaga agaagagaga ttaagcacta 840

tctactgtct tatactgctt taggggctgc atgtaatgaa atcaataggc actacgtaga 900

agattgccag ttaaaagtag gcaaaaatgg agatattgga attgatggta agttcaatag 960

ttacctggct aagcatccat caagttcagt taagaaaatc gttgaccctt atataaatgt 1020

tgatggtaaa gggttttgta tcgaaaaagc tcaaaagtat gttaacaaaa taattcctga 1080

agagatcagt aatgatatcg tagatatgta taaatacttg gtgagaaagt aatgaataat 1140

aatagattga cagatatcat tgaactctta agaaaggata ctggcataaa taatgctatt 1200

gatgccgtcg agcaattgtc actgctacta ttaattaaat atatcgacaa ggcggcctca 1260

atagaattac taaatgaaaa gcatgttggt tcgtttccga tcttatttac cgagctggat 1320

aatctttcac aaaatgcaag agtaagatac aaagtctgtt agaaggtttc agcaaagata 1380

ttggagctat ctcaacggaa tcaattcatg aaaaggcgct gaaaggatag aaagctatag 1440

cgattcataa catgaaattt cagatttagg gtcgagtaac caggcttaaa gtaatggaag 1500

ggcacttaat cgataccttt ctattcaatg gattttatta agtaatacct gtagtgtcag 1560

cgccgatgta aaaatgggtc ttccgcaact aaggtgcata aaatcacgcc agaggactca 1620

ttactctaca tctcaatagt tcgaaacccg cgcggccata catttggcgc tttaacatct 1680

tcaaacgatt tacgtgccct tcaacgacac cattgctcca atgactaatg acagcttcat 1740

taaccgcagg taagtctgcc tccatccctt tagcaactcg ttgaaggtcg atcagtccac 1800

tatcgctaac actttcgaac catcggtgta atgacctttt gttctttgtt ttgagtatct 1860

tgtagaactc taaagctagt ttctgcgcta atttgagctg aggctctttg tcacacatcc 1920

gacttataaa tcttgatgca taactttctt ctcctcgtat tattctccaa ggtgtaagcc 1980

agcgactgat tcgggatgct aatggtatac gtgtaggaac aataactgga tagaccttgc 2040

cttttctgag cctggttact tcatacctca ctgtactaac actgcctgta aacccagctt 2100

cgaccatttc ttgccatagc tgacttgcat tgcagtaacc gctttgcagc tgtttttcta 2160

gccaatcact ccatgaatcg atgagcttag gtctaggtgg tttacttgat atttcaggaa 2220

aagtcttcga ctgtatccat cgtcgaactg ttactcgtga cagtccagtt gccctcgata 2280

tttccctgat accatgccct tttttataga ggtcattcac ttgagtccat cgctgataac 2340

gcgtctgatt cgttaccaat tatgacaact tgacggctac atcattcact ttttcttcac 2400

aaccggcacg aaactcgctc gggctggccc cggtgcattt tttaaatact cgcgagaaat 2460

agagttgatc gtcaaaacca acattgcgac cgacggtggc gataggcatc cgggtagtgc 2520

tcaaaagcag cttcgcctga ctaatgcgtt ggtcctcgcg ccagcttaag acgctaatcc 2580

ctaactgctg gcggaaaaga tgtgacagac gcgacggcga caagcaaaca tgctgtgcga 2640

cgctggcgat atcaaaattg ctgtctgcca ggtgatcgct gatgtactga caagcctcgc 2700

gtacccgatt atccatcggt ggatggagcg actcgttaat cgcttccatg cgccgcagta 2760

acaattgctc aagcagattt atcgccagca gctccgaata gcgcccttcc ccttgcccgg 2820

cgttaatgat ttgcccaaac aggtcgctga aatgcggctg gtgcgcttca tccgggcgaa 2880

agaaacccgt attggcaaat attgacggcc agttaagcca ttcatgccag taggcgcgcg 2940

gacgaaagta aacccactgg tgataccatt cgcgagcctc cggatgacga ccgtagtgat 3000

gaatctctcc tggcgggaac agcaaaatat cacccggtcg gcagacaaat tctcgtccct 3060

gatttttcac caccccctga ccgcgaatgg tgagattgag aatataacct ttcattccca 3120

gcggtcggtc gataaaaaaa tcgagataac cgttggcctc aatcggcgtt aaacccgcca 3180

ccagatgggc gttaaacgag tatcccggca gcaggggatc attttgcgct tcagccatac 3240

ttttcatact cccaccattc agagaagaaa ccaattgtcc atattgcatc agacattgcc 3300

gtcactgcgt cttttactgg ctcttctcgc taacccaacc ggtaaccccg cttattaaaa 3360

gcattctgta acaaagcggg accaaagcca tgacaaaaac gcgtaacaaa agtgtctata 3420

atcacggcag aaaagtccac attgattatt tgcacggcgt cacactttgc tatgccatag 3480

catttttatc cataagatta gcggatccta cctgacgctt tttatcgcaa ctctctactg 3540

tttctccata cccgtttttt tggatggagt gaaacgatgc agtttaaggt ttacacctat 3600

aaaagagaga gccgttatcg tctgtttgtg gatgtacaga gtgatattat tgacacgccc 3660

gggcgacgga tggtgatccc cctggccagt gcacgtctgc tgtcagataa agtctcccgt 3720

gaactttacc cggtggtgca tatcggggat gaaagctggc gcatgatgac caccgatatg 3780

gccagtgtgc cggtctccgt tatcggggaa gaagtggctg atctcagcca ccgcgaaaat 3840

gacatcaaaa acgccattaa cctgatgttc tggggaatat aagagctcca gcttttgttc 3900

cctttagtga gggttaattg cgcgcaattc ccatgtcagc cgttaagtgt tcctgtgtca 3960

ctcaaaattg ctttgagagg ctctaagggc ttctcagtgc gttacatccc tggcttgttg 4020

tccacaaccg ttaaacctta aaagctttaa aagccttata tattcttttt tttcttataa 4080

aacttaaaac cttagaggct atttaagttg ctgatttata ttaattttat tgttcaaaca 4140

tgagagctta gtacgtgaaa catgagagct tagtacgtta gccatgagag cttagtacgt 4200

tagccatgag ggtttagttc gttaaacatg agagcttagt acgttaaaca tgagagctta 4260

gtacgtgaaa catgagagct tagtacgtac tatcaacagg ttgaactgct gatcttcaga 4320

tcctctacgc cggacgcatc gtggccggat cagatctgat atcgtcgcag accaaaacga 4380

tctcaagaag atcatcttat taatcagata aaatatttct aggcaccaat aactgcctta 4440

aaaaaattac gccccgccct gccactcatc gcagtactgt tgtaattcat taagcattct 4500

gccgacatgg aagccatcac aaacggcatg atgaacctga atcgccagcg gcatcagcac 4560

cttgtcgcct tgcgtataat atttgcccat ggtgaaaacg ggggcgaaga agttgtccat 4620

attggccacg tttaaatcaa aactggtgaa actcacccag ggattggctg agacgaaaaa 4680

catattctca ataaaccctt tagggaaata ggccaggttt tcaccgtaac acgccacatc 4740

ttgcgaatat atgtgtagaa actgccggaa atcgtcgtgg tattcactcc agagcgatga 4800

aaacgtttca gtttgctcat ggaaaacggt gtaacaaggg tgaacactat cccatatcac 4860

cagctcaccg tctttcattg ccatacgaaa ttccggatga gcattcatca ggcgggcaag 4920

aatgtgaata aaggccggat aaaacttgtg cttatttttc tttacggtct ttaaaaaggc 4980

cgtaatatcc agctgaacgg tctggttata ggtacattga gcaactgact gaaatgcctc 5040

aaaatgttct ttacgatgcc attgggatat atcaacggtg gtatatccag tgattttttt 5100

ctccatttta gcttccttag ctcctgaaaa tctcgataac tcaaaaaata cgcccggtag 5160

tgatcttatt tcattatggt gaaagttgga acctcttacg tgccgatcaa cgtctcattt 5220

tcgccaaaag ttggcccagg gcttcccggt atcaacaggg acaccaggat ttatttattc 5280

tgcgaagtga tcttccgtca caggtattta ttcggcg 5317

Claims (1)

1.一种基于氢氧化钠刺激的哈维弧菌同源重组基因敲除的方法，其特征在于，是将培养至对数早期的哈维弧菌受体菌在含有哈维弧菌的培养液中加入氢氧化钠进行刺激处理，用新鲜培养基洗涤后与培养至对数生长期早期的供体菌进行混匀，离心去上清，菌沉淀后重悬，点种至固体平板上，接合过夜，对哈维弧菌进行基因敲除；所述的氢氧化钠终浓度为0.02M或0.04~0.05M，刺激处理5~20min；

所述的接合过夜是在28 ℃接合过夜，所述的供体菌为携带有待缺失片段上下游同源臂的重组自杀质粒的供体菌；

所述的携带有待缺失片段上下游同源臂的重组自杀质粒的供体菌的制备方法是：

（1）确定待突变基因hsdM的上下游序列以及自杀质粒pSW7848的插入位点，利用NEB在线软件http://nebuilder.neb.com/设计无缝克隆法重组子载体构建引物，得到上游同源臂扩增引物对hsdM-UP-F/R、下游同源臂扩增引物对hsdM-DOWN-F/R，自杀质粒线性化引物对pSW7848-F/R，重组子质粒检测引物对pSW7848-check-F/R及待突变基因缺失检测引物对hsdM-Del-check-F/R；

PCR引物序列如下：

hsdM-UP-F：aagcttgatatcgaattcgaagaaacacagtataaaattgtttc

hsdM-UP-R：actcttgcattttgtgaaagattatccagc

hsdM-DOWN-F：ttcacaaaatgcaagagtaagatacaaagtctgttag

hsdM-DOWN-R：ttggtaacgaatcagacgcgttatcagcgatggac

pSW7848-F：gtctgattcgttaccaattatgacaac

pSW7848-R：gaattcgatatcaagcttatcgatac

pSW7848-check-F：tcactgtcccttattcgcacc

pSW7848-check-R：ctgcttttgagcactacccg

hsdM-Del-check-F：ctggctaagcatccatcaagttc

hsdM-Del-check-R：cgattaagtgcccttccattac

（2）提取哈维弧菌基因组为模板，基于引物对hsdM-UP-F/R和hsdM-DOWN-F/R，利用PCR技术获取1001 bp的上游同源臂片段UP及1007 bp下游同源臂片段DOWN，琼脂糖电泳检测后切胶回收，回收产物-20℃保存，备用；

PCR扩增体系如下：

2×PrimeSTAR Max Premix 25.0 μL，上游引物F 10 μM 2.0 μL，下游引物R 10 μM2.0 μL，基因组模板20 ng/μL 2.0 μL，用ddH₂O补足50 μL；

PCR扩增程序如下：

98 ℃预变性30 sec；98 ℃变性10 sec，51 ℃ UP or 55 ℃ DOWN 5 sec，72 ℃ 5sec，35个循环；72 ℃延伸 7 min；

（3）提取自杀质粒pSW7848为模板，基于引物对pSW7848-F/R，利用PCR技术获取长度为3309 bp的质粒线性化片段，琼脂糖电泳检测后切胶回收，回收产物-20 ℃保存，备用；

PCR扩增体系如下：

2×PrimeSTAR Max Premix 25.0 μL，上游引物F 10 μM 2.0 μL，下游引物R 10 μM2.0 μL，质粒模板1 ng/μL 2.0 μL，用ddH₂O补足50 μL；

PCR扩增程序如下：

98 ℃预变性30 sec；98 ℃变性10 sec，53 ℃ 15 sec，72 ℃ 17 sec，35个循环；72℃延伸 7 min；

（4）利用商品化多片段无缝克隆试剂盒将步骤（2）获得的上下游同源臂与步骤（3）获得的质粒片段进行等温组装，得到等温组装液；

（5）将等温组装液转化入大肠杆菌Escherichia coli Π3813感受态细胞，基于引物对pSW7848-check-F/R，利用PCR检测后获得阳性重组子pSW7848-△hsdM，琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，长度为2293 bp；

PCR扩增体系如下：

2×Premix Taq™ 25.0 μL，上游引物F 10 μM 2.0 μL，下游引物R 10 μM 2.0 μL，菌液模板2.0 μL，用ddH₂O补足50 μL；

PCR扩增程序如下：

95 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 sec，57 ℃ 30 sec，72 ℃ 2.5 min，35个循环；72℃延伸 10 min；

（6）从阳性重组子pSW7848-△hsdM中提取阳性重组质粒pSW7848-△hsdM转化入大肠杆菌E. coli GEB883感受态细胞中，得到携带了重组子的pSW7848-△hsdM-E. coli GEB883，并以其作为接合供体菌。