CN107603980B - 一种基于PTG-Cas9的猕猴桃基因AcPDS编辑载体及其构建方法和应用 - Google Patents
一种基于PTG-Cas9的猕猴桃基因AcPDS编辑载体及其构建方法和应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN107603980B CN107603980B CN201710702385.XA CN201710702385A CN107603980B CN 107603980 B CN107603980 B CN 107603980B CN 201710702385 A CN201710702385 A CN 201710702385A CN 107603980 B CN107603980 B CN 107603980B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- ptg
- acpds
- gene
- fragment
- kiwi
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种基于PTG‑Cas9的猕猴桃基因AcPDS编辑载体及其构建方法和应用。本发明建立的基于PTG‑Cas9的猕猴桃基因AcPDS编辑载体能够快速简单地对猕猴桃基因进行高效的多靶点定点突变，弥补了猕猴桃中多基因或者多靶点定点编辑技术的空白。实验结果证明：通过农杆菌介导的猕猴桃遗传转化，本发明的基于PTG‑Cas9的猕猴桃基因AcPDS编辑载体成功地对猕猴桃基因AcPDS的四个靶点进行了定点突变，并引起了白化的表型。
Description
技术领域：
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种基于PTG-Cas9的猕猴桃基因编辑载体及其构建方法和应用。
背景技术：
在细胞内基因往往需要和其他基因相互作用才能准确调控特定的性状或者表型。因此多基因突变体的建立是作物遗传改良必不可少的步骤。传统的CRISPR-Cas9系统要实现多个基因/靶点的定点突变需要将多个sgRNA同时在细胞内进行共表达。而传统的sgRNA表达盒由一个三型启动子、gRNA、gRNA scaffold和终止子组成，要构建多靶点的表达盒需要将多个完整的表达盒进行串联，这样就增加了载体构建的难度，增加了工作量和试验费用。同时这种传统的多靶点基因编辑的效率极其的低。最近研究通过使用tRNA序列将多个sgRNA间隔开形成一个多顺反子基因(PTG)，然后由一个三型启动子来驱动这个多顺反子基因的转录(这个系统命名为PTG-Cas9系统)。这个初始转录本中的tRNA序列被细胞内的RNase Z和RNase P准确识别并准确切割，这样就可以同时产生多个成熟的sgRNA。与此同时，由于tRNA中含有转录增强子，因此sgRNA的转录丰度大于传统表达盒转录出来的sgRNA的丰度。有研究表明PTG-Cas9系统单靶点和多靶点的基因编辑效率明显高于CRISPR/Cas9系统对应的基因编辑效率。
猕猴桃果实富含维生素C、膳食纤维和多种矿物质营养，被誉为“水果之王”，已逐渐成为一种新兴的经济水果作物。随着人民生活水平的迅速提高和多种逆境的出现(比如溃疡病的全球爆发)，对高品质、高抗逆的新品种或者种质的需求显著增加。因此急需针对特定性状的准确的控制和遗传改良的方法。建立针对多基因/靶点的定点基因编辑体系可以很好的解决这个问题。
发明内容：
本发明的目的在于克服现有技术中的缺陷，提供一种基于PTG-Cas9的猕猴桃基因AcPDS编辑载体及其构建方法和应用。
本发明的第一个目的是提供一种靶向猕猴桃基因AcPDS的sgRNA表达盒，其特征在于，所述的sgRNA表达盒的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示或如SEQ ID NO.9所示。
本发明的第二个目的是提供一种基于PTG-Cas9的猕猴桃基因AcPDS编辑载体，其特征在于，包括载体pYLCRISPR/Cas9P-35S-N片段和通过无缝克隆插入到载体pYLCRISPR/Cas9P-35S-N的AscI酶切位点的权利要求1所述的sgRNA表达盒。
本发明的第三个目的是提供一种含有上述的基于PTG-Cas9的猕猴桃基因AcPDS编辑载体的细菌。
所述的细菌优选为农杆菌EHA105。
本发明的第四个目的是提供一种猕猴桃基因AcPDS定点突变试剂盒，其特征在于，包含上述的靶向猕猴桃基因AcPDS的sgRNA表达盒或上述的基于PTG-Cas9的猕猴桃基因AcPDS编辑载体或上述的细菌。
本发明的第五个目的是提供一种含有上述的基于PTG-Cas9的猕猴桃基因AcPDS编辑载体的转化体。
本发明的第六个目的是提供一种上述的基于PTG-Cas9的猕猴桃基因AcPDS编辑载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)人工合成依次含有BamHI酶切位点、gRNA scaffold、tRNAGly和HindIII酶切位点的片段一；分别将片段一和载体pYLsgRNA-AtU6-1用BamHI和HindIII进行双酶切反应，回收对应的酶切产物；
(2)将步骤(1)回收的酶切产物混合后使用T4DNA连接酶进行连接反应，得到sgRNA的中间载体pHLW-gRNA-tRNA-HF；
(3)以质粒pYLsgRNA-AtU6-1为模板，以引物U6-1-F和U6-1-R作为引物进行PCR扩增，得到含有AtU6-1启动子的片段二；以质粒pHLW-gRNA-tRNA-HF为模板，以引物TF和TR作为引物进行PCR扩增，得到含有tRNAGly和BsaI酶切位点的片段三；以pYLsgRNA-AtU6-1为模板，以引物GF和GR作为引物进行PCR扩增，得到含有BsaI酶切位点、gRNA scaffold和终止子的片段四；
(4)使用AscI限制性内切酶单酶切质粒pYLCRISPR/Cas9P-35S-N，回收后得到线性化的pYLCRISPR/Cas9P-35S-N；
(5)将步骤(3)得到的片段二、片段三、片段四和线性化的pYLCRISPR/Cas9P-35S-N混合后进行同源重组反应，得到质粒pPTG-gRNA-Cas9-U6-1；
(6)根据猕猴桃基因AcPDS的序列，设计靶标序列对应的引物ptg-gRNA1-F/ptg-gRNA2-R或引物ptg-gRNA3-F/ptg-gRNA4-R；
(7)以质粒pHLW-gRNA-tRNA-HF为模板，以引物ptg-gRNA1-F和ptg-gRNA2-R作为引物进行PCR扩增，回收并纯化得到两端带有BsaI酶切位点、同时含有两个靶标序列的片段五；
或者，以质粒pHLW-gRNA-tRNA-HF为模板，以引物ptg-gRNA3-F和ptg-gRNA4-R作为引物进行PCR扩增，回收并纯化得到两端带有BsaI酶切位点、同时含有两个靶标序列的片段六；
(8)将步骤(7)得到的片段五或片段六与载体pPTG-gRNA-Cas9-U6-1混合，使用BsaI限制性内切酶和T4DNA连接酶进行循环酶切连接反应，得到基于PTG-Cas9的猕猴桃基因AcPDS编辑载体；
所述的步骤(3)和(5)中使用的引物序列如下：
U6-1-F：5’-GACCGGTAAGGCGCGAGAAATCTCAAAATTCCGGCAGAACAA-3’；
U6-1-R：5’-CACTGGTGCTTTGTTAATCACTACTTCGTCTCTAACCATATAT-3’；
TF：5’-AACAAAGCACCAGTGGTCTAGTGGTAGAATAGTACCCTGCCACGGTACAGACCCGGGT-3’；
TR：5’-CGAGACCGGTCTCTTGCACCAGCCGGGAATCGAACCCGGGTCTGTACCGTGG-3’；
GF：5’-AGAGACCGGTCTCGGTTTCAGAGCTATGCTGGAAACAGC-3’；
GR：5’-AGCTCGAGAGGCGCGAAAAAAGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTCAAGTTGAT-3’；
ptg-gRNA1-F：5’-GGTCTCTTGCACAGGTCTGTCCCATCAAGATGTTTCAGAGCTATGCTGGA-3’；
ptg-gRNA2-R：5’-GGTCTCTAAACCTAAGCCAGTATCAGACTCCTGCACCAGCCGGGAATCGA-3’；
ptg-gRNA3-F：5’-GGTCTCTTGCAACTCGATGGATGATGATATAGTTTCAGAGCTATGCTGGA-3’；
ptg-gRNA4-R：5’-GGTCTCTAAACGTCTTTAACAGTTAAACCATTGCACCAGCCGGGAATCGA-3’。
步骤(1)所述的片段一的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明的第七个目的是提供一种猕猴桃基因AcPDS定点突变的方法，其特征在于，包括以下步骤：将上述的基于PTG-Cas9的猕猴桃基因AcPDS编辑载体电转化农杆菌EHA105感受态细胞，筛选阳性克隆，然后侵染猕猴桃叶片，以侵染后的猕猴桃叶片为外植体进行植物组织培养，经抗性筛选，抗性愈伤组织分化再生，用TA克隆测序验证，确认获得转基因猕猴桃。
本发明的第八个目的是提供上述的靶向猕猴桃基因AcPDS的sgRNA表达盒或上述的基于PTG-Cas9的猕猴桃基因AcPDS编辑载体或上述的细菌或上述的猕猴桃基因AcPDS定点突变试剂盒在猕猴桃基因AcPDS定点突变中的应用。
本发明的有益效果：本发明建立的基于PTG-Cas9的猕猴桃基因AcPDS编辑载体能够快速简单地对猕猴桃基因进行高效的多靶点定点突变，弥补了猕猴桃中多基因或者多靶点定点编辑技术的空白。实验结果证明：通过农杆菌介导的猕猴桃遗传转化，本发明的基于PTG-Cas9的猕猴桃基因AcPDS编辑载体成功地对猕猴桃基因AcPDS的四个靶点进行了定点突变，并引起了白化的表型。
附图说明：
图1是Cas9双元表达载体pPTG-gRNA-Cas9-U6-1和sgRNA中间载体pHLW-gRNA-tRNA-HF的示意图；
图2是通过T-DNA区域特异引物SP-DL/SP-R进行PCR检测转基因阳性；M为DNAmaker，1～10为实施例2步骤(8)的PCR产物；
图3是通过靶点特异的引物进行PCR并测序鉴定B1处理的突变的情况；其中WT表示野生型；野生型的序列下方的两行核苷酸序列为阳性克隆测序的序列，与之对应的下部分是阳性克隆测序的峰图；B1表示用B1处理的阳性克隆；
图4是通过靶点特异的引物进行PCR并测序鉴定B2处理的突变的情况；其中WT表示野生型；野生型的序列下方的两行核苷酸序列为阳性克隆测序的序列，与之对应的下部分是阳性克隆测序的峰图；B2表示用B2处理的阳性克隆；
图5是构建的猕猴桃基因AcPDS编辑载体B1和B2诱导突变的植株的表型，其中WT表示野生型，B1表示用B1处理的突变植株，B2表示用B2处理的突变植株。
具体实施方式：
下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步说明，但不应理解为对本发明的限制。
本发明生物材料的来源：
1、载体pYLCRISPR/Cas9P-35S-N、pYLsgRNA-AtU6-1(Ma,X.,Zhang,Q.,Zhu,Q.,Liu,W.,Chen,Y.,Qiu,R.(2015)A Robust CRISPR/Cas9System for Convenient,High-Efficiency Multiplex Genome Editing in Monocot and Dicot Plants.Mol Plant,8,1274–1284)，这两个载体由华南农业大学刘耀光教授赠送给本专利的申请人。
2、所有的引物均由专利申请人自行设计并委托上海生物生工有限公司合成。
3、所有使用的PCR聚合酶均购买自北京全式金有限公司。
4、所有使用的限制性内切酶和T4DNA连接酶均购买自New England Biolabs。
表1本发明中设计的引物
实施例1：
基于PTG-Cas9的猕猴桃基因AcPDS编辑载体的构建方法，具体步骤如下：
(1)挑取含有pYLCRISPR/Cas9P-35S-N、pYLsgRNA-AtU6-1质粒的单菌落，分别接种于含有50ng/mL Kan和50ng/mL Amp的50mL LB液体培养基中，37℃、200r/min恒温摇床过夜培养；
(2)离心收集菌体，使用碱裂解法提取pYLCRISPR/Cas9P-35S-N、pYLsgRNA-AtU6-1质粒，通过Nanodrop 2000测定质粒浓度。
(3)分别使用AscI、BamHI和HindIII限制性内切酶对pYLCRISPR/Cas9P-35S-N、pYLsgRNA-AtU6-1质粒进行酶切验证，同时使用引物SP-DL/SP-R对pYLCRISPR/Cas9P-35S-N质粒进行PCR和测序验证；
(4)人工合成一条177bp的片段一，片段一依次包含BamHI酶切位点、gRNAscaffold、tRNAGly和HindIII酶切位点(其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)。分别将片段一和载体pYLsgRNA-AtU6-1使用BamHI和HindIII限制性内切酶进行双酶切反应，并回收对应的酶切产物；
(5)取步骤(4)回收的酶切产物混合后使用T4DNA连接酶进行连接反应，将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态，挑取阳性克隆、PCR并送样测序验证，得到该系统的sgRNA的中间载体pHLW-gRNA-tRNA-HF；
(6)以pYLsgRNA-AtU6-1为模板，以引物U6-1-F和U6-1-R作为引物进行PCR扩增，得到含有AtU6-1启动子的片段二(其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)；以pHLW-gRNA-tRNA-HF为模板，以引物TF和TR作为引物进行PCR扩增，得到含有tRNAGly和BsaI酶切位点的片段三(其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示)；以pYLsgRNA-AtU6-1为模板，以引物GF和GR作为引物进行PCR扩增，得到含有BsaI酶切位点、gRNA scaffold和终止子的片段四(其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示)；
(7)使用AscI限制性内切酶单酶切质粒pYLCRISPR/Cas9P-35S-N，并回收对应的片段，得到线性化的pYLCRISPR/Cas9P-35S-N；
(8)将步骤(6)得到的片段二、片段三和片段四与步骤(7)得到的线性化的pYLCRISPR/Cas9P-35S-N按照摩尔比3:3:3:1的比例进行混合，使用pEASY-Uni SeamlessCloning and Assembly Kit进行同源重组反应。取5μL反应产物转化大肠杆菌DH5α感受态，并使用含有50ng/mL Kan的LB固体培养基进行过夜培养，挑取单菌落、摇菌、提取质粒，使用SP-DL/SP-R进行PCR得到的产物送样测序，鉴定得到含有如SEQ ID NO.5所示的表达盒骨架的pYLCRISPR/Cas9P-35S-N(即将如SEQ ID NO.5所示的表达盒骨架无缝克隆到线性化的pYLCRISPR/Cas9P-35S-N中)，命名为质粒pPTG-gRNA-Cas9-U6-1(见图1)；
同源重组反应时，片段二的3’端与片段三的5’端的同源序列(5’-AACAAAGCACCAGTG-3’)发生同源重组，片段三的3’端与片段四的5’端的同源序列(5’-AGAGACCGGTCTCG-3’)发生同源重组，片段二的5’端与线性化的pYLCRISPR/Cas9P-35S-N一端的同源序列(5’-GACCGGTAAGGCGCG-3’)发生同源重组，片段四的3’端与线性化的pYLCRISPR/Cas9P-35S-N另一端的同源序列(5’-CGCGCCTCTCGAGCT-3’)发生同源重组。
(9)根据猕猴桃基因AcPDS的序列，设计靶标序列1(gRNA1)、靶标序列2(gRNA2)、靶标序列3(gRNA3)和靶标序列4(gRNA 4)及对应的引物ptg-gRNA1-F、ptg-gRNA2-R、ptg-gRNA3-F和ptg-gRNA4-R(见表1和表2)。
(10)以质粒pHLW-gRNA-tRNA-HF为模板，使用引物ptg-gRNA1-F和ptg-gRNA2-R进行PCR扩增，得到两端带有BsaI位点、同时含有gRNA1和gRNA2的片段五(其核苷酸序列如SEQID NO.6所示)，回收纯化PCR产物；以质粒pHLW-gRNA-tRNA-HF为模板，使用引物ptg-gRNA3-F和ptg-gRNA4-R进行PCR扩增，得到两端带有BsaI位点、同时含有gRNA3和gRNA4的片段六(其核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示)，回收纯化PCR产物。
(11)取70ng步骤(10)回收纯化的片段五与100ng步骤(8)得到的载体pPTG-gRNA-Cas9-U6-1进行混合，使用BsaI限制性内切酶先进行酶切15分钟，然后加入T4DNA连接酶进行循环酶切连接反应(即将片段五插入到质粒pPTG-gRNA-Cas9-U6-1的BsaI酶切位点)；取70ng步骤(10)回收纯化的片段六与100ng步骤(8)得到的载体pPTG-gRNA-Cas9-U6-1进行混合，使用BsaI限制性内切酶先进行酶切15分钟，然后加入T4DNA连接酶进行循环酶切连接反应(即将片段六插入到质粒pPTG-gRNA-Cas9-U6-1的BsaI酶切位点)。
(12)取5μL步骤(11)中片段五和载体pPTG-gRNA-Cas9-U6-1的反应产物与50μLDH5α感受态细胞冰上孵育30分钟，42℃30秒，加入500μL LB液体培养基，37℃、200r/min培养1个小时，离心去掉400μL上清，将剩下的液体重悬菌体，并涂布于含有50ng/mL Kan的LB固体培养基上，37℃培养过夜；挑取单菌落，接种、摇菌、提取质粒，使用引物SP-DL/SP-R进行PCR和测序鉴定，得到载体pPTG-gRNA-Cas9-U6-1-PDS-1(即将如SEQ ID NO.8所示的靶向猕猴桃基因AcPDS的sgRNA表达盒无缝克隆到线性化的pYLCRISPR/Cas9P-35S-N中)。
(13)取5μL步骤(11)中片段六和载体pPTG-gRNA-Cas9-U6-1的反应产物与50μLDH5α感受态细胞冰上孵育30分钟，42℃30秒，加入500μL LB液体培养基，37℃、200r/min培养1个小时，离心去掉400μL上清，将剩下的液体重悬菌体，并涂布于含有50ng/mL Kan的LB固体培养基上，37℃培养过夜。挑取单菌落，接种、摇菌、提取质粒，使用引物SP-DL/SP-R进行PCR和测序鉴定，得到载体pPTG-gRNA-Cas9-U6-1-PDS-2(即将如SEQ ID NO.9所示的靶向猕猴桃基因AcPDS的sgRNA表达盒无缝克隆到线性化的pYLCRISPR/Cas9P-35S-N中)。
表2猕猴桃的靶标序列及对应的引物
实施例2：
基于PTG-Cas9的猕猴桃基因AcPDS编辑载体对猕猴桃基因AcPDS进行多靶点定点突变，具体步骤如下：
(1)将实施例1构建的载体pPTG-gRNA-Cas9-U6-1-PDS-1标记为B1，B1含有靶标gRNA1和gRNA2；将实施例1构建的载体pPTG-gRNA-Cas9-U6-1-PDS-2标记为B2，B2含有靶标gRNA3和gRNA4。
(2)取5μL得到的载体B1和B2，使用标准的电击转化法转化农杆菌株系EHA105感受态细胞，并进行筛选鉴定，然后挑取单菌落接种于含有50ng/mL利福平和50ng/mL Kan的LB液体培养基中28℃、180r/min摇菌过夜，次日上午取种子液按照体积比1:100的比例加入新鲜的含有50ng/mL利福平和50ng/mL Kan的LB液体培养基中28℃、180r/min摇菌至OD600为0.6左右，离心去掉上清液，加入含有100μm/mL的乙酰丁香酮的MS培养基重悬菌体，作为后续实验的侵染液。
(3)取猕猴桃无菌叶片，将叶片切成0.5×0.5的叶盘，将切好的叶盘放入步骤(2)的侵染液中，低速振荡15min；
(4)侵染结束后，去掉侵染液，并用无菌水洗涤4次，然后用无菌滤纸除去残留的液体，并晾干叶盘；
(5)将步骤(4)中的叶盘接种到猕猴桃组织培养的愈伤诱导培养基(愈伤诱导培养基的配方为：每升含有TDZ 1mg、NAA 0.5mg、琼脂6g，余量为MS培养基)中进行共培养3天；
(6)取出步骤(5)中共培养结束后的叶盘并用无菌水洗涤4次，晾干；重新接入含有200mg/L特美汀的愈伤诱导培养基(愈伤诱导培养基的配方同步骤(5)的相同)中进行延迟培养2天；
(7)延迟培养结束后，取出叶盘，接种到含有200mg/L特美汀、75mg/L的G418的愈伤诱导培养基(愈伤诱导培养基的配方同步骤(5)的相同)中，每15天继代一次，一共继代4次；
(8)G418筛选结束后，将得到的抗性愈伤分成两部分一部分用于检测，一部分用于植株再生；用CTAB法提取抗性愈伤的DNA，然后用位点特异性的引物进行PCR扩增(F1/R1用于B1的检测，F2/R2用于B2的检测)，将PCR产物克隆到TA载体中，挑取阳性克隆送样测序(图2、图3和图4)。
(9)通过突变体鉴定，我们的结果证明我们所构建的基于PTG-Cas9的猕猴桃基因AcPDS编辑载体可以成功地诱导定点突变(图5)，对猕猴桃基因AcPDS突变处理的结果见表3。
从表3可知：我们所构建的基于PTG-Cas9的猕猴桃基因AcPDS编辑载体，可以在猕猴桃细胞内高效的发挥单靶点编辑(65.38％-91.67％)和多靶点编辑(65.38％-83.33％)。
表3基于PTG-Cas9的猕猴桃基因AcPDS编辑载体对猕猴桃基因进行突变处理的结果
序列表
<110> 中国科学院华南植物园
<120> 一种基于PTG-Cas9的猕猴桃基因AcPDS编辑载体及其构建方法和应用
<160> 9
<210> 1
<211> 人工序列
<212> DNA
<213> 177
<400> 1
ggatccgttt cagagctatg ctggaaacag catagcaagt tgaaataagg ctagtccgtt 60
atcaacttga aaaagtggca ccgagtcggt gcttaacaaa gcaccagtgg tctagtggta 120
gaatagtacc ctgccacggt acagacccgg gttcgattcc cggctggtgc aaagctt 177
<210> 2
<211> pYLsgRNA-AtU6-1
<212> DNA
<213> 334
<400> 2
gaccggtaag gcgcgagaaa tctcaaaatt ccggcagaac aattttgaat ctcgatccgt 60
agaaacgaga cggtcattgt tttagttcca ccacgattat atttgaaatt tacgtgagtg 120
tgagtgagac ttgcataaga aaataaaatc tttagttggg aaaaaattca ataatataaa 180
tgggcttgag aaggaagcga gggataggcc tttttctaaa ataggcccat ttaagctatt 240
aacaatcttc aaaagtacca cagcgcttag gtaaagaaag cagctgagtt tatatatggt 300
tagagacgaa gtagtgatta acaaagcacc agtg 334
<210> 3
<211> pHLW-gRNA-tRNA-HF
<212> DNA
<213> 91
<400> 3
aacaaagcac cagtggtcta gtggtagaat agtaccctgc cacggtacag acccgggttc 60
gattcccggc tggtgcaaga gaccggtctc g 91
<210> 4
<211> pYLsgRNA-AtU6-1
<212> DNA
<213> 121
<400> 4
agagaccggt ctcggtttca gagctatgct ggaaacagca tagcaagttg aaataaggct 60
agtccgttat caacttgaaa aagtggcacc gagtcggtgc ttttttcgcg cctctcgagc 120
t 121
<210> 5
<211> pPTG-gRNA-Cas9-U6-1
<212> DNA
<213> 487
<400> 5
agaaatctca aaattccggc agaacaattt tgaatctcga tccgtagaaa cgagacggtc 60
attgttttag ttccaccacg attatatttg aaatttacgt gagtgtgagt gagacttgca 120
taagaaaata aaatctttag ttgggaaaaa attcaataat ataaatgggc ttgagaagga 180
agcgagggat aggccttttt ctaaaatagg cccatttaag ctattaacaa tcttcaaaag 240
taccacagcg cttaggtaaa gaaagcagct gagtttatat atggttagag acgaagtagt 300
gattaacaaa gcaccagtgg tctagtggta gaatagtacc ctgccacggt acagacccgg 360
gttcgattcc cggctggtgc aagagaccgg tctcggtttc agagctatgc tggaaacagc 420
atagcaagtt gaaataaggc tagtccgtta tcaacttgaa aaagtggcac cgagtcggtg 480
ctttttt 487
<210> 6
<211> pHLW-gRNA-tRNA-HF
<212> DNA
<213> 227
<400> 6
ggtctcttgc acaggtctgt cccatcaaga tgtttcagag ctatgctgga aacagcatag 60
caagttgaaa taaggctagt ccgttatcaa cttgaaaaag tggcaccgag tcggtgctta 120
acaaagcacc agtggtctag tggtagaata gtaccctgcc acggtacaga cccgggttcg 180
attcccggct ggtgcaggag tctgatactg gcttaggttt agagacc 227
<210> 7
<211> pHLW-gRNA-tRNA-HF
<212> DNA
<213> 227
<400> 7
ggtctcttgc aactcgatgg atgatgatat agtttcagag ctatgctgga aacagcatag 60
caagttgaaa taaggctagt ccgttatcaa cttgaaaaag tggcaccgag tcggtgctta 120
acaaagcacc agtggtctag tggtagaata gtaccctgcc acggtacaga cccgggttcg 180
attcccggct ggtgcaatgg tttaactgtt aaagacgttt agagacc 227
<210> 8
<211> pPTG-gRNA-Cas9-U6-1-PDS-1
<212> DNA
<213> 678
<400> 8
agaaatctca aaattccggc agaacaattt tgaatctcga tccgtagaaa cgagacggtc 60
attgttttag ttccaccacg attatatttg aaatttacgt gagtgtgagt gagacttgca 120
taagaaaata aaatctttag ttgggaaaaa attcaataat ataaatgggc ttgagaagga 180
agcgagggat aggccttttt ctaaaatagg cccatttaag ctattaacaa tcttcaaaag 240
taccacagcg cttaggtaaa gaaagcagct gagtttatat atggttagag acgaagtagt 300
gattaacaaa gcaccagtgg tctagtggta gaatagtacc ctgccacggt acagacccgg 360
gttcgattcc cggctggtgc acaggtctgt cccatcaaga tgtttcagag ctatgctgga 420
aacagcatag caagttgaaa taaggctagt ccgttatcaa cttgaaaaag tggcaccgag 480
tcggtgctta acaaagcacc agtggtctag tggtagaata gtaccctgcc acggtacaga 540
cccgggttcg attcccggct ggtgcaggag tctgatactg gcttaggttt cagagctatg 600
ctggaaacag catagcaagt tgaaataagg ctagtccgtt atcaacttga aaaagtggca 660
ccgagtcggt gctttttt 678
<210> 9
<211> pPTG-gRNA-Cas9-U6-1-PDS-2
<212> DNA
<213> 678
<400> 9
agaaatctca aaattccggc agaacaattt tgaatctcga tccgtagaaa cgagacggtc 60
attgttttag ttccaccacg attatatttg aaatttacgt gagtgtgagt gagacttgca 120
taagaaaata aaatctttag ttgggaaaaa attcaataat ataaatgggc ttgagaagga 180
agcgagggat aggccttttt ctaaaatagg cccatttaag ctattaacaa tcttcaaaag 240
taccacagcg cttaggtaaa gaaagcagct gagtttatat atggttagag acgaagtagt 300
gattaacaaa gcaccagtgg tctagtggta gaatagtacc ctgccacggt acagacccgg 360
gttcgattcc cggctggtgc aactcgatgg atgatgatat agtttcagag ctatgctgga 420
aacagcatag caagttgaaa taaggctagt ccgttatcaa cttgaaaaag tggcaccgag 480
tcggtgctta acaaagcacc agtggtctag tggtagaata gtaccctgcc acggtacaga 540
cccgggttcg attcccggct ggtgcaatgg tttaactgtt aaagacgttt cagagctatg 600
ctggaaacag catagcaagt tgaaataagg ctagtccgtt atcaacttga aaaagtggca 660
ccgagtcggt gctttttt 678
Claims (9)
1.一种靶向猕猴桃基因AcPDS的sgRNA表达盒，其特征在于，所述的sgRNA表达盒的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示或如SEQ ID NO.9所示。
2.一种基于PTG-Cas9的猕猴桃基因AcPDS编辑载体，其特征在于，包括载体pYLCRISPR/Cas9P-35S-N片段和通过无缝克隆插入到载体pYLCRISPR/Cas9P-35S-N的AscI酶切位点的权利要求1所述的sgRNA表达盒。
3.一种含有权利要求2所述的基于PTG-Cas9的猕猴桃基因AcPDS编辑载体的细菌。
4.根据权利要求3所述的细菌，其特征在于，所述的细菌为农杆菌EHA105。
5.一种猕猴桃基因AcPDS定点突变试剂盒，其特征在于，包含权利要求1所述的靶向猕猴桃基因AcPDS的sgRNA表达盒或权利要求2所述的基于PTG-Cas9的猕猴桃基因AcPDS编辑载体或权利要求3所述的细菌。
6.一种权利要求2所述的基于PTG-Cas9的猕猴桃基因AcPDS编辑载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)人工合成依次含有BamHI酶切位点、gRNA scaffold、tRNAGly和HindIII酶切位点的片段一；分别将片段一和载体pYLsgRNA-AtU6-1用BamHI和HindIII限制性内切酶进行双酶切反应，回收对应的酶切产物；
(2)将步骤(1)回收的酶切产物混合后使用T4 DNA连接酶进行连接反应，得到sgRNA的中间载体pHLW-gRNA-tRNA-HF；
(3)以质粒pYLsgRNA-AtU6-1为模板，以引物U6-1-F和U6-1-R作为引物进行PCR扩增，得到含有AtU6-1启动子的片段二；以质粒pHLW-gRNA-tRNA-HF为模板，以引物TF和TR作为引物进行PCR扩增，得到含有tRNAGly和BsaI酶切位点的片段三；以pYLsgRNA-AtU6-1为模板，以引物GF和GR作为引物进行PCR扩增，得到含有BsaI酶切位点、gRNA scaff old和终止子的片段四；
(4)使用AscI限制性内切酶单酶切质粒pYLCRISPR/Cas9P-35S-N，回收后得到线性化的pYLCRISPR/Cas9P-35S-N；
(5)将步骤(3)得到的片段二、片段三、片段四和线性化的pYLCRISPR/Cas9P-35S-N混合后进行同源重组反应，得到质粒pPTG-gRNA-Cas9-U6-1；
(6)根据猕猴桃基因AcPDS的序列，设计靶标序列对应的引物ptg-gRNA1-F/ptg-gRNA2-R或引物ptg-gRNA3-F/ptg-gRNA4-R；
(7)以质粒pHLW-gRNA-tRNA-HF为模板，以引物ptg-gRNA1-F和ptg-gRNA2-R作为引物进行PCR扩增，回收并纯化得到两端带有BsaI酶切位点、同时含有两个靶标序列的片段五；
或者，以质粒pHLW-gRNA-tRNA-HF为模板，以引物ptg-gRNA3-F和ptg-gRNA4-R作为引物进行PCR扩增，回收并纯化得到两端带有BsaI酶切位点、同时含有两个靶标序列的片段六；
(8)将步骤(7)得到的片段五或片段六与载体pPTG-gRNA-Cas9-U6-1混合，使用BsaI限制性内切酶和T4 DNA连接酶进行循环酶切连接反应，得到基于PTG-Cas9的猕猴桃基因AcPDS编辑载体；
所述的步骤(3)和(5)中使用的引物序列如下：
U6-1-F：5’-GACCGGTAAGGCGCGAGAAATCTCAAAATTCCGGCAGAACAA-3’；
U6-1-R-：5’-CACTGGTGCTTTGTTAATCACTACTTCGTCTCTAACCATATAT-3’；
TF：5’-AACAAAGCACCAGTGGTCTAGTGGTAGAATAGTACCCTGCCACGGTACAGACCCGGGT-3’；
TR：5’-CGAGACCGGTCTCTTGCACCAGCCGGGAATCGAACCCGGGTCTGTACCGTGG-3’；
GF：5’-AGAGACCGGTCTCGGTTTCAGAGCTATGCTGGAAACAGC-3’；
GR：5’-AGCTCGAGAGGCGCGAAAAAAGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTCAAGTTGAT-3’；
ptg-gRNA1-F：5’-GGTCTCTTGCACAGGTCTGTCCCATCAAGATGTTTCAGAGCTATGCTGGA-3’；
ptg-gRNA2-R：5’-GGTCTCTAAACCTAAGCCAGTATCAGACTCCTGCACCAGCCGGGAATCGA-3’；
ptg-gRNA3-F：5’-GGTCTCTTGCAACTCGATGGATGATGATATAGTTTCAGAGCTATGCTGGA-3’；
ptg-gRNA4-R：5’-GGTCTCTAAACGTCTTTAACAGTTAAACCATTGCACCAGCCGGGAATCGA-3’。
7.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于，步骤(1)所述的片段一的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
8.一种猕猴桃基因AcPDS定点突变的方法，其特征在于，包括以下步骤：将权利要求2所述的基于PTG-Cas9的猕猴桃基因AcPDS编辑载体电转化农杆菌EHA105感受态细胞，筛选阳性克隆，然后侵染猕猴桃叶片，以侵染后的猕猴桃叶片为外植体进行植物组织培养，经抗性筛选，抗性愈伤组织分化再生，用TA克隆测序验证，确认获得转基因猕猴桃。
9.权利要求1所述的靶向猕猴桃基因AcPDS的sgRNA表达盒或权利要求2所述的基于PTG-Cas9的猕猴桃基因AcPDS编辑载体或权利要求3所述的细菌或权利要求5所述的猕猴桃基因AcPDS定点突变试剂盒在猕猴桃基因AcPDS定点突变中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201710702385.XA CN107603980B (zh) | 2017-08-16 | 2017-08-16 | 一种基于PTG-Cas9的猕猴桃基因AcPDS编辑载体及其构建方法和应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201710702385.XA CN107603980B (zh) | 2017-08-16 | 2017-08-16 | 一种基于PTG-Cas9的猕猴桃基因AcPDS编辑载体及其构建方法和应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN107603980A CN107603980A (zh) | 2018-01-19 |
| CN107603980B true CN107603980B (zh) | 2020-03-24 |
Family
ID=61064088
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201710702385.XA Active CN107603980B (zh) | 2017-08-16 | 2017-08-16 | 一种基于PTG-Cas9的猕猴桃基因AcPDS编辑载体及其构建方法和应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN107603980B (zh) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110257420A (zh) * | 2019-06-14 | 2019-09-20 | 中国科学院武汉植物园 | 基于CasRx的植物基因沉默载体及其构建方法和应用 |
| CN110408652A (zh) * | 2019-08-08 | 2019-11-05 | 中国科学院新疆生态与地理研究所 | 一种基于CRISPR/Cas9系统对新疆野苹果基因多靶点定点突变的方法 |
| CN112442512A (zh) * | 2019-08-30 | 2021-03-05 | 华中农业大学 | 基于tRNA-gRNA-cRNA进行日本青鳉胚胎和细胞的基因编辑系统 |
| CN111979261A (zh) * | 2020-07-29 | 2020-11-24 | 武汉楚为生物科技股份有限公司 | 创制番茄果实色泽材料的多基因编辑载体及方法 |
| CN113564197B (zh) * | 2021-07-08 | 2024-03-15 | 上海师范大学 | 一种CRISPR/Cas9介导的植物多基因编辑载体的构建方法和应用 |
| CN114150001A (zh) * | 2021-11-05 | 2022-03-08 | 中国农业科学院上海兽医研究所(中国动物卫生与流行病学中心上海分中心) | 一种用于弓形虫基因编辑的CRISPR/Cas9载体的构建方法 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101875944A (zh) * | 2009-11-18 | 2010-11-03 | 北京市农林科学院 | 副猪嗜血杆菌aroA基因自杀载体及构建方法 |
| CN107446924A (zh) * | 2017-08-16 | 2017-12-08 | 中国科学院华南植物园 | 一种基于CRISPR‑Cas9的猕猴桃基因AcPDS编辑载体及其构建方法和应用 |
-
2017
- 2017-08-16 CN CN201710702385.XA patent/CN107603980B/zh active Active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101875944A (zh) * | 2009-11-18 | 2010-11-03 | 北京市农林科学院 | 副猪嗜血杆菌aroA基因自杀载体及构建方法 |
| CN107446924A (zh) * | 2017-08-16 | 2017-12-08 | 中国科学院华南植物园 | 一种基于CRISPR‑Cas9的猕猴桃基因AcPDS编辑载体及其构建方法和应用 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Optimized paired-sgRNA/Cas9 cloning and expression cassette triggers high-efficiency multiplex genome editing in kiwifruit;Zupeng Wang 等;《Plant Biotechnology Journal》;20180206;第16卷(第8期);第1424-1433 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN107603980A (zh) | 2018-01-19 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN107446924B (zh) | 一种基于CRISPR-Cas9的猕猴桃基因AcPDS编辑载体及其构建方法和应用 | |
| CN107603980B (zh) | 一种基于PTG-Cas9的猕猴桃基因AcPDS编辑载体及其构建方法和应用 | |
| CN109652422B (zh) | 高效的单碱基编辑系统OsSpCas9-eCDA及其应用 | |
| CN112126637B (zh) | 腺苷脱氨酶及其相关生物材料与应用 | |
| CN112143753A (zh) | 一套腺嘌呤碱基编辑器及其相关生物材料与应用 | |
| CN110283838B (zh) | 一种高剪切效率ScCas9基因及其应用 | |
| CA2658926A1 (en) | Cosmid vector for transforming plant and use thereof | |
| US20230130592A1 (en) | Novel agrobacterium tumefaciens strains | |
| CN111718954B (zh) | 一种基因组编辑工具及其应用 | |
| CN111116725B (zh) | 基因Os11g0682000及其编码的蛋白在调控水稻白叶枯病抗性中的应用 | |
| US20220315938A1 (en) | AUGMENTED sgRNAS AND METHODS FOR THEIR USE TO ENHANCE SOMATIC AND GERMLINE PLANT GENOME ENGINEERING | |
| JP6628218B2 (ja) | アグロバクテリウム、及びそれを用いた形質転換植物の製造方法 | |
| CN112080513A (zh) | 一套编辑范围扩展的水稻人工基因组编辑系统及其应用 | |
| CN112553203A (zh) | 一种调控杨树生长发育的长链非编码RNA-lnc5及其应用 | |
| US6720478B1 (en) | RAD51-like polynucleotide and uses thereof | |
| Sam et al. | DESIGN AND TRANSFER OF OsSWEET14-EDITING T-DNA CONSTRUCT TO BAC THOM 7 RICE CULTIVAR. | |
| CN116286742B (zh) | CasD蛋白、CRISPR/CasD基因编辑系统及其在植物基因编辑中的应用 | |
| Sun et al. | Generation of CRISPR-edited birch Plants without DNA integration using Agrobacterium-mediated Transformation Technology | |
| CN115851784B (zh) | 一种利用Lbcpf1变体构建的植物胞嘧啶碱基编辑系统及其应用 | |
| EP1141303A1 (en) | Maize rad2/fen-1 orthologues and uses thereof | |
| AU771438B2 (en) | Maize Rad50 orthologue and uses thereof | |
| EP3253877A1 (en) | Agrobacterium-mediated genome modification without t-dna integration | |
| WO2023111130A1 (en) | Modified agrobacteria for editing plants | |
| US20040143870A1 (en) | RuvB polynucleotides and uses thereof | |
| EP4326863A1 (en) | Tissue-culture independent gene editing of cells by a long-distance rna transport system |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |