CN112080513A

CN112080513A - 一套编辑范围扩展的水稻人工基因组编辑系统及其应用

Info

Publication number: CN112080513A
Application number: CN202010971535.9A
Authority: CN
Inventors: 周焕斌; 周雪平; 徐子妍; 旷永洁; 任斌; 闫大琦; 严芳
Original assignee: Institute of Plant Protection of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Plant Protection of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2020-09-16
Filing date: 2020-09-16
Publication date: 2020-12-15

Abstract

本发明公开了一套编辑范围扩展的水稻人工基因编辑系统及其应用。本发明提供了DNA分子在水稻单碱基编辑中的应用，该DNA分子由含Cas蛋白+脱氨酶表达盒和sgRNA表达盒组成；所述含Cas蛋白+脱氨酶表达盒表达融合蛋白，所述融合蛋白含有Cas蛋白和脱氨酶，所述脱氨酶为胞嘧啶脱氨酶和/或腺嘌呤脱氨酶，所述Cas蛋白为氨基酸序列是SEQ ID No.6的第212‑1578位的蛋白质；所述sgRNA表达盒表达sgRNA，所述sgRNA的靶标序列是5′‑N_19‑20PAM‑3′。本发明能广泛地应用于水稻基因组中靶标基因的敲除或单碱基的定向突变。

Description

一套编辑范围扩展的水稻人工基因组编辑系统及其应用

技术领域

本发明涉及一套编辑范围扩展的水稻人工基因组编辑系统及其应用。

背景技术

水稻(Oryza sativa L.)是我国乃至世界上最主要的粮食作物，世界上近一半人口将稻米作为主食。中国也是世界上水稻总产量最高的国家，占全球总量的30％左右。但是，随着全球人口的不断增长，以及在生产过程中，水稻各种病害严重制约着水稻的生长发育，影响水稻的产量和品质降低，威胁着全球的粮食安全。因此，改善稻米品质，增加水稻植株抗病、抗逆性、提高水稻产量等研究以保证粮食的稳定供给是人类社会可持续性发展的重大课题。

近年来，基于CRISPR/Cas系统的植物基因组编辑技术发展迅速，在植物中实现了高效便捷的单基因敲除、多基因敲除、DNA大片段删除和基因定点插入替换等，尤其是后面发展而来的单碱基编辑技术和引导编辑技术，更是实现了在单个核苷酸水平上的精准修饰，包括单碱基定向替换和DNA小片段精准插入缺失，这些技术的发展和成熟极大地促进了植物功能基因组学研究和农作物精准遗传改良，加速植物生物学研究进程和保障农业粮食安全生产。植物单碱基编辑技术是由碱基脱氨酶和切口酶Cas9(D10A)形成融合蛋白，在sgRNA的引导下，融合蛋白特异地结合靶位点并将位于碱基编辑活性窗口内的靶碱基胞嘧啶C或腺嘌呤A经过脱氨、DNA修复和复制后逐渐被分别替换为胸腺嘧啶T或鸟嘌呤G，最终形成C向T(胞嘧啶碱基编辑)和A向G(腺嘌呤碱基编辑)的定向替换。与基因定点敲除的碱基随机插入缺失相比，单碱基编辑技术可实现精准碱基修饰，对基因功能研究和作物缺陷型基因矫正更有应用价值。但是通常由于靶碱基位置的固定性，需要同时考虑碱基编辑活性窗口和识别PAM序列，这就使得打靶sgRNA引物的选择受到严重限制，而这种限制主要是由碱基编辑器中所用Cas蛋白的识别PAM导致的。

目前，植物基因组编辑技术中应用最为广泛的系统是来源于化脓链球菌Streptococcus pyogenes的CRISPR/SpCas9系统，在该系统中，SpCas9对靶位点的切割需要识别靶位点序列3′端保守的PAM序列(主要为NGG)。但是对NGG PAM序列的需求，也使得该系统在实际应用过程中受到诸多的限制，比如需要编辑的靶位点附近没有合适的NGG PAM序列等。尤其是在使用单碱基编辑技术对特定靶碱基进行定向编辑时，需要同时考虑碱基编辑活性窗口和识别PAM序列，这就使得单碱基编辑技术的应用更受限制。

因此，能够在植物中开发出一种高效且识别非典型PAM序列的基因组编辑技术，不仅能够在植物全基因组范围内实现基因编辑并且大大地提高基因编辑效率，还能极大地扩展单碱基编辑技术在植物中的编辑范围，这将对植物功能基因组学研究以及作物精准育种等方面具有重要的促进作用。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何开发出高效且既适用于典型PAM序列(如NGG)又适用于非典型PAM序列的植物基因组编辑技术(如水稻基因组编辑技术)。

由于现有技术中的基因组编辑技术存在PAM的限制，进而使得在水稻基因组任意位点进行基因编辑受到了限制，为了解决这一技术问题，本发明提供了DNA分子(基因编辑工具盒)在水稻单碱基编辑中的应用。

本发明所提供的DNA分子在水稻单碱基编辑中的应用中，所述DNA分子由含Cas蛋白+脱氨酶表达盒和sgRNA表达盒组成；所述含Cas蛋白+脱氨酶表达盒表达融合蛋白，所述融合蛋白含有Cas蛋白和脱氨酶，所述脱氨酶为胞嘧啶脱氨酶(cytosine deaminase)和/或腺嘌呤脱氨酶(adenosine deaminase)，所述Cas蛋白为氨基酸序列是SEQ ID No.6的第212-1578位的蛋白质；所述sgRNA表达盒表达sgRNA，所述sgRNA的靶标序列是5′-N_19-20PAM-3′，所述N_19-20为19-20个N，所述PAM(protospacer adjacent motif)为3个N；所述N为A、G、C或T。

上述应用中，所述含Cas蛋白+脱氨酶表达盒和sgRNA表达盒组成可以在一种DNA分子上，也可以分别在两种DNA分子上。

上述应用中，所述含Cas蛋白+脱氨酶表达盒为含Cas蛋白+胞嘧啶脱氨酶表达盒或含Cas蛋白+腺嘌呤脱氨酶表达盒；所述含Cas蛋白+胞嘧啶脱氨酶表达盒表达名称为Cas蛋白/胞嘧啶脱氨酶的融合蛋白，所述Cas蛋白/胞嘧啶脱氨酶含有所述胞嘧啶脱氨酶、所述Cas蛋白和尿嘧啶DNA糖基化酶抑制剂(uracil glycosylase inhibitor,UGI)；所述含Cas蛋白+腺嘌呤脱氨酶表达盒表达名称为Cas蛋白/腺嘌呤脱氨酶的融合蛋白，所述Cas蛋白/腺嘌呤脱氨酶含有所述腺嘌呤脱氨酶和所述Cas蛋白。

上述应用中，所述Cas蛋白/胞嘧啶脱氨酶可为由所述胞嘧啶脱氨酶、所述Cas蛋白、所述尿嘧啶DNA糖基化酶抑制剂和核定位信号(nuclear localization signal,NLS)连接而成的蛋白质。该蛋白质以下简称碱基编辑器(base editor)rBE66；所述Cas蛋白/腺嘌呤脱氨酶可为由所述腺嘌呤脱氨酶、所述Cas蛋白和所述核定位信号连接而成的蛋白质。该蛋白质以下简称碱基编辑器(base editor)rBE68。

在本发明的一个实施例中，rBE66的氨基酸序列是序列表中的SEQ ID No.6。SEQID No.6中，第1-195位是hAID*Δ的氨基酸序列，第196-211位是连接肽的氨基酸序列，第212-1578位是Cas9-AA(D10A)的氨基酸序列，第1579-1669位是UGI的氨基酸序列，第1670-1676位是NLS的氨基酸序列。

在本发明的一个实施例中，rBE68的氨基酸序列是序列表中的SEQ ID No.8。SEQID No.8中，第1-167位是wtTadA的氨基酸序列，第168-199位是连接肽的氨基酸序列，第200-365位是TadA7.10的氨基酸序列，第366-397位是连接肽的氨基酸序列，第398-1764位是Cas9-AA(D10A)的氨基酸序列，第1765-1774位是NLS的氨基酸序列。

上述应用中，所述含Cas蛋白+脱氨酶表达盒中含有所述Cas蛋白的编码基因，所述Cas蛋白的编码基因的编码链的编码序列(CDS)是序列表中的SEQ ID No.5的第640-4740位。

上述应用中，所述含Cas蛋白+胞嘧啶脱氨酶表达盒含有所述Cas蛋白/胞嘧啶脱氨酶的编码基因，所述Cas蛋白/胞嘧啶脱氨酶的编码基因的编码链的编码序列(CDS)是序列表中的SEQ ID No.5；所述含Cas蛋白+腺嘌呤脱氨酶表达盒含有所述Cas蛋白/腺嘌呤脱氨酶的编码基因，所述Cas蛋白/腺嘌呤脱氨酶的编码基因的编码链的编码序列(CDS)是序列表中的SEQ ID No.7。

上述应用中，所述含Cas蛋白+脱氨酶表达盒，是指能够在宿主细胞(如植物细胞)中表达所述融合蛋白的DNA，该DNA不但可包括启动所述融合蛋白基因转录的启动子，还可包括终止所述融合蛋白基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子，组织、器官和发育特异的启动子，和诱导型启动子。启动子的例子包括但不限于：玉米的Ubiquitin启动子、花椰菜花叶病毒的组成型启动子35S；来自西红柿的创伤诱导型启动子，亮氨酸氨基肽酶("LAP",Chao等人(1999)Plant Physiology 120:979-992)；来自烟草的化学诱导型启动子，病程相关蛋白1(PR1)(由水杨酸和BTH(苯并噻二唑-7-硫代羟酸S-甲酯)诱导)；西红柿蛋白酶抑制剂II启动子(PIN2)或LAP启动子(均可用茉莉酮酸甲酯诱导)；热休克启动子(美国专利5，187，267)；四环素诱导型启动子(美国专利5，057,422)；种子特异性启动子，如谷子种子特异性启动子pF128(CN101063139B(中国专利2007 1 0099169.7))，种子贮存蛋白质特异的启动子(例如，菜豆球蛋白、napin,oleosin和大豆beta conglycin的启动子(Beachy等人(1985)EMBOJ.4:3047-3053))。它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。此处引用的所有参考文献均全文引用。合适的转录终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子(NOS终止子)、花椰菜花叶病毒CaMV 35S终止子、tml终止子、豌豆rbcS E9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子(参见，例如：Odell等人(I⁹⁸⁵)Nature 313:810；Rosenberg等人(1987)Gene,56:125；Guerineau等人(1991)Mol.Gen.Genet,262:141；Proudfoot(1991)Cell,64:671；Sanfacon等人Genes Dev.,5:141；Mogen等人(1990)Plant Cell,2:1261；Munroe等人(1990)Gene,91:151；Ballad等人(1989)Nucleic Acids Res.17:7891；Joshi等人(1987)Nucleic Acid Res.,15:9627)。

在本发明的一个实施例中，所述含Cas蛋白+胞嘧啶脱氨酶表达盒由Ubip启动子(核苷酸序列是SEQ ID No.3)，rBE66基因(即Cas蛋白/胞嘧啶脱氨酶的编码基因，其编码链的CDS是序列表中的SEQ ID No.5)和NOS终止子(核苷酸序列是SEQ ID No.4)连接而成。SEQID No.5中，第1-6位为BamHI识别位点，第7-591位为hAID*Δ的CDS，第592-639位为连接肽的CDS，第640-4740位为Cas9-AA(D10A)的CDS，第4741-5013位为UGI的CDS，第5014-5034位为NLS的CDS，第5035-5037位为终止密码子TGA，第5038-5043位为BcuI识别位点。pUbi-rBE66中含有用于gateway LR反应的元件attR1-ccdB-attR2。

在本发明的一个实施例中，所述含Cas蛋白+腺嘌呤脱氨酶表达盒由Ubip启动子(核苷酸序列是SEQ ID No.3)，rBE68基因(即Cas蛋白/腺嘌呤脱氨酶的编码基因，其编码链的CDS是序列表中的SEQ ID No.7)和NOS终止子(核苷酸序列是SEQ ID No.4)连接而成。SEQID No.7中，第1-6位为BamHI识别位点，第7-507位为wtTadA的CDS，第508-603位为连接肽的CDS，第604-1101位为TadA7.10的CDS，第1102-1197位为连接肽的CDS，第1198-5298位为Cas9-AA(D10A)的CDS，第5299-5328位为NLS的CDS，第5329-5331位为终止密码子TGA，第5332-5337位为BcuI识别位点。

上述应用中，所述PAM可为下述任一种：

L1、5′-NAN-3′，L2、5′-NGN-3′，L3、5′-NCG-3′，L4、5′-NCT-3′，L5、5′-NCC-3′，L6、5′-NTC-3′，所述N为A、G、C或T。

上述应用中，所述5′-NAN-3′可为5′-NAG-3′、5′-NAA-3′、5′-NAT-3′和5′-NAC-3′，所述5′-NGN可为5′-NGA-3′、5′-NGT-3′、5′-NGC-3′和5′-NGG-3′。

与上述应用中任一所述的DNA分子相关的生物材料，也属于本发明的保护范围：

B1)上述应用中任一所述的DNA分子；

B2)含有B1)所述DNA分子的重组载体；

B3)含有B1)所述DNA分子的重组微生物；

B4)含有B2)所述的重组载体的重组微生物；

B5)由上述应用中任一所述的DNA分子中的所述Cas蛋白+脱氨酶表达盒和所述sgRNA表达盒组成的组合物；

B6)由上述应用中任一所述的DNA分子中的所述Cas蛋白+脱氨酶表达盒的重组载体和含有上述应用中任一所述的DNA分子中的所述sgRNA表达盒的重组载体组成的组合物；

B7)由上述应用中任一所述的DNA分子中的所述Cas蛋白+脱氨酶表达盒的重组微生物和含有上述应用中任一所述的DNA分子中的所述sgRNA表达盒的重组微生物组成的组合物；

B8)由上述应用中任一所述的DNA分子中的所述融合蛋白和上述应用中任一所述的DNA分子中的所述sgRNA组成的组合物。

上述生物材料中，所述重组微生物具体可为细菌，酵母，藻和真菌。B5)-和B8)所述的组合物可为用于植物单碱基编辑的组合物，如水稻单碱基编辑的组合物。

上述应用中任一所述的Cas蛋白、上述应用中任一所述的DNA分子或所述生物材料在植物基因组编辑中的应用也属于本发明的保护范围。

上述应用中，所述植物基因组编辑可为植物基因组单碱基编辑。所述植物基因组单碱基编辑可为水稻单碱基编辑。

上述应用中，所述植物可为双子叶植物或单子叶植物。所述单子叶植物可为水稻。

在将所述DNA分子(基因编辑工具盒)导入受体植物时，可以采用PEG介导转化的方法，也可以采用基因枪法或农杆菌侵染法中的一种将所述基因编辑工具盒导入到水稻原生质体或愈伤组织中，这是本领域技术人员容易理解的。本领域的技术人员公知，水稻基因组DNA由两条链组成，因此，所述靶核苷酸序列可以在其中互补的任意一条链上。例如，当所述靶核苷酸序列位于某一功能基因的一正义链中时，如果在该功能基因的特定位点上发生一至数个碱基的缺失或插入，并且如果其中的一种突变能够获得预期的使该基因移码突变而产生基因失活，则可以采用此系统来实现，即可以通过直接进行正义链上的碱基缺失或插入，得到水稻基因敲除突变体；当所述靶核苷酸序列位于某一功能基因的正义条链中时，如果该功能基因的特定位点上的C被定点突变为T后，并且如果其中的一种突变能够获得预期的其对应的功能蛋白中的氨基酸，则可以采用此系统来实现，即可以通过直接进行正义链上的碱基替换来实现三联体密码子中的C替换为T，得到水稻基因功能“矫正”突变体；或当所述靶核苷酸序列位于某一功能基因的反义链中时，如果该功能基因的特定位点上的G被定点突变为A后，并且如果其中的一种突变能够获得预期的其对应的功能蛋白中的氨基酸，也可以采用此系统来实现，即可以通过将反义链中的C被定点突变为T，进而使正义链中的相应互补的G替换为A来改变正义链中的所述三联体密码子编码氨基酸，得到水稻基因功能“矫正”突变体；当所述靶核苷酸序列位于某一功能基因的反义链中时，如果该功能基因的特定位点上的T被定点突变为C后，并且如果其中的一种突变能够获得预期的其对应的功能蛋白中的氨基酸，则可以采用此系统来实现，即可以通过将该反义链中的A被定点突变为G，进而使正义链中的相应互补的T替换为C来改变正义链中的所述三联体密码子编码氨基酸，得到水稻基因功能“矫正”突变体；或当所述靶核苷酸序列位于某一功能基因的正义链中时，如果该功能基因的特定位点上的A被定点突变为G后，并且如果其中的一种突变能够获得预期的其对应的功能蛋白中的氨基酸，也可以采用此系统来实现，即可以通过直接进行正义链上的碱基替换来实现三联体密码子中的A替换为G，从而得到水稻基因功能“矫正”突变体。

实验证明，胞嘧啶碱基编辑器rBE66能够识别NGC、NAG和NGA PAM(即NRN PAM，R为A或G)完成靶碱基编辑，对OsCOI2的NGC PAM靶点的靶碱基编辑效率为26.00％；对OsCOI2的NAG PAM靶点的靶碱基编辑效率为34.15％，靶核苷酸序列5′到3′方向的第4和6位的胞嘧啶C可被脱氨替换成T或G；对OsSERK2的NGA PAM靶点的编辑效率为50.00％。其靶核苷酸序列5′到3′方向的第2、3、7、10位的胞嘧啶C可被脱氨替换成T。腺嘌呤碱基编辑器rBE68能够识别NGA PAM完成靶碱基编辑，对OsSERK2的NGA PAM靶点的编辑效率为24.07％。本发明的基因编辑工具盒扩展了已有基因编辑工具盒的PAM序列，具有更宽更广的PAM识别序列，其能广泛地应用于水稻基因组中靶标基因的敲除或单碱基的定向突变，以此创制基因功能失活或获得性突变体材料。本发明不但提高了基因编辑效率，还扩展了单碱基编辑技术在植物中的编辑范围，这将对植物功能基因组学研究以及作物精准育种等方面具有重要的促进作用。尤其是碱基编辑系统在植物中的应用比通过同源重组修复的基因替换或通过非同源末端连接的基因插入更加有效和经济；而广泛的PAM序列使得实现任意位点碱基替换的可能性加大，为植物研究领域科研人员提供一个重要的基因功能研究工具，并在水稻基因功能研究和分子育种方向上为培育水稻新品种提供了新的策略。

附图说明

图1为pUbi-Cas9-AA、pENTR4-sgRNA和pUbi-Cas9-AA-sgRNA的载体图。

图2为Cas9-AA介导的水稻内源基因敲除的突变效果图。图中，ref为水稻参考基因组的相应序列，WT为未进行基因编辑的水稻粳稻品种Kitaake的相应序列，其余序列为突变株的相应序列。

图3为rBE66介导的水稻内源基因OsCOI2的胞嘧啶碱基编辑突变效果图。图中，ref为水稻参考基因组的相应序列，WT为未进行基因编辑的水稻粳稻品种Kitaake的相应序列，其余序列为突变株的相应序列。

图4为rBE66介导的水稻内源基因OsSERK2的胞嘧啶碱基编辑突变效果图。图中，ref为水稻参考基因组的相应序列，WT为未进行基因编辑的水稻粳稻品种Kitaake的相应序列，其余序列为突变株的相应序列。

图5为rBE68介导的水稻内源基因OsSERK2的腺嘌呤碱基编辑突变效果图。图中，ref为水稻参考基因组的相应序列，WT为未进行基因编辑的水稻粳稻品种Kitaake的相应序列，其余序列为突变株的相应序列。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的pUbi-Cas9由发明人所在实验室保存并提供(H.Zhou,B.Liu,D.P.Weeks,M.H.Spalding&B.Yang.Large chromosomal deletions and heritable smallgenetic changes induced by CRISPR/Cas9 in rice.Nucleic Acids Res.2014,42(17):10903-10914)。公众可从发明人所在实验室获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

实施例1、Cas9-AA在水稻中识别PAM序列的筛选鉴定

1、针对OsMPK3等16个基因的共20个靶标序列的设计和基因编辑载体构建

选取设计好的OsMPK3等16个基因的基因登录号和20个靶标序列(依据5′-N₃-3′的形式，针对PAM中后两个位点进行四种碱基的组合，设计了16种PAM)信息见表1，这些基因的基因组序列均从水稻基因组数据库(https://rapdb.dna.affrc.go.jp/)中获得。将表1中各靶标序列(5′-N_19-20PAM-3′)的正反向寡核苷酸链(具体序列见表1)委托生工生物工程(上海)股份有限公司人工合成后，使用T₄多聚核苷酸激酶将引物进行磷酸化处理，退火形成双链DNA片段(含有sgRNA的靶标序列中的5′-N_19-20-3′)，将双链DNA片段分别克隆到pENTR4-sgRNA(图1，含有attL1-sgRNA表达盒-attL2)载体的两个BtgZI或两个BsaI酶切位点中，引物U6p-F1(5′-AAGAACGAACTAAGCCGGAC-3′)测序确认插入片段完全正确后(插入片段含有sgRNA的靶标序列中的5′-N_19-20-3′)，将所得质粒经AatII酶切进行线性化，再通过Gateway的LR反应将sgRNA表达盒(含有sgRNA的编码DNA)分别克隆至植物表达载体pUbi-Cas9-AA(图1)的attR1-ccdB-attR2处，获得各靶标序列的基因编辑载体pUbi-Cas9-AA-sgRNA。pUbi-Cas9-AA-sgRNA是将pUbi-Cas9-AA的元件attR1-ccdB-attR2替换为attB1-sgRNA表达盒-attB2，保持pUbi-Cas9-AA的其它核苷酸不变得到的重组表达载体。共构建了20种基因编辑载体pUbi-Cas9-AA-sgRNA，这20种pUbi-Cas9-AA-sgRNA，区别仅在于attB1-sgRNA表达盒-attB2不同。attB1-sgRNA表达盒-attB2区别仅在于N_19-20不同，表1中的双链DNA片段合成所需的寡核苷酸链中的大写字母即对应于attB1-sgRNA表达盒-attB2中的N_19-20。共得到20种基因编辑载体pUbi-Cas9-AA-sgRNA，分别为靶向OsMPK8基因的载体，命名为pUbi-Cas9-AA-sgRNA-OsMPK8；靶向OsMPK9基因的载体，命名为pUbi-Cas9-AA-sgRNA-OsMPK9；靶向OsMPK10基因的载体，命名为pUbi-Cas9-AA-sgRNA-OsMPK10；靶向OsMPK3基因的载体，命名为pUbi-Cas9-AA-sgRNA-OsMPK3；靶向OsMPK4基因的载体，命名为pUbi-Cas9-AA-sgRNA-OsMPK4；靶向基因OsCPK1的载体，命名为pUbi-Cas9-AA-sgRNA-OsCPK1；靶向OsCPK2基因的载体，命名为pUbi-Cas9-AA-sgRNA-OsCPK2；靶向OsCPK3基因的载体，命名为pUbi-Cas9-AA-sgRNA-OsCPK3；靶向OsCPK4基因的载体，命名为pUbi-Cas9-AA-sgRNA-OsCPK4；靶向OsCPK8基因中两个靶标序列的载体，分别命名为pUbi-Cas9-AA-sgRNA-OsCPK8-1和pUbi-Cas9-AA-sgRNA-OsCPK8-2；靶向OsCPK5基因的载体，命名为pUbi-Cas9-AA-sgRNA-OsCPK5；靶向OsCPK14基因中两个靶标序列的载体，分别命名为pUbi-Cas9-AA-sgRNA-OsCPK14-1和pUbi-Cas9-AA-sgRNA-OsCPK14-2；靶向OsCPK20基因的载体，命名为pUbi-Cas9-AA-sgRNA-OsCPK20；靶向OsCPK21基因中两个靶标序列的的载体，分别命名为pUbi-Cas9-AA-sgRNA-OsCPK21-1和pUbi-Cas9-AA-sgRNA-OsCPK21-2；靶向OsCPK27基因中两个靶标序列的载体，命名为pUbi-Cas9-AA-sgRNA-OsCPK27-1和pUbi-Cas9-AA-sgRNA-OsCPK27-2和靶向OsCPK28基因的载体，命名为pUbi-Cas9-AA-sgRNA-OsCPK28。

其中，植物表达载体pUbi-Cas9-AA的构建方法如下：在确定Cas9-AA的氨基酸序列(SEQ ID No.2第18-1384位)后，根据水稻密码子使用的偏好性对Cas9-AA基因的核苷酸序列进行密码子优化，在Cas9-AA基因5′和3′端各添加一个核定位信号NLS的水稻密码子优化后的编码核苷酸序列，组成嵌合基因NLS-Cas9-AA-NLS(如SEQ ID No.1所示)并委托生工生物工程(上海)股份有限公司完成4197bp的NLS-Cas9-AA-NLS基因(核苷酸序列是SEQ IDNo.1，编码链的编码序列(CDS)是SEQ ID No.1的第7-4191位)人工合成工作。将pUbi-Cas9的BamHI和BcuI识别位点间的小片段(Cas9)替换为SEQ ID No.1的第7-4191位所示的NLS-Cas9-AA-NLS基因，得到载体pUbi-Cas9-AA。SEQ ID No.1中，第1-6位为BamHI识别位点，第7-57位为NLS的CDS，第58-4158位为Cas9-AA的CDS，第4159-4188位为NLS的CDS，第4189-4191位为终止密码子TGA，第4192-4197位为BcuI识别位点。该过程中所用限制性内切酶BamHI和BcuI以及T₄ DNA连接酶均购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司，下同。载体pUbi-Cas9-AA的主要组成元件如下：RB T-DNA repeat序列(核苷酸序列为genbank登陆号为LC506530.1的第13973至第13997位，2020年3月20日)、attR1(核苷酸序列为genbank登陆号为KR233518.1的第2055至第2174位，2015年8月8日)，ccdB表达盒(核苷酸序列为genbank登陆号为KR233518.1的第3289至第3594位，2015年8月8日)，attR2(核苷酸序列为genbank登陆号为KR233518.1的第3635至第3759位，2015年8月8日)，Ubip启动子(核苷酸序列是SEQID No.3)，NLS-Cas9-AA-NLS基因(核苷酸序列为SEQ ID No.1的第7-4191位)，NOS终止子(核苷酸序列是SEQ ID No.4)，CaMV35S启动子(核苷酸序列为genbank登陆号为FJ362600.1的第10382至第11162位，2008年11月26日)，潮霉素基因(核苷酸序列为genbank登陆号为KY420085.1，2017年7月11日)，CaMV poly(A)终止子(核苷酸序列为genbank登陆号为MK896900.1的第8618至第8792位，2019年9月4日)，LB T-DNA repeat(核苷酸序列为genbank登陆号为LC506530.1，第3569至第3593位，2020年3月20日)。

其中，pENTR4-sgRNA的构建方法如下：

按照从5′端到3′端的方向，将依次连接的U6启动子序列1、含有两个BtgZI酶切位点的核苷酸序列、sgRNA Scaffold序列、(T)8终止序列、U6启动子序列2、含有两个BsaI酶切位点的核苷酸序列、sgRNA Scaffold序列、(T)8终止序列组合sgRNA表达盒并委托委托生工生物工程(上海)股份有限公司进行人工合成。以公司合成的基因为模板，利用引物对(sgRNA-F：5′-GCAGGCTGTCGACTGGATCCAAGCTTAAGAACGAACTAAGCC-3′和sgRNA-R1：5′-CAAGAAAGCTGGGTGAATTCGATATCAAGCTTATCGATACCG-3′)扩增获得1kb的sgRNA表达盒片段(核苷酸序列是序列表中的序列SEQ ID No.9)，以pENTR4(Invitrogen)载体为模板，用pENTR4-F1：(5′-CGAATTCACCCAGCTTTCTTGTACAAAGTTGGCATTATAAGA-3′)和pENTR4-R1：(5′-CTTAGTTCGTTCTTAAGCTTGGATCCAGTCGACAGCCTGCTTTTTTGTACAAAGT-3′)扩增2.2kb的pENTR4载体骨架(是将pENTR4的ccdB基因表达盒片段去除得到的DNA片段)，借助试剂盒ClonExpress II OneStep Cloning Kit(购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司)将sgRNA表达盒片段和pENTR4载体骨架进行infusion连接，获得载体pENTR4-sgRNA(图1)。其中的两个BtgZI或两个BsaI酶切位点用于克隆中特定基因的识别序列(sgRNA的靶标序列中的5′-N_19-20-3′)。SEQ IDNo.9中，第27-348位为U6启动子序列1，第349-389位为含有两个BtgZI位点的核苷酸片段，第390-465位为sgRNA Scaffold序列,第466-473位为(T)8终止序列,第474-782位为U6启动子序列2,第783-806位为含有两个BsaI位点的核苷酸片段,第807-882位为sgRNA Scaffold序列,第883-890位为(T)8终止序列。

表1.Cas9-AA靶向各基因的靶标序列信息及其编辑效率

注：编辑效率中，分子为靶基因发生突变的T0代转基因水稻株数，分母为检测的T0代转基因水稻植株总数，括号中的数值为编辑效率。

2、农杆菌介导水稻稳定遗传转化

2.1水稻愈伤诱导：

将去壳的水稻粳稻品种Kitaake成熟种子用50％的商业化84消毒液处理45min；无菌水清洗3-5次，然后将种子转移至无菌的培养皿中，吸出多余的水份；将种子放置于MSD固体培养基(溶质为4.43g/L MS粉，30g/L蔗糖，2ml/L 2，4-D，8g/L植物凝胶；溶剂为水；pH5.7)上，于光照培养室培养10天，诱导愈伤组织形成；去除种子的胚和芽，将愈伤组织转移至新的MSD培养皿上，培养5天后用于农杆菌的转化。

2.2农杆菌转化：

将前述获得各靶核苷酸序列的20种基因编辑载体pUbi-Cas9-AA-sgRNA通过电击法分别转入农杆菌EHA105电击感受态细胞(购自北京博迈德基因技术有限公司)中。将所得农杆菌菌株在TY液体培养基(溶质为5g/L胰蛋白胨，3g/L酵母提取物；溶剂为水；pH7.0)中室温过夜培养12小时；离心收集农杆菌，用100μM乙酰丁香酮+MSD液体培养基(在MSD液体培养基中加入乙酰丁香酮至乙酰丁香酮的含量为100μM得到的液体培养基，MSD液体培养基的溶质为4.43g/L MS粉，30g/L蔗糖，2ml/L 2，4-D；溶剂为水；pH5.7)重悬，使其OD600nm＝0.2待用。

2.3水稻愈伤的农杆菌侵染：

将愈伤组织分别置于上述农杆菌悬浮液中；浸泡30min后除去农杆菌悬浮液，将愈伤组织转移至无菌的吸水纸上除去多余的农杆菌菌液，再将愈伤组织转移至含有100μM乙酰丁香酮的MSD平板上，室温避光培养3天。

2.4水稻抗性愈伤筛选：

将暗培养后的愈伤组织转移至MSD筛选培养基(在MSD固体培养基中加入特美汀和潮霉素B至特美汀的含量为100mg/L和潮霉素B的含量为50mg/L得到的固体培养基)上培养，直至褐色旧愈伤组织表面出现鲜黄色抗性愈伤组织；每2周换一次培养基。

2.5抗性愈伤组织分化与生根：

将抗性愈伤组织转移至再生培养基上(溶质为4.43g/L MS粉，30g/L蔗糖，25g/L山梨醇，0.5mg/L NAA，3mg/L 6BA，100mg/L特美汀，50mg/L潮霉素B，12g/L琼脂粉；溶剂为水；pH＝5.7)，直至分化形成幼芽，期间每7-10天更换培养基；转移幼芽至1/2MS培养基(溶质为2.21g/L MS粉，15g/L蔗糖，8g/L植物凝胶；溶剂为水；pH5.7)中生根并长成幼苗，得到T0代转基因水稻。

2.6对T0代转基因水稻中各基因靶位点的编辑效率检测

提取T0代转基因水稻幼苗的基因组DNA。针对各基因的靶核苷酸序列，设计特异的PCR扩增引物并委托生工生物工程(上海)股份有限公司进人工合成，利用特异的PCR扩增引物对各材料的基因组DNA进行PCR扩增，PCR产物委托生工生物工程(上海)股份有限公司进行Sanger测序，分析编辑效率和突变类型。各基因的靶标序列的检测引物见表2。编辑效率为靶基因发生突变的T0代转基因水稻与得到的T0代转基因水稻的株数的比值。突变类型见图2。

对T0代植株的检测结果显示(见表1)：在16种PAM类型(每种类型设计两个靶位点)中，检测到Cas9-AA能够识别NAN(NAG、NAA、NAT和NAC)、NGN(NGA、NGT、NGC和NGG)、NCG、NCT、NCC和NTC等PAM完成内源靶基因的敲除，编辑效率最高可达74.19％，这表明与野生型SpCas9识别NGG PAM相比，Cas9-AA的识别PAM序列更为灵活和编辑范围更广。

表2.Cas9-AA靶向各基因的靶标序列的检测引物

实施例2、水稻胞嘧啶碱基编辑器表达载体的构建

本实施例提供的水稻胞嘧啶碱基编辑器表达载体pUbi-rBE66，表达的胞嘧啶碱基编辑器是名称为rBE66的融合蛋白质(即Cas蛋白/胞嘧啶脱氨酶)，由名称为hAID*Δ的胞嘧啶脱氨酶、名称为Cas9-AA(D10A)的Cas蛋白、名称为UGI的尿嘧啶DNA糖基化酶抑制剂和名称为NLS的核定位信号连接而成的蛋白质。rBE66的氨基酸序列是序列表中的SEQ ID No.6，第1-195位是hAID*Δ的氨基酸序列，第196-211位是连接肽的氨基酸序列，第212-1578位是Cas9-AA(D10A)的氨基酸序列，第1579-1669位是UGI的氨基酸序列，第1670-1676位是NLS的氨基酸序列。

实施例1中的Cas9-AA是双切口酶，将Cas9-AA(双切口酶)的第10位氨基酸残基由D替换为A(在组建融合蛋白质rBE66时，将Cas9-AA的第1位氨酸残基M去除，故而在融合蛋白质rBE66中体现为Cas9-AA部分的第9位氨基酸残基D替换为A)，其它氨基酸残基不变得到单切口酶Cas9-AA(D10A)。Cas9-AA和Cas9-AA(D10A)识别的PAM相同，如能够识别NAN(NAG、NAA、NAT和NAC)、NGN(NGA、NGT、NGC和NGG)、NCG、NCT、NCC和NTC等PAM。

根据水稻密码子使用的偏好性对嵌合基因rBE66的核苷酸序列进行密码子优化，委托生工生物工程(上海)股份有限公司完成5043bp的rBE66基因(核苷酸序列是SEQ IDNo.5，编码链的编码序列(CDS)是SEQ ID No.5的第7-5037位)人工合成。将pUbi-Cas9-AA的BamHI和BcuI识别位点间的小片段(NLS-Cas9-AA-NLS)替换为SEQ ID No.5的第7-5037位所示的rBE66基因，得到rBE66基因表达载体pUbi-rBE66。SEQ ID No.5中，第1-6位为BamHI识别位点，第7-591位为hAID*Δ的CDS，第592-639位为连接肽的CDS，第640-4740位为Cas9-AA(D10A)的CDS，第4741-5013位为UGI的CDS，第5014-5034位为NLS的CDS，第5035-5037位为终止密码子TGA，第5038-5043位为BcuI识别位点。pUbi-rBE66中含有用于LR反应的元件attR1-ccdB-attR2。

实施例3、利用pUbi:rBE66对水稻内源基因的靶碱基进行C>T替换

OsCOI2(Os03g0265500)和OsSERK2(Os04g0457800)基因的基因组序列从水稻基因组数据库(https://rapdb.dna.affrc.go.jp/)中获得。

对于OsCOI2基因，选取“5′-GTCGACCCTGCACCAGTGGCGGC-3′”(OsCOI2基因靶标序列1，下划线为NGC PAM序列，其余序列为5′-N_19-20-3′)和“5′-GAGCGCGTCGACCCTGCACCAG-3′”(OsCOI2基因靶标序列2，下划线为NAG PAM序列，其余序列为5′-N_19-20-3′)作为sgRNA的靶核苷酸序列。为了制备针对OsCOI2基因靶标序列1的sgRNA，所需合成寡核苷酸链分别为gOsCOI2-F7(5′-gtgtGTCGACCCTGCACCAGTGGC-3′)/gOsCOI2-R7(5′-aaacGCCACTGGTGCAGGGTCGAC-3′)，为了制备针对OsCOI2基因靶标序列2的sgRNA，所需合成寡核苷酸链分别为gOsCOI2-F8(5′-gtgtgGAGCGCGTCGACCCTGCAC-3′)/gOsCOI2-R8(5′-aaacGTGCAGGGTCGACGCGCTCc-3′)，小写字母均为pENTR4-sgRNA载体经BsaI酶切产生的粘性末端，大写字母对应于sgRNA的靶核苷酸序列中的5′-N_19-20-3′。对于OsSERK2基因，为了制备针对OsSERK2基因靶标序列1的sgRNA，选取“5′-GCCGGACAGCTCCATTGCCCGGA-3′”(下划线为NGA PAM序列，其余序列为5′-N_19-20-3′)作为sgRNA的靶核苷酸序列，所需合成寡核苷酸链为gOsSERK2-F6(5′-tgttGCCGGACAGCTCCATTGCCC-3′)和gOsSERK2-R6(5′-aaacGGGCAATGGAGCTGTCCGGC-3′)，小写字母均为pENTR4-sgRNA载体经BtgZI酶切产生的粘性末端，大写字母对应于sgRNA的靶核苷酸序列中的5′-N_19-20-3′)。将各靶标序列的正反向寡核苷酸链委托生工生物工程(上海)股份有限公司人工合成后，使用T₄多聚核苷酸激酶将引物进行磷酸化处理，退火形成双链DNA片段(含有sgRNA的靶标序列中的5′-N_19-20-3′)，将双链DNA片段分别克隆到分别克隆到实施例1的pENTR4-sgRNA载体的BtgZI或BsaI酶切位点中，引物U6p-F1(5′-AAGAACGAACTAAGCCGGAC-3′)测序确认插入片段完全正确后，得到含有元件attL1-sgRNA表达盒-attL2的重组表达载体，将所得含有元件attL1-sgRNA表达盒-attL2的重组表达载体经AatII酶切进行线性化，再通过Gateway的LR反应将sgRNA表达盒分别克隆至pUbi-rBE66中的attR1-ccdB-attR2处，获得各靶标序列的3种碱基编辑载体pUbi-rBE66-sgRNA。

pUbi-rBE66-sgRNA是将pUbi-rBE66的attR1-ccdB-attR2替换为attB1-sgRNA表达盒-attB2(该attB1-sgRNA表达盒-attB2中，除了sgRNA的编码DNA中的5′-N_19-20-3′与实施例1中的attB1-sgRNA表达盒-attB2不同外，其余核苷酸均相同)，保持pUbi-rBE66的其它核苷酸不变得到的重组表达载体。pUbi-rBE66-sgRNA分别命名为pUbi-rBE66-sgRNA-OsCOI2-1(表达rBE66和针对OsCOI2基因靶标序列1的sgRNA)，pUbi-rBE66-sgRNA-OsCOI2-2(表达rBE66和针对OsCOI2基因靶标序列2的sgRNA)，pUbi-rBE66-sgRNA-OsSERK2(表达rBE66和针对OsSERK2基因靶标序列的sgRNA)。

pUbi-rBE66-sgRNA具有含Cas蛋白+脱氨酶表达盒(表达rBE66)和sgRNA表达盒(表达针对目的基因靶标序列的sgRNA)。该含Cas蛋白+脱氨酶表达盒由Ubip启动子(核苷酸序列是SEQ ID No.3)，rBE66基因(即Cas蛋白/胞嘧啶脱氨酶的编码基因，其编码链的CDS是序列表中的SEQ ID No.5)和NOS终止子(核苷酸序列是SEQ ID No.4)连接而成。

将上述获得的碱基编辑载体pUbi-rBE66-sgRNA-OsCOI2-1、pUbi-rBE66-sgRNA-OsCOI2-2和pUbi-rBE66-sgRNA-OsSERK2分别经转化农杆菌EHA105后再进行水稻粳稻品种Kitaake的农杆菌遗传转化和基因组DNA提取检测，具体操作同实施例1的相应操作，获得T0代转基因水稻，即T0代转pUbi-rBE66-sgRNA-OsCOI2-1水稻、T0代转pUbi-rBE66-sgRNA-OsCOI2-2水稻和T0代转pUbi-rBE66-sgRNA-OsSERK2水稻。

分别提取T0代转pUbi-rBE66-sgRNA-OsCOI2-1水稻和T0代转pUbi-rBE66-sgRNA-OsCOI2-2水稻的基因组DNA作为模板，利用特异扩增引物(OsCOI2-F1：5′-CAACTTCCGCTTTTTCCTTG-3′和OsCOI2-R1：5′-TTGAACGAGGAGAGCATGTG-3′)进行PCR扩增OsCOI2基因，并将PCR扩增产物委托生工生物工程(上海)股份有限公司进行Sanger测序。提取T0代转pUbi-rBE66-sgRNA-OsSERK2水稻的基因组DNA作为模板，利用特异扩增引物(OsSERK2-F4：5′-GCACGCATGACTTAGCAAAA-3′和OsSERK2-R4：5′-CCTCCAGATTTGCCAGCTAT-3′)进行PCR扩增OsSERK2基因，并将PCR扩增产物委托生工生物工程(上海)股份有限公司进行Sanger测序。测序结果显示：基于Cas9-AA的胞嘧啶碱基编辑器rBE66能够识别NGC、NAG和NGA PAM(即NRN PAM，R为A或G)完成靶碱基编辑。对OsCOI2的NGC PAM靶点的靶碱基编辑效率为26.00％：检测的50株T0代转pUbi-rBE66-sgRNA-OsCOI2-1水稻中有13株的胞嘧啶C被脱氨替换成T或G，以C替换为T为主。靶标序列5′到3′方向的第3、6、7、8、11、13和14位的胞嘧啶C可被脱氨替换成T或G。其中，有3株的第3位胞嘧啶C(对应图3中的G₃)被脱氨替换成T，有10株的第6位胞嘧啶C(对应图3中的G₆)被脱氨替换成T，有1株的第6位胞嘧啶C(对应图3中的G₆)被脱氨替换成G，有11株的第7位胞嘧啶C(对应图3中的G₇)被脱氨替换成T，有1株的第7位胞嘧啶C(对应图3中的G₇)被脱氨替换成G，有3株的第8位胞嘧啶C(对应图3中的G₈)被脱氨替换成T，有4株的第11位胞嘧啶C(对应图3中的G₁₁)被脱氨替换成T，有6株的第13位胞嘧啶C(对应图3中的G₁₃)被脱氨替换成T，有1株的第14位胞嘧啶C(对应图3中的G₁₄)被脱氨替换成T(图3和表3)。

基于Cas9-AA的胞嘧啶碱基编辑器rBE66对OsCOI2的NAG PAM靶点的靶碱基编辑效率为34.15％：检测的41株T0代转pUbi-rBE66-sgRNA-OsCOI2-2水稻中有14株的胞嘧啶C被脱氨替换成T或G，以C替换为T为主。靶标序列5′到3′方向的第4和6位的胞嘧啶C可被脱氨替换成T或G。其中，有12株的第4位胞嘧啶C(对应图3中的G₄)被脱氨替换成T，有14株的第6位胞嘧啶C(对应图3中的G₆)被脱氨替换成T，有1株的第4位胞嘧啶C(对应图3中的G₄)被脱氨替换成G(图3和表3)。

基于Cas9-AA的胞嘧啶碱基编辑器rBE66对OsSERK2的NGA PAM靶点的编辑效率为50.00％：检测的52株T0代转pUbi-rBE66-sgRNA-OsSERK2水稻中有26株的胞嘧啶C被脱氨替换成T。其靶核苷酸序列5′到3′方向的第2、3、7、10位的胞嘧啶C可被脱氨替换成T或G，以C替换为T为主。其中，有3株的第2位胞嘧啶C(对应图4中的G₂)被脱氨替换成T，有4株的第3位胞嘧啶C(对应图4中的G₃)被脱氨替换成T，有20株的第7位胞嘧啶C(对应图4中的G₇)被脱氨替换成T，有16株的第10位胞嘧啶C(对应图4中的G₁₀)被脱氨替换成T，有1株的第7位胞嘧啶C(对应图4中的G₇)被脱氨替换成G，有1株的第10位胞嘧啶C(对应图4中的G₁₀)被脱氨替换成G(图4和表3)。

虽然本实施例中仅进行了rBE66对NGC、NAG和NGA PAM的碱基编辑效率的检测，但结合碱基编辑器的识别PAM序列是由其中的Cas蛋白所决定的，因此，结合实施例1中筛选鉴定出的Cas9-AA识别PAM，rBE66的建立将有利于扩展胞嘧啶碱基编辑技术在水稻中的应用范围。

实施例4、水稻腺嘌呤碱基编辑器表达载体的构建

本实施例提供的水稻腺嘌呤基编辑器表达载体pUbi-rBE68，表达的腺嘌呤基编辑器是名称为rBE68的融合蛋白质(即Cas蛋白/腺嘌呤脱氨酶)，由名称为wtTadA的野生型腺嘌呤脱氨酶、名称为TadA7.10的突变型腺嘌呤脱氨酶、名称为Cas9-AA(D10A)的Cas蛋白和名称为NLS的核定位信号连接而成的蛋白质。rBE68的氨基酸序列是序列表中的SEQ IDNo.8。SEQ ID No.8中，第1-167位是wtTadA的氨基酸序列，第168-199位是连接肽的氨基酸序列，第200-365位是TadA7.10的氨基酸序列，第366-397位是连接肽的氨基酸序列，第398-1764位是Cas9-AA(D10A)的氨基酸序列，第1765-1774位是NLS的氨基酸序列。

根据水稻密码子使用的偏好性对嵌合基因rBE68基因的核苷酸序列进行密码子优化，委托生工生物工程(上海)股份有限公司完成5337bp的rBE68基因人工合成工作。将pUbi-Cas9-AA的BamHI和BcuI识别位点间的小片段(NLS-Cas9-AA-NLS)替换为SEQ ID No.7的第7-5331位所示的rBE68基因，得到rBE68基因表达载体pUbi-rBE68。SEQ ID No.7中，第1-6位为BamHI识别位点，第7-507位为wtTadA的CDS，第508-603位为连接肽的CDS，第604-1101位为TadA7.10的CDS，第1102-1197位为连接肽的CDS，第1198-5298位为Cas9-AA(D10A)的CDS，第5299-5328位为NLS的CDS，第5329-5331位为终止密码子TGA，第5332-5337位为BcuI识别位点。pUbi-rBE68中含有用于LR反应的元件attR1-ccdB-attR2。

实施例5、利用pUbi-rBE68对水稻内源基因的靶碱基进行A>G替换

本实施例中所用OsSERK2(Os04g0457800)基因的基因组序列可从水稻基因组数据库(https://rapdb.dna.affrc.go.jp/)中获得。对于OsSERK2基因，选取“5′-GCCGGACAGCTCCATTGCCCGGA-3′”(下划线为NGA PAM序列，其余序列为5′-N_19-20-3′)作为sgRNA的靶核苷酸序列(靶标序列)，为了制备针对OsSERK2基因靶标序列的sgRNA，所需合成寡核苷酸链为gOsSERK2-F6(5′-tgttGCCGGACAGCTCCATTGCCC-3′)和gOsSERK2-R6(5′-aaacGGGCAATGGAGCTGTCCGGC-3′)，小写字母均为pENTR4-sgRNA载体经BtgZI酶切产生的粘性末端，大写字母对应于sgRNA的靶核苷酸序列中的5′-N_19-20-3′)。将寡核苷酸链gOsSERK2-F6和gOsSERK2-R6委托生工生物工程(上海)股份有限公司人工合成后，使用T4多聚核苷酸激酶将引物进行磷酸化处理，退火形成双链DNA片段(含有sgRNA的靶标序列中的5′-N_19-20-3′)，将双链DNA片段分别克隆到pENTR4-sgRNA载体的BtgZI酶切位点中，引物U6p-F1(AAGAACGAACTAAGCCGGAC)测序确认插入片段完全正确(插入片段含有sgRNA的靶标序列中的5′-N_19-20-3′)后，将所得质粒经AatII酶切进行线性化，再通过Gateway的LR反应将sgRNA表达盒分别克隆至pUbi-rBE68中，获得靶核苷酸序列的碱基编辑载体pUbi-rBE68-sgRNA-OsSERK2。pUbi-rBE68-sgRNA-OsSERK2是将pUbi-rBE68的attR1-ccdB-attR2替换为attB1-sgRNA表达盒-attB2(该attB1-sgRNA表达盒-attB2中，除了sgRNA的编码DNA中的5′-N_19-20-3′与实施例1中的attB1-sgRNA表达盒-attB2不同外，其余核苷酸均相同)，保持pUbi-rBE68的其它核苷酸不变得到的重组表达载体。

pUbi-rBE68-sgRNA-OsSERK2表达rBE68和针对OsSERK2基因靶标序列的sgRNA。

Ubi-rBE68-sgRNA-OsSERK2具有含Cas蛋白+脱氨酶表达盒(表达rBE68)和sgRNA表达盒(表达针对OsSERK2基因靶标序列的sgRNA)。该含Cas蛋白+脱氨酶表达盒由Ubip启动子(核苷酸序列是SEQ ID No.3)，rBE68基因(即Cas蛋白/腺嘌呤脱氨酶的编码基因，其编码链的CDS是序列表中的SEQ ID No.7)和NOS终止子(核苷酸序列是SEQ ID No.4)连接而成。

将上述获得的碱基编辑载体pUbi-rBE68-sgRNA-OsSERK2经转化农杆菌EHA105后再进行水稻粳稻品种Kitaake的农杆菌遗传转化和基因组DNA提取检测，具体操作同实施例1的相应操作，得到T0代转基因水稻，即T0代转pUbi-rBE68-sgRNA-OsSERK2水稻。

提取T0代转pUbi-rBE68-sgRNA-OsSERK2水稻的基因组DNA作为模板，利用特异扩增引物(OsSERK2-F4：5′-GCACGCATGACTTAGCAAAA-3′和OsSERK2-R4：5′-CCTCCAGATTTGCCAGCTAT-3′)进行PCR扩增OsSERK2基因，并将PCR扩增产物委托生工生物工程(上海)股份有限公司进行Sanger测序。测序结果显示：基于Cas9-AA的腺嘌呤碱基编辑器rBE68能够识别NGA PAM完成靶碱基编辑，检测的54株T0代pUbi-rBE68-sgRNA-OsSERK2转基因水稻中，有13株材料检测到预期的靶碱基突变，其靶核苷酸序列5′到3′方向的第6位的腺嘌呤A(对应图5中的T₆)可被脱氨替换成G，因此rBE68对OsSERK2的NGA PAM靶点的编辑效率为24.07％。虽然本实施例中仅进行了rBE68对NGA PAM的碱基编辑效率的检测，但结合碱基编辑器的识别PAM序列是由其中的Cas蛋白所决定的，因此，结合实施例二中筛选鉴定出的Cas9-AA识别PAM，rBE68的建立将有利于扩展腺嘌呤碱基编辑技术在水稻中的应用范围。

表3 rBE66和rBE68靶向各基因的靶核苷酸序列信息及其碱基编辑效率和突变类型

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

序列表

<110> 中国农业科学院植物保护研究所

<120>一套编辑范围扩展的水稻人工基因组编辑系统及其应用

<130> GNCFH202313

<160> 9

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 4197

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 1

ggatccatgg cacctaagaa gaaaaggaaa gtcggcattc atggcgttcc ggcagccgac 60

aaaaagtata gcatcggcct cgatattggg acaaactctg tgggctgggc ggtaattacc 120

gacgagtaca aggtgcctag taagaaattt aaagtgctcg gaaacactga caggcactct 180

ataaagaaga acctgatcgg ggcactgctt ttcgactccg gagagacggc ggagaggacg 240

cgtctcaagc gtaccgcgcg ccgcaggtac acaagaagga agaataggat ctgctacttg 300

caggaaatct tcagtaacga gatggcgaag gtcgacgata gtttctttca tcggttggaa 360

gaatcgttcc tcgtagagga ggacaaaaag cacgagcgtc acccaatatt cgggaatatt 420

gttgacgagg ttgcctacca tgagaaatat cctacaatat atcacctccg taagaagctt 480

gtcgattcaa ctgataaggc tgatctcaga ctcatctatc ttgccctcgc acatatgatt 540

aagtttcgtg gccacttctt gattgaaggc gacctcaacc cggacaactc agatgttgac 600

aagcttttta tacagctcgt ccagacatat aaccagctgt ttgaagagaa tcccatcaat 660

gcgagtgggg ttgatgctaa agccattttg tccgccaggt tgtccaaatc tcgcagactg 720

gaaaacctga tcgcacagct tcccggtgaa aagaaaaacg ggctcttcgg caatctcatc 780

gcactgtccc tcggcctcac cccaaacttc aagtctaact tcgacctggc cgaggatgcg 840

aagctccagc tgtcaaaaga tacatacgac gacgatttgg acaatctgct tgcgcaaata 900

ggcgaccagt atgcggacct gttcctggct gccaaaaatc tgtcagatgc aatcctcctg 960

tccgatatat tgcgtgtgaa caccgaaatc acgaaggcac cgcttagcgc atccatgatc 1020

aagagatacg acgagcacca tcaggacctc acactcctca aggcgcttgt tcgtcagcag 1080

cttcccgaga aatataagga aatttttttc gatcaaagca agaatggata tgctggctat 1140

attgacggtg gcgcttcgca ggaggagttc tataaattca ttaagccgat tctggagaag 1200

atggacggaa cggaggagct cctcgtcaag cttaaccggg aagacctgtt gcggaagcag 1260

aggacttttg ataacggctc tattccgcac caaatccatc tgggtgagtt gcacgcaatc 1320

ttgagaagac aagaggattt ctacccgttc cttaaggata acagagagaa gatagaaaaa 1380

atactgacct tcaggatacc atactatgtg ggcccactgg cgcgcggaaa tagtcgtttc 1440

gcatggatga ctagaaagtc cgaagaaacg atcacgccat ggaattttga ggaagtggtc 1500

gacaagggcg cctctgccca gagcttcatc gaaaggatga ccaattttga caaaaatctg 1560

cctaacgaaa aggtgcttcc gaagcacagc ctgttgtatg aatacttcac agtttataac 1620

gagctcacta aggtcaagta cgtcacggag ggcatgcgta agcctgcttt cctgtctggt 1680

gaacaaaaaa aggcgattgt ggacctcctt ttcaagacga accgtaaagt tactgtgaag 1740

caactgaaag aggattactt taagaaaatt gagtgcttcg acagtgtgga gatttccggt 1800

gtcgaggacc ggtttaacgc cagcctgggt acgtatcatg acctgcttaa aattatcaag 1860

gataaagatt tcctggataa tgaagagaac gaagatatac tggaggacat tgtgttgact 1920

ttgaccctct tcgaggacag agagatgatt gaggaaagac tgaagaccta cgcacacctt 1980

tttgatgaca aggtcatgaa acaactcaag cgccggcgct atactggctg gggccggctt 2040

tctcgcaagc tcatcaatgg gattcgggat aagcaatcag gcaagacaat tttggacttc 2100

ctcaaatccg acggattcgc aaataggaat tttatgcagc tgatacatga cgactctttg 2160

acattcaaag aagacataca gaaggctcag gtctccggcc aaggagattc tttgcacgag 2220

catatcgcta acttggcagg tagccccgcc ataaaaaagg gcattcttca aacggtaaaa 2280

gttgttgacg aactcgtgaa ggttatgggc cgtcataagc cggaaaacat tgttattgaa 2340

atggctaggg aaaatcagac gacccagaag ggacagaaaa atagcaggga gcggatgaag 2400

agaattgaag agggaattaa ggagcttgga tctcagattc ttaaggagca ccctgtggag 2460

aacacccaac ttcagaatga aaagctctac ctttactacc ttcaaaacgg ccgggatatg 2520

tacgtcgatc aggaacttga cattaaccgg ttgagcgatt atgacgttga ccatattgtg 2580

ccccaatctt tccttaaaga cgactctatc gacaataaag tgctgacgcg cagcgataaa 2640

aatcgcggta agtcggataa tgtcccgtcg gaagaggtgg ttaaaaaaat gaagaactat 2700

tggaggcaac tcctgaatgc caagctgatc actcagagga aattcgacaa tctcaccaag 2760

gcagaaaggg gtggacttag cgagctcgac aaggccggtt ttatcaaaag acagctggtg 2820

gagacacgcc aaatcaccaa acacgttgcc cagatcctgg attcgaggat gaacacgaag 2880

tatgacgaga acgacaagtt gattagggaa gtcaaggtca tcactttgaa gtccaagctg 2940

gtgagcgact ttcgcaaaga cttccagttt tacaaagtca gggaaattaa taactaccac 3000

cacgcccacg acgcctacct taacgccgtg gttggcacag cactcatcaa gaaataccct 3060

aagctcgaat ctgagttcgt ctatggcgac tataaggtct acgacgttag aaaaatgatc 3120

gcgaaatctg agcaggaaat aggcaaggca actgccaagt acttcttcta ttccaatatc 3180

atgaactttt ttaagacgga gattaccctg gcgaatggtg agatccgcaa gcgccctttg 3240

attgagacaa acggagaaac aggagagatc gtatgggaca aagggcggga ctttgctact 3300

gttaggaagg tgctctctat gccacaagtt aacattgtca aaaaaactga agtgcagaca 3360

ggtgggttta gcaaggaatc tatcaggccg aagaggaact ctgacaagct gatcgcccgc 3420

aagaaagatt gggacccgaa aaagtacgga ggattcttgt ggcccacagt tgcgtactcc 3480

gtgcttgtcg tggccaaagt ggagaagggc aagtctaaga agctcaagag cgtcaaagag 3540

ttgttgggga tcacgattat ggagcggtcg tctttcgaaa agaatccgat agattttctc 3600

gaggccaagg gttataaaga agtcaagaag gatcttatca tcaagctccc taagtactcc 3660

ctctttgagc ttgaaaacgg acggaaaaga atgctggctt cagcgaagca gcttcagaag 3720

ggtaatgaac tcgctctgcc ctcaaaatat gtgaatttcc tttacctggc atcacactat 3780

gagaagctta aggggtctcc agaggacaac gagcagaagc aactgttcgt tgaacaacac 3840

aagcactacc ttgacgagat tatcgagcaa atcagcgagt ttagcaagcg cgttatactg 3900

gcagacgcaa atcttgataa ggtccttagc gcctacaaca agcatagaga caaacccatc 3960

cgggagcagg ccgagaacat tattcatctc ttcaccttga cgaggcttgg ggccccgaga 4020

gcgttcaagt acttcgatac taccatagac ccaaagcaat atcggtcgac aaaggaagtt 4080

cttgacgcca cgctgatcca ccaaagtata acaggcctct atgagacacg catcgacctt 4140

tcgcagttgg gcggtgaccg ccccaaaaag aagaggaaag ttggcgggtg aactagt 4197

<210> 2

<211> 1394

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 2

Met Ala Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Gly Ile His Gly Val Pro Ala

1 5 10 15

Ala Asp Lys Lys Tyr Ser Ile Gly Leu Asp Ile Gly Thr Asn Ser Val

20 25 30

Gly Trp Ala Val Ile Thr Asp Glu Tyr Lys Val Pro Ser Lys Lys Phe

35 40 45

Lys Val Leu Gly Asn Thr Asp Arg His Ser Ile Lys Lys Asn Leu Ile

50 55 60

Gly Ala Leu Leu Phe Asp Ser Gly Glu Thr Ala Glu Arg Thr Arg Leu

65 70 75 80

Lys Arg Thr Ala Arg Arg Arg Tyr Thr Arg Arg Lys Asn Arg Ile Cys

85 90 95

Tyr Leu Gln Glu Ile Phe Ser Asn Glu Met Ala Lys Val Asp Asp Ser

100 105 110

Phe Phe His Arg Leu Glu Glu Ser Phe Leu Val Glu Glu Asp Lys Lys

115 120 125

His Glu Arg His Pro Ile Phe Gly Asn Ile Val Asp Glu Val Ala Tyr

130 135 140

His Glu Lys Tyr Pro Thr Ile Tyr His Leu Arg Lys Lys Leu Val Asp

145 150 155 160

Ser Thr Asp Lys Ala Asp Leu Arg Leu Ile Tyr Leu Ala Leu Ala His

165 170 175

Met Ile Lys Phe Arg Gly His Phe Leu Ile Glu Gly Asp Leu Asn Pro

180 185 190

Asp Asn Ser Asp Val Asp Lys Leu Phe Ile Gln Leu Val Gln Thr Tyr

195 200 205

Asn Gln Leu Phe Glu Glu Asn Pro Ile Asn Ala Ser Gly Val Asp Ala

210 215 220

Lys Ala Ile Leu Ser Ala Arg Leu Ser Lys Ser Arg Arg Leu Glu Asn

225 230 235 240

Leu Ile Ala Gln Leu Pro Gly Glu Lys Lys Asn Gly Leu Phe Gly Asn

245 250 255

Leu Ile Ala Leu Ser Leu Gly Leu Thr Pro Asn Phe Lys Ser Asn Phe

260 265 270

Asp Leu Ala Glu Asp Ala Lys Leu Gln Leu Ser Lys Asp Thr Tyr Asp

275 280 285

Asp Asp Leu Asp Asn Leu Leu Ala Gln Ile Gly Asp Gln Tyr Ala Asp

290 295 300

Leu Phe Leu Ala Ala Lys Asn Leu Ser Asp Ala Ile Leu Leu Ser Asp

305 310 315 320

Ile Leu Arg Val Asn Thr Glu Ile Thr Lys Ala Pro Leu Ser Ala Ser

325 330 335

Met Ile Lys Arg Tyr Asp Glu His His Gln Asp Leu Thr Leu Leu Lys

340 345 350

Ala Leu Val Arg Gln Gln Leu Pro Glu Lys Tyr Lys Glu Ile Phe Phe

355 360 365

Asp Gln Ser Lys Asn Gly Tyr Ala Gly Tyr Ile Asp Gly Gly Ala Ser

370 375 380

Gln Glu Glu Phe Tyr Lys Phe Ile Lys Pro Ile Leu Glu Lys Met Asp

385 390 395 400

Gly Thr Glu Glu Leu Leu Val Lys Leu Asn Arg Glu Asp Leu Leu Arg

405 410 415

Lys Gln Arg Thr Phe Asp Asn Gly Ser Ile Pro His Gln Ile His Leu

420 425 430

Gly Glu Leu His Ala Ile Leu Arg Arg Gln Glu Asp Phe Tyr Pro Phe

435 440 445

Leu Lys Asp Asn Arg Glu Lys Ile Glu Lys Ile Leu Thr Phe Arg Ile

450 455 460

Pro Tyr Tyr Val Gly Pro Leu Ala Arg Gly Asn Ser Arg Phe Ala Trp

465 470 475 480

Met Thr Arg Lys Ser Glu Glu Thr Ile Thr Pro Trp Asn Phe Glu Glu

485 490 495

Val Val Asp Lys Gly Ala Ser Ala Gln Ser Phe Ile Glu Arg Met Thr

500 505 510

Asn Phe Asp Lys Asn Leu Pro Asn Glu Lys Val Leu Pro Lys His Ser

515 520 525

Leu Leu Tyr Glu Tyr Phe Thr Val Tyr Asn Glu Leu Thr Lys Val Lys

530 535 540

Tyr Val Thr Glu Gly Met Arg Lys Pro Ala Phe Leu Ser Gly Glu Gln

545 550 555 560

Lys Lys Ala Ile Val Asp Leu Leu Phe Lys Thr Asn Arg Lys Val Thr

565 570 575

Val Lys Gln Leu Lys Glu Asp Tyr Phe Lys Lys Ile Glu Cys Phe Asp

580 585 590

Ser Val Glu Ile Ser Gly Val Glu Asp Arg Phe Asn Ala Ser Leu Gly

595 600 605

Thr Tyr His Asp Leu Leu Lys Ile Ile Lys Asp Lys Asp Phe Leu Asp

610 615 620

Asn Glu Glu Asn Glu Asp Ile Leu Glu Asp Ile Val Leu Thr Leu Thr

625 630 635 640

Leu Phe Glu Asp Arg Glu Met Ile Glu Glu Arg Leu Lys Thr Tyr Ala

645 650 655

His Leu Phe Asp Asp Lys Val Met Lys Gln Leu Lys Arg Arg Arg Tyr

660 665 670

Thr Gly Trp Gly Arg Leu Ser Arg Lys Leu Ile Asn Gly Ile Arg Asp

675 680 685

Lys Gln Ser Gly Lys Thr Ile Leu Asp Phe Leu Lys Ser Asp Gly Phe

690 695 700

Ala Asn Arg Asn Phe Met Gln Leu Ile His Asp Asp Ser Leu Thr Phe

705 710 715 720

Lys Glu Asp Ile Gln Lys Ala Gln Val Ser Gly Gln Gly Asp Ser Leu

725 730 735

His Glu His Ile Ala Asn Leu Ala Gly Ser Pro Ala Ile Lys Lys Gly

740 745 750

Ile Leu Gln Thr Val Lys Val Val Asp Glu Leu Val Lys Val Met Gly

755 760 765

Arg His Lys Pro Glu Asn Ile Val Ile Glu Met Ala Arg Glu Asn Gln

770 775 780

Thr Thr Gln Lys Gly Gln Lys Asn Ser Arg Glu Arg Met Lys Arg Ile

785 790 795 800

Glu Glu Gly Ile Lys Glu Leu Gly Ser Gln Ile Leu Lys Glu His Pro

805 810 815

Val Glu Asn Thr Gln Leu Gln Asn Glu Lys Leu Tyr Leu Tyr Tyr Leu

820 825 830

Gln Asn Gly Arg Asp Met Tyr Val Asp Gln Glu Leu Asp Ile Asn Arg

835 840 845

Leu Ser Asp Tyr Asp Val Asp His Ile Val Pro Gln Ser Phe Leu Lys

850 855 860

Asp Asp Ser Ile Asp Asn Lys Val Leu Thr Arg Ser Asp Lys Asn Arg

865 870 875 880

Gly Lys Ser Asp Asn Val Pro Ser Glu Glu Val Val Lys Lys Met Lys

885 890 895

Asn Tyr Trp Arg Gln Leu Leu Asn Ala Lys Leu Ile Thr Gln Arg Lys

900 905 910

Phe Asp Asn Leu Thr Lys Ala Glu Arg Gly Gly Leu Ser Glu Leu Asp

915 920 925

Lys Ala Gly Phe Ile Lys Arg Gln Leu Val Glu Thr Arg Gln Ile Thr

930 935 940

Lys His Val Ala Gln Ile Leu Asp Ser Arg Met Asn Thr Lys Tyr Asp

945 950 955 960

Glu Asn Asp Lys Leu Ile Arg Glu Val Lys Val Ile Thr Leu Lys Ser

965 970 975

Lys Leu Val Ser Asp Phe Arg Lys Asp Phe Gln Phe Tyr Lys Val Arg

980 985 990

Glu Ile Asn Asn Tyr His His Ala His Asp Ala Tyr Leu Asn Ala Val

995 1000 1005

Val Gly Thr Ala Leu Ile Lys Lys Tyr Pro Lys Leu Glu Ser Glu

1010 1015 1020

Phe Val Tyr Gly Asp Tyr Lys Val Tyr Asp Val Arg Lys Met Ile

1025 1030 1035

Ala Lys Ser Glu Gln Glu Ile Gly Lys Ala Thr Ala Lys Tyr Phe

1040 1045 1050

Phe Tyr Ser Asn Ile Met Asn Phe Phe Lys Thr Glu Ile Thr Leu

1055 1060 1065

Ala Asn Gly Glu Ile Arg Lys Arg Pro Leu Ile Glu Thr Asn Gly

1070 1075 1080

Glu Thr Gly Glu Ile Val Trp Asp Lys Gly Arg Asp Phe Ala Thr

1085 1090 1095

Val Arg Lys Val Leu Ser Met Pro Gln Val Asn Ile Val Lys Lys

1100 1105 1110

Thr Glu Val Gln Thr Gly Gly Phe Ser Lys Glu Ser Ile Arg Pro

1115 1120 1125

Lys Arg Asn Ser Asp Lys Leu Ile Ala Arg Lys Lys Asp Trp Asp

1130 1135 1140

Pro Lys Lys Tyr Gly Gly Phe Leu Trp Pro Thr Val Ala Tyr Ser

1145 1150 1155

Val Leu Val Val Ala Lys Val Glu Lys Gly Lys Ser Lys Lys Leu

1160 1165 1170

Lys Ser Val Lys Glu Leu Leu Gly Ile Thr Ile Met Glu Arg Ser

1175 1180 1185

Ser Phe Glu Lys Asn Pro Ile Asp Phe Leu Glu Ala Lys Gly Tyr

1190 1195 1200

Lys Glu Val Lys Lys Asp Leu Ile Ile Lys Leu Pro Lys Tyr Ser

1205 1210 1215

Leu Phe Glu Leu Glu Asn Gly Arg Lys Arg Met Leu Ala Ser Ala

1220 1225 1230

Lys Gln Leu Gln Lys Gly Asn Glu Leu Ala Leu Pro Ser Lys Tyr

1235 1240 1245

Val Asn Phe Leu Tyr Leu Ala Ser His Tyr Glu Lys Leu Lys Gly

1250 1255 1260

Ser Pro Glu Asp Asn Glu Gln Lys Gln Leu Phe Val Glu Gln His

1265 1270 1275

Lys His Tyr Leu Asp Glu Ile Ile Glu Gln Ile Ser Glu Phe Ser

1280 1285 1290

Lys Arg Val Ile Leu Ala Asp Ala Asn Leu Asp Lys Val Leu Ser

1295 1300 1305

Ala Tyr Asn Lys His Arg Asp Lys Pro Ile Arg Glu Gln Ala Glu

1310 1315 1320

Asn Ile Ile His Leu Phe Thr Leu Thr Arg Leu Gly Ala Pro Arg

1325 1330 1335

Ala Phe Lys Tyr Phe Asp Thr Thr Ile Asp Pro Lys Gln Tyr Arg

1340 1345 1350

Ser Thr Lys Glu Val Leu Asp Ala Thr Leu Ile His Gln Ser Ile

1355 1360 1365

Thr Gly Leu Tyr Glu Thr Arg Ile Asp Leu Ser Gln Leu Gly Gly

1370 1375 1380

Asp Arg Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Gly Gly

1385 1390

<210> 3

<211> 1765

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 3

gcagcgtgac ccggtcgtgc ccctctctag agataatgag cattgcatgt ctaagttata 60

aaaaattacc acatattttt tttgtcacac ttgtttgaag tgcagtttat ctatctttat 120

acatatattt aaactttact ctacgaataa tataatctat agtactacaa taatatcagt 180

gttttagaga atcatataaa tgaacagtta gacatggtct aaaggacaat tgagtatttt 240

gacaacagga ctctacagtt ttatcttttt agtgtgcatg tgttctcctt tttttttgca 300

aatagcttca cctatataat acttcatcca ttttattagt acatccattt agggtttagg 360

gttaatggtt tttatagact aattttttta gtacatctat tttattctat tttagcctct 420

aaattaagaa aactaaaact ctattttagt ttttttattt aataatttag atataaaata 480

gaataaaata aagtgactaa aaattaaaca aatacccttt aagaaattaa aaaaactaag 540

gaaacatttt tcttgtttcg agtagataat gccagcctgt taaacgccgt cgacgagtct 600

aacggacacc aaccagcgaa ccagcagcgt cgcgtcgggc caagcgaagc agacggcacg 660

gcatctctgt cgctgcctct ggacccctct cgagagttcc gctccaccgt tggacttgct 720

ccgctgtcgg catccagaaa ttgcgtggcg gagcggcaga cgtgagccgg cacggcaggc 780

ggcctcctcc tcctctcacg gcacggcagc tacgggggat tcctttccca ccgctccttc 840

gctttccctt cctcgcccgc cgtaataaat agacaccccc tccacaccct ctttccccaa 900

cctcgtgttg ttcggagcgc acacacacac aaccagatct cccccaaatc cacccgtcgg 960

cacctccgct tcaaggtacg ccgctcgtcc tccccccccc cccctctcta ccttctctag 1020

atcggcgttc cggtccatgg ttagggcccg gtagttctac ttctgttcat gtttgtgtta 1080

gatccgtgtt tgtgttagat ccgtgctgct agcgttcgta cacggatgcg acctgtacgt 1140

cagacacgtt ctgattgcta acttgccagt gtttctcttt ggggaatcct gggatggctc 1200

tagccgttcc gcagacggga tcgatttcat gatttttttt gtttcgttgc atagggtttg 1260

gtttgccctt ttcctttatt tcaatatatg ccgtgcactt gtttgtcggg tcatcttttc 1320

atgctttttt tttgtcttgg ttgtgatgat gtggtgtggt tgggcggtcg ttcattcgtt 1380

ctagatcgga gtagaatact gtttcaaact acctggtgta tttattaatt ttggaactgt 1440

atgtgtgtgt catacatctt catagttacg agtttaagat ggatggaaat atcgatctag 1500

gataggtata catgttgatg tgggttttac tgatgcatat acatgatggc atatgcagca 1560

tctattcata tgctctaacc ttgagtacct atctattata ataaacaagt atgttttata 1620

attattttga tcttgatata cttggatgat ggcatatgca gcagctatat gtggattttt 1680

ttagccctgc cttcatacgc tatttatttg cttggtactg tttcttttgt cgatgctcac 1740

cctgttgttt ggtgttactt ctgca 1765

<210> 4

<211> 253

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 4

gatcgttcaa acatttggca ataaagtttc ttaagattga atcctgttgc cggtcttgcg 60

atgattatca tataatttct gttgaattac gttaagcatg taataattaa catgtaatgc 120

atgacgttat ttatgagatg ggtttttatg attagagtcc cgcaattata catttaatac 180

gcgatagaaa acaaaatata gcgcgcaaac taggataaat tatcgcgcgc ggtgtcatct 240

atgttactag atc 253

<210> 5

<211> 5043

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 5

ggatccatgg atagccttct catgaacaga agagagtttc tctatcagtt taaaaatgtt 60

cggtgggcga aggggaggag agagacatat ctctgctatg ttgttaagcg gagagattct 120

gcgacctcat tctcactcga ttttggttat ttgaggaaca agaatggatg tcatgtcgaa 180

ttgttgtttc tccggtatat ttccgactgg gatttggacc cagggcggtg ttaccgggtc 240

acatggttta tttcctggag tccatgttac gactgtgcgc gccatgtcgc cgacttcctc 300

aggggtaatc ctaacttgtc cttgcggatt tttacagcca gactctattt ctgtgaggat 360

cggaaggcgg aacccgaggg gctgagaaga ctgcaccgcg ctggcgtcca aatcgccatc 420

atgactttta aggattattt ctactgttgg aacacgttcg tcgagaacca cggtcggacc 480

ttcaaagcct gggaagggct gcatgaaaat tccgtgaggt tgtcccggca actccgcaga 540

atactcctgc ccctttatga ggtcgacgat ctcagagacg cctttagaac tagcggaagc 600

gagacgccag ggacttctga atcggccacc cccgagagcg ataaaaagta ttcaatcgga 660

cttgctattg ggacaaactc tgtgggctgg gcggtaatta ccgacgagta caaggtgcct 720

agtaagaaat ttaaagtgct cggaaacact gacaggcact ctataaagaa gaacctgatc 780

ggggcactgc ttttcgactc cggagagacg gcggagagga cgcgtctcaa gcgtaccgcg 840

cgccgcaggt acacaagaag gaagaatagg atctgctact tgcaggaaat cttcagtaac 900

gagatggcga aggtcgacga tagtttcttt catcggttgg aagaatcgtt cctcgtagag 960

gaggacaaaa agcacgagcg tcacccaata ttcgggaata ttgttgacga ggttgcctac 1020

catgagaaat atcctacaat atatcacctc cgtaagaagc ttgtcgattc aactgataag 1080

gctgatctca gactcatcta tcttgccctc gcacatatga ttaagtttcg tggccacttc 1140

ttgattgaag gcgacctcaa cccggacaac tcagatgttg acaagctttt tatacagctc 1200

gtccagacat ataaccagct gtttgaagag aatcccatca atgcgagtgg ggttgatgct 1260

aaagccattt tgtccgccag gttgtccaaa tctcgcagac tggaaaacct gatcgcacag 1320

cttcccggtg aaaagaaaaa cgggctcttc ggcaatctca tcgcactgtc cctcggcctc 1380

accccaaact tcaagtctaa cttcgacctg gccgaggatg cgaagctcca gctgtcaaaa 1440

gatacatacg acgacgattt ggacaatctg cttgcgcaaa taggcgacca gtatgcggac 1500

ctgttcctgg ctgccaaaaa tctgtcagat gcaatcctcc tgtccgatat attgcgtgtg 1560

aacaccgaaa tcacgaaggc accgcttagc gcatccatga tcaagagata cgacgagcac 1620

catcaggacc tcacactcct caaggcgctt gttcgtcagc agcttcccga gaaatataag 1680

gaaatttttt tcgatcaaag caagaatgga tatgctggct atattgacgg tggcgcttcg 1740

caggaggagt tctataaatt cattaagccg attctggaga agatggacgg aacggaggag 1800

ctcctcgtca agcttaaccg ggaagacctg ttgcggaagc agaggacttt tgataacggc 1860

tctattccgc accaaatcca tctgggtgag ttgcacgcaa tcttgagaag acaagaggat 1920

ttctacccgt tccttaagga taacagagag aagatagaaa aaatactgac cttcaggata 1980

ccatactatg tgggcccact ggcgcgcgga aatagtcgtt tcgcatggat gactagaaag 2040

tccgaagaaa cgatcacgcc atggaatttt gaggaagtgg tcgacaaggg cgcctctgcc 2100

cagagcttca tcgaaaggat gaccaatttt gacaaaaatc tgcctaacga aaaggtgctt 2160

ccgaagcaca gcctgttgta tgaatacttc acagtttata acgagctcac taaggtcaag 2220

tacgtcacgg agggcatgcg taagcctgct ttcctgtctg gtgaacaaaa aaaggcgatt 2280

gtggacctcc ttttcaagac gaaccgtaaa gttactgtga agcaactgaa agaggattac 2340

tttaagaaaa ttgagtgctt cgacagtgtg gagatttccg gtgtcgagga ccggtttaac 2400

gccagcctgg gtacgtatca tgacctgctt aaaattatca aggataaaga tttcctggat 2460

aatgaagaga acgaagatat actggaggac attgtgttga ctttgaccct cttcgaggac 2520

agagagatga ttgaggaaag actgaagacc tacgcacacc tttttgatga caaggtcatg 2580

aaacaactca agcgccggcg ctatactggc tggggccggc tttctcgcaa gctcatcaat 2640

gggattcggg ataagcaatc aggcaagaca attttggact tcctcaaatc cgacggattc 2700

gcaaatagga attttatgca gctgatacat gacgactctt tgacattcaa agaagacata 2760

cagaaggctc aggtctccgg ccaaggagat tctttgcacg agcatatcgc taacttggca 2820

ggtagccccg ccataaaaaa gggcattctt caaacggtaa aagttgttga cgaactcgtg 2880

aaggttatgg gccgtcataa gccggaaaac attgttattg aaatggctag ggaaaatcag 2940

acgacccaga agggacagaa aaatagcagg gagcggatga agagaattga agagggaatt 3000

aaggagcttg gatctcagat tcttaaggag caccctgtgg agaacaccca acttcagaat 3060

gaaaagctct acctttacta ccttcaaaac ggccgggata tgtacgtcga tcaggaactt 3120

gacattaacc ggttgagcga ttatgacgtt gaccatattg tgccccaatc tttccttaaa 3180

gacgactcta tcgacaataa agtgctgacg cgcagcgata aaaatcgcgg taagtcggat 3240

aatgtcccgt cggaagaggt ggttaaaaaa atgaagaact attggaggca actcctgaat 3300

gccaagctga tcactcagag gaaattcgac aatctcacca aggcagaaag gggtggactt 3360

agcgagctcg acaaggccgg ttttatcaaa agacagctgg tggagacacg ccaaatcacc 3420

aaacacgttg cccagatcct ggattcgagg atgaacacga agtatgacga gaacgacaag 3480

ttgattaggg aagtcaaggt catcactttg aagtccaagc tggtgagcga ctttcgcaaa 3540

gacttccagt tttacaaagt cagggaaatt aataactacc accacgccca cgacgcctac 3600

cttaacgccg tggttggcac agcactcatc aagaaatacc ctaagctcga atctgagttc 3660

gtctatggcg actataaggt ctacgacgtt agaaaaatga tcgcgaaatc tgagcaggaa 3720

ataggcaagg caactgccaa gtacttcttc tattccaata tcatgaactt ttttaagacg 3780

gagattaccc tggcgaatgg tgagatccgc aagcgccctt tgattgagac aaacggagaa 3840

acaggagaga tcgtatggga caaagggcgg gactttgcta ctgttaggaa ggtgctctct 3900

atgccacaag ttaacattgt caaaaaaact gaagtgcaga caggtgggtt tagcaaggaa 3960

tctatcaggc cgaagaggaa ctctgacaag ctgatcgccc gcaagaaaga ttgggacccg 4020

aaaaagtacg gaggattctt gtggcccaca gttgcgtact ccgtgcttgt cgtggccaaa 4080

gtggagaagg gcaagtctaa gaagctcaag agcgtcaaag agttgttggg gatcacgatt 4140

atggagcggt cgtctttcga aaagaatccg atagattttc tcgaggccaa gggttataaa 4200

gaagtcaaga aggatcttat catcaagctc cctaagtact ccctctttga gcttgaaaac 4260

ggacggaaaa gaatgctggc ttcagcgaag cagcttcaga agggtaatga actcgctctg 4320

ccctcaaaat atgtgaattt cctttacctg gcatcacact atgagaagct taaggggtct 4380

ccagaggaca acgagcagaa gcaactgttc gttgaacaac acaagcacta ccttgacgag 4440

attatcgagc aaatcagcga gtttagcaag cgcgttatac tggcagacgc aaatcttgat 4500

aaggtcctta gcgcctacaa caagcataga gacaaaccca tccgggagca ggccgagaac 4560

attattcatc tcttcacctt gacgaggctt ggggccccga gagcgttcaa gtacttcgat 4620

actaccatag acccaaagca atatcggtcg acaaaggaag ttcttgacgc cacgctgatc 4680

caccaaagta taacaggcct ctatgagaca cgcatcgacc tttcgcagtt gggcggtgac 4740

tccggcggaa gtacaaacct ttcagacatt atagaaaagg aaaccggcaa gcaactcgtc 4800

atccaggaat ccatacttat gctccctgaa gaggtggaag aagtgatcgg taataaacca 4860

gagagcgaca tacttgtcca caccgcttat gacgaaagta cagacgaaaa cgtcatgctt 4920

ctgacgagtg atgcccccga atacaaacct tgggcgctcg tcatccagga ttccaatggg 4980

gagaataaaa taaagatgct ctctggaggc agcccaaaga agaagagaaa ggtctgaact 5040

agt 5043

<210> 6

<211> 1676

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 6

Met Asp Ser Leu Leu Met Asn Arg Arg Glu Phe Leu Tyr Gln Phe Lys

1 5 10 15

Asn Val Arg Trp Ala Lys Gly Arg Arg Glu Thr Tyr Leu Cys Tyr Val

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Val Lys Arg Arg Asp Ser Ala Thr Ser Phe Ser Leu Asp Phe Gly Tyr

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Leu Arg Asn Lys Asn Gly Cys His Val Glu Leu Leu Phe Leu Arg Tyr

50 55 60

Ile Ser Asp Trp Asp Leu Asp Pro Gly Arg Cys Tyr Arg Val Thr Trp

65 70 75 80

Phe Ile Ser Trp Ser Pro Cys Tyr Asp Cys Ala Arg His Val Ala Asp

85 90 95

Phe Leu Arg Gly Asn Pro Asn Leu Ser Leu Arg Ile Phe Thr Ala Arg

100 105 110

Leu Tyr Phe Cys Glu Asp Arg Lys Ala Glu Pro Glu Gly Leu Arg Arg

115 120 125

Leu His Arg Ala Gly Val Gln Ile Ala Ile Met Thr Phe Lys Asp Tyr

130 135 140

Phe Tyr Cys Trp Asn Thr Phe Val Glu Asn His Gly Arg Thr Phe Lys

145 150 155 160

Ala Trp Glu Gly Leu His Glu Asn Ser Val Arg Leu Ser Arg Gln Leu

165 170 175

Arg Arg Ile Leu Leu Pro Leu Tyr Glu Val Asp Asp Leu Arg Asp Ala

180 185 190

Phe Arg Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr

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210 215 220

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Lys Phe Lys Val Leu Gly Asn Thr Asp Arg His Ser Ile Lys Lys Asn

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Leu Ile Gly Ala Leu Leu Phe Asp Ser Gly Glu Thr Ala Glu Arg Thr

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Lys Lys His Glu Arg His Pro Ile Phe Gly Asn Ile Val Asp Glu Val

325 330 335

Ala Tyr His Glu Lys Tyr Pro Thr Ile Tyr His Leu Arg Lys Lys Leu

340 345 350

Val Asp Ser Thr Asp Lys Ala Asp Leu Arg Leu Ile Tyr Leu Ala Leu

355 360 365

Ala His Met Ile Lys Phe Arg Gly His Phe Leu Ile Glu Gly Asp Leu

370 375 380

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405 410 415

Asp Ala Lys Ala Ile Leu Ser Ala Arg Leu Ser Lys Ser Arg Arg Leu

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Gly Asn Leu Ile Ala Leu Ser Leu Gly Leu Thr Pro Asn Phe Lys Ser

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Asn Phe Asp Leu Ala Glu Asp Ala Lys Leu Gln Leu Ser Lys Asp Thr

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Tyr Asp Asp Asp Leu Asp Asn Leu Leu Ala Gln Ile Gly Asp Gln Tyr

485 490 495

Ala Asp Leu Phe Leu Ala Ala Lys Asn Leu Ser Asp Ala Ile Leu Leu

500 505 510

Ser Asp Ile Leu Arg Val Asn Thr Glu Ile Thr Lys Ala Pro Leu Ser

515 520 525

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530 535 540

Leu Lys Ala Leu Val Arg Gln Gln Leu Pro Glu Lys Tyr Lys Glu Ile

545 550 555 560

Phe Phe Asp Gln Ser Lys Asn Gly Tyr Ala Gly Tyr Ile Asp Gly Gly

565 570 575

Ala Ser Gln Glu Glu Phe Tyr Lys Phe Ile Lys Pro Ile Leu Glu Lys

580 585 590

Met Asp Gly Thr Glu Glu Leu Leu Val Lys Leu Asn Arg Glu Asp Leu

595 600 605

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610 615 620

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Pro Phe Leu Lys Asp Asn Arg Glu Lys Ile Glu Lys Ile Leu Thr Phe

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Arg Ile Pro Tyr Tyr Val Gly Pro Leu Ala Arg Gly Asn Ser Arg Phe

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Met Thr Asn Phe Asp Lys Asn Leu Pro Asn Glu Lys Val Leu Pro Lys

705 710 715 720

His Ser Leu Leu Tyr Glu Tyr Phe Thr Val Tyr Asn Glu Leu Thr Lys

725 730 735

Val Lys Tyr Val Thr Glu Gly Met Arg Lys Pro Ala Phe Leu Ser Gly

740 745 750

Glu Gln Lys Lys Ala Ile Val Asp Leu Leu Phe Lys Thr Asn Arg Lys

755 760 765

Val Thr Val Lys Gln Leu Lys Glu Asp Tyr Phe Lys Lys Ile Glu Cys

770 775 780

Phe Asp Ser Val Glu Ile Ser Gly Val Glu Asp Arg Phe Asn Ala Ser

785 790 795 800

Leu Gly Thr Tyr His Asp Leu Leu Lys Ile Ile Lys Asp Lys Asp Phe

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Leu Asp Asn Glu Glu Asn Glu Asp Ile Leu Glu Asp Ile Val Leu Thr

820 825 830

Leu Thr Leu Phe Glu Asp Arg Glu Met Ile Glu Glu Arg Leu Lys Thr

835 840 845

Tyr Ala His Leu Phe Asp Asp Lys Val Met Lys Gln Leu Lys Arg Arg

850 855 860

Arg Tyr Thr Gly Trp Gly Arg Leu Ser Arg Lys Leu Ile Asn Gly Ile

865 870 875 880

Arg Asp Lys Gln Ser Gly Lys Thr Ile Leu Asp Phe Leu Lys Ser Asp

885 890 895

Gly Phe Ala Asn Arg Asn Phe Met Gln Leu Ile His Asp Asp Ser Leu

900 905 910

Thr Phe Lys Glu Asp Ile Gln Lys Ala Gln Val Ser Gly Gln Gly Asp

915 920 925

Ser Leu His Glu His Ile Ala Asn Leu Ala Gly Ser Pro Ala Ile Lys

930 935 940

Lys Gly Ile Leu Gln Thr Val Lys Val Val Asp Glu Leu Val Lys Val

945 950 955 960

Met Gly Arg His Lys Pro Glu Asn Ile Val Ile Glu Met Ala Arg Glu

965 970 975

Asn Gln Thr Thr Gln Lys Gly Gln Lys Asn Ser Arg Glu Arg Met Lys

980 985 990

Arg Ile Glu Glu Gly Ile Lys Glu Leu Gly Ser Gln Ile Leu Lys Glu

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His Pro Val Glu Asn Thr Gln Leu Gln Asn Glu Lys Leu Tyr Leu

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Tyr Tyr Leu Gln Asn Gly Arg Asp Met Tyr Val Asp Gln Glu Leu

1025 1030 1035

Asp Ile Asn Arg Leu Ser Asp Tyr Asp Val Asp His Ile Val Pro

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Gln Ser Phe Leu Lys Asp Asp Ser Ile Asp Asn Lys Val Leu Thr

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Arg Ser Asp Lys Asn Arg Gly Lys Ser Asp Asn Val Pro Ser Glu

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Glu Val Val Lys Lys Met Lys Asn Tyr Trp Arg Gln Leu Leu Asn

1085 1090 1095

Ala Lys Leu Ile Thr Gln Arg Lys Phe Asp Asn Leu Thr Lys Ala

1100 1105 1110

Glu Arg Gly Gly Leu Ser Glu Leu Asp Lys Ala Gly Phe Ile Lys

1115 1120 1125

Arg Gln Leu Val Glu Thr Arg Gln Ile Thr Lys His Val Ala Gln

1130 1135 1140

Ile Leu Asp Ser Arg Met Asn Thr Lys Tyr Asp Glu Asn Asp Lys

1145 1150 1155

Leu Ile Arg Glu Val Lys Val Ile Thr Leu Lys Ser Lys Leu Val

1160 1165 1170

Ser Asp Phe Arg Lys Asp Phe Gln Phe Tyr Lys Val Arg Glu Ile

1175 1180 1185

Asn Asn Tyr His His Ala His Asp Ala Tyr Leu Asn Ala Val Val

1190 1195 1200

Gly Thr Ala Leu Ile Lys Lys Tyr Pro Lys Leu Glu Ser Glu Phe

1205 1210 1215

Val Tyr Gly Asp Tyr Lys Val Tyr Asp Val Arg Lys Met Ile Ala

1220 1225 1230

Lys Ser Glu Gln Glu Ile Gly Lys Ala Thr Ala Lys Tyr Phe Phe

1235 1240 1245

Tyr Ser Asn Ile Met Asn Phe Phe Lys Thr Glu Ile Thr Leu Ala

1250 1255 1260

Asn Gly Glu Ile Arg Lys Arg Pro Leu Ile Glu Thr Asn Gly Glu

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Thr Gly Glu Ile Val Trp Asp Lys Gly Arg Asp Phe Ala Thr Val

1280 1285 1290

Arg Lys Val Leu Ser Met Pro Gln Val Asn Ile Val Lys Lys Thr

1295 1300 1305

Glu Val Gln Thr Gly Gly Phe Ser Lys Glu Ser Ile Arg Pro Lys

1310 1315 1320

Arg Asn Ser Asp Lys Leu Ile Ala Arg Lys Lys Asp Trp Asp Pro

1325 1330 1335

Lys Lys Tyr Gly Gly Phe Leu Trp Pro Thr Val Ala Tyr Ser Val

1340 1345 1350

Leu Val Val Ala Lys Val Glu Lys Gly Lys Ser Lys Lys Leu Lys

1355 1360 1365

Ser Val Lys Glu Leu Leu Gly Ile Thr Ile Met Glu Arg Ser Ser

1370 1375 1380

Phe Glu Lys Asn Pro Ile Asp Phe Leu Glu Ala Lys Gly Tyr Lys

1385 1390 1395

Glu Val Lys Lys Asp Leu Ile Ile Lys Leu Pro Lys Tyr Ser Leu

1400 1405 1410

Phe Glu Leu Glu Asn Gly Arg Lys Arg Met Leu Ala Ser Ala Lys

1415 1420 1425

Gln Leu Gln Lys Gly Asn Glu Leu Ala Leu Pro Ser Lys Tyr Val

1430 1435 1440

Asn Phe Leu Tyr Leu Ala Ser His Tyr Glu Lys Leu Lys Gly Ser

1445 1450 1455

Pro Glu Asp Asn Glu Gln Lys Gln Leu Phe Val Glu Gln His Lys

1460 1465 1470

His Tyr Leu Asp Glu Ile Ile Glu Gln Ile Ser Glu Phe Ser Lys

1475 1480 1485

Arg Val Ile Leu Ala Asp Ala Asn Leu Asp Lys Val Leu Ser Ala

1490 1495 1500

Tyr Asn Lys His Arg Asp Lys Pro Ile Arg Glu Gln Ala Glu Asn

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Ile Ile His Leu Phe Thr Leu Thr Arg Leu Gly Ala Pro Arg Ala

1520 1525 1530

Phe Lys Tyr Phe Asp Thr Thr Ile Asp Pro Lys Gln Tyr Arg Ser

1535 1540 1545

Thr Lys Glu Val Leu Asp Ala Thr Leu Ile His Gln Ser Ile Thr

1550 1555 1560

Gly Leu Tyr Glu Thr Arg Ile Asp Leu Ser Gln Leu Gly Gly Asp

1565 1570 1575

Ser Gly Gly Ser Thr Asn Leu Ser Asp Ile Ile Glu Lys Glu Thr

1580 1585 1590

Gly Lys Gln Leu Val Ile Gln Glu Ser Ile Leu Met Leu Pro Glu

1595 1600 1605

Glu Val Glu Glu Val Ile Gly Asn Lys Pro Glu Ser Asp Ile Leu

1610 1615 1620

Val His Thr Ala Tyr Asp Glu Ser Thr Asp Glu Asn Val Met Leu

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Leu Thr Ser Asp Ala Pro Glu Tyr Lys Pro Trp Ala Leu Val Ile

1640 1645 1650

Gln Asp Ser Asn Gly Glu Asn Lys Ile Lys Met Leu Ser Gly Gly

1655 1660 1665

Ser Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val

1670 1675

<210> 7

<211> 5337

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 7

ggatccatgt ccgaagtgga atttagccat gaatattgga tgcggcacgc cctcacgctt 60

gccaagagag cctgggatga gagggaggtt cccgtcggtg ccgtgttggt ccataacaac 120

agggtgattg gggaaggatg gaacagaccc attgggcgcc atgatccaac tgcccatgca 180

gagattatgg cgctcaggca aggggggttg gttatgcaaa actaccggct tattgacgca 240

accctgtatg tcacccttga accctgtgtt atgtgcgcgg gggccatgat acactctcgg 300

atagggcggg tggtgttcgg ggctcgggat gctaagaccg gagctgctgg ttccctcatg 360

gatgtcttgc atcatcctgg tatgaaccat agagtcgaga ttactgaagg cattctcgca 420

gacgaatgcg ctgcccttct ctcagatttc tttagaatgc gcagacagga aataaaggct 480

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gagacacccg gtacgagtga atccgctacg cccgaatcct cggggggaag ctctggaggc 600

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tatgtcacat ttgaaccatg tgttatgtgt gcgggcgcta tgatccattc acgcataggt 900

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tgcgcggctc ttctttgtta ttttttcaga atgccccgcc aagtgtttaa tgctcaaaag 1080

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ataaagaaga acctgatcgg ggcactgctt ttcgactccg gagagacggc ggagaggacg 1380

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caggaaatct tcagtaacga gatggcgaag gtcgacgata gtttctttca tcggttggaa 1500

gaatcgttcc tcgtagagga ggacaaaaag cacgagcgtc acccaatatt cgggaatatt 1560

gttgacgagg ttgcctacca tgagaaatat cctacaatat atcacctccg taagaagctt 1620

gtcgattcaa ctgataaggc tgatctcaga ctcatctatc ttgccctcgc acatatgatt 1680

aagtttcgtg gccacttctt gattgaaggc gacctcaacc cggacaactc agatgttgac 1740

aagcttttta tacagctcgt ccagacatat aaccagctgt ttgaagagaa tcccatcaat 1800

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gaaaacctga tcgcacagct tcccggtgaa aagaaaaacg ggctcttcgg caatctcatc 1920

gcactgtccc tcggcctcac cccaaacttc aagtctaact tcgacctggc cgaggatgcg 1980

aagctccagc tgtcaaaaga tacatacgac gacgatttgg acaatctgct tgcgcaaata 2040

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atactgacct tcaggatacc atactatgtg ggcccactgg cgcgcggaaa tagtcgtttc 2580

gcatggatga ctagaaagtc cgaagaaacg atcacgccat ggaattttga ggaagtggtc 2640

gacaagggcg cctctgccca gagcttcatc gaaaggatga ccaattttga caaaaatctg 2700

cctaacgaaa aggtgcttcc gaagcacagc ctgttgtatg aatacttcac agtttataac 2760

gagctcacta aggtcaagta cgtcacggag ggcatgcgta agcctgcttt cctgtctggt 2820

gaacaaaaaa aggcgattgt ggacctcctt ttcaagacga accgtaaagt tactgtgaag 2880

caactgaaag aggattactt taagaaaatt gagtgcttcg acagtgtgga gatttccggt 2940

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ttgaccctct tcgaggacag agagatgatt gaggaaagac tgaagaccta cgcacacctt 3120

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tctcgcaagc tcatcaatgg gattcgggat aagcaatcag gcaagacaat tttggacttc 3240

ctcaaatccg acggattcgc aaataggaat tttatgcagc tgatacatga cgactctttg 3300

acattcaaag aagacataca gaaggctcag gtctccggcc aaggagattc tttgcacgag 3360

catatcgcta acttggcagg tagccccgcc ataaaaaagg gcattcttca aacggtaaaa 3420

gttgttgacg aactcgtgaa ggttatgggc cgtcataagc cggaaaacat tgttattgaa 3480

atggctaggg aaaatcagac gacccagaag ggacagaaaa atagcaggga gcggatgaag 3540

agaattgaag agggaattaa ggagcttgga tctcagattc ttaaggagca ccctgtggag 3600

aacacccaac ttcagaatga aaagctctac ctttactacc ttcaaaacgg ccgggatatg 3660

tacgtcgatc aggaacttga cattaaccgg ttgagcgatt atgacgttga ccatattgtg 3720

ccccaatctt tccttaaaga cgactctatc gacaataaag tgctgacgcg cagcgataaa 3780

aatcgcggta agtcggataa tgtcccgtcg gaagaggtgg ttaaaaaaat gaagaactat 3840

tggaggcaac tcctgaatgc caagctgatc actcagagga aattcgacaa tctcaccaag 3900

gcagaaaggg gtggacttag cgagctcgac aaggccggtt ttatcaaaag acagctggtg 3960

gagacacgcc aaatcaccaa acacgttgcc cagatcctgg attcgaggat gaacacgaag 4020

tatgacgaga acgacaagtt gattagggaa gtcaaggtca tcactttgaa gtccaagctg 4080

gtgagcgact ttcgcaaaga cttccagttt tacaaagtca gggaaattaa taactaccac 4140

cacgcccacg acgcctacct taacgccgtg gttggcacag cactcatcaa gaaataccct 4200

aagctcgaat ctgagttcgt ctatggcgac tataaggtct acgacgttag aaaaatgatc 4260

gcgaaatctg agcaggaaat aggcaaggca actgccaagt acttcttcta ttccaatatc 4320

atgaactttt ttaagacgga gattaccctg gcgaatggtg agatccgcaa gcgccctttg 4380

attgagacaa acggagaaac aggagagatc gtatgggaca aagggcggga ctttgctact 4440

gttaggaagg tgctctctat gccacaagtt aacattgtca aaaaaactga agtgcagaca 4500

ggtgggttta gcaaggaatc tatcaggccg aagaggaact ctgacaagct gatcgcccgc 4560

aagaaagatt gggacccgaa aaagtacgga ggattcttgt ggcccacagt tgcgtactcc 4620

gtgcttgtcg tggccaaagt ggagaagggc aagtctaaga agctcaagag cgtcaaagag 4680

ttgttgggga tcacgattat ggagcggtcg tctttcgaaa agaatccgat agattttctc 4740

gaggccaagg gttataaaga agtcaagaag gatcttatca tcaagctccc taagtactcc 4800

ctctttgagc ttgaaaacgg acggaaaaga atgctggctt cagcgaagca gcttcagaag 4860

ggtaatgaac tcgctctgcc ctcaaaatat gtgaatttcc tttacctggc atcacactat 4920

gagaagctta aggggtctcc agaggacaac gagcagaagc aactgttcgt tgaacaacac 4980

aagcactacc ttgacgagat tatcgagcaa atcagcgagt ttagcaagcg cgttatactg 5040

gcagacgcaa atcttgataa ggtccttagc gcctacaaca agcatagaga caaacccatc 5100

cgggagcagg ccgagaacat tattcatctc ttcaccttga cgaggcttgg ggccccgaga 5160

gcgttcaagt acttcgatac taccatagac ccaaagcaat atcggtcgac aaaggaagtt 5220

cttgacgcca cgctgatcca ccaaagtata acaggcctct atgagacacg catcgacctt 5280

tcgcagttgg gcggtgaccg ccccaaaaag aagaggaaag ttggcgggtg aactagt 5337

<210> 8

<211> 1774

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 8

Met Ser Glu Val Glu Phe Ser His Glu Tyr Trp Met Arg His Ala Leu

1 5 10 15

Thr Leu Ala Lys Arg Ala Trp Asp Glu Arg Glu Val Pro Val Gly Ala

20 25 30

Val Leu Val His Asn Asn Arg Val Ile Gly Glu Gly Trp Asn Arg Pro

35 40 45

Ile Gly Arg His Asp Pro Thr Ala His Ala Glu Ile Met Ala Leu Arg

50 55 60

Gln Gly Gly Leu Val Met Gln Asn Tyr Arg Leu Ile Asp Ala Thr Leu

65 70 75 80

Tyr Val Thr Leu Glu Pro Cys Val Met Cys Ala Gly Ala Met Ile His

85 90 95

Ser Arg Ile Gly Arg Val Val Phe Gly Ala Arg Asp Ala Lys Thr Gly

100 105 110

Ala Ala Gly Ser Leu Met Asp Val Leu His His Pro Gly Met Asn His

115 120 125

Arg Val Glu Ile Thr Glu Gly Ile Leu Ala Asp Glu Cys Ala Ala Leu

130 135 140

Leu Ser Asp Phe Phe Arg Met Arg Arg Gln Glu Ile Lys Ala Gln Lys

145 150 155 160

Lys Ala Gln Ser Ser Thr Asp Ser Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Ser

165 170 175

Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Ser

180 185 190

Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Ser Glu Val Glu Phe Ser His Glu Tyr

195 200 205

Trp Met Arg His Ala Leu Thr Leu Ala Lys Arg Ala Arg Asp Glu Arg

210 215 220

Glu Val Pro Val Gly Ala Val Leu Val Leu Asn Asn Arg Val Ile Gly

225 230 235 240

Glu Gly Trp Asn Arg Ala Ile Gly Leu His Asp Pro Thr Ala His Ala

245 250 255

Glu Ile Met Ala Leu Arg Gln Gly Gly Leu Val Met Gln Asn Tyr Arg

260 265 270

Leu Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Val Thr Phe Glu Pro Cys Val Met Cys

275 280 285

Ala Gly Ala Met Ile His Ser Arg Ile Gly Arg Val Val Phe Gly Val

290 295 300

Arg Asn Ala Lys Thr Gly Ala Ala Gly Ser Leu Met Asp Val Leu His

305 310 315 320

Tyr Pro Gly Met Asn His Arg Val Glu Ile Thr Glu Gly Ile Leu Ala

325 330 335

Asp Glu Cys Ala Ala Leu Leu Cys Tyr Phe Phe Arg Met Pro Arg Gln

340 345 350

Val Phe Asn Ala Gln Lys Lys Ala Gln Ser Ser Thr Asp Ser Gly Gly

355 360 365

Ser Ser Gly Gly Ser Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser

370 375 380

Ala Thr Pro Glu Ser Ser Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Asp Lys Lys

385 390 395 400

Tyr Ser Ile Gly Leu Ala Ile Gly Thr Asn Ser Val Gly Trp Ala Val

405 410 415

Ile Thr Asp Glu Tyr Lys Val Pro Ser Lys Lys Phe Lys Val Leu Gly

420 425 430

Asn Thr Asp Arg His Ser Ile Lys Lys Asn Leu Ile Gly Ala Leu Leu

435 440 445

Phe Asp Ser Gly Glu Thr Ala Glu Arg Thr Arg Leu Lys Arg Thr Ala

450 455 460

Arg Arg Arg Tyr Thr Arg Arg Lys Asn Arg Ile Cys Tyr Leu Gln Glu

465 470 475 480

Ile Phe Ser Asn Glu Met Ala Lys Val Asp Asp Ser Phe Phe His Arg

485 490 495

Leu Glu Glu Ser Phe Leu Val Glu Glu Asp Lys Lys His Glu Arg His

500 505 510

Pro Ile Phe Gly Asn Ile Val Asp Glu Val Ala Tyr His Glu Lys Tyr

515 520 525

Pro Thr Ile Tyr His Leu Arg Lys Lys Leu Val Asp Ser Thr Asp Lys

530 535 540

Ala Asp Leu Arg Leu Ile Tyr Leu Ala Leu Ala His Met Ile Lys Phe

545 550 555 560

Arg Gly His Phe Leu Ile Glu Gly Asp Leu Asn Pro Asp Asn Ser Asp

565 570 575

Val Asp Lys Leu Phe Ile Gln Leu Val Gln Thr Tyr Asn Gln Leu Phe

580 585 590

Glu Glu Asn Pro Ile Asn Ala Ser Gly Val Asp Ala Lys Ala Ile Leu

595 600 605

Ser Ala Arg Leu Ser Lys Ser Arg Arg Leu Glu Asn Leu Ile Ala Gln

610 615 620

Leu Pro Gly Glu Lys Lys Asn Gly Leu Phe Gly Asn Leu Ile Ala Leu

625 630 635 640

Ser Leu Gly Leu Thr Pro Asn Phe Lys Ser Asn Phe Asp Leu Ala Glu

645 650 655

Asp Ala Lys Leu Gln Leu Ser Lys Asp Thr Tyr Asp Asp Asp Leu Asp

660 665 670

Asn Leu Leu Ala Gln Ile Gly Asp Gln Tyr Ala Asp Leu Phe Leu Ala

675 680 685

Ala Lys Asn Leu Ser Asp Ala Ile Leu Leu Ser Asp Ile Leu Arg Val

690 695 700

Asn Thr Glu Ile Thr Lys Ala Pro Leu Ser Ala Ser Met Ile Lys Arg

705 710 715 720

Tyr Asp Glu His His Gln Asp Leu Thr Leu Leu Lys Ala Leu Val Arg

725 730 735

Gln Gln Leu Pro Glu Lys Tyr Lys Glu Ile Phe Phe Asp Gln Ser Lys

740 745 750

Asn Gly Tyr Ala Gly Tyr Ile Asp Gly Gly Ala Ser Gln Glu Glu Phe

755 760 765

Tyr Lys Phe Ile Lys Pro Ile Leu Glu Lys Met Asp Gly Thr Glu Glu

770 775 780

Leu Leu Val Lys Leu Asn Arg Glu Asp Leu Leu Arg Lys Gln Arg Thr

785 790 795 800

Phe Asp Asn Gly Ser Ile Pro His Gln Ile His Leu Gly Glu Leu His

805 810 815

Ala Ile Leu Arg Arg Gln Glu Asp Phe Tyr Pro Phe Leu Lys Asp Asn

820 825 830

Arg Glu Lys Ile Glu Lys Ile Leu Thr Phe Arg Ile Pro Tyr Tyr Val

835 840 845

Gly Pro Leu Ala Arg Gly Asn Ser Arg Phe Ala Trp Met Thr Arg Lys

850 855 860

Ser Glu Glu Thr Ile Thr Pro Trp Asn Phe Glu Glu Val Val Asp Lys

865 870 875 880

Gly Ala Ser Ala Gln Ser Phe Ile Glu Arg Met Thr Asn Phe Asp Lys

885 890 895

Asn Leu Pro Asn Glu Lys Val Leu Pro Lys His Ser Leu Leu Tyr Glu

900 905 910

Tyr Phe Thr Val Tyr Asn Glu Leu Thr Lys Val Lys Tyr Val Thr Glu

915 920 925

Gly Met Arg Lys Pro Ala Phe Leu Ser Gly Glu Gln Lys Lys Ala Ile

930 935 940

Val Asp Leu Leu Phe Lys Thr Asn Arg Lys Val Thr Val Lys Gln Leu

945 950 955 960

Lys Glu Asp Tyr Phe Lys Lys Ile Glu Cys Phe Asp Ser Val Glu Ile

965 970 975

Ser Gly Val Glu Asp Arg Phe Asn Ala Ser Leu Gly Thr Tyr His Asp

980 985 990

Leu Leu Lys Ile Ile Lys Asp Lys Asp Phe Leu Asp Asn Glu Glu Asn

995 1000 1005

Glu Asp Ile Leu Glu Asp Ile Val Leu Thr Leu Thr Leu Phe Glu

1010 1015 1020

Asp Arg Glu Met Ile Glu Glu Arg Leu Lys Thr Tyr Ala His Leu

1025 1030 1035

Phe Asp Asp Lys Val Met Lys Gln Leu Lys Arg Arg Arg Tyr Thr

1040 1045 1050

Gly Trp Gly Arg Leu Ser Arg Lys Leu Ile Asn Gly Ile Arg Asp

1055 1060 1065

Lys Gln Ser Gly Lys Thr Ile Leu Asp Phe Leu Lys Ser Asp Gly

1070 1075 1080

Phe Ala Asn Arg Asn Phe Met Gln Leu Ile His Asp Asp Ser Leu

1085 1090 1095

Thr Phe Lys Glu Asp Ile Gln Lys Ala Gln Val Ser Gly Gln Gly

1100 1105 1110

Asp Ser Leu His Glu His Ile Ala Asn Leu Ala Gly Ser Pro Ala

1115 1120 1125

Ile Lys Lys Gly Ile Leu Gln Thr Val Lys Val Val Asp Glu Leu

1130 1135 1140

Val Lys Val Met Gly Arg His Lys Pro Glu Asn Ile Val Ile Glu

1145 1150 1155

Met Ala Arg Glu Asn Gln Thr Thr Gln Lys Gly Gln Lys Asn Ser

1160 1165 1170

Arg Glu Arg Met Lys Arg Ile Glu Glu Gly Ile Lys Glu Leu Gly

1175 1180 1185

Ser Gln Ile Leu Lys Glu His Pro Val Glu Asn Thr Gln Leu Gln

1190 1195 1200

Asn Glu Lys Leu Tyr Leu Tyr Tyr Leu Gln Asn Gly Arg Asp Met

1205 1210 1215

Tyr Val Asp Gln Glu Leu Asp Ile Asn Arg Leu Ser Asp Tyr Asp

1220 1225 1230

Val Asp His Ile Val Pro Gln Ser Phe Leu Lys Asp Asp Ser Ile

1235 1240 1245

Asp Asn Lys Val Leu Thr Arg Ser Asp Lys Asn Arg Gly Lys Ser

1250 1255 1260

Asp Asn Val Pro Ser Glu Glu Val Val Lys Lys Met Lys Asn Tyr

1265 1270 1275

Trp Arg Gln Leu Leu Asn Ala Lys Leu Ile Thr Gln Arg Lys Phe

1280 1285 1290

Asp Asn Leu Thr Lys Ala Glu Arg Gly Gly Leu Ser Glu Leu Asp

1295 1300 1305

Lys Ala Gly Phe Ile Lys Arg Gln Leu Val Glu Thr Arg Gln Ile

1310 1315 1320

Thr Lys His Val Ala Gln Ile Leu Asp Ser Arg Met Asn Thr Lys

1325 1330 1335

Tyr Asp Glu Asn Asp Lys Leu Ile Arg Glu Val Lys Val Ile Thr

1340 1345 1350

Leu Lys Ser Lys Leu Val Ser Asp Phe Arg Lys Asp Phe Gln Phe

1355 1360 1365

Tyr Lys Val Arg Glu Ile Asn Asn Tyr His His Ala His Asp Ala

1370 1375 1380

Tyr Leu Asn Ala Val Val Gly Thr Ala Leu Ile Lys Lys Tyr Pro

1385 1390 1395

Lys Leu Glu Ser Glu Phe Val Tyr Gly Asp Tyr Lys Val Tyr Asp

1400 1405 1410

Val Arg Lys Met Ile Ala Lys Ser Glu Gln Glu Ile Gly Lys Ala

1415 1420 1425

Thr Ala Lys Tyr Phe Phe Tyr Ser Asn Ile Met Asn Phe Phe Lys

1430 1435 1440

Thr Glu Ile Thr Leu Ala Asn Gly Glu Ile Arg Lys Arg Pro Leu

1445 1450 1455

Ile Glu Thr Asn Gly Glu Thr Gly Glu Ile Val Trp Asp Lys Gly

1460 1465 1470

Arg Asp Phe Ala Thr Val Arg Lys Val Leu Ser Met Pro Gln Val

1475 1480 1485

Asn Ile Val Lys Lys Thr Glu Val Gln Thr Gly Gly Phe Ser Lys

1490 1495 1500

Glu Ser Ile Arg Pro Lys Arg Asn Ser Asp Lys Leu Ile Ala Arg

1505 1510 1515

Lys Lys Asp Trp Asp Pro Lys Lys Tyr Gly Gly Phe Leu Trp Pro

1520 1525 1530

Thr Val Ala Tyr Ser Val Leu Val Val Ala Lys Val Glu Lys Gly

1535 1540 1545

Lys Ser Lys Lys Leu Lys Ser Val Lys Glu Leu Leu Gly Ile Thr

1550 1555 1560

Ile Met Glu Arg Ser Ser Phe Glu Lys Asn Pro Ile Asp Phe Leu

1565 1570 1575

Glu Ala Lys Gly Tyr Lys Glu Val Lys Lys Asp Leu Ile Ile Lys

1580 1585 1590

Leu Pro Lys Tyr Ser Leu Phe Glu Leu Glu Asn Gly Arg Lys Arg

1595 1600 1605

Met Leu Ala Ser Ala Lys Gln Leu Gln Lys Gly Asn Glu Leu Ala

1610 1615 1620

Leu Pro Ser Lys Tyr Val Asn Phe Leu Tyr Leu Ala Ser His Tyr

1625 1630 1635

Glu Lys Leu Lys Gly Ser Pro Glu Asp Asn Glu Gln Lys Gln Leu

1640 1645 1650

Phe Val Glu Gln His Lys His Tyr Leu Asp Glu Ile Ile Glu Gln

1655 1660 1665

Ile Ser Glu Phe Ser Lys Arg Val Ile Leu Ala Asp Ala Asn Leu

1670 1675 1680

Asp Lys Val Leu Ser Ala Tyr Asn Lys His Arg Asp Lys Pro Ile

1685 1690 1695

Arg Glu Gln Ala Glu Asn Ile Ile His Leu Phe Thr Leu Thr Arg

1700 1705 1710

Leu Gly Ala Pro Arg Ala Phe Lys Tyr Phe Asp Thr Thr Ile Asp

1715 1720 1725

Pro Lys Gln Tyr Arg Ser Thr Lys Glu Val Leu Asp Ala Thr Leu

1730 1735 1740

Ile His Gln Ser Ile Thr Gly Leu Tyr Glu Thr Arg Ile Asp Leu

1745 1750 1755

Ser Gln Leu Gly Gly Asp Arg Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Gly

1760 1765 1770

Gly

<210> 9

<211> 990

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 9

gcaggctgtc gactggatcc aagcttaaga acgaactaag ccggacaaaa aaaggagcac 60

atatacaaac cggttttatt catgaatggt cacgatggat gatggggctc agacttgagc 120

tacgaggccg caggcgagag aagcctagtg tgctctctgc ttgtttgggc cgtaacggag 180

gatacggccg acgagcgtgt actaccgcgc gggatgccgc tgggcgctgc gggggccgtt 240

ggatggggat cggtgggtcg cgggagcgtt gaggggagac aggtttagta ccacctcgcc 300

taccgaacaa tgaagaaccc accttataac cccgcgcgct gccgcttgtg ttggctagga 360

tccatcgcag tcagcgatga gtacagcaag ttttagagct agaaatagca agttaaaata 420

aggctagtcc gttatcaact tgaaaaagtg gcaccgagtc ggtgcttttt tttgagattt 480

ccaaccaggt ccctggagcc catagtctag taacggccgc cagtgtgctg gaattgccct 540

tggatcatga accaacggcc tggctgtatt tggtggttgt gtagggagat ggggagaaga 600

aaagcccgat tctcttcgct gtgatgggct ggatgcatgc gggggagcgg gaggcccaag 660

tacgtgcacg gtgagcggcc cacagggcga gtgtgagcgc gagaggcggg aggaacagtt 720

tagtaccaca ttgcccagct aactcgaacg cgaccaactt ataaacccgc gcgctgtcgc 780

ttgtgtagag accaaaggag gtctcagttt tagagctaga aatagcaagt taaaataagg 840

ctagtccgtt atcaacttga aaaagtggca ccgagtcggt gctttttttt gtcccttcga 900

agggcaattc tgcagatatc catcacactg gcggccgctc gaggtcgacg gtatcgataa 960

gcttgatatc gaattcaccc agctttcttg 990

Claims

1.DNA分子在水稻单碱基编辑中的应用，所述DNA分子由含Cas蛋白+脱氨酶表达盒和sgRNA表达盒组成；所述含Cas蛋白+脱氨酶表达盒表达融合蛋白，所述融合蛋白含有Cas蛋白和脱氨酶，所述脱氨酶为胞嘧啶脱氨酶和/或腺嘌呤脱氨酶，所述Cas蛋白为氨基酸序列是SEQ ID No.6的第212-1578位的蛋白质；所述sgRNA表达盒表达sgRNA，所述sgRNA的靶标序列是5′-N_19-20PAM-3′，所述N_19-20为19-20个N，所述PAM为3个N；所述N为A、G、C或T。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述含Cas蛋白+脱氨酶表达盒为含Cas蛋白+胞嘧啶脱氨酶表达盒或含Cas蛋白+腺嘌呤脱氨酶表达盒；

所述含Cas蛋白+胞嘧啶脱氨酶表达盒表达名称为Cas蛋白/胞嘧啶脱氨酶的融合蛋白，所述Cas蛋白/胞嘧啶脱氨酶含有所述胞嘧啶脱氨酶、所述Cas蛋白和尿嘧啶DNA糖基化酶抑制剂；

所述含Cas蛋白+腺嘌呤脱氨酶表达盒表达名称为Cas蛋白/腺嘌呤脱氨酶的融合蛋白，所述Cas蛋白/腺嘌呤脱氨酶含有所述腺嘌呤脱氨酶和所述Cas蛋白。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述Cas蛋白/胞嘧啶脱氨酶是由所述胞嘧啶脱氨酶、所述Cas蛋白、所述尿嘧啶DNA糖基化酶抑制剂和核定位信号连接而成的蛋白质，

所述Cas蛋白/腺嘌呤脱氨酶是由所述腺嘌呤脱氨酶、所述Cas蛋白和所述核定位信号连接而成的蛋白质。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述Cas蛋白/胞嘧啶脱氨酶的氨基酸序列为序列表中的SEQ ID No.6，所述Cas蛋白/腺嘌呤脱氨酶的氨基酸序列为序列表中的SEQID No.8。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述含Cas蛋白+脱氨酶表达盒中含有所述Cas蛋白的编码基因，所述Cas蛋白的编码基因的编码链的编码序列是序列表中的SEQ IDNo.5的第640-4740位。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述含Cas蛋白+胞嘧啶脱氨酶表达盒含有所述Cas蛋白/胞嘧啶脱氨酶的编码基因，所述Cas蛋白/胞嘧啶脱氨酶的编码基因的编码链的编码序列是序列表中的SEQ ID No.5；

所述含Cas蛋白+腺嘌呤脱氨酶表达盒含有所述Cas蛋白/腺嘌呤脱氨酶的编码基因，所述Cas蛋白/腺嘌呤脱氨酶的编码基因的编码链的编码序列是序列表中的SEQ ID No.7。

7.根据权利要求1-6中任一所述的应用，其特征在于：所述PAM是下述任一种：

L1、5′-NAN-3′，

L2、5′-NGN-3′，

L3、5′-NCG-3′，

L4、5′-NCT-3′，

L5、5′-NCC-3′，

L6、5′-NTC-3′，

所述N为A、G、C或T。

8.与权利要求1-7中任一所述的DNA分子相关的生物材料，所述生物材料为下述任一种：

B1)权利要求1-7中任一所述的DNA分子；

B2)含有B1)所述DNA分子的重组载体；

B3)含有B1)所述DNA分子的重组微生物；

B4)含有B2)所述的重组载体的重组微生物；

B5)由权利要求1-7中任一所述的DNA分子中的所述Cas蛋白+脱氨酶表达盒和所述sgRNA表达盒组成的组合物；

B6)由含有权利要求1-7中任一所述的DNA分子中的所述Cas蛋白+脱氨酶表达盒的重组载体和含有权利要求1-7中任一所述的DNA分子中的所述sgRNA表达盒的重组载体组成的组合物；

B7)由含有权利要求1-7中任一所述的DNA分子中的所述Cas蛋白+脱氨酶表达盒的重组微生物和含有权利要求1-7中任一所述的DNA分子中的所述sgRNA表达盒的重组微生物组成的组合物；

B8)由权利要求1-7中任一所述的DNA分子中的所述融合蛋白和权利要求1-7中任一所述的DNA分子中的所述sgRNA组成的组合物。

9.权利要求1中所述的Cas蛋白、权利要求1-7中任一所述的DNA分子或权利要求8所述的生物材料在植物基因组编辑中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述植物为双子叶植物或单子叶植物。