CN112852791B - 腺嘌呤碱基编辑器及其相关生物材料与应用 - Google Patents

腺嘌呤碱基编辑器及其相关生物材料与应用 Download PDF

Info

Publication number
CN112852791B
CN112852791B CN202110061201.2A CN202110061201A CN112852791B CN 112852791 B CN112852791 B CN 112852791B CN 202110061201 A CN202110061201 A CN 202110061201A CN 112852791 B CN112852791 B CN 112852791B
Authority
CN
China
Prior art keywords
leu
lys
glu
ile
asp
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202110061201.2A
Other languages
English (en)
Other versions
CN112852791A (zh
Inventor
周焕斌
严芳
任斌
闫大琦
柳浪
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institute of Plant Protection of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Original Assignee
Institute of Plant Protection of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institute of Plant Protection of Chinese Academy of Agricultural Sciences filed Critical Institute of Plant Protection of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority to CN202110061201.2A priority Critical patent/CN112852791B/zh
Publication of CN112852791A publication Critical patent/CN112852791A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN112852791B publication Critical patent/CN112852791B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C12N15/8218—Antisense, co-suppression, viral induced gene silencing [VIGS], post-transcriptional induced gene silencing [PTGS]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y305/00—Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5)
    • C12Y305/04—Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5) in cyclic amidines (3.5.4)
    • C12Y305/04004—Adenosine deaminase (3.5.4.4)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/09—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a nuclear localisation signal

Abstract

本发明公开了腺嘌呤碱基编辑器及其相关生物材料与应用。该腺嘌呤碱基编辑器是一种融合蛋白质，该融合蛋白质是含有Cas蛋白和腺苷脱氨酶的蛋白质，所述腺苷脱氨酶是氨基酸序列是序列表中序列2的第1‑167位的蛋白质，即TadA9。TadA9与SpCas9(D10A)、SpCas9‑NG(D10A)、ScCas9(D10A)和SpRY(D10A)融合后介导的腺嘌呤碱基编辑技术的编辑效率显著高于TadA7.10和TadA‑R突变体介导的腺嘌呤碱基编辑技术，并且可以扩展其编辑活性窗口，提高了腺嘌呤碱基编辑技术的效率和扩宽了其应用范围。本发明能够在水稻甚至其它植物细胞中广泛适用。

Description

腺嘌呤碱基编辑器及其相关生物材料与应用
本申请是申请号为202011308944.7、申请日为2020年11月20日、发明创造名称为“腺苷脱氨酶及其相关生物材料与应用”的分案申请。
技术领域
本发明涉及酶、变异和遗传工程领域中的腺嘌呤碱基编辑器及其相关生物材料与应用。
背景技术
基因组编辑技术是利用人工核酸酶对生物体基因组特定位置进行改造的一种基因工程技术。这一过程主要依赖于特定的核酸酶对靶标位点进行切割，产生DNA双链断裂，而后生物体利用非同源末端连接(Non-homologous end-joining,NHEJ)修复或同源重组修复(Homology-directed repair,HDR)的方式引入碱基的缺失、插入和错配等现象，从而达到突变的目的。近年来，以ZFN、TALEN和CRISPR为主的人工核酸酶技术陆续开发成功。尤其CRISPR/Cas技术，因其易操作、效率高以及普适性受到了研究人员的广泛关注。
单核苷酸多态性(Single-nucleotide polymorphism,SNP)是农作物农艺性状的遗传基础，植物中有许多重要农艺性状是由单个核苷酸位点决定。目前，SNP被越来越多的发现和用于植物表型性状的筛选。随着CRISPR/Cas技术的发展，以此为基础建立的在基因组上引起单个碱基改变的单碱基编辑技术，包括胞嘧啶碱基编辑系统和腺嘌呤碱基编辑系统，用来指导植物中的靶标碱基替换。碱基编辑技术自被开发以来，因其具有高效性、不依赖DNA双链断裂、无需供体DNA存在等优势，已经成功应用于动植物等多种生物体中。已经成功应用于植物碱基编辑系统的胞苷脱氨酶有APOBEC1，APOBEC3，AID等，腺苷脱氨酶有TadA7.10。
以腺苷脱氨酶为基础的腺嘌呤碱基编辑技术主要是利用由切口酶Cas9n(D10A)结合腺苷脱氨酶组成融合蛋白，在sgRNA的引导下，将位于碱基编辑活性窗口内的靶碱基A脱氨形成次黄嘌呤I，再经DNA修复和复制后逐渐被替换为G，最终形成A向G的定向替换(A>G)。然而目前植物腺嘌呤碱基编辑技术存在编辑效率低，甚至于存在在碱基编辑活性窗口内的靶位点仍然无法达到有效碱基编辑事件。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何提高植物腺嘌呤碱基编辑的效率，和/或如何实现目前技术无法完成的预期腺嘌呤碱基编辑。
为了解决以上技术问题，本发明提供了一种腺苷脱氨酶。
本发明所提供的腺苷脱氨酶，名称为TadA9，是一种非天然蛋白质，是对大肠杆菌tRNA腺苷脱氨酶TadA的突变体TadA7.10进行人工突变获得的高活性的腺苷脱氨酶。腺苷脱氨酶是氨基酸序列是序列表中序列2(SEQ ID No.2)的第1-167位的蛋白质(即序列表中序列1的第7-507位核苷酸(CDS)编码的蛋白质)。为解决上述技术问题，本发明还提供了与所述TadA9相关的生物材料。
本发明所提供的与所述TadA9相关的生物材料，可为下述B1)-B7)中至少一种：
B1)编码所述蛋白质的核酸分子；
B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；
B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体或含有B2)所述表达盒的重组载体；
B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、含有B2)所述表达盒的重组微生物或含有B3)所述重组载体的重组微生物；
B5)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系或含有B3)所述重组载体的转基因植物细胞系；
B6)含有B1)所述核酸分子的转基因植物组织、含有B2)所述表达盒的转基因植物组织或含有B3)所述重组载体的转基因植物组织；
B7)含有B1)所述核酸分子的转基因植物器官、含有B2)所述表达盒的转基因植物器官或含有B3)所述重组载体的转基因植物器官。
上述生物材料中，B1)所述核酸分子可为如下B11)或B12)所示的基因：
B11)其编码链的编码序列(CDS)是序列1的第7-507位所示的cDNA分子或DNA分子；
B12)与B11)限定的核苷酸序列具有80％或80％以上同一性，且编码所述蛋白质的cDNA分子或DNA分子。
本发明还提供了腺嘌呤碱基编辑器。
本发明所提供的腺嘌呤碱基编辑器是一种融合蛋白质，所述融合蛋白质是含有Cas蛋白和腺苷脱氨酶的蛋白质，所述腺苷脱氨酶是所述TadA9。
上述腺嘌呤碱基编辑器中，所述Cas蛋白可为SpCas9(D10A)、SpCas9-NG(D10A)、ScCas9(D10A)或SpRY(D10A)。
上述腺嘌呤碱基编辑器中，所述SpCas9(D10A)是氨基酸序列是序列2的第200-1567位的蛋白质(即序列表中序列1的第604-4707位核苷酸(CDS)编码的蛋白质)，SpCas9-NG(D10A)是氨基酸序列是序列4的第200-1567位的蛋白质(即序列表中序列3的第604-4707位核苷酸(CDS)编码的蛋白质)，ScCas9(D10A)是氨基酸序列是序列6的第200-1574位的蛋白质(即序列表中序列5的第604-4728位核苷酸(CDS)编码的蛋白质)，SpRY(D10A)氨基酸序列是序列8的第200-1567位的蛋白质(即序列表中序列7的第604-4707位核苷酸(CDS)编码的蛋白质)。
上述腺嘌呤碱基编辑器中，所述腺嘌呤碱基编辑器可为由所述腺苷脱氨酶、所述Cas蛋白和核定位信号(nuclear localization signal,NLS)连接而成的蛋白质。
上述腺嘌呤碱基编辑器中，所述腺嘌呤碱基编辑器具体可为TadA9-SpCas9(D10A)、TadA9-SpCas9-NG(D10A)TadA9-ScCas9(D10A)或TadA9-SpRY(D10A)，所述TadA9-SpCas9(D10A)为氨基酸序列是序列2的蛋白质(即序列表中序列1的第7-4737位核苷酸(CDS)编码的蛋白质)，所述TadA9-SpCas9-NG(D10A)为氨基酸序列是序列4的蛋白质(即序列表中序列3的第7-4737位核苷酸(CDS)编码的蛋白质)，所述TadA9-ScCas9(D10A)为氨基酸序列是序列6的蛋白质(即序列表中序列5的第7-4758位核苷酸(CDS)编码的蛋白质)，所述TadA9-SpRY(D10A)为氨基酸序列是序列8的蛋白质(即序列表中序列7的第7-4737位核苷酸(CDS)编码的蛋白质)。
与上述腺嘌呤碱基编辑器的相关的生物材料也属于本发明的保护范围。
与上述腺嘌呤碱基编辑器的相关的生物材料具体可为下述D1)-D7)中至少一种：
D1)编码所述腺嘌呤碱基编辑器的核酸分子；
D2)含有D1)所述核酸分子的表达盒；
D3)含有D1)所述核酸分子的重组载体或含有D2)所述表达盒的重组载体；
D4)含有D1)所述核酸分子的重组微生物、含有D2)所述表达盒的重组微生物或含有D3)所述重组载体的重组微生物；
D5)含有D1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、含有D2)所述表达盒的转基因植物细胞系或含有D3)所述重组载体的转基因植物细胞系；
D6)含有D1)所述核酸分子的转基因植物组织、含有D2)所述表达盒的转基因植物组织或含有D3)所述重组载体的转基因植物组织；
D7)含有D1)所述核酸分子的转基因植物器官、含有D2)所述表达盒的转基因植物器官或含有D3)所述重组载体的转基因植物器官。
与上述腺嘌呤碱基编辑器的相关的生物材料中，D1)所述核酸分子可为TadA9-SpCas9(D10A)的编码基因、TadA9-SpCas9-NG(D10A)的编码基因、TadA9-ScCas9(D10A)的编码基因或TadA9-SpRY(D10A)的编码基因；
所述TadA9-SpCas9(D10A)的编码基因可为如下任一所示的基因：
D131)其编码链的编码序列(CDS)是序列1的第7-4737位所示的cDNA分子或DNA分子，
D132)与D131)限定的核苷酸序列具有80％或80％以上同一性，且编码所述TadA9-SpCas9(D10A)的cDNA分子或DNA分子；
所述TadA9-SpCas9-NG(D10A)的编码基因可为如下任一所示的基因：
D141)其编码链的编码序列(CDS)是序列3的第7-4737所示的cDNA分子或DNA分子，
D142)与D141)限定的核苷酸序列具有80％或80％以上同一性，且编码所述TadA9-SpCas9(D10A)的cDNA分子或DNA分子；
所述TadA9-ScCas9(D10A)的编码基因可为如下任一所示的基因：
D111)其编码链的编码序列(CDS)是序列5的第7-4758位所示的cDNA分子或DNA分子，
D112)与D111)限定的核苷酸序列具有80％或80％以上同一性，且编码所述TadA9-ScCas9(D10A)的cDNA分子或DNA分子；
所述TadA9-SpRY(D10A)的编码基因可为如下任一所示的基因：
D121)其编码链的编码序列(CDS)是序列7的第7-4737位所示的cDNA分子或DNA分子，
D122)与D121)限定的核苷酸序列具有80％或80％以上同一性，且编码所述TadA9-SpRY(D10A)的cDNA分子或DNA分子。
上文中，所述表达盒，是指能够在宿主细胞(如植物细胞)中表达所述蛋白质的DNA，该DNA不但可包括启动所述蛋白质基因转录的启动子，还可包括终止所述蛋白质基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子，组织、器官和发育特异的启动子，和诱导型启动子。启动子的例子包括但不限于：玉米的Ubiquitin启动子、花椰菜花叶病毒的组成型启动子35S；来自西红柿的创伤诱导型启动子，亮氨酸氨基肽酶("LAP",Chao等人(1999)Plant Physiology 120:979-992)；来自烟草的化学诱导型启动子，病程相关蛋白1(PR1)(由水杨酸和BTH(苯并噻二唑-7-硫代羟酸S-甲酯)诱导)；西红柿蛋白酶抑制剂II启动子(PIN2)或LAP启动子(均可用茉莉酮酸甲酯诱导)；热休克启动子(美国专利5，187，267)；四环素诱导型启动子(美国专利5，057,422)；种子特异性启动子，如谷子种子特异性启动子pF128(CN101063139B(中国专利2007 1 0099169.7))，种子贮存蛋白质特异的启动子(例如，菜豆球蛋白、napin,oleosin和大豆beta conglycin的启动子(Beachy等人(1985)EMBO J.4:3047-3053))。它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。此处引用的所有参考文献均全文引用。合适的转录终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子(NOS终止子)、花椰菜花叶病毒CaMV 35S终止子、tml终止子、豌豆rbcS E9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子(参见，例如：Odell等人(I985)Nature 313:810；Rosenberg等人(1987)Gene,56:125；Guerineau等人(1991)Mol.Gen.Genet,262:141；Proudfoot(1991)Cell,64:671；Sanfacon等人GenesDev.,5:141；Mogen等人(1990)Plant Cell,2:1261；Munroe等人(1990)Gene,91:151；Ballad等人(1989)Nucleic Acids Res.17:7891；Joshi等人(1987)Nucleic Acid Res.,15:9627)。
在本发明的一个实施例中，所述表达盒由Ubip启动子(核苷酸序列是序列9)，编码所述腺嘌呤碱基编辑器的核酸分子和NOS终止子(核苷酸序列是序列10)连接而成。
这里使用的术语“同一性”指核酸序列间的序列相似性。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。上述80％以上同一性可为85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或以上的同一性。
上文中，所述重组微生物具体可为细菌，酵母，藻和真菌。
下述任一种应用也属于本发明的保护范围：
1)TadA9在植物单碱基编辑中的应用，
2)TadA9相关的生物材料在植物单碱基编辑中的应用，
3)上述腺嘌呤碱基编辑器在植物单碱基编辑中的应用，
4)与上述腺嘌呤碱基编辑器的相关的生物材料在植物单碱基编辑中的应用。
为了解决以上技术问题，本发明提供了一种将植物基因组上的A定点突变为G的方法。
本发明所提供的将植物基因组上的A定点突变为G的方法，其包括如下步骤：将表达所述腺嘌呤碱基编辑器和sgRNA的DNA分子导入受体植物中，得到含有A定点突变为G的目的植物；所述sgRNA的靶标序列是5′-N19-20PAM-3′，所述N19-20为19-20个N，所述PAM(protospacer adjacent motif)为3个N；所述N为A、G、C或T。
在将表达所述腺嘌呤碱基编辑器和sgRNA的DNA分子导入受体植物时，可以采用PEG介导转化的方法，也可以采用基因枪法或农杆菌侵染法中的一种将所述基因编辑工具盒导入到水稻原生质体或愈伤组织中，这是本领域技术人员容易理解的。本领域的技术人员公知，水稻基因组DNA由两条链组成，因此，所述靶核苷酸序列可以在其中互补的任意一条链上。例如，当所述靶核苷酸序列位于某一功能基因的正义链中时，如果该功能基因的特定位点上的A被定点突变为G后，并且如果其中的一种突变能够获得预期的其对应的功能蛋白中的氨基酸，也可以采用此系统来实现，即可以通过直接进行正义链上的碱基替换来实现三联体密码子中的A替换为G，从而得到水稻基因功能“矫正”突变体；或当所述靶核苷酸序列位于某一功能基因的反义链中时，如果该功能基因的特定位点上的T被定点突变为C后，并且如果其中的一种突变能够获得预期的其对应的功能蛋白中的氨基酸，则可以采用此系统来实现，即可以通过将该反义链中的A被定点突变为G，进而使正义链中的相应互补的T替换为C来改变正义链中的所述三联体密码子编码氨基酸，得到水稻基因功能“矫正”突变体。
上文中，所述植物可为双子叶植物或单子叶植物。所述单子叶植物可为水稻。所述单碱基编辑可为将腺嘌呤A替换为鸟嘌呤G。
本发明通过对TadA蛋白进行人工突变获得了高活性的突变体TadA9，并利用其开发一个全新CRISPR/Cas基因编辑工具盒。本发明的TadA9与SpCas9(D10A)、SpCas9-NG(D10A)、ScCas9(D10A)和SpRY(D10A)融合后介导的腺嘌呤碱基编辑技术的编辑效率显著高于TadA7.10和TadA-R突变体介导的腺嘌呤碱基编辑技术，并且可以扩展其编辑活性窗口，提高了腺嘌呤碱基编辑技术的效率和扩宽了其应用范围。尤其是解决了TadA7.10介导的碱基编辑载体无法编辑的靶点的腺嘌呤碱基编辑难题，扩宽了植物基因组定点编辑的使用范围，为植物研究和作物遗传改良领域科研人员提供一套重要的基因功能研究和矫正工具。本发明可以提高腺嘌呤碱基编辑的效率且能够精确地介导靶位点的碱基突变，并且能够在水稻甚至其它植物细胞中广泛适用。
附图说明
图1为rBE14、rBE46b和rBE49b介导的水稻内源基因OsTms9的腺嘌呤碱基编辑突变效果图。图中，ref表示水稻参考基因组的相应序列，核苷酸序列为序列14；WT表示未进行基因编辑的水稻粳稻品种Kitaake的相应序列，核苷酸序列为序列14；T＞C表示突变株的相应序列，核苷酸序列为序列15。
图2为rBE14、rBE46b和rBE49b介导的水稻内源基因OsWRKY45的腺嘌呤碱基编辑突变效果图。图中，ref表示水稻参考基因组的相应序列，核苷酸序列为序列16；WT表示未进行基因编辑的水稻粳稻品种Kitaake的相应序列，核苷酸序列为序列16；A＞G表示突变株的相应序列，核苷酸序列为序列17。
图3为rBE23、rBE50和rBE53介导的水稻内源基因OsDEP2的腺嘌呤碱基编辑突变效果图。图中，ref表示水稻参考基因组的相应序列，核苷酸序列为序列18；WT表示未进行基因编辑的水稻粳稻品种Kitaake的相应序列，核苷酸序列为序列18；2A＞2G表示突变株的相应序列，核苷酸序列为序列19。
图4为rBE23、rBE50和rBE53介导的水稻内源基因OsWRKY45的腺嘌呤碱基编辑突变效果图。图中，ref表示水稻参考基因组的相应序列，核苷酸序列为序列20；WT表示未进行基因编辑的水稻粳稻品种Kitaake的相应序列，核苷酸序列为序列20；T＞C表示突变株的相应序列，核苷酸序列为序列21。
图5为rBE26、rBE54和rBE57介导的水稻内源基因OsGS1的腺嘌呤碱基编辑突变效果图。图中，ref表示水稻参考基因组的相应序列，核苷酸序列为序列22；WT表示未进行基因编辑的水稻粳稻品种Kitaake的相应序列，核苷酸序列为序列22；3A＞3G表示突变株的相应序列，核苷酸序列为序列23；4A＞4G表示突变株的相应序列，核苷酸序列为序列24。
图6为rBE54和rBE57介导的水稻内源基因OsSERK2的腺嘌呤碱基编辑突变效果图。图中，ref表示水稻参考基因组的相应序列，核苷酸序列为序列25；WT表示未进行基因编辑的水稻粳稻品种Kitaake的相应序列，核苷酸序列为序列25；2T＞2C表示突变株的相应序列，核苷酸序列为序列26。
图7为rBE62和rBE65介导的水稻内源基因OsMPK13的腺嘌呤碱基编辑突变效果图。图中，ref表示水稻参考基因组的相应序列，核苷酸序列为序列27；WT表示未进行基因编辑的水稻粳稻品种Kitaake的相应序列，核苷酸序列为序列27；A＞G表示突变株的相应序列，核苷酸序列为序列28；2A＞2G表示突变株的相应序列，核苷酸序列为序列29。
图8为rBE62和rBE65介导的水稻内源基因OsGSK4的腺嘌呤碱基编辑突变效果图。图中，ref表示水稻参考基因组的相应序列，核苷酸序列为序列30；WT表示未进行基因编辑的水稻粳稻品种Kitaake的相应序列，核苷酸序列为序列30；T＞C表示突变株的相应序列，核苷酸序列为序列31；2T＞2C表示突变株的相应序列，核苷酸序列为序列32；4T＞4C表示突变株的相应序列，核苷酸序列为序列33。
图9为rBE62和rBE65介导的水稻内源基因OsJAR1的腺嘌呤碱基编辑突变效果图。图中，ref表示水稻参考基因组的相应序列，核苷酸序列为序列34；WT表示未进行基因编辑的水稻粳稻品种Kitaake的相应序列，核苷酸序列为序列34；2T＞2C表示突变株的相应序列，核苷酸序列为序列35；3T＞3C表示突变株的相应序列，核苷酸序列为序列36。
图10为各靶基因的靶核苷酸序列信息。图中的双链DNA片段合成所需的寡核苷酸链中的大写字母即对应于attB1-sgRNA表达盒-attB2中的N19，小写字母gtgt对应于BsaI位点，小写字母tgtt对应于BtgZI位点。
图11为各靶基因的检测引物。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的pUbi-Cas9由发明人所在实验室保存并提供(H.Zhou,B.Liu,D.P.Weeks,M.H.Spalding&B.Yang.Large chromosomal deletions and heritable smallgenetic changes induced by CRISPR/Cas9 in rice.Nucleic Acids Res.2014,42(17):10903-10914)。公众可从发明人所在实验室获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
实施例1、将水稻基因组中的A定点突变为G
本实施例提供了腺苷脱氨酶TadA7.10(以下简称TadA7.10)的人工突变体，即腺苷脱氨酶TadA9(以下简称TadA9)。TadA7.10是序列序列12的第598-1095位核苷酸编码的蛋白质。TadA9的氨基酸序列是序列表中的序列2的第1-167位。TadA9与TadA7.10相比，氨基酸序列上存在以下突变：V81S/A108S/T110R/D118N/H121N/Y146D/F148Y/Q153R/T165I/D166N。
本实施例提供了作为TadA9对照的两种用于腺嘌呤碱基编辑的对照腺苷脱氨酶，分别是wtTadA-TadA7.10(序列12的第1-1095位核苷酸编码的蛋白质)和TadA-R(序列13的第1-501位核苷酸编码的蛋白质)。wtTadA-TadA7.10是现有的常用于植物的腺苷脱氨酶二聚体。TadA-R与TadA9相比，氨基酸序列上少了V81S和Q153R这两个突变，与TadA7.10相比，氨基酸序列上存在以下突变：A108S/T110R/D118N/H121N/Y146D/F148Y/T165I/D166N。
本实施例提供了含有TadA9的四种水稻腺嘌呤碱基编辑器表达载体pUbi-rBE，名称分别为pUbi-rBE49b、pUbi-rBE53、pUbi-rBE57和pUbi-rBE65。pUbi-rBE49b表达的腺嘌呤碱基编辑器是名称为rBE49b的融合蛋白质(又称TadA9-SpCas9(D10A))，由名称为TadA9的腺苷脱氨酶、名称为SpCas9(D10A)的Cas蛋白和名称为NLS的核定位信号连接而成的蛋白质。rBE49b的氨基酸序列是序列2。序列2中，第1-167位是TadA9的氨基酸序列，第168-199位是连接肽的氨基酸序列，第200-1567位是SpCas9(D10A)的氨基酸序列，第1568-1576位是NLS的氨基酸序列。根据水稻密码子使用的偏好性和异源蛋白表达密码子优化策略对嵌合基因rBE49b基因的核苷酸序列进行密码子优化，委托生工生物工程(上海)股份有限公司完成4743bp的rBE49b基因人工合成。将pUbi-Cas9的BamHI和BcuI识别位点间的小片段(Cas9)替换为序列1的第7-4737位所示的rBE49b基因，保持pUbi-Cas9的其它核苷酸不变，得到rBE49b基因表达载体pUbi-rBE49b。序列1中，第1-6位为BamHI识别位点，第7-507位为TadA9的CDS，第508-603位为连接肽的CDS，第604-4707位为SpCas9(D10A)的CDS，第4708-4734位为NLS的CDS，第4735-4737位为终止密码子TGA，第4738-4743位为BcuI识别位点。pUbi-rBE49b中含有用于LR反应的元件attR1-ccdB-attR2。
pUbi-rBE53表达的腺嘌呤碱基编辑器是名称为rBE53的融合蛋白质(又称TadA9-SpCas9-NG(D10A))，由名称为TadA9的腺苷脱氨酶、名称为SpCas9-NG的Cas蛋白和名称为NLS的核定位信号连接而成的蛋白质。rBE50的氨基酸序列是序列表中的序列4。序列4中，第1-167位是TadA9的氨基酸序列，第168-199位是连接肽的氨基酸序列，第200-1567位是SpCas9-NG(D10A)的氨基酸序列，第1568-1576位是NLS的氨基酸序列。根据水稻密码子使用的偏好性对嵌合基因rBE53基因的核苷酸序列进行密码子优化，委托生工生物工程(上海)股份有限公司完成4743bp的rBE53基因人工合成。将pUbi-Cas9的BamHI和BcuI识别位点间的小片段(Cas9)替换为序列3的第7-4737位所示的rBE53基因，保持pUbi-Cas9的其它核苷酸不变，得到rBE53基因表达载体pUbi-rBE53。序列3中，第1-6位为BamHI识别位点，第7-507位为TadA9的CDS，第508-603位为连接肽的CDS，第604-4707位为SpCas9-NG(D10A)的CDS，第4708-4734位为NLS的CDS，第4735-4737位为终止密码子TGA，第4738-4743位为BcuI识别位点。pUbi-rBE50中含有用于LR反应的元件attR1-ccdB-attR2。
pUbi-rBE57表达的腺嘌呤碱基编辑器是名称为rBE57的融合蛋白质(又称TadA9-ScCas9(D10A))，由名称为TadA9的腺苷脱氨酶、名称为ScCas9(D10A)的Cas蛋白和名称为NLS的核定位信号连接而成的蛋白质。rBE57的氨基酸序列是序列表中的序列6。序列6中，第1-167位是TadA9的氨基酸序列，第168-199位是连接肽的氨基酸序列，第200-1574位是ScCas9(D10A)的氨基酸序列，第1575-1583位是NLS的氨基酸序列。根据水稻密码子使用的偏好性对嵌合基因rBE57基因的核苷酸序列进行密码子优化，委托生工生物工程(上海)股份有限公司完成4764bp的rBE57基因人工合成。将pUbi-Cas9的BamHI和BcuI识别位点间的小片段(Cas9)替换为序列5的第7-4758位所示的rBE57基因，保持pUbi-Cas9的其它核苷酸不变，得到rBE57基因表达载体rBE57。序列5中，第1-6位为BamHI识别位点，第7-507位为TadA9的CDS，第508-603位为连接肽的CDS，第604-4728位为ScCas9(D10A)的CDS，第4729-4755位为NLS的CDS，第4756-4758位为终止密码子TGA，第4759-4764位为BcuI识别位点。pUbi-rBE57中含有用于LR反应的元件attR1-ccdB-attR2。
pUbi-rBE65表达的腺嘌呤碱基编辑器是名称为rBE65的融合蛋白质(又称TadA9-SpRY(D10A))，由名称为TadA9的腺苷脱氨酶、名称为SpRY(D10A)的Cas蛋白和名称为NLS的核定位信号连接而成的蛋白质。rBE65的氨基酸序列是序列表中的序列8。序列8中，第1-167位是TadA9的氨基酸序列，第168-199位是连接肽的氨基酸序列，第200-1567位是SpRY(D10A)的氨基酸序列，第1568-1576位是NLS的氨基酸序列。根据水稻密码子使用的偏好性对嵌合基因rBE65基因的核苷酸序列进行密码子优化，委托生工生物工程(上海)股份有限公司完成4743bp的rBE65基因人工合成。将pUbi-Cas9的BamHI和BcuI识别位点间的小片段(Cas9)替换为序列7的第7-4737位所示的rBE65基因，保持pUbi-Cas9的其它核苷酸不变，得到rBE65基因表达载体pUbi-rBE65。序列7中，第1-6位为BamHI识别位点，第7-507位为TadA9的CDS，第508-603位为连接肽的CDS，第604-4707位为SPRY(D10A)的CDS，第4708-4734位为NLS的CDS，第4735-4737位为终止密码子TGA，第4738-4743位为BcuI识别位点。pUbi-rBE65中含有用于LR反应的元件attR1-ccdB-attR2。
pUbi-rBE49b、pUbi-rBE53、pUbi-rBE57和pUbi-rBE65的区别仅在于腺嘌呤碱基编辑器rBE的编码基因不同。rBE49b、rBE53、rBE57和rBE65这4个腺嘌呤碱基编辑器的区别仅在于Cas蛋白不同。
载体pUbi-rBE49b、pUbi-rBE53、pUbi-rBE57和pUbi-rBE65的主要组成元件如下：RB T-DNA repeat序列(核苷酸序列为genbank登陆号为LC506530.1的第13973至第13997位，2020年3月20日)、attR1(核苷酸序列为genbank登陆号为KR233518.1的第2055至第2179位，2015年8月8日)，ccdB表达盒(核苷酸序列为genbank登陆号为KR233518.1的第3289至第3594位，2015年8月8日)，attR2(核苷酸序列为genbank登陆号为KR233518.1的第3635至第3759位，2015年8月8日)，Ubip启动子(核苷酸序列是序列9)，水稻腺嘌呤碱基编辑器rBE基因(rBE49b基因(核苷酸序列为序列1的第7-4737位)、rBE53基因(核苷酸序列为序列3的第7-4737位)、rBE57基因(核苷酸序列为序列5的第7-4758位)或rBE65基因(核苷酸序列为序列7的第7-4737位))，NOS终止子(核苷酸序列是序列10)，CaMV35S启动子(核苷酸序列为genbank登陆号为FJ362600.1的第10414至第11092位，2008年11月26日)，潮霉素基因(核苷酸序列为genbank登陆号为KY420085.1的第511至第1536位，2017年7月10日)，CaMV poly(A)终止子(核苷酸序列为genbank登陆号为MK896900.1的第8618至第8792位，2019年9月4日)，LB T-DNA repeat(核苷酸序列为genbank登陆号为LC506530.1，第3635至第3795位，2020年3月20日)。
本实施例还提供了7种作为对照的水稻腺嘌呤碱基编辑器表达载体，作为本发明pUbi-rBE49b的对照载体名称为pUbi-rBE14和pUbi-rBE46b，作为本发明pUbi-rBE53的对照载体名称为pUbi-rBE23和pUbi-rBE50，作为本发明pUbi-rBE57的对照载体名称为pUbi-rBE26和pUbi-rBE54，作为本发明pUbi-rBE65的对照载体名称为pUbi-rBE62。
pUbi-rBE14表达的腺嘌呤碱基编辑器是名称为rBE14的融合蛋白质(又称wtTadA-TadA7.10-SpCas9(D10A)-NLS)，由名称为wtTadA的野生型腺苷脱氨酶、名称为TadA7.10的突变型腺苷脱氨酶、名称为SpCas9(D10A)的Cas蛋白和名称为NLS的核定位信号连接而成的蛋白质。rBE14与rBE49b在氨基酸序列上的区别仅在于，将rBE49b中的名称为TadA9的腺苷脱氨酶替换为由名称为wtTadA的野生型腺苷脱氨酶和名称为TadA7.10的突变型腺苷脱氨酶连接而成的蛋白质wtTadA-TadA7.10，其它氨基酸完全相同。rBE14基因是将rBE49b基因(核苷酸序列是序列1的第7-4737位)中TadA9的CDS(核苷酸序列为序列1的第7-507位)替换为序列12所示的wtTadA-TadA7.10基因，保持序列1的其它核苷酸不变得到的DNA分子。序列12是蛋白质wtTadA-TadA7.10的编码基因，其CDS是序列12；序列12中，第1-501位为wtTadA的CDS，第502-597位为连接肽的CDS，第598-1095位为TadA7.10的CDS。pUbi-rBE14是将pUbi-rBE49b中的rBE49b基因替换为rBE14基因，保持pUbi-rBE49b的其它核苷酸不变得到的rBE14基因表达载体。
pUbi-rBE46b表达的腺嘌呤碱基编辑器是名称为rBE46b的融合蛋白质(又称TadA-R-SpCas9(D10A)-NLS)，由名称为TadA-R的突变型腺苷脱氨酶、名称为SpCas9(D10A)的Cas蛋白和名称为NLS的核定位信号连接而成的蛋白质。rBE46b与rBE49b在氨基酸序列上的区别仅在于，将rBE49b中的名称为TadA9的腺苷脱氨酶替换为名称为TadA-R的突变型腺苷脱氨酶，其它氨基酸完全相同。rBE46b基因是将rBE49b基因(核苷酸序列是序列1的第7-4737位)中TadA9的CDS(核苷酸序列为序列1的第7-507位)替换为序列13所示的TadA-R基因序列，保持序列1的其它核苷酸不变得到的DNA分子。pUbi-rBE46b是将pUbi-rBE49b中的rBE49b基因替换为rBE46b基因，保持pUbi-rBE49b的其它核苷酸不变得到的rBE46b基因表达载体。
pUbi-rBE23表达的腺嘌呤碱基编辑器是名称为rBE23的融合蛋白质(又称wtTadA-Tada7.10-SpCas9-NG(D10A)-NLS)，由名称为wtTadA的野生型腺嘌呤脱氨酶、名称为TadA7.10的突变型腺嘌呤脱氨酶、名称为SpCas9-NG(D10A)的Cas蛋白和名称为NLS的核定位信号连接而成的蛋白质。rBE23与rBE53在氨基酸序列上的区别仅在于，将rBE53中的名称为TadA9的腺嘌呤脱氨酶替换为由名称为wtTadA的野生型腺嘌呤脱氨酶和名称为TadA7.10的突变型腺嘌呤脱氨酶连接而成的蛋白质wtTadA-TadA7.10，其它氨基酸完全相同。rBE23基因是将rBE53基因(核苷酸序列是序列3的第7-4737位)中TadA9的CDS(核苷酸序列为序列3的第7-507位)替换为序列12所示的wtTadA-TadA7.10基因，保持序列3的其它核苷酸不变得到的DNA分子。pUbi-rBE23是将pUbi-rBE53中的rBE53基因替换为rBE23基因，保持pUbi-rBE53的其它核苷酸不变得到的rBE23基因表达载体。
pUbi-rBE50表达的腺嘌呤碱基编辑器是名称为rBE50的融合蛋白质(又称wtTadA-TadA7.10-SpCas9-NG(D10A)-NLS)，由名称为TadA-R的突变型腺苷脱氨酶、名称为SpCas9-NG(D10A)的Cas蛋白和名称为NLS的核定位信号连接而成的蛋白质。rBE50与rBE53在氨基酸序列上的区别仅在于，将rBE53中的名称为TadA9的腺苷脱氨酶替换为名称为TadA-R的突变型腺苷脱氨酶，其它氨基酸完全相同。rBE50基因是将rBE53基因(核苷酸序列是序列3的第7-4737位)中TadA9的CDS(核苷酸序列为序列1的第7-507位)替换为序列13所示的TadA-R基因，保持序列3的其它核苷酸不变得到的DNA分子。pUbi-rBE50是将pUbi-rBE53中的rBE53基因替换为rBE50基因，保持pUbi-rBE53的其它核苷酸不变得到的rBE50基因表达载体。
pUbi-rBE26表达的腺嘌呤碱基编辑器是名称为rBE26的融合蛋白质(又称wtTadA-Tada7.10-ScCas9(D10A)-NLS)，由名称为wtTadA的野生型腺嘌呤脱氨酶、名称为TadA7.10的突变型腺嘌呤脱氨酶、名称为ScCas9(D10A)的Cas蛋白和名称为NLS的核定位信号连接而成的蛋白质。rBE26与rBE57在氨基酸序列上的区别仅在于，将rBE57中的名称为TadA9的腺嘌呤脱氨酶替换为由名称为wtTadA的野生型腺嘌呤脱氨酶和名称为TadA7.10的突变型腺嘌呤脱氨酶连接而成的蛋白质wtTadA-TadA7.10，其它氨基酸完全相同。rBE26基因是将rBE57基因(核苷酸序列是序列5的第7-4758位)中TadA9的CDS(核苷酸序列为序列5的第7-507位)替换为序列12所示的wtTadA-TadA7.10基因，保持序列5的其它核苷酸不变得到的DNA分子。pUbi-rBE26是将pUbi-rBE57中的rBE57基因替换为rBE26基因，保持pUbi-rBE57的其它核苷酸不变得到的rBE26基因表达载体。
pUbi-rBE54表达的腺嘌呤碱基编辑器是名称为rBE54的融合蛋白质(又称TadA-R-ScCas9(D10A)-NLS)，由名称为TadA-R的突变型腺苷脱氨酶、名称为ScCas9(D10A)的Cas蛋白和名称为NLS的核定位信号连接而成的蛋白质。rBE54与rBE57在氨基酸序列上的区别仅在于，将rBE57中的名称为TadA9的腺苷脱氨酶替换为名称为TadA-R的突变型腺苷脱氨酶，其它氨基酸完全相同。rBE54基因是将rBE57基因(核苷酸序列是序列5的第7-4758位)中TadA9的CDS(核苷酸序列为序列5的第7-507位)替换为序列13所示的TadA-R基因序列，保持序列5的其它核苷酸不变得到的DNA分子。pUbi-rBE54是将pUbi-rBE57中的rBE57基因替换为rBE54基因，保持pUbi-rBE57的其它核苷酸不变得到的rBE54基因表达载体。
pUbi-rBE62表达的腺嘌呤碱基编辑器是名称为rBE62的融合蛋白质(又称TadA-R-SpRY(D10A)-NLS)，由名称为TadA-R的突变型腺苷脱氨酶、名称为SpRY(D10A)的Cas蛋白和名称为NLS的核定位信号连接而成的蛋白质。rBE62与rBE65在氨基酸序列上的区别仅在于，将rBE65中的名称为TadA9的腺苷脱氨酶替换为名称为TadA-R的突变型腺苷脱氨酶，其它氨基酸完全相同。rBE62基因是将rBE65基因(核苷酸序列是序列7的第7-4737位)中TadA9的CDS(核苷酸序列为序列7的第7-507位)替换为序列13所示的TadA-R基因序列保持序列7的其它核苷酸不变得到的DNA分子。pUbi-rBE62是将pUbi-rBE65中的rBE65基因替换为rBE62基因，保持pUbi-rBE65的其它核苷酸不变得到的rBE62基因表达载体。
二、利用水稻腺嘌呤碱基编辑器表达载体对水稻内源基因的靶碱基进行A>G替换
1、针对靶标序列的基因编辑载体pUbi-rBE-sgRNA的构建
所选用靶基因(见图10)的基因组DNA序列从水稻基因组数据库(https://rapdb.dna.affrc.go.jp/)中获得，针对各碱基编辑器识别PAM需求，设计相应的靶标序列及正反向寡核苷酸链，将图10中各靶标序列(5′-N19PAM-3′)的正反向寡核苷酸链(具体序列见图10)委托生工生物工程(上海)股份有限公司人工合成后，使用T4多聚核苷酸激酶将引物进行磷酸化处理，退火形成双链DNA片段(含有sgRNA的靶标序列中的5′-N19-3′)，将双链DNA片段分别克隆到pENTR4：sgRNA(含有attL1-sgRNA表达盒-attL2)载体的两个BtgZI或两个BsaI酶切位点中，引物U6p-F1(5′-AAGAACGAACTAAGCCGGAC-3′(序列37))测序确认插入片段完全正确后(插入片段含有sgRNA的靶标序列中的5′-N19-3′)，将所得质粒经AatII酶切进行线性化，再通过Gateway的LR反应将sgRNA表达盒(含有sgRNA的编码DNA)分别克隆至水稻腺嘌呤碱基编辑器表达载体pUbi-rBE的attR1-ccdB-attR2处，获得各靶标序列的基因编辑载体pUbi-rBE-sgRNA。pUbi-rBE-sgRNA是将pUbi-rBE的元件attR1-ccdB-attR2替换为attB1-sgRNA表达盒-attB2，保持pUbi-rBE的其它核苷酸不变得到的重组表达载体。得到靶向OsTms9基因的3种碱基编辑载体，分别为pUbi-rBE49b-sgRNA-OsTms9、pUbi-rBE14-sgRNA-OsTms9和pUbi-rBE46b-sgRNA-OsTms9。得到靶向OsWRKY45基因的靶标序列1(序列76，含有NGG PAM)的3种碱基编辑载体，分别为pUbi-rBE49b-sgRNA-OsWRKY45、pUbi-rBE14-sgRNA-OsWRKY45和pUbi-rBE46b-sgRNA-OsWRKY45。得到靶向OsDEP2基因的3种碱基编辑载体，分别为pUbi-rBE53-sgRNA-OsDEP2、pUbi-rBE23-sgRNA-OsDEP2和pUbi-rBE50-sgRNA-OsDEP2。得到靶向OsWRKY45基因的靶标序列2(序列79，含有NGT PAM)的3种碱基编辑载体，分别为pUbi-rBE53-sgRNA-OsWRKY45、pUbi-rBE23-sgRNA-OsWRKY45和pUbi-rBE50-sgRNA-OsWRKY45。得到靶向OsGS1基因的3种碱基编辑载体，分别为pUbi-rBE57-sgRNA-OsGS1、pUbi-rBE54-sgRNA-OsGS1和pUbi-rBE26-sgRNA-OsGS1。得到靶向OsSERK2基因的2种碱基编辑载体为pUbi-rBE57-sgRNA-OsSERK2和pUbi-rBE54-sgRNA-OsSERK2。得到靶向OsMPK13基因的2种碱基编辑载体，为pUbi-rBE65-sgRNA-OsMPK13和pUbi-rBE62-sgRNA-OsMPK13。得到靶向OsGSK4基因的2种碱基编辑载体，为pUbi-rBE65-sgRNA-OsGSK4和pUbi-rBE62-sgRNA-OsGSK4。得到靶向OsJAR1基因的2种碱基编辑载体，为pUbi-rBE65-sgRNA-OsJAR1和pUbi-rBE62-sgRNA-OsJAR1。
其中，pENTR4：sgRNA的构建方法如下：
按照从5′端到3′端的方向，将依次连接的U6启动子序列1、含有两个BtgZI酶切位点的核苷酸序列、sgRNA Scaffold序列、(T)8终止序列、U6启动子序列2、含有两个BsaI酶切位点的核苷酸序列、sgRNA Scaffold序列、(T)8终止序列组合sgRNA表达盒并委托委托生工生物工程(上海)股份有限公司进行人工合成。以公司合成的基因为模板，利用引物对(sgRNA-F：5′-GCAGGCTGTCGACTGGATCCAAGCTTAAGAACGAACTAAGCC-3′(序列38)和sgRNA-R：5′-CAAGAAAGCTGGGTGAATTCGATATCAAGCTTATCGATACCG-3′(序列39))扩增获得1kb的sgRNA表达盒片段(核苷酸序列是序列表中的序列序列11)，以pENTR4(Invitrogen)载体为模板，用pENTR4-F1：(5′-CGAATTCACCCAGCTTTCTTGTACAAAGTTGGCATTATAAGA-3′(序列40)和pENTR4-R1：(5′-CTTAGTTCGTTCTTAAGCTTGGATCCAGTCGACAGCCTGCTTTTTTGTACAAAGT-3′(序列41)扩增2.2kb的pENTR4载体骨架(是将pENTR4的ccdB基因表达盒片段去除得到的DNA片段)，借助试剂盒ClonExpress II One Step Cloning Kit(购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司)将sgRNA表达盒片段和pENTR4载体骨架进行infusion连接，获得载体pENTR4：sgRNA。其中的两个BtgZI或两个BsaI酶切位点用于克隆中特定基因的识别序列(sgRNA的靶标序列中的5′-N19-3′)。序列11中，第27-348位为U6启动子序列1，第349-389位为含有两个BtgZI位点的核苷酸片段，第390-465位为sgRNA Scaffold序列，第466-473位为(T)8终止序列,第474-782位为U6启动子序列2，第783-806位为含有两个BsaI位点的核苷酸片段，第807-882位为sgRNA Scaffold序列,第883-890位为(T)8终止序列。
2、农杆菌介导水稻稳定遗传转化
将获得的各靶基因碱基编辑载体通过电击法转化农杆菌EHA105(EHA105电击感受细胞购自北京博迈德基因技术有限公司)，参考Hiei等(Hiei Y.,Ohta S.,Komari T.,andKumashiro T.(1994).Efficient transformation of rice(Oryza sativa L.)mediatedby Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA.PlantJ.6:271–282.)公开的方法进行水稻农杆菌介导的遗传转化，获得T0代各靶基因碱基编辑水稻材料。
3、T0代转基因水稻靶基因位点的碱基编辑效率检测
采用常规的CTAB法提取T0代转基因水稻材料的基因组DNA。
各靶基因的靶标序列信息及其检测引物见图11，所有的引物均委托生工生物工程(上海)股份有限公司进行人工合成。检测时涉及的PCR反应均利用高保真酶预混液I-5TM2×High-Fidelity Master Mix(购自克劳宁(北京)生物科技有限公司)进行PCR扩增目的片段，PCR产物直接委托生工生物工程(上海)股份有限公司进行Sanger测序。测序结果显示：
碱基编辑器rBE14对OsTms9的NGG PAM靶点的靶碱基编辑效率为0％，碱基编辑器rBE46b对OsTms9的NGG PAM靶点的靶碱基编辑效率为64.58％，碱基编辑器rBE49b对OsTms9的NGG PAM靶点的靶碱基编辑效率为97.92％(表1)：检测的54株T0代转pUbi-rBE14-sgRNA-OsTms9水稻中有0株的腺嘌呤A被脱氨替换成鸟嘌呤G；检测的48株T0代转pUbi-rBE46b-sgRNA-OsTms9水稻中有31株的腺嘌呤A被脱氨替换成鸟嘌呤G，均为靶标序列5′到3′方向的第5位的A(对应图1中的T5)可被脱氨替换成G；检测的48株T0代转pUbi-rBE49b-sgRNA-OsTms9水稻中有47株的腺嘌呤A被脱氨替换成鸟嘌呤G，均为靶标序列5′到3′方向的第5位的A(对应图1中的T5)可被脱氨替换成G。
碱基编辑器rBE14对OsWRKY45的NGG PAM靶点的靶碱基编辑效率为0.00％，碱基编辑器rBE46b对OsWRKY45的NGG PAM靶点的靶碱基编辑效率为0.00％，碱基编辑器rBE49b对OsWRKY45的NGG PAM靶点的靶碱基编辑效率为2.86％(表1)：检测的53株T0代转pUbi-rBE14-sgRNA-OsWRKY45水稻中有0株的腺嘌呤A被脱氨替换成鸟嘌呤G；检测的48株T0代转pUbi-rBE46b-sgRNA-OsWRKY45水稻中有0株的腺嘌呤A被脱氨替换成鸟嘌呤G；检测的35株T0代转pUbi-rBE49b-sgRNA-OsWRKY45水稻中有1株的腺嘌呤A被脱氨替换成鸟嘌呤G,均为靶标序列5′到3′方向的第4位的A可被脱氨替换成G(对应图2中的A4)。
碱基编辑器rBE23对OsDEP2的NGA PAM靶点的靶碱基编辑效率为0.00％，碱基编辑器rBE50对OsDEP2的NGA PAM靶点的靶碱基编辑效率为27.08％,碱基编辑器rBE53对OsDEP2的NGA PAM靶点的靶碱基编辑效率为78.72％(表2)：检测的96株T0代转pUbi-rBE23-sgRNA-OsDEP2水稻中有0的腺嘌呤A被脱氨替换成鸟嘌呤G；检测的48株T0代转pUbi-rBE50-sgRNA-OsDEP2水稻中有13株的腺嘌呤A被脱氨替换成鸟嘌呤G，靶标序列5′到3′方向的第4和6位的A可被脱氨替换成G，其中，有10株的第4位腺嘌呤A(对应图3中的A4)被脱氨替换成G，有13株的第6位腺嘌呤A(对应图3中的A6)被脱氨替换成G；检测的47株T0代转pUbi-rBE53-sgRNA-OsDEP2水稻中有37株的腺嘌呤A被脱氨替换成鸟嘌呤G，靶标序列5′到3′方向的第4和6位的A可被脱氨替换成G，其中，有37株的第4位腺嘌呤A(对应图3中的A4)被脱氨替换成G，有28株的第6位腺嘌呤A(对应图3中的A6)被脱氨替换成G。
碱基编辑器rBE23对OsWRKY45的NGT PAM靶点的靶碱基编辑效率为0％，碱基编辑器rBE50对OsWRKY45的NGT PAM靶点的靶碱基编辑效率为89.36％，碱基编辑器rBE53对OsWRKY45的NGT PAM靶点的靶碱基编辑效率为93.75％(表2)：检测的52株T0代转pUbi-rBE23-sgRNA-OsWRKY45水稻中有0株的腺嘌呤A被脱氨替换成鸟嘌呤G；检测的47株T0代转pUbi-rBE50-sgRNA-OsWRKY45水稻中有42株的腺嘌呤A被脱氨替换成鸟嘌呤G，均为靶标序列5′到3′方向的第5位的A可被脱氨替换成G(对应图4中的T5)；检测的48株T0代转pUbi-rBE53-sgRNA-OsWRKY45水稻中有45株的腺嘌呤A被脱氨替换成鸟嘌呤G，均为靶标序列5′到3′方向的第5位的A可被脱氨替换成G(对应图4中的T5)。
碱基编辑器rBE26对OsGS1的NAG PAM靶点的靶碱基编辑效率为0.00％，碱基编辑器rBE54对OsGS1的NAG PAM靶点的靶碱基编辑效率为25.00％，碱基编辑器rBE57对OsGS1的NAG PAM靶点的靶碱基编辑效率为54.17％(表3)：检测的36株T0代转pUbi-rBE26-sgRNA-OsGS1水稻中有0株的腺嘌呤A被脱氨替换成鸟嘌呤G；检测的48株T0代转pUbi-rBE54-sgRNA-OsGS1水稻中有12株的腺嘌呤A被脱氨替换成鸟嘌呤G，靶标序列5′到3′方向的第3、6和9位的A可被脱氨替换成G，其中，有3株的第3位腺嘌呤A(对应图5中的A3)被脱氨替换成G，有11株的第6位腺嘌呤A(对应图5中的A6)被脱氨替换成G，有12株的第9位腺嘌呤A(对应图5中的A9)被脱氨替换成G；检测的48株T0代转pUbi-rBE57-sgRNA-OsGS1水稻中有26株的腺嘌呤A被脱氨替换成鸟嘌呤G，靶标序列5′到3′方向的第3、4、6、9和11位的A可被脱氨替换成G，其中，有26株的第3位腺嘌呤A(对应图5中的A3)被脱氨替换成G，有13株的第4位腺嘌呤A(对应图5中的A4)被脱氨替换成G，有26株的第6位腺嘌呤A(对应图5中的A6)被脱氨替换成G，有26株的第9位腺嘌呤A(对应图5中的A9)被脱氨替换成G，有1株的第11位腺嘌呤A(对应图5中的A11)被脱氨替换成G。
碱基编辑器rBE54对OsSERK2的NAG PAM靶点的靶碱基编辑效率为28.26％，碱基编辑器rBE57对OsSERK2的NAG PAM靶点的靶碱基编辑效率为72.34％(表3)：检测的46株T0代转pUbi-rBE54-sgRNA-OsSERK2水稻中有13株的腺嘌呤A被脱氨替换成鸟嘌呤G，靶标序列5′到3′方向的第4和6位的A可被脱氨替换成G，其中，有3株的第4位腺嘌呤A(对应图6中的T4)被脱氨替换成G，有13株的第6位腺嘌呤A(对应图4中的T6)被脱氨替换成G；检测的47株T0代转pUbi-rBE57-sgRNA-OsSERK2水稻中有34株的腺嘌呤A被脱氨替换成鸟嘌呤G，靶标序列5′到3′方向的第4和6位的A可被脱氨替换成G，其中，有34株的第4位腺嘌呤A(对应图6中的T4)被脱氨替换成G，有34株的第6位腺嘌呤A(对应图6中的T6)被脱氨替换成G。
碱基编辑器rBE62对OsMPK13的NAA PAM靶点的靶碱基编辑效率为29.17％，碱基编辑器rBE65对OsMPK13的NAA PAM靶点的靶碱基编辑效率为31.91％(表4)：检测的48株T0代转pUbi-rBE62-sgRNA-OsMPK13水稻中有14株的腺嘌呤A被脱氨替换成鸟嘌呤G，均为靶标序列5′到3′方向的第6位的A(对应图7中的A6)同时被脱氨替换成G；检测的47株T0代转pUbi-rBE65-sgRNA-OsMPK13水稻中有15株的腺嘌呤A被脱氨替换成鸟嘌呤G，靶标序列5′到3′方向的第4和6位的A可被脱氨替换成G，其中，有2株的第4位腺嘌呤A(对应图7中的A4)被脱氨替换成G，有15株的第6位腺嘌呤A(对应图7中的A6)被脱氨替换成G。
碱基编辑器rBE62对OsGSK4的NAC PAM靶点的靶碱基编辑效率为51.28％，碱基编辑器rBE65对OsGSK4的NAC PAM靶点的靶碱基编辑效率为73.17％(表4)：检测的39株T0代转pUbi-rBE62-sgRNA-OsGSK4水稻中有20株的腺嘌呤A被脱氨替换成鸟嘌呤G，靶标序列5′到3′方向的第4和11位的A可被脱氨替换成G，其中，有20株的第4位腺嘌呤A(对应图8中的T4)被脱氨替换成G，有2株的第11位腺嘌呤A(对应图8中的T11)被脱氨替换成G；检测的41株T0代转pUbi-rBE65-sgRNA-OsGSK4水稻中有30株的腺嘌呤A被脱氨替换成鸟嘌呤G，靶标序列5′到3′方向的第4、8、9和11位的A可被脱氨替换成G，其中，有30株的第4位腺嘌呤A(对应图8中的T4)被脱氨替换成G，有1株的第8位腺嘌呤A(对应图8中的T8)被脱氨替换成G，有1株的第9位腺嘌呤A(对应图8中的T9)被脱氨替换成G，有9株的第11位腺嘌呤A(对应图8中的T11)被脱氨替换成G。
碱基编辑器rBE62对OsJAR1的NAT PAM靶点的靶碱基编辑效率36.17％，碱基编辑器rBE65对OsJAR1的NAT PAM靶点的靶碱基编辑效率为45.00％(表4)：检测的47株T0代转pUbi-rBE62-sgRNA-OsJAR1水稻中有17株的腺嘌呤A被脱氨替换成鸟嘌呤G，靶标序列5′到3′方向的第4和6位的A可被脱氨替换成G，其中，有17株的第4位腺嘌呤A(对应图9中的T4)被脱氨替换成G，有9株的第6位腺嘌呤A(对应图9中的T6)被脱氨替换成G；检测的40株T0代转pUbi-rBE65-sgRNA-OsJAR1水稻中有18株的腺嘌呤A被脱氨替换成鸟嘌呤G，靶标序列5′到3′方向的第2、4和6位的A可被脱氨替换成G，其中，有3株的第2位腺嘌呤A(对应图9中的T2)被脱氨替换成G，有18株的第4位腺嘌呤A(对应图9中的T4)被脱氨替换成G，有18株的第6位腺嘌呤A(对应图9中的T6)被脱氨替换成G。
上述结果表明，本发明中的TadA9与SpCas9n/ScCas9/SpCas9-NG/SpRY融合后介导的腺嘌呤碱基编辑技术的编辑效率远远高于TadA7.10等TadA-R突变体介导的腺嘌呤碱基编辑技术，并且可以扩展其编辑活性窗口，提高了腺嘌呤碱基编辑技术的效率和扩宽了其应用范围。
表1.腺苷脱氨酶与SpCas9(D10A)的融合载体的编辑效率
基因靶位点 PAM rBE14 rBE46b rBE49b
OsTms9 NGG 0.00％(0/54) 64.58％(31/48) 97.92％(47/48)
OsWRKY45 NGG 0.00％(0/53) 0.00％(0/48) 2.86％(1/35)
表2.腺苷脱氨酶与SpCas9-NG(D10A)融合载体的编辑效率
基因靶位点 PAM rBE23 rBE50 rBE53
OsDEP2 NGA 0.00％(0/96) 27.08％(13/48) 78.72％(37/47)
OsWRKY45 NGT 0.00％(0/52) 89.36％(42/47) 93.75％(45/48)
表3.腺苷脱氨酶与ScCas9(D10A)融合载体的编辑效率
基因靶位点 PAM rBE26 rBE54 rBE57
OsGS1 NAG 0.00％(0/36) 25.00％(12/48) 54.17％(26/48)
OsSERK2 NAG \ 28.26％(13/46) 72.34％(34/47)
注：“\”，由于前面大量数据显示TadA7.10介导的碱基编辑效率明显低于TadA-R和TadA9，故未再对该位点的编辑效率进行检测。
表4.腺苷脱氨酶与SpRY(D10A)融合载体的编辑效率
基因靶位点 PAM rBE62 rBE65
OsMPK13 NAA 29.17％(14/48) 31.91％(15/47)
OsGSK4 NAC 51.28％(20/39) 73.17％(30/41)
OsJAR1 NAT 36.17％(17/47) 45.00％(18/40)
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
序列表
<110> 中国农业科学院植物保护研究所
<120>腺嘌呤碱基编辑器及其相关生物材料与应用
<160> 84
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 4743
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 1
ggatccatgt cagaagtcga gttctcccat gagtattgga tgaggcacgc cctcactctt 60
gcgaagaggg ccagggacga gagggaggtg ccggtcggtg ctgtcctggt cttgaataac 120
agggtgatag gcgaaggttg gaacagggct attggccttc atgaccctac tgctcatgcg 180
gaaatcatgg cacttagaca ggggggcctc gttatgcaaa attaccgcct gatcgacgcc 240
actctttatt ccacatttga accatgtgtt atgtgtgcgg gcgctatgat ccattcacgc 300
ataggtcgcg tggtttttgg agttcgcaac agtaaacgtg gggctgcagg ctctctgatg 360
aacgttttga attatccggg aatgaaccat agagtcgaaa tcacagaagg gattttggca 420
gacgaatgcg cggctcttct ttgtgatttt tacagaatgc cccgccgtgt gtttaatgct 480
caaaagaaag cgcagagtag catcaactcg gggggatctt ctgggggctc gtctggttcc 540
gagactcccg gaacttccga gtcggcaaca cctgaatcct ccggcggctc ttcgggcgga 600
tctgacaaaa aatactcaat tggtctggct attgggacaa actctgtggg ctgggcggta 660
attaccgacg agtacaaggt gcctagtaag aaatttaaag tgctcggaaa cactgacagg 720
cactctataa agaagaacct gatcggggca ctgcttttcg actccggaga gacggcggag 780
gcgacgcgtc tcaagcgtac cgcgcgccgc aggtacacaa gaaggaagaa taggatctgc 840
tacttgcagg aaatcttcag taacgagatg gcgaaggtcg acgatagttt ctttcatcgg 900
ttggaagaat cgttcctcgt agaggaggac aaaaagcacg agcgtcaccc aatattcggg 960
aatattgttg acgaggttgc ctaccatgag aaatatccta caatatatca cctccgtaag 1020
aagcttgtcg attcaactga taaggctgat ctcagactca tctatcttgc cctcgcacat 1080
atgattaagt ttcgtggcca cttcttgatt gaaggcgacc tcaacccgga caactcagat 1140
gttgacaagc tttttataca gctcgtccag acatataacc agctgtttga agagaatccc 1200
atcaatgcga gtggggttga tgctaacgcc attttgtccg ccaggttgtc caaatctcgc 1260
agactggaaa acctgatcgc acagcttccc ggtgaaaaga aaaacgggct cttcggcaat 1320
ctcatcgcac tgtccctcgg cctcacccca aacttcaagt ctaacttcga cctggccgag 1380
gatgcgaagc tccagctgtc aaaagataca tacgacgacg atttggacaa tctgcttgcg 1440
caaataggcg accagtatgc ggacctgttc ctggctgcca aaaatctgtc agatgcaatc 1500
ctcctgtccg atatattgcg tgtgaacacc gaaatcacga aggcaccgct tagcgcatcc 1560
atgatcaaga gatacgacga gcaccatcag gacctcacac tcctcaaggc gcttgttcgt 1620
cagcagcttc ccgagaaata taaggaaatt tttttcgatc aaagcaagaa tggatatgct 1680
ggctatattg acggtggcgc ttcgcaggag gagttctata aattcattaa gccgattctg 1740
gagaagatgg acggaacgga ggagctcctc gtcaagctta accgggaaga cctgttgcgg 1800
aagcagagga cttttgataa cggctctatt ccgcaccaaa tccatctggg tgagttgcac 1860
gcaatcttga gaagacaaga ggatttctac ccgttcctta aggataacag agagaagata 1920
gaaaaaatac tgaccttcag gataccatac tatgtgggcc cactggcgcg cggaaatagt 1980
cgtttcgcat ggatgactag aaagtccgaa gaaacgatca cgccatggaa ttttgaggaa 2040
gtggtcgaca agggcgcctc tgcccagagc ttcatcgaaa ggatgaccaa ttttgacaaa 2100
aatctgccta acgaaaaggt gcttccgaag cacagcctgt tgtatgaata cttcacagtt 2160
tataacgagc tcactaaggt caagtacgtc acggagggca tgcgtaagcc tgctttcctg 2220
tctggtgaac aaaaaaaggc gattgtggac ctccttttca agacgaaccg taaagttact 2280
gtgaagcaac tgaaagagga ttactttaag aaaattgagt gcttcgacag tgtggagatt 2340
tccggtgtcg aggaccggtt taacgccagc ctgggtacgt atcatgacct gcttaaaatt 2400
atcaaggata aagatttcct ggataatgaa gagaacgaag atatactgga ggacattgtg 2460
ttgactttga ccctcttcga ggacagagag atgattgagg aaagactgaa gacctacgca 2520
cacctttttg atgacaaggt catgaaacaa ctcaagcgcc ggcgctatac tggctggggc 2580
cggctttctc gcaagctcat caatgggatt cgggataagc aatcaggcaa gacaattttg 2640
gacttcctca aatccgacgg attcgcaaat aggaatttta tgcagctgat acatgacgac 2700
tctttgacat tcaaagaaga catacagaag gctcaggtct ccggccaagg agattctttg 2760
cacgagcata tcgctaactt ggcaggtagc cccgccataa aaaagggcat tcttcaaacg 2820
gtaaaagttg ttgacgaact cgtgaaggtt atgggccgtc ataagccgga aaacattgtt 2880
attgaaatgg ctagggaaaa tcagacgacc cagaagggac agaaaaatag cagggagcgg 2940
atgaagagaa ttgaagaggg aattaaggag cttggatctc agattcttaa ggagcaccct 3000
gtggagaaca cccaacttca gaatgaaaag ctctaccttt actaccttca aaacggccgg 3060
gatatgtacg tcgatcagga acttgacatt aaccggttga gcgattatga cgttgacgct 3120
attgtgcccc aatctttcct taaagacgac tctatcgaca ataaagtgct gacgcgcagc 3180
gataaaaatc gcggtaagtc ggataatgtc ccgtcggaag aggtggttaa aaaaatgaag 3240
aactattgga ggcaactcct gaatgccaag ctgatcactc agaggaaatt cgacaatctc 3300
accaaggcag aaaggggtgg acttagcgag ctcgacaagg ccggttttat caaaagacag 3360
ctggtggaga cacgccaaat caccaaacac gttgcccaga tcctggattc gaggatgaac 3420
acgaagtatg acgagaacga caagttgatt agggaagtca aggtcatcac tttgaagtcc 3480
aagctggtga gcgactttcg caaagacttc cagttttaca aagtcaggga aattaataac 3540
taccaccacg cccacgacgc ctaccttaac gccgtggttg gcacagcact catcaagaaa 3600
taccctaagc tcgaatctga gttcgtctat ggcgactata aggtctacga cgttagaaaa 3660
atgatcgcga aatctgagca ggaaataggc aaggcaactg ccaagtactt cttctattcc 3720
aatatcatga acttttttaa gacggagatt accctggcga atggtgagat ccgcaagcgc 3780
cctttgattg agacaaacgg agaaacagga gagatcgtat gggacaaagg gcgggacttt 3840
gctactgtta ggaaggtgct ctctatgcca caagttaaca ttgtcaaaaa aactgaagtg 3900
cagacaggtg ggtttagcaa ggaatctatc ctgccgaaga ggaactctga caagctgatc 3960
gcccgcaaga aagattggga tccgaaaaag tacggaggat tcgactcccc cacagttgcg 4020
tactccgtgc ttgtcgtggc caaagtggag aagggcaagt ctaagaagct caagagcgtc 4080
aaagagttgt tggggatcac gattatggag cggtcgtctt tcgaaaagaa tccgatagat 4140
tttctcgagg ccaagggtta taaagaagtc aagaaggatc ttatcatcaa gctccctaag 4200
tactccctct ttgagcttga aaacggacgg aaaagaatgc tggcttcagc gggtgaactt 4260
cagaagggta atgaactcgc tctgccctca aaatatgtga atttccttta cctggcatca 4320
cactatgaga agcttaaggg gtctccagag gacaacgagc agaagcaact gttcgttgaa 4380
caacacaagc actaccttga cgagattatc gagcaaatca gcgagtttag caagcgcgtt 4440
atactggcag acgcaaatct tgataaggtc cttagcgcct acaacaagca tagagacaaa 4500
cccatccggg agcaggccga gaacattatt catctcttca ccttgacgaa tcttggggcc 4560
ccggccgcgt tcaagtactt cgatactacc atagacagaa agcgctatac atcgacaaag 4620
gaagttcttg acgccacgct gatccaccaa agtataacag gcctctatga gacacgcatc 4680
gacctttcgc agttgggcgg tgaccgcccc aaaaagaaga ggaaagttgg cgggtgaact 4740
agt 4743
<210> 2
<211> 1576
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 2
Met Ser Glu Val Glu Phe Ser His Glu Tyr Trp Met Arg His Ala Leu
1 5 10 15
Thr Leu Ala Lys Arg Ala Arg Asp Glu Arg Glu Val Pro Val Gly Ala
20 25 30
Val Leu Val Leu Asn Asn Arg Val Ile Gly Glu Gly Trp Asn Arg Ala
35 40 45
Ile Gly Leu His Asp Pro Thr Ala His Ala Glu Ile Met Ala Leu Arg
50 55 60
Gln Gly Gly Leu Val Met Gln Asn Tyr Arg Leu Ile Asp Ala Thr Leu
65 70 75 80
Tyr Ser Thr Phe Glu Pro Cys Val Met Cys Ala Gly Ala Met Ile His
85 90 95
Ser Arg Ile Gly Arg Val Val Phe Gly Val Arg Asn Ser Lys Arg Gly
100 105 110
Ala Ala Gly Ser Leu Met Asn Val Leu Asn Tyr Pro Gly Met Asn His
115 120 125
Arg Val Glu Ile Thr Glu Gly Ile Leu Ala Asp Glu Cys Ala Ala Leu
130 135 140
Leu Cys Asp Phe Tyr Arg Met Pro Arg Arg Val Phe Asn Ala Gln Lys
145 150 155 160
Lys Ala Gln Ser Ser Ile Asn Ser Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Ser
165 170 175
Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Ser
180 185 190
Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Asp Lys Lys Tyr Ser Ile Gly Leu Ala
195 200 205
Ile Gly Thr Asn Ser Val Gly Trp Ala Val Ile Thr Asp Glu Tyr Lys
210 215 220
Val Pro Ser Lys Lys Phe Lys Val Leu Gly Asn Thr Asp Arg His Ser
225 230 235 240
Ile Lys Lys Asn Leu Ile Gly Ala Leu Leu Phe Asp Ser Gly Glu Thr
245 250 255
Ala Glu Ala Thr Arg Leu Lys Arg Thr Ala Arg Arg Arg Tyr Thr Arg
260 265 270
Arg Lys Asn Arg Ile Cys Tyr Leu Gln Glu Ile Phe Ser Asn Glu Met
275 280 285
Ala Lys Val Asp Asp Ser Phe Phe His Arg Leu Glu Glu Ser Phe Leu
290 295 300
Val Glu Glu Asp Lys Lys His Glu Arg His Pro Ile Phe Gly Asn Ile
305 310 315 320
Val Asp Glu Val Ala Tyr His Glu Lys Tyr Pro Thr Ile Tyr His Leu
325 330 335
Arg Lys Lys Leu Val Asp Ser Thr Asp Lys Ala Asp Leu Arg Leu Ile
340 345 350
Tyr Leu Ala Leu Ala His Met Ile Lys Phe Arg Gly His Phe Leu Ile
355 360 365
Glu Gly Asp Leu Asn Pro Asp Asn Ser Asp Val Asp Lys Leu Phe Ile
370 375 380
Gln Leu Val Gln Thr Tyr Asn Gln Leu Phe Glu Glu Asn Pro Ile Asn
385 390 395 400
Ala Ser Gly Val Asp Ala Asn Ala Ile Leu Ser Ala Arg Leu Ser Lys
405 410 415
Ser Arg Arg Leu Glu Asn Leu Ile Ala Gln Leu Pro Gly Glu Lys Lys
420 425 430
Asn Gly Leu Phe Gly Asn Leu Ile Ala Leu Ser Leu Gly Leu Thr Pro
435 440 445
Asn Phe Lys Ser Asn Phe Asp Leu Ala Glu Asp Ala Lys Leu Gln Leu
450 455 460
Ser Lys Asp Thr Tyr Asp Asp Asp Leu Asp Asn Leu Leu Ala Gln Ile
465 470 475 480
Gly Asp Gln Tyr Ala Asp Leu Phe Leu Ala Ala Lys Asn Leu Ser Asp
485 490 495
Ala Ile Leu Leu Ser Asp Ile Leu Arg Val Asn Thr Glu Ile Thr Lys
500 505 510
Ala Pro Leu Ser Ala Ser Met Ile Lys Arg Tyr Asp Glu His His Gln
515 520 525
Asp Leu Thr Leu Leu Lys Ala Leu Val Arg Gln Gln Leu Pro Glu Lys
530 535 540
Tyr Lys Glu Ile Phe Phe Asp Gln Ser Lys Asn Gly Tyr Ala Gly Tyr
545 550 555 560
Ile Asp Gly Gly Ala Ser Gln Glu Glu Phe Tyr Lys Phe Ile Lys Pro
565 570 575
Ile Leu Glu Lys Met Asp Gly Thr Glu Glu Leu Leu Val Lys Leu Asn
580 585 590
Arg Glu Asp Leu Leu Arg Lys Gln Arg Thr Phe Asp Asn Gly Ser Ile
595 600 605
Pro His Gln Ile His Leu Gly Glu Leu His Ala Ile Leu Arg Arg Gln
610 615 620
Glu Asp Phe Tyr Pro Phe Leu Lys Asp Asn Arg Glu Lys Ile Glu Lys
625 630 635 640
Ile Leu Thr Phe Arg Ile Pro Tyr Tyr Val Gly Pro Leu Ala Arg Gly
645 650 655
Asn Ser Arg Phe Ala Trp Met Thr Arg Lys Ser Glu Glu Thr Ile Thr
660 665 670
Pro Trp Asn Phe Glu Glu Val Val Asp Lys Gly Ala Ser Ala Gln Ser
675 680 685
Phe Ile Glu Arg Met Thr Asn Phe Asp Lys Asn Leu Pro Asn Glu Lys
690 695 700
Val Leu Pro Lys His Ser Leu Leu Tyr Glu Tyr Phe Thr Val Tyr Asn
705 710 715 720
Glu Leu Thr Lys Val Lys Tyr Val Thr Glu Gly Met Arg Lys Pro Ala
725 730 735
Phe Leu Ser Gly Glu Gln Lys Lys Ala Ile Val Asp Leu Leu Phe Lys
740 745 750
Thr Asn Arg Lys Val Thr Val Lys Gln Leu Lys Glu Asp Tyr Phe Lys
755 760 765
Lys Ile Glu Cys Phe Asp Ser Val Glu Ile Ser Gly Val Glu Asp Arg
770 775 780
Phe Asn Ala Ser Leu Gly Thr Tyr His Asp Leu Leu Lys Ile Ile Lys
785 790 795 800
Asp Lys Asp Phe Leu Asp Asn Glu Glu Asn Glu Asp Ile Leu Glu Asp
805 810 815
Ile Val Leu Thr Leu Thr Leu Phe Glu Asp Arg Glu Met Ile Glu Glu
820 825 830
Arg Leu Lys Thr Tyr Ala His Leu Phe Asp Asp Lys Val Met Lys Gln
835 840 845
Leu Lys Arg Arg Arg Tyr Thr Gly Trp Gly Arg Leu Ser Arg Lys Leu
850 855 860
Ile Asn Gly Ile Arg Asp Lys Gln Ser Gly Lys Thr Ile Leu Asp Phe
865 870 875 880
Leu Lys Ser Asp Gly Phe Ala Asn Arg Asn Phe Met Gln Leu Ile His
885 890 895
Asp Asp Ser Leu Thr Phe Lys Glu Asp Ile Gln Lys Ala Gln Val Ser
900 905 910
Gly Gln Gly Asp Ser Leu His Glu His Ile Ala Asn Leu Ala Gly Ser
915 920 925
Pro Ala Ile Lys Lys Gly Ile Leu Gln Thr Val Lys Val Val Asp Glu
930 935 940
Leu Val Lys Val Met Gly Arg His Lys Pro Glu Asn Ile Val Ile Glu
945 950 955 960
Met Ala Arg Glu Asn Gln Thr Thr Gln Lys Gly Gln Lys Asn Ser Arg
965 970 975
Glu Arg Met Lys Arg Ile Glu Glu Gly Ile Lys Glu Leu Gly Ser Gln
980 985 990
Ile Leu Lys Glu His Pro Val Glu Asn Thr Gln Leu Gln Asn Glu Lys
995 1000 1005
Leu Tyr Leu Tyr Tyr Leu Gln Asn Gly Arg Asp Met Tyr Val Asp
1010 1015 1020
Gln Glu Leu Asp Ile Asn Arg Leu Ser Asp Tyr Asp Val Asp Ala
1025 1030 1035
Ile Val Pro Gln Ser Phe Leu Lys Asp Asp Ser Ile Asp Asn Lys
1040 1045 1050
Val Leu Thr Arg Ser Asp Lys Asn Arg Gly Lys Ser Asp Asn Val
1055 1060 1065
Pro Ser Glu Glu Val Val Lys Lys Met Lys Asn Tyr Trp Arg Gln
1070 1075 1080
Leu Leu Asn Ala Lys Leu Ile Thr Gln Arg Lys Phe Asp Asn Leu
1085 1090 1095
Thr Lys Ala Glu Arg Gly Gly Leu Ser Glu Leu Asp Lys Ala Gly
1100 1105 1110
Phe Ile Lys Arg Gln Leu Val Glu Thr Arg Gln Ile Thr Lys His
1115 1120 1125
Val Ala Gln Ile Leu Asp Ser Arg Met Asn Thr Lys Tyr Asp Glu
1130 1135 1140
Asn Asp Lys Leu Ile Arg Glu Val Lys Val Ile Thr Leu Lys Ser
1145 1150 1155
Lys Leu Val Ser Asp Phe Arg Lys Asp Phe Gln Phe Tyr Lys Val
1160 1165 1170
Arg Glu Ile Asn Asn Tyr His His Ala His Asp Ala Tyr Leu Asn
1175 1180 1185
Ala Val Val Gly Thr Ala Leu Ile Lys Lys Tyr Pro Lys Leu Glu
1190 1195 1200
Ser Glu Phe Val Tyr Gly Asp Tyr Lys Val Tyr Asp Val Arg Lys
1205 1210 1215
Met Ile Ala Lys Ser Glu Gln Glu Ile Gly Lys Ala Thr Ala Lys
1220 1225 1230
Tyr Phe Phe Tyr Ser Asn Ile Met Asn Phe Phe Lys Thr Glu Ile
1235 1240 1245
Thr Leu Ala Asn Gly Glu Ile Arg Lys Arg Pro Leu Ile Glu Thr
1250 1255 1260
Asn Gly Glu Thr Gly Glu Ile Val Trp Asp Lys Gly Arg Asp Phe
1265 1270 1275
Ala Thr Val Arg Lys Val Leu Ser Met Pro Gln Val Asn Ile Val
1280 1285 1290
Lys Lys Thr Glu Val Gln Thr Gly Gly Phe Ser Lys Glu Ser Ile
1295 1300 1305
Leu Pro Lys Arg Asn Ser Asp Lys Leu Ile Ala Arg Lys Lys Asp
1310 1315 1320
Trp Asp Pro Lys Lys Tyr Gly Gly Phe Asp Ser Pro Thr Val Ala
1325 1330 1335
Tyr Ser Val Leu Val Val Ala Lys Val Glu Lys Gly Lys Ser Lys
1340 1345 1350
Lys Leu Lys Ser Val Lys Glu Leu Leu Gly Ile Thr Ile Met Glu
1355 1360 1365
Arg Ser Ser Phe Glu Lys Asn Pro Ile Asp Phe Leu Glu Ala Lys
1370 1375 1380
Gly Tyr Lys Glu Val Lys Lys Asp Leu Ile Ile Lys Leu Pro Lys
1385 1390 1395
Tyr Ser Leu Phe Glu Leu Glu Asn Gly Arg Lys Arg Met Leu Ala
1400 1405 1410
Ser Ala Gly Glu Leu Gln Lys Gly Asn Glu Leu Ala Leu Pro Ser
1415 1420 1425
Lys Tyr Val Asn Phe Leu Tyr Leu Ala Ser His Tyr Glu Lys Leu
1430 1435 1440
Lys Gly Ser Pro Glu Asp Asn Glu Gln Lys Gln Leu Phe Val Glu
1445 1450 1455
Gln His Lys His Tyr Leu Asp Glu Ile Ile Glu Gln Ile Ser Glu
1460 1465 1470
Phe Ser Lys Arg Val Ile Leu Ala Asp Ala Asn Leu Asp Lys Val
1475 1480 1485
Leu Ser Ala Tyr Asn Lys His Arg Asp Lys Pro Ile Arg Glu Gln
1490 1495 1500
Ala Glu Asn Ile Ile His Leu Phe Thr Leu Thr Asn Leu Gly Ala
1505 1510 1515
Pro Ala Ala Phe Lys Tyr Phe Asp Thr Thr Ile Asp Arg Lys Arg
1520 1525 1530
Tyr Thr Ser Thr Lys Glu Val Leu Asp Ala Thr Leu Ile His Gln
1535 1540 1545
Ser Ile Thr Gly Leu Tyr Glu Thr Arg Ile Asp Leu Ser Gln Leu
1550 1555 1560
Gly Gly Asp Arg Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Gly Gly
1565 1570 1575
<210> 3
<211> 4743
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 3
ggatccatgt cagaagtcga gttctcccat gagtattgga tgaggcacgc cctcactctt 60
gcgaagaggg ccagggacga gagggaggtg ccggtcggtg ctgtcctggt cttgaataac 120
agggtgatag gcgaaggttg gaacagggct attggccttc atgaccctac tgctcatgcg 180
gaaatcatgg cacttagaca ggggggcctc gttatgcaaa attaccgcct gatcgacgcc 240
actctttatt ccacatttga accatgtgtt atgtgtgcgg gcgctatgat ccattcacgc 300
ataggtcgcg tggtttttgg agttcgcaac agtaaacgtg gggctgcagg ctctctgatg 360
aacgttttga attatccggg aatgaaccat agagtcgaaa tcacagaagg gattttggca 420
gacgaatgcg cggctcttct ttgtgatttt tacagaatgc cccgccgtgt gtttaatgct 480
caaaagaaag cgcagagtag catcaactcg gggggatctt ctgggggctc gtctggttcc 540
gagactcccg gaacttccga gtcggcaaca cctgaatcct ccggcggctc ttcgggcgga 600
tctgacaaaa aatactcaat tggtctggct attgggacaa actctgtggg ctgggcggta 660
attaccgacg agtacaaggt gcctagtaag aaatttaaag tgctcggaaa cactgacagg 720
cactctataa agaagaacct gatcggggca ctgcttttcg actccggaga gacggcggag 780
gcgacgcgtc tcaagcgtac cgcgcgccgc aggtacacaa gaaggaagaa taggatctgc 840
tacttgcagg aaatcttcag taacgagatg gcgaaggtcg acgatagttt ctttcatcgg 900
ttggaagaat cgttcctcgt agaggaggac aaaaagcacg agcgtcaccc aatattcggg 960
aatattgttg acgaggttgc ctaccatgag aaatatccta caatatatca cctccgtaag 1020
aagcttgtcg attcaactga taaggctgat ctcagactca tctatcttgc cctcgcacat 1080
atgattaagt ttcgtggcca cttcttgatt gaaggcgacc tcaacccgga caactcagat 1140
gttgacaagc tttttataca gctcgtccag acatataacc agctgtttga agagaatccc 1200
atcaatgcga gtggggttga tgctaaagcc attttgtccg ccaggttgtc caaatctcgc 1260
agactggaaa acctgatcgc acagcttccc ggtgaaaaga aaaacgggct cttcggcaat 1320
ctcatcgcac tgtccctcgg cctcacccca aacttcaagt ctaacttcga cctggccgag 1380
gatgcgaagc tccagctgtc aaaagataca tacgacgacg atttggacaa tctgcttgcg 1440
caaataggcg accagtatgc ggacctgttc ctggctgcca aaaatctgtc agatgcaatc 1500
ctcctgtccg atatattgcg tgtgaacacc gaaatcacga aggcaccgct tagcgcatcc 1560
atgatcaaga gatacgacga gcaccatcag gacctcacac tcctcaaggc gcttgttcgt 1620
cagcagcttc ccgagaaata taaggaaatt tttttcgatc aaagcaagaa tggatatgct 1680
ggctatattg acggtggcgc ttcgcaggag gagttctata aattcattaa gccgattctg 1740
gagaagatgg acggaacgga ggagctcctc gtcaagctta accgggaaga cctgttgcgg 1800
aagcagagga cttttgataa cggctctatt ccgcaccaaa tccatctggg tgagttgcac 1860
gcaatcttga gaagacaaga ggatttctac ccgttcctta aggataacag agagaagata 1920
gaaaaaatac tgaccttcag gataccatac tatgtgggcc cactggcgcg cggaaatagt 1980
cgtttcgcat ggatgactag aaagtccgaa gaaacgatca cgccatggaa ttttgaggaa 2040
gtggtcgaca agggcgcctc tgcccagagc ttcatcgaaa ggatgaccaa ttttgacaaa 2100
aatctgccta acgaaaaggt gcttccgaag cacagcctgt tgtatgaata cttcacagtt 2160
tataacgagc tcactaaggt caagtacgtc acggagggca tgcgtaagcc tgctttcctg 2220
tctggtgaac aaaaaaaggc gattgtggac ctccttttca agacgaaccg taaagttact 2280
gtgaagcaac tgaaagagga ttactttaag aaaattgagt gcttcgacag tgtggagatt 2340
tccggtgtcg aggaccggtt taacgccagc ctgggtacgt atcatgacct gcttaaaatt 2400
atcaaggata aagatttcct ggataatgaa gagaacgaag atatactgga ggacattgtg 2460
ttgactttga ccctcttcga ggacagagag atgattgagg aaagactgaa gacctacgca 2520
cacctttttg atgacaaggt catgaaacaa ctcaagcgcc ggcgctatac tggctggggc 2580
cggctttctc gcaagctcat caatgggatt cgggataagc aatcaggcaa gacaattttg 2640
gacttcctca aatccgacgg attcgcaaat aggaatttta tgcagctgat acatgacgac 2700
tctttgacat tcaaagaaga catacagaag gctcaggtca gcggccaagg agattctttg 2760
cacgagcata tcgctaactt ggcaggtagc cccgccataa aaaagggcat tcttcaaacg 2820
gtaaaagttg ttgacgaact cgtgaaggtt atgggccgtc ataagccgga aaacattgtt 2880
attgaaatgg ctagggaaaa tcagacgacc cagaagggac agaaaaatag cagggagcgg 2940
atgaagagaa ttgaagaggg aattaaggag cttggatctc agattcttaa ggagcaccct 3000
gtggagaaca cccaacttca gaatgaaaag ctctaccttt actaccttca aaacggccgg 3060
gatatgtacg tcgatcagga acttgacatt aaccggttga gcgattatga cgttgaccat 3120
attgtgcccc aatctttcct taaagacgac tctatcgaca ataaagtgct gacgcgcagc 3180
gataaaaatc gcggtaagtc ggataatgtc ccgtcggaag aggtggttaa aaaaatgaag 3240
aactattgga ggcaactcct gaatgccaag ctgatcactc agaggaaatt cgacaatctc 3300
accaaggcag aaaggggtgg acttagcgag ctcgacaagg ccggttttat caaaagacag 3360
ctggtggaga cacgccaaat caccaaacac gttgcccaga tcctggattc gaggatgaac 3420
acgaagtatg acgagaacga caagttgatt agggaagtca aggtcatcac tttgaagtcc 3480
aagctggtga gcgactttcg caaagacttc cagttttaca aagtcaggga aattaataac 3540
taccaccacg cccacgacgc ctaccttaac gccgtggttg gcacagcact catcaagaaa 3600
taccctaagc tcgaatctga gttcgtctat ggcgactata aggtctacga cgttagaaaa 3660
atgatcgcga aatctgagca ggaaataggc aaggcaactg ccaagtactt cttctattcc 3720
aatatcatga acttttttaa gacggagatt accctggcga atggtgagat ccgcaagcgc 3780
cctttgattg agacaaacgg agaaacagga gagatcgtat gggacaaagg gcgggacttt 3840
gctactgtta ggaaggtgct ctctatgcca caagttaaca ttgtcaaaaa aactgaagtg 3900
cagacaggtg ggtttagcaa ggaatctatc cgcccgaaga ggaactctga caagctgatc 3960
gcccgcaaga aagattggga cccgaaaaag tacggaggat tcgtttcccc cacagttgcg 4020
tactccgtgc ttgtcgtggc caaagtggag aagggcaagt ctaagaagct caagagcgtc 4080
aaagagttgt tggggatcac gattatggag cggtcgtctt tcgaaaagaa tccgatagat 4140
tttctcgagg ccaagggtta taaagaagtc aagaaggatc ttatcatcaa gctccctaag 4200
tactccctct ttgagcttga aaacggacgg aaaagaatgc tggcttcagc gcgctttctt 4260
cagaagggta atgaactcgc tctgccctca aaatatgtga atttccttta cctggcatca 4320
cactatgaga agcttaaggg ttctccagag gacaacgagc agaagcaact gttcgttgaa 4380
caacacaagc actaccttga cgagattatc gagcaaatca gcgagtttag caagcgcgtt 4440
atactggcag acgcaaatct tgataaggtc cttagcgcct acaacaagca tagagacaaa 4500
cccatccggg agcaggccga gaacattatt catctcttca ccttgacgaa tcttggggcc 4560
ccgcgcgcgt tcaagtactt cgatactacc atagacagaa aggtctatcg ctcgacaaag 4620
gaagttcttg acgccacgct gatccaccaa agtataacag gcctctatga gacacgcatc 4680
gacctttcgc agttgggcgg tgaccgcccc aaaaagaaga ggaaagttgg cgggtgaact 4740
agt 4743
<210> 4
<211> 1576
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 4
Met Ser Glu Val Glu Phe Ser His Glu Tyr Trp Met Arg His Ala Leu
1 5 10 15
Thr Leu Ala Lys Arg Ala Arg Asp Glu Arg Glu Val Pro Val Gly Ala
20 25 30
Val Leu Val Leu Asn Asn Arg Val Ile Gly Glu Gly Trp Asn Arg Ala
35 40 45
Ile Gly Leu His Asp Pro Thr Ala His Ala Glu Ile Met Ala Leu Arg
50 55 60
Gln Gly Gly Leu Val Met Gln Asn Tyr Arg Leu Ile Asp Ala Thr Leu
65 70 75 80
Tyr Ser Thr Phe Glu Pro Cys Val Met Cys Ala Gly Ala Met Ile His
85 90 95
Ser Arg Ile Gly Arg Val Val Phe Gly Val Arg Asn Ser Lys Arg Gly
100 105 110
Ala Ala Gly Ser Leu Met Asn Val Leu Asn Tyr Pro Gly Met Asn His
115 120 125
Arg Val Glu Ile Thr Glu Gly Ile Leu Ala Asp Glu Cys Ala Ala Leu
130 135 140
Leu Cys Asp Phe Tyr Arg Met Pro Arg Arg Val Phe Asn Ala Gln Lys
145 150 155 160
Lys Ala Gln Ser Ser Ile Asn Ser Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Ser
165 170 175
Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Ser
180 185 190
Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Asp Lys Lys Tyr Ser Ile Gly Leu Ala
195 200 205
Ile Gly Thr Asn Ser Val Gly Trp Ala Val Ile Thr Asp Glu Tyr Lys
210 215 220
Val Pro Ser Lys Lys Phe Lys Val Leu Gly Asn Thr Asp Arg His Ser
225 230 235 240
Ile Lys Lys Asn Leu Ile Gly Ala Leu Leu Phe Asp Ser Gly Glu Thr
245 250 255
Ala Glu Ala Thr Arg Leu Lys Arg Thr Ala Arg Arg Arg Tyr Thr Arg
260 265 270
Arg Lys Asn Arg Ile Cys Tyr Leu Gln Glu Ile Phe Ser Asn Glu Met
275 280 285
Ala Lys Val Asp Asp Ser Phe Phe His Arg Leu Glu Glu Ser Phe Leu
290 295 300
Val Glu Glu Asp Lys Lys His Glu Arg His Pro Ile Phe Gly Asn Ile
305 310 315 320
Val Asp Glu Val Ala Tyr His Glu Lys Tyr Pro Thr Ile Tyr His Leu
325 330 335
Arg Lys Lys Leu Val Asp Ser Thr Asp Lys Ala Asp Leu Arg Leu Ile
340 345 350
Tyr Leu Ala Leu Ala His Met Ile Lys Phe Arg Gly His Phe Leu Ile
355 360 365
Glu Gly Asp Leu Asn Pro Asp Asn Ser Asp Val Asp Lys Leu Phe Ile
370 375 380
Gln Leu Val Gln Thr Tyr Asn Gln Leu Phe Glu Glu Asn Pro Ile Asn
385 390 395 400
Ala Ser Gly Val Asp Ala Lys Ala Ile Leu Ser Ala Arg Leu Ser Lys
405 410 415
Ser Arg Arg Leu Glu Asn Leu Ile Ala Gln Leu Pro Gly Glu Lys Lys
420 425 430
Asn Gly Leu Phe Gly Asn Leu Ile Ala Leu Ser Leu Gly Leu Thr Pro
435 440 445
Asn Phe Lys Ser Asn Phe Asp Leu Ala Glu Asp Ala Lys Leu Gln Leu
450 455 460
Ser Lys Asp Thr Tyr Asp Asp Asp Leu Asp Asn Leu Leu Ala Gln Ile
465 470 475 480
Gly Asp Gln Tyr Ala Asp Leu Phe Leu Ala Ala Lys Asn Leu Ser Asp
485 490 495
Ala Ile Leu Leu Ser Asp Ile Leu Arg Val Asn Thr Glu Ile Thr Lys
500 505 510
Ala Pro Leu Ser Ala Ser Met Ile Lys Arg Tyr Asp Glu His His Gln
515 520 525
Asp Leu Thr Leu Leu Lys Ala Leu Val Arg Gln Gln Leu Pro Glu Lys
530 535 540
Tyr Lys Glu Ile Phe Phe Asp Gln Ser Lys Asn Gly Tyr Ala Gly Tyr
545 550 555 560
Ile Asp Gly Gly Ala Ser Gln Glu Glu Phe Tyr Lys Phe Ile Lys Pro
565 570 575
Ile Leu Glu Lys Met Asp Gly Thr Glu Glu Leu Leu Val Lys Leu Asn
580 585 590
Arg Glu Asp Leu Leu Arg Lys Gln Arg Thr Phe Asp Asn Gly Ser Ile
595 600 605
Pro His Gln Ile His Leu Gly Glu Leu His Ala Ile Leu Arg Arg Gln
610 615 620
Glu Asp Phe Tyr Pro Phe Leu Lys Asp Asn Arg Glu Lys Ile Glu Lys
625 630 635 640
Ile Leu Thr Phe Arg Ile Pro Tyr Tyr Val Gly Pro Leu Ala Arg Gly
645 650 655
Asn Ser Arg Phe Ala Trp Met Thr Arg Lys Ser Glu Glu Thr Ile Thr
660 665 670
Pro Trp Asn Phe Glu Glu Val Val Asp Lys Gly Ala Ser Ala Gln Ser
675 680 685
Phe Ile Glu Arg Met Thr Asn Phe Asp Lys Asn Leu Pro Asn Glu Lys
690 695 700
Val Leu Pro Lys His Ser Leu Leu Tyr Glu Tyr Phe Thr Val Tyr Asn
705 710 715 720
Glu Leu Thr Lys Val Lys Tyr Val Thr Glu Gly Met Arg Lys Pro Ala
725 730 735
Phe Leu Ser Gly Glu Gln Lys Lys Ala Ile Val Asp Leu Leu Phe Lys
740 745 750
Thr Asn Arg Lys Val Thr Val Lys Gln Leu Lys Glu Asp Tyr Phe Lys
755 760 765
Lys Ile Glu Cys Phe Asp Ser Val Glu Ile Ser Gly Val Glu Asp Arg
770 775 780
Phe Asn Ala Ser Leu Gly Thr Tyr His Asp Leu Leu Lys Ile Ile Lys
785 790 795 800
Asp Lys Asp Phe Leu Asp Asn Glu Glu Asn Glu Asp Ile Leu Glu Asp
805 810 815
Ile Val Leu Thr Leu Thr Leu Phe Glu Asp Arg Glu Met Ile Glu Glu
820 825 830
Arg Leu Lys Thr Tyr Ala His Leu Phe Asp Asp Lys Val Met Lys Gln
835 840 845
Leu Lys Arg Arg Arg Tyr Thr Gly Trp Gly Arg Leu Ser Arg Lys Leu
850 855 860
Ile Asn Gly Ile Arg Asp Lys Gln Ser Gly Lys Thr Ile Leu Asp Phe
865 870 875 880
Leu Lys Ser Asp Gly Phe Ala Asn Arg Asn Phe Met Gln Leu Ile His
885 890 895
Asp Asp Ser Leu Thr Phe Lys Glu Asp Ile Gln Lys Ala Gln Val Ser
900 905 910
Gly Gln Gly Asp Ser Leu His Glu His Ile Ala Asn Leu Ala Gly Ser
915 920 925
Pro Ala Ile Lys Lys Gly Ile Leu Gln Thr Val Lys Val Val Asp Glu
930 935 940
Leu Val Lys Val Met Gly Arg His Lys Pro Glu Asn Ile Val Ile Glu
945 950 955 960
Met Ala Arg Glu Asn Gln Thr Thr Gln Lys Gly Gln Lys Asn Ser Arg
965 970 975
Glu Arg Met Lys Arg Ile Glu Glu Gly Ile Lys Glu Leu Gly Ser Gln
980 985 990
Ile Leu Lys Glu His Pro Val Glu Asn Thr Gln Leu Gln Asn Glu Lys
995 1000 1005
Leu Tyr Leu Tyr Tyr Leu Gln Asn Gly Arg Asp Met Tyr Val Asp
1010 1015 1020
Gln Glu Leu Asp Ile Asn Arg Leu Ser Asp Tyr Asp Val Asp His
1025 1030 1035
Ile Val Pro Gln Ser Phe Leu Lys Asp Asp Ser Ile Asp Asn Lys
1040 1045 1050
Val Leu Thr Arg Ser Asp Lys Asn Arg Gly Lys Ser Asp Asn Val
1055 1060 1065
Pro Ser Glu Glu Val Val Lys Lys Met Lys Asn Tyr Trp Arg Gln
1070 1075 1080
Leu Leu Asn Ala Lys Leu Ile Thr Gln Arg Lys Phe Asp Asn Leu
1085 1090 1095
Thr Lys Ala Glu Arg Gly Gly Leu Ser Glu Leu Asp Lys Ala Gly
1100 1105 1110
Phe Ile Lys Arg Gln Leu Val Glu Thr Arg Gln Ile Thr Lys His
1115 1120 1125
Val Ala Gln Ile Leu Asp Ser Arg Met Asn Thr Lys Tyr Asp Glu
1130 1135 1140
Asn Asp Lys Leu Ile Arg Glu Val Lys Val Ile Thr Leu Lys Ser
1145 1150 1155
Lys Leu Val Ser Asp Phe Arg Lys Asp Phe Gln Phe Tyr Lys Val
1160 1165 1170
Arg Glu Ile Asn Asn Tyr His His Ala His Asp Ala Tyr Leu Asn
1175 1180 1185
Ala Val Val Gly Thr Ala Leu Ile Lys Lys Tyr Pro Lys Leu Glu
1190 1195 1200
Ser Glu Phe Val Tyr Gly Asp Tyr Lys Val Tyr Asp Val Arg Lys
1205 1210 1215
Met Ile Ala Lys Ser Glu Gln Glu Ile Gly Lys Ala Thr Ala Lys
1220 1225 1230
Tyr Phe Phe Tyr Ser Asn Ile Met Asn Phe Phe Lys Thr Glu Ile
1235 1240 1245
Thr Leu Ala Asn Gly Glu Ile Arg Lys Arg Pro Leu Ile Glu Thr
1250 1255 1260
Asn Gly Glu Thr Gly Glu Ile Val Trp Asp Lys Gly Arg Asp Phe
1265 1270 1275
Ala Thr Val Arg Lys Val Leu Ser Met Pro Gln Val Asn Ile Val
1280 1285 1290
Lys Lys Thr Glu Val Gln Thr Gly Gly Phe Ser Lys Glu Ser Ile
1295 1300 1305
Arg Pro Lys Arg Asn Ser Asp Lys Leu Ile Ala Arg Lys Lys Asp
1310 1315 1320
Trp Asp Pro Lys Lys Tyr Gly Gly Phe Val Ser Pro Thr Val Ala
1325 1330 1335
Tyr Ser Val Leu Val Val Ala Lys Val Glu Lys Gly Lys Ser Lys
1340 1345 1350
Lys Leu Lys Ser Val Lys Glu Leu Leu Gly Ile Thr Ile Met Glu
1355 1360 1365
Arg Ser Ser Phe Glu Lys Asn Pro Ile Asp Phe Leu Glu Ala Lys
1370 1375 1380
Gly Tyr Lys Glu Val Lys Lys Asp Leu Ile Ile Lys Leu Pro Lys
1385 1390 1395
Tyr Ser Leu Phe Glu Leu Glu Asn Gly Arg Lys Arg Met Leu Ala
1400 1405 1410
Ser Ala Arg Phe Leu Gln Lys Gly Asn Glu Leu Ala Leu Pro Ser
1415 1420 1425
Lys Tyr Val Asn Phe Leu Tyr Leu Ala Ser His Tyr Glu Lys Leu
1430 1435 1440
Lys Gly Ser Pro Glu Asp Asn Glu Gln Lys Gln Leu Phe Val Glu
1445 1450 1455
Gln His Lys His Tyr Leu Asp Glu Ile Ile Glu Gln Ile Ser Glu
1460 1465 1470
Phe Ser Lys Arg Val Ile Leu Ala Asp Ala Asn Leu Asp Lys Val
1475 1480 1485
Leu Ser Ala Tyr Asn Lys His Arg Asp Lys Pro Ile Arg Glu Gln
1490 1495 1500
Ala Glu Asn Ile Ile His Leu Phe Thr Leu Thr Asn Leu Gly Ala
1505 1510 1515
Pro Arg Ala Phe Lys Tyr Phe Asp Thr Thr Ile Asp Arg Lys Val
1520 1525 1530
Tyr Arg Ser Thr Lys Glu Val Leu Asp Ala Thr Leu Ile His Gln
1535 1540 1545
Ser Ile Thr Gly Leu Tyr Glu Thr Arg Ile Asp Leu Ser Gln Leu
1550 1555 1560
Gly Gly Asp Arg Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Gly Gly
1565 1570 1575
<210> 5
<211> 4764
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 5
ggatccatgt cagaagtcga gttctcccat gagtattgga tgaggcacgc cctcactctt 60
gcgaagaggg ccagggacga gagggaggtg ccggtcggtg ctgtcctggt cttgaataac 120
agggtgatag gcgaaggttg gaacagggct attggccttc atgaccctac tgctcatgcg 180
gaaatcatgg cacttagaca ggggggcctc gttatgcaaa attaccgcct gatcgacgcc 240
actctttatt ccacatttga accatgtgtt atgtgtgcgg gcgctatgat ccattcacgc 300
ataggtcgcg tggtttttgg agttcgcaac agtaaacgtg gggctgcagg ctctctgatg 360
aacgttttga attatccggg aatgaaccat agagtcgaaa tcacagaagg gattttggca 420
gacgaatgcg cggctcttct ttgtgatttt tacagaatgc cccgccgtgt gtttaatgct 480
caaaagaaag cgcagagtag catcaactcg gggggatctt ctgggggctc gtctggttcc 540
gagactcccg gaacttccga gtcggcaaca cctgaatcct ccggcggctc ttcgggcgga 600
tctgagaaaa aatactcaat tggtctggct attggaacca attcggttgg gtgggcagtc 660
ataaccgatg actataaagt tccgagcaaa aaatttaagg tccttggtaa taccaacagg 720
aaaagcataa aaaagaatct gatgggtgct ttgctgttcg attcaggtga gacagccgag 780
gctacccggc ttaagcggac cgctcgcaga aggtacaccc ggagaaaaaa tcgcatccgc 840
tatctccagg aaattttcgc gaatgaaatg gcaaagttgg acgatagttt cttccagagg 900
ctggaagaat ccttccttgt cgaagaagat aagaaaaacg agagacaccc tatcttcgga 960
aacctggcag acgaagtggc gtaccataga aactacccta cgatttatca tctcaggaaa 1020
aagctggcag attcaccgga gaaagccgac ctcaggttga tatacttggc actcgcgcac 1080
attattaaat ttagaggtca cttccttatc gaagggaaac tgaatgcaga aaactcggat 1140
gttgctaaac ttttttatca gttgatacaa acttacaatc agctgtttga agaatcccct 1200
ttggacgaaa tcgaggttga tgctaagggc attctttctg ctaggttgtc aaagagcaaa 1260
aggctcgaaa agctcattgc tgtctttccc aacgaaaaga agaatggact ttttgggaac 1320
attatagctc ttgccctcgg cctgactcca aacttcaaaa gcaactttga tttgactgag 1380
gacgccaaac tccaattgtc aaaggatact tacgatgacg acctggacga actcttgggt 1440
cagatcgggg atcaatacgc ggatcttttc agtgctgcaa agaatctctc cgacgctatt 1500
cttctttcag acatcctgcg ctcaaatagt gaggtcacta aggctccgtt gtccgcgtcg 1560
atggttaaac ggtatgatga acatcaccag gacctcgcgc ttctgaaaac actcgtccgg 1620
caacagttcc ctgaaaagta tgcagaaata ttcaaagacg acacaaaaaa tggttacgct 1680
gggtacgtcg ggattggcat caagcataga aaacggacta ctaaacttgc tacccaagag 1740
gagttctaca agtttattaa gccaatcctg gaaaaaatgg atggcgcgga agaactcctt 1800
gccaagttga atagggatga cctcctccgg aagcaacgca cttttgacaa cggctctatc 1860
ccgcatcaga ttcacttgaa agagttgcac gcaatactcc gccgccaaga ggaattttac 1920
ccatttctca aggagaacag ggagaaaata gagaaaatct tgacgttcag gattccttac 1980
tatgtggggc ctcttgctcg gggtaattct cgctttgcct ggttgacaag aaaatctgaa 2040
gaagctatca ccccgtggaa tttcgaagaa gtcgttgata aaggcgccag cgctcaatct 2100
ttcattgagc ggatgacaaa cttcgacgag cagttgccga ataaaaaggt tctgccaaag 2160
cactcactgc tttatgagta ttttaccgtc tacaacgagt tgacgaaggt caaatacgtg 2220
actgagagga tgcggaaacc tgagtttttg tctggtgagc agaagaaagc cattgttgac 2280
cttcttttca agaccaaccg gaaggtgact gttaagcaac tcaaggaaga ttatttcaag 2340
aaaattgaat gcttcgactc cgttgagata ataggtgttg aggaccgctt caatgcgtca 2400
ctcggaacct atcacgactt gctcaaaata atcaaggaca aagactttct tgataacgaa 2460
gaaaatgaag acatattgga ggatatagtg ctcaccctta cattgttcga ggacagagaa 2520
atgatcgagg agcggcttaa gacctacgcg catctgttcg atgataaggt tatgaagcag 2580
ctgaagagga gacattacac gggttggggc cggctttcca ggaagatgat taacggtatc 2640
cgggataaac agtcaggaaa aactatactg gactttttga aatcagacgg tttctcaaac 2700
agaaacttca tgcaattgat tcatgacgat agtcttactt ttaaagagga aatcgagaag 2760
gcgcaagtga gcggacaagg agactcgctg cacgagcaaa tcgccgacct ggctgggtcg 2820
ccggctataa agaagggtat attgcagacc gtcaaaatcg tggacgagct ggtgaaggtt 2880
atggggcaca aacctgaaaa tattgttatt gagatggcta gggagaatca gactactacg 2940
aagggattgc aacagtctcg cgagcgcaag aaaaggatcg aggaaggtat taaggaactt 3000
gaatcccaga tactcaagga gaatcccgtc gagaacacac aacttcagaa cgaaaaactc 3060
tatctttact atcttcaaaa tggcagagat atgtatgtgg accaagagct ggatattaat 3120
aggctctctg attacgatgt tgaccatatc gtgccgcagt catttattaa agatgactct 3180
attgataaca aggtcctcac tcgctccgtc gaaaatcgcg gtaaatcaga caatgtcccc 3240
tcggaggaag tcgtgaagaa aatgaagaac tactggaggc agctgcttaa cgcaaagttg 3300
attactcagc gcaagtttga caacttgaca aaggccgaga ggggaggact ctctgaggcg 3360
gacaaggcag gtttcatcaa gcgccaactc gtcgagacac ggcagataac caaacacgtc 3420
gcaaggatat tggatagcag aatgaacaca aagagagata agaacgacaa accaatacgc 3480
gaagtgaaag tcatcacatt gaagtccaaa ttggttagtg atttccgcaa ggacttccaa 3540
ctgtacaaag tgagagacat caacaactac catcatgctc acgatgcata tctgaatgct 3600
gtcgtcggca cagctcttat aaagaaatac ccgaaactcg aatcggagtt cgtttatggg 3660
gattataagg tttatgacgt taggaagatg attgccaagt cagaacaaga aatcgggaag 3720
gctacagcga aacgcttttt ttattcgaac ataatgaatt tctttaaaac ggaggtcaaa 3780
cttgcgaacg gggaaatccg gaaacgcccg cttatcgaga caaatggaga aacaggtgaa 3840
gtcgtgtgga ataaagaaaa ggacttcgcc accgttcgga aagttctcgc catgccgcag 3900
gtcaacattg tcaagaaaac ggaggtccaa accgggggct tctccaagga atccattctc 3960
tcaaagaggg agagtgcaaa gctcatacct aggaagaagg gttgggacac acgcaaatac 4020
ggcgggtttg gcagtcccac ggtggcatac tctatccttg tggtcgccaa agtcgaaaag 4080
ggcaaggcga aaaaattgaa gagcgttaaa gtgcttgtcg ggatcaccat aatggagaag 4140
ggctcctacg agaaggaccc tatcgggttc ttggaagcga agggttataa agacattaag 4200
aaagagctga tcttcaaatt gccgaaatac agcctgttcg aactggagaa cggcaggcgg 4260
cgcatgttgg cgagtgccac cgagcttcag aaggctaatg agcttgtttt gccgcagcat 4320
ctcgtccgcc tcctctatta tacgcaaaat attagtgcta ctactgggtc aaataacctc 4380
ggatatattg aacaacatag ggaggagttt aaggagatat ttgagaaaat catagacttc 4440
tctgaaaagt atatactgaa aaataaggtg aactccaatc tcaagtcttc ctttgacgaa 4500
cagtttgctg tgtcggactc catacttctc agcaattctt tcgtttccct gttgaaatat 4560
acgtcatttg gcgcttccgg gggatttacc tttcttgatc ttgacgttaa acagggtagg 4620
ctcagatacc agactgtcac ggaagtgctc gatgccactc ttatatacca atcaattacg 4680
ggcctgtacg aaacgcggac agatttgtcc cagctcggcg gcgaccggcc aaagaagaag 4740
cggaaagtcg gaggctgaac tagt 4764
<210> 6
<211> 1583
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 6
Met Ser Glu Val Glu Phe Ser His Glu Tyr Trp Met Arg His Ala Leu
1 5 10 15
Thr Leu Ala Lys Arg Ala Arg Asp Glu Arg Glu Val Pro Val Gly Ala
20 25 30
Val Leu Val Leu Asn Asn Arg Val Ile Gly Glu Gly Trp Asn Arg Ala
35 40 45
Ile Gly Leu His Asp Pro Thr Ala His Ala Glu Ile Met Ala Leu Arg
50 55 60
Gln Gly Gly Leu Val Met Gln Asn Tyr Arg Leu Ile Asp Ala Thr Leu
65 70 75 80
Tyr Ser Thr Phe Glu Pro Cys Val Met Cys Ala Gly Ala Met Ile His
85 90 95
Ser Arg Ile Gly Arg Val Val Phe Gly Val Arg Asn Ser Lys Arg Gly
100 105 110
Ala Ala Gly Ser Leu Met Asn Val Leu Asn Tyr Pro Gly Met Asn His
115 120 125
Arg Val Glu Ile Thr Glu Gly Ile Leu Ala Asp Glu Cys Ala Ala Leu
130 135 140
Leu Cys Asp Phe Tyr Arg Met Pro Arg Arg Val Phe Asn Ala Gln Lys
145 150 155 160
Lys Ala Gln Ser Ser Ile Asn Ser Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Ser
165 170 175
Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Ser
180 185 190
Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Glu Lys Lys Tyr Ser Ile Gly Leu Ala
195 200 205
Ile Gly Thr Asn Ser Val Gly Trp Ala Val Ile Thr Asp Asp Tyr Lys
210 215 220
Val Pro Ser Lys Lys Phe Lys Val Leu Gly Asn Thr Asn Arg Lys Ser
225 230 235 240
Ile Lys Lys Asn Leu Met Gly Ala Leu Leu Phe Asp Ser Gly Glu Thr
245 250 255
Ala Glu Ala Thr Arg Leu Lys Arg Thr Ala Arg Arg Arg Tyr Thr Arg
260 265 270
Arg Lys Asn Arg Ile Arg Tyr Leu Gln Glu Ile Phe Ala Asn Glu Met
275 280 285
Ala Lys Leu Asp Asp Ser Phe Phe Gln Arg Leu Glu Glu Ser Phe Leu
290 295 300
Val Glu Glu Asp Lys Lys Asn Glu Arg His Pro Ile Phe Gly Asn Leu
305 310 315 320
Ala Asp Glu Val Ala Tyr His Arg Asn Tyr Pro Thr Ile Tyr His Leu
325 330 335
Arg Lys Lys Leu Ala Asp Ser Pro Glu Lys Ala Asp Leu Arg Leu Ile
340 345 350
Tyr Leu Ala Leu Ala His Ile Ile Lys Phe Arg Gly His Phe Leu Ile
355 360 365
Glu Gly Lys Leu Asn Ala Glu Asn Ser Asp Val Ala Lys Leu Phe Tyr
370 375 380
Gln Leu Ile Gln Thr Tyr Asn Gln Leu Phe Glu Glu Ser Pro Leu Asp
385 390 395 400
Glu Ile Glu Val Asp Ala Lys Gly Ile Leu Ser Ala Arg Leu Ser Lys
405 410 415
Ser Lys Arg Leu Glu Lys Leu Ile Ala Val Phe Pro Asn Glu Lys Lys
420 425 430
Asn Gly Leu Phe Gly Asn Ile Ile Ala Leu Ala Leu Gly Leu Thr Pro
435 440 445
Asn Phe Lys Ser Asn Phe Asp Leu Thr Glu Asp Ala Lys Leu Gln Leu
450 455 460
Ser Lys Asp Thr Tyr Asp Asp Asp Leu Asp Glu Leu Leu Gly Gln Ile
465 470 475 480
Gly Asp Gln Tyr Ala Asp Leu Phe Ser Ala Ala Lys Asn Leu Ser Asp
485 490 495
Ala Ile Leu Leu Ser Asp Ile Leu Arg Ser Asn Ser Glu Val Thr Lys
500 505 510
Ala Pro Leu Ser Ala Ser Met Val Lys Arg Tyr Asp Glu His His Gln
515 520 525
Asp Leu Ala Leu Leu Lys Thr Leu Val Arg Gln Gln Phe Pro Glu Lys
530 535 540
Tyr Ala Glu Ile Phe Lys Asp Asp Thr Lys Asn Gly Tyr Ala Gly Tyr
545 550 555 560
Val Gly Ile Gly Ile Lys His Arg Lys Arg Thr Thr Lys Leu Ala Thr
565 570 575
Gln Glu Glu Phe Tyr Lys Phe Ile Lys Pro Ile Leu Glu Lys Met Asp
580 585 590
Gly Ala Glu Glu Leu Leu Ala Lys Leu Asn Arg Asp Asp Leu Leu Arg
595 600 605
Lys Gln Arg Thr Phe Asp Asn Gly Ser Ile Pro His Gln Ile His Leu
610 615 620
Lys Glu Leu His Ala Ile Leu Arg Arg Gln Glu Glu Phe Tyr Pro Phe
625 630 635 640
Leu Lys Glu Asn Arg Glu Lys Ile Glu Lys Ile Leu Thr Phe Arg Ile
645 650 655
Pro Tyr Tyr Val Gly Pro Leu Ala Arg Gly Asn Ser Arg Phe Ala Trp
660 665 670
Leu Thr Arg Lys Ser Glu Glu Ala Ile Thr Pro Trp Asn Phe Glu Glu
675 680 685
Val Val Asp Lys Gly Ala Ser Ala Gln Ser Phe Ile Glu Arg Met Thr
690 695 700
Asn Phe Asp Glu Gln Leu Pro Asn Lys Lys Val Leu Pro Lys His Ser
705 710 715 720
Leu Leu Tyr Glu Tyr Phe Thr Val Tyr Asn Glu Leu Thr Lys Val Lys
725 730 735
Tyr Val Thr Glu Arg Met Arg Lys Pro Glu Phe Leu Ser Gly Glu Gln
740 745 750
Lys Lys Ala Ile Val Asp Leu Leu Phe Lys Thr Asn Arg Lys Val Thr
755 760 765
Val Lys Gln Leu Lys Glu Asp Tyr Phe Lys Lys Ile Glu Cys Phe Asp
770 775 780
Ser Val Glu Ile Ile Gly Val Glu Asp Arg Phe Asn Ala Ser Leu Gly
785 790 795 800
Thr Tyr His Asp Leu Leu Lys Ile Ile Lys Asp Lys Asp Phe Leu Asp
805 810 815
Asn Glu Glu Asn Glu Asp Ile Leu Glu Asp Ile Val Leu Thr Leu Thr
820 825 830
Leu Phe Glu Asp Arg Glu Met Ile Glu Glu Arg Leu Lys Thr Tyr Ala
835 840 845
His Leu Phe Asp Asp Lys Val Met Lys Gln Leu Lys Arg Arg His Tyr
850 855 860
Thr Gly Trp Gly Arg Leu Ser Arg Lys Met Ile Asn Gly Ile Arg Asp
865 870 875 880
Lys Gln Ser Gly Lys Thr Ile Leu Asp Phe Leu Lys Ser Asp Gly Phe
885 890 895
Ser Asn Arg Asn Phe Met Gln Leu Ile His Asp Asp Ser Leu Thr Phe
900 905 910
Lys Glu Glu Ile Glu Lys Ala Gln Val Ser Gly Gln Gly Asp Ser Leu
915 920 925
His Glu Gln Ile Ala Asp Leu Ala Gly Ser Pro Ala Ile Lys Lys Gly
930 935 940
Ile Leu Gln Thr Val Lys Ile Val Asp Glu Leu Val Lys Val Met Gly
945 950 955 960
His Lys Pro Glu Asn Ile Val Ile Glu Met Ala Arg Glu Asn Gln Thr
965 970 975
Thr Thr Lys Gly Leu Gln Gln Ser Arg Glu Arg Lys Lys Arg Ile Glu
980 985 990
Glu Gly Ile Lys Glu Leu Glu Ser Gln Ile Leu Lys Glu Asn Pro Val
995 1000 1005
Glu Asn Thr Gln Leu Gln Asn Glu Lys Leu Tyr Leu Tyr Tyr Leu
1010 1015 1020
Gln Asn Gly Arg Asp Met Tyr Val Asp Gln Glu Leu Asp Ile Asn
1025 1030 1035
Arg Leu Ser Asp Tyr Asp Val Asp His Ile Val Pro Gln Ser Phe
1040 1045 1050
Ile Lys Asp Asp Ser Ile Asp Asn Lys Val Leu Thr Arg Ser Val
1055 1060 1065
Glu Asn Arg Gly Lys Ser Asp Asn Val Pro Ser Glu Glu Val Val
1070 1075 1080
Lys Lys Met Lys Asn Tyr Trp Arg Gln Leu Leu Asn Ala Lys Leu
1085 1090 1095
Ile Thr Gln Arg Lys Phe Asp Asn Leu Thr Lys Ala Glu Arg Gly
1100 1105 1110
Gly Leu Ser Glu Ala Asp Lys Ala Gly Phe Ile Lys Arg Gln Leu
1115 1120 1125
Val Glu Thr Arg Gln Ile Thr Lys His Val Ala Arg Ile Leu Asp
1130 1135 1140
Ser Arg Met Asn Thr Lys Arg Asp Lys Asn Asp Lys Pro Ile Arg
1145 1150 1155
Glu Val Lys Val Ile Thr Leu Lys Ser Lys Leu Val Ser Asp Phe
1160 1165 1170
Arg Lys Asp Phe Gln Leu Tyr Lys Val Arg Asp Ile Asn Asn Tyr
1175 1180 1185
His His Ala His Asp Ala Tyr Leu Asn Ala Val Val Gly Thr Ala
1190 1195 1200
Leu Ile Lys Lys Tyr Pro Lys Leu Glu Ser Glu Phe Val Tyr Gly
1205 1210 1215
Asp Tyr Lys Val Tyr Asp Val Arg Lys Met Ile Ala Lys Ser Glu
1220 1225 1230
Gln Glu Ile Gly Lys Ala Thr Ala Lys Arg Phe Phe Tyr Ser Asn
1235 1240 1245
Ile Met Asn Phe Phe Lys Thr Glu Val Lys Leu Ala Asn Gly Glu
1250 1255 1260
Ile Arg Lys Arg Pro Leu Ile Glu Thr Asn Gly Glu Thr Gly Glu
1265 1270 1275
Val Val Trp Asn Lys Glu Lys Asp Phe Ala Thr Val Arg Lys Val
1280 1285 1290
Leu Ala Met Pro Gln Val Asn Ile Val Lys Lys Thr Glu Val Gln
1295 1300 1305
Thr Gly Gly Phe Ser Lys Glu Ser Ile Leu Ser Lys Arg Glu Ser
1310 1315 1320
Ala Lys Leu Ile Pro Arg Lys Lys Gly Trp Asp Thr Arg Lys Tyr
1325 1330 1335
Gly Gly Phe Gly Ser Pro Thr Val Ala Tyr Ser Ile Leu Val Val
1340 1345 1350
Ala Lys Val Glu Lys Gly Lys Ala Lys Lys Leu Lys Ser Val Lys
1355 1360 1365
Val Leu Val Gly Ile Thr Ile Met Glu Lys Gly Ser Tyr Glu Lys
1370 1375 1380
Asp Pro Ile Gly Phe Leu Glu Ala Lys Gly Tyr Lys Asp Ile Lys
1385 1390 1395
Lys Glu Leu Ile Phe Lys Leu Pro Lys Tyr Ser Leu Phe Glu Leu
1400 1405 1410
Glu Asn Gly Arg Arg Arg Met Leu Ala Ser Ala Thr Glu Leu Gln
1415 1420 1425
Lys Ala Asn Glu Leu Val Leu Pro Gln His Leu Val Arg Leu Leu
1430 1435 1440
Tyr Tyr Thr Gln Asn Ile Ser Ala Thr Thr Gly Ser Asn Asn Leu
1445 1450 1455
Gly Tyr Ile Glu Gln His Arg Glu Glu Phe Lys Glu Ile Phe Glu
1460 1465 1470
Lys Ile Ile Asp Phe Ser Glu Lys Tyr Ile Leu Lys Asn Lys Val
1475 1480 1485
Asn Ser Asn Leu Lys Ser Ser Phe Asp Glu Gln Phe Ala Val Ser
1490 1495 1500
Asp Ser Ile Leu Leu Ser Asn Ser Phe Val Ser Leu Leu Lys Tyr
1505 1510 1515
Thr Ser Phe Gly Ala Ser Gly Gly Phe Thr Phe Leu Asp Leu Asp
1520 1525 1530
Val Lys Gln Gly Arg Leu Arg Tyr Gln Thr Val Thr Glu Val Leu
1535 1540 1545
Asp Ala Thr Leu Ile Tyr Gln Ser Ile Thr Gly Leu Tyr Glu Thr
1550 1555 1560
Arg Thr Asp Leu Ser Gln Leu Gly Gly Asp Arg Pro Lys Lys Lys
1565 1570 1575
Arg Lys Val Gly Gly
1580
<210> 7
<211> 4743
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 7
ggatccatgt cagaagtcga gttctcccat gagtattgga tgaggcacgc cctcactctt 60
gcgaagaggg ccagggacga gagggaggtg ccggtcggtg ctgtcctggt cttgaataac 120
agggtgatag gcgaaggttg gaacagggct attggccttc atgaccctac tgctcatgcg 180
gaaatcatgg cacttagaca ggggggcctc gttatgcaaa attaccgcct gatcgacgcc 240
actctttatt ccacatttga accatgtgtt atgtgtgcgg gcgctatgat ccattcacgc 300
ataggtcgcg tggtttttgg agttcgcaac agtaaacgtg gggctgcagg ctctctgatg 360
aacgttttga attatccggg aatgaaccat agagtcgaaa tcacagaagg gattttggca 420
gacgaatgcg cggctcttct ttgtgatttt tacagaatgc cccgccgtgt gtttaatgct 480
caaaagaaag cgcagagtag catcaactcg gggggatctt ctgggggctc gtctggttcc 540
gagactcccg gaacttccga gtcggcaaca cctgaatcct ccggcggctc ttcgggcgga 600
tctgacaaaa aatactcaat tggtctggct attgggacaa actctgtggg ctgggcggta 660
attaccgacg agtacaaggt gcctagtaag aaatttaaag tgctcggaaa cactgacagg 720
cactctataa agaagaacct gatcggggca ctgcttttcg actccggaga gacggcggag 780
aggacgcgtc tcaagcgtac cgcgcgccgc aggtacacaa gaaggaagaa taggatctgc 840
tacttgcagg aaatcttcag taacgagatg gcgaaggtcg acgatagttt ctttcatcgg 900
ttggaagaat cgttcctcgt agaggaggac aaaaagcacg agcgtcaccc aatattcggg 960
aatattgttg acgaggttgc ctaccatgag aaatatccta caatatatca cctccgtaag 1020
aagcttgtcg attcaactga taaggctgat ctcagactca tctatcttgc cctcgcacat 1080
atgattaagt ttcgtggcca cttcttgatt gaaggcgacc tcaacccgga caactcagat 1140
gttgacaagc tttttataca gctcgtccag acatataacc agctgtttga agagaatccc 1200
atcaatgcga gtggggttga tgctaaagcc attttgtccg ccaggttgtc caaatctcgc 1260
agactggaaa acctgatcgc acagcttccc ggtgaaaaga aaaacgggct cttcggcaat 1320
ctcatcgcac tgtccctcgg cctcacccca aacttcaagt ctaacttcga cctggccgag 1380
gatgcgaagc tccagctgtc aaaagataca tacgacgacg atttggacaa tctgcttgcg 1440
caaataggcg accagtatgc ggacctgttc ctggctgcca aaaatctgtc agatgcaatc 1500
ctcctgtccg atatattgcg tgtgaacacc gaaatcacga aggcaccgct tagcgcatcc 1560
atgatcaaga gatacgacga gcaccatcag gacctcacac tcctcaaggc gcttgttcgt 1620
cagcagcttc ccgagaaata taaggaaatt tttttcgatc aaagcaagaa tggatatgct 1680
ggctatattg acggtggcgc ttcgcaggag gagttctata aattcattaa gccgattctg 1740
gagaagatgg acggaacgga ggagctcctc gtcaagctta accgggaaga cctgttgcgg 1800
aagcagagga cttttgataa cggctctatt ccgcaccaaa tccatctggg tgagttgcac 1860
gcaatcttga gaagacaaga ggatttctac ccgttcctta aggataacag agagaagata 1920
gaaaaaatac tgaccttcag gataccatac tatgtgggcc cactggcgcg cggaaatagt 1980
cgtttcgcat ggatgactag aaagtccgaa gaaacgatca cgccatggaa ttttgaggaa 2040
gtggtcgaca agggcgcctc tgcccagagc ttcatcgaaa ggatgaccaa ttttgacaaa 2100
aatctgccta acgaaaaggt gcttccgaag cacagcctgt tgtatgaata cttcacagtt 2160
tataacgagc tcactaaggt caagtacgtc acggagggca tgcgtaagcc tgctttcctg 2220
tctggtgaac aaaaaaaggc gattgtggac ctccttttca agacgaaccg taaagttact 2280
gtgaagcaac tgaaagagga ttactttaag aaaattgagt gcttcgacag tgtggagatt 2340
tccggtgtcg aggaccggtt taacgccagc ctgggtacgt atcatgacct gcttaaaatt 2400
atcaaggata aagatttcct ggataatgaa gagaacgaag atatactgga ggacattgtg 2460
ttgactttga ccctcttcga ggacagagag atgattgagg aaagactgaa gacctacgca 2520
cacctttttg atgacaaggt catgaaacaa ctcaagcgcc ggcgctatac tggctggggc 2580
cggctttctc gcaagctcat caatgggatt cgggataagc aatcaggcaa gacaattttg 2640
gacttcctca aatccgacgg attcgcaaat aggaatttta tgcagctgat acatgacgac 2700
tctttgacat tcaaagaaga catacagaag gctcaggtct ccggccaagg agattctttg 2760
cacgagcata tcgctaactt ggcaggtagc cccgccataa aaaagggcat tcttcaaacg 2820
gtaaaagttg ttgacgaact cgtgaaggtt atgggccgtc ataagccgga aaacattgtt 2880
attgaaatgg ctagggaaaa tcagacgacc cagaagggac agaaaaatag cagggagcgg 2940
atgaagagaa ttgaagaggg aattaaggag cttggatctc agattcttaa ggagcaccct 3000
gtggagaaca cccaacttca gaatgaaaag ctctaccttt actaccttca aaacggccgg 3060
gatatgtacg tcgatcagga acttgacatt aaccggttga gcgattatga cgttgaccat 3120
attgtgcccc aatctttcct taaagacgac tctatcgaca ataaagtgct gacgcgcagc 3180
gataaaaatc gcggtaagtc ggataatgtc ccgtcggaag aggtggttaa aaaaatgaag 3240
aactattgga ggcaactcct gaatgccaag ctgatcactc agaggaaatt cgacaatctc 3300
accaaggcag aaaggggtgg acttagcgag ctcgacaagg ccggttttat caaaagacag 3360
ctggtggaga cacgccaaat caccaaacac gttgcccaga tcctggattc gaggatgaac 3420
acgaagtatg acgagaacga caagttgatt agggaagtca aggtcatcac tttgaagtcc 3480
aagctggtga gcgactttcg caaagacttc cagttttaca aagtcaggga aattaataac 3540
taccaccacg cccacgacgc ctaccttaac gccgtggttg gcacagcact catcaagaaa 3600
taccctaagc tcgaatctga gttcgtctat ggcgactata aggtctacga cgttagaaaa 3660
atgatcgcga aatctgagca ggaaataggc aaggcaactg ccaagtactt cttctattcc 3720
aatatcatga acttttttaa gacggagatt accctggcga atggtgagat ccgcaagcgc 3780
cctttgattg agacaaacgg agaaacagga gagatcgtat gggacaaagg gcgggacttt 3840
gctactgtta ggaaggtgct ctctatgcca caagttaaca ttgtcaaaaa aactgaagtg 3900
cagacaggtg ggtttagcaa ggaatctatc aggccgaaga ggaactctga caagctgatc 3960
gcccgcaaga aagattggga cccgaaaaag tacggaggat tcttgtggcc cacagttgcg 4020
tactccgtgc ttgtcgtggc caaagtggag aagggcaagt ctaagaagct caagagcgtc 4080
aaagagttgt tggggatcac gattatggag cggtcgtctt tcgaaaagaa tccgatagat 4140
tttctcgagg ccaagggtta taaagaagtc aagaaggatc ttatcatcaa gctccctaag 4200
tactccctct ttgagcttga aaacggacgg aaaagaatgc tggcttcagc gaagcagctt 4260
cagaagggta atgaactcgc tctgccctca aaatatgtga atttccttta cctggcatca 4320
cactatgaga agcttaaggg gtctccagag gacaacgagc agaagcaact gttcgttgaa 4380
caacacaagc actaccttga cgagattatc gagcaaatca gcgagtttag caagcgcgtt 4440
atactggcag acgcaaatct tgataaggtc cttagcgcct acaacaagca tagagacaaa 4500
cccatccggg agcaggccga gaacattatt catctcttca ccttgacgag gcttggggcc 4560
ccgagagcgt tcaagtactt cgatactacc atagacccaa agcaatatcg gtcgacaaag 4620
gaagttcttg acgccacgct gatccaccaa agtataacag gcctctatga gacacgcatc 4680
gacctttcgc agttgggcgg tgaccgcccc aaaaagaaga ggaaagttgg cgggtgaact 4740
agt 4743
<210> 8
<211> 1576
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 8
Met Ser Glu Val Glu Phe Ser His Glu Tyr Trp Met Arg His Ala Leu
1 5 10 15
Thr Leu Ala Lys Arg Ala Arg Asp Glu Arg Glu Val Pro Val Gly Ala
20 25 30
Val Leu Val Leu Asn Asn Arg Val Ile Gly Glu Gly Trp Asn Arg Ala
35 40 45
Ile Gly Leu His Asp Pro Thr Ala His Ala Glu Ile Met Ala Leu Arg
50 55 60
Gln Gly Gly Leu Val Met Gln Asn Tyr Arg Leu Ile Asp Ala Thr Leu
65 70 75 80
Tyr Ser Thr Phe Glu Pro Cys Val Met Cys Ala Gly Ala Met Ile His
85 90 95
Ser Arg Ile Gly Arg Val Val Phe Gly Val Arg Asn Ser Lys Arg Gly
100 105 110
Ala Ala Gly Ser Leu Met Asn Val Leu Asn Tyr Pro Gly Met Asn His
115 120 125
Arg Val Glu Ile Thr Glu Gly Ile Leu Ala Asp Glu Cys Ala Ala Leu
130 135 140
Leu Cys Asp Phe Tyr Arg Met Pro Arg Arg Val Phe Asn Ala Gln Lys
145 150 155 160
Lys Ala Gln Ser Ser Ile Asn Ser Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Ser
165 170 175
Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Ser
180 185 190
Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Asp Lys Lys Tyr Ser Ile Gly Leu Ala
195 200 205
Ile Gly Thr Asn Ser Val Gly Trp Ala Val Ile Thr Asp Glu Tyr Lys
210 215 220
Val Pro Ser Lys Lys Phe Lys Val Leu Gly Asn Thr Asp Arg His Ser
225 230 235 240
Ile Lys Lys Asn Leu Ile Gly Ala Leu Leu Phe Asp Ser Gly Glu Thr
245 250 255
Ala Glu Arg Thr Arg Leu Lys Arg Thr Ala Arg Arg Arg Tyr Thr Arg
260 265 270
Arg Lys Asn Arg Ile Cys Tyr Leu Gln Glu Ile Phe Ser Asn Glu Met
275 280 285
Ala Lys Val Asp Asp Ser Phe Phe His Arg Leu Glu Glu Ser Phe Leu
290 295 300
Val Glu Glu Asp Lys Lys His Glu Arg His Pro Ile Phe Gly Asn Ile
305 310 315 320
Val Asp Glu Val Ala Tyr His Glu Lys Tyr Pro Thr Ile Tyr His Leu
325 330 335
Arg Lys Lys Leu Val Asp Ser Thr Asp Lys Ala Asp Leu Arg Leu Ile
340 345 350
Tyr Leu Ala Leu Ala His Met Ile Lys Phe Arg Gly His Phe Leu Ile
355 360 365
Glu Gly Asp Leu Asn Pro Asp Asn Ser Asp Val Asp Lys Leu Phe Ile
370 375 380
Gln Leu Val Gln Thr Tyr Asn Gln Leu Phe Glu Glu Asn Pro Ile Asn
385 390 395 400
Ala Ser Gly Val Asp Ala Lys Ala Ile Leu Ser Ala Arg Leu Ser Lys
405 410 415
Ser Arg Arg Leu Glu Asn Leu Ile Ala Gln Leu Pro Gly Glu Lys Lys
420 425 430
Asn Gly Leu Phe Gly Asn Leu Ile Ala Leu Ser Leu Gly Leu Thr Pro
435 440 445
Asn Phe Lys Ser Asn Phe Asp Leu Ala Glu Asp Ala Lys Leu Gln Leu
450 455 460
Ser Lys Asp Thr Tyr Asp Asp Asp Leu Asp Asn Leu Leu Ala Gln Ile
465 470 475 480
Gly Asp Gln Tyr Ala Asp Leu Phe Leu Ala Ala Lys Asn Leu Ser Asp
485 490 495
Ala Ile Leu Leu Ser Asp Ile Leu Arg Val Asn Thr Glu Ile Thr Lys
500 505 510
Ala Pro Leu Ser Ala Ser Met Ile Lys Arg Tyr Asp Glu His His Gln
515 520 525
Asp Leu Thr Leu Leu Lys Ala Leu Val Arg Gln Gln Leu Pro Glu Lys
530 535 540
Tyr Lys Glu Ile Phe Phe Asp Gln Ser Lys Asn Gly Tyr Ala Gly Tyr
545 550 555 560
Ile Asp Gly Gly Ala Ser Gln Glu Glu Phe Tyr Lys Phe Ile Lys Pro
565 570 575
Ile Leu Glu Lys Met Asp Gly Thr Glu Glu Leu Leu Val Lys Leu Asn
580 585 590
Arg Glu Asp Leu Leu Arg Lys Gln Arg Thr Phe Asp Asn Gly Ser Ile
595 600 605
Pro His Gln Ile His Leu Gly Glu Leu His Ala Ile Leu Arg Arg Gln
610 615 620
Glu Asp Phe Tyr Pro Phe Leu Lys Asp Asn Arg Glu Lys Ile Glu Lys
625 630 635 640
Ile Leu Thr Phe Arg Ile Pro Tyr Tyr Val Gly Pro Leu Ala Arg Gly
645 650 655
Asn Ser Arg Phe Ala Trp Met Thr Arg Lys Ser Glu Glu Thr Ile Thr
660 665 670
Pro Trp Asn Phe Glu Glu Val Val Asp Lys Gly Ala Ser Ala Gln Ser
675 680 685
Phe Ile Glu Arg Met Thr Asn Phe Asp Lys Asn Leu Pro Asn Glu Lys
690 695 700
Val Leu Pro Lys His Ser Leu Leu Tyr Glu Tyr Phe Thr Val Tyr Asn
705 710 715 720
Glu Leu Thr Lys Val Lys Tyr Val Thr Glu Gly Met Arg Lys Pro Ala
725 730 735
Phe Leu Ser Gly Glu Gln Lys Lys Ala Ile Val Asp Leu Leu Phe Lys
740 745 750
Thr Asn Arg Lys Val Thr Val Lys Gln Leu Lys Glu Asp Tyr Phe Lys
755 760 765
Lys Ile Glu Cys Phe Asp Ser Val Glu Ile Ser Gly Val Glu Asp Arg
770 775 780
Phe Asn Ala Ser Leu Gly Thr Tyr His Asp Leu Leu Lys Ile Ile Lys
785 790 795 800
Asp Lys Asp Phe Leu Asp Asn Glu Glu Asn Glu Asp Ile Leu Glu Asp
805 810 815
Ile Val Leu Thr Leu Thr Leu Phe Glu Asp Arg Glu Met Ile Glu Glu
820 825 830
Arg Leu Lys Thr Tyr Ala His Leu Phe Asp Asp Lys Val Met Lys Gln
835 840 845
Leu Lys Arg Arg Arg Tyr Thr Gly Trp Gly Arg Leu Ser Arg Lys Leu
850 855 860
Ile Asn Gly Ile Arg Asp Lys Gln Ser Gly Lys Thr Ile Leu Asp Phe
865 870 875 880
Leu Lys Ser Asp Gly Phe Ala Asn Arg Asn Phe Met Gln Leu Ile His
885 890 895
Asp Asp Ser Leu Thr Phe Lys Glu Asp Ile Gln Lys Ala Gln Val Ser
900 905 910
Gly Gln Gly Asp Ser Leu His Glu His Ile Ala Asn Leu Ala Gly Ser
915 920 925
Pro Ala Ile Lys Lys Gly Ile Leu Gln Thr Val Lys Val Val Asp Glu
930 935 940
Leu Val Lys Val Met Gly Arg His Lys Pro Glu Asn Ile Val Ile Glu
945 950 955 960
Met Ala Arg Glu Asn Gln Thr Thr Gln Lys Gly Gln Lys Asn Ser Arg
965 970 975
Glu Arg Met Lys Arg Ile Glu Glu Gly Ile Lys Glu Leu Gly Ser Gln
980 985 990
Ile Leu Lys Glu His Pro Val Glu Asn Thr Gln Leu Gln Asn Glu Lys
995 1000 1005
Leu Tyr Leu Tyr Tyr Leu Gln Asn Gly Arg Asp Met Tyr Val Asp
1010 1015 1020
Gln Glu Leu Asp Ile Asn Arg Leu Ser Asp Tyr Asp Val Asp His
1025 1030 1035
Ile Val Pro Gln Ser Phe Leu Lys Asp Asp Ser Ile Asp Asn Lys
1040 1045 1050
Val Leu Thr Arg Ser Asp Lys Asn Arg Gly Lys Ser Asp Asn Val
1055 1060 1065
Pro Ser Glu Glu Val Val Lys Lys Met Lys Asn Tyr Trp Arg Gln
1070 1075 1080
Leu Leu Asn Ala Lys Leu Ile Thr Gln Arg Lys Phe Asp Asn Leu
1085 1090 1095
Thr Lys Ala Glu Arg Gly Gly Leu Ser Glu Leu Asp Lys Ala Gly
1100 1105 1110
Phe Ile Lys Arg Gln Leu Val Glu Thr Arg Gln Ile Thr Lys His
1115 1120 1125
Val Ala Gln Ile Leu Asp Ser Arg Met Asn Thr Lys Tyr Asp Glu
1130 1135 1140
Asn Asp Lys Leu Ile Arg Glu Val Lys Val Ile Thr Leu Lys Ser
1145 1150 1155
Lys Leu Val Ser Asp Phe Arg Lys Asp Phe Gln Phe Tyr Lys Val
1160 1165 1170
Arg Glu Ile Asn Asn Tyr His His Ala His Asp Ala Tyr Leu Asn
1175 1180 1185
Ala Val Val Gly Thr Ala Leu Ile Lys Lys Tyr Pro Lys Leu Glu
1190 1195 1200
Ser Glu Phe Val Tyr Gly Asp Tyr Lys Val Tyr Asp Val Arg Lys
1205 1210 1215
Met Ile Ala Lys Ser Glu Gln Glu Ile Gly Lys Ala Thr Ala Lys
1220 1225 1230
Tyr Phe Phe Tyr Ser Asn Ile Met Asn Phe Phe Lys Thr Glu Ile
1235 1240 1245
Thr Leu Ala Asn Gly Glu Ile Arg Lys Arg Pro Leu Ile Glu Thr
1250 1255 1260
Asn Gly Glu Thr Gly Glu Ile Val Trp Asp Lys Gly Arg Asp Phe
1265 1270 1275
Ala Thr Val Arg Lys Val Leu Ser Met Pro Gln Val Asn Ile Val
1280 1285 1290
Lys Lys Thr Glu Val Gln Thr Gly Gly Phe Ser Lys Glu Ser Ile
1295 1300 1305
Arg Pro Lys Arg Asn Ser Asp Lys Leu Ile Ala Arg Lys Lys Asp
1310 1315 1320
Trp Asp Pro Lys Lys Tyr Gly Gly Phe Leu Trp Pro Thr Val Ala
1325 1330 1335
Tyr Ser Val Leu Val Val Ala Lys Val Glu Lys Gly Lys Ser Lys
1340 1345 1350
Lys Leu Lys Ser Val Lys Glu Leu Leu Gly Ile Thr Ile Met Glu
1355 1360 1365
Arg Ser Ser Phe Glu Lys Asn Pro Ile Asp Phe Leu Glu Ala Lys
1370 1375 1380
Gly Tyr Lys Glu Val Lys Lys Asp Leu Ile Ile Lys Leu Pro Lys
1385 1390 1395
Tyr Ser Leu Phe Glu Leu Glu Asn Gly Arg Lys Arg Met Leu Ala
1400 1405 1410
Ser Ala Lys Gln Leu Gln Lys Gly Asn Glu Leu Ala Leu Pro Ser
1415 1420 1425
Lys Tyr Val Asn Phe Leu Tyr Leu Ala Ser His Tyr Glu Lys Leu
1430 1435 1440
Lys Gly Ser Pro Glu Asp Asn Glu Gln Lys Gln Leu Phe Val Glu
1445 1450 1455
Gln His Lys His Tyr Leu Asp Glu Ile Ile Glu Gln Ile Ser Glu
1460 1465 1470
Phe Ser Lys Arg Val Ile Leu Ala Asp Ala Asn Leu Asp Lys Val
1475 1480 1485
Leu Ser Ala Tyr Asn Lys His Arg Asp Lys Pro Ile Arg Glu Gln
1490 1495 1500
Ala Glu Asn Ile Ile His Leu Phe Thr Leu Thr Arg Leu Gly Ala
1505 1510 1515
Pro Arg Ala Phe Lys Tyr Phe Asp Thr Thr Ile Asp Pro Lys Gln
1520 1525 1530
Tyr Arg Ser Thr Lys Glu Val Leu Asp Ala Thr Leu Ile His Gln
1535 1540 1545
Ser Ile Thr Gly Leu Tyr Glu Thr Arg Ile Asp Leu Ser Gln Leu
1550 1555 1560
Gly Gly Asp Arg Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Gly Gly
1565 1570 1575
<210> 9
<211> 1765
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 9
gcagcgtgac ccggtcgtgc ccctctctag agataatgag cattgcatgt ctaagttata 60
aaaaattacc acatattttt tttgtcacac ttgtttgaag tgcagtttat ctatctttat 120
acatatattt aaactttact ctacgaataa tataatctat agtactacaa taatatcagt 180
gttttagaga atcatataaa tgaacagtta gacatggtct aaaggacaat tgagtatttt 240
gacaacagga ctctacagtt ttatcttttt agtgtgcatg tgttctcctt tttttttgca 300
aatagcttca cctatataat acttcatcca ttttattagt acatccattt agggtttagg 360
gttaatggtt tttatagact aattttttta gtacatctat tttattctat tttagcctct 420
aaattaagaa aactaaaact ctattttagt ttttttattt aataatttag atataaaata 480
gaataaaata aagtgactaa aaattaaaca aatacccttt aagaaattaa aaaaactaag 540
gaaacatttt tcttgtttcg agtagataat gccagcctgt taaacgccgt cgacgagtct 600
aacggacacc aaccagcgaa ccagcagcgt cgcgtcgggc caagcgaagc agacggcacg 660
gcatctctgt cgctgcctct ggacccctct cgagagttcc gctccaccgt tggacttgct 720
ccgctgtcgg catccagaaa ttgcgtggcg gagcggcaga cgtgagccgg cacggcaggc 780
ggcctcctcc tcctctcacg gcacggcagc tacgggggat tcctttccca ccgctccttc 840
gctttccctt cctcgcccgc cgtaataaat agacaccccc tccacaccct ctttccccaa 900
cctcgtgttg ttcggagcgc acacacacac aaccagatct cccccaaatc cacccgtcgg 960
cacctccgct tcaaggtacg ccgctcgtcc tccccccccc cccctctcta ccttctctag 1020
atcggcgttc cggtccatgg ttagggcccg gtagttctac ttctgttcat gtttgtgtta 1080
gatccgtgtt tgtgttagat ccgtgctgct agcgttcgta cacggatgcg acctgtacgt 1140
cagacacgtt ctgattgcta acttgccagt gtttctcttt ggggaatcct gggatggctc 1200
tagccgttcc gcagacggga tcgatttcat gatttttttt gtttcgttgc atagggtttg 1260
gtttgccctt ttcctttatt tcaatatatg ccgtgcactt gtttgtcggg tcatcttttc 1320
atgctttttt tttgtcttgg ttgtgatgat gtggtgtggt tgggcggtcg ttcattcgtt 1380
ctagatcgga gtagaatact gtttcaaact acctggtgta tttattaatt ttggaactgt 1440
atgtgtgtgt catacatctt catagttacg agtttaagat ggatggaaat atcgatctag 1500
gataggtata catgttgatg tgggttttac tgatgcatat acatgatggc atatgcagca 1560
tctattcata tgctctaacc ttgagtacct atctattata ataaacaagt atgttttata 1620
attattttga tcttgatata cttggatgat ggcatatgca gcagctatat gtggattttt 1680
ttagccctgc cttcatacgc tatttatttg cttggtactg tttcttttgt cgatgctcac 1740
cctgttgttt ggtgttactt ctgca 1765
<210> 10
<211> 253
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 10
gatcgttcaa acatttggca ataaagtttc ttaagattga atcctgttgc cggtcttgcg 60
atgattatca tataatttct gttgaattac gttaagcatg taataattaa catgtaatgc 120
atgacgttat ttatgagatg ggtttttatg attagagtcc cgcaattata catttaatac 180
gcgatagaaa acaaaatata gcgcgcaaac taggataaat tatcgcgcgc ggtgtcatct 240
atgttactag atc 253
<210> 11
<211> 990
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 11
gcaggctgtc gactggatcc aagcttaaga acgaactaag ccggacaaaa aaaggagcac 60
atatacaaac cggttttatt catgaatggt cacgatggat gatggggctc agacttgagc 120
tacgaggccg caggcgagag aagcctagtg tgctctctgc ttgtttgggc cgtaacggag 180
gatacggccg acgagcgtgt actaccgcgc gggatgccgc tgggcgctgc gggggccgtt 240
ggatggggat cggtgggtcg cgggagcgtt gaggggagac aggtttagta ccacctcgcc 300
taccgaacaa tgaagaaccc accttataac cccgcgcgct gccgcttgtg ttggctagga 360
tccatcgcag tcagcgatga gtacagcaag ttttagagct agaaatagca agttaaaata 420
aggctagtcc gttatcaact tgaaaaagtg gcaccgagtc ggtgcttttt tttgagattt 480
ccaaccaggt ccctggagcc catagtctag taacggccgc cagtgtgctg gaattgccct 540
tggatcatga accaacggcc tggctgtatt tggtggttgt gtagggagat ggggagaaga 600
aaagcccgat tctcttcgct gtgatgggct ggatgcatgc gggggagcgg gaggcccaag 660
tacgtgcacg gtgagcggcc cacagggcga gtgtgagcgc gagaggcggg aggaacagtt 720
tagtaccaca ttgcccagct aactcgaacg cgaccaactt ataaacccgc gcgctgtcgc 780
ttgtgtagag accaaaggag gtctcagttt tagagctaga aatagcaagt taaaataagg 840
ctagtccgtt atcaacttga aaaagtggca ccgagtcggt gctttttttt gtcccttcga 900
agggcaattc tgcagatatc catcacactg gcggccgctc gaggtcgacg gtatcgataa 960
gcttgatatc gaattcaccc agctttcttg 990
<210> 12
<211> 1095
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 12
atgtccgaag tggaatttag ccatgaatat tggatgcggc acgccctcac gcttgccaag 60
agagcctggg atgagaggga ggttcccgtc ggtgccgtgt tggtccataa caacagggtg 120
attggggaag gatggaacag acccattggg cgccatgatc caactgccca tgcagagatt 180
atggcgctca ggcaaggggg gttggttatg caaaactacc ggcttattga cgcaaccctg 240
tatgtcaccc ttgaaccctg tgttatgtgc gcgggggcca tgatacactc tcggataggg 300
cgggtggtgt tcggggctcg ggatgctaag accggagctg ctggttccct catggatgtc 360
ttgcatcatc ctggtatgaa ccatagagtc gagattactg aaggcattct cgcagacgaa 420
tgcgctgccc ttctctcaga tttctttaga atgcgcagac aggaaataaa ggctcaaaaa 480
aaagcacaga gttccacgga ttccggcggg tcgagcggtg gcagctccgg ctccgagaca 540
cccggtacga gtgaatccgc tacgcccgaa tcctcggggg gaagctctgg aggctcatca 600
gaagtcgagt tctcccatga gtattggatg aggcacgccc tcactcttgc gaagagggcc 660
agggacgaga gggaggtgcc ggtcggtgct gtcctggtct tgaataacag ggtgataggc 720
gaaggttgga acagggctat tggccttcat gaccctactg ctcatgcgga aatcatggca 780
cttagacagg ggggcctcgt tatgcaaaat taccgcctga tcgacgccac tctttatgtc 840
acatttgaac catgtgttat gtgtgcgggc gctatgatcc attcacgcat aggtcgcgtg 900
gtttttggag ttcgcaacgc gaaaacaggg gctgcaggct ctctgatgga cgttttgcac 960
tatccgggaa tgaaccatag agtcgaaatc acagaaggga ttttggcaga cgaatgcgcg 1020
gctcttcttt gttatttttt cagaatgccc cgccaagtgt ttaatgctca aaagaaagcg 1080
cagagtagca cagac 1095
<210> 13
<211> 501
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 13
atgtcagaag tcgagttctc ccatgagtat tggatgaggc acgccctcac tcttgcgaag 60
agggccaggg acgagaggga ggtgccggtc ggtgctgtcc tggtcttgaa taacagggtg 120
ataggcgaag gttggaacag ggctattggc cttcatgacc ctactgctca tgcggaaatc 180
atggcactta gacagggggg cctcgttatg caaaattacc gcctgatcga cgccactctt 240
tatgtcacat ttgaaccatg tgttatgtgt gcgggcgcta tgatccattc acgcataggt 300
cgcgtggttt ttggagttcg caacagtaaa cgtggggctg caggctctct gatgaacgtt 360
ttgaattatc cgggaatgaa ccatagagtc gaaatcacag aagggatttt ggcagacgaa 420
tgcgcggctc ttctttgtga tttttacaga atgccccgcc aagtgtttaa tgctcaaaag 480
aaagcgcaga gtagcatcaa c 501
<210> 14
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 14
gcggccacaa gctgctcagc ctcggcgacc 30
<210> 15
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 15
gcggccacaa gctgctcagc cccggcgacc 30
<210> 16
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 16
cagcctcacg cccggcagct ccgcggcgcg 30
<210> 17
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 17
cagcctcgcg cccggcagct ccgcggcgcg 30
<210> 18
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 18
gtgcaagaca ggataaacat gtttgagagt a 31
<210> 19
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 19
gtgcaaggcg ggataaacat gtttgagagt a 31
<210> 20
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 20
ccggaccagg gcgatgtcac gtcctccctg c 31
<210> 21
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 21
ccggaccagg gcgatgtcac gccctccctg c 31
<210> 22
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 22
ttgagcaaga gtacaccctc ctccagaagg 30
<210> 23
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 23
ttgagcgagg gtgcaccctc ctccagaagg 30
<210> 24
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 24
ttgagcgggg gtgcaccctc ctccagaagg 30
<210> 25
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 25
caatctccgg gcaatggagc tgtccggccc 30
<210> 26
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 26
caatctccgg gcaatggagc cgcccggccc 30
<210> 27
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 27
atcggacatg gagttcttta cggaata 27
<210> 28
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 28
atcggacgtg gagttcttta cggaata 27
<210> 29
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 29
atcgggcgtg gagttcttta cggaata 27
<210> 30
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 30
tttgtcctct agactattag ctatatg 27
<210> 31
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 31
tttgtcctct agactattag ccatatg 27
<210> 32
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 32
tttgtcctct agaccattag ccatatg 27
<210> 33
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 33
tttgtcctct agaccaccag ccatatg 27
<210> 34
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 34
caaatcctgc atcccattgt gtgtgcac 28
<210> 35
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 35
caaatcctgc atcccattgc gcgtgcac 28
<210> 36
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 36
caaatcctgc atcccattgc gcgcgcac 28
<210> 37
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 37
aagaacgaac taagccggac 20
<210> 38
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 38
gcaggctgtc gactggatcc aagcttaaga acgaactaag cc 42
<210> 39
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 39
caagaaagct gggtgaattc gatatcaagc ttatcgatac cg 42
<210> 40
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 40
cgaattcacc cagctttctt gtacaaagtt ggcattataa ga 42
<210> 41
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 41
cttagttcgt tcttaagctt ggatccagtc gacagcctgc ttttttgtac aaagt 55
<210> 42
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 42
gtgtgccgag gctgagcagc ttg 23
<210> 43
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 43
aaaccaagct gctcagcctc ggc 23
<210> 44
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 44
aaaccggagc tgccgggcgt gagc 24
<210> 45
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 45
gtgtggcaag agtacaccct cctc 24
<210> 46
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 46
aaacgaggag ggtgtactct tgcc 24
<210> 47
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 47
gtgtgcggac agctccattg cccg 24
<210> 48
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 48
aaaccgggca atggagctgt ccgc 24
<210> 49
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 49
tgttggagga cgtgacatcg ccct 24
<210> 50
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 50
aaacagggcg atgtcacgtc ctcc 24
<210> 51
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 51
gtgtgaagac aggataaaca tgtt 24
<210> 52
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 52
aaacaacatg tttatcctgt cttc 24
<210> 53
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 53
gtgtgggaca tggagttctt tacg 24
<210> 54
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 54
aaaccgtaaa gaactccatg tccc 24
<210> 55
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 55
gtgtgggaga agaagacgcg gatc 24
<210> 56
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 56
aaacgatccg cgtcttcttc tccc 24
<210> 57
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 57
gtgtgcacac acaatgggat gcag 24
<210> 58
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 58
aaacctgcat cccattgtgt gtgc 24
<210> 59
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 59
acatggagct gaggctgct 19
<210> 60
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 60
tgagcacgaa gtcgaggag 19
<210> 61
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 61
acgaccagca cgatcacc 18
<210> 62
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 62
tgctagcatg tctgcagctt a 21
<210> 63
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 63
gcgatcatct gttctaccta acct 24
<210> 64
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 64
tcccactgaa aaaccgatca ca 22
<210> 65
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 65
gcacgcatga cttagcaaaa 20
<210> 66
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 66
cctccagatt tgccagctat 20
<210> 67
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 67
aggtgcatcc agcaacaaat 20
<210> 68
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 68
cctccaaatt ggcagatgtt 20
<210> 69
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 69
tgtgtgccat tacagtttcc a 21
<210> 70
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 70
cctgaactcc cttcgggtag 20
<210> 71
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 71
ggaaatgatc cagtcacagg t 21
<210> 72
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 72
tcgggaacaa actccatgac 20
<210> 73
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 73
accattctga tgccaactcc 20
<210> 74
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 74
cgtgtgttgt accggaactg 20
<210> 75
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 75
gccgaggctg agcagcttgt gg 22
<210> 76
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 76
ctcacgcccg gcagctccgc gg 22
<210> 77
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 77
gcaagagtac accctcctcc ag 22
<210> 78
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 78
cggacagctc cattgcccgg ag 22
<210> 79
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 79
gaggacgtga catcgccctg gt 22
<210> 80
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 80
aagacaggat aaacatgttt ga 22
<210> 81
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 81
ggacatggag ttctttacgg aa 22
<210> 82
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 82
ggagaagaag acgcggatcc ac 22
<210> 83
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 83
cacacacaat gggatgcagg at 22
<210> 84
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 84
gtgtgctcac gcccggcagc tccg 24

Claims (5)

1.融合蛋白质，其特征在于：所述融合蛋白质是rBE49b、rBE53、rBE57或rBE65，所述rBE49b为氨基酸序列是序列2的蛋白质，所述rBE53为氨基酸序列是序列4的蛋白质，所述rBE57为氨基酸序列是序列6的蛋白质，所述rBE65为氨基酸序列是序列8的蛋白质。
2.权利要求1所述的融合蛋白质的相关的生物材料，为下述D1）-D4）中至少一种：
D1）编码所述融合蛋白质的核酸分子；
D2）含有D1）所述核酸分子的表达盒；
D3）含有D1）所述核酸分子的重组载体或含有D2）所述表达盒的重组载体；
D4）含有D1）所述核酸分子的重组微生物、含有D2）所述表达盒的重组微生物或含有D3）所述重组载体的重组微生物。
3.根据权利要求2所述的生物材料，其特征在于：D1）所述核酸分子为权利要求1中所述的rBE49b的编码基因、rBE53的编码基因、rBE57的编码基因或rBE65的编码基因；
所述rBE49b的编码基因为编码链的编码序列是序列1的第7-4737位所示的cDNA分子或DNA分子；
所述rBE53的编码基因为编码链的编码序列是序列3的第7-4737所示的cDNA分子或DNA分子；
所述rBE57的编码基因为编码链的编码序列是序列5的第7-4758位所示的cDNA分子或DNA分子；
所述rBE65的编码基因为编码链的编码序列是序列7的第7-4737位所示的cDNA分子或DNA分子。
4.权利要求1所述的融合蛋白质在植物单碱基编辑中的应用，所述植物单碱基编辑为植物基因组上的A定点突变为G，所述植物为水稻。
5.权利要求2或3所述的生物材料在植物单碱基编辑中的应用，所述植物单碱基编辑为植物基因组上的A定点突变为G，所述植物为水稻。
CN202110061201.2A 2020-11-20 2020-11-20 腺嘌呤碱基编辑器及其相关生物材料与应用 Active CN112852791B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110061201.2A CN112852791B (zh) 2020-11-20 2020-11-20 腺嘌呤碱基编辑器及其相关生物材料与应用

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011308944.7A CN112126637B (zh) 2020-11-20 2020-11-20 腺苷脱氨酶及其相关生物材料与应用
CN202110061201.2A CN112852791B (zh) 2020-11-20 2020-11-20 腺嘌呤碱基编辑器及其相关生物材料与应用

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202011308944.7A Division CN112126637B (zh) 2020-11-20 2020-11-20 腺苷脱氨酶及其相关生物材料与应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN112852791A CN112852791A (zh) 2021-05-28
CN112852791B true CN112852791B (zh) 2022-05-24

Family

ID=73852107

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202011308944.7A Active CN112126637B (zh) 2020-11-20 2020-11-20 腺苷脱氨酶及其相关生物材料与应用
CN202110061201.2A Active CN112852791B (zh) 2020-11-20 2020-11-20 腺嘌呤碱基编辑器及其相关生物材料与应用

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202011308944.7A Active CN112126637B (zh) 2020-11-20 2020-11-20 腺苷脱氨酶及其相关生物材料与应用

Country Status (4)

Country Link
JP (1) JP2023550932A (zh)
KR (1) KR20230135047A (zh)
CN (2) CN112126637B (zh)
WO (1) WO2022105190A1 (zh)

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112126637B (zh) * 2020-11-20 2021-02-09 中国农业科学院植物保护研究所 腺苷脱氨酶及其相关生物材料与应用
CN113699135B (zh) * 2021-08-10 2022-05-24 国家卫生健康委科学技术研究所 一种无pam限制的腺嘌呤碱基编辑器融合蛋白及应用
CN114438110B (zh) * 2022-01-25 2023-08-04 浙江大学杭州国际科创中心 一种精确无pam限制的腺嘌呤碱基编辑器及其构建方法
WO2023163806A1 (en) * 2022-02-22 2023-08-31 Massachusetts Institute Of Technology Engineered nucleases and methods of use thereof
CN114606227B (zh) * 2022-02-22 2024-03-08 复旦大学 高精度腺嘌呤碱基编辑器及其应用
WO2023187027A1 (en) * 2022-03-30 2023-10-05 BASF Agricultural Solutions Seed US LLC Optimized base editors
CN115725533B (zh) * 2022-11-18 2023-08-25 中国农业科学院作物科学研究所 一种获得抗草甘膦水稻的方法及其所用双碱基融合编辑系统

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110029096A (zh) * 2019-05-09 2019-07-19 上海科技大学 一种腺嘌呤碱基编辑工具及其用途
WO2019226953A1 (en) * 2018-05-23 2019-11-28 The Broad Institute, Inc. Base editors and uses thereof
CN110607320A (zh) * 2018-11-23 2019-12-24 电子科技大学 一种植物基因组定向碱基编辑骨架载体及其应用
WO2020214842A1 (en) * 2019-04-17 2020-10-22 The Broad Institute, Inc. Adenine base editors with reduced off-target effects

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112126637B (zh) * 2020-11-20 2021-02-09 中国农业科学院植物保护研究所 腺苷脱氨酶及其相关生物材料与应用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2019226953A1 (en) * 2018-05-23 2019-11-28 The Broad Institute, Inc. Base editors and uses thereof
CN110607320A (zh) * 2018-11-23 2019-12-24 电子科技大学 一种植物基因组定向碱基编辑骨架载体及其应用
WO2020214842A1 (en) * 2019-04-17 2020-10-22 The Broad Institute, Inc. Adenine base editors with reduced off-target effects
CN110029096A (zh) * 2019-05-09 2019-07-19 上海科技大学 一种腺嘌呤碱基编辑工具及其用途

Also Published As

Publication number Publication date
CN112126637A (zh) 2020-12-25
CN112126637B (zh) 2021-02-09
JP2023550932A (ja) 2023-12-06
KR20230135047A (ko) 2023-09-22
CN112852791A (zh) 2021-05-28
WO2022105190A1 (zh) 2022-05-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN112852791B (zh) 腺嘌呤碱基编辑器及其相关生物材料与应用
Ma et al. CRISPR/Cas9 platforms for genome editing in plants: developments and applications
CN107027313B (zh) 用于多元rna引导的基因组编辑和其它rna技术的方法和组合物
CN107177625B (zh) 一种定点突变的人工载体系统及定点突变方法
CN112143753A (zh) 一套腺嘌呤碱基编辑器及其相关生物材料与应用
EP3601579B1 (en) Expression modulating elements and use thereof
CN110526993B (zh) 一种用于基因编辑的核酸构建物
WO2018098935A1 (zh) 一种用于植物基因组定点碱基替换的载体
CN112266420B (zh) 一种植物高效胞嘧啶单碱基编辑器及其构建与应用
Yamchi et al. Proline accumulation in transgenic tobacco as a result of expression of Arabidopsis Δ 1-pyrroline-5-carboxylate synthetase (P5CS) during osmotic stress
US20220315938A1 (en) AUGMENTED sgRNAS AND METHODS FOR THEIR USE TO ENHANCE SOMATIC AND GERMLINE PLANT GENOME ENGINEERING
JP2023515116A (ja) ゲノム編集のための新規なｃｒｉｓｐｒ－ｃａｓシステム
KR102516522B1 (ko) 반수체 식물을 유도하는 pPLAⅡη 유전자 및 이의 용도
CN112080513A (zh) 一套编辑范围扩展的水稻人工基因组编辑系统及其应用
EP4243608A1 (en) Fusion protein for editing endogenous dna of a eukaryotic cell
JP2022549430A (ja) Ｄｎａ塩基編集のための方法及び組成物
EP3350329B1 (en) Modifying messenger rna stability in plant transformations
KR20190122595A (ko) 식물의 염기 교정용 유전자 구조체, 이를 포함하는 벡터 및 이를 이용한 염기 교정 방법
CN115851784B (zh) 一种利用Lbcpf1变体构建的植物胞嘧啶碱基编辑系统及其应用
CN116286742B (zh) CasD蛋白、CRISPR/CasD基因编辑系统及其在植物基因编辑中的应用
CN114196644B (zh) 一种蛋白棕榈酰化转移酶dhhc16及其在提高水稻耐盐方面的应用
JP7452884B2 (ja) Ｄｎａが編集された植物細胞を製造する方法、及びそれに用いるためのキット
US20160222395A1 (en) Agrobacterium-mediated genome modification without t-dna integration
US20230272408A1 (en) Plastid transformation by complementation of plastid mutations
CN117126257A (zh) 一种植物耐盐碱性相关的hb20蛋白质及其相关生物材料与应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant