CN110526993B

CN110526993B - 一种用于基因编辑的核酸构建物

Info

Publication number: CN110526993B
Application number: CN201910838286.3A
Authority: CN
Inventors: 不公告发明人
Original assignee: Shandong Shunfeng Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Shandong Shunfeng Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2019-03-06
Filing date: 2019-09-05
Publication date: 2020-06-16
Anticipated expiration: 2039-09-05
Also published as: CN110526993A

Abstract

本发明提供了一种用于基因编辑的核酸构建物，具体地，本发明涉及一种核酸构建物，本发明采用特定结构的核酸构建物，首次在植物中成功实现了sgRNA引导的高效的碱基定点突变(如T突变为C或A突变为G)。

Description

一种用于基因编辑的核酸构建物

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地，涉及一种用于基因编辑的核酸构建物。

背景技术

植物中许多性状的差异由一个或几个DNA碱基的变异造成，突变某些特定碱基可增强、减弱或抑制其某个性状的表达。CRISPR-Cas9基因编辑技术已经广泛应用于动植物基因编辑的研究中，目前主要包括胞嘧啶碱基编辑器(CBE)和腺嘌呤碱基编辑器(ABE)，碱基编辑器能够在基因组中进行精确的碱基改变(如替换)，且不会造成DNA双链断裂(DSB)。早期开发的CBE和ABE系统，分别由大鼠胞苷脱氨酶APOBEC1来源于七鳃鳗的胞苷脱氨酶PmCDA1和由tRNA腺嘌呤脱氨酶进化来的TadA组成，已应用于许多植物物种中，如水稻，小麦，玉米，番茄，拟南芥和甘蓝型油菜。为了进一步提高植物的碱基编辑效率，Kang等人对启动子进行了优化，Zong等人对脱氨酶进行了优化。另一方面，为了扩大基因编辑范围，Qin等和Hua等人利用了不同于SpCas9的其它Cas9蛋白，这些Cas9蛋白的变体可识别与经典NGG基序不一样的PAM序列。然而，相对于目前广泛使用的基因敲除技术，单碱基编辑的效率仍然很低。此外，至今报道的碱基编辑器仅能识别有限的几种PAM序列，使得植物基因组中可编辑的范围受到很大的限制。

因此，本领域迫切需要开发一种在植物细胞中可高效、可在较大范围内且精确地实现A-G转化同时显著降低插入或缺失突变风险的新的用于基因编辑的核酸构建物。

发明内容

本发明的目的在于提供一种在植物细胞中可高效、可在较大范围且精确地实现A-G转化同时显著降低插入或缺失突变风险的新的用于基因编辑的核酸构建物。

本发明第一方面提供了一种核酸构建物，所述核酸构建物具有5’-3’(5’至3’)的式I结构：

I1-Z1-Z2-I2 (I)

式中，

I1为第一整合元件；

I2为第二整合元件；

Z1为第一表达盒；

Z2为第二表达盒；

并且，Z1和Z2中的一个表达盒具有Ia结构，而另一个表达盒具有式Ib结构：

P1-S1-X1-L1-X2-L2-X3 (Ia)

P2-Y1 (Ib)；

式中，

P1、S1、X1、L1、X2、L2、X3、P2、Y1分别为用于构成所述构建物的元件；

P1为第一启动子，所述第一启动子为RNA聚合酶II依赖的启动子；

S1为核定位信号的编码序列；

X1为腺嘌呤脱氨酶(如野生型和/或突变型TadA)的编码序列；

L1为无或第一连接肽的编码序列；

X2为Cas9核酸酶的编码序列，所述的Cas9核酸酶是无切割活性或单链切割活性的；

L2为无或第二连接肽的编码序列；

X3为核定位信号的编码序列；

P2为第二启动子；

Y1为sgRNA的编码序列；

并且，各“-”为键或核苷酸连接序列。

在另一优选例中，所述第一启动子来源于选自下组的一种或多种植物：玉米、水稻、大豆、拟南芥或番茄。

在另一优选例中，所述第一启动子来源于选自下组的一种或多种微生物：链霉菌、大肠杆菌。

在另一优选例中，所述第一启动子来源于选自下组的一种或多种病毒：烟草花叶病毒、黄叶卷曲病毒、花椰菜花叶病毒、棉花曲叶病毒。

在另一优选例中，所述第一启动子包括玉米泛素启动子。

在另一优选例中，所述泛素启动子包括UBI启动子。

在另一优选例中，所述第一启动子选自下组：UBI、UBQ、35S、Actin、SPL，CmYLCV、YAO、CDC45、rbcS、rbcL、PsGNS2、UEP1、TobRB7、Cab、或其组合。

在另一优选例中，所述的L1和L2的核苷酸序列长度各自独立地为3-120nt,较佳的为3-96nt，并且优选为3的倍数。

在另一优选例中，所述的L1和L2编码的氨基酸序列长度各自独立的为3-40aa，较佳的为6-32aa，较佳的为18-32aa，较佳的为24-32aa。

在另一优选例中，所述的核苷酸连接序列长度为1-300nt，较佳地1-100nt。

在另一优选例中，所述核苷酸连接序列不影响各元件的正常转录和翻译。在另一优选例中，所述Cas9核酸酶选自下组：Cas9n、Cas9NG、或其组合。

在另一优选例中，所述Cas9核酸酶选自下组：SpCas9n(D10A)、nSpCas9NG、SaCas9n、ScCas9n、SqCas9n、XCas9n、或其组合。

在另一优选例中，所述Cas9核酸酶包括突变的Cas9核酸酶。

在另一优选例中，所述的Cas9核酸酶与所述的突变的Cas9核酸酶的相同性≥80％，较佳地≥90％；更佳地≥95％，更佳地，≥98％或99％。

在另一优选例中，所述的突变Cas9核酸酶与野生型Cas9酶的活性相当或显著优于野生型Cas9酶的活性。

在另一优选例中，所述突变Cas9核酸酶由所述的野生型的Cas9核酸酶经过一个或多个，较佳地1-15个，较佳地1-10个，较佳的1-7个，更佳地2-5个，氨基酸取代、缺失；和/或

经过1-5，较佳地1-4个，更佳地1-3个，最佳地1-2个氨基酸的添加形成的。

在另一优选例中，所述X2元件中，突变位点在Cas9核酸酶(SEQ ID NO.:2)的D10A位；

MDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGD(SEQ ID NO.:2)。

在另一优选例中，所述X2元件在Cas9核酸酶的对应于SEQ ID NO.:2的选自下组的一个或多个位点发生突变：

第1335位精氨酸(R)；

第1111位亮氨酸(L)；

第1135位天冬氨酸(D)；

第1218位甘氨酸(G)；

第1219位谷氨酸(E)；

第1322位的丙氨酸(A)；

第1337位的苏氨酸(T)。

在另一优选例中，所述第1335位精氨酸(R)突变为丙氨酸(A)；和/或

第1111位亮氨酸(L)突变为精氨酸(R)；和/或

第1135位天冬氨酸(D)突变为缬氨酸(V)；和/或

第1218位甘氨酸(G)突变为精氨酸(R)；和/或

第1219位谷氨酸(E)突变为苯丙氨酸(F)；和/或

第1322位的丙氨酸(A)突变为精氨酸(R)；和/或

第1337位的苏氨酸(T)突变为精氨酸(R)。

在另一优选例中，所述突变选自下组：R1335A；L1111R；D1135V；G1218R；E1219F；A1322R；T1337R。

在另一优选例中，所述X2元件的氨基酸序列如SEQ ID NO.:3所示；

MDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESIRPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFVSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASARFLQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPRAFKYFDTTIDRKVYRSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGD(SEQ ID NO.:3)。

在另一优选例中，所述X2元件来源于细菌。

在另一优选例中，所述X2元件来源选自下组：酿脓链球菌(Streptococcuspyogenes)、葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、犬链球菌(Streptococcus canis)、或其组合。

在另一优选例中，所述第一连接肽的编码序列、第二连接肽的编码序列各自独立地包括XTEN。

在另一优选例中，所述第一连接肽的编码序列、第二连接肽的编码序列如SEQ IDNO.:4或7所示。

在另一优选例中，所述核定位信号为密码子优化的核定位信号。

在另一优选例中，所述核定位信号为植物密码子优化的核定位信号。

在另一优选例中，所述核定位信号包括bpNLS。

在另一优选例中，所述核定位信号为bpNLS。

在另一优选例中，所述X3元件的核苷酸序列如SEQ ID NO.:5所示。

在另一优选例中，所述腺嘌呤脱氨酶包括野生型和突变型。

在另一优选例中，所述腺嘌呤脱氨酶包括野生型和/或突变型的TadA。

在另一优选例中，所述腺嘌呤脱氨酶包括TadA。

在另一优选例中，所述腺嘌呤脱氨酶的突变型包括TadA7-10。

在另一优选例中，所述腺嘌呤脱氨酶为串联型腺嘌呤脱氨酶，所述串联型腺嘌呤脱氨酶结构如式II所示：

Z8-L8-Z9(II)

其中，

Z8为野生型的腺嘌呤脱氨酶TadA的氨基酸序列；

L8为任选的连接肽序列；

Z9为突变型的腺嘌呤脱氨酶TadA7-10的氨基酸序列。

在另一优选例中，所述腺嘌呤脱氨酶为密码子优化的腺嘌呤脱氨酶。

在另一优选例中，所述腺嘌呤脱氨酶为植物密码子优化的腺嘌呤脱氨酶。

在另一优选例中，所述腺嘌呤脱氨酶的编码序列选自下组：

(i)序列如SEQ ID NO.:1所示的多核苷酸；

(ii)核苷酸序列与SEQ ID NO.:1所示序列的同源性≥75％(较佳地≥85％，更佳地≥90％或≥95％或≥98％或≥99％)的多核苷酸；

(iii)在SEQ ID NO.:1所示多核苷酸的5'端和/或3'端截短或添加1-60个(较佳地1-30，更佳地1-10个)核苷酸的多核苷酸；

(iv)与(i)-(iii)任一所述的多核苷酸互补的多核苷酸。

在另一优选例中，所述腺嘌呤脱氨酶的编码序列如SEQ ID NO.1所示。

在另一优选例中，所述腺嘌呤脱氨酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.:8所示。

在另一优选例中，所述第二启动子来源于选自下组的一种或多种植物：水稻、玉米、大豆、拟南芥或番茄。

在另一优选例中，所述第二启动子来源于选自下组的一种或多种微生物：链霉菌、大肠杆菌。

在另一优选例中，所述第二启动子来源于选自下组的一种或多种病毒：烟草花叶病毒、黄叶卷曲病毒、花椰菜花叶病毒、棉花曲叶病毒。

在另一优选例中，所述第二启动子包括RNA聚合酶III依赖的启动子。

在另一优选例中，所述第二启动子为RNA聚合酶III依赖的启动子。

在另一优选例中，所述第二启动子选自下组：U6、U3、U6a、U6b、U6c、U6-1、U3b、U3d、U6-26、U6-29、H1、或其组合。

在另一优选例中，所述第二启动子包括U6启动子。

在另一优选例中，所述第二启动子选自下组：OsU6、OsU3、OsU6a、OsU6b、OsU6c、AtU6-1、AtU3b、AtU3d、AtU6-1、AtU6-26、AtU6-29、或其组合。

在另一优选例中，所述的“无切割活性或单链切割活性”指Cas9核酸酶对于靶位点T所在的单链无切割活性。

在另一优选例中，本发明的上述核苷酸元件是按阅读框(in-frame)连接的，从而表达氨基酸序列正确的融合蛋白。

在另一优选例中，所述的构建物具有式IIa或式IIb结构：

I1-P1-S1-X1-L1-X2-L2-X3-P2-Y1-I2 (IIa)；

I1-P2-Y1-P1-S1-X1-L1-X2-L2-X3-I2 (IIb)；

式中，各元件的定义如上所述。

在另一优选例中，所述的第一表达盒和第二表达盒均具有终止子。

在另一优选例中，所述的第一表达盒和第二表达盒共用相同的终止子。

在另一优选例中，所述终止子包括适用于植物基因编辑的终止子。

在另一优选例中，所述终止子选自下组：NOS、Poly A、T-UBQ、rbcS、或其组合。

在另一优选例中，所述终止子的核苷酸序列如SEQ ID NO.:6所示。

在另一优选例中，所述第一整合元件包括5’同源臂序列。

在另一优选例中，所述第二整合元件包括3’同源臂序列。

在另一优选例中，所述核酸构建物的长度为3000-10000bp，较佳地，4000-8500bp，更佳地，4000-6000bp。

在另一优选例中，在所述的I1和I2元件之间，还含有额外插入的一个或多个额外的表达盒。

在另一优选例中，所述的额外表达盒是独立于所述的第一表达盒和第二表达盒的。

在另一优选例中，所述的额外表达盒表达选自下组的物质：

(a1)标记基因；

(a2)与Y1编码的sgRNA不同的一种或多种sgRNA。

在另一优选例中，所述标记基因包括抗性基因(如潮霉素抗性基因、除草剂抗性基因)、荧光基因、或其组合。

本发明第二方面提供了一种融合蛋白，所述的融合蛋白包括腺嘌呤脱氨酶和Cas9核酸酶，并且所述融合蛋白由本发明第一方面所述的核酸构建物编码。

本发明第三方面提供了一种载体，所述载体含有本发明第一方面所述的核酸构建物。

在另一优选例中，所述载体为植物表达载体。

在另一优选例中，所述的载体为可转染或转化植物细胞的表达载体。

在另一优选例中，所述的载体为农杆菌Ti载体。

在另一优选例中，所述的构建物整合到所述载体的T-DNA区。

在另一优选例中，所述载体是环状的或线性的。

本发明第四方面提供了一种基因工程细胞，所述细胞含有本发明第一方面所述的核酸构建物，或其基因组整合有一个或多个本发明第一方面所述的核酸构建物。

在另一优选例中，所述的细胞为植物细胞。

在另一优选例中，所述的植物选自下组：单子叶植物、双子叶植物、裸子植物、或其组合。

在另一优选例中，所述的植物选自下组：禾本科植物、豆科植物、十字花科植物、茄科、伞形科、或其组合。

在另一优选例中，所述的植物包括：拟南芥、小麦、大麦、燕麦、玉米、水稻、高粱、粟、大豆、花生、烟草、番茄、白菜、油菜、菠菜、生菜、黄瓜、茼蒿、空心菜、芹菜、油麦菜、或其组合。

在另一优选例中，所述的基因工程细胞是用选自下组的方法将权利要求1所述的核酸构建物导入细胞的：农杆菌转化法、基因枪法、显微注射法、电击法、超声波法和聚乙二醇(PEG)介导法。

本发明第五方面提供了一种用于基因编辑的试剂组合，包括：

(i)第一核酸构建物，或含有所述第一核酸构建物的第一载体，所述第一核酸构建物具有从5’-3’的式Ia结构：

P1-S1-X1-L1-X2-L2-X3 (Ia)

其中，

S1为核定位信号的编码序列；

X1为腺嘌呤脱氨酶(如野生型和/或突变型TadA)的编码序列；

L1为无或第一连接肽的编码序列；

L2为无或第二连接肽的编码序列；

X3为核定位信号的编码序列；

并且，“-”为键或核苷酸连接序列；和

(ii)第二核酸构建物，或含有所述第二核酸构建物的第二载体，所述第二核酸构建物具有从5’-3’的式Ib所示的结构：

P2-Y1 (Ib)；

其中，P2为第二启动子；

Y1为sgRNA的编码序列；

并且，“-”为键或核苷酸连接序列。

在另一优选例中，所述第一载体和所述第二载体为不同的载体。

在另一优选例中，所述第一核酸构建物和所述第二核酸构建物位于不同的载体上。

在另一优选例中，所述第一载体和所述第二载体为相同的载体。

在另一优选例中，所述第一核酸构建物和所述第二核酸构建物位于相同的载体上。

本发明第六方面提供了一种试剂盒，所述试剂盒含有本发明第五方面所述的试剂组合。

在另一优选例中，所述试剂盒还含有标签或说明书。

本发明第七方面提供了一种对植物进行基因编辑的方法，包括步骤：

(i)提供待编辑植物；和

(ii)将本发明第一方面所述的核酸构建物、本发明第三方面所述的载体或本发明第五方面所述的试剂组合导入所述待编辑植物的植物细胞，从而在所述植物细胞内进行基因编辑。

在另一优选例中，所述导入为通过农杆菌导入。

在另一优选例中，所述导入为通过基因枪导入。

在另一优选例中，所述的基因编辑为定点碱基替换(或突变)。

在另一优选例中，所述定点替换(或突变)包括将A突变为G。

在另一优选例中，所述的植物包括任何可进行转化技术的高等植物类型，包括单子叶植物、双子叶植物和裸子植物。

本发明第八方面提供了一种制备经基因编辑的植物细胞的方法，包括步骤：

将本发明第一方面所述的核酸构建物、本发明第三方面所述的载体或本发明第五方面所述的试剂组合转染植物细胞，使得所述植物细胞中的染色体发生定点替换(或突变)，从而制得所述经基因编辑的植物细胞。

在另一优选例中，所述的转染采用农杆菌转化法或基因枪轰击法。

本发明第九方面提供了一种本发明第一方面所述的核酸构建物本发明第二方面所述的融合蛋白、本发明第三方面所述的载体、本发明第四方面所述的基因工程细胞、本发明第五方面所述的试剂组合、本发明第六方面所述的试剂盒的用途，用于对植物进行基因编辑。

本发明第十方面提供了一种制备经基因编辑的植物的方法，包括步骤：

将本发明第八方面或本发明第九方面所述方法制备的所述经基因编辑的植物细胞再生为植物体，从而获得所述经基因编辑的植物。

本发明第十一方面提供了一种经基因编辑的植物，所述的植物是用本发明第十方面所述的方法制备的。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了ABE-nCas9和ABEmax-nCas9对ALS基因的编辑效率。

图2显示了ABE-nCas9、ABEmax-nCas9和ABEmax-nCas9NG在不同PAM位点对ALS基因的编辑效率。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入地研究，通过优化腺嘌呤碱基编辑器元件的质量和数量，采用双核定位信号、优化的腺嘌呤脱氨酶、不同的Cas9核酸酶，构建了一种在植物基因编辑中更加高效、识别范围更宽的腺嘌呤碱基编辑工具，本发明首次在植物中成功实现了sgRNA引导的碱基定点突变(如A突变为G)，并且突变效率非常高(可高达≥40％或更高)，可识别更多的PAM位点(包括NGG,NG)，同时indel比例很低。并在此基础上完成了本发明。

术语

如本文所用，术语“同源臂”指打靶载体上待插入的外源序列两侧的与基因组序列完全一致的侧翼序列，用于识别并发生重组的区域。

如本文所用，术语“植物启动子”指能够在植物细胞中启动核酸转录的核酸序列。该植物启动子可以是来源于植物、微生物(如细菌、病毒)或动物等，或者是人工合成或改造过的启动子。

如本文所用，术语“基因编辑”或“碱基突变”或“碱基编辑”指核苷酸序列的某一位置处发生碱基的替换(substitution)、插入(insertion)和/或缺失(deletion)。本发明中所述“编辑”或“突变”优选为单碱基突变。

如本文所用，术语“碱基替换”指核苷酸序列的某一位置处的碱基突变为另一不同的碱基，比如A突变为G。

如本文所用，术语“A.T到G.C”指在双链核酸序列(尤其是基因组序列)中，某一位置上的A-T碱基对突变为或替换为G-C碱基对。

如本文所用，术语“Cas蛋白”指一种核酸酶。一种优选的Cas蛋白是Cas9蛋白。典型的Cas9蛋白包括(但并不限于)：来源于酿脓链球菌(Streptococcuspyogenes)的Cas9。在本发明中，Cas9蛋白为突变的Cas9蛋白，具体地，是无切割活性或只具有单链切割活性的突变的Cas9蛋白。在一优选实施方式中，本发明的Cas9蛋白包括SpCas9n(D10A)、nSpCas9NG、SaCas9n、ScCas9n、XCas9n。

如本文所用，术语“Cas蛋白的编码序列”指编码Cas蛋白的核苷酸序列。在插入的多聚核苷酸序列被转录和翻译从而产生功能性Cas蛋白的情况下，技术人员会认识到，因为密码子的简并性，有大量多聚核苷酸序列可以编码相同的多肽。另外，技术人员也会认识到不同物种对于密码子具有一定的偏好性，可能会根据在不同物种中表达的需要，会对Cas蛋白的密码子进行优化，这些变异体都被术语“Cas蛋白的编码序列”所具体涵盖。此外，术语特定地包括了全长的、与Cas基因序列基本相同的序列，以及编码出保留Cas蛋白功能的蛋白质的序列。

在本发明中，核苷酸序列的描述是从5’至3’方向，除非特别注明。

腺嘌呤脱氨酶

如本文所用，术语“腺嘌呤脱氨酶”指TadA腺嘌呤脱氨酶，来源于大肠杆菌，原本作用于tRNA，能够对tRNA中的特定腺嘌呤进行脱氨反应。

在本发明中，适用的TadA既包含野生型的形式也包含其特定的突变形式TadA7-10，也可包含野生型的形式和突变形式的组合。TadA7-10能够以DNA作为底物进行脱氨反应。

在另一优选例中，本发明的腺嘌呤脱氨酶的编码序列是对密码子进行优化的，从而能够更高效地在植物中表达。

本发明的构建物

本发明提供了一种核酸构建物，用于对植物进行基因编辑，所述的核酸构建物具有5’-3’的式I结构：

I1-Z1-Z2-I2 (I)

式中，

I1为第一整合元件；

I2为第二整合元件；

Z1为第一表达盒；

Z2为第二表达盒；

P1-S1-X1-L1-X2-L2-X3 (Ia)

P2-Y1 (Ib)；

I1、P1、S1、X1、L1、X2、L2、X3、P2、Y1、I2分别为用于构成所述构建物的元件，其定义如本发明第一方面所述；

并且，各“-”为键或核苷酸连接序列。

在上述式I结构中，I1元件(或左侧整合元件)和I2元件(或右侧整合元件)可协同作用，从而将位于其间的元件(即从P1至Y1的核苷酸序列)整合到植物细胞的基因组中。

代表性的I1和I2是来自于农杆菌的Ti元件。当然，其他可起到类似整合作用的元件也可用于本发明。

本发明的构建物中所用的各种元件或者是本领域中已知的，或者可用本领域技术人员已知的方法制备。例如，可通过常规方法，如PCR方法、全人工化学合成法、酶切方法获得相应的元件，然后通过熟知的DNA连接技术连接在一起，就形成了本发明的构建物。

将本发明的构建物插入外源载体(尤其是适合转基因植物操作的载体)，就构成了本发明的载体。

将本发明的载体转化植物细胞从而介导本发明的载体对植物细胞染色体进行整合，并在植物体内表达，制得经基因编辑的植物细胞。

将本发明的经基因编辑的植物细胞再生为植物体，从而获得经基因编辑的植物。

将本发明构建好的上述核酸构建物，通过常规的植物重组技术(例如农杆菌转让技术)，可以导入植物细胞，从而获得携带所述核酸构建物(或带有所述核酸构建物的载体)的植物细胞，或获得基因组中整合有所述核酸构建物的植物细胞。

本发明中整合有所述核酸构建物的植物个体，在其子代可通过常规筛选或采用本领域已知的其他手段进行分离或去除，从而制得经基因编辑且不含有核酸构建物的植物体。

具体地，本发明是将一种优化过的腺嘌呤脱氨酶表达盒构建于植物的CRISPR/Cas9系统中，腺嘌呤脱氨酶可将靶DNA中的腺嘌呤(A)脱氨基转变为肌苷(I)，肌苷可与胞嘧啶配对，在DNA水平被当成鸟嘌呤(G)进行读码与复制，实现在突变窗口内A到G的突变。

核酸构建物的基本结构如下：

原有的ABE系统中，脱氨酶表达盒为ZmUbi-ecTadA-32aa linker-ecTadA(7.10)-32aa linker-nSpCas9/nSaCas9-SV40NLS-NOS

一级优化后：

OsU6-sgRNA-ZmUbi-bpNLS-OptimizedABE7.10-linker-nCas9-bpNLS-NOS

二级优化后：

ABEmax-nCas9NG:

OsU6-sgRNA-ZmUbi-bpNLS-OptimizedABE7.10-linker-nCas9NG-bpNL S-NOS

载体构建

该载体的主要特征是将腺嘌呤脱氨基酶与CRISPR/Cas系统中的Cas蛋白以及核定位信号bpNLS的编码序列连接在一起，从而形成融合蛋白的编码序列。当该编码序列所编码的融合蛋白在细胞质中表达后，所述的融合蛋白可以非常高效地被转移至细胞核内，并由式I构建物所编码的guide RNA引导至基因组中的靶点位置，从而在靶点位置进行A.T到G.C的碱基替换，并基本上避免或消除了发生插入/缺失的风险。

由于腺嘌呤脱氨基酶直接将A突变为G，并不需要Cas蛋白的DNA双链切割活性。因此，在本发明中Cas蛋白是无切割活性或具有单链切割活性的突变的Cas蛋白。在一优选实施方式中，本发明的Cas蛋白可以是Cas9(D10A)，其氨基酸序列如SEQ ID NO.:2所示。在一优选实施方式中，本发明的Cas蛋白可以是Cas9NG，其氨基酸序列如SEQ ID NO.:3所示。一般的，为了增加融合蛋白的活性，蛋白间一般通过一些柔性短肽连接，即Linker(连接肽序列)。优选的，该Linker可以选用XTEN，其编码序列如SEQ ID NO.:4所示。

在本发明中，合适的启动子包括组成型和/或诱导型启动子。优选地，为了增加效率，可以选择适用于植物细胞的强启动子，代表性的例子包括(但并不限于)：CaMV 35S启动子或者UBI启动子或Actin启动子等。

选择适用于植物细胞的guide RNA的表达框，并将其与上述融合蛋白的开放表达框(ORF)构建在同一载体。

靶点设计

在本发明中，当腺嘌呤脱氨基酶通过CRISPR/Cas9系统引导至靶点位置后，脱氨基酶的作用区域就被固定的。

例如，将腺嘌呤脱氨基酶TadA或突变型的腺嘌呤脱氨基酶TadA7-10蛋白通过32个氨基酸的XTEN Linker连接至Cas9的N端后，本发明得到的实验结果表明，本发明的各种Cas蛋白的编辑窗口差别不大，均为PAM位点前20个碱基范围内，较佳的热点区域在3－10个碱基范围内。

遗传转化

在本发明中，对于将本发明的式I构建物导入细胞或整合到基因组的方法，没有特别限制。可以用常规的方法进行，例如将式I构建物或相应的载体通过合适的方法导入到植物细胞中。代表性的导入方法包括但并不限于：农杆菌转染法、基因枪法、显微注射法、电击法、超声波法、和聚乙二醇(PEG)介导法等。

在本发明中，对于受体植物没有特别限制，其中包括各种不同的农作物植物(如禾本科植物)、林业植物、园艺植物(如花卉植物)等。代表性的例子包括但不限于：水稻、大豆、番茄、玉米、烟草、小麦、高粱、马铃薯等。

上述DNA载体或片段导入植物细胞后，使转化的植物细胞中的DNA表达该融合蛋白和gRNA。融合腺嘌呤脱氨基酶的Cas蛋白在相应gRNA的引导下，将靶点位置的A突变为G(进而使得互补链的T突变为C)。

对于用本发明方法进行植物基因组定点替换后的植物细胞或组织或器官，可以用常规方法再生获得相应的经基因编辑的植株。例如，通过组织培养，再生获得碱基替换后的植株。

密码子优化

在本发明中，对腺嘌呤脱氨酶的编码序列进行密码子优化，尤其是植物密码子优化。

遗传密码有64种，但绝大多数倾向于利用这些密码子中的一部分。那些最被频繁利用的称为偏爱密码子或最佳密码子，那些不被经常利用的称为稀有或利用率低的密码子。实际上利用蛋白表达或生产的每种生物都表现出某种程度的密码子利用的差异或偏爱。利用偏爱密码子并避免利用率低的或稀有的密码子进行基因合成，基因的这种重设称为密码子优化。

本发明中，对腺嘌呤脱氨酶、核定位信号的氨基酸序列进行了密码子优化，采用真核细胞偏爱的密码子进行优化，优选的，采用动物细胞偏爱的密码子进行优化，更优选的，采用植物细胞偏爱的密码进行优化。

应用

本发明可以用于植物基因工程领域，用于植物研究和育种，尤其是具有经济价值的农作物、林业作物或园艺植物的遗传改良。

本发明的主要优点包括：

(1)本发明首次将Cas9核酸酶(如Cas9或Cas9NG)与优化的腺嘌呤脱氨酶、双核定位信号构成融合蛋白，在植物中成功实现了sgRNA引导的碱基定点突变(如A突变为G)，并且突变效率非常高(可高达≥40％或更高)，同时显著降低或基本上消除在靶位点发生插入和/或缺失(indel)的风险。

(2)本发明可以通过使用不同形式的Cas9，扩大植物基因组中可被定点编辑的范围。

(3)本发明首次发现，本发明的Cas9NG可识非NGG(比如NG)的PAM，并可获得非常高效的碱基编辑效率。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。本发明中所涉及的实验材料和试剂如无特殊说明均可从市售渠道获得。

实施例1利用ABEmax-nCas9提高A到G的碱基编辑效率

具体操作流程如下：

1.1载体构建

ABE-nCas9编辑器构建

具体参见文献Hua K,Tao X,Yuan F,Wang D and Zhu J(2018)Precise A.T toG.C Base Editing in the Rice Genome.MOL PLANT11:627-630.

ABEmax-nCas9编辑器构建

(1)通过南京金斯瑞公司合成bis-bpNLS，密码子优化的ABE7.10和由96个碱基组成桥梁序列。

(2)利用KpnI和HindIII限制性酶切位点用合成的序列替换原有ABE编辑器中的ecTadA-linker-ecTadA(7.10)-linker-Cas9-SV40NLS(Hua et al.,2018)。

1.2sgRNA设计

针对水稻ALS基因设计合成sgRNA，

ALS-sg3：CGCATTCAAGGACATGATCCTGG(SEQ ID NO.:9)

ALS-sg1：GCGCCCCCACTTGGGATCATAGG(SEQ ID NO.:10)

1.3水稻遗传转化过程

包含碱基编辑器和潮霉素抗性基因的核酸构建物(pCambia1300)导入农杆菌EHA105，然后转化水稻愈伤组织，水稻的转化、组织培养、植株生长过程按照文献中记载过程执行。(Nishimura et al.,2006；Wang et al.,2015).

1.4植株处理和碱基编辑效率的检测

从每一株转基因植株中取2-3片叶子，并从中分离出基因组DNA。靶标位点由PCR技术扩增，然后通过Sanger测序分析。测序峰图通过DSDecodeM网站分解出具体的DNA序列。测序峰图复杂的样品再通过TA克隆测序进一步验证。碱基编辑效率为靶标位点实现预期碱基替换的植株数量与鉴定的植株总数的百分比。用于PCR和测序的引物列在表S2-S3中。

表S2.用于扩增再生稻苗中靶位点的PCR引物

表S3.用于对靶PCR产物进行测序的引物。

1.5实验结果

ABE-nCas9在靶位点产生A到G突变的效率约20％，而ABEmax-nCas9的效率约40％-50％，具体结果见图1。

1.5实验结论

ABEmax-nCas9的编辑效率高达40％,比ABE-nCas9的编辑效率提高了一倍,结果表明，优化后的ABEmax-nCas9碱基编辑器可高效的应用于植物基因组的定点碱基替换。

实施例2利用ABEmax-nCas9NG扩大碱基编辑范围

1、载体构建

采用Mut

MultiS多重定点突变试剂盒(南京诺唯赞)在nSpCas9(D10A)的基础上获得nSpCas9-NG，共包含7个氨基酸的替换R1335A/L1111R/D1135V/G1218R/E1219F/A1322R/T1337R。突变后的序列通过BamHI和SpeI限制性酶切位点替换ABEmax-nCas9编辑器中的nSpCas9(D10A)片段，获得了ABEmax-nCas9NG编辑器。

为了验证ABEmax-nCas9NG编辑器在非传统的以NGG作为PAM基序的编辑可行性，在水稻EPSPS和ALS基因各设计了一条sgRNA(EPSPS-sg2：GAGAAGGATGCGAAAGAGGAAGT(SEQ IDNO.:17)和ALS-sg4：TAACAAAGAAGAGTGAAGTCCGT(SEQ ID NO.:18)，分别以AGT和CGT作为PAM基序。遗传转化以及碱基编辑效率检测参考实施例1中的1.2和1.3。转基因植株的鉴定结果表明，在EPSPS靶位点出现A到G碱基替换的植株超过40％，而在ALS靶位点出现A到G碱基替换的植株也将近10％(图2)。这些实验结果表明，ABEmax-nCas9NG碱基编辑器可以NGN作为PAM基序有效的进行碱基替换，在植物基因组中极大的扩大了碱基编辑的范围。

参考文献

1.Hua K,Tao X,Yuan F,Wang D and Zhu J(2018)Precise A.T to G.C BaseEditing in the Rice Genome.MOL PLANT 11:627-630.

2.Koblan LW,Doman JL,Wilson C,Levy JM,Tay T,Newby GA,Maianti JP,Raguram A and Liu DR(2018)Improving cytidine and adenine base editors byexpression optimization and ancestral reconstruction.NAT BIOTECHNOL36:843-846.

3.Nishimasu H,Shi X,Ishiguro S,Gao L,Hirano S,Okazaki S,Noda T,Abudayyeh OO,Gootenberg JS,Mori H,Oura S,Holmes B,Tanaka M,Seki M,Hirano H,Aburatani H,Ishitani R,Ikawa M,Yachie N,Zhang F and Nureki O(2018)EngineeredCRISPR-Cas9 nuclease with expanded targeting space.SCIENCE 361:1259-1262.

4.Hu,J.H.,Miller,S.M.,Geurts,M.H.,Tang,W.,Chen,L.,Sun,N.,Zeina,C.M.,Gao,X.,Rees,H.A.,Lin,Z.,et al.(2018).Evolved Cas9 variants with broad PAMcompatibility and high DNA specificity.Nature 556,57-63.

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 山东舜丰生物科技有限公司

<120> 一种用于基因编辑的核酸构建物

<130> P2019-1321

<150> CN201910169340.X

<151> 2019-03-06

<160> 18

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1092

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 1

tctgaagtcg agtttagcca cgagtattgg atgaggcacg cactgaccct ggcaaagcga 60

gcatgggatg aaagagaagt ccccgtgggc gccgtgctgg tgcacaacaa tagagtgatc 120

ggagagggat ggaacaggcc aatcggccgc cacgacccta ccgcacacgc agagatcatg 180

gcactgaggc agggaggcct ggtcatgcag aattaccgcc tgatcgatgc caccctgtat 240

gtgacactgg agccatgcgt gatgtgcgca ggagcaatga tccacagcag gatcggaaga 300

gtggtgttcg gagcacggga cgccaagacc ggcgcagcag gctccctgat ggatgtgctg 360

caccaccccg gcatgaacca ccgggtggag atcacagagg gaatcctggc agacgagtgc 420

gccgccctgc tgagcgattt ctttagaatg cggagacagg agatcaaggc ccagaagaag 480

gcacagagct ccaccgactc tggaggatct agcggaggtt cctctggaag cgagacacca 540

ggcacaagcg agtccgccac accagagagc tccggcggct cctccggagg ctcctctgag 600

gtggagtttt cccacgagta ctggatgaga catgccctga ccctggccaa gagggcacgc 660

gatgagaggg aggtgcctgt gggagccgtg ctggtgctga acaatagagt gatcggcgag 720

ggctggaaca gagccatcgg cctgcacgac ccaacagccc atgccgaaat tatggccctg 780

agacagggcg gcctggtcat gcagaactac agactgattg acgccaccct gtacgtgaca 840

ttcgagcctt gcgtgatgtg cgccggcgcc atgatccact ctaggatcgg ccgcgtggtg 900

tttggcgtga ggaacgcaaa aaccggcgcc gcaggctccc tgatggacgt gctgcactac 960

cccggcatga atcaccgcgt cgaaattacc gagggaatcc tggcagatga atgtgccgcc 1020

ctgctgtgct atttctttcg gatgcctaga caggtgttca atgctcagaa gaaggcccag 1080

agctccaccg ac 1092

<210> 2

<211> 1368

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 2

Met Asp Lys Lys Tyr Ser Ile Gly Leu Ala Ile Gly Thr Asn Ser Val

1 5 10 15

Gly Trp Ala Val Ile Thr Asp Glu Tyr Lys Val Pro Ser Lys Lys Phe

20 25 30

Lys Val Leu Gly Asn Thr Asp Arg His Ser Ile Lys Lys Asn Leu Ile

35 40 45

Gly Ala Leu Leu Phe Asp Ser Gly Glu Thr Ala Glu Ala Thr Arg Leu

50 55 60

Lys Arg Thr Ala Arg Arg Arg Tyr Thr Arg Arg Lys Asn Arg Ile Cys

65 70 75 80

Tyr Leu Gln Glu Ile Phe Ser Asn Glu Met Ala Lys Val Asp Asp Ser

85 90 95

Phe Phe His Arg Leu Glu Glu Ser Phe Leu Val Glu Glu Asp Lys Lys

100 105 110

His Glu Arg His Pro Ile Phe Gly Asn Ile Val Asp Glu Val Ala Tyr

115 120 125

His Glu Lys Tyr Pro Thr Ile Tyr His Leu Arg Lys Lys Leu Val Asp

130 135 140

Ser Thr Asp Lys Ala Asp Leu Arg Leu Ile Tyr Leu Ala Leu Ala His

145 150 155 160

Met Ile Lys Phe Arg Gly His Phe Leu Ile Glu Gly Asp Leu Asn Pro

165 170 175

Asp Asn Ser Asp Val Asp Lys Leu Phe Ile Gln Leu Val Gln Thr Tyr

180 185 190

Asn Gln Leu Phe Glu Glu Asn Pro Ile Asn Ala Ser Gly Val Asp Ala

195 200 205

Lys Ala Ile Leu Ser Ala Arg Leu Ser Lys Ser Arg Arg Leu Glu Asn

210 215 220

Leu Ile Ala Gln Leu Pro Gly Glu Lys Lys Asn Gly Leu Phe Gly Asn

225 230 235 240

Leu Ile Ala Leu Ser Leu Gly Leu Thr Pro Asn Phe Lys Ser Asn Phe

245 250 255

Asp Leu Ala Glu Asp Ala Lys Leu Gln Leu Ser Lys Asp Thr Tyr Asp

260 265 270

Asp Asp Leu Asp Asn Leu Leu Ala Gln Ile Gly Asp Gln Tyr Ala Asp

275 280 285

Leu Phe Leu Ala Ala Lys Asn Leu Ser Asp Ala Ile Leu Leu Ser Asp

290 295 300

Ile Leu Arg Val Asn Thr Glu Ile Thr Lys Ala Pro Leu Ser Ala Ser

305 310 315 320

Met Ile Lys Arg Tyr Asp Glu His His Gln Asp Leu Thr Leu Leu Lys

325 330 335

Ala Leu Val Arg Gln Gln Leu Pro Glu Lys Tyr Lys Glu Ile Phe Phe

340 345 350

Asp Gln Ser Lys Asn Gly Tyr Ala Gly Tyr Ile Asp Gly Gly Ala Ser

355 360 365

Gln Glu Glu Phe Tyr Lys Phe Ile Lys Pro Ile Leu Glu Lys Met Asp

370 375 380

Gly Thr Glu Glu Leu Leu Val Lys Leu Asn Arg Glu Asp Leu Leu Arg

385 390 395 400

Lys Gln Arg Thr Phe Asp Asn Gly Ser Ile Pro His Gln Ile His Leu

405 410 415

Gly Glu Leu His Ala Ile Leu Arg Arg Gln Glu Asp Phe Tyr Pro Phe

420 425 430

Leu Lys Asp Asn Arg Glu Lys Ile Glu Lys Ile Leu Thr Phe Arg Ile

435 440 445

Pro Tyr Tyr Val Gly Pro Leu Ala Arg Gly Asn Ser Arg Phe Ala Trp

450 455 460

Met Thr Arg Lys Ser Glu Glu Thr Ile Thr Pro Trp Asn Phe Glu Glu

465 470 475 480

Val Val Asp Lys Gly Ala Ser Ala Gln Ser Phe Ile Glu Arg Met Thr

485 490 495

Asn Phe Asp Lys Asn Leu Pro Asn Glu Lys Val Leu Pro Lys His Ser

500 505 510

Leu Leu Tyr Glu Tyr Phe Thr Val Tyr Asn Glu Leu Thr Lys Val Lys

515 520 525

Tyr Val Thr Glu Gly Met Arg Lys Pro Ala Phe Leu Ser Gly Glu Gln

530 535 540

Lys Lys Ala Ile Val Asp Leu Leu Phe Lys Thr Asn Arg Lys Val Thr

545 550 555 560

Val Lys Gln Leu Lys Glu Asp Tyr Phe Lys Lys Ile Glu Cys Phe Asp

565 570 575

Ser Val Glu Ile Ser Gly Val Glu Asp Arg Phe Asn Ala Ser Leu Gly

580 585 590

Thr Tyr His Asp Leu Leu Lys Ile Ile Lys Asp Lys Asp Phe Leu Asp

595 600 605

Asn Glu Glu Asn Glu Asp Ile Leu Glu Asp Ile Val Leu Thr Leu Thr

610 615 620

Leu Phe Glu Asp Arg Glu Met Ile Glu Glu Arg Leu Lys Thr Tyr Ala

625 630 635 640

His Leu Phe Asp Asp Lys Val Met Lys Gln Leu Lys Arg Arg Arg Tyr

645 650 655

Thr Gly Trp Gly Arg Leu Ser Arg Lys Leu Ile Asn Gly Ile Arg Asp

660 665 670

Lys Gln Ser Gly Lys Thr Ile Leu Asp Phe Leu Lys Ser Asp Gly Phe

675 680 685

Ala Asn Arg Asn Phe Met Gln Leu Ile His Asp Asp Ser Leu Thr Phe

690 695 700

Lys Glu Asp Ile Gln Lys Ala Gln Val Ser Gly Gln Gly Asp Ser Leu

705 710 715 720

His Glu His Ile Ala Asn Leu Ala Gly Ser Pro Ala Ile Lys Lys Gly

725 730 735

Ile Leu Gln Thr Val Lys Val Val Asp Glu Leu Val Lys Val Met Gly

740 745 750

Arg His Lys Pro Glu Asn Ile Val Ile Glu Met Ala Arg Glu Asn Gln

755 760 765

Thr Thr Gln Lys Gly Gln Lys Asn Ser Arg Glu Arg Met Lys Arg Ile

770 775 780

Glu Glu Gly Ile Lys Glu Leu Gly Ser Gln Ile Leu Lys Glu His Pro

785 790 795 800

Val Glu Asn Thr Gln Leu Gln Asn Glu Lys Leu Tyr Leu Tyr Tyr Leu

805 810 815

Gln Asn Gly Arg Asp Met Tyr Val Asp Gln Glu Leu Asp Ile Asn Arg

820 825 830

Leu Ser Asp Tyr Asp Val Asp His Ile Val Pro Gln Ser Phe Leu Lys

835 840 845

Asp Asp Ser Ile Asp Asn Lys Val Leu Thr Arg Ser Asp Lys Asn Arg

850 855 860

Gly Lys Ser Asp Asn Val Pro Ser Glu Glu Val Val Lys Lys Met Lys

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Asn Tyr Trp Arg Gln Leu Leu Asn Ala Lys Leu Ile Thr Gln Arg Lys

885 890 895

Phe Asp Asn Leu Thr Lys Ala Glu Arg Gly Gly Leu Ser Glu Leu Asp

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Lys Ala Gly Phe Ile Lys Arg Gln Leu Val Glu Thr Arg Gln Ile Thr

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Lys His Val Ala Gln Ile Leu Asp Ser Arg Met Asn Thr Lys Tyr Asp

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Glu Asn Asp Lys Leu Ile Arg Glu Val Lys Val Ile Thr Leu Lys Ser

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Lys Leu Val Ser Asp Phe Arg Lys Asp Phe Gln Phe Tyr Lys Val Arg

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Glu Ile Asn Asn Tyr His His Ala His Asp Ala Tyr Leu Asn Ala Val

980 985 990

Val Gly Thr Ala Leu Ile Lys Lys Tyr Pro Lys Leu Glu Ser Glu Phe

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Val Tyr Gly Asp Tyr Lys Val Tyr Asp Val Arg Lys Met Ile Ala Lys

1010 1015 1020

Ser Glu Gln Glu Ile Gly Lys Ala Thr Ala Lys Tyr Phe Phe Tyr Ser

1025 1030 1035 1040

Asn Ile Met Asn Phe Phe Lys Thr Glu Ile Thr Leu Ala Asn Gly Glu

1045 1050 1055

Ile Arg Lys Arg Pro Leu Ile Glu Thr Asn Gly Glu Thr Gly Glu Ile

1060 1065 1070

Val Trp Asp Lys Gly Arg Asp Phe Ala Thr Val Arg Lys Val Leu Ser

1075 1080 1085

Met Pro Gln Val Asn Ile Val Lys Lys Thr Glu Val Gln Thr Gly Gly

1090 1095 1100

Phe Ser Lys Glu Ser Ile Leu Pro Lys Arg Asn Ser Asp Lys Leu Ile

1105 1110 1115 1120

Ala Arg Lys Lys Asp Trp Asp Pro Lys Lys Tyr Gly Gly Phe Asp Ser

1125 1130 1135

Pro Thr Val Ala Tyr Ser Val Leu Val Val Ala Lys Val Glu Lys Gly

1140 1145 1150

Lys Ser Lys Lys Leu Lys Ser Val Lys Glu Leu Leu Gly Ile Thr Ile

1155 1160 1165

Met Glu Arg Ser Ser Phe Glu Lys Asn Pro Ile Asp Phe Leu Glu Ala

1170 1175 1180

Lys Gly Tyr Lys Glu Val Lys Lys Asp Leu Ile Ile Lys Leu Pro Lys

1185 1190 1195 1200

Tyr Ser Leu Phe Glu Leu Glu Asn Gly Arg Lys Arg Met Leu Ala Ser

1205 1210 1215

Ala Gly Glu Leu Gln Lys Gly Asn Glu Leu Ala Leu Pro Ser Lys Tyr

1220 1225 1230

Val Asn Phe Leu Tyr Leu Ala Ser His Tyr Glu Lys Leu Lys Gly Ser

1235 1240 1245

Pro Glu Asp Asn Glu Gln Lys Gln Leu Phe Val Glu Gln His Lys His

1250 1255 1260

Tyr Leu Asp Glu Ile Ile Glu Gln Ile Ser Glu Phe Ser Lys Arg Val

1265 1270 1275 1280

Ile Leu Ala Asp Ala Asn Leu Asp Lys Val Leu Ser Ala Tyr Asn Lys

1285 1290 1295

His Arg Asp Lys Pro Ile Arg Glu Gln Ala Glu Asn Ile Ile His Leu

1300 1305 1310

Phe Thr Leu Thr Asn Leu Gly Ala Pro Ala Ala Phe Lys Tyr Phe Asp

1315 1320 1325

Thr Thr Ile Asp Arg Lys Arg Tyr Thr Ser Thr Lys Glu Val Leu Asp

1330 1335 1340

Ala Thr Leu Ile His Gln Ser Ile Thr Gly Leu Tyr Glu Thr Arg Ile

1345 1350 1355 1360

Asp Leu Ser Gln Leu Gly Gly Asp

1365

<210> 3

<211> 1368

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 3

Met Asp Lys Lys Tyr Ser Ile Gly Leu Ala Ile Gly Thr Asn Ser Val

1 5 10 15

Gly Trp Ala Val Ile Thr Asp Glu Tyr Lys Val Pro Ser Lys Lys Phe

20 25 30

Lys Val Leu Gly Asn Thr Asp Arg His Ser Ile Lys Lys Asn Leu Ile

35 40 45

Gly Ala Leu Leu Phe Asp Ser Gly Glu Thr Ala Glu Ala Thr Arg Leu

50 55 60

Lys Arg Thr Ala Arg Arg Arg Tyr Thr Arg Arg Lys Asn Arg Ile Cys

65 70 75 80

Tyr Leu Gln Glu Ile Phe Ser Asn Glu Met Ala Lys Val Asp Asp Ser

85 90 95

Phe Phe His Arg Leu Glu Glu Ser Phe Leu Val Glu Glu Asp Lys Lys

100 105 110

His Glu Arg His Pro Ile Phe Gly Asn Ile Val Asp Glu Val Ala Tyr

115 120 125

His Glu Lys Tyr Pro Thr Ile Tyr His Leu Arg Lys Lys Leu Val Asp

130 135 140

Ser Thr Asp Lys Ala Asp Leu Arg Leu Ile Tyr Leu Ala Leu Ala His

145 150 155 160

Met Ile Lys Phe Arg Gly His Phe Leu Ile Glu Gly Asp Leu Asn Pro

165 170 175

Asp Asn Ser Asp Val Asp Lys Leu Phe Ile Gln Leu Val Gln Thr Tyr

180 185 190

Asn Gln Leu Phe Glu Glu Asn Pro Ile Asn Ala Ser Gly Val Asp Ala

195 200 205

Lys Ala Ile Leu Ser Ala Arg Leu Ser Lys Ser Arg Arg Leu Glu Asn

210 215 220

Leu Ile Ala Gln Leu Pro Gly Glu Lys Lys Asn Gly Leu Phe Gly Asn

225 230 235 240

Leu Ile Ala Leu Ser Leu Gly Leu Thr Pro Asn Phe Lys Ser Asn Phe

245 250 255

Asp Leu Ala Glu Asp Ala Lys Leu Gln Leu Ser Lys Asp Thr Tyr Asp

260 265 270

Asp Asp Leu Asp Asn Leu Leu Ala Gln Ile Gly Asp Gln Tyr Ala Asp

275 280 285

Leu Phe Leu Ala Ala Lys Asn Leu Ser Asp Ala Ile Leu Leu Ser Asp

290 295 300

Ile Leu Arg Val Asn Thr Glu Ile Thr Lys Ala Pro Leu Ser Ala Ser

305 310 315 320

Met Ile Lys Arg Tyr Asp Glu His His Gln Asp Leu Thr Leu Leu Lys

325 330 335

Ala Leu Val Arg Gln Gln Leu Pro Glu Lys Tyr Lys Glu Ile Phe Phe

340 345 350

Asp Gln Ser Lys Asn Gly Tyr Ala Gly Tyr Ile Asp Gly Gly Ala Ser

355 360 365

Gln Glu Glu Phe Tyr Lys Phe Ile Lys Pro Ile Leu Glu Lys Met Asp

370 375 380

Gly Thr Glu Glu Leu Leu Val Lys Leu Asn Arg Glu Asp Leu Leu Arg

385 390 395 400

Lys Gln Arg Thr Phe Asp Asn Gly Ser Ile Pro His Gln Ile His Leu

405 410 415

Gly Glu Leu His Ala Ile Leu Arg Arg Gln Glu Asp Phe Tyr Pro Phe

420 425 430

Leu Lys Asp Asn Arg Glu Lys Ile Glu Lys Ile Leu Thr Phe Arg Ile

435 440 445

Pro Tyr Tyr Val Gly Pro Leu Ala Arg Gly Asn Ser Arg Phe Ala Trp

450 455 460

Met Thr Arg Lys Ser Glu Glu Thr Ile Thr Pro Trp Asn Phe Glu Glu

465 470 475 480

Val Val Asp Lys Gly Ala Ser Ala Gln Ser Phe Ile Glu Arg Met Thr

485 490 495

Asn Phe Asp Lys Asn Leu Pro Asn Glu Lys Val Leu Pro Lys His Ser

500 505 510

Leu Leu Tyr Glu Tyr Phe Thr Val Tyr Asn Glu Leu Thr Lys Val Lys

515 520 525

Tyr Val Thr Glu Gly Met Arg Lys Pro Ala Phe Leu Ser Gly Glu Gln

530 535 540

Lys Lys Ala Ile Val Asp Leu Leu Phe Lys Thr Asn Arg Lys Val Thr

545 550 555 560

Val Lys Gln Leu Lys Glu Asp Tyr Phe Lys Lys Ile Glu Cys Phe Asp

565 570 575

Ser Val Glu Ile Ser Gly Val Glu Asp Arg Phe Asn Ala Ser Leu Gly

580 585 590

Thr Tyr His Asp Leu Leu Lys Ile Ile Lys Asp Lys Asp Phe Leu Asp

595 600 605

Asn Glu Glu Asn Glu Asp Ile Leu Glu Asp Ile Val Leu Thr Leu Thr

610 615 620

Leu Phe Glu Asp Arg Glu Met Ile Glu Glu Arg Leu Lys Thr Tyr Ala

625 630 635 640

His Leu Phe Asp Asp Lys Val Met Lys Gln Leu Lys Arg Arg Arg Tyr

645 650 655

Thr Gly Trp Gly Arg Leu Ser Arg Lys Leu Ile Asn Gly Ile Arg Asp

660 665 670

Lys Gln Ser Gly Lys Thr Ile Leu Asp Phe Leu Lys Ser Asp Gly Phe

675 680 685

Ala Asn Arg Asn Phe Met Gln Leu Ile His Asp Asp Ser Leu Thr Phe

690 695 700

Lys Glu Asp Ile Gln Lys Ala Gln Val Ser Gly Gln Gly Asp Ser Leu

705 710 715 720

His Glu His Ile Ala Asn Leu Ala Gly Ser Pro Ala Ile Lys Lys Gly

725 730 735

Ile Leu Gln Thr Val Lys Val Val Asp Glu Leu Val Lys Val Met Gly

740 745 750

Arg His Lys Pro Glu Asn Ile Val Ile Glu Met Ala Arg Glu Asn Gln

755 760 765

Thr Thr Gln Lys Gly Gln Lys Asn Ser Arg Glu Arg Met Lys Arg Ile

770 775 780

Glu Glu Gly Ile Lys Glu Leu Gly Ser Gln Ile Leu Lys Glu His Pro

785 790 795 800

Val Glu Asn Thr Gln Leu Gln Asn Glu Lys Leu Tyr Leu Tyr Tyr Leu

805 810 815

Gln Asn Gly Arg Asp Met Tyr Val Asp Gln Glu Leu Asp Ile Asn Arg

820 825 830

Leu Ser Asp Tyr Asp Val Asp His Ile Val Pro Gln Ser Phe Leu Lys

835 840 845

Asp Asp Ser Ile Asp Asn Lys Val Leu Thr Arg Ser Asp Lys Asn Arg

850 855 860

Gly Lys Ser Asp Asn Val Pro Ser Glu Glu Val Val Lys Lys Met Lys

865 870 875 880

Asn Tyr Trp Arg Gln Leu Leu Asn Ala Lys Leu Ile Thr Gln Arg Lys

885 890 895

Phe Asp Asn Leu Thr Lys Ala Glu Arg Gly Gly Leu Ser Glu Leu Asp

900 905 910

Lys Ala Gly Phe Ile Lys Arg Gln Leu Val Glu Thr Arg Gln Ile Thr

915 920 925

Lys His Val Ala Gln Ile Leu Asp Ser Arg Met Asn Thr Lys Tyr Asp

930 935 940

Glu Asn Asp Lys Leu Ile Arg Glu Val Lys Val Ile Thr Leu Lys Ser

945 950 955 960

Lys Leu Val Ser Asp Phe Arg Lys Asp Phe Gln Phe Tyr Lys Val Arg

965 970 975

Glu Ile Asn Asn Tyr His His Ala His Asp Ala Tyr Leu Asn Ala Val

980 985 990

Val Gly Thr Ala Leu Ile Lys Lys Tyr Pro Lys Leu Glu Ser Glu Phe

995 1000 1005

Val Tyr Gly Asp Tyr Lys Val Tyr Asp Val Arg Lys Met Ile Ala Lys

1010 1015 1020

Ser Glu Gln Glu Ile Gly Lys Ala Thr Ala Lys Tyr Phe Phe Tyr Ser

1025 1030 1035 1040

Asn Ile Met Asn Phe Phe Lys Thr Glu Ile Thr Leu Ala Asn Gly Glu

1045 1050 1055

Ile Arg Lys Arg Pro Leu Ile Glu Thr Asn Gly Glu Thr Gly Glu Ile

1060 1065 1070

Val Trp Asp Lys Gly Arg Asp Phe Ala Thr Val Arg Lys Val Leu Ser

1075 1080 1085

Met Pro Gln Val Asn Ile Val Lys Lys Thr Glu Val Gln Thr Gly Gly

1090 1095 1100

Phe Ser Lys Glu Ser Ile Arg Pro Lys Arg Asn Ser Asp Lys Leu Ile

1105 1110 1115 1120

Ala Arg Lys Lys Asp Trp Asp Pro Lys Lys Tyr Gly Gly Phe Val Ser

1125 1130 1135

Pro Thr Val Ala Tyr Ser Val Leu Val Val Ala Lys Val Glu Lys Gly

1140 1145 1150

Lys Ser Lys Lys Leu Lys Ser Val Lys Glu Leu Leu Gly Ile Thr Ile

1155 1160 1165

Met Glu Arg Ser Ser Phe Glu Lys Asn Pro Ile Asp Phe Leu Glu Ala

1170 1175 1180

Lys Gly Tyr Lys Glu Val Lys Lys Asp Leu Ile Ile Lys Leu Pro Lys

1185 1190 1195 1200

Tyr Ser Leu Phe Glu Leu Glu Asn Gly Arg Lys Arg Met Leu Ala Ser

1205 1210 1215

Ala Arg Phe Leu Gln Lys Gly Asn Glu Leu Ala Leu Pro Ser Lys Tyr

1220 1225 1230

Val Asn Phe Leu Tyr Leu Ala Ser His Tyr Glu Lys Leu Lys Gly Ser

1235 1240 1245

Pro Glu Asp Asn Glu Gln Lys Gln Leu Phe Val Glu Gln His Lys His

1250 1255 1260

Tyr Leu Asp Glu Ile Ile Glu Gln Ile Ser Glu Phe Ser Lys Arg Val

1265 1270 1275 1280

Ile Leu Ala Asp Ala Asn Leu Asp Lys Val Leu Ser Ala Tyr Asn Lys

1285 1290 1295

His Arg Asp Lys Pro Ile Arg Glu Gln Ala Glu Asn Ile Ile His Leu

1300 1305 1310

Phe Thr Leu Thr Asn Leu Gly Ala Pro Arg Ala Phe Lys Tyr Phe Asp

1315 1320 1325

Thr Thr Ile Asp Arg Lys Val Tyr Arg Ser Thr Lys Glu Val Leu Asp

1330 1335 1340

Ala Thr Leu Ile His Gln Ser Ile Thr Gly Leu Tyr Glu Thr Arg Ile

1345 1350 1355 1360

Asp Leu Ser Gln Leu Gly Gly Asp

1365

<210> 4

<211> 96

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 4

tccggaggat ctagcggagg ctcctctggc tctgagacac ctggcacaag cgagagcgca 60

acacctgaaa gcagcggggg cagcagcggg ggatcc 96

<210> 5

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 5

aaaagaaccg ccgacggcag cgaattcgag cccaagaaga agaggaaagt c 51

<210> 6

<211> 284

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 6

tgattgatcg atagagctcg aatttccccg atcgttcaaa catttggcaa taaagtttct 60

taagattgaa tcctgttgcc ggtcttgcga tgattatcat ataatttctg ttgaattacg 120

ttaagcatgt aataattaac atgtaatgca tgacgttatt tatgagatgg gtttttatga 180

ttagagtccc gcaattatac atttaatacg cgatagaaaa caaaatatag cgcgcaaact 240

aggataaatt atcgcgcgcg gtgtcatcta tgttactaga tcgg 284

<210> 7

<211> 96

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 7

tctggaggat ctagcggagg ctcctctggc agcgagacac caggaacaag cgagtcagca 60

acaccagaga gcagtggcgg cagcagcggc ggatcc 96

<210> 8

<211> 364

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 8

Ser Glu Val Glu Phe Ser His Glu Tyr Trp Met Arg His Ala Leu Thr

1 5 10 15

Leu Ala Lys Arg Ala Trp Asp Glu Arg Glu Val Pro Val Gly Ala Val

20 25 30

Leu Val His Asn Asn Arg Val Ile Gly Glu Gly Trp Asn Arg Pro Ile

35 40 45

Gly Arg His Asp Pro Thr Ala His Ala Glu Ile Met Ala Leu Arg Gln

50 55 60

Gly Gly Leu Val Met Gln Asn Tyr Arg Leu Ile Asp Ala Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Val Thr Leu Glu Pro Cys Val Met Cys Ala Gly Ala Met Ile His Ser

85 90 95

Arg Ile Gly Arg Val Val Phe Gly Ala Arg Asp Ala Lys Thr Gly Ala

100 105 110

Ala Gly Ser Leu Met Asp Val Leu His His Pro Gly Met Asn His Arg

115 120 125

Val Glu Ile Thr Glu Gly Ile Leu Ala Asp Glu Cys Ala Ala Leu Leu

130 135 140

Ser Asp Phe Phe Arg Met Arg Arg Gln Glu Ile Lys Ala Gln Lys Lys

145 150 155 160

Ala Gln Ser Ser Thr Asp Ser Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Ser Gly

165 170 175

Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Ser Gly

180 185 190

Gly Ser Ser Gly Gly Ser Ser Glu Val Glu Phe Ser His Glu Tyr Trp

195 200 205

Met Arg His Ala Leu Thr Leu Ala Lys Arg Ala Arg Asp Glu Arg Glu

210 215 220

Val Pro Val Gly Ala Val Leu Val Leu Asn Asn Arg Val Ile Gly Glu

225 230 235 240

Gly Trp Asn Arg Ala Ile Gly Leu His Asp Pro Thr Ala His Ala Glu

245 250 255

Ile Met Ala Leu Arg Gln Gly Gly Leu Val Met Gln Asn Tyr Arg Leu

260 265 270

Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Val Thr Phe Glu Pro Cys Val Met Cys Ala

275 280 285

Gly Ala Met Ile His Ser Arg Ile Gly Arg Val Val Phe Gly Val Arg

290 295 300

Asn Ala Lys Thr Gly Ala Ala Gly Ser Leu Met Asp Val Leu His Tyr

305 310 315 320

Pro Gly Met Asn His Arg Val Glu Ile Thr Glu Gly Ile Leu Ala Asp

325 330 335

Glu Cys Ala Ala Leu Leu Cys Tyr Phe Phe Arg Met Pro Arg Gln Val

340 345 350

Phe Asn Ala Gln Lys Lys Ala Gln Ser Ser Thr Asp

355 360

<210> 9

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 9

cgcattcaag gacatgatcc tgg 23

<210> 10

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 10

gcgcccccac ttgggatcat agg 23

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 11

ttggaccagc agaagaggga 20

<210> 12

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 12

ggattaccat gccaagcaca tc 22

<210> 13

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 13

caactttgga ggtttcgcac tg 22

<210> 14

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 14

tcgcttgagc ttggcaggaa ta 22

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 15

ttggaccagc agaagaggga 20

<210> 16

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 16

ctggttatta gggcacaac 19

<210> 17

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 17

gagaaggatg cgaaagagga agt 23

<210> 18

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 18

taacaaagaa gagtgaagtc cgt 23

Claims

1.一种核酸构建物，其特征在于，所述核酸构建物具有5’-3’的式（I）结构：

I1-Z1-Z2-I2 (I)

式中，

I1为第一整合元件；

I2为第二整合元件；

Z1为第一表达盒；

Z2为第二表达盒；

并且，Z1和Z2中的一个表达盒具有(Ia)结构，而另一个表达盒具有式(Ib)结构：

P1-S1-X1-L1-X2-L2-X3 (Ia)

P2-Y1 (Ib)；

式中，

S1为核定位信号的编码序列；

X1为腺嘌呤脱氨酶的编码序列；

L1为无或第一连接肽的编码序列；

L2为无或第二连接肽的编码序列；

X3为核定位信号的编码序列；

P2为第二启动子；

Y1为sgRNA的编码序列；

并且，各“-”为键或核苷酸连接序列，所述Cas9核酸酶选自下组：Cas9n、Cas9NG、或其组合；所述核定位信号为bpNLS；

所述腺嘌呤脱氨酶的编码序列为如SEQ ID NO.:1所示的多核苷酸。

2.如权利要求1所述的核酸构建物，其特征在于，所述第一启动子包括玉米泛素启动子。

3.如权利要求1所述的核酸构建物，其特征在于，所述X2元件在Cas9核酸酶的对应于SEQ ID NO.:2的选自下组的一个或多个位点发生突变：

第1335位精氨酸（R）；

第1111位亮氨酸（L）；

第1135位天冬氨酸（D）；

第1218位甘氨酸（G）；

第1219位谷氨酸（E）；

第1322位的丙氨酸（A）；

第1337位的苏氨酸（T）。

4.如权利要求3 所述的核酸构建物，其特征在于，所述突变选自下组：R1335A；L1111R；D1135V；G1218R；E1219F；A1322R；T1337R。

5.如权利要求1所述的核酸构建物，其特征在于，所述X2元件的氨基酸序列如SEQ IDNO.:3所示。

6.如权利要求1所述的核酸构建物，其特征在于，所述X3元件的核苷酸序列如SEQ IDNO.:5所示。

7.如权利要求1所述的核酸构建物，其特征在于，所述第二启动子包括RNA聚合酶III依赖的启动子。

8.如权利要求1所述的核酸构建物，其特征在于，所述核酸构建物的长度为3000-10000bp。

9.如权利要求8所述的核酸构建物，其特征在于，所述核酸构建物的长度为4000-8500bp。

10.如权利要求9所述的核酸构建物，其特征在于，所述核酸构建物的长度为4000-6000bp。

11.一种载体，其特征在于，所述载体含有权利要求1－10任一所述的核酸构建物。

12.一种基因工程细胞，其特征在于，所述细胞含有权利要求1－10任一所述的核酸构建物，或其基因组整合有一个或多个权利要求1－10任一所述的核酸构建物，所述基因工程细胞不作为植物繁殖材料。

13.一种用于基因编辑的试剂组合，其特征在于，包括：

(i) 第一核酸构建物，或含有所述第一核酸构建物的第一载体，所述第一核酸构建物具有从5’-3’的式(Ia)结构：

P1-S1-X1-L1-X2-L2-X3 (Ia)

其中，

S1为核定位信号的编码序列；

X1为腺嘌呤脱氨酶的编码序列；

L1为无或第一连接肽的编码序列；

L2为无或第二连接肽的编码序列；

X3为核定位信号的编码序列；

并且，“-”为键或核苷酸连接序列；和

(ii) 第二核酸构建物，或含有所述第二核酸构建物的第二载体，所述第二核酸构建物具有从5’-3’的式(Ib)所示的结构：

P2-Y1 (Ib)；

其中，P2为第二启动子；

Y1为sgRNA的编码序列；

并且，“-”为键或核苷酸连接序列，所述Cas9核酸酶选自下组：Cas9n、Cas9NG、或其组合；所述核定位信号为bpNLS；

14.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有权利要求13所述的试剂组合。

15.一种对植物进行基因编辑的方法，其特征在于，包括步骤：

(i) 提供待编辑植物；和

(ii) 将权利要求1所述的核酸构建物或权利要求11所述的载体或权利要求13所述的试剂组合导入所述待编辑植物的植物细胞，从而在所述植物细胞内进行基因编辑。

16.一种制备经基因编辑的植物细胞的方法，其特征在于，包括步骤：

将权利要求1所述的核酸构建物或权利要求11所述的载体或权利要求13所述的试剂组合转染植物细胞，使得所述植物细胞中的染色体发生定点替换，从而制得所述经基因编辑的植物细胞。

17.一种权利要求1所述的核酸构建物或权利要求11所述的载体或权利要求12所述的基因工程细胞或权利要求13所述的试剂组合或权利要求14所述的试剂盒的用途，其特征在于，用于对植物进行基因编辑。

18.一种制备经基因编辑的植物的方法，其特征在于，包括步骤：

将权利要求16所述方法制备的所述经基因编辑的植物细胞再生为植物体，从而获得所述经基因编辑的植物。