JP2022549430A

JP2022549430A - Ｄｎａ塩基編集のための方法及び組成物

Info

Publication number: JP2022549430A
Application number: JP2022518227A
Authority: JP
Inventors: ジャンピンシュ; ジアンリ
Original assignee: シンジェンタクロッププロテクションアクチェンゲゼルシャフト
Priority date: 2019-09-26
Filing date: 2020-09-18
Publication date: 2022-11-25
Also published as: WO2021056302A1; AU2020354372A1; CL2022000745A1; WO2021061507A1; IL290572A; EP4034648A1; MX2022003577A; KR20220066111A; US20220403396A1; EP4034648A4; CN114761547A; CA3149273A1

Abstract

本発明は、細胞のゲノム中の標的部位を改変するための方法及び組成物に関する。改善されたリンカー配列で接続されている１個又は複数個のＤＮＡ結合ドメイン及び１個又は複数個の異種ドメイン、例えばＤＮＡ改変ドメインを含む、融合タンパク質が提供される。改善されたリンカー配列により接続されている１個又は複数個のＤＮＡ結合ドメイン及び１個又は複数個の異種ドメインを含む融合タンパク質をコードする、コドン最適化ポリヌクレオチドが提供される。

Description

本発明は、細胞のゲノム中における標的ヌクレオチド塩基編集のための方法及び組成物に関する。

配列表の電子的提出に関する陳述
本明細書には、２０２０年９月１８に作成されて３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２１に基づいて提出された、約７０２キロバイトの、「８１９４５＿ＳＴ２５」という表題のＡＳＣＩＩテキスト形式の配列表が添付されており、且つ本明細書と共に提出されており、この配列表は、参照により本明細書に組み込まれる。

農業では、植物のゲノムを編集して有利な対立遺伝子を作り出す能力が非常に求められている。この能力により、収量が増加したり疾患が予防されたりする可能性がある。ゲノム編集は、植物では進展が遅れている新しい分野である。さらに、意図された変更以外のゲノムに対する変更には、望ましい変更の適用が制限されるという問題がある。ＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳ９は、ＤＮＡに二本鎖切断を行なうことにより機能する。この切断は、非相同末端結合又は相同性依存性修復により修復されることから、ＤＮＡ塩基の挿入又は欠失が起こる場合がある。塩基編集と称される戦略により、切断されて挿入及び欠失が生じることなくＤＮＡが変更される。１つのバージョンでは、シチジンデアミナーゼと称される酵素は、ＤＮＡを切断し得ないように改変されているＣＡＳ９酵素（Ｓｈｉｍａｔａｎｉｅｔａｌ，２０１７．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３５，４４１－４４３）又はＣＡＳ１２ａ酵素（Ｌｉｅｔａｌ，２０１８．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３６，３２４－３２７）により、特定の塩基を標的とする。シチジンデアミナーゼ及びヌクレアーゼ欠損ＣＡＳ９又はＣＡＳ１２ａは、アミノ酸リンカーを介した接続により互いに融合している。リンカー接続の改善により、例えば、オフターゲット塩基変更が減少して切断の精度が改善され、これにより、この融合タンパク質の機能が改善され得る。

この改善に関する要求を満たすために、本発明者らは、最適化されており且つ改善されているＣａｓ１２ａ酵素及び構築物を提供する。具体的には、本発明者らは、異種ドメイン、第１のリンカー配列、及びＶ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ酵素を含む融合タンパク質を提供する。第１のリンカー配列は、反復ＧＧＧＧＳ配列を含む。異種ドメインは、デアミナーゼ、ポリメラーゼ、ヌクレアーゼ、リラクサーゼ（ｒｅｌａｘａｓｅ）、アルキルトランスフェラーゼ、メチルトランスフェラーゼ、アデノシンデアミナーゼ、シチジンデアミナーゼ、オキシダーゼ、チミンアルキルトランスフェラーゼ、アデニンオキシダーゼ、アデノシンメチルトランスフェラーゼ、グリコシラーゼ、又は核局在化シグナルであり得る。塩基編集のために、異種ドメインは、デアミナーゼドメイン（例えば、シチジンデアミナーゼ又はアデニンデアミナーゼ）である。シチジンデアミナーゼドメインは、活性化誘導シチジンデアミナーゼ（「ＡＩＤ」）、又は例えばデアミナーゼのＡＰＯＢＥＣ１ファミリ由来のアポリポタンパク質ＢｍＲＮＡ編集複合体（「ＡＰＯＢＥＣ」）ドメインであり得る。状況によっては、ＡＰＯＢＥＣドメインは、配列番号１と少なくとも７０％同一の配列を含む。アデニンデアミナーゼが必要な場合には、アデニンデアミナーゼは、配列番号９２と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列を含むＴａｄＡドメインであり得る。

Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ酵素がＶ－Ａ型（「Ｃａｓ１２ａ」）酵素である場合には、Ｃａｓ１２ａは、配列番号３、配列番号６、配列番号２２、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、及び配列番号４８で構成された群から選択される。Ｃａｓ１２ａドメインは、触媒的に不活性であり得るが、標的ＤＮＡに依然として結合して異種ドメインが作動することを可能にする。Ｃａｓ１２ａは不活性であり、この配列は、配列番号３、配列番号６、又は配列番号２２である。

異種ドメインとＣａｓ１２ａ酵素との間の第１のリンカー配列は、少なくとも３回反復されたＧＧＧＧＳを含み得る。他の用途では、第１のリンカー配列は、少なくとも６回反復されたＧＧＧＧＳを含み得る。

本融合タンパク質は、配列番号１１、１２、１３、又は４４を含み得、且つウラシルＤＮＡグリコシラーゼインヒビター（「ＵＧＩ」）ドメイン（配列番号８により表される）も含み得る。このＵＧＩドメインは、配列ＳＧＧＳを含む第２のリンカーによりＣａｓ１２ａ酵素に連結され得る。この融合タンパク質は、配列番号１７、配列番号２４、配列番号３５、配列番号３９、配列番号４３、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号８１、配列番号８３、配列番号８５、配列番号８７、又は配列番号８９を含み得る。これらの融合タンパク質は、ＤＮＡと接触した場合には、反復ＧＧＧＧＳ配列の第１のリンカー配列を欠く先行技術の融合タンパク質と比較して、高い頻度でオンターゲット編集を生じ、及び低い頻度でオフターゲット編集を生じる。

本発明者らはまた、植物ゲノムＤＮＡを編集する方法であって、植物ゲノムＤＮＡと、（ａ）ＵＧＩドメインを任意に含む、上記態様の内の１つにより説明されている融合タンパク質、及び（ｂ）工程（ａ）の融合タンパク質の標的を植物ゲノムＤＮＡの標的ＤＮＡ配列に定めるガイドＲＮＡ（「ｇＲＮＡ」）とを接触させることによる方法であり、編集された植物ゲノムＤＮＡは、反復ＧＧＧＧＳ配列以外の第１のリンカーを有する融合タンパク質により編集された植物ゲノムＤＮＡと比較してオフターゲット編集が低い、方法も提供する。

本発明者らはまた、低いオフターゲット編集で植物ゲノムＤＮＡを編集する方法であって、植物ゲノムＤＮＡと、（ａ）ＵＧＩドメインを任意に含む、上記態様の内の１つにより説明されている融合タンパク質、及び（ｂ）工程（ａ）の融合タンパク質の標的を植物ゲノムＤＮＡの標的ＤＮＡ配列に定めるガイドＲＮＡ（「ｇＲＮＡ」）と接触させることによる方法であり、編集された植物ゲノムＤＮＡは、反復ＧＧＧＧＳ配列以外の第１のリンカーを有する融合タンパク質により編集された植物ゲノムＤＮＡと比較してオフターゲット編集が低い、方法も提供する。一態様では、この融合タンパク質は、配列番号２４を含む。

本発明者らはまた、オフターゲット編集が低い編集植物の集団を得る方法であって、（ａ）編集するゲノムＤＮＡを含む植物細胞の集団を得ること、（ｂ）上記態様の内の１つにより説明されている融合タンパク質及び任意のＵＧＩドメインをコードするヌクレオチド配列を得ること、（ｃ）この植物細胞の集団を工程（ｂ）のヌクレオチド配列で形質転換させ、それにより、この植物細胞の集団内で、この核酸配列によりコードされた融合タンパク質を発現させること、（ｄ）形質転換された植物細胞の集団を植物へと成長させることであり、この植物の少なくとも１つは編集されている、成長させること、並びに（ｅ）工程（ｄ）の生成物から少なくとも１つの編集植物を選択し、それにより編集植物の集団を得ることによる方法であり、この編集植物の集団は、反復ＧＧＧＧＳ配列以外の第１のリンカーを有する融合タンパク質により編集された植物と比較してオフターゲット編集が低い、方法も提供する。一態様では、融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、配列番号１７、配列番号２４、配列番号３５、配列番号３９、配列番号４３、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号８１、配列番号８３、配列番号８５、配列番号８７、又は配列番号８９を含む。

Ｃａｓ１２ａＢＥに関する３つのバージョンのＤＮＡ構築物の略図を示す。（１）は、プロモーターを示し、（２）は、核局在化シグナルであり、（３）は、デアミナーゼ（例えばＡＰＯＢＥＣデアミナーゼ）であり、（４）は、ＸＴＥＮリンカーであり、（５）は、ＬｂＣａｓ１２ａであり、（６）は、ＳＧＧＳリンカーであり、（７）は、ウラシルグリコシラーゼインヒビターであり、（８）は、長リンカー（例えば（Ｇ₄Ｓ）₆リンカー）であり、（９）は、Ｍｂ２Ｃａｓ１２ａであり、（１０）は、ガイドＲＮＡコードエレメントである。図１Ａは、５’から３’の方向にＬｂＣａｓ１２ａＢＥプラスガイドＲＮＡ構築物を示しており、デアミナーゼ（３）は、ＸＴＥＮリンカー（４）によりＬｂＣａｓ１２ａ（５）に作動可能に連結されている。図１Ｂは、５’から３’の方向にＬｂＣａｓ１２ａＢＥプラスガイドＲＮＡ構築物を示しており、デアミナーゼ（３）は、（Ｇ₄Ｓ）₆リンカー（８）によりＬｂＣａｓ１２ａ（５）に作動可能に連結されている。図１Ｃは、５’から３’の方向にＭｂ２Ｃａｓ１２ａＢＥプラスガイドＲＮＡ構築物を示しており、デアミナーゼ（３）は、（Ｇ₄Ｓ）₆リンカー（８）によりＭｂ２Ｃａｓ１２ａ（９）に作動可能に連結されている。５’から３’の方向にＣａｓ１２ａＢＥ及び多重ガイドＲＮＡを含むＤＮＡ構築物の略図を示す。（１）は、プロモーターを示し、（２）は、核局在化シグナルであり、（３）は、デアミナーゼ（例えばＡＰＯＢＥＣデアミナーゼ）であり、（６）は、ＳＧＧＳリンカーであり、（７）は、ウラシルグリコシラーゼインヒビターであり、（８）は、長リンカー（例えば（Ｇ₄Ｓ）₆リンカー）であり、（９）は、Ｃａｓ１２ａであり、（１０）は、第１のガイドＲＮＡコードエレメントであり、（１１）は、第２のガイドＲＮＡコードエレメントであり、（１２）は、第３のガイドＲＮＡコードエレメントである。各ガイドＲＮＡコードエレメントは、ｃｒＲＮＡセグメントと、ゲノム標的ＤＮＡ配列にハイブリダイズし得る標的配列セグメントとを含む。

配列表中の配列の簡単な説明
配列番号１は、Ａｐｏｂｅｃ１のアミノ酸配列である。
配列番号２は、Ａｐｏｂｅｃ１のヌクレオチド配列である。
配列番号３は、触媒的に不活性なＭｂ２Ｃａｓ１２ａのアミノ酸配列である。
配列番号４は、触媒的に不活性なＭｂ２Ｃａｓ１２ａのヌクレオチド配列である。
配列番号５は、触媒的に不活性なｃＬｂＣａｓ１２ａＢＥのヌクレオチド配列である。
配列番号６は、触媒的に不活性なｃＬｂＣａｓ１２ａＢＥのアミノ酸配列である。
配列番号７は、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼインヒビター（ＵＧＩ）のヌクレオチド配列である。
配列番号８は、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼインヒビター（ＵＧＩ）のアミノ酸配列である。
配列番号９は、発現カセットｐｒＳｏＵｂｉ４：ＳＶ４０ＮＬＳ：ｃＬｂＣａｓ１２ａＢＥ：ＧＳ６Ｌｉｎｋｅｒ：ＳＶ４０ＮＬＳ：ＳＧＧＳＬｉｎｋｅｒ：ＵＧＩ：ＳＧＧＳＬｉｎｋｅｒ：ＳＶ４０ＮＬＳ：ｔＮＯＳを含むヌクレオチド配列である。
配列番号１０は、最適化された（Ｇ４Ｓ）×６リンカーのヌクレオチド配列である。
配列番号１１は、最適化された（Ｇ４Ｓ）×６リンカーのアミノ酸配列である。
配列番号１２は、１８ａａリンカー－ＳＸのアミノ酸配列である。
配列番号１３は、１５ａａリンカー－（Ｇ４Ｓ）×３のアミノ酸配列である。
配列番号１４は、構築物２５０５７由来の融合タンパク質ｃＬＢＣａｓ１２ａＢＥ－０７を含むヌクレオチド配列である。
配列番号１５は、構築物２５０５７由来の融合タンパク質ｃＬＢＣａｓ１２ａＢＥ－０７を含むアミノ酸配列である。
配列番号１６は、構築物２５０５８由来の融合タンパク質ｃＬＢＣａｓ１２ａＢＥ－０８を含むヌクレオチド配列である。
配列番号１７は、構築物２５０５８由来の融合タンパク質ｃＬＢＣａｓ１２ａＢＥ－０８を含むアミノ酸配列である。
配列番号１８は、構築物２４５２４由来の融合タンパク質ｃＬＢＣａｓ１２ａＢＥ－０１を含むヌクレオチド配列である。
配列番号１９は、構築物２４５２４由来の融合タンパク質ｃＬＢＣａｓ１２ａＢＥ－０１を含むアミノ酸配列である。
配列番号２０は、ｃＣａｓ９ＢＥ－０２のヌクレオチド配列である。
配列番号２１は、ｃＣａｓ９ＢＥ－０２のアミノ酸配列である。
配列番号２２は、触媒的に不活性なＡｓＣａｓ１２ａのアミノ酸配列である。
配列番号２３は、構築物２４９０４由来の融合タンパク質ｃＬＢＣａｓ１２ａＢＥ－０６を含むヌクレオチド配列である。
配列番号２４は、構築物２４９０４由来の融合タンパク質ｃＬＢＣａｓ１２ａＢＥ－０６を含むアミノ酸配列である。
配列番号２５は、プロモーターｐｒＳｏＵｂｉ４－０２を含むヌクレオチド配列である。
配列番号２６は、Ｃａｓ１２ａｇＲＮＡｗａｘｙ１標的配列を含むヌクレオチド配列である。
配列番号２７は、Ｃａｓ９ｇＲＮＡｗａｘｙ１標的配列を含むヌクレオチド配列である。
配列番号２８は、ＺｍＷａｘｙ１遺伝子エクソン４を含むヌクレオチド配列である。
配列番号２９は、ＺｍＷａｘｙ１のフォワードプライマーである。
配列番号３０は、ＺｍＷａｘｙ１のリバースプライマーである。
配列番号３１は、ＺｍＷａｘｙ１の配列決定プライマーである。
配列番号３２は、構築物２４５２３由来の融合タンパク質ｃＬｂＣｐｆ１－０２を含むヌクレオチド配列である。
配列番号３３は、構築物２４５２３由来の融合タンパク質ｃＬｂＣｐｆ１－０２を含むアミノ酸配列である。
配列番号３４は、構築物２５１８１由来の融合タンパク質ｃＬｂＣａｓ１２ａ－０５を含むヌクレオチド配列である。
配列番号３５は、構築物２５１８１由来の融合タンパク質ｃＬｂＣａｓ１２ａ－０５を含むアミノ酸配列である。
配列番号３６は、構築物２５２０５由来の融合タンパク質ｃＬｂＣａｓ１２ａ－０２を含むヌクレオチド配列である。
配列番号３７は、構築物２５２０５由来の融合タンパク質ｃＬｂＣａｓ１２ａ－０２を含むアミノ酸配列である。
配列番号３８は、構築物２５５１３由来の融合タンパク質ｃＬｂＣａｓ１２ａ－２５を含むヌクレオチド配列である。
配列番号３９は、構築物２５５１３由来の融合タンパク質ｃＬｂＣａｓ１２ａ－２５を含むアミノ酸配列である。
配列番号４０は、構築物２５２２０由来の融合タンパク質ｃＭｂ２Ｃａｓ１２ａ－０１を含むヌクレオチド配列である。
配列番号４１は、構築物２５２２０由来の融合タンパク質ｃＭｂ２Ｃａｓ１２ａ－０１を含むアミノ酸配列である。
配列番号４２は、構築物２５３８２由来の融合タンパク質ｃＭｂ２Ｃａｓ１２ａ－０２を含むヌクレオチド配列である。
配列番号４３は、構築物２５３８２由来の融合タンパク質ｃＭｂ２Ｃａｓ１２ａ－０２を含むアミノ酸配列である。
配列番号４４は、最適化された（Ｇ４ＳＧ）ｘ６リンカーのアミノ酸配列である。
配列番号４５は、活性なＬｂＣａｓ１２ａのアミノ酸配列である。
配列番号４６は、活性なＭｂ２Ｃａｓ１２ａのアミノ酸配列である。
配列番号４７は、活性なＡｓＣａｓ１２ａのアミノ酸配列である。
配列番号４８は、活性なＦｎＣａｓ１２ａのアミノ酸配列である。
配列番号４９は、構築物２５４５７由来の融合タンパク質ｃＭｂ２Ｃａｓ１２ａ－ＢＥ－０１を含むヌクレオチド配列である。
配列番号５０は、構築物２５４５７由来の融合タンパク質ｃＭｂ２Ｃａｓ１２ａ－ＢＥ－０１を含むアミノ酸配列である。
配列番号５１は、構築物２５２６８由来の融合タンパク質ｃＬｂＣａｓ１２ａ－ＢＥ－０８を含むヌクレオチド配列である。
配列番号５２は、構築物２５２６８由来の融合タンパク質ｃＬｂＣａｓ１２ａ－ＢＥ－０８を含むアミノ酸配列である。
配列番号５３は、構築物２５１７３由来の融合タンパク質ｃＬｂＣａｓ１２ａ－０５を含むヌクレオチド配列である。
配列番号５４は、構築物２５１７３由来の融合タンパク質ｃＬｂＣａｓ１２ａ－０５を含むアミノ酸配列である。
配列番号５５は、構築物２５１７５由来の融合タンパク質ｃＬｂＣａｓ１２ａ－０５を含むヌクレオチド配列である。
配列番号５６は、構築物２５１７５由来の融合タンパク質ｃＬｂＣａｓ１２ａ－０５を含むアミノ酸配列である。
配列番号５７は、最適化された（Ｇ４ＳＧ）６リンカーを有する触媒的な不活性なＬｂＣａｓ１２ａのアミノ酸配列である。
配列番号５８は、最適化された（Ｇ４Ｓ）６リンカーを有する活性なＭｂ２Ｃａｓ１２ａのアミノ酸配列である。
配列番号５９は、ＸＴＥＮリンカーを有する触媒的に不活性なＭｂ２Ｃａｓ１２ａのアミノ酸配列である。
配列番号６０は、ＸＴＥＮリンカーを有する活性なＡｓＣａｓ１２ａのアミノ酸配列である。
配列番号６１は、ＸＴＥＮリンカーを有する触媒的に不活性なＡｓＣａｓ１２ａのアミノ酸配列である。
配列番号６２は、ＸＴＥＮリンカーを有する活性なＦｎＣａｓ１２ａのアミノ酸配列である。
配列番号６３は、最適化された（Ｇ４Ｓ）６リンカーを有する活性なＡｓＣａｓ１２ａのアミノ酸配列である。
配列番号６４は、最適化された（Ｇ４Ｓ）６リンカーを有する触媒的に不活性なＡｓＣａｓ１２ａのアミノ酸配列である。
配列番号６５は、最適化された（Ｇ４Ｓ）６リンカーを有する活性なＦｎＣａｓ１２ａのアミノ酸配列である。
配列番号６６は、最適化された（Ｇ４ＳＧ）６リンカーを有する触媒的に不活性なＭｂ２Ｃａｓ１２ａのアミノ酸配列である。
配列番号６７は、最適化された（Ｇ４ＳＧ）６リンカーを有する活性なＡｓＣａｓ１２ａのアミノ酸配列である。
配列番号６８は、最適化された（Ｇ４ＳＧ）６リンカーを有する触媒的に不活性なＡｓＣａｓ１２ａのアミノ酸配列である。
配列番号６９は、最適化された（Ｇ４ＳＧ）６リンカーを有する活性なＦｎＣａｓ１２ａのアミノ酸配列である。
配列番号７０は、ＸＴＥＮリンカーのアミノ酸配列である。
配列番号７１は、Ｃａｓ１２ａｇＲＮＡＳＢＥＩＩ標的配列を含むヌクレオチド配列である。
配列番号７２は、Ｃａｓ１２ａｇＲＮＡＧＬ２標的配列を含むヌクレオチド配列である。
配列番号７３は、Ｃａｓ１２ａｇＲＮＡＦａｄ２標的配列を含むヌクレオチド配列である。
配列番号７４は、ｗａｘｙ１標的配列、ＳＢＥＩＩ標的配列、及びＦａｄ２標的配列により使用されるＣａｓ１２ａｃｒＲＮＡ配列を含むヌクレオチド配列である。
配列番号７５は、ＧＬ２標的配列により使用されるＣａｓ１２ａｃｒＲＮＡ配列を含むヌクレオチド配列である。
配列番号７６は、構築物２４７８５由来の融合タンパク質ｃＣａｓ９ＡＢＥ－０１を含むヌクレオチド配列である。
配列番号７７は、構築物２４７８５由来の融合タンパク質ｃＣａｓ９ＡＢＥ－０１を含むアミノ酸配列である。
配列番号７８は、構築物２５４５９由来の融合タンパク質ｃＬｂＣａｓ１ａＡＢＥ－０１を含むヌクレオチド配列である。
配列番号７９は、構築物２５４５９由来の融合タンパク質ｃＬｂＣａｓ１ａＡＢＥ－０１を含むアミノ酸配列である。
配列番号８０は、構築物２５５０４由来の融合タンパク質ｃＬｂＣａｓ１２ａＡＢＥ－０２を含むヌクレオチド配列である。
配列番号８１は、構築物２５５０４由来の融合タンパク質ｃＬｂＣａｓ１２ａＡＢＥ－０２を含むアミノ酸配列である。
配列番号８２は、構築物２５２８９由来の融合タンパク質ｃＬｂＣａｓ１２ａＢＥ－０９を含むヌクレオチド配列である。
配列番号８３は、構築物２５２８９由来の融合タンパク質ｃＬｂＣａｓ１２ａＢＥ－０９を含むアミノ酸配列である。
配列番号８４は、構築物２５６５８由来の融合タンパク質ｃｄＬｂＣａｓ１２ａ－ＡＢＥ－ＣＢＥ－０１を含むヌクレオチド配列である。
配列番号８５は、構築物２５６５８由来の融合タンパク質ｃｄＬｂＣａｓ１２ａ－ＡＢＥ－ＣＢＥ－０１を含むアミノ酸配列である。
配列番号８６は、構築物２５７０１由来の融合タンパク質ｃｄＬｂＣａｓ１２ａ－ＡＢＥ－ＣＢＥ－０２を含むヌクレオチド配列である。
配列番号８７は、構築物２５７０１由来の融合タンパク質ｃｄＬｂＣａｓ１２ａ－ＡＢＥ－ＣＢＥ－０２を含むアミノ酸配列である。
配列番号８８は、構築物２５７０２由来の融合タンパク質ｃｄＬｂＣａｓ１２ａ－ＡＢＥ－ＣＢＥ－０３を含むヌクレオチド配列である。
配列番号８９は、構築物２５７０２由来の融合タンパク質ｃｄＬｂＣａｓ１２ａ－ＡＢＥ－ＣＢＥ－０３を含むアミノ酸配列である。
配列番号９０は、Ｃａｓ１２ａｇＲＮＡＡＤＨ１標的配列を含むヌクレオチド配列である。
配列番号９１は、ＴａｄＡ二量体を含むヌクレオチド配列である。
配列番号９２は、ＴａｄＡ二量体を含むアミノ酸配列である。

この説明は、本発明を実施することができる全ての異なる方法、又は本発明に追加することができる全ての特徴の詳細なカタログであることを意図するものではない。例えば、一実施形態に関連して示される特徴は、他の実施形態に組み込まれてもよく、特定の実施形態に関連して示される特徴は、その実施形態から削除されてもよい。加えて、本明細書で示唆される様々な実施形態に対する多数のバリエーション及び追加は、本開示に照らして当業者には明らかであり、本発明から逸脱するものではない。従って、以下の説明は、本発明のいくつかの特定の実施形態を例示することを意図しており、その全ての置換、組合せ、及びバリエーションを網羅的に特定することを意図していない。

定義
別途定義されない限り、本明細書に用いられる全ての技術的及び科学的用語は、本発明が属する当業者により一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書における本発明の説明において使用される用語は、特定の実施形態を説明するためだけのものであり、本発明を限定することを意図するものではない。本明細書に言及されている全ての出版物、特許出願、特許、及び他の参考文献は、それらの全体が参照により組み込まれる。

以下の定義及び方法は、本発明をより良く定義し、本発明の実施において当業者を導くために提供される。特に断らない限り、本明細書で使用される用語は、関連技術における当業者による従来の使用に従って理解されるべきである。分子生物学における一般的用語の定義は、Ｒｉｅｇｅｒｅｔａｌ．，ＧｌｏｓｓａｒｙｏｆＧｅｎｅｔｉｃｓ：ＣｌａｓｓｉｃａｌａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒ，５^th ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ：ＮｅｗＹｏｒｋ，１９９４にも見出すことができる。

本明細書で使用される場合、「長リンカー」という用語は、異種ドメインを目的のタンパク質に連結するために使用される少なくとも１０個のアミノ酸のポリペプチド鎖を指す。例えば、限定されないが、長リンカーは、配列ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１１）を含み得、別途、（Ｇ₄Ｓ）₆、又は（Ｇ４Ｓ）×６、又は（Ｇ４Ｓ）＊６と表される。長リンカーは、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＳＧ（配列番号４４）を含み得、別途、（Ｇ₄ＳＧ）₆、又は（Ｇ４ＳＧ）×６、又は（Ｇ４ＳＧ）＊６と表される。長リンカーによりタンパク質に連結される異種ドメインとして、下記が挙げられる：シチジンデアミナーゼ、グアニンデアミナーゼ、ウラシルグリコシラーゼインヒビター（「ＵＧＩ」）、ヌクレアーゼ、及び目的のタンパク質に異種様式で作動可能に連結され得るあらゆる他のタンパク質性ドメイン。そのような目的のタンパク質として下記が挙げられるが、これらに限定されない：部位特異的ヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｉ、Ｃａｓ１２ｊ、又は他のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ）、ジンクフィンガー、メガヌクレアーゼ、転写アクチベーター様エフェクターヌクレーアゼ（「ＴＡＬＥＮ」）、及び同類のもの。

本発明の実施形態及び添付の特許請求の範囲の記載で使用されるように、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、及び「その（ｔｈｅ）」は、文脈が別段の明確な指示をしない限り、複数形も含むことが意図される。

本明細書で使用される場合、「及び／又は」は、関連する列挙された項目のうちの１つ以上の任意の及び全ての可能な組合せを指し、包含する。

「約」という用語は、本明細書で使用される場合、化合物の量、用量、時間、温度等の測定可能な値を指す場合、特定の量の２０％、１０％、５％、１％、０．５％、又はさらには０．１％の変動を包含することを意味する。

「含む」及び／又は「含んでいる」という用語は、本明細書で使用される場合、述べられた特徴、整数、工程、操作、エレメント、及び／又は成分の存在を指定するが、１つ以上の他の特徴、整数、工程、操作、エレメント、成分、及び／又はそれらの群の存在又は追加を排除しない。

本明細書で使用される場合、「から本質的になる」という移行句は、請求項の範囲が請求項に記載された特定の材料又は工程、並びに請求項に記載された発明の基本的且つ新規な特徴に実質的に影響を及ぼさないものを包含すると解釈されることを意味する。従って、用語「から本質的になる」は、本発明の請求項で使用される場合、「を含む」と同等であると解釈されることを意図しない。

本明細書で使用される場合、「増幅された」という用語は、核酸分子の少なくとも１つを鋳型として使用する、核酸分子の複数のコピー又は核酸分子に相補的な複数のコピーの構築を意味する。例えば、ＤｉａｇｎｏｓｔｉｃＭｏｌｅｃｕｌａｒＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ：ＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｄ．Ｈ．Ｐｅｒｓｉｎｇｅｔａｌ．，Ｅｄ．，ＡｍｅｒｉｃａｎＳｏｃｉｅｔｙｆｏｒＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．（１９９３）を参照されたい。増幅の産物は、アンプリコンと呼ばれる。

「コード配列」は、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、センスＲＮＡ又はアンチセンスＲＮＡ等のＲＮＡに転写される核酸配列である。いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、次いで、生物において翻訳されて、タンパク質を産生する。

本明細書で使用される場合、トランスジェニック「事象」という用語は、異種ＤＮＡ、例えば、１つ以上の目的の遺伝子（例えば、導入遺伝子）を含む発現カセットを有する単一の植物細胞の形質転換及び再生によって産生される組換え植物を指す。「事象」という用語は、異種ＤＮＡを含む形質転換体の元の形質転換体及び／又は子孫を指す。「事象」という用語はまた、形質転換体と別の系統との間の性的異系交配によって産生される子孫を指す。反復親に対して戻し交配を繰り返した後でも、挿入されたＤＮＡと形質転換された親からの隣接するＤＮＡは、同じ染色体上の位置で交配の子孫に存在する。通常、植物組織の形質転換は複数の事象を生じ、事象の各々は、植物細胞のゲノムの異なる位置へのＤＮＡ構築物の挿入を表している。導入遺伝子の発現又は他の望ましい特徴に基づいて、特定の事象が選択される。従って、本明細書で使用される「事象ＭＩＲ６０４」、「ＭＩＲ６０４」又は「ＭＩＲ６０４事象」は、ＭＩＲ６０４形質転換体の元のＭＩＲ６０４形質転換体及び／又は子孫を意味する（米国特許第７，３６１，８１３号明細書、第７，８９７，７４８号明細書、第８，３５４，５１９号明細書、及び第８，８８４，１０２号明細書、参照により本明細書に組み込まれる）。

本明細書で使用される「発現カセット」は、適切な宿主細胞における特定のヌクレオチド配列の発現を指示することができる核酸分子を意味し、目的のヌクレオチド配列（典型的には、コード領域）に作動可能に連結されたプロモーターを含み、これは終結シグナルに作動可能に連結されている。発現カセットはまた、典型的には、ヌクレオチド配列の適切な翻訳に必要な配列を含む。コード領域は、通常、目的のタンパク質をコードするが、目的の機能性ＲＮＡ、例えばアンチセンスＲＮＡ、又は翻訳されないＲＮＡも、センス又はアンチセンス方向にコードしてもよい。発現カセットはまた、目的のヌクレオチド配列の直接発現に必要ではないが、発現ベクターからカセットを除去するための便利な制限部位のために存在する配列を含んでもよい。目的のヌクレオチド配列を含む発現カセットは、キメラであり得、これは、その成分の少なくとも１つが、その他の成分の少なくとも１つに関して異種であることを意味する。発現カセットはまた、天然に存在するが、異種発現に有用な組換え形態で得られたものであってもよい。しかしながら、典型的には、発現カセットは、宿主に対して異種であり、即ち、発現カセットの特定の核酸配列は、宿主細胞内に天然には存在せず、当技術方法で既知の形質転換プロセスによって宿主細胞又は宿主細胞の祖先に導入されていなければならない。発現カセット内のヌクレオチド配列の発現は、構成的プロモーターの制御下にあってもよいし、又は宿主細胞が何らかの特定の外部刺激にさらされたときにのみ転写を開始する誘導性プロモーターの制御下にあってもよい。植物等の多細胞生物の場合、プロモーターはまた、特定の組織、又は器官、又は発生段階に特異的であり得る。発現カセット又はその断片はまた、植物に形質転換される場合、「挿入された配列」又は「挿入配列」と称され得る。

「遺伝子」は、ゲノム内に位置し、前述のコード核酸配列に加えて、コード部分の発現、即ち転写及び翻訳の制御に関与する他の主に調節性の核酸配列を含む、規定された領域である。遺伝子は、コード領域及び非コード領域（例えば、イントロン、調節エレメント、プロモーター、エンハンサー、終結配列、並びに５’及び３’非翻訳領域）の両方を含み得る。遺伝子は、典型的には、ｍＲＮＡ、機能性ＲＮＡ、又は調節配列を含む特定のタンパク質を発現する。遺伝子は、機能的タンパク質を産生するために使用され得るか、又はされ得ない。いくつかの実施形態では、遺伝子は、コード領域のみを指す。「天然遺伝子」という用語は、天然に見出されるような遺伝子を指す。「キメラ遺伝子」という用語は、１）天然では、共存して見出されない調節配列及びコード配列を含むＤＮＡ配列、又は２）天然には隣接していないタンパク質の一部をコードする配列、又は３）天然には隣接していないプロモーターの一部を含む任意の遺伝子を指す。従って、キメラ遺伝子は、異なる供給源に由来する調節配列及びコード配列を含むか、又は同じ供給源に由来するが、天然に見出されるものとは異なる様式で配置される調節配列及びコード配列を含み得る。遺伝子は、「単離」されてもよく、これは天然の状態で核酸分子と関連して通常見出される成分を実質的に又は本質的に含まない核酸分子を意味する。このような成分としては、他の細胞材料、組換え産生由来の培養培地、及び／又は核酸分子を化学的に合成する際に使用される種々の化学物質が挙げられる。

ポリヌクレオチドコード配列の「発現する」又は「発現」という用語は、配列が転写され、任意に翻訳されることを意味する。

「目的の遺伝子」、「目的のヌクレオチド配列」、又は「目的の配列」は、植物に移入された場合に、抗生物質耐性、ウイルス耐性、昆虫耐性、疾病耐性、又は他の害虫に対する耐性、除草剤耐性、栄養価の改善、工業プロセスにおける性能の改善、又は生殖能力の変化等の所望の特徴を植物に付与する任意の遺伝子を指す。「目的の遺伝子」はまた、植物において商業的に価値のある酵素又は代謝産物を産生するために植物に移入されるものであってもよい。

本明細書で使用される場合、「異種」は、それが導入される宿主細胞と天然に関連しない核酸分子又はヌクレオチド配列を指し、これは、別の種に由来するか、又は同じ種若しくは生物に由来するが、その元の形態又は細胞内で主に発現される形態から改変されている（天然に存在する核酸配列の天然に存在しない複数のコピーを含む）。従って、ヌクレオチド配列が導入される細胞のものとは異なる生物又は種に由来するヌクレオチド配列は、その細胞及び細胞の子孫に関して異種である。加えて、異種ヌクレオチド配列は、同じ天然の元の細胞型に由来し、挿入されるが、非天然の状態で存在する（例えば、異なるコピー数で存在する）、及び／又は核酸分子の天然の状態で見出されるものとは異なる調節配列の制御下に存在する、ヌクレオチド配列を含む。核酸配列はまた、例えば、発現ベクターのような核酸構築物において、それが関連し得る他の核酸配列に対して異種であり得る。非限定的な一例として、プロモーターは、その特定のプロモーターと関連して天然には存在しない、即ち、プロモーターに対して異種の１つ以上の調節エレメント及び／又はコード配列と組み合わせて、核酸構築物中に存在し得る。

「相同」核酸配列は、それが導入される宿主細胞に天然に関連する核酸配列である。相同核酸配列はまた、例えば核酸構築物中に存在し得る他の核酸配列と天然に関連する核酸配列であり得る。非限定的な一例として、プロモーターは、その特定のプロモーターと関連して天然に存在する、即ち、プロモーターと相同の１つ以上の調節エレメント及び／又はコード配列と組み合わせて、核酸構築物中に存在し得る。

「作動可能に連結された」は、一方の機能が他方の機能に影響を及ぼすような、単一の核酸配列上の核酸配列の会合を指す。例えば、プロモーターは、コード配列又は機能性ＲＮＡの発現に影響を及ぼすことができる場合（即ち、コード配列又は機能性ＲＮＡがプロモーターの転写制御下にある場合）、そのコード配列又は機能性ＲＮＡと作動可能に連結されている。センス又はアンチセンス配向におけるコード配列は、調節配列に作動可能に連結され得る。従って、ヌクレオチド配列と作動可能に関連する調節配列又は制御配列（例えば、プロモーター）は、ヌクレオチド配列の発現に影響を及ぼすことができる。例えば、ＧＦＰをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーターは、そのＧＦＰヌクレオチド配列の発現に影響を及ぼすことができる。

制御配列は、それらがその発現を指示するように機能する限り、目的のヌクレオチド配列と連続している必要はない。従って、例えば、介在する非翻訳であるが転写された配列は、プロモーターとコード配列との間に存在することができ、プロモーター配列は、依然としてコード配列に「作動可能に連結されている」と考えることができる。

本明細書で使用される「プライマー」は、核酸ハイブリダイゼーションによって相補的標的ＤＮＡ鎖にアニールされて、プライマーと標的ＤＮＡ鎖との間にハイブリッドを形成し、次いで、ＤＮＡポリメラーゼのようなポリメラーゼによって標的ＤＮＡ鎖に沿って伸長される単離された核酸である。プライマー対又はセットは、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）又は他の核酸増幅方法による核酸分子の増幅のために使用され得る。

「プローブ」は、標的核酸分子の一部に相補的であり、典型的には、標的核酸分子を検出及び／又は定量するために使用される、単離された核酸分子である。従って、いくつかの実施形態では、プローブは、検出可能な部分又はレポーター分子（例えば、放射性同位体、リガンド、化学発光剤、蛍光剤又は酵素）が結合している単離された核酸分子であり得る。本発明によるプローブは、デオキシリボ核酸又はリボ核酸だけでなく、標的核酸配列に特異的に結合し、その標的核酸配列の存在を検出し及び／又はその量を定量するために使用することができるポリアミド及び他のプローブ材料も含むことができる。

ＴａｑＭａｎプローブは、特定のプライマーセットによって増幅されたＤＮＡ領域内でアニールするように設計される。Ｔａｑポリメラーゼがプライマーを伸長し、新生鎖を一本鎖鋳型から相補鎖の３’から５’を合成すると、ポリメラーゼの５’から３’のエキソヌクレアーゼは、プローブを介して新生鎖を伸長し、その結果、鋳型にアニールしたプローブを分解する。プローブの分解は、それからフルオロフォアを放出し、クエンチャーへの近接を破壊し、従って、クエンチング効果を軽減し、フルオロフォアの蛍光を可能にする。従って、定量的ＰＣＲサーマルサイクラーで検出される蛍光は、放出されるフルオロフォア及びＰＣＲに存在するＤＮＡ鋳型の量に正比例する。

プライマー及びプローブは、一般に、５～１００ヌクレオチド又はそれを超える長さである。いくつかの実施形態では、プライマー及びプローブは、少なくとも２０ヌクレオチド以上の長さ、又は少なくとも２５ヌクレオチド以上、又は少なくとも３０ヌクレオチド以上の長さであり得る。このようなプライマー及びプローブは、当技術分野で既知の最適なハイブリダイゼーション条件下で標的配列に特異的にハイブリダイズする。本発明によるプライマー及びプローブは、標的配列と完全な配列相補性を有し得るが、標的配列とは異なり、標的配列にハイブリダイズする能力を保持するプローブは、本発明による従来の方法によって設計され得る。

プローブ及びプライマーを調製及び使用する方法は、例えば、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，２ｎｄｅｄ．，ｖｏｌ．１－３，ｅｄ．Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ．，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９に記載されている。ＰＣＲ－プライマー対は、例えば、その目的のために意図されるコンピュータープログラムを使用することによって、既知の配列から誘導され得る。

ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、ＤＮＡの特定の断片を「増幅」するための技術である。ＰＣＲを行うためには、複製されるＤＮＡ分子のヌクレオチド配列の少なくとも一部が既知でなければならない。一般に、増幅されるＤＮＡ（既知の配列）の各鎖の３’末端のヌクレオチド配列に相補的（例えば、実質的に相補的又は完全に相補的）なプライマー又は短いオリゴヌクレオチドが使用される。ＤＮＡサンプルを加熱してその鎖を分離し、プライマーと混合する。プライマーは、ＤＮＡサンプル中のそれらの相補的配列にハイブリダイズする。元のＤＮＡ鎖を鋳型として使用して合成が開始する（５’から３’方向）。反応混合物は、４つ全てのデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰ）及びＤＮＡポリメラーゼを含有しなければならない。重合は、新たに合成された各鎖が他のプライマーによって認識される配列を含むのに十分に進行するまで続く。これが起こると、元の分子と同一である２つのＤＮＡ分子が生成される。これらの２つの分子は、それらの鎖を分離するために加熱され、このプロセスが繰り返される。各サイクルでＤＮＡ分子の数が２倍になる。自動化された装置を用いて、複製の各サイクルを５分未満で完了することができる。３０サイクル後、ＤＮＡの単一分子として開始したものは、１０億を超えるコピーに増幅されている（２³⁰＝１．０２×１０⁹）。

オリゴヌクレオチドプライマー対のオリゴヌクレオチドは、反対のＤＮＡ鎖上に位置し、増幅されるべき領域に隣接するＤＮＡ配列に相補的である。アニーリングされたプライマーは、新たに合成されたＤＮＡ鎖にハイブリダイズする。最初の増幅サイクルは、その５’末端がオリゴヌクレオチドプライマーの位置によって固定されるが、その３’末端が可変である（不規則な（ｒａｇｇｅｄ）３’末端）２つの新しいＤＮＡ鎖を生じる。２つの新しい鎖は、次に、所望の長さの相補鎖の合成のための鋳型として働くことができる（５’末端はプライマーによって規定され、合成は、対向するプライマーの末端を越えて進行することができないため、３’末端は固定される）。数サイクル後、所望の固定長の産物が優勢になり始める。

リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応とも称される定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）は、ＰＣＲ反応からのＤＮＡ産物の蓄積をリアルタイムでモニターする。ｑＰＣＲは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に基づく分子生物学の実験室技術であり、標的ＤＮＡ分子を増幅し、同時に定量するために使用される。特異的配列の１コピーでさえ、ＰＣＲにおいて増幅及び検出することができる。ＰＣＲ反応は、ＤＮＡ鋳型のコピーを指数関数的に生成する。これは、出発標的配列の量と任意の特定のサイクルで蓄積されたＰＣＲ産物の量との間の定量的関係を生じる。鋳型、試薬制限又はピロリン酸分子の蓄積で見出されるポリメラーゼ反応の阻害剤のために、ＰＣＲ反応は、最終的に、指数関数的速度（即ち、プラトー相）で鋳型を生成するのを停止し、ＰＣＲ産物の終点定量を信頼できないものにする。従って、重複反応は、可変量のＰＣＲ産物を生成し得る。ＰＣＲ反応の指数関数相の間のみ、鋳型配列の開始量を決定するために外挿し戻すことが可能である。ＰＣＲ産物が蓄積するときのＰＣＲ産物の測定（即ち、リアルタイム定量ＰＣＲ）は、反応の指数関数相における定量を可能にし、従って、従来のＰＣＲに関連する変動性を除去する。リアルタイムＰＣＲアッセイにおいて、陽性反応は、蛍光シグナルの蓄積によって検出される。ＤＮＡサンプル中の１つ以上の特異的配列について、定量的ＰＣＲは、検出及び定量の両方を可能にする。この量は、コピーの絶対数、又はＤＮＡインプットに対して正規化された場合の相対量、又はさらなる正規化遺伝子のいずれかであり得る。リアルタイムＰＣＲの最初の記録以来、それは、ｍＲＮＡ発現研究、ゲノム又はウイルスＤＮＡにおけるＤＮＡコピー数測定、対立遺伝子識別アッセイ、遺伝子の特異的スプライスバリアントの発現分析、並びにパラフィン包埋組織及びレーザー捕獲顕微解剖細胞における遺伝子発現を含む、増大する及び多様な数の応用に使用されてきた。

本明細書で使用される場合、「Ｃｔ値」という表現は、「閾値サイクル」を指し、これは、「増幅された標的の量が固定閾値に達する分数サイクル数」と定義される。いくつかの実施形態では、これは、増幅曲線と閾値線との交点を表す。増幅曲線は、典型的には、所与のサイクル（Ｘ軸）での各反応の相対蛍光（Ｙ軸）の変化を示す「Ｓ」字形であり、これは、いくつかの実施形態では、リアルタイムＰＣＲ機器によってＰＣＲ中に記録される。閾値線は、いくつかの実施形態では、反応がバックグラウンドを超える蛍光強度に達する検出のレベルである。Ｌｉｖａｋ＆Ｓｃｈｍｉｔｔｇｅｎ（２００１）２５Ｍｅｔｈｏｄｓ４０２－４０８を参照されたい。これは、ＰＣＲにおける標的の濃度の相対的尺度である。一般に、ｑＰＣＲのような定量アッセイのための良好なＣｔ値は、いくつかの実施形態では、所与の参照遺伝子について１０～４０の範囲である。Ｃｔレベルは、サンプル中の標的核酸の量に反比例する（即ち、Ｃｔレベルが低いほど、サンプル中の検出可能な標的核酸の量が多い）。加えて、ｑＰＣＲのような定量アッセイについての良好なＣｔ値は、標的ｇＤＮＡの比例希釈で線形応答範囲を示す。

いくつかの実施形態では、ｑＰＣＲは、Ｃｔ値が定量分析のためにリアルタイムで収集され得る条件下で行われる。例えば、典型的なｑＰＣＲ実験において、ＤＮＡ増幅は、伸長段階の間のＰＣＲの各サイクルでモニターされる。ＤＮＡが増幅の対数線形相にある場合、蛍光の量は、一般にバックグラウンドを超えて増加する。いくつかの実施形態では、Ｃｔ値は、この時点で収集される。

本明細書で使用される場合、「細胞」という用語は、任意の生細胞を指す。細胞は、原核細胞又は真核細胞であり得る。細胞は、単離することができる。細胞は、生物に再生することができてもできなくてもよい。細胞は、組織、カルス、培養物、器官、又は部分の状態であり得る。いくつかの実施形態では、細胞は、植物細胞であってもよい。本発明の植物細胞は、単離された単一細胞の形態であり得るか、又は培養された細胞であり得るか、又は例えば植物組織若しくは植物器官のようなより高度に組織化された単位の一部であり得る。植物細胞は、被子植物若しくは裸子植物に由来し得るか、又はその一部であり得る。さらなる実施形態では、植物細胞は、単子葉植物細胞、双子葉植物細胞であってもよい。単子葉植物細胞は、例えば、トウモロコシ、イネ、モロコシ、サトウキビ、大麦、小麦、カラス麦、芝草、又は観賞用草細胞であり得る。双子葉植物細胞は、例えば、タバコ、コショウ、ナス、ヒマワリ、アブラナ科、アマ、ジャガイモ、綿、大豆、テンサイ、又はアブラナ細胞であってもよい。

「植物部分」という用語は、限定されるものではないが、本明細書で使用される場合、胚、花粉、胚珠、種子、葉、茎、苗条、花、枝、果実、穀粒、穂（ｅａｒ）、穂軸（ｃｏｂ）、殻、柄、根、根端、葯、植物細胞を含み、植物細胞は、植物及び／又は植物の一部、植物プロトプラスト、植物組織、植物細胞組織培養物、植物カルス、植物塊等において無傷である植物細胞を含む。本明細書で使用される場合、「苗条」は、葉及び茎を含む地上部分を指す。さらに、本明細書で使用される場合、「植物細胞」は、細胞壁を含み、プロトプラストとも称され得る、植物の構造的及び生理的単位を指す。

細胞、原核細胞、細菌細胞、真核細胞、植物細胞、植物及び／又は植物部分の状況における「導入している」又は「導入する」という用語は、核酸分子が細胞、真核細胞、植物細胞、並びに／又は植物及び／若しくは植物部分の細胞の内部に接近するように、核酸分子を細胞、真核細胞、植物、植物部分及び／又は植物細胞と接触させることを意味する。２つ以上の核酸分子が導入される場合、これらの核酸分子は、単一のポリヌクレオチド若しくは核酸構築物の一部として、又は別個のポリヌクレオチド若しくは核酸構築物として組み立てられ得、同じ又は異なる核酸構築物上に位置し得る。従って、これらのポリヌクレオチドは、単一の形質転換事象において、別々の形質転換事象において、又は例えば繁殖プロトコルの一部として、植物細胞に導入され得る。

本明細書で使用される場合、「形質転換された」及び「遺伝子導入」という用語は、少なくとも１つの組換え（例えば、異種）ポリヌクレオチドの全部又は一部を含有する任意の細胞、原核細胞、真核細胞、植物、植物細胞、カルス、植物組織、又は植物部分を指す。いくつかの実施形態では、組換えポリヌクレオチドの全部又は一部は、染色体又は安定な染色体外エレメントに安定的に統合され、その結果、連続した世代に渡される。本発明の目的のために、「組換えポリヌクレオチド」という用語は、遺伝子工学によって変更され、再配置され、又は改変されたポリヌクレオチドを指す。例としては、異種配列に結合又は連結された任意のクローン化ポリヌクレオチド、又はポリヌクレオチドが挙げられる。「組換え」という用語は、自然発生的変異のような天然に存在する事象から、又は非自然発生的変異誘発に続く選択的繁殖から生じるポリヌクレオチドの変化を指すものではない。

本明細書で使用される「形質転換」という用語は、異種核酸の細胞への導入を指す。細胞の形質転換は、安定的であっても一過性であってもよい。従って、本発明の遺伝子導入細胞、植物細胞、植物及び／又は植物部分は、安定的に形質転換され得るか、又は一過性に形質転換され得る。形質転換は、宿主細胞のゲノムへの核酸分子の転移を指し得、遺伝的に安定な継承をもたらす。いくつかの実施形態では、植物、植物部分及び／又は植物細胞への導入は、細菌媒介形質転換、粒子衝撃形質転換、リン酸カルシウム媒介形質転換、シクロデキストリン媒介形質転換、エレクトロポレーション、リポソーム媒介形質転換、ナノ粒子媒介形質転換、ポリマー媒介形質転換、ウイルス媒介核酸送達、ウィスカー媒介核酸送達、マイクロインジェクション、超音波処理、浸潤、ポリエチレングリコール媒介形質転換、プロトプラスト形質転換、又は植物、植物部分及び／若しくはその細胞への核酸の導入をもたらす任意の他の電気的、化学的、物理的及び／若しくは生物学的メカニズム、又はそれらの任意の組合せを介する。

植物を形質転換するための手順は、当技術分野で周知且つ日常的であり、文献を通して記載される。植物の形質転換のための方法の非限定的な例としては、細菌媒介核酸送達（例えば、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属からの細菌を介する）、ウイルス媒介核酸送達、炭化ケイ素又は核酸ウィスカー媒介核酸送達、リポソーム媒介核酸送達、マイクロインジェクション、マイクロ粒子衝撃、リン酸カルシウム媒介形質転換、シクロデキストリン媒介形質転換、エレクトロポレーション、ナノ粒子媒介形質転換、超音波処理、浸潤、ＰＥＧ媒介核酸取り込み、並びに植物細胞への核酸の導入をもたらす任意の他の電気的、化学的、物理的（機械的）及び／又は生物学的メカニズム（これらの任意の組み合わせを含む）を介する形質転換が挙げられる。当技術分野で既知の種々の植物形質転換法への一般的なガイドとしては、Ｍｉｋｉｅｔａｌ．（“ＰｒｏｃｅｄｕｒｅｓｆｏｒＩｎｔｒｏｄｕｃｉｎｇＦｏｒｅｉｇｎＤＮＡｉｎｔｏＰｌａｎｔｓ”ｉｎＭｅｔｈｏｄｓｉｎＰｌａｎｔＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙａｎｄＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｇｌｉｃｋ，Ｂ．Ｒ．ａｎｄＴｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｅ．，Ｅｄｓ．（ＣＲＣＰｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，ＢｏｃａＲａｔｏｎ，１９９３），ｐａｇｅｓ６７－８８）及びＲａｋｏｗｏｃｚｙ－Ｔｒｏｊａｎｏｗｓｋａ（ＣｅｌｌＭｏｌＢｉｏｌＬｅｔｔ７：８４９－８５８（２００２））が挙げられる。

アグロバクテリウム媒介形質転換は、形質転換の高い効率のため、及び多くの異なる種とのその広範な有用性のために、植物を形質転換するために一般に使用される方法である。アグロバクテリウム媒介形質転換は、典型的には、目的の外来ＤＮＡを担持するバイナリーベクターを、共存するＴｉプラスミド上又は染色体上のいずれかで宿主アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）株によって担持されるｖｉｒ遺伝子の補体に依存し得る適切なアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）株に導入することを含む（Ｕｋｎｅｓｅｔａｌ．１９９３，ＰｌａｎｔＣｅｌｌ５：１５９－１６９）。組換えバイナリーベクターのアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）への導入は、組換えバイナリーベクターを担持する大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）、組換えバイナリーベクターを標的アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）株に動員することができるプラスミドを担持するヘルパー大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株を用いる三親交配手順によって達成することができる。或いは、組換えバイナリーベクターは、核酸形質転換によってアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）に導入され得る（ＨｏｅｆｇｅｎａｎｄＷｉｌｌｍｉｔｚｅｒ１９８８，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ１６：９８７７）。

組換えアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）による植物の形質転換は、通常、植物からの外植片とのアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の共培養を含み、当技術分野で周知の方法に従う。形質転換された組織は、典型的には、バイナリープラスミドＴ－ＤＮＡ境界の間に抗生物質又は除草剤耐性マーカーを保有する選択培地上で再生される。

植物、植物部分及び植物細胞を形質転換するための別の方法は、植物組織及び細胞において不活性又は生物学的に活性な粒子を推進することを含む。例えば、米国特許第４，９４５，０５０号明細書、同第５，０３６，００６号明細書及び同第５，１００，７９２号明細書を参照されたい。一般に、この方法は、細胞の外表面に浸透し、その内部に組み込むのに有効な条件下で、植物細胞において不活性又は生物学的に活性な粒子を推進することを含む。不活性粒子が利用される場合、ベクターは、目的の核酸を含むベクターで粒子をコーティングすることによって、細胞に導入され得る。或いは、１つ以上の細胞をベクターによって取り囲むことができ、その結果、ベクターは、粒子の伴流によって細胞内に運ばれる。生物学的に活性な粒子（例えば、各々が導入されることが求められる１つ以上の核酸を含む、乾燥酵母細胞、乾燥細菌又はバクテリオファージ）もまた、植物組織中に推進され得る。

ポリヌクレオチドの状況における「一過性形質転換」は、ポリヌクレオチドが細胞に導入され、細胞のゲノムに統合されないことを意味する。

本明細書で使用される場合、細胞に導入されるポリヌクレオチドの状況において、「安定的に導入する」、「安定的に導入される」、「安定な形質転換」、又は「安定的に形質転換される」は、導入されたポリヌクレオチドが細胞のゲノムに安定的に統合され、従って、細胞がポリヌクレオチドで安定的に形質転換されていることを意味する。従って、統合されたポリヌクレオチドは、その子孫によって、より詳細には、複数の連続した世代の子孫によって遺伝され得る。本明細書で使用される「ゲノム」は、核及び／又は色素体ゲノムを含み、従って、例えば、葉緑体ゲノムへのポリヌクレオチドの統合を含む。本明細書で使用される安定な形質転換はまた、染色体外に維持されるポリヌクレオチド（例えば、ミニ染色体）を指す。

一過性の形質転換は、例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）又はウェスタンブロットによって検出され得、これは、生物に導入された１つ以上の核酸分子によってコードされるペプチド又はポリペプチドの存在を検出し得る。細胞の安定な形質転換は、例えば、生物（例えば、植物）に導入された核酸分子のヌクレオチド配列と特異的にハイブリダイズする核酸配列を用いた細胞のゲノムＤＮＡのサザンブロットハイブリダイゼーションアッセイによって検出され得る。細胞の安定な形質転換は、例えば、植物又は他の生物に導入された核酸分子のヌクレオチド配列と特異的にハイブリダイズする核酸配列を用いた細胞のＲＮＡのノーザンブロットハイブリダイゼーションアッセイによって検出することができる。細胞の安定な形質転換はまた、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）又は当技術分野で周知の他の増幅反応によって検出することができ、核酸分子の標的配列とハイブリダイズする特異的プライマー配列を使用し、標的配列の増幅をもたらし、これは、標準的な方法に従って検出され得る。形質転換はまた、当技術分野で周知の直接配列決定及び／又はハイブリダイゼーションプロトコルによって検出することができる。

従って、本発明の特定の実施形態において、植物細胞は、当技術分野で既知の任意の方法によって、また本明細書に記載されるように、形質転換され得、無傷の植物は、種々の既知の技術のいずれかを使用して、これらの形質転換細胞から再生され得る。植物細胞、植物組織培養物及び／又は培養プロトプラストからの植物再生は、例えば、Ｅｖａｎｓｅｔａｌ．（ＨａｎｄｂｏｏｋｏｆＰｌａｎｔＣｅｌｌＣｕｌｔｕｒｅｓ，Ｖｏｌ．１，ＭａｃＭｉｌａｎＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏ．ＮｅｗＹｏｒｋ（１９８３））；及びＶａｓｉｌＩ．Ｒ．（ｅｄ．）（ＣｅｌｌＣｕｌｔｕｒｅａｎｄＳｏｍａｔｉｃＣｅｌｌＧｅｎｅｔｉｃｓｏｆＰｌａｎｔｓ，Ａｃａｄ．Ｐｒｅｓｓ，Ｏｒｌａｎｄｏ，Ｖｏｌ．Ｉ（１９８４），ａｎｄＶｏｌ．ＩＩ（１９８６））に記載されている。形質転換された遺伝子導入植物、植物細胞、及び／又は植物組織培養物を選択する方法は、当技術分野で慣用的であり、本明細書に提供される本発明の方法において使用され得る。

「形質転換及び再生プロセス」は、植物細胞に導入遺伝子を安定的に導入し、遺伝子導入植物細胞から植物を再生するプロセスを指す。本明細書で使用される場合、形質転換及び再生は、形質転換された細胞が選択剤の存在下で生存し、発達的に繁殖するように、導入遺伝子が選択マーカーを含み、形質転換された細胞が導入遺伝子を組み込んで発現する選択プロセスを含む。「再生」は、植物細胞、植物細胞の群、又は植物片、例えばプロトプラスト、カルス、又は組織部分から植物全体を成長させることを指す。

「ヌクレオチド配列」、「核酸」、「核酸配列」、「核酸分子」、「オリゴヌクレオチド」及び「ポリヌクレオチド」という用語は、本明細書において、ヌクレオチドのヘテロポリマーを指すために互換的に使用され、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、合成（例えば、化学的に合成された）ＤＮＡ又はＲＮＡ、並びにＲＮＡ及びＤＮＡのキメラを含むＲＮＡ及びＤＮＡの両方を包含する。核酸分子という用語は、鎖の長さに関係なくヌクレオチドの鎖を指す。ヌクレオチドは、糖、リン酸、及びプリン又はピリミジンのいずれかである塩基を含む。核酸分子は、二本鎖又は一本鎖であり得る。一本鎖の場合、核酸分子は、センス鎖又はアンチセンス鎖であり得る。核酸分子は、オリゴヌクレオチド類似体又は誘導体（例えば、イノシン又はホスホロチオエートヌクレオチド）を用いて合成することができる。このようなオリゴヌクレオチドは、例えば、変化した塩基対合能力又はヌクレアーゼに対する増大した耐性を有する核酸分子を調製するために使用され得る。本明細書に提供される核酸配列は、左から右への５’から３’方向に提示され、米国配列規則、３７ＣＦＲ§§１．８２１－１．８２５及び世界知的所有権機関（ＷＩＰＯ）規格ＳＴ．２５に記載されているヌクレオチド文字を表すための標準コードを使用して表される。

「核酸断片」は、所与の核酸分子の断片である。「ＲＮＡ断片」は、所与のＲＮＡ分子の断片である。「ＤＮＡ断片」は、所与のＤＮＡ分子の断片である。「核酸断片」は、所与の核酸分子の断片であり、分子から単離されていない。「ＲＮＡ断片」は、所与のＲＮＡ分子の断片であり、分子から単離されていない。「ＤＮＡ断片」は、所与のＤＮＡ分子の断片であり、分子から単離されていない。ポリヌクレオチドのセグメントは、任意の長さ、例えば、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００、１５０、２００、３００又は５００以上のヌクレオチド長であり得る。ガイド配列のセグメント又は部分は、ガイド配列の約５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、例えば、ガイド配列の３分の１以下、例えば、７、６、５、４、３、又は２ヌクレオチド長であり得る。

分子の状況における「に由来する」という用語は、親分子又はその親分子からの情報を使用して単離又は作製された分子を指す。例えば、Ｃａｓ９単一変異体ニッカーゼ及びＣａｓ９二重変異体ヌル－ヌクレアーゼは、各々、野生型Ｃａｓ９タンパク質に由来する。

高等植物において、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）は遺伝物質であり、一方、リボ核酸（ＲＮＡ）は、ＤＮＡ内に含まれる情報のタンパク質への転移に関与する。「ゲノム」は、生物の各細胞に含まれる遺伝物質の全体である。他に示されない限り、本発明の特定の核酸配列はまた、その保存的に改変されたバリアント（例えば、縮重コドン置換）及び相補的配列並びに明示的に示される配列を暗黙に包含する。具体的には、縮重コドン置換は、１つ以上の選択された（又は全ての）コドンの第３の位置が混合塩基及び／又はデオキシイノシン残基で置換される配列を生成することによって達成され得る（Ｂａｔｚｅｒｅｔａｌ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＲｅｓ．１９：５０８１（１９９１）；Ｏｈｔｓｕｋａｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５－２６０８（１９８５）；及びＲｏｓｓｏｌｉｎｉｅｔａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ８：９１－９８（１９９４））。核酸分子という用語は、遺伝子、ｃＤＮＡ、及び遺伝子によってコードされるｍＲＮＡと互換的に使用される。

本明細書で使用される「配列同一性」は、成分（例えば、ヌクレオチド又はアミノ酸）のアライメントのウィンドウ全体にわたって、２つの最適に整列されたポリヌクレオチド又はペプチド配列が不変である程度を指す。「同一性」は、ＣｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ（Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，ｅｄ．）ＯｘｆｏｒｄＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＰｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ（１９８８）；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：ＩｎｆｏｒｍａｔｉｃｓａｎｄＧｅｎｏｍｅＰｒｏｊｅｃｔｓ（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，ｅｄ．）ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ（１９９３）；ＣｏｍｐｕｔｅｒＡｎａｌｙｓｉｓｏｆＳｅｑｕｅｎｃｅＤａｔａ，ＰａｒｔＩ（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄＧｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，ｅｄｓ．）ＨｕｍａｎａＰｒｅｓｓ，ＮｅｗＪｅｒｓｅｙ（１９９４）；ＳｅｑｕｅｎｃｅＡｎａｌｙｓｉｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ（ｖｏｎＨｅｉｎｊｅ，Ｇ．，ｅｄ．）ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ（１９８７）；及びＳｅｑｕｅｎｃｅＡｎａｌｙｓｉｓＰｒｉｍｅｒ（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｄｓ．）ＳｔｏｃｋｔｏｎＰｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ（１９９１）に記載されているものを含むがこれらに限定されない、既知の方法によって容易に計算することができる。

本明細書で使用される場合、「配列同一性パーセント」又は「同一性パーセント」という用語は、２つの配列が最適に整列される場合の試験（「対象」）ポリヌクレオチド分子（又はその相補鎖）と比較した、参照（「問い合わせ」）ポリヌクレオチド分子（又はその相補鎖）の線状ポリヌクレオチド配列中の同一ヌクレオチドの百分率を指す。いくつかの実施形態では、「同一性パーセント」は、アミノ酸配列中の同一アミノ酸の百分率を指すことができる。

本明細書で使用される場合、「実質的に同一」という表現は、２つの核酸分子、ヌクレオチド配列又はタンパク質配列の状況において、以下の配列比較アルゴリズムのうちの１つを使用して、又は目視検査によって測定して、最大対応について比較及び整列された場合に、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％のヌクレオチド又はアミノ酸残基の同一性を有する２つ以上の配列又はサブ配列を指す。本発明のいくつかの実施形態では、実質的な同一性は、長さが少なくとも約５０残基～約１５０残基である配列の領域にわたって存在する。従って、本発明のいくつかの実施形態では、実質的な同一性は、長さが少なくとも約５０、約６０、約７０、約８０、約９０、約１００、約１１０、約１２０、約１３０、約１４０、約１５０、又はそれを超える残基である配列の領域にわたって存在する。いくつかの特定の実施形態では、配列は、少なくとも約１５０残基にわたって実質的に同一である。さらなる実施形態では、配列は、コード領域の全長にわたって実質的に同一である。さらに、代表的な実施形態では、実質的に同一のヌクレオチド又はタンパク質配列は、実質的に同じ機能を行う（例えば、特定のゲノム標的への誘導、特定のゲノム標的部位のエンドヌクレアーゼ切断）。

配列比較のために、典型的には、１つの配列が、試験配列が比較される参照配列として機能する。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験配列及び参照配列をコンピュータに入力し、必要に応じてサブ配列座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメーターを指定する。次いで、配列比較アルゴリズムは、指定されたプログラムパラメーターに基づいて、参照配列に対する試験配列の配列同一性パーセントを計算する。

比較ウィンドウを整列させるための配列の最適なアライメントは、当業者に周知であり、Ｓｍｉｔｈ及びＷａｔｅｒｍａｎの局所相同性アルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈの相同性アライメントアルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ及びＬｉｐｍａｎの類似性方法の検索等のツールによって、及び任意に、ＧＣＧ（登録商標）ＷｉｓｃｏｎｓｉｎＰａｃｋａｇｅ（登録商標）（ＡｃｃｅｌｒｙｓＩｎｃ．、ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡ）の一部として入手可能なＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＴＡ等のこれらのアルゴリズムのコンピュータ化された実装によって、実施することができる。試験配列及び参照配列の整列されたセグメントについての「同一性分数」は、２つの整列された配列によって共有される同一の成分の数を、参照配列セグメント（即ち、参照配列全体又は参照配列のより小さい規定された部分）中の成分の総数で割ったものである。配列同一性パーセントは、同一性分数に１００を掛けたものとして表される。１つ以上のポリヌクレオチド配列の比較は、全長ポリヌクレオチド配列若しくはその一部、又はより長いポリヌクレオチド配列に対するものであり得る。本発明の目的のために、「同一性パーセント」はまた、翻訳されたヌクレオチド配列については、ＢＬＡＳＴＸバージョン２．０を使用し、ポリヌクレオチド配列については、ＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を使用して決定され得る。

ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアは、ＮａｔｉｏｎａｌＣｅｎｔｅｒｆｏｒＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎを通して公的に入手可能である。このアルゴリズムは、最初に、問い合わせ配列中の長さＷの短いワードを同定することによって、高スコア配列対（ＨＳＰ）を同定することを含み、これは、データベース配列中の同じ長さのワードと整列された場合に、いくつかの正の値の閾値スコアＴと一致するか、又は満たす。Ｔは、近傍ワードスコア閾値と称される（Ａｌｔｓｃｈｕｌｅｔａｌ．、１９９０）。これらの最初の近傍ワードヒットは、それらを含むより長いＨＳＰを見出すための検索を開始するための種として作用する。次いで、ワードヒットは、累積アライメントスコアが増加され得る限り、各配列に沿って両方向に伸長される。累積スコアは、ヌクレオチド配列について、パラメーターＭ（１対のマッチング残基に対する報酬スコア；常に＞０）及びＮ（ミスマッチング残基に対するペナルティスコア；常に＜０）を用いて算出される。アミノ酸配列については、スコアリングマトリックスを用いて累積スコアを計算する。各方向におけるワードヒットの延長は、累積アライメントスコアがその最大達成値から量Ｘだけ低下し、累積スコアが１つ以上の負のスコアリング残基アライメントの累積のためにゼロ以下になるか、又はいずれかの配列の末端に到達した場合に、停止される。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーターＷ、Ｔ、及びＸは、アライメントの感度及び速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列について）は、デフォルトとして、ワード長（Ｗ）１１、期待値（Ｅ）１０、カットオフ１００、Ｍ＝５、Ｎ＝４、及び両方の鎖の比較を使用する。アミノ酸配列については、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトとして、ワード長（Ｗ）３、期待値（Ｅ）１０、及びＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスを使用する（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ＆Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：１０９１５（１９８９）を参照されたい）。

配列同一性パーセントを計算することに加えて、ＢＬＡＳＴアルゴリズムはまた、２つの配列間の類似性の統計的分析を行う（例えば、Ｋａｒｌｉｎ＆Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：５８７３－５７８７（１９９３）を参照されたい）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性の１つの尺度は、最小合計確率（Ｐ（Ｎ））であり、これは、２つのヌクレオチド配列又はアミノ酸配列の間の一致が偶然に生じる確率の指標を提供する。例えば、試験核酸配列は、試験ヌクレオチド配列と参照ヌクレオチド配列との比較における最小合計確率が約０．１未満～約０．００１未満である場合、参照配列に類似すると考えられる。従って、本発明のいくつかの実施形態では、試験ヌクレオチド配列と参照ヌクレオチド配列との比較における最小合計確率は、約０．００１未満である。

２つのヌクレオチド配列はまた、２つの配列がストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズする場合、実質的に同一と考えられ得る。いくつかの代表的な実施形態では、実質的に同一であると考えられる２つのヌクレオチド配列は、高度にストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズする。

核酸ハイブリダイゼーション実験、例えばサザン及びノーザンハイブリダイゼーションの状況における「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」及び「ストリンジェントなハイブリダイゼーション洗浄条件」は、配列依存性であり、異なる環境パラメーターの下で異なっている。核酸のハイブリダイゼーションの広範な指針は、ＴｉｊｓｓｅｎＬａｂｏｒａｔｏｒｙＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓｉｎＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ－ＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎｗｉｔｈＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＰｒｏｂｅｓｐａｒｔＩｃｈａｐｔｅｒ２“Ｏｖｅｒｖｉｅｗｏｆｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓｏｆｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎａｎｄｔｈｅｓｔｒａｔｅｇｙｏｆｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄｐｒｏｂｅａｓｓａｙｓ”Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，ＮｅｗＹｏｒｋ（１９９３）に見出される。一般に、高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション及び洗浄条件は、規定されたイオン強度及びｐＨにおける特異的配列についての熱融点（Ｔ_m）よりも約５℃低くなるように選択される。

Ｔ_mとは、標的配列の５０％が完全に一致するプローブとハイブリダイズする（規定のイオン強度及びｐＨの下での）温度である。非常にストリンジェントな条件は、特定のプローブについてのＴ_mに等しくなるように選択される。サザン又はノーザンブロットにおいてフィルター上に１００を超える相補的残基を有する相補的ヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションのためのストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例は、４２℃での５０％ホルムアミドと１ｍｇのヘパリンであり、ハイブリダイゼーションは、一晩行われる。高度にストリンジェントな洗浄条件の例は、７２℃で約１５分間、０．１５ＭＮａＣｌである。ストリンジェントな洗浄条件の例は、６５℃で１５分間の０．２ｘＳＳＣ洗浄である（ＳＳＣ緩衝液の記載については、下記のＳａｍｂｒｏｏｋを参照されたい）。しばしば、バックグラウンドプローブシグナルを除去するために、高ストリンジェンシー洗浄の前に、低ストリンジェンシー洗浄が行われる。例えば、１００ヌクレオチドを超える二重鎖についての中程度のストリンジェンシー洗浄の例は、４５℃で１５分間の１ｘＳＳＣである。例えば、１００ヌクレオチドを超える二重鎖についての低ストリンジェンシー洗浄の例は、４０℃で１５分間の４～６ｘＳＳＣである。短いプローブ（例えば、約１０～５０ヌクレオチド）の場合、ストリンジェントな条件は、典型的には、約１．０Ｍ未満のＮａイオンの塩濃度、典型的には、ｐＨ７．０～８．３で約０．０１～１．０ＭのＮａイオン濃度（又は他の塩）を含み、温度は、典型的には、少なくとも約３０℃である。ストリンジェントな条件は、ホルムアミド等の不安定化剤の添加によっても達成することができる。一般に、特定のハイブリダイゼーションアッセイにおいて無関係なプローブについて観察されるものよりも２倍（又はそれよりも高い）のシグナル対ノイズ比は、特異的ハイブリダイゼーションの検出を示す。ストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズしないヌクレオチド配列は、それらがコードするタンパク質が実質的に同一である場合、なお実質的に同一である。これは、例えば、ヌクレオチド配列のコピーが遺伝暗号によって許容される最大コドン縮重を用いて作製される場合に起こり得る。

以下は、本発明の参照ヌクレオチド配列と実質的に同一である相同ヌクレオチド配列をクローニングするために使用され得るハイブリダイゼーション／洗浄条件のセットの例である。一実施形態では、参照ヌクレオチド配列は、５０℃で７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．５ＭＮａＰＯ₄、１ｍＭＥＤＴＡ中の「試験」ヌクレオチド配列とハイブリダイズし、５０℃で２ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で洗浄する。別の実施形態では、参照ヌクレオチド配列は、５０℃で７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．５ＭＮａＰＯ₄、１ｍＭＥＤＴＡ中の「試験」ヌクレオチド配列とハイブリダイズし、５０℃で１ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で洗浄し、又は５０℃で７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．５ＭＮａＰＯ₄、１ｍＭＥＤＴＡ中の「試験」ヌクレオチド配列とハイブリダイズし、５０℃で０．５ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で洗浄する。なおさらなる実施形態では、参照ヌクレオチド配列は、５０℃で７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．５ＭＮａＰＯ₄、１ｍＭＥＤＴＡ中の「試験」ヌクレオチド配列とハイブリダイズし、５０℃で０．１ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で洗浄し、又は５０℃で７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．５ＭＮａＰＯ₄、１ｍＭＥＤＴＡ中の「試験」ヌクレオチド配列とハイブリダイズし、６５℃で０．１ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で洗浄する。

「単離された」核酸分子若しくはヌクレオチド配列又は「単離された」ポリペプチドは、ヒトの手によって、その天然の環境とは別に存在し、及び／又はその天然の環境におけるその機能と比較して異なる、改変された、調節された、及び／又は変更された機能を有し、従って天然の産物ではない、核酸分子、ヌクレオチド配列又はポリペプチドである。単離された核酸分子又は単離されたポリペプチドは、精製された形態で存在し得るか、又は非天然環境（例えば、組換え宿主細胞）において存在し得る。従って、例えば、ポリヌクレオチドに関して、単離されるという用語は、それが天然に存在する染色体及び／又は細胞から分離されることを意味する。ポリヌクレオチドはまた、それが天然に存在する染色体及び／又は細胞から分離され、次いで遺伝的状況、染色体、染色体位置、及び／又はそれが天然に存在しない細胞に挿入される場合、単離される。本発明の組換え核酸分子及びヌクレオチド配列は、上記で定義したように「単離された」と考えることができる。

従って、「単離された核酸分子」又は「単離されたヌクレオチド配列」は、それが由来する生物の天然に存在するゲノムにおいて、それが直接隣接している（５’末端に１つ、３’末端に１つ）ヌクレオチド配列に対して直接隣接していない核酸分子又はヌクレオチド配列である。従って、一実施形態では、単離された核酸は、コード配列に直接隣接する５’非コード（例えば、プロモーター）配列のいくつか又は全てを含む。従って、この用語は、例えば、ベクター、自律複製プラスミド若しくはウイルス、又は原核生物若しくは真核生物のゲノムＤＮＡに組み込まれるか、又は他の配列とは無関係に別個の分子（例えば、ＰＣＲ又は制限エンドヌクレアーゼ処理によって産生されるｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ断片）として存在する組換え核酸を含む。それはまた、さらなるポリペプチド又はペプチド配列をコードするハイブリッド核酸分子の一部である組換え核酸を含む。「単離された核酸分子」又は「単離されたヌクレオチド配列」はまた、同じ天然の元の細胞型に由来し、挿入されるが、非天然の状態で存在する、例えば異なるコピー数で存在する、及び／又は核酸分子の天然の状態で見出されるものとは異なる調節配列の制御下で存在する、ヌクレオチド配列を含み得る。

「単離された」という用語は、さらに、細胞物質、ウイルス物質、及び／又は培養培地を実質的に含まない核酸分子、ヌクレオチド配列、ポリペプチド、ペプチド、又は断片（例えば、組換えＤＮＡ技術によって生成された場合）、又は化学的前駆体若しくは他の化学物質（例えば、化学的に合成された場合）を指すことができる。さらに、「単離された断片」は、断片として天然には存在せず、そのようなものとして天然の状態では見出されない核酸分子、ヌクレオチド配列、又はポリペプチドの断片である。「単離された」は、調製物が技術的に純粋（均質）であることを必ずしも意味しないが、意図された目的のために使用することができる形態でポリペプチド又は核酸を提供するのに十分に純粋である。

本発明の代表的な実施形態では、「単離された」核酸分子、ヌクレオチド配列、及び／又はポリペプチドは、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％（ｗ／ｗ）又はそれを超える純度である。他の実施形態では、「単離された」核酸、ヌクレオチド配列、及び／又はポリペプチドは、出発物質と比較して、核酸（ｗ／ｗ）の少なくとも約５倍、１０倍、２５倍、１００倍、１０００倍、１０，０００倍、１００，０００倍又はそれを超える濃縮が達成されていることを示す。

「野生型」ヌクレオチド配列又はアミノ酸配列は、天然に存在する（「天然」）又は内因性のヌクレオチド配列又はアミノ酸配列を指す。従って、例えば、「野生型ｍＲＮＡ」は、生物内に天然に存在する、又は生物に内因性のｍＲＮＡである。「相同」ヌクレオチド配列は、それが導入される宿主細胞に天然に関連するヌクレオチド配列である。

「オープンリーディングフレーム」及び「ＯＲＦ」という用語は、コード配列の翻訳開始コドンと終結コドンとの間にコードされるアミノ酸配列を指す。「開始コドン」及び「終結コドン」という用語は、各々、タンパク質合成（ｍＲＮＡ翻訳）の開始及び連鎖終結を指定するコード配列中の３つの隣接するヌクレオチド（「コドン」）の単位を指す。

「プロモーター」は、通常そのコード配列の上流（５’）にあるヌクレオチド配列を指し、これはＲＮＡポリメラーゼ及び適切な転写に必要な他の因子に対する認識を提供することによってコード配列の発現を制御する。「プロモーター調節配列」は、近位及びより遠位の上流エレメントから成る。プロモーター調節配列は、関連するコード配列の転写、ＲＮＡプロセシング又は安定性、又は翻訳に影響を及ぼす。調節配列には、エンハンサー、プロモーター、非翻訳リーダー配列、イントロン、及びポリアデニル化シグナル配列が含まれる。これらには、天然及び合成配列、並びに天然及び合成配列の組み合わせであり得る配列が含まれる。「エンハンサー」は、プロモーター活性を刺激し得るＤＮＡ配列であり、プロモーターの生得的エレメント、又はプロモーターのレベル若しくは組織特異性を高めるために挿入された異種エレメントであり得る。エンハンサーは、両方の配向（通常又は反転）で作動することができ、プロモーターから上流又は下流のいずれかに移動させても機能することができる。「プロモーター」という用語の意味は、「プロモーター調節配列」を含む。

「一次形質転換体」及び「Ｔ０世代」は、最初に形質転換された（即ち、形質転換から減数分裂及び受精を経ていない）組織と同じ遺伝的世代である遺伝子導入植物を指す。「二次形質転換体」及び「Ｔ１、Ｔ２、Ｔ３等の世代」は、１つ以上の減数分裂及び受精サイクルを経て一次形質転換体に由来する遺伝子導入植物を指す。これらは、一次若しくは二次形質転換体の自家受精、又は一次若しくは二次形質転換体と他の形質転換された若しくは形質転換されていない植物との交配によって誘導され得る。

「導入遺伝子」は、形質転換によってゲノムに導入され、安定的に維持されている核酸分子を指す。導入遺伝子は、少なくとも１つの発現カセットを含んでもよく、典型的には、少なくとも２つの発現カセットを含み、１０以上の発現カセットを含んでもよい。導入遺伝子には、例えば、形質転換される特定の植物の遺伝子と異種又は同種の遺伝子が含まれ得る。さらに、導入遺伝子には、非天然生物に挿入された天然遺伝子、又はキメラ遺伝子が含まれ得る。「内因性遺伝子」という用語は、生物のゲノム中の天然位置にある天然遺伝子を指す。「外来」遺伝子は、宿主生物には通常見られないが、遺伝子導入によって生物に導入される遺伝子を指す。

「イントロン」は、ほとんど真核生物の遺伝子内にのみ存在するが、遺伝子産物中のアミノ酸配列には翻訳されないＤＮＡの介在区分を指す。イントロンは、スプライシングと呼ばれるプロセスを経て未熟なｍＲＮＡから除去され、スプライシングは、エクソンをそのままに残してｍＲＮＡを形成する。本発明の目的のために、「イントロン」という用語の定義は、標的遺伝子に由来するイントロンのヌクレオチド配列に対する改変を含むが、但し、改変されたイントロンは、その関連する５’調節配列の活性を有意に低下させないことを条件とする。

「エクソン」は、タンパク質又はその一部のコード配列を有するＤＮＡの部分を指す。エクソンは、介在する非コード配列（イントロン）によって分離されている。本発明の目的のために、「エクソン」という用語の定義は、標的遺伝子に由来するエクソンのヌクレオチド配列に対する改変を含むが、但し、改変されたエクソンは、その関連する５’調節配列の活性を有意に低下させないことを条件とする。

「切断」又は「切断している」という用語は、ポリヌクレオチドのリボシルホスホジエステルバックボーンにおける共有結合ホスホジエステル結合の切断を意味する。「切断」又は「切断している」という用語は、一本鎖切断及び二本鎖切断の両方を包含する。二本鎖切断は、２つの異なる一本鎖切断事象の結果として起こり得る。切断は、平滑末端又は互い違いの末端のいずれかの生成をもたらすことができる。「ヌクレアーゼ切断部位」又は「ゲノムヌクレアーゼ切断部位」は、特定のヌクレアーゼによって認識されるヌクレアーゼ切断配列を含むヌクレオチドの領域であり、これは、一方又は両方の鎖においてゲノムＤＮＡのヌクレオチド配列を切断するように作用する。ヌクレアーゼ酵素によるこのような切断は、細胞内でＤＮＡ修復機構を開始させ、それが相同組換えを起こすための環境を確立する。

本発明は、融合タンパク質であって、デアミナーゼドメインと部位特異的ＤＮＡ結合ドメインとの間のリンカーが改善されており、それにより編集効率が上昇しており且つ変異頻度が低下している、融合タンパク質を提供する。本発明の一部の実施形態では、デアミナーゼドメインは、シチジンデアミナーゼである。本発明の他の実施形態では、デアミナーゼドメインは、アデニンデアミナーゼである。一部の実施形態では、シチジンデアミナーゼドメインは、活性化誘導シチジンデアミナーゼ（「ＡＩＤ」）である。本発明の一部の実施形態では、シチジンデアミナーゼドメインは、アポリポタンパク質ＢｍＲＮＡ編集複合体（「ＡＰＯＢＥＣ」）ドメインである。一部の実施形態では、このＡＰＯＢＥＣドメインは、ＡＰＯＢＥＣ１ファミリデアミナーゼである。

「シチジンデアミナーゼ」は、シチジン及びデオキシシチジンそれぞれのウリジン及びデオキシウリジンへの不可逆的な加水分解的脱アミノ化を触媒する酵素を指す。シチジンデアミナーゼは、細胞内ピリミジンプールを維持する。シチジンデアミナーゼのあるファミリは、ＡＰＯＢＥＣ（「アポリポタンパク質ＢｍＲＮＡ編集酵素、触媒ポリペプチド様」）である。このファミリのメンバーは、ＣからＵへの編集酵素である。ＡＰＯＢＥＣ様タンパク質のＮ末端ドメインは触媒ドメインであり、Ｃ末端ドメインは疑似触媒ドメインである。より具体的には、この触媒ドメインは、亜鉛依存性のシチジンデアミナーゼドメインであり、シチジン脱アミノ化に重要である。ＡＰＯＢＥＣ１によるＲＮＡ編集にはホモ二量体化が必要であり、この複合体は、ＲＮＡ結合タンパク質と相互作用してエディトソーム（ｅｄｉｔｏｓｏｍｅ）を形成する。ＡＰＯＢＥＣタンパク質の非限定的な例として、ＡＰＯＢＥＣ１、ＡＰＯＢＥＣ２、ＡＰＯＢＥＣ３Ａ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｂ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｃ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｄ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｆ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｈ、ＡＰＯＢＥＣ４、及び活性化誘導（シチジン）デアミナーゼが挙げられる。ＡＰＯＢＥＣタンパク質の様々な変異体であって、塩基エディタに対して異なる編集特性をもたらす変異体も既知である。例えば、ヒトＡＰＯＢＥＣ３Ａの場合には、ある特定の変異体（例えば、Ｙ１３０Ｆ、Ｙ１３２Ｄ、Ｗ１０４Ａ、及びＤ１３１Ｙ）は、編集効率という点で、野生型ヒトＡＰＯＢＥＣ３Ａよりもさらに優れている。従って、ＡＰＯＢＥＣという用語、及びそのファミリメンバーのそれぞれはまた、対応する野生型ＡＰＯＢＥＣタンパク質に対してある特定レベル（例えば、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％）の配列同一性を有し且つシチジン脱アミノ化活性を保持するバリアント及び変異体も包含する。これらバリアント及び変異体を、アミノ酸の付加、欠失、及び／又は置換により誘導し得る。そのような置換は、一部の実施形態では、保存的置換である。

「シトシン塩基エディタ」（「ＣＢＥ」）は、Ｃ・Ｇ塩基対をＴ・Ａ塩基対へと変換する。

「アデニンデアミナーゼ」は、アデノシンのイノシンへの加水分解的脱アミノ化を触媒する酵素を指す。イノシンはＣと対を形成し、従ってＧとして読み取られるか、又はＧとして複製される。例示的な酵素は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来のＴａｄＡであり、このＴａｄＡは、ホモ二量体として機能する。

「アデニン塩基エディタ」（「ＡＢＥ」）は、Ａ・Ｔ塩基対をＧ・Ｃ塩基対へと変換する。

ラクノスピラ科細菌（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）Ｃｐｆ１（ＬｂＣｐｆ１）は、大きい群の多くのＣｐｆ１タンパク質の内の１つである。「Ｃｐｆ１」及び「Ｃａｓ１２ａ」という用語は、全体を通して互換的に使用される。Ｃｐｆ１は、Ｃａｓタンパク質である。「Ｃａｓタンパク質」又は「クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）関連（Ｃａｓ）タンパク質」という用語は、例えばストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｙｏｇｅｎｅｓ）及び他の細菌で見出される適応免疫系であるＣＲＩＳＰＲ（クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート）と関連するＲＮＡ誘導ＤＮＡエンドヌクレアーゼ酵素を指す。Ｃａｓタンパク質として、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１２、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｉ、Ｃａｓ１２ｊ等が挙げられる。本発明の一部の実施形態では、部位特異的ＤＮＡ結合ドメインは、ラクノスピラ科細菌（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）由来の触媒的に不活性なＣａｓ１２ａ（「ｄＬｂＣａｓ１２ａ」）である。他の実施形態では、部位特異的ＤＮＡ結合ドメインは、ラクノスピラ科細菌（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）由来の触媒的に活性なもの（「ＬｂＣａｓ１２ａ」）又はモラクセラ・ボーボクリ（Ｍｏｒａｘｅｌｌａｂｏｖｏｃｕｌｉ）ＡＡＸ０８＿００２０５由来の触媒的に活性なもの（「Ｍｂ２Ｃａｓ１２ａ」）である。本発明の一部の実施形態では、融合タンパク質の部位特異的ＤＮＡ結合ドメインとして、ラクノスピラ科細菌（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、アシダミノコッカス種（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓｓｐ．）、モラクセラ・ボーボクリ（Ｍｏｒａｘｅｌｌａｂｏｖｏｃｕｌｉ）、チオミクロスピラ種（Ｔｈｉｏｍｉｃｒｏｓｐｉｒａｓｐ．）、モラクセラ・ラクナータ（Ｍｏｒａｘｅｌｌａｌａｃｕｎａｔａ）、メタノメチルオフィルス・アルバス（Ｍｅｔｈａｎｏｍｅｔｈｙｌｏｐｈｉｌｕｓａｌｖｕｓ）、ブチリビブリオ種（Ｂｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏｓｐ．）、又はバクテロイデテソラル種（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓｏｒａｌｓｐ．）由来のＣａｓ１２ａタンパク質が提供される。

本融合タンパク質は、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼインヒビター（ＵＧＩ）及び核局在化配列（ＮＬＳ）等の他の断片を含み得る。

バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）バクテリオファージＰＢＳ１から調製され得る「ウラシルグリコシラーゼインヒビター」（ＵＧＩ）は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ウラシル－ＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）及び他種由来のＵＤＧを阻害する低分子タンパク質（９．５ｋＤａ）である。ＵＤＧの阻害は、１：１ＵＧＤ：ＵＧＩ化学量論での可逆的タンパク質結合により起こる。ＵＧＩは、ＵＤＧ－ＤＮＡ複合体を解離させ得る。ＵＧＩの非限定的な例は、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ファージＡＲ９で見出される（ＹＰ＿００９２８３００８．１）。一部の実施形態では、ＵＧＩは、配列番号８のアミノ酸配列を含むか、又は配列番号８に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、又は９５％の配列同一性を有し、且つウラシルグリコシラーゼ阻害活性を保持する。

一部の実施形態では、ＵＧＩは、シチジンデアミナーゼ－Ｃｐｆ１部分のＣ末端側に配置されている。一部の実施形態では、本融合タンパク質は、少なくとも２個のＵＧＩを含む。

一部の実施形態では、少なくとも１個の核局在化シグナル（「ＮＬＣ」）が第１の断片及び第２の断片（シチジンデアミナーゼ－Ｃｐｆ１部分）のＣ末端に位置しており、例えば、第２の断片（Ｃｐｆ１を含む）とＵＧＩとの間に位置している。一部の実施形態では、少なくとも２個のＮＬＳが、第２の断片とＵＧＩとの間に位置している。一部の実施形態では、少なくとも３個のＮＬＳが、第２の断片とＵＧＩとの間に位置している。一部の実施形態では、少なくとも１個のＮＬＳが、第１の断片及び第２の断片（シチジンデアミナーゼ－Ｃｐｆ１部分）のＮ末端に位置している。

本融合タンパク質中の構成成分の配置の非限定的な例として、下記が挙げられる：Ｎ末端からＣ末端へ、（ａ）ＮＬＳ、シチジンデアミナーゼ、Ｃａｓ１２ａ、ＮＬＳ、ＵＧＩ、ＮＬＳ、２Ａ、及びＵＧＩ；（ｂ）ＮＬＳ、シチジンデアミナーゼ、Ｃａｓ１２ａ、ＮＬＳ、ＮＬＳ、ＵＧＩ、ＮＬＳ、２Ａ、及びＵＧＩ；（ｃ）ＮＬＳ、シチジンデアミナーゼ、Ｃａｓ１２ａ、ＮＬＳ、ＵＧＩ、ＮＬＳ、２Ａ、ＵＧＩ、２Ａ、及びＵＧＩ；（ｄ）ＮＬＳ、シチジンデアミナーゼ、Ｃａｓ１２ａ、ＮＬＳ、ＵＧＩ、ＮＬＳ、２Ａ、ＵＧＩ、２Ａ、ＵＧＩ、２Ａ、及びＵＧＩ。

一部の実施形態では、本融合タンパク質中のそれぞれの断片の間には、ペプチドリンカーが任意選択的に設けられている。一部の実施形態では、このペプチドリンカーは、１～１００個のアミノ酸残基（又は限定されないが、３～２０個、４～１５個）を有する。一部の実施形態では、ペプチドリンカーのアミノ酸残基の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％は、アラニン、グリシン、システイン、及びセリンからなる群から選択されるアミノ酸残基である。

本発明はまた、本発明のガイドＲＮＡをコードする核酸配列を含む核酸分子を提供する。この核酸分子は、ＤＮＡ又はＲＮＡ分子であり得る。いくつかの実施形態では、この核酸分子は、環状化されている。他の実施形態では、この核酸分子は、線状である。いくつかの実施形態では、この核酸分子は、一本鎖、部分二本鎖、又は二本鎖である。いくつかの実施形態では、この核酸分子は、少なくとも１つのポリペプチドと複合体化される。ポリペプチドは、核酸認識ドメイン又は核酸結合ドメインを有し得る。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、例えば、本発明のキメラＲＮＡ及び任意にヌクレアーゼの送達を媒介するためのシャトルである。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、Ｆｅｌｄａｎシャトル（米国特許出願公開第２０１６０２９８０７８号明細書、参照により本明細書に組み込まれる）である。

「オンターゲット編集」とは、ｇＲＮＡの標的であるＰＡＭ部位の後に続く領域におけるシトシンからチミンへの置換のことである。主な編集ウィンドウは、ＰＡＭ部位の後に続く８～１３個の塩基である。「オフターゲット編集」とは、ｇＲＮＡ標的領域内でのインデル若しくはＣからＴ以外の塩基変更のことであるか、又はｇＲＮＡ標的領域外での塩基変更若しくはインデルのことである。

「部位特異的改変ポリペプチド」は、標的ＤＮＡ（例えば、標的ＤＮＡの切断又はメチル化）及び／又は標的ＤＮＡに関連するポリペプチド（例えば、ヒストン尾部のメチル化又はアセチル化）を改変する。部位特異的改変ポリペプチドは、本明細書では、「部位特異的ポリペプチド」又は「ＲＮＡ結合部位特異的改変ポリペプチド」とも称される。部位特異的改変ポリペプチドは、単一ＲＮＡ分子又は少なくとも２つのＲＮＡ分子のＲＮＡ二重鎖のいずれかであり、且つガイドＲＮＡとの関係により、ＤＮＡ配列（例えば、染色体配列又は染色体外配列、例えば、エピソーム配列、ミニサークル配列、ミトコンドリア配列、葉緑体配列等）に導かれるガイドＲＮＡと相互作用する。

いくつかの場合、部位特異的改変ポリペプチドは、天然に存在する改変ポリペプチドである。他の場合、部位特異的改変ポリペプチドは、天然に存在しないポリペプチド（例えば、キメラポリペプチド又は改変された、例えば、変異、削除、挿入された天然に存在するポリペプチド）である。例示的な天然に存在する部位特異的改変ポリペプチドは、当技術分野で既知である（例えば、Ｍａｋａｒｏｖａｅｔａｌ．，２０１７，Ｃｅｌｌ１６８：３２８－３２８．ｅ１，及びＳｈｍａｋｏｖｅｔａｌ．，２０１７，ＮａｔＲｅｖＭｉｃｒｏｂｉｏｌ１５（３）：１６９－１８２参照、両方とも参照により本明細書に組み込まれる）。これらの天然に存在するポリペプチドは、ＤＮＡ標的化ＲＮＡに結合し、それにより標的ＤＮＡ内の特異的配列に誘導され、標的ＤＮＡを切断して二本鎖切断を生成する。

部位特異的改変ポリペプチドは、２つの部分、ＲＮＡ結合部分及び活性部分を含む。いくつかの実施形態では、部位特異的改変ポリペプチドは、以下を含む：（ｉ）ＤＮＡ標的化ＲＮＡと相互作用するＲＮＡ結合部分、ここでＤＮＡ標的化ＲＮＡは、標的ＤＮＡにおける配列に相補的なヌクレオチド配列を含む；及び（ｉｉ）部位特異的酵素活性（例えば、ＤＮＡメチル化についての活性、ＤＮＡ切断についての活性、ヒストンアセチル化についての活性、ヒストンメチル化についての活性等）を示す活性部分、ここで酵素活性の部位は、ＤＮＡ標的化ＲＮＡによって決定される。他の実施形態では、部位特異的改変ポリペプチドは、以下を含む：（ｉ）ＤＮＡ標的化ＲＮＡと相互作用するＲＮＡ結合部分、ここでＤＮＡ標的化ＲＮＡは、標的ＤＮＡにおける配列に相補的なヌクレオチド配列を含む；及び（ｉｉ）標的ＤＮＡ内の転写を調節する（例えば、転写を増加又は低下させるために）活性部分、ここで標的ＤＮＡ内の調節される転写の部位は、ＤＮＡ標的化ＲＮＡによって決定される。

場合によっては、部位特異的改変ポリペプチドは、作動可能に連結されている異種ドメインを有する。この異種ドメインは、酵素又はシグナルペプチドであり得る。この異種ドメインが酵素ドメインである態様では、このドメインは、標的核酸を改変する酵素活性（例えば、ヌクレアーゼ活性、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、ＤＮＡ修復活性、ＤＮＡ損傷活性、脱アミノ化活性、逆転写酵素活性、ジスムターゼ活性、アルキル化活性、メチル化活性、脱プリン活性、酸化活性、ピリミジン二量体形成活性、インテグラーゼ活性、トランスポサーゼ活性、リコンビナーゼ活性、ポリメラーゼ活性、リガーゼ活性、ヘリカーゼ活性、フォトリアーゼ活性、又はグリコシラーゼ活性）を持つ。他の場合では、部位特異的改変ポリペプチドは、作動可能に連結されている酵素ドメインを有しており、この酵素ドメインの酵素活性は、標的ＤＮＡと関連するポリペプチド（例えばヒストン）を改変する（例えば、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、デアセチラーゼ活性、キナーゼ活性、ホスファターゼ活性、ユビキチンリガーゼ活性、脱ユビキチン化活性、アデニル化活性、脱アデニル化活性、ＳＵＭＯ化活性、脱ＳＵＭＯ化活性、リボシル化活性、脱リボシル化活性、ミリストイル化活性、又は脱ミリストイル化活性）。例示的な酵素ドメインとして、単独か又は他の酵素ドメインとの組み合わせで、アデノシンデアミナーゼ、オキシダーゼ、チミンアルキルトランスフェラーゼ、アデニンオキシダーゼ、アデノシンメチルトランスフェラーゼ、アデノシンデアミナーゼ、グリコシラーゼが挙げられる。この異種ドメインがシグナルペプチドである態様では、このシグナルペプチドは、核局在化シグナル（「ＮＬＳ」、例えばＳＶ４０ＮＬＳ）であり得る。

場合によって、異なる部位特異的改変ポリペプチド、例えば、異なるＣａｓ９タンパク質（すなわち、様々な種からのＣａｓ９タンパク質）は、異なるＣａｓ９タンパク質の様々な酵素学的性質（例えば、異なるＰＡＭ配列選好のため；増加若しくは減少した酵素活性のため；増加若しくは減少したレベルの細胞毒性のため；ＮＨＥＪ、相同組換え修復、一本鎖切断、二本鎖切断の間のバランスを変化させるなど）を十分に利用するために本発明の様々な提供する方法において使用するのに有利であり得る。様々な種からのＣａｓ９タンパク質（例えば、Ｓｈｍａｋｏｖｅｔａｌ．，２０１７に開示されているもの、又はそれに由来するポリペプチド）は、標的ＤＮＡにおける異なるＰＡＭ配列を必要とし得る。従って、選択される特定のＣａｓ９酵素について、ＰＡＭ配列の要件は、Ｃａｓ９活性に必要であるとして既知の５’－ＮＧＧ－３’配列（ここでＮは、Ａ、Ｔ、Ｃ、又はＧのいずれかである）とは異なり得る。非常に様々な種からの多数のＣａｓ９オルソログが本明細書で特定されており、タンパク質は、僅かな同一のアミノ酸を共有する。特定された全Ｃａｓ９オルソログは同じドメイン構造（ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ）を有し、中央ＨＮＨエンドヌクレアーゼドメイン及び分割ＲｕｖＣ／ＲＮａｓｅＨドメインを有する。Ｃａｓ９タンパク質は、保存された構造を有する４つの重要なモチーフを共有する；モチーフ１、２、及び４は、ＲｕｖＣ様モチーフである一方、モチーフ３はＨＮＨ－モチーフである。対照的に、様々な種由来のＣａｓ１２ａタンパク質は、ＴＴＴＶのＬｂＣａｓ１２ａカノニカルＰＡＭと比較して異なるＰＡＭ配列要件を有し得る。

部位特異的改変ポリペプチドはまた、キメラ及び改変ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼであり得る。例えば、部位特異的改変ポリペプチドは、改変されたＣａｓ９「塩基エディタ」であり得る。塩基の編集により、ＤＮＡ切断又はドナーＤＮＡ分子を必要とすることなく、プログラム可能な方法で、１つの標的ＤＮＡ塩基を別の塩基に直接且つ不可逆的に変換することが可能となる。例えば、Ｋｏｍｏｒｅｔａｌ（２０１６，Ｎａｔｕｒｅ，５３３：４２０－４２４）は、Ｃａｓ９－シチジンデアミナーゼ融合を教示し、ここでＣａｓ９も、不活性であり、二本鎖ＤＮＡ切断を誘導しないように操作されている。加えて、Ｇａｕｄｅｌｌｉｅｔａｌ（２０１７，Ｎａｔｕｒｅ，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ２４６４４）は、ｔＲＮＡアデノシンデアミナーゼに融合した触媒的に障害されたＣａｓ９を教示し、これは標的ＤＮＡ配列におけるＡ／ＴからＧ／Ｃへの変換を媒介し得る。本発明の方法及び組成物において部位特異的改変ポリペプチドとして作用し得る操作されたＣａｓ９ヌクレアーゼの別のクラスは、ＮＧ、ＧＡＡ及びＧＡＴを含む幅広いＰＡＭ配列を認識できるバリアントである（Ｈｕｅｔａｌ．，２０１８，Ｎａｔｕｒｅ，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ２６１５５）。

実施形態
一実施形態では、本発明者らは、Ｎ末端からＣ末端の方向に、異種ドメイン、第１のリンカー配列、及びＶ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ酵素を含む融合タンパク質であって、第１のリンカー配列は、反復ＧＧＧＧＳ配列を含む、融合タンパク質を提供する。一態様では、この異種ドメインは、デアミナーゼ、ポリメラーゼ、ヌクレアーゼ、リラクサーゼ、アルキルトランスフェラーゼ、メチルトランスフェラーゼ、アデノシンデアミナーゼ、シチジンデアミナーゼ、オキシダーゼ、チミンアルキルトランスフェラーゼ、アデニンオキシダーゼ、アデノシンメチルトランスフェラーゼ、グリコシラーゼ、又は核局在化シグナルである。別の態様では、この異種ドメインは、デアミナーゼドメインである。さらに別の態様では、このデアミナーゼドメインは、シチジンデアミナーゼである。別の態様では、このシチジンデアミナーゼドメインは、活性化誘導シチジンデアミナーゼ（「ＡＩＤ」）である。さらに別の態様では、このシチジンデアミナーゼドメインは、アポリポタンパク質ＢｍＲＮＡ編集複合体（「ＡＰＯＢＥＣ」）ドメインである。別の態様では、このＡＰＯＢＥＣドメインは、ＡＰＯＢＥＣ１ファミリのデアミナーゼである。さらに別の態様では、このＡＰＯＢＥＣドメインは、配列番号１と少なくとも７０％同一の配列を含む。別の態様では、このデアミナーゼドメインは、アデニンデアミナーゼである。さらに別の態様では、このアデニンデアミナーゼは、配列番号９２と少なくとも７０％同一の配列を含むＴａｄＡドメインである。

一態様では、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ酵素は、Ｖ－Ａ型（「Ｃａｓ１２ａ」）酵素である。別の態様では、Ｃａｓ１２ａドメインは、配列番号３、配列番号６、配列番号２２、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、及び配列番号４８で構成された群から選択される。さらに別の態様では、このＣａｓ１２ａドメインは、触媒的に不活性であり、且つ配列番号３、配列番号６、及び配列番号２２で構成された群から選択される。

一態様では、第１のリンカー配列は、少なくとも３回反復されたＧＧＧＧＳを含む。別の態様では、第１のリンカー配列は、少なくとも６回反復されたＧＧＧＧＳを含む。

一態様では、融合タンパク質は、配列番号１１、１２、１３、及び４４からなる群から選択される配列を含む。別の態様では、融合タンパク質は、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼインヒビター（「ＵＧＩ」）ドメインをさらに含む。さらに別の態様では、このＵＧＩドメインは、配列番号８を含む。別の態様では、このＵＧＩドメインは、配列ＳＧＧＳを含む第２のリンカーによりＣａｓ１２ａ酵素に連結されている。さらに別の態様では、融合タンパク質は、配列番号１７、配列番号２４、配列番号３５、配列番号３９、配列番号４３、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号８１、配列番号８３、配列番号８５、配列番号８７、及び配列番号８９からなる群から選択される配列を含む。別の態様では、融合タンパク質は、ＤＮＡと接触した場合には、反復ＧＧＧＧＳ配列以外の第１のリンカー配列を有する融合タンパク質と比較して、高い頻度でオンターゲット編集を生じ、且つ低い頻度でオフターゲット編集を生じる。

別の実施形態では、本発明者らは、植物ゲノムＤＮＡを編集する方法であって、植物ゲノムＤＮＡと、（ａ）ＵＧＩドメインを任意に含む、上記態様の融合タンパク質、及び（ｂ）工程（ａ）の融合タンパク質の標的を植物ゲノムＤＮＡの標的ＤＮＡ配列に定めるガイドＲＮＡ（「ｇＲＮＡ」）とを接触させることを含み、編集された植物ゲノムＤＮＡは、反復ＧＧＧＧＳ配列以外の第１のリンカーを有する融合タンパク質により編集された植物ゲノムＤＮＡと比較してオフターゲット編集が低い、方法を提供する。

別の実施形態では、本発明者らは、低いオフターゲット編集で植物ゲノムＤＮＡを編集する方法であって、植物ゲノムＤＮＡと、（ａ）ＵＧＩドメインを任意に含む、上記態様の融合タンパク質、及び（ｂ）工程（ａ）の融合タンパク質の標的を植物ゲノムＤＮＡの標的ＤＮＡ配列に定めるガイドＲＮＡ（「ｇＲＮＡ」）とを接触させることを含み、編集された植物ゲノムＤＮＡは、反復ＧＧＧＧＳ配列以外の第１のリンカーを有する融合タンパク質により編集された植物ゲノムＤＮＡと比較してオフターゲット編集が低い、方法を提供する。態様では、この融合タンパク質は、配列番号２４を含む。

別の実施形態では、本発明者らは、オフターゲット編集が低い編集植物の集団を得る方法であって、（ａ）編集するゲノムＤＮＡを含む植物細胞の集団を得ること、（ｂ）上記態様の融合タンパク質及び任意のＵＧＩドメインをコードするヌクレオチド配列を得ること、（ｃ）植物細胞の集団を工程（ｂ）のヌクレオチド配列で形質転換させ、それにより、この植物細胞の集団内で、核酸配列によりコードされた融合タンパク質を発現させること、（ｄ）形質転換された植物細胞の集団を植物へと成長させることであり、この植物の少なくとも１つは編集されている、成長させること、並びに（ｅ）工程（ｄ）の生成物から少なくとも１つの編集植物を選択し、それにより編集植物の集団を得ることを含み、編集植物の集団は、反復ＧＧＧＧＳ配列以外の第１のリンカーを有する融合タンパク質により編集された植物と比較してオフターゲット編集が低い、方法を提供する。一態様では、融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、配列番号１７、配列番号２４、配列番号３５、配列番号３９、配列番号４３、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号８１、配列番号８３、配列番号８５、配列番号８７、及び配列番号８９を含む。一部の実施形態では、改善されたリンカー配列により接続されている１個又は複数個のＤＮＡ結合ドメイン及び１個又は複数個のＤＮＡ改変ドメインを含む融合タンパク質をコードするコドン最適化ポリヌクレオチドが提供される。

下記の実施例は、例示的な実施形態を提供する。本開示及び当該技術分野の一般的な技術水準を考慮して、当業者は、下記の実施例は例示的であることのみが意図されていること、並びに本開示の主題の範囲を逸脱することなく多数の変化、改変、及び変更が採用され得ることを理解するだろう。

実施例１．ｄＬｂＣａｓ１２ａ－ＢＥ及びガイドＲＮＡの発現用のベクターの構築
本発明者らは、Ｄ８３２Ａ／Ｅ９２５Ａ／Ｄ１１４８Ａ変異を含む触媒的に不活性なラクノスピラ科細菌（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）Ｃａｓ１２ａ（これ以降、「ｄＬｂＣａｓ１２ａ」、ｄＬｂＣｐｆ１として既に既知である）、ラットシチジンデアミナーゼ（ＡＰＯＢＥＣ１）、及びウラシルＤＮＡグリコシラーゼインヒビター（ＵＧＩ）を、アミノ酸リンカーにより連結して１個のタンパク質として融合させ、植物中での塩基編集に有利な性質を使用可能にした。この融合構築物をＺｅａｍａｙｓコドンに最適化させ、商業的に合成し（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ，Ｎａｎｊｉｎｇ，Ｃｈｉｎａ）、サトウキビユビキチン－４（ＳｏＵｂｉ４）遺伝子プロモーター下でクローニングしてｄＬｂＣａｓ１２ａ－ＢＥを構成的に生成した。

構築物２４５２４のｄＬｂＣａｓ１２ａ－ＢＥでは、核局在化シグナル（ＳＶ４０－ＮＬＳ）に、ＸＴＥＮタンパク質リンカーによりｄＬｂＣａｓ１２ａに連結されたＡＰＯＢＥＣ１が続き、さらに、ＳＧＧＳリンカーによりＵＧＩに連結されたＳＶ４０－ＮＬＳが続いた。ＳＶ４０－ＮＬＳはまた、ＳＧＧＳリンカーによりＵＧＩのＣ末端にも組み込まれており、この融合タンパク質の核中へのターゲティングが改善された。トウモロコシ最適化コドンにより作製されたｄＬｂＣａｓ１２ａ－ＢＥの合成配列は、配列番号１８に記載されている。

構築物２４９０４のｄＬｂＣａｓ１２ａ－ＢＥでは、ＳＶ４０－ＮＬＳに、（Ｇ４Ｓ）×６と称される６回のＧＧＧＧＳアミノ酸反復を有する３０個アミノ酸リンカーＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１１）によりｄＬｂＣａｓ１２ａに連結されたＡＰＯＢＥＣ１が続き、さらに、ＳＧＧＳリンカーによりＵＧＩに連結されたＳＶ４０ＮＬＳが続いた。ＳＶ４０－ＮＬＳはまた、ＳＧＧＳリンカーによりＵＧＩのＣ末端にも組み込まれており、この融合タンパク質の核中へのターゲティングが改善された。トウモロコシ最適化コドンにより作製されたｄＬｂＣａｓ１２ａ－ＢＥの合成配列は、配列番号２３に記載されている。

構築物２５０５７のｄＬｂＣａｓ１２ａ－ＢＥでは、ＳＶ４０－ＮＬＳに、ＸＴＥＮタンパク質リンカーによりｄＬｂＣａｓ１２ａに連結されたＡＰＯＢＥＣ１が続き、さらに、ＳＸと称される１８個アミノ酸リンカーＧＧＳＴＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＳＧ（配列番号１２）によりＵＧＩに連結されたＳＶ４０－ＮＬＳが続いた。ＳＶ４０－ＮＬＳはまた、（Ｇ４Ｓ）×３と称される１５個アミノ酸リンカーＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳによりＵＧＩのＣ末端にも組み込まれており、ｄＬｂＣａｓ１２ａ－ＢＥの核中へのターゲティングが改善された。トウモロコシ最適化コドンにより作製されたｄＬｂＣａｓ１２ａ－ＢＥの合成配列は、配列番号１４に記載されている。

構築物２５０５８のｄＬｂＣａｓ１２ａ－ＢＥでは、ＳＶ４０－ＮＬＳに、３０個アミノ酸リンカー（Ｇ４Ｓ）×６によりｄＬｂＣａｓ１２ａに連結されたＡＰＯＢＥＣ１が続き、さらに、ＳＸリンカーによりＵＧＩに連結されたＳＶ４０－ＮＬＳが続いた。ＳＶ４０－ＮＬＳはまた、（Ｇ４Ｓ）×３によりＵＧＩのＣ末端にも組み込まれており、ｄＬｂＣａｓ１２ａ－ＢＥの核へのターゲティングが改善された。トウモロコシ最適化コドンにより作製されたｄＬｂＣａｓ１２ａ－ＢＥの合成配列は、配列番号１６に記載されている。

ｄＬｂＣａｓ１２ａ－ＢＥ構築物では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ａガイドＲＮＡ転写産物は、ＳｏＵｂｉ４プロモーターの制御下で発現され、このＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ａガイドＲＮＡ転写産物は、トウモロコシＷａｘｙ１第４エクソン領域を標的として、エクソン４中のＰＡＭ配列に続くＣ９、Ｃ１０、又はＣ２２をＴに変更する。このＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ａガイドＲＮＡ転写産物はまた、足場としてＬｂＣｒＲＮＡの直接反復も含んだ。ガイドＲＮＡの合成配列は、配列番号２６に記載されている。

構築物２４７８４では、核局在化シグナル（ｘＳＶ４０ＮＬＳ－０６）に、ｘＸＴＥＮ－０２によりトウモロコシ最適化Ｃａｓ９遺伝子（ｃＣａｓ９ＢＥ－０２）に連結されたシチジンデアミナーゼ（ｘＡＰＯＢＥＣ１－０１）が続き、さらに、ｘＳＧＧＳリンカー－０２によりウラシルＤＮＡグリコシラーゼインヒビターｘＵＧＩ－０２に連結された、核局在化シグナル（ｘＳＶ４０ＮＬＳ－０４）が続き、ｘＵＧＩ－０２は、ｘＳＧＧＳリンカー－０２により核局在化シグナルｘＳＶ４０ＮＬＳ－０７に連結されている。この融合タンパク質は、サトウキビユビキチン－４プロモーター（ｐｒＳｏＵｂｉ４－０２）、続いてＮＯＳターミネーター（ｔＮＯＳ－０５－０１）の制御下で駆動された。Ｃａｓ９タンパク質は、ラットＡＰＯＢＥＣ１に融合したＤ１０Ａ及びウラシルＤＮＡグリコシラーゼインヒビター（ＵＧＩ）を有するニッカーゼＣａｓ９変異である。核局在化シグナルはまた、Ｃａｓ９のＣ末端にも組み込まれており、核へのＣａｓ９のターゲティングが改善された。ｃＣａｓ９ＢＥ－０２の合成配列は、配列番号２０に記載されている。

実施例２．トウモロコシ胚のアグロバクテリウム媒介形質転換
トウモロコシＷｘ１での編集による潜在的事象を発生させるために、エリートトウモロコシ形質転換変種ＮＰ２２２２を、説明されている全ての実験用に選択した（国際公開第１６１０６１２１号、参照より本明細書に組み込まれる）。

トウモロコシ形質転換用に、トウモロコシ変種ＮＰ２２２２を採用した。トウモロコシの穂を、未熟胚が約１．２ｍｍである時点でＧＨから収穫し、次いで、この穂を２０分にわたり２０％Ｃｌｏｒｏｘ溶液で滅菌し、滅菌水で３回すすいだ。

エレクトロポレーションによりベクターを有するアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）株ＬＢＡ４４０４１７７４０ＲｅｃＡ^-を、Ｇｅｎｔ抗生物質（２５μｇ／ｍｌ）及びＳｐｅｃ抗生物質（１００μｇ／ｍｌ）を含むＹＰ培地上で画線し、２日にわたり２８℃で増殖させた。形質転換前に、単一コロニーを選択し、新鮮なＹＰプレート上に画線し、２８℃で１日にわたり増殖させた。アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）を、接種培地を使用して再懸濁させた。ＯＤ₆₆₀を０．２５に調整した。

本発明者らは、胚乳を取り出し、次いで滅菌メスにより未熟胚を単離してまとめて回収し、２～３分にわたりアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）懸濁液に注入した。感染した未熟胚を、２～４日にわたり２２℃下で共培養培地に移した。

共培養段階後、この胚を、２８℃の暗条件下で４週間にわたり、選択剤を含む培地に移した。耐性を示す胚発生カルスを再生培地に移し、１６／８光周期条件にて２８℃下で培養した。約３週間後、再生した小植物を、同一の培養温度及び光条件下で、発根用培地が入った栽培容器に移した。

実施例３．標的領域中の編集塩基の分析
本発明者らは、ＰｈｉｒｅＰｌａｎｔＤｉｒｅｃｔＰＣＲＭａｓｔｅｒＭｉｘ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，Ｆ１６０Ｌ）を使用して、トウモロコシの葉のサンプルから直接、標的領域を含む約４１０ｂｐのＤＮＡ断片を増幅させた。ＰＣＲの前に、ＤＮＡ精製は必要ではない。増幅されたＤＮＡ断片のＳａｎｇｅｒＤＮＡ配列決定により、標的部位の変異を分析した。

ＤＮＡ抽出及びＰＣＲ増幅を、製造業者の推奨に従って実施した。若葉の一部（例えば、直径が約２ｍｍのパンチ）を、希釈緩衝液３０μＬに入れた。この葉のサンプルを、チューブの壁に軽く押し付けることにより１００μＬピペットチップで粉砕し、希釈緩衝液２０μＬを添加した。この葉の粉砕後、溶液は緑色がかっていた。植物材料を遠心分離機で沈降させ、上清１μＬを、２０μＬＰＣＲ反応用のテンプレートとして使用した。

ＰＣＲシステムは、下記からなる。

ＺｍＷａｘｙ１用のＰＣＲプライマー：
フォワードプライマー：５’－ＡＧＡＴＧＧＧＡＧＡＣＧＧＧＴＡＣＧＡＧＡＣＧＧ－３’（配列番号２９）
リバースプライマー：５’－ＧＴＡＴＧＧＧＴＴＧＴＴＧＴＴＧＡＧＧＣＴＣＡＧＧ－３’（配列番号３０）
ＤＮＡ配列決定プライマー：５’－ＧＡＣＣＡＣＣＣＡＣＴＧＴＴＣＣＴＧＧＡＧＡＧＧＧ－３’（配列番号３１）

ＰＣＲ条件：
５分にわたり９８℃；
５秒にわたり９８℃、続いて５秒にわたり６０℃を３５サイクル；
２０秒にわたり７２℃；
１分にわたり７２℃；及び
分析の準備が整うまで４℃で保持。

配列決定：
ＰＣＲ産物を、アガロースゲル電気泳動により分離し、特定のプライマーによるＳａｎｇｅｒＤＮＡ配列決定前に精製した。ヘテロ接合変異の場合には、標的ヌクレオチド位置で二重ピークを観察したが、コントロールと異なる独特な単一ピークをホモ接合変異と見なした。構築物２４５２４、２４９０４、及び２４７８４のトランスジェニック事象を使用してＺｍＷｘｙ１エクソン４を増幅させて配列決定し、塩基編集を評価した。

編集されたヌクレオチドを、灰色の網掛けで示す。上記に示されるように、ＡＰＯＢＥＣドメインと部位特異的ヌクレアーゼとの間にＸＴＥＮリンカーを含む、このバージョンのＣａｓ１２ａ塩基エディタは、５位及び６位でシステインをチアミンへと最も効率的に編集した。しかしながら、－２位、７位、及び４９位でのグアニンからアデニンへの編集例が存在する。位置は、ＰＡＭ部位の開始から離れるヌクレオチドの数で決定されている。

編集されたヌクレオチドを、灰色の網掛けで示す。このバージョンでは、ＡＰＯＢＥＣドメインと不活性化された部位特異的ヌクレアーゼとの間にＸＴＥＮリンカーを含むＣａｓ１２ａ塩基エディタは、９位、１０位、及び２２位でシステインをチアミンへと編集し、且つ３９位、４４位、５２位、そして特に５３位で、グアニンをアデニンへと編集した。グアニンがアデニンへと編集されている箇所は、相補鎖で編集が行なわれたことを示す。

編集されたヌクレオチドを、灰色の網掛けで示す。このバージョンでは、ＡＰＯＢＥＣドメインと不活性化された部位特異的ヌクレアーゼとの間に、（Ｇ₄Ｓ）₆を含む長リンカーを含むＣａｓ１２ａ塩基エディタは、９位及び１０位でシステインをチアミンへと編集し、且つ１９位及び５３位でグアニンをアデニンへと編集した。グアニンがアデニンへと編集されている箇所は、相補鎖で編集が行なわれたことを示す。

実施例４．編集効率の測定。

表４は、長リンカーを有するＣａｓ１２ａの塩基編集効率がＣａｓ９の塩基編集効率にどれくらい匹敵するかを示す。最適化されていないと、Ｃａｓ１２ａＢＥは編集効率が約５％と低く、Ｃａｓ９（８７％）の編集効率よりもはるかに低い。しかしながら、デアミナーゼを触媒的に不活性なＣａｓ１２ａに作動可能に連結する長リンカーの添加により、編集効率が１２倍改善された。

表５は、ＸＴＥＮリンカー又は長リンカーのいずれかに作動可能に連結された場合のＬｂＣａｓ１２ａ塩基エディタの編集効率の直接比較を示す。困難な標的の編集効率は、デアミナーゼが長リンカー（例えば（Ｇ₄Ｓ）₆）により部位特異的ヌクレアーゼに作動可能に連結されている場合には、ほぼ５倍改善されている。

同一構築物内でのいくつかのガイドＲＮＡ分子を使用する多重同時編集（「多重化」又は「多重編集」）、及び核局在化シグナルと活性なＣａｓ１２ａとの間に長リンカーを有することにより、高い編集効率が達成される。ＳＢＥＩＩｂ等の難しい標的であっても、多重編集実験デザインの一部である場合には、許容される編集効率が達成された。

実施例５．ダイズでの編集の改善。
長リンカーとＣａｓ１２ａとの組み合わせを使用するダイズ編集も、大きく改善されている。標準的なＣａｓ１２ａ及び長リンカー－Ｃａｓ１２ａによるＧｍＦＡＤ２編集は、ほぼ７倍改善される。

実施例６．長リンカーは、トウモロコシにおけるＭｂ２Ｃａｓ１２ａ編集を改善した。
この長リンカーはまた、Ｍｂ２Ｃａｓ１２ａ等のさらなるＣａｓ１２酵素の編集効率も改善する。

長リンカーがないと、Ｍｂ２Ｃａｓ１２ａは標的配列を全く編集しなかった。しかしながら、長リンカーにより、編集効率は顕著に改善される。

実施例７．長リンカーにより接続された、Ｃａｓ１２ａに作動可能に連結されている他の異種ドメイン。
長リンカーにより異種ドメインを（ＡＰＯＢＥＣデアミナーゼのみを超えて）Ｃａｓ１２ａに繋ぎ止めることは、本発明の範囲内である。そのような異種ドメインとして下記が挙げられるが、これらに限定されない：デアミナーゼ、ポリメラーゼ、ヌクレアーゼ、リラクサーゼ、アルキルトランスフェラーゼ、メチルトランスフェラーゼ、アデノシンデアミナーゼ、シチジンデアミナーゼ、オキシダーゼ、チミンアルキルトランスフェラーゼ、アデニンオキシダーゼ、アデノシンメチルトランスフェラーゼ、グリコシラーゼ、又は核局在化シグナル。

本発明者らは、アデニンデアミナーゼをＣａｓ１２ａに作動可能に連結させて、Ｃａｓ１２ａアデニン塩基エディタ（「Ｃａｓ１２ａ－ＡＢＥ」）を作製した。本発明者らは、触媒的に不活性なＬｂＣａｓ１２ａ（Ｄ８３２Ａ、Ｅ９２５Ａ、及びＤ１１４８Ａ変異を含む）を、アミノ酸リンカーにより作動可能に連結されている大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）野生アデニンデアミナーゼ（Ｗ２３Ｒ、Ｈ３６Ｌ、Ｐ４８Ａ、Ｒ５１Ｌ、Ｌ８４Ｆ、Ａ１０６Ｖ、Ｄ１０８Ｎ、Ｈ１２３Ｙ、Ｓ１４６Ｃ、Ｄ１４７Ｙ、Ｒ１５２Ｐ、Ｅ１５５Ｖ、Ｉ１５６Ｆ、及びＫ１５７Ｎアミノ酸置換を含むように操作された「ＴａｄＡ」）に融合させた。この融合構築物をＺｅａｍａｙｓコドンに最適化させ、商業的に合成し（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ，Ｎａｎｊｉｎｇ，Ｃｈｉｎａ）、サトウキビユビキチン－４（ＳｏＵｂｉ４）遺伝子プロモーター下でクローニングしてｄＬｂＣａ１２ａ－ＢＥを構成的に生成した。

構築物２５４５９のｄＬｂＣａｓ１２ａ－ＡＢＥでは、ＴａｄＡ二量体を作製するために、１８９ｂｐのジャガイモイントロンが、ＸＴＥＮタンパク質リンカーにより連結されたＴａｄＡバリアントに後続するＴａｄＡコード配列に挿入された。これはｄＬｂＣａｓ１２ａに融合しており、且つＳＶ４０－ＮＬＳもＧＳリンカーによりｄＬｂＣａｓ１２ａのＣ末端に組み込まれており、この融合タンパク質の核中へのターゲティングが改善された。トウモロコシ最適化コドンにより作製されたｄＬｂＣａｓ１２ａ－ＡＢＥの合成配列は、配列番号７９に記載されている。

構築物２５５０４のｄＬｂＣａｓ１２ａ－ＡＢＥでは、ＴａｄＡ二量体を作製するために、１８９ｂｐのジャガイモイントロンが、ＴａｄＡバリアントに後続するＴａｄＡコード配列に挿入された。これは、３０個アミノ酸リンカー（Ｇ４Ｓ）×６タンパク質リンカーによりｄＬｂＣａｓ１２ａに連結されており、且つＳＶ４０－ＮＬＳもＧＳリンカーによりｄＬｂＣａｓ１２ａのＣ末端に組み込まれており、この融合タンパク質の核中へのターゲティングが改善された。トウモロコシ最適化コドンにより作製されたｄＬｂＣａｓ１２ａ－ＡＢＥの合成配列は、配列番号８１に記載されている。

ｄＬｂＣａｓ１２ａ－ＡＢＥ構築物では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ａガイドＲＮＡ転写産物は、ＳｏＵｂｉ４プロモーターの制御下で発現され、このＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ａガイドＲＮＡ転写産物は、トウモロコシＷａｘｙ１遺伝子を標的とする。このＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ａガイドＲＮＡ転写産物はまた、足場としてＬｂＣｒＲＮＡの直接反復も含んだ。ガイドＲＮＡの合成配列は、配列番号７４に記載されている。

構築物２５４５９（アデニンデアミナーゼが、ＸＴＥＮリンカーによりｄＬｂＣａｓ１２ａに連結されていた）による実験では、トウモロコシ植物で使用した場合には、検出可能な編集が得られなかった。アデニンデアミナーゼが（Ｇ４Ｓ）＊６長リンカーによりｄＬｂＣａｓ１２ａに連結されていた構築物２５５０４による実験では、編集効率が、Ｃａｓ９ＡＢＥコントロール（構築物２４７８５）の約半分である７％であった。表１０を参照されたい。

本発明者らは、Ｃａｓ１２ａＡＢＥが植物で機能することが示されたのはこれが初めてであると考えている。この技術的成功の原因は、アデニンデアミナーゼをＣａｓ１２ａに作動可能に連結するための長リンカーの使用であると考えられる。

実施例８．トウモロコシでの二重塩基エディタ
二重塩基エディタ（Ｃａｓ酵素に融合したシチジンデアミナーゼドメイン及びアデニンデアミナーゼドメイン）。この概念では、作物遺伝子の標的飽和変異誘発を適用して、農学的性能が改善されている遺伝子バリアント（例えば、同一の標的領域でのＣ：Ｇ＞Ｔ：Ａ置換及びＡ：Ｔ＞Ｇ：Ｃ置換）を作製し得た。本発明者らは、下記の４種のガイドＲＮＡを多重化した：ＺｍＷａｘｙ１遺伝子を標的とする１種、及びＺｍＡＤＨ遺伝子を標的とする３種の異なるガイドＲＮＡ。

合計で、ｄＬｂＣａｓ１２ａに基づくＣＢＥ－ＡＢＥは、１％のＣからＴへの変異及びＡからＧへの変異である。イントロンの付加により、ベクターの安定性が増加するが、非効率的なスプライシングにより酵素活性が低下する場合がある。これは、Ｃａｓ１２ａを使用する植物での二重ＣＢＥ－ＡＢＥ編集の最初の例であると考えられる。

上記の表では、ほとんどのＣａｓ１２ａＢＥ構築物は、異種酵素ドメイン－リンカー－Ｃａｓ酵素のパターンに従う。このパターンの例外は、２５７０２［ＴａｄＡ二量体－リンカー－ＰｍＣＤＡ－リンカー－Ｃａｓ酵素］、２５７０１［ＰｍＣＤＡ－リンカー－ＴａｄＡ二量体－リンカー－Ｃａｓ酵素］、及び２５６５８［ＴａｄＡ二量体－リンカー－Ｃａｓ酵素－ＰｍＣＤＡ］である。さらなる核局在化配列、ウラシルグリコシラーゼインヒビター、及び他の構成成分が存在し得るが、この表では示されていない。そのような詳細は、添付の配列表に示された配列に示されている。

本明細書で提供される実施例及び実施形態は、特許請求の範囲の非限定的な例示であり、唯一の実用例として解釈されるべきではない。さらなる変形例が、当業者により実行され得る。

Claims

Ｎ末端からＣ末端の方向に、異種ドメイン、第１のリンカー配列、及びＶ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ酵素を含む融合タンパク質であって、前記第１のリンカー配列が、反復ＧＧＧＧＳ配列を含む、融合タンパク質。
前記異種ドメインが、デアミナーゼ、ポリメラーゼ、ヌクレアーゼ、リラクサーゼ、アルキルトランスフェラーゼ、メチルトランスフェラーゼ、アデノシンデアミナーゼ、シチジンデアミナーゼ、オキシダーゼ、チミンアルキルトランスフェラーゼ、アデニンオキシダーゼ、アデノシンメチルトランスフェラーゼ、グリコシラーゼ、又は核局在化シグナルである、請求項１に記載の融合タンパク質。
前記異種ドメインが、デアミナーゼドメインである、請求項２に記載の融合タンパク質。
前記デアミナーゼドメインが、シチジンデアミナーゼである、請求項３に記載の融合タンパク質。
前記シチジンデアミナーゼドメインが、活性化誘導シチジンデアミナーゼ（「ＡＩＤ」）である、請求項４に記載の融合タンパク質。
前記シチジンデアミナーゼドメインが、アポリポタンパク質ＢｍＲＮＡ編集複合体（「ＡＰＯＢＥＣ」）ドメインである、請求項４に記載の融合タンパク質。
前記ＡＰＯＢＥＣドメインが、ＡＰＯＢＥＣ１ファミリのデアミナーゼである、請求項６に記載の融合タンパク質。
前記ＡＰＯＢＥＣドメインが、配列番号１と少なくとも７０％同一の配列を含む、請求項７に記載の融合タンパク質。
前記デアミナーゼドメインが、アデニンデアミナーゼである、請求項３に記載の融合タンパク質。
前記アデニンデアミナーゼが、ＴａｄＡドメインである、請求項９に記載の融合タンパク質。
前記ＴａｄＡドメインが、配列番号９２と少なくとも７０％同一の配列を含む、請求項１０に記載の融合タンパク質。
前記Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ酵素が、Ｖ－Ａ型（Ｃａｓ１２ａ）酵素である、請求項１に記載の融合タンパク質。
前記Ｃａｓ１２ａドメインが、配列番号３、配列番号６、配列番号２２、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、及び配列番号４８で構成された群から選択される、請求項１２に記載の融合タンパク質。
前記Ｃａｓ１２ａドメインが、触媒的に不活性であり、並びに配列番号３、配列番号６、及び配列番号２２で構成された群から選択される、請求項１３に記載の融合タンパク質。
前記第１のリンカー配列が、少なくとも３回反復されたＧＧＧＧＳを含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
前記第１のリンカー配列が、少なくとも６回反復されたＧＧＧＧＳを含む、請求項１５に記載の融合タンパク質。
前記融合タンパク質が、配列番号１１、１２、１３、及び４４からなる群から選択される配列を含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
ウラシルＤＮＡグリコシラーゼインヒビター（「ＵＧＩ」）ドメインをさらに含む、請求項１～１７のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
前記ＵＧＩドメインが、配列番号８を含む、請求項１８に記載の融合タンパク質。
前記ＵＧＩドメインが、配列ＳＧＧＳを含む第２のリンカーにより前記Ｃａｓ１２ａ酵素に連結されている、請求項１９に記載の融合タンパク質。
前記融合タンパク質が、配列番号１７、配列番号２４、配列番号３５、配列番号３９、配列番号４３、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号８１、配列番号８３、配列番号８５、配列番号８７、及び配列番号８９からなる群から選択される配列を含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
前記融合タンパク質が、ＤＮＡと接触した場合に、反復ＧＧＧＧＳ配列以外の第１のリンカー配列を有する融合タンパク質と比較して、高い頻度でオンターゲット編集を生じ、及び低い頻度でオフターゲット編集を生じる、請求項１に記載の融合タンパク質。
植物ゲノムＤＮＡを編集する方法であって、植物ゲノムＤＮＡと、
（ａ）ＵＧＩドメインを任意に含む、請求項１～１７のいずれか一項に記載の融合タンパク質、及び
（ｂ）工程（ａ）の前記融合タンパク質の標的を前記植物ゲノムＤＮＡの標的ＤＮＡ配列に定めるガイドＲＮＡ（「ｇＲＮＡ」）
とを接触させることを含み、
編集された植物ゲノムＤＮＡが、反復ＧＧＧＧＳ配列以外の第１のリンカーを有する融合タンパク質により編集された植物ゲノムＤＮＡと比較してオフターゲット編集が低い、
方法。
低いオフターゲット編集で植物ゲノムＤＮＡを編集する方法であって、植物ゲノムＤＮＡと、
（ａ）ＵＧＩドメインを任意に含む、請求項１～１７のいずれか一項に記載の融合タンパク質、及び
（ｂ）工程（ａ）の前記融合タンパク質の標的を前記植物ゲノムＤＮＡの標的ＤＮＡ配列に定めるガイドＲＮＡ（「ｇＲＮＡ」）
とを接触させることを含み、
編集された植物ゲノムＤＮＡが、反復ＧＧＧＧＳ配列以外の第１のリンカーを有する融合タンパク質により編集された植物ゲノムＤＮＡと比較してオフターゲット編集が低い、
方法。
前記融合タンパク質が、配列番号２４を含む、請求項２４に記載の方法。
オフターゲット編集が低い編集植物の集団を得る方法であって、
（ａ）編集するゲノムＤＮＡを含む植物細胞の集団を得ること、
（ｂ）請求項１～１６のいずれか一項に記載の融合タンパク質及び任意のＵＧＩドメインをコードするヌクレオチド配列を得ること、
（ｃ）前記植物細胞の集団を工程（ｂ）の前記ヌクレオチド配列で形質転換させ、それにより、前記植物細胞の集団内で、前記核酸配列によりコードされた融合タンパク質を発現させること、
（ｄ）前記形質転換された植物細胞の集団を植物へと成長させることであり、前記植物の少なくとも１つは編集されている、成長させること、
並びに
（ｅ）工程（ｄ）の生成物から少なくとも１つの編集植物を選択し、それにより編集植物の集団を得ること
を含み、
前記編集植物の集団が、反復ＧＧＧＧＳ配列以外の第１のリンカーを有する融合タンパク質により編集された植物と比較してオフターゲット編集が低い、
方法。
前記ヌクレオチド配列が、配列番号１７、配列番号２４、配列番号３５、配列番号３９、配列番号４３、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号８１、配列番号８３、配列番号８５、配列番号８７、及び配列番号８９からなる群から選択される融合タンパク質をコードする、請求項２６に記載の方法。