JP2004521625A

JP2004521625A - アポリポタンパク質ＢｍＲＮＡ編集を改変するための方法および組成物

Info

Publication number: JP2004521625A
Application number: JP2002568770A
Authority: JP
Inventors: ハロルドシー．スミス，; ヤンヤン，; マークピー．ソウデン，
Original assignee: University of Rochester
Current assignee: University of Rochester
Priority date: 2001-02-27
Filing date: 2002-02-26
Publication date: 2004-07-22
Also published as: EP1392846B1; CA2439472A1; WO2002068676A2; US20100297219A1; WO2002068676A3; US20040115184A1; DE60227069D1; EP1392846A2; ATE398180T1; EP1392846A4

Abstract

本発明の第１の局面は、以下を含むキメラタンパク質に関する：タンパク質形質導入ドメイン（ｐｒｏｔｅｉｎｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎｄｏｍａｉｎ）を含む第１のポリペプチド、およびアポリポタンパク質ＢをコードするｍＲＮＡを編集（ｅｄｉｔ）し得るＡＰＯＢＥＣ−１またはそのフラグメントを含む第２のポリペプチド。本発明の第２の局面は、以下を含むキメラタンパク質に関する：タンパク質形質導入ドメインを含む第１のポリペプチド；およびアポリポタンパク質ＢｍＲＮＡに結合してＡＰＯＢＥＣ−１によるｍＲＮＡの編集を促進し得るＡＰＯＢＥＣ−１相補因子（「ＡＣＦ」）またはそのフラグメントを含む第２のポリペプチド。

Description

【技術分野】
【０００１】
本願は、米国仮特許出願番号６０／２７１，８５６（２００１年２月２７日出願；これは、全体が参考として援用される）の利益を主張する。
【０００２】
本発明は、少なくとも部分的に、米国公衆衛生局からの米国基金（助成金ＤＫ４３７３９）を使用して、生み出された。合衆国政府は、本発明において特定の権利を有し得る。
（発明の分野）
本発明は、一般的には、アポリポタンパク質Ｂプロセシングを改変するため、アテローム発生性の疾患および障害を処置または予防するため、ならびに、血管内のリポタンパク質の集団を改変するための、キメラタンパク質、１以上のキメラタンパク質を含有する組成物および産物、ならびにそれらの使用に、関する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
コレステロールは、アポリポタンパク質と呼ばれる特定のキャリアタンパク質によって血液中で運搬され、かつ、リポタンパク質粒子として、ある組織から別の組織へと運搬される。アポリポタンパク質Ｂは、カイロミクロン、超低比重リポタンパク質（「ＶＬＤＬ」）、および低比重リポタンパク質（ＬＤＬ）と呼ばれるリポタンパク質粒子の、内在性で交換不可能な構造成分である。アポリポタンパク質Ｂは、２つのアイソフォーム、つまり、アポリポタンパク質Ｂ１００およびアポリポタンパク質Ｂ４８として、ヒトの血漿中を循環する。アポリポタンパク質Ｂ４８は、コドン２１５３（ＣＡＡ）を翻訳終止コドン（ＵＡＡ）に変化させるＲＮＡ編集機構によって、産生される（Ｃｈｅｎら、”ＡｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎＢ−４８ｉｓｔｈｅｐｒｏｄｕｃｔｏｆａｍｅｓｓｅｎｇｅｒＲＮＡｗｉｔｈａｎｏｒｇａｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｎ−ｆｒａｍｅｓｔｏｐｃｏｄｏｎ，”Ｓｃｉｅｎｃｅ２３８：３６３−３６６（１９８７）；Ｐｏｗｅｌｌら”Ａｎｏｖｅｌｆｏｒｍｏｆｔｉｓｓｕｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃＲＮＡｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇｐｒｏｄｕｃｅｓａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ−Ｂ４８ｉｎｉｎｔｅｓｔｉｎｅ，”Ｃｅｌｌ５０：８３１−８４０（１９８７））。編集は、補助因子（ａｕｘｉｌｉａｒｙｆａｃｔｏｒ）に補助され、アポリポタンパク質ＢｍＲＮＡ編集触媒サブユニット１（これは、ＡＰＯＢＥＣ−１として既知である（Ｔｅｎｇら、”ＭｏｌｅｃｕｌａｒｃｌｏｎｉｎｇｏｆａｎａｐｏＢｍｅｓｓｅｎｇｅｒＲＮＡｅｄｉｔｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ，”Ｓｃｉｅｎｃｅ２６０：１８１１６−１８１９（１９９３）））によって触媒される、部位特異的脱アミノ化事象である。（Ｔｅｎｇら、”ＭｏｌｅｃｕｌａｒｃｌｏｎｉｎｇｏｆａｎａｐｏＢｍｅｓｓｅｎｇｅｒＲＮＡｅｄｉｔｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ，”Ｓｃｉｅｎｃｅ２６０：１８１１６〜１８１９（１９９３）；Ｙａｎｇら，”ＰａｒｔｉａｌｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｔｈｅａｕｘｉｌｉａｒｙｆａｃｔｏｒｓｉｎｖｏｌｖｅｄｉｎａｐｏＢｍＲＮＡｅｄｉｔｉｎｇｔｈｒｏｕｇｈＡＰＯＢＥＣ−１ａｆｆｉｎｉｔｙｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，”Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：２７７００−２７７０６（１９９７）；Ｙａｎｇら，”Ｍｕｌｔｉｐｌｅｐｒｏｔｅｉｎｄｏｍａｉｎｓｄｅｔｅｒｍｉｎｅｔｈｅｃｅｌｌｔｙｐｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃｎｕｃｌｅａｒｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｏｆｔｈｅｃａｔａｌｙｔｉｃｓｕｂｕｎｉｔｒｅｑｕｉｒｅｄｆｏｒａｐｏＢｍＲＮＡｅｄｉｔｉｎｇ，”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９４：１３０７５−１３０８０（１９９７）；Ｌｅｌｌｅｋら，”ＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒｃｌｏｎｉｎｇｏｆａｎｏｖｅｌｅｓｓｅｎｔｉａｌｃｏｍｐｏｎｅｎｔｏｆｔｈｅａｐｏＢｍＲＮＡｅｄｉｔｉｎｇｅｎｚｙｍｅｃｏｍｐｌｅｘ，”Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：１９８４８−１９８５６（２０００）；Ｍｅｈｔａら，”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｌｏｎｉｎｇｏｆａｐｏｂｅｃ−ｌｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎｆａｃｔｏｒ，ａｎｏｖｅｌＲＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎｉｎｖｏｌｖｅｄｉｎｔｈｅｅｄｉｔｉｎｇｏｆａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎＢｍＲＮＡ，”Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２０：１８４６−１８５４（２０００）；Ｙａｎｇら，”ＩｎｄｕｃｔｉｏｎｏｆｃｙｔｉｄｉｎｅｔｏｕｒｉｄｉｎｅｅｄｉｔｉｎｇｏｎｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎＢｍＲＮＡｂｙｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇＡＰＯＢＥＣ−１，”Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：２２６６３−２２６６９（２０００）；Ｂｌａｎｃら、”ＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＧＲＹ−ＲＢＰａｓａｎａｐｏＢｍＲＮＡｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎｔｈａｔｉｎｔｅｒａｃｔｓｗｉｔｈｂｏｔｈａｐｏｂｅｃ−１ａｎｄｗｉｔｈａｐｏｂｅｃ−１ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎｆａｃｔｏｒ（ＡＣＦ）ｔｏｍｏｄｕｌａｔｅＣｔｏＵｅｄｉｔｉｎｇ，”Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：１０２７２−１０２８３（２００１））ａｓａｈｏｌｏｅｎｚｙｍｅｏｒｅｄｉｔｏｓｏｍｅ（Ｓｍｉｔｈら”ＩｎｖｉｔｒｏａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎＢｍＲＮＡｅｄｉｔｉｎｇ：Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆａ２７Ｓｅｄｉｔｉｎｇｃｏｍｐｌｅｘ，”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８８：１４８９−１４９３（１９９１）；Ｈａｒｒｉｓら，”Ｅｘｔｒａｃｔ−ｓｐｅｃｉｆｉｃｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙｉｎｈｉｇｈ−ｏｒｄｅｒｃｏｍｐｌｅｘｅｓｃｏｎｔａｉｎｉｎｇａｐｏＢｍＲＮＡｅｄｉｔｉｎｇａｃｔｉｖｉｔｙａｎｄＲＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎｓ，”Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：７３８２−７３９２（１９９３））。アポリポタンパク質Ｂ１００およびアポリポタンパク質Ｂ４８は、脂質代謝において異なった役割を担い、最も重要なことに、アポリポタンパク質Ｂ１００結合型リポタンパク質（ＶＬＤＬおよびＬＤＬ）は、アポリポタンパク質Ｂ４８結合型リポタンパク質（カイロミクロンおよびそれらの組換え体ならびにＶＬＤＬ）よりもずっとアテローム発生性である。
【０００４】
具体的には、このアポリポタンパク質Ｂ４８結合型リポタンパク質は、このアポリポタンパク質Ｂ１００結合型リポタンパク質よりも迅速に血清中から除去される。結果として、
アポリポタンパク質Ｂ４８−ＶＬＤＬは、通常、血清リパーゼがＶＬＤＬをＬＤＬに変換するのに十分な時間量で、血清中に存在しない。対照的に、アポリポタンパク質Ｂ１００−ＶＬＤＬは、十分な時間量で血清中に存在し、血清リパーゼがＶＬＤＬをＬＤＬに変換することを可能にする。ＬＤＬの上昇した血清レベルは、これらアテローム発生性の疾患または障害の危険性の上昇と関連するので、特に生物学的に重要である。リポタンパク質分析によって、編集を行う哺乳動物の肝臓の能力が、（ＶＬＤＬ＋ＬＤＬ）：ＨＤＬの比を低下させる結果となることが示された。従って、アポリポタンパク質Ｂ１００（または全アポリポタンパク質濃度）に比例して、アポリポタンパク質Ｂ４８の相対濃度の上昇に好都合である、アポリポタンパク質Ｂ編集を改変するためのアプローチを同定し、それによって、血清からより高濃度のリポタンパク質を除去し、そして、高血清レベルのＶＬＤＬおよびＬＤＬに関連するアテローム発生性の危険性を最小化することが所望される。
【０００５】
現在の脂質低下療法は、スタチンおよび胆汁酸結合樹脂を含む。スタチンは、ヒドロキシメチルグルタリル補酵素Ａ（ＨＭＧ−ＣｏＡ）酸化還元酵素の競合的インヒビターであり、この酸化還元酵素は、コレステロール合成における授受工程を触媒する（Ｄａｖｉｇｎｏｎら，”ＨＭＧ−ＣｏＡｒｅｄｕｃｔａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ：ａｌｏｏｋｂａｃｋａｎｄａｌｏｏｋａｈｅａｄ，”Ｃａｎ．Ｊ．Ｃａｒｄｉｏｌ．８：８４３−６４（１９９２））。胆汁酸結合樹脂は、腸内の胆汁酸を隔離し、それによって、胆汁酸の腸肝循環を阻害し、そして、身体からのコレステロールの除去を増大させる。これらは、高脂質血症を有する一部の患者にとって、効果的な治療法である；しかし、３０％までの患者に、悪影響が観察され、これは、既存のものに代わる治療法に対する必要性を示唆する。ＬＤＬレセプターまたはアポリポタンパク質Ｂをコードする遺伝子での変異によって、家族性高コレステロール血症として知られているヒトの遺伝的疾患が引き起こされ得、この高コレステロール赤症は、細胞によるＬＤＬレセプター媒介性コレステロール摂取の欠損に起因する、コレステロールの上昇したレベルおよび若年性アテローム性動脈硬化症によって、特徴付けられる（Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎら，Ｆａｍｉｌｉａｌｈｙｐｅｒｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌｅｍｉａ，”ＩｎＴｈｅＭｅｔａｂｏｌｉｃａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＢａｓｅｓｏｆＩｎｈｅｒｉｔｅｄＤｉｓｅａｓｅ，第２巻，１９８１〜２０３０頁，Ｓｃｒｉｖｅｒら（編）、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，ＮｅｗＹｏｒｋ（１９９５））。この障害を有する子供に対する治療法が、罹病または死亡を阻止するために必要とされているが、しかし、ＮａｔｉｏｎａｌＣｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌＥｄｕｃａｔｉｏｎＰｒｏｇｒａｍ（ＮＣＥＰ）は、１０歳以上の子供に対してのみ薬物療法を考慮することを推奨しており、これは、長期間の薬物治療が、成長および思春期の発達を損なう可能性があるという危険性のためである。従って、血清ＬＤＬレベルの低下ための、既存のものに代わるアプローチの開発は、未だに危機に瀕している区分の集団にとって必須である。
【０００６】
肝臓のアポリポタンパク質ＢのｍＲＮＡ編集を刺激することは、ＶＬＤＬを含有するアポリポタンパク質Ｂ１００の合成および分泌を減少させることを介して、血清ＬＤＬを低下させる手段である。ヒトを含むほとんどの哺乳動物において、アポリポタンパク質ＢのｍＲＮＡ編集は、小腸のみにおいて行われている。肝臓におけるかなりの編集の存在（これは、４種に見出される）は、肝臓での編集活性を有さない動物と比較して、少ないアテローム発生性リポタンパク質プロフィールと関連する（Ｇｒｅｅｖｅら，”ＡｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎＢｍＲＮＡｅｄｉｔｉｎｇｉｎ１２ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｍａｍｍａｌｉａｎｓｐｅｃｉｅｓ：ｈｅｐａｔｉｃｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｓｒｅｆｌｅｃｔｅｄｉｎｌｏｗｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓｏｆａｐｏＢ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｐｌａｓｍａｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｓ，”Ｊ．ＬｉｐｉｄＲｅｓ．３４：１３６７−１３８３（１９９３））。ＡＰＯＢＥＣ−１は、アポリポタンパク質ＢｍＲＮＡ編集を行う全ての組織において発現されている（Ｔｅｎｇら，”ＭｏｌｅｃｕｌａｒｃｌｏｎｉｎｇｏｆａｎａｐｏＢｍｅｓｓｅｎｇｅｒＲＮＡｅｄｉｔｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ，”Ｓｃｉｅｎｃｅ２６０：１８１１６〜１８１９（１９９３））。ヒトの肝臓は、ＡＰＯＢＥＣ−１を発現しないが、ヒトの肝臓は、トランスフェクトされた細胞でのアポリポタンパク質ＢｍＲＮＡ編集における外因性ＡＰＯＢＥＣ−１を補完するのに十分な補助タンパク質（ａｕｘｉｌｉａｒｙｐｒｏｔｅｉｎ）を発現する（Ｔｅｎｇら、”ＭｏｌｅｃｕｌａｒｃｌｏｎｉｎｇｏｆａｎａｐｏＢｍｅｓｓｅｎｇｅｒＲＮＡｅｄｉｔｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ，”Ｓｃｉｅｎｃｅ２６０：１８１１６〜１８１９（１９９３）；Ｓｏｗｄｅｎら、”ＡｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎＢＲＮＡＳｅｑｕｅｎｃｅ３’ ｏｆｔｈｅｍｏｏｒｉｎｇｓｅｑｕｅｎｃｅａｎｄｃｅｌｌｕｌａｒｓｏｕｒｃｅｓｏｆａｕｘｉｌｉａｒｙｆａｃｔｏｒｓｄｅｔｅｒｍｉｎｅｔｈｅｌｏｃａｔｉｏｎａｎｄｅｘｔｅｎｔｏｆｐｒｏｍｉｓｃｕｏｕｓｅｄｉｔｉｎｇ，”ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．２６：１６４４−１６５２（１９９８））。
【０００７】
ａｐｏｂｅｃ−１遺伝子移入を介して肝臓の編集を増強することを目的とするトランスジェニック実験によって、血漿アポリポタンパク質Ｂ１００の顕著な低下および血清ＬＤＬの有意な減少が示されている（Ｔｅｎｇら，”Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ−ｍｅｄｉａｔｅｄｇｅｎｅｔｒａｎｓｆｅｒｏｆｒａｔａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎＢｍＲＮＡｅｄｉｔｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎｉｎｍｉｃｅｖｉｒｔｕａｌｌｙｅｌｉｍｉｎａｔｅｓａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎＢ１００ａｎｄｎｏｒｍａｌｌｏｗｄｅｎｓｉｔｙｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，”Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：２９３９５〜２９４０４（１９９４）；Ｈｕｇｈｓら，”ＧｅｎｅｔｒａｎｓｆｅｒｏｆｃｙｔｉｄｉｎｅｄｅａｍｉｎａｓｅＡＰＯＢＥＣ−ｌｌｏｗｅｒｓｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ（ａ）ｉｎｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｍｉｃｅａｎｄｉｎｄｕｃｅｓａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎＢｍＲＮＡｅｄｉｔｉｎｇｉｎｒａｂｂｉｔｓ，”Ｈｕｍ．ＧｅｎｅＴｈｅｒ．７：３９−４９（１９９６）；Ｎａｋａｍｕｔａら，”Ｃｏｍｐｌｅｔｅｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｔｈｅａｐｏｂｅｃ−１ｋｎｏｃｋｏｕｔｍｉｃｅｗｉｔｈａｗｉｌｄ−ｔｙｐｅｇｅｎｅｔｉｃｂａｃｋｇｒｏｕｎｄａｎｄａｈｕｍａｎａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎＢｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ，ａｎｄｒｅｓｔｏｒａｔｉｏｎｏｆａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎＢｍＲＮＡｅｄｉｔｉｎｇｂｙｓｏｍａｔｉｃｇｅｎｅｔｒａｎｓｆｅｒｏｆＡｐｏｂｅｃ−１，”Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２５９８１−２５９８８（１９９６）；Ｋｏｚａｒｓｋｙら，”ＨｅｐａｔｉｃｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｔｈｅｃａｔａｌｙｔｉｃｓｕｂｕｎｉｔｏｆｔｈｅａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎＢｍＲＮＡｅｄｉｔｉｎｇｅｎｚｙｍｅａｍｅｌｉｏｒａｔｅｓｈｙｐｅｒｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌｅｍｉａｉｎＬＤＬｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔｒａｂｂｉｔｓ，”Ｈｕｍ．ＧｅｎｅＴｈｅｒ．７：９４３−９５７（１９９６）；Ｆａｒｅｓｅら，”ＰｈｅｎｏｔｙｐｉｃａｎａｌｙｓｉｓｏｆｍｉｃｅｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇｅｘｃｌｕｓｉｖｅｌｙａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎＢ４８ｏｒａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎＢ１００，”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｉ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９３：６３９３−６３９８（１９９６）；Ｑｉａｎら，”ＬｏｗｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｔｈｅａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎＢｍＲＮＡｅｄｉｔｉｎｇｔｒａｎｓｇｅｎｅｉｎｍｉｃｅｒｅｄｕｃｅｓＬＤＬｂｕｔｄｏｅｓｎｏｔｃａｕｓｅｌｉｖｅｒｄｙｓｐｌａｓｉａｏｒｔｕｍｏｒｓ，”Ａｒｔｅｒｉｏｓｃ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．１８：１０１３−１０２０（１９９８）；Ｗｕら、”ＮｏｒｍａｌｐｅｒｉｎａｔａｌｒｉｓｅｉｎｓｅｒｕｍｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌｉｓｉｎｈｉｂｉｔｅｄｂｙｈｅｐａｔｉｃｄｅｌｉｖｅｒｙｏｆａｄｅｎｏｖｉｒａｌｖｅｃｔｏｒｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎＢｍＲＮＡｅｄｉｔｉｎｇｅｎｚｙｍｅｉｎｒａｂｂｉｔｓ，”Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｒｅｓ．８５：１４８−１５７（１９９９））。
【０００８】
標的化された突然変異誘発によって作製され、正常に発達した、アポリポタンパク質Ｂ４８を排他的に合成するマウス（アポリポタンパク質Ｂ４８単独マウス（ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎＢ４８−ｏｎｌｙｍｉｃｅ））が健康かつ繁殖力がある場合、アポリポタンパク質Ｂ１００は生存にとって必須ではない。食餌（ｃｈｏｗｄｉｅｔ）が供給された野生型マウスと比較して、ＬＤＬコレステロールのレベルは、アポリポタンパク質Ｂ４８単独マウスにおけるＬＤＬコレステロールレベルよりも低かった（Ｆａｒｅｓｅら，”ＰｈｅｎｏｔｙｐｉｃａｎａｌｙｓｉｓｏｆｍｉｃｅｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇｅｘｃｌｕｓｉｖｅｌｙａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎＢ４８ｏｒａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎＢ１００，”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９３：６３９３〜６３９８（１９９６））。しかし、ａｐｏｂｅｃ−１遺伝子の移入および組織特異的な過剰発現を介したアポリポタンパク質ＢｍＲＮＡ編集活性の導入によって、これが、トランスジェニックマウスおよびトランスジェニックラットにおける肝細胞形成異常および肝細胞癌腫を導入したという点における大変な難題が保持される（Ｙａｍａｎａｋａら、”ＡｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎＢｍＲＮＡｅｄｉｔｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎｉｎｄｕｃｅｓｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒｃａｒｃｉｎｏｍａａｎｄｄｙｓｐｌａｓｉａｉｎｔｒａｎｓｇｅｎｉｃａｎｉｍａｌｓ．”、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｉ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９２：８４８３−８４８７（１９９５）；Ｙａｍａｎａｋａら，”ＨｙｐｅｒｅｄｉｔｉｎｇｏｆｍｕｌｔｉｐｌｅｃｙｔｉｄｉｎｅｓｏｆａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎＢｍＲＮＡｂｙＡＰＯＢＥＣ−１ｒｅｑｕｉｒｅｓａｕｘｉｌｉａｒｙｐｒｏｔｅｉｎ（ｓ）ｂｕｔｎｏｔａｍｏｏｒｉｎｇｓｅｑｕｅｎｃｅｍｏｔｉｆ，”Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：１１５０６−１１５１０（１９９６）；Ｙａｍａｎａｋａら、”ＡｎｏｖｅｌｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌｒｅｐｒｅｓｓｏｒｍＲＮＡｉｓｅｄｉｔｅｄｅｘｔｅｎｓｉｖｅｌｙｉｎｌｉｖｅｒｓｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｔｕｍｏｒｓｃａｕｓｅｄｂｙｔｈｅｔｒａｎｓｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｔｈｅａｐｏＢｍＲＮＡｅｄｉｔｉｎｇｅｎｚｙｍｅ，”Ｇｅｎｅｓ＆Ｄｅｖ．１１：３２１−３３３（１９９７））。これは、非調節性かつ非特異的なｍＲＮＡ編集を生じる、永続的に高レベルのＡＰＯＢＥＣ−１発現に起因していると提案された（Ｓｏｗｄｅｎら，”ＯｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＡＰＯＢＥＣ−１ｒｅｓｕｌｔｓｉｎｍｏｏｒｉｎｇ−ｓｅｑｕｅｎｃｅ− ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｐｒｏｍｉｓｃｕｏｕｓＲＮＡｅｄｉｔｉｎｇ，”Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：３０１１−３０１７（１９９６）；Ｙａｍａｎａｋａら，”ＡｎｏｖｅｌｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌｒｅｐｒｅｓｓｏｒｍＲＮＡｉｓｅｄｉｔｅｄｅｘｔｅｎｓｉｖｅｌｙｉｎｌｉｖｅｒｓｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｔｕｍｏｒｓｃａｕｓｅｄｂｙｔｈｅｔｒａｎｓｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｔｈｅａｐｏＢｍＲＮＡｅｄｉｔｉｎｇｅｎｚｙｍｅ，”Ｇｅｎｅｓ＆Ｄｅｖ．１１：３２１−３３３（１９９７）；Ｓｏｗｄｅｎら，”ＡｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎＢＲＮＡＳｅｑｕｅｎｃｅ３’ｏｆｔｈｅｍｏｏｒｉｎｇｓｅｑｕｅｎｃｅａｎｄｃｅｌｌｕｌａｒｓｏｕｒｃｅｓｏｆａｕｘｉｌｉａｒｙｆａｃｔｏｒｓｄｅｔｅｒｍｉｎｅｔｈｅｌｏｃａｔｉｏｎａｎｄｅｘｔｅｎｔｏｆｐｒｏｍｉｓｃｕｏｕｓｅｄｉｔｉｎｇ，”ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．２６：１６４４−１６５２（１９９８））。悪影響は、低レベルから中程度のレベルのＡＰＯＢＥＣ−１発現を有するトランスジェニック動物において観測されなかった（Ｔｅｎｇら，”Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ−ｍｅｄｉａｔｅｄｇｅｎｅｔｒａｎｓｆｅｒｏｆｒａｔａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎＢｍＲＮＡｅｄｉｔｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎｉｎｍｉｃｅｖｉｒｔｕａｌｌｙｅｌｉｍｉｎａｔｅｓａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎＢ１００ａｎｄｎｏｒｍａｌｌｏｗｄｅｎｓｉｔｙｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，”Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：２９３９５〜２９４０４（１９９４）；Ｑｉａｎら，”ＬｏｗｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｔｈｅａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎＢｍＲＮＡｅｄｉｔｉｎｇｔｒａｎｓｇｅｎｅｉｎｍｉｃｅｒｅｄｕｃｅｓＬＤＬｂｕｔｄｏｅｓｎｏｔｃａｕｓｅｌｉｖｅｒｄｙｓｐｌａｓｉａｏｒｔｕｍｏｒｓ，”Ａｒｔｅｒｉｏｓｃ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．１８：１０１３−１０２０（１９９８）；Ｗｕら、”ＮｏｒｍａｌｐｅｒｉｎａｔａｌｒｉｓｅｉｎｓｅｒｕｍｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌｉｓｉｎｈｉｂｉｔｅｄｂｙｈｅｐａｔｉｃｄｅｌｉｖｅｒｙｏｆａｄｅｎｏｖｉｒａｌｖｅｃｔｏｒｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎＢｍＲＮＡｅｄｉｔｉｎｇｅｎｚｙｍｅｉｎｒａｂｂｉｔｓ，”Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｒｅｓ．８５：１４８−１５７（１９９９））。
【０００９】
アポリポタンパク質ＢｍＲＮＡ編集を改変することにおける、ａｐｏｂｅｃ−１遺伝子治療法の限界のある結果にもかかわらず、このような遺伝子治療は、永続的に上昇したレベルのＡＰＯＢＥＣ−１発現または感染性形質転換ベクター（例えば、アデノウイルスベクター）の使用に関連する問題のいずれかに由来する、大きすぎる悪影響の危険性を提示している。
【００１０】
これらの理由のために、アポリポタンパク質ＢｍＲＮＡ編集を達成するためのアプローチを同定することが所望され、ここで、この導入は、低レベルで維持され得、そして重要なことには、一過性の様式で達成され得る。さらに、報告された遺伝子療法的アプローチにおいて観察される副作用を実質的に持たないアポリポタンパク質ＢｍＲＮＡ編集を達成するためのアプローチを同定することが所望される。本発明は、当該分野におけるこれらおよび他の困難性を克服するように指向される。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
（発明の要旨）
本発明の第１の局面は、以下を含むキメラタンパク質に関する：タンパク質形質導入ドメイン（ｐｒｏｔｅｉｎｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎｄｏｍａｉｎ）を含む第１のポリペプチド、およびアポリポタンパク質ＢをコードするｍＲＮＡを編集（ｅｄｉｔ）し得るＡＰＯＢＥＣ−１またはそのフラグメントを含む第２のポリペプチド。
【００１２】
本発明の第２の局面は、以下を含むキメラタンパク質に関する：タンパク質形質導入ドメインを含む第１のポリペプチド；およびアポリポタンパク質ＢｍＲＮＡに結合してＡＰＯＢＥＣ−１によるｍＲＮＡの編集を促進し得るＡＰＯＢＥＣ−１相補因子（「ＡＣＦ」）またはそのフラグメントを含む第２のポリペプチド。
【００１３】
本発明の第３および第４の局面は、本発明のキメラタンパク質のうちの１つをコードするＤＮＡ分子に関する。このようなＤＮＡ分子を含むＤＮＡ構築物、発現ベクター、および組換え宿主細胞もまた開示される。
【００１４】
本発明の第５の局面は、以下を含む組成物に関する：薬学的に受容可能なキャリアおよび本発明のキメラタンパク質。
【００１５】
本発明の第６の局面は、以下を含む組成物に関する：タンパク質形質導入ドメインを含む第１のポリペプチドおよびアポリポタンパク質ＢをコードするｍＲＮＡを編集し得るＡＰＯＢＥＣ−１またはそのフラグメントを含む第２のポリペプチドを含む第１のキメラタンパク質；ならびにタンパク質形質導入ドメインを含む第１のポリペプチドおよびアポリポタンパク質ＢｍＲＮＡに結合してＡＰＯＢＥＣ−１またはそのフラグメントによるｍＲＮＡの編集を促進し得るＡＣＦまたはそのフラグメントを含む第２のポリペプチドを含む第２のキメラタンパク質。
【００１６】
本発明の第７の局面は、本発明のキメラタンパク質または本発明の組成物のいずれかを含む送達デバイスに関する。
【００１７】
本発明の第８の局面は、以下を包含する、インビボでのアポリポタンパク質ＢｍＲＮＡの編集を修飾する方法に関する：タンパク質形質導入ドメインを含む第１のポリペプチドおよびアポリポタンパク質ＢをコードするｍＲＮＡを編集し得るＡＰＯＢＥＣ−１またはそのフラグメントを含む第２のポリペプチドを含むキメラタンパク質と、細胞中のアポリポタンパク質ＢｍＲＮＡとを、未処理細胞と比較して、この細胞により分泌されるアポリポタンパク質Ｂ１００の濃度と比較した場合にこの細胞により分泌されるアポリポタンパク質Ｂ４８の濃度を増加させるのに有効な条件下で接触させる工程。
【００１８】
本発明の第９の局面は、以下を包含する血清ＬＤＬレベルを減少する方法に関する：アポリポタンパク質ＢをコードするｍＲＮＡを編集し得るＡＰＯＢＥＣ−１またはそのフラグメントを含む一定量のタンパク質を、患者の１つ以上の細胞に、細胞を遺伝子改変することなく送達する工程（この一定量は、１つ以上の細胞により血清に分泌されるＶＬＤＬ−アポリポタンパク質Ｂ４８の濃度を増加させ、その結果、ＬＤＬの血清濃度を減少させるのに有効である）。
【００１９】
本発明の第１０の局面は、以下を包含する、アテローム発生性の疾患または障害を処置または予防する方法に関する：アポリポタンパク質ＢをコードするｍＲＮＡを編集し得るＡＰＯＢＥＣ−１またはそのフラグメントを含む、有効量のタンパク質を患者に投与する工程（ここで、投与の際に、このタンパク質は、１つ以上の細胞により血清に分泌されるＶＬＤＬ−アポリポタンパク質Ｂ４８の濃度を増加させるのに有効な条件下で、ＶＬＤＬ−アポリポタンパク質Ｂを合成および分泌し得る患者の１つ以上の細胞により取り込まれ、それによって、血清からのＶＬＤＬ−アポリポタンパク質Ｂ４８の迅速な除去が、ＬＤＬの血清濃度を減少させて、アテローム発生性疾患または障害を処置または予防する）。
【００２０】
本発明の第１１の局面は、肝臓細胞による摂取に対して標的化されたリポソームまたはニオソームに関する。このリポソームまたはニオソームは、（ｉ）アポリポタンパク質ＢｍＲＮＡを編集するのに有効なＡＰＯＢＥＣ−１またはそのフラグメント、（ｉｉ）アポリポタンパク質ＢｍＲＮＡに結合するのに有効なＡＣＦまたはそのフラグメント、あるいは（ｉｉｉ）それらの組み合わせ、を含有する。リポソームまたはニオソームを含む組成物もまた開示される。
【００２１】
本発明は、ＶＬＤＬ−アポリポタンパク質Ｂを産生および分泌する細胞において細胞内ＡＰＯＢＥＣ−１を増加させるための、タンパク質媒介性送達の有効性を実証する。インビボでのアポリポタンパク質ＢｍＲＮＡ編集の程度を増大することにより、このような細胞により分泌されるＶＬＤＬ−アポリポタンパク質Ｂ１００に対するＶＬＤＬ−アポリポタンパク質Ｂ４８の比率を改変する（特に、ＶＬＤＬ―アポリポタンパク質Ｂ４８の相対的血清濃度を増加させ、そしてＶＬＤＬ−アポリポタンパク質Ｂ１００の相対的血清濃度を減少させる）ことが可能である。これらの複合体の性質に起因して、Ｂ４８複合体は、血清からより迅速に除去され、主要なアテローム発生性疾患因子であるＬＤＬへのＶＬＤＬの変換を最小限に抑える。ＶＬＤＬ−アポリポタンパク質Ｂ１００の量を最小限に抑え、そしてＶＬＤＬ−アポリポタンパク質Ｂ４８の量を増加させることにより、アテローム発生性疾患または障害の処置および予防の両方を行うことが可能である。さらに、タンパク質送達を用いることにより、遺伝子療法の明らかに回避不可能な副作用を回避することが可能である。本明細書中に示されるこれらの結果は、正確に制御された肝性編集活性の誘導を介した高脂血の処置について新たな可能性を開くものである。
【００２２】
（発明の詳細な説明）
本発明は、アポリポタンパク質ＢｍＲＮＡの編集を調節するため、従って、分泌されるアポリポタンパク質Ｂ誘導体の相対濃度を調節するための、タンパク質により媒介されるアプローチに関し、これは、アポリポタンパク質Ｂおよびその誘導体に関連するアテローム性疾患因子（例えば、低密度リポタンパク質（「ＬＤＬ」））の血清レベルを制御するためのアプローチを提供する。
【００２３】
本発明の１つの局面によれば、このような使用のための第１のキメラタンパク質が提供される。この第１のキメラタンパク質は、タンパク質形質導入ドメインを含む第１のポリペプチド、およびＡＰＯＢＥＣ−１またはアポリポタンパク質ＢをコードするｍＲＮＡを編集し得るそのフラグメントを含む第２のポリペプチドを含む。
【００２４】
この第１のポリペプチドは、キメラタンパク質の細胞取込みを誘導するために適切な、任意のタンパク質、またはそのポリペプチドフラグメントであり得る。
【００２５】
例として、いくつかの公知のタンパク質由来のタンパク質形質導入ドメインが使用され得、これには、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ＨＩＶ−１Ｔａｔタンパク質、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ異種形成転写因子（ＡＮＴＰ）、およびＨＳＶ−１ＶＰ２２転写因子（Ｓｃｈｗａｒｚｅら、「Ｉｎｖｉｖｏｐｒｏｔｅｉｎｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ：Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｄｅｌｉｖｅｒｙｏｆｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙａｃｔｉｖｅｐｒｏｔｅｉｎｓ，ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ，ａｎｄＤＮＡ」、ＴｉＰＳ２１：４５−４８（２０００）、これは、その全体が本明細書中に参考として援用される）。
【００２６】
好ましいタンパク質形質導入ドメインは、ヒト免疫不全ウイルス（「ＨＩＶ」）ｔａｔタンパク質のタンパク質形質導入ドメインである。例示的なＨＩＶｔａｔタンパク質形質導入ドメインは、以下のような配列番号９のアミノ酸配列を有する：
【００２７】
【化１】

このタンパク質形質導入ドメインはまた、核転座ドメインであることが注目されている（ＨＩＶＳｅｑｕｅｎｃｅＣｏｍｐｅｎｄｉｕｍ２０００，Ｋｕｉｋｅｎら（編）、ＴｈｅｏｒｅｔｉｃａｌＢｉｏｌｏｇｙａｎｄＢｉｏｐｈｙｓｉｃｓＧｒｏｕｐ，ＬｏｓＡｌａｍｏｓＮａｔｉｏｎａｌＬａｂｏｒａｔｏｒｙ、これは、その全体が本明細書中に参考として援用される）。ＨＩＶｔａｔタンパク質形質導入ドメインをコードする１つのＤＮＡ分子は、以下のような配列番号１０のヌクレオチド配列を有する：
ａｇａａａａａａａａｇａａｇａｃａａａｇａａｇａａｇａ２７
これらのｔａｔ配列のバリエーションもまた、使用され得る。このような配列改変体は、ＨＩＶＳｅｑｕｅｎｃｅＣｏｍｐｅｎｄｉｕｍ２０００，Ｋｕｉｋｅｎら（編）、ＴｈｅｏｒｅｔｉｃａｌＢｉｏｌｏｇｙａｎｄＢｉｏｐｈｙｓｉｃｓＧｒｏｕｐ，ＬｏｓＡｌａｍｏｓＮａｔｉｏｎａｌＬａｂｏｒａｔｏｒｙ（これは、その全体が本明細書中に参考として援用される）において報告されている。
【００２８】
他の細胞取り込みポリペプチドおよびその使用は、文献に記載されており、これらのポリペプチドとしては、ＳＮ５０ペプチドの膜貫通配列、Ｇｒｂ２ＳＨ２ドメイン、ならびにインテグリンβ_３、インテグリンβ_１、およびインテグリンα_ＩＩｂの細胞質ドメインが挙げられる（Ｈａｗｉｇｅｒ、「Ｎｏｎｉｎｖａｓｉｖｅｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｄｅｌｉｖｅｒｙｏｆｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｐｅｐｔｉｄｅｓａｎｄｐｒｏｔｅｉｎｓ」、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．３：８９−９４（１９９９）、これは、その全体が本明細書中に参考として援用される）。
【００２９】
第２のポリペプチドは、全長ＡＰＯＢＥＣ−１、またはその触媒ドメインを含むそのフラグメントのいずれかであり得る。ＡＰＯＢＥＣ−１タンパク質またはそのフラグメントは、哺乳動物ＡＰＯＢＥＣ−１タンパク質またはそのフラグメントであり、ヒト、ラット、マウスなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３０】
全長ヒトＡＰＯＢＥＣ−１は、以下のような配列番号１１によるアミノ酸配列を有する：
【００３１】
【化２】

このヒトＡＰＯＢＥＣ−１配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＰ＿００１６３５において報告され、これは、その全体が本明細書中に参考として援用される。全長ヒトＡＰＯＢＥＣ−１は、推定二部構成核転座シグナルをアミノ酸残基１５〜３４の間に、触媒中心をアミノ酸残基６１〜９８の間に、そして推定細胞質保持シグナルをアミノ酸残基１７３−２２９の間に含むと考えられる。全長ヒトＡＰＯＢＥＣ−１をコードするｃＤＮＡ配列を、以下のように配列番号１２として記載する：
【００３２】
【化３】

全長ラットＡＰＯＢＥＣ−１は、以下のような配列番号１３によるアミノ酸配列を有する：
【００３３】
【化４】

このラットＡＰＯＢＥＣ−１配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｐ３８４８３において報告されており、これは、その全体が本明細書中に参考として援用される。ラットＡＰＯＢＥＣ−１を使用する組換え研究は、推定核転座シグナルを含むＮ末端領域が、ＡＰＯＢＥＣ−１の核分布のために必要とされ、一方で、Ｃ末端領域は、推定細胞質保持シグナルを含むことを実証した（Ｙａｎｇら、「Ｍｕｌｔｉｐｌｅｐｒｏｔｅｉｎｄｏｍａｉｎｓｄｅｔｅｒｍｉｎｅｔｈｅｃｅｌｌｔｙｐｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃｎｕｃｌｅａｒｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｏｆｔｈｅｃａｔａｌｙｔｉｃｓｕｂｕｎｉｔｒｅｑｕｉｒｅｄｆｏｒａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎＢｍＲＮＡｅｄｉｔｉｎｇ」Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９４：１３０７５−１３０８０（１９９７）、これは、その全体が本明細書中に参考として援用される）。全長ラットＡＰＯＢＥＣ−１をコードするｃＤＮＡ配列は、以下のような配列番号１４として記載される：
【００３４】
【化５】

このｃＤＮＡ分子は、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｌ０７１１４において報告されており、これは、その全体が本明細書中に参考として援用される。
【００３５】
全長マウスＡＰＯＢＥＣ−１は、以下のような配列番号１５によるアミノ酸配列を有する：
【００３６】
【化６】

このマウスＡＰＯＢＥＣ−１配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＰ＿１１２４３６において報告されており、これは、その全体が本明細書中に参考として援用される。全長マウスＡＰＯＢＥＣ−１をコードするｃＤＮＡ配列は、以下のような配列番号１６として記載される：
【００３７】
【化７】

このｃＤＮＡ分子は、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＭ＿０３１１５９において報告されており、これは、その全体が本明細書中に参考として援用される。
【００３８】
本発明の第１のキメラタンパク質はまた、１つ以上の他のポリペプチド配列を含み得、この配列としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：（ｉ）細胞質局在タンパク質を含むポリペプチドまたはそのフラグメントであって、これは、第１のキメラタンパク質の細胞取り込みの際に、第１のキメラタンパク質を細胞質に局在させる；（ｉｉ）隣接する複数のヒスチジン残基を含むポリペプチド；ならびに（ｉｉｉ）エピトープタグを含むポリペプチド。
【００３９】
細胞質局在タンパク質を含むポリペプチドまたはそのフラグメントは、第１のキメラタンパク質が転座された細胞の細胞質内に第１のキメラタンパク質を効率的に保持し得る、任意のタンパク質、またはそのフラグメントであり得る。１つのこのようなタンパク質は、ニワトリ筋肉ピルビン酸キナーゼ（「ＣＭＰＫ」）であり、これは、以下のような配列番号１７のアミノ酸配列を有する：
【００４０】
【化８】

全長ＣＭＰＫをコードするＤＮＡ分子は、以下のような配列番号１８によるヌクレオチド配列を有する：
【００４１】
【化９】

全長ＣＭＰＫについてのアミノ酸配列およびヌクレオチド配列は、それぞれＧｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＡＡ４９０２１およびＪ００９０３において報告されており、これらの各々は、その全体が本明細書中に参考として援用される。
【００４２】
第１のキメラタンパク質の細胞質保持をもたらすＣＭＰＫのフラグメントとしては、配列番号１８の少なくとも残基１〜４７９を含むポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４３】
複数のヒスチジン残基を含むポリペプチドは、好ましくは、このようなヒスチジン残基を含む第１のキメラタンパク質が、複数のヒスチジン残基を認識する抗体によって結合されることを可能にするために十分な数のヒスチジン残基を含む。Ｈ_ｎをコードするＤＮＡ分子の１つの型は、（ｃａｃ）_ｎであり、ここで、ｎは、１より大きいが、好ましくは、５より大きい。このＨｉｓ領域は、免疫精製（これは、以下にさらに詳細に記載される）の間に使用され得る。
【００４４】
エピトープタグを含むポリペプチドは、そのエピトープタグに対して惹起される抗体で認識される、任意のエピトープタグであり得る。例示的なエピトープタグは、赤血球凝集素（「ＨＡ」）ドメインである。ＨＡドメインは、第１のキメラタンパク質の、転座された細胞内での局在を試験することが望ましい場合にのみ、すなわち、インビトロで、存在する。１つの適切なＨＡドメインは、以下のような配列番号１９によるアミノ酸配列を有する：
【００４５】
【化１０】

このＨＡ配列は、以下のような配列番号２０によるヌクレオチド配列を有するＤＮＡ分子によって、コードされる：
ｔａｃｃｃｃｔａｃｇａｃｇｔｇｃｃｃｇａｃｔａｃｇｃｃ２７
ヒトにおける使用に適切な本発明の例示的な第１のキメラタンパク質（ＴＡＴ−ｈＡＰＯＢＥＣ−ＣＭＰＫと命名される）が、図１Ａに記載される。この第１のキメラタンパク質（ヒト）は、Ｎ末端ＨＩＶｔａｔタンパク質形質導入ドメイン、血球凝集素ドメイン、ヒトＡＰＯＢＥＣ−１のポリペプチドフラグメント、ＣＭＰＫドメインおよびＣ末端Ｈｉｓタグを含む。この例示的な第１のキメラタンパク質（ヒト）のアミノ酸配列（配列番号２）およびコードヌクレオチド配列（配列番号１）は、それぞれ、図１Ｄおよび１Ｂ〜Ｃに記載される。
【００４６】
ラットにおける使用に適切な本発明の例示的な第１のキメラタンパク質（ＴＡＴ−ｒＡＰＯＢＥＣ−ＣＭＰＫと命名される）が、図２Ａに記載される。この第１のキメラタンパク質（ラット）は、Ｎ末端ＨＩＶｔａｔタンパク質形質導入ドメイン、血球凝集素ドメイン、ラットＡＰＯＢＥＣ−１のポリペプチドフラグメント、ＣＭＰＫドメインおよびＣ末端Ｈｉｓタグを含む。この例示的な第１のキメラタンパク質（ラット）のアミノ酸配列（配列番号４）およびコードヌクレオチド配列（配列番号３）は、それぞれ、図２Ｄおよび２Ｂ〜Ｃに記載される。
【００４７】
本発明の第２の局面によると、上記の第１のキメラタンパク質と共に使用するための第２のキメラタンパク質が提供される。この第２のキメラタンパク質は、タンパク質形質導入ドメインを含む第１のポリペプチドと、アポリポタンパク質ＢｍＲＮＡに結合し得るＡＣＦまたはそのフラグメントを含む第２のポリペプチドとを含む。
【００４８】
この第２のキメラタンパク質の第１のポリペプチドは、上記のタイプのタンパク質形質導入ドメインであり得る。この第２のキメラタンパク質のタンパク質形質導入ドメインは、この第１のキメラタンパク質のタンパク質形質導入ドメインと同じであっても異なっていてもよい。
【００４９】
上記のように、この第２のキメラタンパク質の第２のポリペプチドは、アポリポタンパク質ＢｍＲＮＡに結合し得るＡＣＦまたはそのフラグメントを含む。多数の異なるタンパク質が、アポリポタンパク質ＢｍＲＮＡの編集においてＡＰＯＢＥＣ−１を援助することが提案されているが、ＡＣＦは、ヒト系におけるインビトロでの編集のための最小タンパク質補体として同定された（Ｍｅｈｔａら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｌｏｎｉｎｇｏｆａｐｏｂｅｃ−１ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎｆａｃｔｏｒ，ａｎｏｖｅｌＲＮＡｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎｉｎｖｏｌｖｅｄｉｎｔｈｅｅｄｉｔｉｎｇｏｆａｐｏＢｍＲＮＡ」、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２０：１８４６−１８５４（２０００）（これはその全体が本明細書中に参考として援用される））。従って、本発明によると、第２のキメラタンパク質は、ムアリング（ｍｏｏｒｉｎｇ）配列においてアポリポタンパク質ＢｍＲＮＡに結合し、そして第１のキメラタンパク質との相互作用を介して、この第１のキメラタンパク質を編集されるべきアポリポタンパク質ＢｍＲＮＡのシチジン（すなわち、６６６６位）まで隔離し、それによりウリジンへの変換を引き起こす。上記のように、この変換は、アポリポタンパク質Ｂ４８誘導体の発現に寄与する終止コドンを生じる。
【００５０】
最近の研究により、ＡＰＯＢＥＣ−１が、その核局在化のためのシャペロンを必要とすることが示唆された（Ｙａｎｇら、「ＩｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓｉｎＡＰＯＢＥＣ−１，ｔｈｅｃａｔａｌｙｔｉｃｓｕｂｕｎｉｔｆｏｒｃｙｔｉｄｉｎｅｔｏｕｒｉｄｉｎｅｅｄｉｔｉｎｇｏｆａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎＢｍＲＮＡ」、Ｅｘｐ．ＣｅｌｌＲｅｓ．２６７：１５３−１６４（２００１）（これはその全体が本明細書中に参考として援用される））。しかし、より最近では、ＡＰＯＢＥＣ−１が、細胞全体にわたって、ＡＣＦと会合している可能性が最も高く、従って、これはＡＰＯＢＥＣ−１／ＡＣＦ複合体として核に移入し得ることが、知られている。二部構成核局在化シグナルは、ＡＣＦ中にあることが予測される（以下を参照のこと）。
【００５１】
ＡＣＦは、ラットの肝細胞内で十分なレベルで発現され（Ｄａｎｃｅら、「ＴｗｏｐｒｏｔｅｉｎｓｅｓｓｅｎｔｉａｌｆｏｒａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎＢｍＲＮＡｅｄｉｔｉｎｇａｒｅｅｘｐｒｅｓｓｅｄｆｒｏｍａｓｉｎｇｌｅｇｅｎｅｔｈｒｏｕｇｈａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅｓｐｌｉｃｉｎｇ」、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，（写本Ｍ１１１３３７２００（２０００）として電子的に公開されている）（これはその全体が本明細書中に参考として援用される））、その結果、細胞内ＡＣＦ濃度の増大は必要ない。しかし、アポリポタンパク質ＢｍＲＮＡの編集を最適化するために、いくつかの場合において、細胞内ＡＣＦ濃度を増加することが望まれ得る。
【００５２】
全長ラットＡＣＦは、以下の配列番号２１に従うアミノ酸配列を有する：
【００５３】
【化１１】

全長ラットＡＣＦをコードするＤＮＡ分子は、以下の配列番号２２に従うヌクレオチド配列を有する：
【００５４】
【化１２】

全長ラットＡＣＦ６５のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列は、それぞれ、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＫＫ５０１４５およびＡＹ０２８９４５として報告され、これらの各々は、その全体が本明細書中に参考として援用される。さらに、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＦ２９０９８４（これはその全体が本明細書中に参考として援用される）として同定されるように、ラットＡＣＦ５４の短いアイソフォームが存在することに注意しなければならない。
【００５５】
全長ヒトＡＣＦは、以下の配列番号２３に従うアミノ酸配列を有する：
【００５６】
【化１３】

全長ヒトＡＣＦをコードするＤＮＡ分子は、以下の配列番号２４に従うヌクレオチド配列を有する：
【００５７】
【化１４】

全長ヒトＡＣＦのアミノ酸配列およびヌクレオチド配列は、それぞれ、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＡＦ７６２２１およびＡＦ２７１７８９として報告され、これらの各々は、その全体が本明細書中に参考として援用される。
【００５８】
ヒトＡＣＦホモログとラットＡＣＦホモログとの比較において、これらのタンパク質は、アミノ酸レベルにおいて９３．５％の同一性を共有し、さらに、ヒトＡＣＦに対して惹起された抗体もまた、ラットＡＣＦを認識するようである。ＡＰＯＢＥＣ−１によるアポリポタンパク質ｍＲＮＡの編集の機能的相補性は、ＡＣＦのＮ末端の３８０残基に関連することが報告された（Ｂｌａｎｃら、「ＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓｏｆＡｐｏｂｅｃ−１ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｒｅｖｅａｌｓｄｉｓｔｉｎｃｔｄｏｍａｉｎｓｔｈａｔｍｏｄｕｌａｔｅＲＮＡｂｉｎｄｉｎｇ，ｐｒｏｔｅｉｎ−ｐｒｏｔｅｉｎｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｗｉｔｈＡｐｏｂｅｃ−１，ａｎｄｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎｏｆＣｔｏＵＲＮＡ−ｅｄｉｔｉｎｇａｃｔｉｖｉｔｙ」、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６（４９）：４６３８６−４６３９３（２００１）（これはその全体が本明細書中に参考として援用される））。
【００５９】
本発明の第２のキメラタンパク質はまた、１つ以上の他のポリペプチド配列を含み得、これには以下が挙げられるが、これらに限定されない：（ｉ）細胞質局在化タンパク質またはそのフラグメントを含むポリペプチドであって、第２のキメラタンパク質の細胞取込みの際、この第２のキメラタンパク質を細胞質に局在する、ポリペプチド：（ｉｉ）複数の隣接ヒスチジン残基を含むポリペプチド；および（ｉｉｉ）血球凝集素ドメインを含むポリペプチド。これらの各々は、第１のキメラタンパク質に関して上で記載されている。
【００６０】
ヒトにおける使用に適切な本発明の例示的な第２のキメラタンパク質（Ｔａｔ−ｈＡＣＦと命名される）は、図３Ａに記載される。この第２のキメラタンパク質（ヒト）は、Ｎ末端ＨＩＶｔａｔタンパク質形質導入ドメイン、血球凝集素ドメイン、ヒトＡＣＦのポリペプチドフラグメント、およびＣ末端Ｈｉｓタグを含む。この例示的な第２のキメラタンパク質（ヒト）のアミノ酸配列（配列番号６）およびコードヌクレオチド配列（配列番号５）は、図３Ｂ〜Ｃに記載される。
【００６１】
ラットにおける使用に適切な本発明の例示的な第２のキメラタンパク質（Ｔａｔ−ｒＡＣＦと命名される）は、図４Ａに記載される。この第２のキメラタンパク質（ラット）は、Ｎ末端ＨＩＶｔａｔタンパク質形質導入ドメイン、血球凝集素ドメイン、ラットＡＣＦのポリペプチドフラグメント、およびＣ末端Ｈｉｓタグを含む。この例示的な第２のキメラタンパク質（ラット）のアミノ酸配列（配列番号８）およびコードヌクレオチド配列（配列番号７）は、図４Ｂ〜Ｃに記載される。
【００６２】
上記の第１および第２のキメラタンパク質をコードするＤＮＡ分子は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇｓＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇｓＨａｒｂｏｒ，ＮｅｗＹｏｒｋ（１９８９）、およびＡｕｓｕｂｅｌら（編）、ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ，Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（ＮｅｗＹｏｒｋ，ＮＹ）（１９９９および上記の版）（これらの各々はその全体が本明細書中に参考として援用される）に記載されるような、遺伝子フラグメントをサブクローニングするための従来の分子遺伝子操作を使用して、構築され得る。これらと共に、ＡＰＯＢＥＣ−１、ＡＣＦまたはＣＭＰＫをコードするＤＮＡ分子の所望のフラグメントが、このタンパク質の特定の部分を提示するように選択された特定のプライマーセットと共にＰＣＲ技術を使用して、得られ得る。Ｅｒｌｉｃｈら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２５２：１６４３−５１（１９９１）（これはその全体が本明細書中に参考として援用される）。
【００６３】
一旦、所望のＤＮＡ分子が構築されると、ＤＮＡ構築物は、適切な調節配列を有する第１または第２のキメラタンパク質をコードするＤＮＡ分子と一緒にライゲーションすることによって、構築され得、この調節配列としては、ＤＮＡ分子の５’に作動可能に連結されたプロモーター配列、ＤＮＡ分子の３’に作動可能に連結された３’調節配列、および任意のエンハンサーエレメント、サプレッサエレメントなどが挙げられるが、これらに限定されない。このＤＮＡ構築物は、次いで、適切な発現ベクターに挿入され得る。その後、このベクターを使用して、宿主細胞（代表的には、原核生物を除く）を形質転換し、そして組換え宿主細胞は、本発明の第１または第２のキメラタンパク質を発現し得る。
【００６４】
原核生物宿主細胞が、その後の形質転換のために選択される場合、ＤＮＡ構築物（すなわち、導入遺伝子）を構築するために使用されるプロモーター領域は、特定の宿主に適切でなければならない。真核生物宿主細胞における発現について以下に記載されるように、真核生物プロモーターのＤＮＡ配列は、原核生物プロモーターのＤＮＡ配列とは異なる。真核生物プロモーターおよび付随する遺伝子シグナルは、原核生物系において認識され得ないか、または原核生物系中で機能し得ず、さらに、原核生物プロモーターは、真核生物細胞において認識されず、そして真核生物細胞中で機能しない。
【００６５】
同様に、原核生物におけるｍＲＮＡの翻訳は、真核生物のシグナルとは異なる適切な原核生物シグナルの存在に依存する。原核生物におけるｍＲＮＡの効率的な翻訳は、ｍＲＮＡ上のリボソーム結合部位（シャイン−ダルガーノ（「ＳＤ」）配列と呼ばれる）を必要とする。この配列は、タンパク質のアミノ末端メチオニンをコードする開始コドン（通常は、ＡＵＧ）の前に位置するｍＲＮＡの短いヌクレオチド配列である。このＳＤ配列は、１６ＳｒＲＮＡ（リボソームＲＮＡ）の３’末端に対して相補的であり、おそらく、ｒＲＮＡと二重鎖形成することによって、リボソームへのｍＲＮＡの結合を促進し、リボソームの正確な位置決めを可能にする。遺伝子発現の最大化の総説については、ＲｏｂｅｒｔｓおよびＬａｕｅｒ、ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，６８：４７３（１９７９）（これはその全体が本明細書中に参考として援用される）を参照のこと。
【００６６】
プロモーターは、それらの「強さ」（すなわち、それらの転写を促進する能力）が様々である。クローニングされた遺伝子を発現する目的で、高レベルの転写、従って高レベルのこの遺伝子の発現を得るために、強いプロモーターを使用することが望ましい。利用される宿主細胞系に依存して、多くの適切なプロモーターのいずれか１つが使用され得る。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるクローニングの場合、そのバクテリオファージまたはプラスミド、Ｔ７ファージプロモーターのようなプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、リボソームＲＮＡプロモーター、大腸菌ファージλなどのＰ_ＲプロモーターおよびＰ_Ｌプロモーター（ｌａｃＵＶ５、ｏｍｐＦ、ｂｌａ、ｌｐｐなどが挙げられるが、これらに限定されない）が、隣接するＤＮＡセグメントの高レベルの転写を方向付けるために使用され得る。さらに、ハイブリッドｔｒｐ−ｌａｃＵＶ５（ｔａｃ）プロモーターまたは組換えＤＮＡもしくは他の合成ＤＮＡ技術により生成される他のＥ．ｃｏｌｉプロモーターは、挿入される遺伝子の転写を提供するために使用され得る。
【００６７】
細菌宿主細胞系統および発現ベクターは、特異的に誘導されない限り、プロモーターの作用を阻害するように選択され得る。特定のオペロンにおいて、特異的誘導物質の添加は、挿入されるＤＮＡの効率的な転写に必要である。例えば、ｌａｃオペロンは、ラクトースまたはＩＰＴＧ（イソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトシド）の添加により誘導される。種々の他のオペロン（例えば、ｔｒｐ、ｐｒｏなど）は、異なる制御下にある。
【００６８】
特異的開始シグナルもまた、原核生物細胞における効率的な遺伝子の転写および翻訳に必要である。これらの転写および翻訳開始シグナルは、それぞれ、遺伝子特異的メッセンジャーＲＮＡおよび合成されるタンパク質の量により測定されるように、「強さ」がさまざまであり得る。プロモーターを含むＤＮＡ発現ベクターはまた、種々の「強い」転写および／または翻訳開始シグナルの任意の組み合わせを含み得る。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉにおける効率的な翻訳は、リボソーム結合部位を提供するための開始コドン（「ＡＴＧ」）に対して５’側の約７〜９塩基のシャイン−ダルガーノ（「ＳＤ」）配列を必要とする。従って、宿主細胞リボソームにより利用され得る任意のＳＤ−ＡＴＧ組み合わせが使用され得る。このような組み合わせとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：大腸菌ファージλのｃｒｏ遺伝子もしくはＮ遺伝子からのＳＤ−ＡＴＧ組み合わせ、またはＥ．ｃｏｌｉトリプトファンＥ、Ｄ、Ｃ、ＢまたはＡ遺伝子からの組み合わせ。さらに、組換えＤＮＡまたは他の技術（合成ヌクレオチドの組み込みを含む）により生成された任意のＳＤ−ＡＴＧ組み合わせが使用され得る。
【００６９】
哺乳動物細胞はまた、本発明の第１のキメラタンパク質または第２のキメラタンパク質を組換え生成するために使用され得る。適切な哺乳動物宿主細胞としては、ＣＯＳ細胞（例えば、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１６５０または１６５１）、ＢＨＫ細胞（例えば、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ６２８１）、ＣＨＯ細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ６１）、ＨｅＬａ細胞（例えば、ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ２）、２９３細胞（ＡＴＣＣ番号１５７３）、ＣＨＯＰ細胞、およびＮＳ−１細胞が挙げられるが、これらに限定されない。哺乳動物細胞における発現を方向付けるための適切な発現ベクターは、一般に、プロモーター、ならびに当該分野で公知の他の転写制御配列および翻訳制御配列を含む。一般的なプロモーターとしては、ＳＶ４０、ＭＭＴＶ、メタロチオネイン−１、アデノウイルスＥ１ａ、ＣＭＶ、即時初期、免疫グロブリン重鎖プロモーターおよびエンハンサー、ならびにＲＳＶ−ＬＴＲが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７０】
宿主細胞の選択に拘らず、一旦、第１のキメラタンパク質または第２のキメラタンパク質をコードするＤＮＡ分子が、周知の分子クローニング技術を使用して、その適切な調節領域と連結されると、このＤＮＡ分子は、適切なベクターに導入されるかまたはそうでなければ当該分野で周知の形質転換プロトコルを使用して宿主細胞に直接導入され得る（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，第２版，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＰｒｅｓｓ，ＮＹ（１９８９）（その全体が本明細書中に参考として援用される））。
【００７１】
組換えＤＮＡ分子は、形質転換、特に形質導入、接合、動員（ｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）、またはエレクトロポレーションを介して宿主細胞に導入され得る。適切な宿主細胞としては、細菌、ウイルス、酵母、哺乳動物細胞、昆虫、植物などが挙げられるが、これらに限定されない。宿主細胞は、適切な培地中で増殖される場合、キメラタンパク質を発現し得る。次いで、このキメラタンパク質は、培地から単離され得、必要であれば、精製され得る。第１のキメラタンパク質または第２のキメラタンパク質は、好ましくは、従来の技術（免疫精製技術を含む）により精製形態（好ましくは、少なくとも約８０％純粋、より好ましくは約９０％純粋）で生成される。免疫単離、その後の金属キレートアフィニティークロマトグラフィーおよび陽イオン交換クロマトグラフィーは、以下の実施例１に記載される。
【００７２】
本発明のさらなる局面は、多くの組成物、好ましくは、薬学的組成物に関する。これらは、本発明の第１のキメラタンパク質および／または第２のキメラタンパク質を含む。
【００７３】
１つの実施形態に従って、組成物は、薬学的に受容可能なキャリアおよび本発明の第１のキメラタンパク質を含む。第１のキメラタンパク質は、好ましくは、第１のキメラタンパク質を取り込む細胞におけるアポリポタンパク質ＢｍＲＮＡの編集を改変するに有効な量で存在する。
【００７４】
第２の実施形態に従って、組成物は、本発明の第１のキメラタンパク質および第２のキメラタンパク質を含む。この組成物はまた、第１のキメラタンパク質および第２のキメラタンパク質が分散される薬学的に受容可能なキャリアを含み得る。好ましくは、この第１のキメラタンパク質は、第１のキメラタンパク質を取り込む細胞におけるアポリポタンパク質ＢｍＲＮＡの編集を改変するに有効な量で存在し、そして第２のキメラタンパク質は、第１のキメラタンパク質および第２のキメラタンパク質を取り込む細胞においてアポリポタンパク質ＢｍＲＮＡを改変する際に、アポリポタンパク質ＢｍＲＮＡに結合し第１のキメラタンパク質を補助するに有効な量で存在する。
【００７５】
本発明の組成物はまた、適切な賦形剤または安定化剤を含み得、固体形態または液体形態（例えば、錠剤、カプセル剤、散剤、溶液、懸濁液または乳濁液）にあり得る。代表的には、この組成物は、キャリア、賦形剤、安定化剤などとともに、約０．０１〜９９％、好ましくは、約２０〜７５％のキメラタンパク質を含む。
【００７６】
固体の単位投薬形態は、従来どおりの型であり得る。この固体形態は、カプセル剤（例えば、本発明の第１のキメラタンパク質および／または第２のキメラタンパク質、ならびにキャリア（例えば、滑沢剤およびラクトース、スクロースまたはコーンスターチなどのような不活性充填剤）を含む通常のゼラチン型）であり得る。別の実施形態において、これら第１のキメラタンパク質および／または第２のキメラタンパク質は、結合剤（例えば、アカシアゴム、コーンスターチまたはゼラチン）、崩壊剤（例えば、コーンスターチ、ポテトスターチ、アルギン酸）および滑沢剤（例えば、ステアリン酸またはステアリン酸マグネシウム）と組み合わせて、従来の錠剤基剤（例えば、ラクトース、スクロースまたはコーンスターチ）とともに錠剤にされ得る。
【００７７】
本発明の第１のキメラタンパク質および／または第２のキメラタンパク質はまた、薬学的キャリアとともに、生理学的に受容可能な希釈剤中のこれらの材料の溶液または懸濁液により注射可能なまたは局所的に適用可能な投薬量で投与され得る。このようなキャリアは、界面活性剤および他の薬学的かつ生理学的に受容可能なキャリア（アジュバント、賦形剤または安定化剤を含む）の添加ありまたはなしの、滅菌液体（例えば、水および油）を含む。例示的な油は、石油、動物性油、植物性油、または合成起源の油（例えば、落花生油、ダイズ油、または鉱油）である。一般に、水、生理食塩水、デキストロース水溶液および関連した糖類水溶液、およびグリコール（例えば、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコール）は、特に注射用液体に関してましい液体キャリアである。
【００７８】
エアロゾルとしての使用に関して、溶液中または懸濁液中の本発明の第１のキメラタンパク質および／または第２のキメラタンパク質は、適切な噴霧体（例えば、従来のアジュバントを含有する炭化水素噴霧体（例えば、プロパン、ブタンまたはイソブタン））とともに、加圧エアロゾル容器中に充填され得る。本発明の組成物はまた、ネブライザまたはアトマイザ中のような加圧していない形態で投与され得る。
【００７９】
達成される処置に依存して、本発明の化合物は、経口的に、局所的に、経皮的に、非経口的に、皮下に、静脈内に、筋肉内に、腹腔内に、腔内に、または嚢内注入により、眼内に、動脈内に、病巣内に、または粘膜（例えば、鼻粘膜、喉粘膜、および気管支粘膜）への適用により、投与され得る。大部分の場合、皮下経路、静脈内経路、筋肉内経路、腹腔内経路、および動脈内経路が好ましい。
【００８０】
本発明の範囲内の組成物は、本発明の第１のキメラタンパク質および／または第２のキメラタンパク質が、上記の意図された目的を達成するに有効な量で含まれる全ての組成物を含む。個々の必要性は変化するが、第１のキメラタンパク質および／または第２のキメラタンパク質の各々の有効量の至適範囲の決定は、当該分野の技術範囲内である。代表的な投薬量は、約０．０１〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重を含む。好ましい投薬量は、約０．１〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重を含む。最も好ましい投薬量は、約１〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重を含む。
【００８１】
第１のキメラタンパク質および第２のキメラタンパク質の量は、アポリポタンパク質ＢｍＲＮＡ編集の所望の程度に従って、第１のキメラタンパク質および第２のキメラタンパク質の投薬レベルを最適化するための慣用的な試験を使用して当業者により決定され得る。国立衛生研究所の国民コレステロール教育プログラム（ＮＣＥＰ）による２００１年５月のガイドラインに基づくと、心臓発作の危険性が低い個体は、１６０ｍｇ／ｄＬ未満のＬＤＬレベルを有するものとしているが、危険性が最高の個体は、１００ｍｇ／ｄＬ未満のＬＤＬを目指すものとしている。本発明の第１のキメラタンパク質および／または第２のキメラタンパク質の投与のための処置レジメンはまた、当業者により容易に決定され得る。
【００８２】
代表的には、第１のキメラタンパク質および／または第２のキメラタンパク質（あるいは本発明のキメラタンパク質の一方または両方を含む組成物）は、本発明のキメラタンパク質または組成物を含む薬物送達デバイスを介して投与され得る。例示的な送達デバイスとしては、リポソーム、ニオソーム（ｎｉｏｓｏｍｅ）、経皮パッチ、インプラント、およびシリンジが挙げられるが、これらに限定されない。
【００８３】
リポソームは、水相をカプセル化する１以上の同心円状に並んだ脂質二重層から構成されるビヒクルである。これらは、通常は、漏れやすくはないが、穴または孔が膜に生じれば、膜が溶解または分解されれば、あるいは膜温度が相転移温度に上昇すれば、漏れやすくなり得る。リポソームを介する薬物送達の現在の方法は、リポソームキャリアが、最終的には、標的部位にて透過性になり、カプセル化された薬物を放出することが必要である。このことは、例えば、リポソーム二重層が、体内の種々の因子の作用を介して経時的に分解される受動的様式にて達成され得る。あらゆるリポソーム組成物は、循環中または体内の他の部位にて特徴的な半減期を有し、従って、リポソーム組成物の半減期を制御することにより、脂質二重層が分解する速度は、いくらか制御され得る。
【００８４】
受動的薬物放出とは対照的に、能動的な薬物放出は、リポソームビヒクル中の透過性の変化を誘導する薬剤を使用することを包含する。リポソーム膜は、環境がリポソーム膜の近辺で酸性になると不安定になるように構築され得る（例えば、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８４：７８５１（１９８７）；Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２８：９０８（１９８９）（本明細書中にそれらの全体が参考として援用される）を参照のこと）。例えば、リポソームが標的細胞によるエンドサイトーシスを受けると、例えば、リポソームは、酸性エンドソーム（これは、リポソームを不安定にし、薬物放出を生じる）に送られ得る。
【００８５】
あるいは、リポソーム膜は、リポソームをゆっくりと不安定にする酵素が、膜上のコーティングとして配置されるように、化学的に修飾され得る。薬物放出の制御は、最初に膜に配置された酵素の濃度に依存するので、薬物放出を調節または変化させて、「要求に応じた」薬物送達を達成する真の効率的方法は存在しない。リポソームビヒクルが標的細胞に接触すると直ぐに飲み込まれ、ｐＨの低下が薬物放出をもたらすという点で、同じ問題がｐＨ感受性リポソームにある。
【００８６】
このリポソーム送達系はまた、能動的な標的化を介して標的の器官、組織または細胞に蓄積するように作製され得る。本発明に従って、リポソームは、肝細胞レセプターを標的化する分子をリポソーム二重層に取り込むことによって、肝臓細胞に標的化され得る。１つのこのような分子は、肝細胞のアシアロ糖タンパク質レセプターを標的化する、アシアロ糖タンパク質アシアロフェチュインである。リポソーム二重層へのアシアロフェチュインの取り込みは、Ｗｕら，「Ｉｎｃｒｅａｓｅｄｌｉｖｅｒｕｐｔａｋｅｏｆｌｉｐｏｓｏｍｅｓａｎｄｉｍｐｒｏｖｅｄｔａｒｇｅｔｉｎｇｅｆｆｉｃａｃｙｂｙｌａｂｅｌｉｎｇｗｉｔｈａｓｉａｌｏｆｅｔｕｉｎｉｎｒｏｄｅｎｔｓ」，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ２７（３）：７７２−７７８（１９９８）（これは、その全体において、本明細書中で参考として援用される）に示される手順に従って実施され得る。
【００８７】
ニオソームは、両親媒性材料によって形成される小胞である。非イオン性界面活性剤が、最初に研究された材料であった（Ｉｇａら，「Ｍｅｍｂｒａｎｅｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｂｙｎｅｇａｔｉｖｅｌｙｃｈａｒｇｅｄｓｔｅａｒｙｌｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓｆｏｒｔｈｅｒｍｏｓｅｎｓｉｔｉｖｅｌｉｐｏｓｏｍｅｓ：Ｒｅｄｕｃｅｄｌｉｐｏｓｏｍａｌａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎａｎｄａｖｏｉｄａｎｃｅｏｆｒｅｔｉｃｕｌｏｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｓｙｓｔｅｍｕｐｔａｋｅ」，Ｊ．ＤｒｕｇＴａｒｇｅｔ２：２５９−６７（１９９４）（これは、その全体において、本明細書中で参考として援用される））。そしてそれ以後、多数の界面活性剤が、密閉した二重層小胞へと自己アセンブルすることが見出されている（Ａｈｌら，「ＥｎｈａｎｃｅｍｅｎｔｏｆｔｈｅｉｎｖｉｖｏｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎｌｉｆｅｔｉｍｅｏｆＬ−ａｌｐｈａ−ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅｌｉｐｏｓｏｍｅｓ：Ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅｏｆｌｉｐｏｓｏｍａｌａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎｖｅｒｓｕｓｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔｏｐｓｏｎｉｚａｔｉｏｎ」，ＢｉｏｃｈｉｍＢｉｏｐｈｙｓＡｃｔａ１３２９：３７０−８２（１９９７）（これは、その全体において、本明細書中で参考として援用される））。これらのニオソーム材料は、第１キメラタンパク質もしくは第２キメラタンパク質の送達のために、あるいは、ＡＰＯＢＥＣ−１またはそのフラグメントの単独またはＡＣＦもしくはそのフラグメントとの組み合わせでの送達のために、使用され得る。
【００８８】
例えば、ポリオキシエチレン（分子量１，０００）表面を有する２００ｎｍのドキソルビシンニオソームは、肝臓によって迅速に取り込まれることが示されており（Ｕｃｈｅｇｂｕら，「Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ，ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍａｎｄｔｕｍｏｒｉｃｉｄａｌａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄｉｎｓｏｒｂｉｔａｎｍｏｎｏｓｔｅａｒａｔｅ（Ｓｐａｎ６０）ｎｉｏｓｏｍｅｓｉｎｔｈｅｍｏｕｓｅ」，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．１２：１０１９−２４（１９９５）（これは、その全体において、本明細書中で参考として援用される））、薬物送達のためにポリマー性薬物結合体が形成されるのを可能にしている（Ｄｕｎｃａｎ，「Ｄｒｕｇｐｏｌｙｍｅｒｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ−ｐｏｔｅｎｔｉａｌｆｏｒｉｍｐｒｏｖｅｄｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ」，Ａｎｔｉ−ＣａｎｃｅｒＤｒｕｇｓ３：１７５−２１０（１９９２）（これは、その全体において、本明細書中で参考として援用される）を参照のこと）。これらの技術は、第１キメラタンパク質および第２キメラタンパク質の送達のために、あるいは、ＡＰＯＢＥＣ−１またはそのフラグメントの単独またはＡＣＦもしくはそのフラグメントとの組み合わせでの送達のために、容易に適合され得る。
【００８９】
薬学的に受容可能なキャリア中においてこのリポソームまたはニオソームを含む組成物もまた意図される。
【００９０】
経皮送達デバイスは、ソノフォレーシス（ｓｏｎｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）と組み合わせて脂質ベースの組成物（すなわち、パッチの形態）を使用することによって、低分子量タンパク質の送達のために使用されている。しかし、Ｅｌｌｉｎｗｏｏｄ，Ｊｒ．らに対する米国特許第６，０４１，２５３号（これは、その全体において、本明細書中で参考として援用される）において報告されたように、経皮送達は、例えば、イオン導入法またはエレクトロポレーションによって電場を適用することによって、さらに増強され得る。角質層中の脂質層の空洞化を誘導する低周波超音波を使用することによって、より高い経皮フラックス、経皮フラックスの迅速な制御、およびより低い超音波強度での薬物送達が達成され得る。なおさらなる増強が、電場および超音波と共に化学的エンハンサーおよび／または磁場の組み合わせを使用して獲得され得る。
【００９１】
移植可能または注射可能なタンパク質蓄積組成物もまた使用され得、これは、例えば、第１キメラタンパク質および第２キメラタンパク質の長期間送達を提供する。例えば、Ｂｒｏｄｂｅｃｋらに対する米国特許第６，３３１，３１１号（これは、その全体において、本明細書中で参考として援用される）は、生体適合性ポリマー、このポリマーを溶解しそして粘着性のゲルを形成する溶媒、およびこの粘着性のゲル中に分散した液滴相の形態の乳化剤を含む、注射可能な蓄積ゲル組成物を報告している。注射に際して、このようなゲル組成物は、送達される薬剤の比較的持続した速度での分配を提供し得、それによって、送達される薬剤が最初に一気に流出する（ｂｕｒｓｔ）のを回避する。
【００９２】
当業者に公知である他の適切なタンパク質送達系もまた使用されて、所望の送達を達成し得、それにより、アポリポタンパク質ＢｍＲＮＡの編集における改変およびそれに付随する効果を達成し得る。
【００９３】
アポリポタンパク質ＢｍＲＮＡを編集し得る第１キメラタンパク質によって、本発明は、インビボにおけるアポリポタンパク質ＢｍＲＮＡの編集を改変する方法を提供する。本発明のこの局面は、未処理細胞（すなわち、第１キメラタンパク質を取り込まなかった細胞）と相対的な、この細胞によって分泌されるアポリポタンパク質Ｂ１００の濃度と比較して、この細胞によって分泌されるアポリポタンパク質Ｂ４８の濃度を増加させるのに有効な条件下で、本発明の第１キメラタンパク質と細胞中のアポリポタンパク質ＢｍＲＮＡとを接触させることによって実施され得る。基本的には、この接触は、第１キメラタンパク質の細胞性取り込みを誘導するに有効な条件下で、この第１キメラタンパク質に細胞を曝露することによって実施される。この第１キメラタンパク質は、第１ポリペプチドを含む（すなわち、この第１キメラタンパク質は、タンパク質形質導入ドメインを含む）ので、この第１キメラタンパク質は細胞によって取り込まれる。さらに、同じ細胞はまた、本発明の第２キメラタンパク質と接触され得、これによってこの第２キメラタンパク質もまた、細胞によって取り込ませる。結果として、細胞中のアポリポタンパク質ＢｍＲＮＡは、第２キメラタンパク質によって接触され、第１キメラタンパク質によるその編集を容易にするように、アポリポタンパク質ｍＲＮＡ（上記のような）に結合する。アポリポタンパク質ＢｍＲＮＡの編集を改変する細胞は、アポリポタンパク質Ｂまたはその誘導体を有するＶＬＤＬを合成および分泌し得る任意の細胞であり得る。この型の細胞の例としては、肝臓細胞および腸細胞が挙げられるが、好ましくは、肝臓細胞である。この細胞はまた、哺乳動物、好ましくは、ヒトの細胞であり得る。
【００９４】
同様に、本発明はまた、血清ＬＤＬレベルを低下させる方法を提供する。本発明のこの局面は、患者の１つ以上の細胞中に、アポリポタンパク質ＢをコードするｍＲＮＡを編集し得るＡＰＯＢＥＣ−１またはそのフラグメントを含む一定量のタンパク質を、その細胞を遺伝的に改変することなく送達することによって実施され得る。この量は、この１つ以上の細胞によって血清中に分泌されるＶＬＤＬ−アポリポタンパク質Ｂ４８の濃度を増加させ、その結果として、ＬＤＬの血清濃度を減少させるのに有効な量である。本発明のこの局面によれば、この患者は、哺乳動物、好ましくは、ヒトであり、そしてこの１つ以上の細胞は、好ましくは、肝臓細胞、腸細胞、またはその組み合わせである。
【００９５】
低下した血清ＬＤＬレベルを維持するために、１つ以上の細胞へのタンパク質の送達は、好ましくは、周期的に（すなわち、約１〜約７日間遅らせた後で）繰り返される。
【００９６】
１つ以上の細胞へのタンパク質の送達は、このタンパク質の細胞性取り込みを生じさせるのに有効な条件下で、この１つ以上の細胞をこのタンパク質に曝露することによって実施され得る。好ましくは、ＡＰＯＢＥＣ−１またはそのフラグメントを含むタンパク質が事実上、本発明の第１キメラタンパク質であり、そしてこのタンパク質形質導入ドメインは、１つ以上の細胞による細胞性取り込みを誘導する。タンパク質を送達することに加えて、第２タンパク質もまた、患者の１つ以上の細胞に、その細胞を遺伝的に改変することなく同時に送達され得る。ここで、この第２タンパク質は、アポリポタンパク質ＢｍＲＮＡに結合し得る、ＡＣＦまたはそのフラグメントを含む。好ましくは、この第２タンパク質は、本発明の第２キメラタンパク質であり、そしてこのタンパク質形質導入ドメインは、１つ以上の細胞による細胞性取り込みを誘導する。
【００９７】
あるいは、ＡＰＯＢＥＣ−１は、１つ以上の肝臓細胞の各々を、肝細胞レセプターに結合する分子（例えば、アシアロフェチュイン）を含むリポソームと接触させ、それにより、そのリポソームの取り込みを誘導し、そしてその内容物をその１つ以上の肝臓細胞に移すために細胞内でそのリポソームの分解を誘導することによって、１つ以上の肝臓細胞に直接的に送達され得る。さらに、アポリポタンパク質ＢｍＲＮＡに結合し得る、ＡＣＦまたはそのフラグメントもまた、リポソームを介して送達され得る。
【００９８】
１つ以上の細胞によって分泌される、アポリポタンパク質Ｂ１００に対するアポリポタンパク質Ｂ４８の割合を増加させることによって、本発明はまた、アテローム発生性の疾患または障害を処置または予防する方法に関する。本発明のこの局面は、アポリポタンパク質ＢをコードするｍＲＮＡを編集し得る、ＡＰＯＢＥＣ−１またはそのフラグメントを含む有効量のタンパク質を、患者に投与することによって実施され得る。ここでこの投与に際して、このタンパク質は、この１つ以上の細胞によって血清中に分泌されるＶＬＤＬ−アポリポタンパク質Ｂ４８の濃度を増加させるのに有効な条件下でＶＬＤＬ−アポリポタンパク質を合成および分泌し得る、患者の１つ以上の細胞によって取り込まれ、それによる血清からのＶＬＤＬ−アポリポタンパク質Ｂ４８の迅速な清澄化が、ＬＤＬの血清濃度を減少させて、アテローム発生性の疾患または障害を処置または予防する。本発明のこの局面によれば、この患者は、哺乳動物、好ましくは、ヒトであり、そしてこの１つ以上の細胞は、好ましくは、肝臓細胞である。
【００９９】
タンパク質の投与は、上記に同定された任意のアプローチに従って実施され得る。持続的な予防的処置または治療的処置は、ＡＰＯＢＥＣ−１タンパク質を周期的に（すなわち、約１〜約７日間遅らせた後で）繰り返して投与することによってもたらされ得る。
【０１００】
好ましくは、ＡＰＯＢＥＣ−１またはそのフラグメントを含むタンパク質が事実上、本発明の第１キメラタンパク質であり、そしてこのタンパク質形質導入ドメインは、１つ以上の細胞による細胞性取り込みを誘導する。上記の方法と共に、アポリポタンパク質ＢｍＲＮＡに結合し得るＡＣＦまたはそのフラグメントを含む第２タンパク質もまた、同時に送達され得る。好ましくは、この第２タンパク質は、本発明の第２キメラタンパク質であり、そしてこのタンパク質形質導入ドメインは、１つ以上の細胞による細胞性取り込みを誘導する。
【０１０１】
あるいは、リポソーム送達ビヒクルを使用して、ＡＰＯＢＥＣ−１、および必要に応じてＡＣＦは、１つ以上の肝臓細胞の各々を、肝細胞レセプターに結合する分子を含むリポソームと接触させ、それにより、そのリポソームの取り込みを誘導し、そしてその内容物をその１つ以上の肝臓細胞に移すために細胞内でそのリポソームの分解を誘導することによって、１つ以上の肝臓細胞に直接的に送達され得る。
【実施例】
【０１０２】
以下の実施例は、添付の特許請求の範囲に示される本発明の範囲を例示するために意図されるが、制限することを決して意図されない。
【０１０３】
（実施例１−ＴＡＴ融合タンパク質の生成）
肝臓アポリポタンパク質ＢｍＲＮＡの編集の誘導を、ＴＡＴによって媒介される肝臓細胞へのＡＰＯＢＥＣ−１タンパク質の形質導入を通して探求した。ＨＩＶ−１ＴＡＴタンパク質の１１アミノ酸のタンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）を、異種タンパク質に連結することによって、細胞に形質導入する能力が付与されることが示されている（Ｎａｇａｈａｒａら，「Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎｏｆｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈＴＡＴｆｕｓｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎｓｉｎｔｏｍａｍｍａｌｉａｎｃｅｌｌｓ：ＴＡＴ−Ｐ２７^Ｋｉｐ１ｉｎｄｕｃｅｓｃｅｌｌｍｉｇｒａｔｉｏｎ」，ＮａｔｕｒｅＭｅｄ．４：１４４９−１４５２（１９９８）；Ｓｃｈｗａｒｚｅら，「Ｉｎｖｉｖｏｐｒｏｔｅｉｎｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ：ｄｅｌｉｖｅｒｙｏｆａｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙａｃｔｉｖｅｐｒｏｔｅｉｎｉｎｔｏｔｈｅｍｏｕｓｅ」，Ｓｃｉｅｎｃｅ２８５：１５６９−１５７２（１９９９）；Ｖｏｃｅｒｏ−Ａｋｂａｎｉら，「ＫｉｌｌｉｎｇＨＩＶ−ｉｎｆｅｃｔｅｄｃｅｌｌｓｂｙｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎｗｉｔｈａｎＨＩＶｐｒｏｔｅａｓｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄｃａｓｐａｓｅ−３ｐｒｏｔｅｉｎ」，ＮａｔｕｒｅＭｅｄ．５：２９−３３（１９９９）（これらの各々は、その全体において、本明細書中で参考として援用される））。ＰＴＤに連結されたタンパク質は、約１００％の細胞に形質導入し、そしてこの形質導入プロセスは、迅速に、そしてレセプターおよび輸送体とは独立した様式であるが濃度依存的な様式で生じた（Ｓｃｈｗａｒｚｅら，「Ｐｒｏｔｅｉｎｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ：ｕｎｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄｄｅｌｉｖｅｒｙｉｎｔｏａｌｌｃｅｌｌｓ」，ＴｒｅｎｄｓＣｅｌｌＢｉｏｌ．１０：２９０−２９５（２０００）（これは、その全体において、本明細書中で参考として援用される））。肝臓細胞は、形質導入に対して感受性であることが示された（Ｎａｇａｈａｒａら，「Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎｏｆｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈＴＡＴｆｕｓｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎｓｉｎｔｏｍａｍｍａｌｉａｎｃｅｌｌｓ：ＴＡＴ−Ｐ２７^Ｋｉｐ１ｉｎｄｕｃｅｓｃｅｌｌｍｉｇｒａｔｉｏｎ」，ＮａｔｕｒｅＭｅｄ．４：１４４９−１４５２（１９９８）（これは、その全体において、本明細書中で参考として援用される））。Ｅ．ｃｏｌｉからインフレームでＴＡＴ融合タンパク質を生成するために、ドメインの自由な結合回転のためのグリシン残基に隣接したＮ末端ＰＴＤ（Ｓｃｈｗａｒｚｅら，「Ｉｎｖｉｖｏｐｒｏｔｅｉｎｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ：ｄｅｌｉｖｅｒｙｏｆａｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙａｃｔｉｖｅｐｒｏｔｅｉｎｉｎｔｏｔｈｅｍｏｕｓｅ」，Ｓｃｉｅｎｃｅ２８５：１５６９−１５７２（１９９９）（これは、その全体において、本明細書中で参考として援用される））、血球凝集素（ＨＡ）タグ、およびＣ末端６−ヒスチジンタグを有する、原核生物発現ベクターを構築した。バックボーンとしてこのベクターを使用して、全長のＴＡＴ−ｒＡＰＯＢＥＣ−ＣＭＰＫタンパク質（配列番号４）をコードするようにプラスミドを構築した（図２Ａ、２Ｄおよび５Ａ）。ＣＭＰＫに結合体化されたＡＰＯＢＥＣ−１を、この研究において使用した。なぜなら、これは、インビトロにおいて頑健性（ｒｏｂｕｓｔ）の低い編集活性を示し、そして主に細胞質ｍＲＮＡを標的化したからである（Ｙａｎｇら，「ＩｎｄｕｃｔｉｏｎｏｆｃｙｔｉｄｉｎｅｔｏｕｒｉｄｉｎｅｅｄｉｔｉｎｇｏｎｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎＢｍＲＮＡｂｙｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇＡＰＯＢＥＣ−１」，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：２２６６３−２２６６９（２０００）（これは、その全体において、本明細書中で参考として援用される））。インビトロ研究によって、ＡＰＯＢＥＣ−１は、種々の長さの非特異的タンパク質に結合体化された場合に触媒活性を維持することが実証されている（Ｓｉｄｄｉｑｕｉら，「ＤｉｓｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎａｔｅｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｂｅｔｗｅｅｎＡＰＯＢＥＣ−１ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄａｐｏＢｍＲＮＡｅｄｉｔｉｎｇａｃｔｉｖｉｔｙ」，Ｅｘｐ．ＣｅｌｌＲｅｓ．２５２：１５４−１６４（１９９９）；Ｙａｎｇら，「ＩｎｄｕｃｔｉｏｎｏｆｃｙｔｉｄｉｎｅｔｏｕｒｉｄｉｎｅｅｄｉｔｉｎｇｏｎｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎＢｍＲＮＡｂｙｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇＡＰＯＢＥＣ−１」，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：２２６６３−２２６６９（２０００）（これらの各々は、その全体において、本明細書中で参考として援用される））。
【０１０４】
グリシン残基に隣接する９−アミノ酸ＴＡＴドメインをコードする二重鎖オリゴマーヌクレオチド（以下に示されるセンス鎖、配列番号２５）
【０１０５】
【数１】

およびＨＡ−ｒＡＰＯＢＥＣ−ＣＭＰＫ（以下に示されるような配列番号２６）
【０１０６】
【数２】

またはＨＡ−ＣＭＰＫ（以下に示すような配列番号２７）
【０１０７】
【数３】

をコードするＰＣＲ産物（Ｙａｎｇら、「ＩｎｄｕｃｔｉｏｎｏｆｃｙｔｉｄｉｎｅｔｏｕｒｉｄｉｎｅｅｄｉｔｉｎｇｏｎｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎＢｍＲＮＡｂｙｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇＡＰＯＢＥＣ−１」Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：２２６６３−２２６６９（２０００）（これは、その全体において参考として本明細書中で援用される）が、ＮｄｅＩ／ＸｈｏＩ消化されたｐＰＲＯＥＸベクター（Ｌｉｆｅ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、Ｍａｒｙｌａｎｄ）に挿入された。この構築物全体（ＴＡＴ−ｒＡＰＯＢＥＣ−ＣＭＰＫ（配列番号３）またはＴＡＴ−ＣＭＰＫ（以下に示すような配列番号２８））
【０１０８】
【数４】

は、Ｃ末端Ｈｉｓ_６タグを利用するためにｐＥＴ−２４ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）ベクターに挿入された。ＴＡＴ融合タンパク質（配列番号２８の発現産物であるＴＡＴ−ＣＭＰＫ、および配列番号４のＴＡＴ−ｒＡＰＯＢＥＣ−ＣＭＰＫと呼ばれる）は、ＢＬ−２１（ＤＥ３）コドンおよび細胞から精製された（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ＬａＪｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）。２つから４つの１リットルの培地に１０ｍｌの一晩培養物をそれぞれ接種し、そして０．１ｍＭのＩＰＴＧによって３０℃で１時間誘導した。可溶性タンパク質を２５ｍｌの緩衝液Ａ（８Ｍ尿素、１０ｍＭＴｒｉｓｐＨ８、１００ｍＭＮａＨ_２ＰＯ_４）中でのフレンチプレスによって得た。細胞溶解物を遠心分離によって清澄にし、１０〜２０ｍＭのイミダゾールを含む緩衝液Ａ中の５ｍｌＮｉ−ＮＴＡカラム（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）にロ充填し、洗浄し、そして緩衝液Ａ中のイミダゾールで「段階的に」（１００ｍＭ、１７５ｍＭおよび２５０ｍＭ）溶出し、そしてＨｉＴｒａｐＳＰカラム（ＡｍｅｒｓｈａｍＰｈａｒｍａｃｉａ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮｅｗＪｅｒｓｅｙ）に充填した。このカラムを洗浄し、そして緩衝液Ａ中の１ＭＮａＣｌによって溶出した。尿素および高塩（ｈｉｇｈｓａｌｔ）を緩衝液Ｂ（３０ｍＭＴｒｉｓｐＨ８．５、５０ｍＭＮａＣｌ、１０μＭ酢酸亜鉛、５％グリセロール）に対する急速な透析によって関連する画分から除去した。この溶出プロフィールをＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。ゲルを製造者の勧めによって銀で染色した（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）。
【０１０９】
組換えタンパク質を細菌細胞から８Ｍの尿素緩衝液に溶解し、それによって封入体からの収率を最大にした。以前の研究は、変性タンパク質が、天然のタンパク質と同様に形質転換し得ることを示している（Ｓｃｈｗａｒｚｅら、「Ｉｎｖｉｖｏｐｒｏｔｅｉｎｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ：ｄｅｌｉｖｅｒｙｏｆａｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙａｃｔｉｖｅｐｒｏｔｅｉｎｉｎｔｏｔｈｅｍｏｕｓｅ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ２８５：１５６９−１５７２（１９９９）（これは、その全体において、本明細書中で参考として援用される））。このタンパク質を、金属キレートアフィニティークロマトグラフィー、続く陽イオン交換クロマトグラフィーによって精製した。尿素を急速な透析によって除去し、全長８６ｋＤａＴＡＴ−ｒＡＰＯＢＥＣ−ＣＭＰＫ（配列番号４）の純度は、銀染色によって示されるように明らかである（図５Ｂ）。この全長タンパク質の精製をまた、抗−Ｈｉｓ_６抗体を用いるウエスタンブロットによって確認した。
【０１１０】
（実施例２）ＴＡＴ−ｒＡＰＯＢＥＣ−ＣＭＰＫのＭｃＡｒｄｌｅ細胞へのインビトロでの導入
ＴＡＴ−ｒＡＰＯＢＥＣ−ＣＭＰＫ（配列番号４）の、ＭｃＡｒｄｌｅ細胞への取りこみをＨＡエピトープとの抗体反応および蛍光顕微鏡を使用して調べた。
【０１１１】
ＭｃＡｒｄｌｅＲＨ７７７７細胞をＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖｉｒｇｉｎｉａ）から入手し、そして以前に記載されたように培養した（Ｙａｎｇら、「ＰａｒｔｉａｌｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｔｈｅａｕｘｉｌｉａｒｙｆａｃｔｏｒｓｉｎｖｏｌｖｅｄｉｎａｐｏＢｍＲＮＡｅｄｉｔｉｎｇｔｈｒｏｕｇｈＡＰＯＢＥＣ−１ａｆｆｉｎｉｔｙｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ」Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：２７７００−２７７０６（１９９７）（これは、その全体において本明細書中で参考として援用される））。６ウエルのクラスタープレート上で増殖させたＭｃＡｒｄｌｅ細胞を、ＴＡＴ−ｒＡＰＯＢＥＣ−ＣＭＰＫまたはＴＡＴ−ＣＭＰＫのいずれかによって示された時間、処理した。次いで、細胞をＰＢＳで広範に洗浄し、続いて２％のパラホルムアルデヒドで固定し、０．４％のＴｒｉｔｏｎＸ１００で透過化処理し、１％のＢＳＡでブロキングし、そして親和性精製した抗−ＨＡ（Ｂａｂｃｏ、Ｂｅｒｋｅｌｅｙ、ＣＡ）およびヤギ抗−マウス２次抗体と結合体化された親和性精製したＦＩＴＣ（ＯｒｇａｎｏｎＴｅｋｎｉｋａ、ＷｅｓｔＣｈｅｓｔｅｒ、ＰＡ）をそれぞれ１：１０００の希釈で反応させた。蛍光を観察し、そして電子画像を倒立蛍光Ｏｌｙｍｐｕｓ顕微鏡に取りこんだ。
【０１１２】
組換えＡＰＯＢＥＣ−１は、凝集する傾向、ＴＡＴ−ｒＡＰＯＢＥＣ−ＣＭＰＫ中で持続する特性を有し、培地へのタンパク質の添加後、１時間、細胞の表面に接着するＨＡ抗体反応性物質の凝集として識別できる（図６Ａ〜Ｂ）。凝集は、培地へのその添加後１時間、ＭｃＡｒｄｌｅ細胞の表面に接着するスペックルのアレイとして現れる、より高いモル濃度におけるコントロールタンパク質（ＴＡＴ−ＣＭＰＫ）としてのＴＡＴモチーフまたはＣＭＰＫの特性ではなかった（図７ＡおよびＢ）。
【０１１３】
処理後６時間以内に、ＴＡＴ−ｒＡＰＯＢＥＣ−ＣＭＰＫ（図６Ｃ〜Ｄ）およびＴＡＴ−ＣＭＰＫ（図７Ｃ〜Ｄ）の両方が細胞内に現れ、そしてその細胞表面に接着した凝集体がより分散するようであった。処理の２４時間後、ＴＡＴ−ｒＡＰＯＢＥＣ−ＣＭＰＫで処理した多くの細胞は、明るい核周辺の蛍光を示し、また、核および細胞質全体にわたって低い蛍光強度も示した（図６Ｅ〜Ｆ）。ＴＡＴ−ＣＮＰＫで２４時間処理した細胞は、細胞質内に明るい蛍光スペックル、およびよりかすかな同種の核蛍光を示した（図７Ｅ〜Ｆ）。この組換えタンパク質の核分布は、ＡＰＯＢＥＣ−１単独では機能ＮＬＳを有さないように（Ｙａｎｇら、「Ｍｕｌｔｉｐｌｅｐｒｏｔｅｉｎｄｏｍａｉｎｓｄｅｔｅｒｍｉｎｅｔｈｅｃｅｌｌｔｙｐｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃｎｕｃｌｅａｒｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｏｆｔｈｅｃａｔａｌｙｔｉｃｓｕｂｕｎｉｔｒｅｑｕｉｒｅｄｆｏｒａｐｏＢｍＲＮＡｅｄｉｔｉｎｇ」Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９４：１３０７５−１３０８０（１９９７）（これは、その全体が本明細書中で参考として援用される））包埋されたＴＡＴ配列中の核局在化シグナル（ＮＬＳ）によって促進され得（Ｓｃｈｗａｒｚｅら、「Ｉｎｖｉｖｏｐｒｏｔｅｉｎｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ：ｄｅｌｉｖｅｒｙｏｆａｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙａｃｔｉｖｅｐｒｏｔｅｉｎｉｎｔｏｔｈｅｍｏｕｓｅ」Ｓｃｉｅｎｃｅ２８５：１５６９−１５７２（１９９９）（これは、その全体が参考として本明細書中で援用される）そして６Ｈｉｓ−ＨＡ−ＡＰＯＢＥＣ−ＣＭＰＫが、核から排除された（Ｙａｎｇら、「ＩｎｄｕｃｔｉｏｎｏｆｃｙｔｉｄｉｎｅｔｏｕｒｉｄｉｎｅｅｄｉｔｉｎｇｏｎｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎＢｍＲＮＡｂｙｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇＡＰＯＢＥＣ−１」Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：２２６６３−２２６６９（２０００）（これは、その全体が、本明細書中で参考として援用される））。このデータは、ＴＡＴ−ｒＡＰＯＢＥＣ−ＣＭＰＫおよびＴＡＴ−ＣＭＰＫの両方が、ＭｃＡｒｄｌｅ細胞に取りこまれることを示唆した。比較すると、ＴＡＴ−ｒＡＰＯＢＥＣ−ＣＭＰＫの取り込みは、ＴＡＴ−ＣＭＰＫの取り込みよりも乏しく、そして細胞内のこれらのタンパク質の分布は、異なるようである。
【０１１４】
（実施例３）ＴＡＴ−ｒＡＰＯＢＥＣ−ＣＭＰＫ形質転換されたＭｃＡｒｄｌｅ細胞におけるアポリポタンパク質ＢｍＲＮＡ編集の測定
実施例２に示したように、ＴＡＴ−ＣＭＰＫが、ＭｃＡｒｄｌｅ細胞に入る場合、これがアポリポタンパク質ＢｍＲＮＡ編集活性に影響を及ぼすか否かを評価した（図８）。細胞を、示された量のＴＡＴ−ＣＭＰＫで処理し（図７と同じタンパク質調製物を使用して）そして総細胞ＲＮＡを２４時間後に単離し、編集されたアポリポタンパク質ＢｍＲＮＡの比率を測定した。
【０１１５】
総細胞ＲＮＡを、Ｔｒｉ−Ｒｅａｇｅｎｔ（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＲｅｓｅａｒｃｈＣｅｎｔｅｒ，Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ，Ｏｈｉｏ）によって製造者の勧めに従って細胞から単離した。精製されたＲＮＡをＲＱ−ＤＮａｓｅＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）および標的基質のＰＣＲアニーリング部位間に認識部位を持つＲｓａＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ）制限酵素で消化し、混入するゲノムＤＮＡの除去を確実にした。
【０１１６】
編集活性を、以前に記載された逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）方法論（Ｓｍｉｔｈら、「ＩｎｖｉｔｒｏａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎＢｍＲＮＡｅｄｉｔｉｎｇ：Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆａ２７Ｓｅｄｉｔｉｎｇｃｏｍｐｌｅｘ」Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８８：１４８９−１４９３（１９９１）（これは、その全体において、本明細書中で参考として援用される））によって決定した。第一のｃＤＮＡ鎖をオリゴｄＴで初回刺激した総細胞ＲＮＡを使用して作製した。編集部位を包囲するラットアポリポタンパク質Ｂ配列の特異的ＰＣＲ増幅を、以下にしめすようなＮＤ１／ＮＤ２プライマー対を用いて達成した。
【０１１７】
【数５】

ＰＣＲ産物をゲル単離し、そして編集有効性を、以下：
【０１１８】
【数６】

に示すような^３２ＰＡＴＰ（ＮＥＮ、Ｂｏｓｔｏｎ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）末端標識されたＤＤ３プライマー（配列番号３１）を使用する毒入りのプライマー伸長アッセイによって、高濃度のジデオキシＧＴＰ下で以前に記載されたように決定した（Ｓｍｉｔｈら「ＩｎｖｉｔｒｏａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎＢｍＲＮＡｅｄｉｔｉｎｇ：Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆａ２７Ｓｅｄｉｔｉｎｇｃｏｍｐｌｅｘ」Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８８：１４８９−１４９３（１９９１）；Ｓｏｗｄｅｎら「ＯｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＡＰＯＢＥＣ−１ｒｅｓｕｌｔｓｉｎｍｏｏｒｉｎｇ−ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｐｒｏｍｉｓｃｕｏｕｓＲＮＡｅｄｉｔｉｎｇ」Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：３０１１−３０１７（１９９６）（これらの各々は、その全体において本明細書中で参考として援用される））。プライマー伸長産物を、１０％の変性ポリアクリルアミドゲルで分離し、オートラジオグラフにかけ、次いでレーザー濃度測定走査（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｙｎａｍｉｃｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）によって数量化した。編集パーセントは、ＵＡＡ（編集された）バンド中の数をＵＡＡバンド中の数とＣＡＡ（未編集）バンド中の数との合計で割り、１００をかけることで計算した。
【０１１９】
未処理の細胞（図９参照）に関連するアポリポタンパク質ＢｍＲＮＡの編集パーセントにおける変化は、４５〜１１２５ｎＭ（培地１ｍｌあたり５μｇ〜１３３μｇタンパク質）の濃度範囲のＴＡＴ−ＣＭＰＫでは観察されなかった（図８）。
【０１２０】
対照的に、編集活性は、３６０ｎＭ（培地１ｍｌあたり６２μｇのタンパク質のＴＡＴ−ｒＡＰＯＢＥＣ−ＣＭＰＫ）を有するＭｃＡｒｄｌｅ細胞において、６時間後に増加し、そして２４時間までコントロール細胞において観察された編集レベルの３倍より大きい増加ピークを持続した（図９）。編集された残存ＲＮＡの比率は、処理後４８時間まで上昇し（図９）、そして７２時間までにベースラインに達した。酵素活性は、細胞内の形質転換されたタンパク質の出現より遅れ、これはおそらく形質転換されたタンパク質の遅い再折りたたみに起因することが報告されている（Ｓｃｈｗａｒｚｅら、「Ｉｎｖｉｖｏｐｒｏｔｅｉｎｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ：ｄｅｌｉｖｅｒｙｏｆａｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙａｃｔｉｖｅｐｒｏｔｅｉｎｉｎｔｏｔｈｅｍｏｕｓｅ」Ｓｃｉｅｎｃｅ２８５：１５６９−１５７２（１９９９）（これは、その全体において参考として本明細書中で援用される））。ひとまとめにして考えると、この結果は、ＴＡＴ−ｒＡＰＯＢＥＣ−ＣＭＰＫがＭｃＡｒｄｌｅ細胞を形質転換し、最初の６時間にわたって酵素的に活性な立体配置に再折りたたみされ、次いでアポリポタンパク質ＢｍＲＮＡを編集することを示した。４８時間後の編集されたアポリポタンパク質ＢｍＲＮＡの比率の減少は、酵素の不活性およびアポリポタンパク質ＢｍＲＮＡの代謝回転に起因するようである。この特徴は、それが、タンパク質形質転換系の一過性で可逆的な性質を示すため、重要であった。
【０１２１】
（実施例４−ＴＡＴ−ｒＡＰＯＢＥＣ−ＣＭＰＫの初代肝細胞へのインビトロ導入）
ＭｃＡｒｄｌｅ細胞を使用して取得した結果が、初代肝細胞に適用可能であるか否かを決定するために、培養したラット初代肝細胞を調製し、次いで、ＴＡＴ−ｒＡＰＯＢＥＣ−ＣＭＰＫで処理した。ラット初代肝細胞を、以前に記載されたように（ＶａｎＭａｔｅｒら、「ＥｔｈａｎｏｌｉｎｃｒｅａｓｅｓａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎＢｍＲＮＡｅｄｉｔｉｎｇｉｎｒａｔｐｒｉｍａｒｙｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓａｎｄＭｃＡｒｄｌｅｃｅｌｌｓ」Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．２５２：３３４−３３９（１９９８）（本明細書中でその全体が参考として援用される））、非絶食の雄性Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（固形試料を自由に摂食させた正常ラット）（２５０ｇ〜２７５ｇ体重、ＴａｃｏｎｉｃＦａｒｍ）から調製した。組換えＴＡＴ融合タンパク質を、透析後、細胞培養培地に直接添加した。
【０１２２】
初代ラット肝細胞中の編集効率は、培養における７２時間後の増殖の結果として減少することが示された（ＶａｎＭａｔｅｒら、「ＥｔｈａｎｏｌｉｎｃｒｅａｓｅｓａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎＢｍＲＮＡｅｄｉｔｉｎｇｉｎｒａｔｐｒｉｍａｒｙｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓａｎｄＭｃＡｒｄｌｅｃｅｌｌｓ」Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．２５２：３３４−３３９（１９９８）（本明細書中でその全体が参考として援用される））。ＴＡＴ−ｒＡＰＯＢＥＣ−ＣＭＰＫが、ＭｃＡｒｄｌｅ細胞における処理の２４時間後、編集を最大限に増加させるという事実と一緒にすると、決定を、研究速度論ではなく、定期間の用量応答を評価するためにした。初代肝細胞を、示された量のＴＡＴ−ｒＡＰＯＢＥＣ−ＣＭＰＫで処理し、そして、その２４時間後、編集されたアポリポタンパク質ＢｍＲＮＡについて分析した。アポリポタンパク質ＢｍＲＮＡの分析を、上記の実施例３中の記載のように実施した。
【０１２３】
肝細胞の編集活性は、緩衝液のみで処理した細胞（図１０）またはＴＡＴ−ＣＭＰＫで処理した細胞（図８）に対して細胞培養培地に添加したＴＡＴ−ｒＡＰＯＢＥＣ−ＣＭＰＫの量に比例して増加した。初代肝細胞を、ＭｃＡｒｄｌｅ細胞と同じ数の細胞数で播種する場合、図９と図１０のデータの比較は、ＴＡＴ−ｒＡＰＯＢＥＣ−ＣＭＰＫが、初代細胞培養物において編集活性を誘導する際に、より効率的であることを示唆した。これは、組換えタンパク質および初代細胞のいくつかの調製についてあてはまり、ゆえに、差異は、初代肝細胞が、ＭｃＡｒｄｌｅ細胞よりも高いベースライン編集を有する（４８％対７％）という事実に起因し得、そして／またはより補助的な因子で「プライム」され得る。
【０１２４】
トランスフェクトされた細胞のラットアポリポタンパク質ＢｍＲＮＡ中のさらなるシチジンの乱交雑な編集（Ｓｏｗｄｅｎら、「ＯｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＡＰＯＢＥＣ−１ｒｅｓｕｌｔｓｉｎｍｏｏｒｉｎｇ−ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｐｒｏｍｉｓｃｕｏｕｓＲＮＡｅｄｉｔｉｎｇ」Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：３０１１−３０１７（１９９６）；Ｙａｍａｎａｋａら、「ＨｙｐｅｒｅｄｉｔｉｎｇｏｆｍｕｌｔｉｐｌｅｃｙｔｉｄｉｎｅｓｏｆａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎＢｍＲＮＡｂｙＡＰＯＢＥＣ−１ｒｅｑｕｉｒｅｓａｕｘｉｌｉａｒｙｐｒｏｔｅｉｎ（ｓ）ｂｕｔｎｏｔａｍｏｏｒｉｎｇｓｅｑｕｅｎｃｅｍｏｔｉｆ」Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：１１５０６−１１５１０（１９９６）；Ｓｏｗｄｅｎら、「ＡｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎＢＲＮＡＳｅｑｕｅｎｃｅ３’ｏｆｔｈｅｍｏｏｒｉｎｇｓｅｑｕｅｎｃｅａｎｄｃｅｌｌｕｌａｒｓｏｕｒｃｅｓｏｆａｕｘｉｌｉａｒｙｆａｃｔｏｒｓｄｅｔｅｒｍｉｎｅｔｈｅｌｏｃａｔｉｏｎａｎｄｅｘｔｅｎｔｏｆｐｒｏｍｉｓｃｕｏｕｓｅｄｉｔｉｎｇ」ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．２６：１６４４−１６５２（１９９８）（各々が、その全体が本明細書中に参考として援用される））、または、トランスジェニックマウスおよびトランスジェニックウサギ中の他のｍＲＮＡの過剰編集（Ｙａｍａｎａｋａら、「ＨｙｐｅｒｅｄｉｔｉｎｇｏｆｍｕｌｔｉｐｌｅｃｙｔｉｄｉｎｅｓｏｆａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎＢｍＲＮＡｂｙＡＰＯＢＥＣ−１ｒｅｑｕｉｒｅｓａｕｘｉｌｉａｒｙｐｒｏｔｅｉｎ（ｓ）ｂｕｔｎｏｔａｍｏｏｒｉｎｇｓｅｑｕｅｎｃｅｍｏｔｉｆ」Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：１１５０６−１１５１０（１９９６）；Ｙａｍａｎａｋａら、「ＡｎｏｖｅｌｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌｒｅｐｒｅｓｓｏｒｍＲＮＡｉｓｅｄｉｔｅｄｅｘｔｅｎｓｉｖｅｌｙｉｎｌｉｖｅｒｓｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｔｕｍｏｒｓｃａｕｓｅｄｂｙｔｈｅｔｒａｎｓｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｔｈｅａｐｏＢｍＲＮＡｅｄｉｔｉｎｇｅｎｚｙｍｅ」Ｇｅｎｅｓ＆Ｄｅｖ．１１：３２１−３３３（１９９７）（各々が、その全体が本明細書中に参考として援用される））は、非常に高レベルのＡＰＯＢＥＣ−１発現に応答して観察された。野生型編集部位（Ｃ６６６６）のシチジン５’の編集は、ラット細胞における編集部位フィデリティーの損失についての指標であり、そして、これを使用して、ＡＰＯＢＥＣ−１発現の変化に対する乱交雑な編集の誘導をモニターし得た（Ｓｏｗｄｅｎら、「ＡｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎＢＲＮＡＳｅｑｕｅｎｃｅ３’ｏｆｔｈｅｍｏｏｒｉｎｇｓｅｑｕｅｎｃｅａｎｄｃｅｌｌｕｌａｒｓｏｕｒｃｅｓｏｆａｕｘｉｌｉａｒｙｆａｃｔｏｒｓｄｅｔｅｒｍｉｎｅｔｈｅｌｏｃａｔｉｏｎａｎｄｅｘｔｅｎｔｏｆｐｒｏｍｉｓｃｕｏｕｓｅｄｉｔｉｎｇ」ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．２６：１６４４−１６５２（１９９８）；Ｓｉｄｄｉｑｕｉら、「ＤｉｓｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎａｔｅｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｂｅｔｗｅｅｎＡＰＯＢＥＣ−１ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄａｐｏＢｍＲＮＡｅｄｉｔｉｎｇａｃｔｉｖｉｔｙ」Ｅｘｐ．ＣｅｌｌＲｅｓ．２５２：１５４−１６４（１９９９）（各々が、その全体が本明細書中に参考として援用される））。アポリポタンパク質ＢｍＲＮＡ中のシチジン３’Ｃ６６６６の乱交雑な編集は、ラット細胞において有意な範囲で生じず、そして、アポリポタンパク質Ｂ以外のｍＲＮＡの過剰編集は、ラット細胞中のＡＰＯＢＥＣ−１過剰発現の特徴ではなかった（Ｓｏｗｄｅｎら、「ＡｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎＢＲＮＡＳｅｑｕｅｎｃｅ３’ｏｆｔｈｅｍｏｏｒｉｎｇｓｅｑｕｅｎｃｅａｎｄｃｅｌｌｕｌａｒｓｏｕｒｃｅｓｏｆａｕｘｉｌｉａｒｙｆａｃｔｏｒｓｄｅｔｅｒｍｉｎｅｔｈｅｌｏｃａｔｉｏｎａｎｄｅｘｔｅｎｔｏｆｐｒｏｍｉｓｃｕｏｕｓｅｄｉｔｉｎｇ」ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＲｅｓ．２６：１６４４−１６５２（１９９８）（その全体が本明細書中に参考として援用される））。
【０１２５】
処理された初代肝細胞における高レベルの編集活性にもかかわらず、乱交雑な編集（ＵＡＡ上流のさらなるプライマー伸長産物として明白である）（Ｓｏｗｄｅｎら、「ＤｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓｉｎｖｏｌｖｅｄｉｎｒｅｇｕｌａｔｉｎｇｔｈｅｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎｏｆｅｄｉｔｅｄａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎＢＲＮＡｓ」ＲＮＡ２：２７４−２８８（１９９６）；Ｓｏｗｄｅｎら、「ＡｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎＢＲＮＡＳｅｑｕｅｎｃｅ３’ｏｆｔｈｅｍｏｏｒｉｎｇｓｅｑｕｅｎｃｅａｎｄｃｅｌｌｕｌａｒｓｏｕｒｃｅｓｏｆａｕｘｉｌｉａｒｙｆａｃｔｏｒｓｄｅｔｅｒｍｉｎｅｔｈｅｌｏｃａｔｉｏｎａｎｄｅｘｔｅｎｔｏｆｐｒｏｍｉｓｃｕｏｕｓｅｄｉｔｉｎｇ」ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＲｅｓ．２６：１６４４−１６５２（１９９８）（各々が、その全体が本明細書中に参考として援用される））は、観察されなかった（図１０）。乱交雑な編集に対する本発明者らの検出限界が０．３％である場合（Ｓｏｗｄｅｎら、「ＤｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓｉｎｖｏｌｖｅｄｉｎｒｅｇｕｌａｔｉｎｇｔｈｅｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎｏｆｅｄｉｔｅｄａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎＢＲＮＡｓ」ＲＮＡ２：２７４−２８８（１９９６）（その全体が本明細書中に参考として援用される））、このデータは、ＴＡＴ−ｒＡＰＯＢＥＣ−ＣＭＰＫを使用して、反応のフィデリティーの有意な損失なしに、アポリポタンパク質ＢｍＲＮＡの部位特異的な編集を実質的に増大させ得るということを示唆した。
【０１２６】
（実施例５−形質転換された初代肝細胞による分泌されたリポタンパク質産物の分析）
本方法の効力をさらに確認するために、分泌されたアポリポタンパク質Ｂタンパク質を、ＴＡＴ−ｒＡＰＯＢＥＣ−ＣＭＰＫ処理後、［^３５Ｓ］−メチオニンおよび［^３５Ｓ］−システインで長期的に代謝的標識化された初代ラット肝細胞において、評価した。
【０１２７】
Ｗａｙｍｏｕｔｈの７５２／１培地（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）中で１２時間〜１８時間増殖したラット初代肝細胞を、ＴＡＴ−ｒＡＰＯＢＥＣ−ＣＭＰＫで１１時間処理し、次いで、０．２％（ｗ／ｖ）のＢＳＡ、０．１ｎＭのインスリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンおよび５０μｇ／ｍｌのゲンタマイシンを含む、ＤＭＥＭ欠乏培地（メチオニン、システインおよびＬ−グルタミンを含まない）（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）中で１時間インキュベートした。この培地を、ＥＸＰＲＥ^３５Ｓ^３５Ｓタンパク質標識ミックス（ｐｒｏｔｅｉｎｌａｂｅｌｉｎｇｍｉｘ）（ＮＥＮ，Ｂｏｓｔｏｎ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を使用して、０．７μＣｉ／ｍｌＬ−［^３５Ｓ］−メチオニンおよびＬ−［^３５Ｓ］−システインを含む新たな標識培地と交換した。細胞を、この標識培地中で、３０分間インキュベートした。非放射性のシステインおよび非放射性のメチオニンを有するＷａｙｍｏｕｔｈの培地の１体積を、細胞に添加し、そして、標識化をさらに１２時間続け、この後、細胞培養培地を、分泌されたアポリポタンパク質ＢおよびＲＮＡの単離および分析のために収集した（ＲＮＡ分析は、上記の実施例３中のように実施した）。
【０１２８】
細胞培養培地からのアポリポタンパク質Ｂの免疫沈降を、以前に記載したように実施した（Ｓｐａｒｋｓら、「Ｉｎｓｕｌｉｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｏｆａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎＢｓｅｃｒｅｔｉｏｎｒｅｑｕｉｒｅｓａｎｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇｅｖｅｎｔａｎｄｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ３−ｋｉｎａｓｅａｃｔｉｖａｔｉｏｎ：ｓｕｔｕｄｉｅｓｗｉｔｈｂｒｅｆｅｌｄｉｎＡａｎｄｗｏｒｔｍａｎｎｉｎｉｎｐｒｉｍａｒｙｃｕｌｔｕｒｅｓｏｆｒａｔｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ」Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３１３：５６７−５７４（１９９６）（その全体が本明細書中に参考として援用される））。ラットアポリポタンパク質Ｂに対して惹起され、そして、アポリポタンパク質Ｂ１００およびアポリポタンパク質Ｂ４８のＮ末端と反応性である、ウサギポリクローナル抗体（Ｄｒｓ．Ｊ．Ｄ．ＳｐａｒｋｓおよびＣ．Ｅ．Ｓｐａｒｋｓ，ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＲｏｃｈｅｓｔｅｒから得た）を使用して、アポリポタンパク質Ｂを沈降させた。この免疫沈降物を、５％ゲルのＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した。このゲルを乾燥させ、そして、フィルムに曝露し、１２時間の標識期間の間に、分泌されたアポリポタンパク質Ｂ４８およびアポリポタンパク質Ｂ１００を表すリポタンパク質プロフィールを含む、分泌されたアポリポタンパク質Ｂを明らかにした。
【０１２９】
分泌された［^３５Ｓ］標識化アポリポタンパク質Ｂリポタンパク質を、１２時間細胞に曝露した細胞培養培地から単離し、次いで、免疫沈降し、そして、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分離の後オートラジオグラフィーにより分析した。ゲル上のシグナルは、アポリポタンパク質Ｂ１００およびアポリポタンパク質Ｂ４８中のシステイン残基およびメチオニン残基の数に直接比例した。アポリポタンパク質Ｂ４８は、アポリポタンパク質Ｂ１００のＮ末端の４８％なので、より強度なシグナルが、コントロール細胞におけるアポリポタンパク質Ｂ１００から予想された。しかし、ＴＡＴ−ｒＡＰＯＢＥＣ−ＣＭＰＫ処理に起因して、編集有効性は、９０％に達したので、増大量のアポリポタンパク質Ｂ４８が分泌され、そして、アポリポタンパク質Ｂ１００はほぼ検出不可能となった（図１１）。従って、正確に制御された肝臓性アポリポタンパク質ＢｍＲＮＡ編集を介するアテローム発生の危険因子に関連するアポリポタンパク質Ｂ１００の低下は、ＴＡＴ−ｒＡＰＯＢＥＣ−ＣＭＰＫを用いたタンパク質シ形質導入によって達成可能であった。
【０１３０】
（実施例１〜実施例５の考察）
本発明は、標的（例えば、肝）細胞へのタンパク質シグナル伝達を使用することによりアポリポタンパク質ＢｍＲＮＡ編集の上方制御を介して、アテローム発生の因子に関連するアポリポタンパク質Ｂ１００肝臓性産出量の削減する新規なアプローチを提供すると考えられる。ＰＴＤ（ＨＩＶ−１ＴＡＴタンパク質のアミノ酸残基４９〜５７）は、機能的な全長タンパク質分子を細胞に送達するための他の系において使用されている（Ｎａｇａｈａｒａら、「Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎｏｆｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈＴＡＴｆｕｓｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎｓｉｎｔｏｍａｍｍａｌｉａｎｃｅｌｓ：ＴＡＴ−ｐ^{２７Ｋｉｐ１} ｉｎｄｕｃｅｓｃｅｌｌｍｉｇｒａｔｉｏｎ」ＮａｔｕｒｅＭｅｄ．４：１４４９−１４５２（１９９８）；Ｓｃｈｗａｒｚｅら、「Ｉｎｖｉｖｏｐｒｏｔｅｉｎｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ：ｄｅｌｉｖｅｒｙｏｆａｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙａｃｔｉｖｅｐｒｏｔｅｉｎｉｎｔｏｔｈｅｍｏｕｓｅ」Ｓｃｉｅｎｃｅ２８５：１５６９−１５７２（１９９９）；Ｖｏｃｅｒｏ−Ａｋｂａｎｉら、「ＫｉｌｌｉｎｇＨＩＶ−ｉｎｆｅｃｔｅｄｃｅｌｌｓｂｙｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎｗｉｔｈａｎＨＩＶｐｒｏｔｅａｓｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄｃａｓｐａｓｅ−３ｐｒｏｔｅｉｎ」ＮａｔｕｒｅＭｅｄ．５：２９−３３（１９９９）（各々が、その全体が本明細書中に参考として援用される））。これらの融合分子のいくつかは、マウス中に導入された場合、全ての組織細胞に入り、血液脳関門を通過しさえする（Ｓｃｈｗａｒｚｅら、「Ｉｎｖｉｖｏｐｒｏｔｅｉｎｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ：ｄｅｌｉｖｅｒｙｏｆａｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙａｃｔｉｖｅｐｒｏｔｅｉｎｉｎｔｏｔｈｅｍｏｕｓｅ」Ｓｃｉｅｎｃｅ２８５：１５６９−１５７２（１９９９（その全体が本明細書中に参考として援用される）））。これらの融合物の細胞取り込みについての詳細な機構は未知のままであるが、膜形質導入の間のタンパク質の変性は、迅速なプロセスであると考えられ、そして、律速的事象は、細胞内にいったん入る時の形質導入されたタンパク質の再生である（Ｓｃｈｗａｒｚｅら、「Ｐｒｏｔｅｉｎｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ：ｕｎｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄｄｅｉｖｅｒｙｉｎｔｏａｌｌｃｅｌｌｓ」ＴｒｅｎｄｓＣｅｌｌＢｉｏｌ．１０：２９０−２９５（２０００）（本明細書中にその全体が参考として援用される））。
【０１３１】
このことについて、タンパク質形質導入法は、いくつかのタンパク質が、フォールディングされなかった後、活性な高次構造を首尾よく採用し得ないかもしれないという制限を有し得る。ゆえに、上記の実施例は、ＴＡＴ−ＣＭＰＫ（配列番号２８の発現産物）およびＴＡＴ−ｒＡＰＯＢＥＣ−ＣＭＰＫ（配列番号４）の両方が肝細胞に入る能力を有すること、そして、ＴＡＴ−ｒＡＰＯＢＥＣ−ＣＭＰＫが、培地へのこの添加の６時間内に編集を活性化するということを立証する、ということは明らかである。類似の速度論が、ネイティブ条件下で調製されたＴＡＴ−ｒＡＰＯＢＥＣ−ＣＭＰＫでも観察された。
【０１３２】
重要なことに、ＴＡＴ−ＣＭＰＫは、編集活性を刺激し得ず、これは、編集において観察された変化が、組換えタンパク質を含むＡＰＯＢＥＣ−１に特異的であることを実証した。タンパク質を含むＡＰＯＢＥＣ−１の凝集しやすい傾向を考慮すると、細胞に入る際の遅れの一部は、これらの多量体の複合体が、原形質膜を横切れないこと、およびＴＡＴ−ｒＡＰＯＢＥＣ−ＣＭＰＫモノマーが凝集体から解離し、そして膜をよぎるのにかかる時間に起因し得る。これは、ＴＡＴ−ＣＭＰＫ（これは、巨大な凝集体を形成しなさそうである）が、ＴＡＴ−ｒＡＰＯＢＥＣ−ＣＭＰＫで観察された速度論よりも速い速度論で、細胞内に蓄積しそうであるという発見によって支持される。編集活性の増加が測定され得る前の６時間の遅れはまた、形質導入されたタンパク質が再折り畳みし、そして、エディトソームを構築するのに必要な時間に起因した可能性がある。
【０１３３】
アポリポタンパク質ＢｍＲＮＡの編集は、編集因子がまた、細胞質において示され得るという事実にも関わらず、細胞核内で生じる（Ｙａｎｇら、「ＩｎｄｕｃｔｉｏｎｏｆｃｙｔｉｄｉｎｅｔｏｕｒｉｄｉｎｅｅｄｉｔｉｎｇｏｎｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎＢｍＲＮＡｂｙｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇＡＰＯＢＥＣ−１」Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：２２６６３〜２２６６９（２０００）、これは本明細書中でその全体を参考として援用される）。核におけるＡＰＯＢＥＣ−１の分配を担う機構は理解されていないが（Ｙａｎｇら、「ＩｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒＴｒａｆｆｉｃｋｉｎｇＤｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓｉｎＡＰＯＢＥＣ−１，ｔｈｅＣａｔａｌｙｔｉｃＳｕｂｕｎｉｔｆｏｒＣｙｔｉｄｉｎｅｔｏＵｒｉｄｉｎｅＥｄｉｔｉｎｇｏｆＡｐｏＢｍＲＮＡ」Ｅｘｐ．ＣｅｌｌＲｅｓ．２６７：１６３〜１８４（２００１）、これは本明細書中でその全体を参考として援用される）、その質量が重要であるようであった。なぜなら、キメラタンパク質ＡＰＯＢＥＣ−ＣＭＰＫは、核から排除されたからである。（Ｙａｎｇら「Ｍｕｌｔｉｐｌｅｐｒｏｔｅｉｎｄｏｍａｉｎｓｄｅｔｅｒｍｉｎｅｔｈｅｃｅｌｌｔｙｐｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃｎｕｃｌｅａｒｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｏｆｔｈｅｃａｔａｌｙｔｉｃｓｕｂｕｎｉｔｒｅｑｕｉｒｅｄｆｏｒａｐｏＢｍＲＮＡｅｄｉｔｉｎｇ」Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９４：１３０７５〜１３０８０（１９９７）；Ｙａｎｇら、「ＩｎｄｕｃｔｉｏｎｏｆｃｙｔｉｄｉｎｅｔｏｕｒｉｄｉｎｅｅｄｉｔｉｎｇｏｎｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎＢｍＲＮＡｂｙｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇＡＰＯＢＥＣ−１」Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：２２６６３〜２２６６９（２０００）、これらの各々は、本明細書中でその全体を参考として援用される）。細胞質および核の両方に分配するＴＡＴ−ｒＡＰＯＢＥＣ−ＣＭＰＫの能力は、核の局在化シグナルとしてもまた作用するＴＡＴＰＴＤの提案された能力と一致した（Ｓｃｈｗａｒｚｅら、「Ｉｎｖｉｖｏｐｒｏｔｅｉｎｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ：ｄｅｌｉｖｅｒｙｏｆａｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙａｃｔｉｖｅｐｒｏｔｅｉｎｉｎｔｏｔｈｅｍｏｕｓｅ」Ｓｃｉｅｎｃｅ２８５：１５６９〜１５７２（１９９９）、これは本明細書中でその全体を参考として援用される）。ＴＡＴ−ｒＡＰＯＢＥＣ−ＣＭＰＫの分配は、野生型酵素の分配を模倣しているが（Ｙａｎｇら、「Ｍｕｌｔｉｐｌｅｐｒｏｔｅｉｎｄｏｍａｉｎｓｄｅｔｅｒｍｉｎｅｔｈｅｃｅｌｌｔｙｐｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃｎｕｃｌｅａｒｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｏｆｔｈｅｃａｔａｌｙｔｉｃｓｕｂｕｎｉｔｒｅｑｕｉｒｅｄｆｏｒａｐｏＢｍＲＮＡｅｄｉｔｉｎｇ」Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９４：１３０７５〜１３０８０（１９９７）、これは、本明細書中でその全体を参考として援用される）、全ての形質導入されたＴＡＴ−ｒＡＰＯＢＥＣ−ＣＭＰＫ分子が編集において活性であるか否か、および細胞質または核の転写物が編集されたか否かについては不確かなままである。それにもかかわらず、活性の程度またはその細胞内の局在性に関係なく、アポリポタンパク質Ｂ１００リポタンパク質における明確な減少が実証された。
【０１３４】
遺伝子の転移を介するＡＰＯＢＥＣ−１の過剰発現による編集活性の増強は、核および細胞質の転写物の両方における乱雑な編集に関連することが示されている（Ｓｏｗｄｅｎら、「ＯｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＡＰＯＢＥＣ−１ｒｅｓｕｌｔｓｉｎｍｏｏｒｉｎｇ−ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｐｒｏｍｉｓｃｕｏｕｓＲＮＡｅｄｉｔｉｎｇ」Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：３０１１〜３０１７（１９９６）；Ｙａｎｇら、「ｉｎｄｕｃｔｉｏｎｏｆｃｙｔｉｄｉｎｅｔｏｕｒｉｄｉｎｅｅｄｉｔｉｎｇｏｎｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎＢｍＲＮＡｂｙｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇＡＰＯＢＥＣ−１」Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：２２６６３〜２２６６９（２０００）、これらの各々は、本明細書中でその全体を参考として援用される）。アポリポタンパク質ＢｍＲＮＡ編集の代謝刺激は常に忠実に維持された（Ｗｕら、「ＡｐｏＢｍＲＮＡｅｄｉｔｉｎｇ：ｖａｌｉｄａｔｉｏｎｏｆａｓｅｎｓｉｔｉｖｅａｓｓａｙａｎｄｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌｂｉｏｌｏｇｙｏｆＲＮＡｅｄｉｔｉｎｇｉｎｔｈｅｒａｔ」Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：１２３１２〜１２３１６（１９９０）；Ｇｒｅｅｖｅら、「ＡｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎＢｍＲＮＡｅｄｉｔｉｎｇｉｎ１２ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｍａｍｍａｌｉａｎｓｐｅｃｉｅｓ：ｈｅｐａｔｉｃｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｓｒｅｆｌｅｃｔｅｄｉｎｌｏｗｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓｏｆａｐｏＢ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｐｌａｓｍａｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｓ」Ｊ．Ｌｉｐｉｄ．Ｒｅｓ．３４：１３６７〜１３８３（１９９３）；Ｐｈｕｎｇら、「ＲｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｈｅｐａｔｉｃａｐｏＢＲＮＡｅｄｉｔｉｎｇｉｎｔｈｅｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙｏｂｅｓｅＺｕｃｋｅｒｒａｔ」Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ４５：１０５６〜１０５８（１９９６）；ｖｏｎＷｒｏｎｓｋｉら、「Ｉｎｓｕｌｉｎｉｎｃｒｅａｓｅｓｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆａｐｏｂｅｃ−１，ｔｈｅｃａｔａｌｙｔｉｃｓｕｂｕｎｉｔｏｆｔｈｅａｐｏＢＢｍＲＮＡｅｄｉｔｉｎｇｃｏｍｐｌｅｘｉｎｒａｔｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ」ＭｅｔａｂｏｌｉｓｍＣｌｉｎｉｃａｌ＆Ｅｘｐ．７：８６９〜８７３（１９９８）、これらは各々、本明細書中でその全体を参考として援用される）。従って、編集が９０％よりも高く増強された場合でもなお編集活性の忠実性が、ＴＡＴ−ｒＡＰＯＢＥＣ−ＣＭＰＫで保持されたことは非常に意味がある。この高い忠実性の編集のレベルは、ａｐｏｂｅｃ−１トランスジェニック動物における高度な編集なしでは達成され得ない（Ｙａｍａｎａｋａら、「ＨｙｐｅｒｅｄｉｔｉｎｇｏｆｍｕｌｔｉｐｌｅｃｙｔｉｄｉｎｅｓｏｆａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎＢｍＲＮＡｂｙＡＰＯＢＥＣ−１ｒｅｑｕｉｒｅｓａｕｘｉｌｉａｒｙｐｒｏｔｅｉｎ（ｓ）ｂｕｔｎｏｔａｍｏｏｒｉｎｇｓｅｑｕｅｎｃｅｍｏｔｉｆ」Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：１１５０６〜１１５１０（１９９６）；Ｙａｍａｎａｋａら、「ＡｎｏｖｅｌｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌｒｅｐｒｅｓｓｏｒｍＲＮＡｉｓｅｄｉｔｅｄｅｘｔｅｎｓｉｖｅｌｙｉｎｌｉｖｅｒｓｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｔｕｍｏｒｓｃａｕｓｅｄｂｙｔｈｅｔｒａｎｓｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｔｈｅａｐｏＢｍＲＮＡｅｄｉｔｉｎｇｅｎｚｙｍｅ」Ｇｅｎｅｓ＆Ｄｅｖ．１１：３２１〜３３３（１９９７）；Ｓｏｗｄｅｎら、「ＯｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＡＰＯＢＥＣ−１ｒｅｓｕｌｔｓｉｎｍｏｏｒｉｎｇ−ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｐｒｏｍｉｓｃｕｏｕｓＲＮＡｅｄｉｔｉｎｇ」Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：３０１１〜３０１７（１９９６）；Ｓｏｗｄｅｎら、「ＡｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎＢＲＮＡＳｅｑｕｅｎｃｅ３’ ｏｆｔｈｅｍｏｏｒｉｎｇｓｅｑｕｅｎｃｅａｎｄｃｅｌｌｕｌａｒｓｏｕｒｃｅｓｏｆａｕｘｉｌｉａｒｙｆａｃｔｏｒｓｄｅｔｅｒｍｉｎｅｔｈｅｌｏｃａｔｉｏｎａｎｄｅｘｔｅｎｔｏｆｐｒｏｍｉｓｃｕｏｕｓｅｄｉｔｉｎｇ」ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．２６：１６４４〜１６５２（１９９８）；これらは各々、本明細書中でその全体を参考として援用される）。肝臓アポリポタンパク質ＢｍＲＮＡ編集の導入が、低レベルのａｐｏｂｅｃ−１発現で達成されたトランスジェニック動物に病状はなく、そしてこれらの動物は、著しく低い血清アポリポタンパク質Ｂ１００およびコントロールと比較して有意に減少された血清ＬＤＬを有していた（Ｔｅｎｇら、「Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ−ｍｅｄｉａｔｅｄｇｅｎｅｔｒａｎｓｆｅｒｏｆｒａｔａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎＢｍＲＮＡｅｄｉｔｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎｉｎｍｉｃｅｖｉｒｔｕａｌｌｙｅｌｉｍｉｎａｔｅｓａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎＢ−１００ａｎｄｎｏｒｍａｌｌｏｗｄｅｎｓｉｔｙｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ」Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：２９３９５〜２９４０４（１９９４）；Ｈｕｇｈｓら、「ＧｅｎｅｔｒａｎｓｆｅｒｏｆｃｙｔｉｄｉｎｅｄｅａｍｉｎａｓｅＡＰＯＢＥＣ−１ｌｏｗｅｒｓｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ（ａ）ｉｎｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｍｉｃｅａｎｄｉｎｄｕｃｅｓａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎＢｍＲＮＡｅｄｉｔｉｎｇｉｎｒａｂｂｉｔｓ」Ｈｕｍ．ＧｅｎｅＴｈｅｒ．７：３９〜４９（１９９６）；Ｋｏｚａｒｓｋｙら、「ＨｅｐａｔｉｃｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｔｈｅｃａｔａｌｙｔｉｃｓｕｂｕｎｉｔｏｆｔｈｅａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎＢｍＲＮＡｅｄｉｔｉｎｇｅｎｚｙｍｅａｍｅｌｉｏｒａｔｅｓｈｙｐｅｒｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌｅｍｉａｉｎＬＤＬｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔｒａｂｂｉｔｓ」Ｈｕｍ．ＧｅｎｅＴｈｅｒ．７：９４３〜９５７（１９９６）；Ｆａｒｅｓｅら、「ＰｈｅｎｏｔｙｐｉｃａｎａｌｙｓｉｓｏｆｍｉｃｅｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇｅｘｃｌｕｓｉｖｅｌｙａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎＢ４８ｏｒａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎＢ１００」Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９３：６３９３〜６３９８（１９９６）；Ｑｉａｎら「ＬｏｗｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｔｈｅａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎＢｍＲＮＡｅｄｉｔｉｎｇｔｒａｎｓｇｅｎｅｉｎｍｉｃｅｒｅｄｕｃｅｓＬＤＬｂｕｔｄｏｅｓｎｏｔｃａｕｓｅｌｉｖｅｒｄｙｓｐｌａｓｉａｏｒｔｕｍｏｒｓ」Ａｒｔｅｒｉｏｓｃ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．１８：１０１３〜１０２０（１９９８）；Ｗｕら「ＮｏｒｍａｌｐｅｒｉｎａｔａｌｒｉｓｅｉｎｓｅｒｕｍｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌｉｓｉｎｈｉｂｉｔｅｄｂｙｈｅｐａｔｉｃｄｅｌｉｖｅｒｙｏｆａｄｅｎｏｖｉｒａｌｖｅｃｔｏｒｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎＢｍＲＮＡｅｄｉｔｉｎｇｅｎｚｙｍｅｉｎｒａｂｂｉｔｓ」Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｒｅｓ．８５：１４８〜１５７（１９９９）、これらは各々、本明細書中でその全体を参考として援用される。興味深いことに、は、ａｐｏｂｅｃ−１遺伝子ノックアウトマウス中へのａｐｏｂｅｃ−１遺伝子の転移は回復し、そして血清ＬＤＬレベルを減少させ（Ｎａｋａｍｕｔａら、「Ｃｏｍｐｌｅｔｅｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｔｈｅａｐｏｂｅｃ−１ｋｎｏｃｋｏｕｔｍｉｃｅｗｉｔｈａｗｉｌｄ−ｔｙｐｅｇｅｎｅｔｉｃｂａｃｋｇｒｏｕｎｄａｎｄａｈｕｍａｎａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎＢｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ，ａｎｄｒｅｓｔｏｒａｔｉｏｎｏｆａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎＢｍＲＮＡｅｄｉｔｉｎｇｂｙｓｏｍａｔｉｃｇｅｎｅｔｒａｎｓｆｅｒｏｆＡｐｏｂｅｃ−１」Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２５９８１〜２５９８８（１９９６）、本明細書中でその全体を参考として援用される）、このことはＡＰＯＢＥＣ−１が、予めの編集活性を有さない肝臓において治療的潜在能を有することを実証する。ＬＤＬレセプター欠損を有するａｐｏｂｅｃ−１トランスジェニックウサギにおけるアポリポタンパク質ＢｍＲＮＡの肝臓編集の誘導はまた、高コレステロール血症を改善させた（Ｋｏｚａｒｓｋｙら「ＨｅｐａｔｉｃｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｔｈｅｃａｔａｌｙｔｉｃｓｕｂｕｎｉｔｏｆｔｈｅａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎＢｍＲＮＡｅｄｉｔｉｎｇｅｎｚｙｍｅａｍｅｌｉｏｒａｔｅｓｈｙｐｅｒｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌｅｍｉａｉｎＬＤＬｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔｒａｂｂｉｔｓ」Ｈｕｍ．ＧｅｎｅＴｈｅｒ．７：９４３〜９５７（１９９６）、これは本明細書中でその全体を参考として援用される）。ひとまとめにして、これらの研究は、アポリポタンパク質ＢｍＲＮＡの編集が、血清ＬＤＬおよびアテローム発生性の疾患の危険性を減少するための機構として安全に標的化され得ることを示唆した。
【０１３５】
しかし、遺伝子治療を用いて低レベルのａｐｏｂｅｃ−１発現を制御することは困難であり、そして通常予測不可能である。これらの全ての理由のために、遺伝子治療アプローチの限られた成功例にも関わらず、ａｐｏｂｅｃ−１を用いる遺伝子治療は、アテローム発生性の疾患要因についての予防的または治療的制御のために研究され得る有望な目的達成手段でないようである。タンパク質形質導入治療の利点は、投薬量が、所望の応答と相対的に調節され得ること、および編集に対する効果が、中止治療によって終結され得ることである。
【０１３６】
ＰＴＤは、タンパク質が、静脈内で送達される場合でもなお、タンパク質が身体の全ての細胞に入ることを可能にすべきである（Ｓｃｈｗａｒｚｅら、「Ｉｎｖｉｖｏｐｒｏｔｅｉｎｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ：ｄｅｌｉｖｅｒｙｏｆａｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙａｃｔｉｖｅｐｒｏｔｅｉｎｉｎｔｏｔｈｅｍｏｕｓｅ」Ｓｃｉｅｎｃｅ２８５：１５６９〜１５７２（１９９９）、これは、本明細書中でその全体を参考として援用される）。想像上、肝臓は、ＴＡＴ−ｒＡＰＯＢＥＣ−ＣＭＰＫで特異的に標的化され、そして腹腔内注射は、第１の通過クリアランス（ｆｉｒｓｔｐａｓｓｃｌｅａｒａｎｃｅ）を達成するために利用され得、殆どのタンパク質を肝細胞に形質導入する。ＡＰＯＢＥＣ−１は、組織中で広範に発現されないが（Ｔｅｎｇら「ＭｏｌｅｃｕｌａｒｃｌｏｎｉｎｇｏｆａｎａｐｏＢｍｅｓｓｅｎｇｅｒＲＮＡｅｄｉｔｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ」Ｓｃｉｅｎｃｅ２６０：１８１１６〜１８１９（１９９３）、これは、本明細書中でその全体を参考として援用される）、トランスジェニック動物中でのその全身的な発現は、病状を誘導しない（Ｔｅｎｇら「Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ−ｍｅｄｉａｔｅｄｇｅｎｅｔｒａｎｓｆｅｒｏｆｒａｔａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎＢｍＲＮＡｅｄｉｔｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎｉｎｍｉｃｅｖｉｒｔｕａｌｌｙｅｌｉｍｉｎａｔｅｓａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎＢ−１００ａｎｄｎｏｒｍａｌｌｏｗｄｅｎｓｉｔｙｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ」Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：２９３９５〜２９４０４（１９９４）；Ｈｕｇｈｓら「ＧｅｎｅｔｒａｎｓｆｅｒｏｆｃｙｔｉｄｉｎｅｄｅａｍｉｎａｓｅＡＰＯＢＥＣ−１ｌｏｗｅｒｓｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ（ａ）ｉｎｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｍｉｃｅａｎｄｉｎｄｕｃｅｓａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎＢｍＲＮＡｅｄｉｔｉｎｇｉｎｒａｂｂｉｔｓ」Ｈｕｍ．ＧｅｎｅＴｈｅｒ．７：３９〜４９（１９９６）；Ｋｏｚａｒｓｋｙら「ＨｅｐａｔｉｃｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｔｈｅｃａｔａｌｙｔｉｃｓｕｂｕｎｉｔｏｆｔｈｅａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎＢｍＲＮＡｅｄｉｔｉｎｇｅｎｚｙｍｅａｍｅｌｉｏｒａｔｅｓｈｙｐｅｒｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌｅｍｉａｉｎＬＤＬｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔｒａｂｂｉｔｓ」Ｈｕｍ．ＧｅｎｅＴｈｅｒ．７：９４３〜９５７（１９９６）；Ｆａｒｅｓｅら「ＰｈｅｎｏｔｙｐｉｃａｎａｌｙｓｉｓｏｆｍｉｃｅｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇｅｘｃｌｕｓｉｖｅｌｙａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎＢ４８ｏｒａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎＢ１００」Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９３：６３９３〜６３９８（１９９６）；Ｑｉａｎら「ＬｏｗｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｔｈｅａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎＢｍＲＮＡｅｄｉｔｉｎｇｔｒａｎｓｇｅｎｅｉｎｍｉｃｅｒｅｄｕｃｅｓＬＤＬｂｕｔｄｏｅｓｎｏｔｃａｕｓｅｌｉｖｅｒｄｙｓｐｌａｓｉａｏｒｔｕｍｏｒｓ」Ａｒｔｅｒｉｏｓｃ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．１８：１０１３〜１０２０（１９９８）；Ｗｕら、「ＮｏｒｍａｌｐｅｒｉｎａｔａｌｒｉｓｅｉｎｓｅｒｕｍｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌｉｓｉｎｈｉｂｉｔｅｄｂｙｈｅｐａｔｉｃｄｅｌｉｖｅｒｙｏｆａｄｅｎｏｖｉｒａｌｖｅｃｔｏｒｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎＢｍＲＮＡｅｄｉｔｉｎｇｅｎｚｙｍｅｉｎｒａｂｂｉｔｓ」Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｒｅｓ．８５：１４８〜１５７（１９９９）、これらの各々は、本明細書中でその全体を参考として援用される）。
【０１３７】
ＴＡＴ−ｒＡＰＯＢＥＣ−ＣＭＰＫまたはＴＡＴ−ｈＡＰＯＢＥＣ−ＣＭＰＫの取り込みは、いかなる副作用も誘導しないようである。１つの研究の側面は、肝臓におけるＡＰＯＢＥＣ−１の過剰発現が、アポリポタンパク質Ｂ以外のｍＲＮＡの編集を導き得ることを示唆し（Ｙａｍａｎａｋａら「ＡｎｏｖｅｌｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌｒｅｐｒｅｓｓｏｒｍＲＮＡｉｓｅｄｉｔｅｄｅｘｔｅｎｓｉｖｅｌｙｉｎｌｉｖｅｒｓｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｔｕｍｏｒｓｃａｕｓｅｄｂｙｔｈｅｔｒａｎｓｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｔｈｅａｐｏＢｍＲＮＡｅｄｉｔｉｎｇｅｎｚｙｍｅ」Ｇｅｎｅｓ＆Ｄｅｖ．１１：３２１〜３３３（１９９７）、これは、本明細書中でその全体を参考として援用される）、ＡＰＯＢＥＣ−１に対する他のｍＲＮＡ基質は見出されていない（Ｓｋｕｓｅら「ＮｅｕｒｏｆｉｂｒｏｍａｔｏｓｉｓｔｙｐｅＩｍＲＮＡｕｎｄｅｒｇｏｅｓｂａｓｅ−ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎＲＮＡｅｄｉｔｉｎｇ」ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．２４：４７８〜４８６（１９９６）；Ｓｏｗｄｅｎら、「ＡｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎＢＲＮＡＳｅｑｕｅｎｃｅ３’ ｏｆｔｈｅｍｏｏｒｉｎｇｓｅｑｕｅｎｃｅａｎｄｃｅｌｌｕｌａｒｓｏｕｒｃｅｓｏｆａｕｘｉｌｉａｒｙｆａｃｔｏｒｓｄｅｔｅｒｍｉｎｅｔｈｅｌｏｃａｔｉｏｎａｎｄｅｘｔｅｎｔｏｆｐｒｏｍｉｓｃｕｏｕｓｅｄｉｔｉｎｇ」ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．２６：１６４４〜１６５２（１９９８）、これは各々、本明細書中でその全体を参考として援用される）。さらに、ａｐｏｂｅｃ−１遺伝子ノックアウトの研究は、アポリポタンパク質ＢｍＲＮＡを編集し得る他の編集酵素がないこと、およびＡＰＯＢＥＣ−１が生存に必須でないことを示している（Ｈｉｒａｎｏら「Ｔａｒｇｅｔｅｄｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎｏｆｔｈｅｍｏｕｓｅａｐｏｂｅｃ−１ｇｅｎｅａｂｏｌｉｓｈｅｓａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎＢｍＲＮＡｅｄｉｔｉｎｇａｎｄｅｌｉｍｉｎａｔｅｓａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎＢ４８」Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：９８８７〜９８９０（１９９６）Ｎａｋａｍｕｒａら「Ｃｏｍｐｌｅｔｅｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｔｈｅａｐｏｂｅｃ−１ｋｎｏｃｋｏｕｔｍｉｃｅｗｉｔｈａｗｉｌｄ−ｔｙｐｅｇｅｎｅｔｉｃｂａｃｋｇｒｏｕｎｄａｎｄａｈｕｍａｎａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎＢｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ，ａｎｄｒｅｓｔｏｒａｔｉｏｎｏｆａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎＢｍＲＮＡｅｄｉｔｉｎｇｂｙｓｏｍａｔｉｃｇｅｎｅｔｒａｎｓｆｅｒｏｆＡｐｏｂｅｃ−１」Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２５９８１〜１５９８８（１９９６）、これらの各々は、本明細書中でその全体を参考として援用される）。ひとまとめにすると、このデータは、ＡＰＯＢＥＣによるｍＲＮＡ編集が、アポリポタンパク質ＢｍＲＮＡに対するその特異性に起因して自己制限され、従って、ＴＡＴ−ｒＡＰＯＢＥＣ−ＣＭＰＫもＴＡＴ−ｈＡＰＯＢＥＣ−ＣＭＰＫもアポリポタンパク質ＢｍＲＮＡおよび補助的なタンパク質を発現する組織以外の組織において効果を有する可能性があることを示唆する。
【０１３８】
近年のコレステロール低下治療は、増強された除去または減少された産生のレベルで、循環するコレステロールを標的化する。集団中の中の一部（ｓｅｃｔｏｒ）は、いくらかのこれらの患者における近年の治療からの副作用に起因するアテローム性動脈硬化症の危険および、従来のコレステロール低下治療から完全に利益を享受するためのアポリポタンパク質Ｂおよび／またはＬＤＬレセプターに媒介される取り込み経路において欠損を有する他の患者での不能の問題が解決されていない。高コレステロール血症は、初期に発症する疾患であるが、なお思春期での発達が妨害されるという可能性に起因して、子供における通常の治療の使用は制限されているということが解決されていない。タンパク質ベースの治療（例えば、インスリンまたは成長ホルモン）は、Ｉ型糖尿病または下垂体小人症をそれぞれ処置するために子供に広範に使用されている。患者または患者の親に対して、タンパク質ベースの治療の可逆性の性質は、遺伝子治療よりも魅力的であり得る。この目的のために、上記の結果は、危険性のある集団の中の一部におけるアテローム性動脈硬化症の危険性を減少するための通常のアプローチまたは遺伝子治療アプローチの代替を示す。
【０１３９】
好ましい実施形態が、本明細書中で説明され、詳細に記載されているが、種々の改変、不可、置換などが本発明の精神から逸脱することなく行われ得、従ってそれらは、上記の特許請求の範囲に規定されるような本発明の範囲内であるとみなされることが、当業者に明らかである。
【図面の簡単な説明】
【０１４０】
【図１Ａ】図１Ａは、ヒトアポリポタンパク質ＢｍＲＮＡ編集に特異的な例示的な第１のキメラタンパク質（ＴＡＴ−ｈＡＰＯＢＥＣ−ＣＭＰＫと示される）の構造を示す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、ヒトアポリポタンパク質ＢｍＲＮＡ編集に特異的な例示的な第１のキメラタンパク質（ＴＡＴ−ｈＡＰＯＢＥＣ−ＣＭＰＫと示される）のヌクレオチド配列（配列番号１）を示す。図１Ｂ〜Ｃにおいて、ヒトＡＰＯＢＥＣ−１をコードする領域は小文字で示され、そしてこの構築物の開始コドンがこの配列の最初にある。ＴＡＴタンパク質形質導入ドメインおよびヘマグルチニンドメインをコードする配列は、５’末端付近（すなわち、ＡＰＯＢＥＣ−１配列の上流）に大文字で示される。ＣＭＰＫをコードする配列は、ＡＰＯＢＥＣ−１配列の３’に大文字で示される。ヒスチジンタグをコードする配列は、３’末端領域に存在し、小文字で示される。
【図１Ｃ】図１Ｃは、ヒトアポリポタンパク質ＢｍＲＮＡ編集に特異的な例示的な第１のキメラタンパク質（ＴＡＴ−ｈＡＰＯＢＥＣ−ＣＭＰＫと示される）のヌクレオチド配列（配列番号１）を示す。図１Ｂ〜Ｃにおいて、ヒトＡＰＯＢＥＣ−１をコードする領域は小文字で示され、そしてこの構築物の開始コドンがこの配列の最初にある。ＴＡＴタンパク質形質導入ドメインおよびヘマグルチニンドメインをコードする配列は、５’末端付近（すなわち、ＡＰＯＢＥＣ−１配列の上流）に大文字で示される。ＣＭＰＫをコードする配列は、ＡＰＯＢＥＣ−１配列の３’に大文字で示される。ヒスチジンタグをコードする配列は、３’末端領域に存在し、小文字で示される。
【図１Ｄ】図１Ｄは、ヒトアポリポタンパク質ＢｍＲＮＡ編集に特異的な例示的な第１のキメラタンパク質（ＴＡＴ−ｈＡＰＯＢＥＣ−ＣＭＰＫと示される）のアミノ酸配列（配列番号２）を示す。図１Ｄにおいて、Ｎ末端から始めると、ＴＡＴタンパク質形質導入ドメインが太字で示され、その後にヘマグルチニンドメインもまた太字で示され、ヒトＡＰＯＢＥＣ−１は下線で示され、ＣＭＰＫもまた下線で示され、そしてヒスチジンタグはＣ末端に太字で示される。
【図２Ａ】図２Ａは、ラットアポリポタンパク質ＢｍＲＮＡ編集に特異的な例示的な第１のキメラタンパク質（ＴＡＴ−ｒＡＰＯＢＥＣ−ＣＭＰＫと示される）の構造を示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、ラットアポリポタンパク質ＢｍＲＮＡ編集に特異的な例示的な第１のキメラタンパク質（ＴＡＴ−ｒＡＰＯＢＥＣ−ＣＭＰＫと示される）のヌクレオチド配列（配列番号３）を示す。図２Ｂ〜Ｃにおいて、ラットＡＰＯＢＥＣ−１をコードする領域は小文字で示され、そしてこの構築物の開始コドンがこの配列の最初にある。ＴＡＴタンパク質形質導入ドメインおよびヘマグルチニンドメインをコードする配列は、５’末端付近（すなわち、ＡＰＯＢＥＣ−１配列の上流）に大文字で示される。ＣＭＰＫをコードする配列は、ＡＰＯＢＥＣ−１配列の３’に大文字で示される。ヒスチジンタグをコードする配列は、３’末端領域に存在し、小文字で示される。
【図２Ｃ】図２Ｃは、ラットアポリポタンパク質ＢｍＲＮＡ編集に特異的な例示的な第１のキメラタンパク質（ＴＡＴ−ｒＡＰＯＢＥＣ−ＣＭＰＫと示される）のヌクレオチド配列（配列番号３）を示す。図２Ｂ〜Ｃにおいて、ラットＡＰＯＢＥＣ−１をコードする領域は小文字で示され、そしてこの構築物の開始コドンがこの配列の最初にある。ＴＡＴタンパク質形質導入ドメインおよびヘマグルチニンドメインをコードする配列は、５’末端付近（すなわち、ＡＰＯＢＥＣ−１配列の上流）に大文字で示される。ＣＭＰＫをコードする配列は、ＡＰＯＢＥＣ−１配列の３’に大文字で示される。ヒスチジンタグをコードする配列は、３’末端領域に存在し、小文字で示される。
【図２Ｄ】図２Ｄは、ラットアポリポタンパク質ＢｍＲＮＡ編集に特異的な例示的な第１のキメラタンパク質（ＴＡＴ−ｒＡＰＯＢＥＣ−ＣＭＰＫと示される）のアミノ酸配列（配列番号４）を示す。図２Ｄにおいて、Ｎ末端から始めると、ＴＡＴタンパク質形質導入ドメインが太字で示され、その後にヘマグルチニンドメインもまた太字で示され、ラットＡＰＯＢＥＣ−１は下線で示され、ＣＭＰＫもまた下線で示され、そしてヒスチジンタグはＣ末端に太字で示される。
【図３Ａ】図３Ａは、相補的なヒトＡＰＯＢＥＣ−１に特異的な例示的な第２のキメラタンパク質（ＴＡＴ−ｈＡＣＦと示される）の構造を示す。
【図３Ｂ】図３Ｂは、相補的なヒトＡＰＯＢＥＣ−１に特異的な例示的な第２のキメラタンパク質（ＴＡＴ−ｈＡＣＦと示される）のヌクレオチド配列（配列番号５）を示す。図３Ｂにおいて、ヒトＡＣＦをコードする領域は小文字で示され、そしてこの構築物の開始コドンがこの配列の最初にある。ＴＡＴタンパク質形質導入ドメインおよびヘマグルチニンドメインをコードする配列は、５’末端付近（すなわち、ＡＣＦ配列の上流）に大文字で示される。ヒスチジンタグをコードする配列は、３’末端領域に存在し、小文字で示される。
【図３Ｃ】図３Ｃは、相補的なヒトＡＰＯＢＥＣ−１に特異的な例示的な第２のキメラタンパク質（ＴＡＴ−ｈＡＣＦと示される）のアミノ酸配列（配列番号６）を示す。図３Ｃにおいて、Ｎ末端から始めると、ＴＡＴタンパク質形質導入ドメインが太字で示され、その後にヘマグルチニンドメインもまた太字で示され、ヒトＡＣＦは下線で示され、そしてヒスチジンタグはＣ末端に太字で示される。
【図４Ａ】図４Ａは、相補的なラットＡＰＯＢＥＣ−１に特異的な例示的な第２のキメラタンパク質（ＴＡＴ−ｒＡＣＦと示される）の構造を示す。
【図４Ｂ】図４Ｂは、相補的なラットＡＰＯＢＥＣ−１に特異的な例示的な第２のキメラタンパク質（ＴＡＴ−ｒＡＣＦと示される）のヌクレオチド配列（配列番号７）を示す。図４Ｂにおいて、ラットＡＣＦをコードする領域は小文字で示され、そしてこの構築物の開始コドンがこの配列の最初にある。ＴＡＴタンパク質形質導入ドメインおよびヘマグルチニンドメインをコードする配列は、５’末端付近（すなわち、ＡＣＦ配列の上流）に大文字で示される。ヒスチジンタグをコードする配列は、３’末端領域に存在し、小文字で示される。
【図４Ｃ】図４Ｃは、相補的なラットＡＰＯＢＥＣ−１に特異的な例示的な第２のキメラタンパク質（ＴＡＴ−ｒＡＣＦと示される）のアミノ酸配列（配列番号８）を示す。図４Ｃにおいて、Ｎ末端から始めると、ＴＡＴタンパク質形質導入ドメインが太字で示され、その後にヘマグルチニンドメインもまた太字で示され、ラットＡＣＦは下線で示され、そしてヒスチジンタグはＣ末端に太字で示される。
【図５】図５Ａ〜Ｂは、全長ＴＡＴ−ｒＡＰＯＢＥＣ−ＣＭＰＫタンパク質の精製を示す。図５Ａにおいて、概略図は、ＴＡＴ融合タンパク質をコードする原核生物発現ベクターｐＥＴ−２４ｂの大まかな構造を示す。図５Ｂは、２カラム精製および銀染色後のゲルの画像を示す。ＴＡＴ融合タンパク質は、有意な濃度で回収された唯一のタンパク質である。
【図６】図６Ａ〜Ｆは、ＴＡＴ融合タンパク質ＴＡＴ−ｒＡＰＯＢＥＣ−ＣＭＰＫに曝した、免疫染色細胞の画像である。ＭｃＡｒｄｌｅ細胞を、示される時間（１時間、６時間、または２４時間）、６５０ｎＭの組換えＴＡＴ−ｒＡＰＯＢＥＣ−ＣＭＰＫで処理した。実施例に記載されるように、細胞を固定し、透過化処理し、ＨＡエピトープに対する抗体およびＦＩＴＣ結合抗マウス二次抗体と反応させ、そしてＤＡＰＩ含有緩衝液中でモニタリングした。矢印は、選択した核の位置を示す。
【図７】図７Ａ〜Ｆは、ＴＡＴ−ＣＭＰＫ融合タンパク質に曝した、免疫染色細胞の画像である。ＭｃＡｒｄｌｅ細胞を、示される時間（１時間、６時間、または２４時間）、１１２５ｎＭの組換えＴＡＴ−ＣＭＰＫで処理した。実施例に記載されるように、細胞を固定し、透過化処理し、ＨＡエピトープに対する抗体およびＦＩＴＣ結合抗マウス二次抗体と反応させ、そしてＤＡＰＩ含有緩衝液中でモニタリングした。矢印は、選択した核の位置を示す。
【図８】図８は、ＴＡＴ−ＣＭＰＫが編集を刺激しなかったことを示すゲルの画像である。ＭｃＡｒｄｌｅ細胞を、４５ｎＭ、２２５ｎＭ、および１１２５ｎＭの組換えＴＡＴ−ＣＭＰＫで２４時間処理した。総細胞ＲＮＡを単離し、そしてアポリポタンパク質ＢｍＲＮＡを、実施例に記載されるように、逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応（「ＲＴ−ＰＣＲ」）により選択的に増幅し、そして編集されたアポリポタンパク質ＢＲＮＡの比率を、位置決めされたプライマー伸長により決定した。ＣＡＡ、非編集ＲＮＡに対応するプライマー伸長産物；ＵＡＡ、編集ＲＮＡに対応するプライマー伸長産物；Ｐ、プライマー。
【図９】図９は、ＴＡＴ−ｒＡＰＯＢＥＣ−ＣＭＰＫが、ＭｃＡｒｄｌｅ細胞における編集活性を増加させたことを示す、ゲルの画像である。ＴＡＴ融合タンパク質（３６０ｎＭまたは６２μｇタンパク質／ｍｌ培地）を細胞培養培地に添加し、そして示される時点で、野生型ＭｃＡｒｄｌｅ細胞からの処理に続いて、ＲＮＡを単離した。コントロール細胞を、組換えタンパク質を透析するために使用した緩衝液Ｂの対応するアリコートで処理した。編集の効率を、実施例に記載されるように計算した。ゲル上のレーンの各々に対する標準偏差は、左から右へと読んで、以下の通りである：０．９、２．２、３．８、２．１、１．１、０．９、０．２（ｎ＝３）。ＣＡＡ、下線を引いたＲＮＡに対応するプライマー伸長産物；ＵＡＡ、編集されたＲＮＡに対応するプライマー伸長産物；Ｐ、プライマー。
【図１０】図１０は、ＴＡＴ融合タンパク質が、一次ラット肝実質細胞における編集活性を増加させたことを示す、ゲルの画像である。実施例に記載されるように、肝実質細胞を調製し、そしてＴＡＴ−ｒＡＰＯＢＥＣ−ＣＭＰＫで処理した。コントロール細胞を、組換えタンパク質を透析するために使用した緩衝液Ｂの対応するアリコートで処理した。ＴＡＴ融合タンパク質によって引き起こされた編集活性の増加が明らかであった。ゲル上のレーンの各々に対する標準偏差は、左から右へと読んで、以下の通りである：２．２、３．６、２．５、１．９（ｎ＝３）。
【図１１】図１１は、ＴＡＴ−ｒＡＰＯＢＥＣ−ＣＭＰＫ処理に起因する、分泌されるリポタンパク質プロフィールの変化を示す画像である。一次肝実質細胞を、まずＴＡＴ融合タンパク質で処理し、次いで［^３５Ｓ］メチオニンおよび［^３５Ｓ］システインで標識した。コントロール細胞（−）を、組換えタンパク質を透析するために使用した緩衝液Ｂの対応するアリコートで処理した。細胞培養培地を収集し、アポリポタンパク質Ｂ４８およびアポリポタンパク質Ｂ１００を、抗アポＢ抗体によって沈澱させ、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した。アポリポタンパク質Ｂ４８の下の第２のバンドは、タンパク質分解に起因したかもしれず、そしてアポリポタンパク質Ｂ１００とアポリポタンパク質Ｂ４８との間のバンドは、Ｃ−３相補体であり得る。同じ細胞の編集効率を、下部に示す。これらの結果は、類似の結果の３つの実験を代表する単一の実験からのものである。

Claims

キメラタンパク質であって、第１のポリペプチドと第２のポリペプチドとを含み、
該第１のポリペプチドは、タンパク質形質導入ドメインを含み、
該第２のポリペプチドは、アポリポタンパク質ＢをコードするｍＲＮＡを編集し得る、ＡＰＯＢＥＣ−１またはそのフラグメントを含む、
キメラタンパク質。
請求項１に記載のキメラタンパク質であって、前記タンパク質形質導入ドメインが、ＨＩＶＴＡＴタンパク質形質導入ドメインである、キメラタンパク質。
請求項２に記載のキメラタンパク質であって、前記ＨＩＶＴＡＴタンパク質形質導入ドメインが、配列番号９のアミノ酸配列を含む、キメラタンパク質。
請求項１に記載のキメラタンパク質であって、ＡＰＯＢＥＣ−１またはそのフラグメントが、配列番号１１のアミノ酸配列、配列番号１３のアミノ酸配列、もしくは配列番号１５のアミノ酸配列、またはそれらのフラグメントを含む、キメラタンパク質。
請求項１に記載のキメラタンパク質であって、第３のポリペプチドをさらに含み、
該第３のポリペプチドは、該キメラタンパク質の細胞取り込みの際に、細胞質への該キメラタンパク質の局在化を増強する、細胞質局在化タンパク質またはそのフラグメントを含む、キメラタンパク質。
請求項５に記載のキメラタンパク質であって、前記細胞質局在化タンパク質またはそのフラグメントが、ニワトリ筋肉ピルビン酸キナーゼまたはそのフラグメントである、キメラタンパク質。
請求項６に記載のキメラタンパク質であって、前記ニワトリ筋肉ピルビン酸キナーゼまたはそのフラグメントが、配列番号１７のアミノ酸配列またはそのフラグメントを含む、キメラタンパク質。
請求項５に記載のキメラタンパク質であって、該キメラタンパク質内で、前記第３のポリペプチドが、前記第２のポリペプチドのＣ末端側にある、キメラタンパク質。
請求項１に記載のキメラタンパク質であって、第３のポリペプチドをさらに含み、
該第３のポリペプチドは、複数の隣接ヒスチジン残基を含む、キメラタンパク質。
請求項１に記載のキメラタンパク質であって、第３のポリペプチドをさらに含み、
該第３のポリペプチドは、赤血球凝集素ドメインを含む、キメラタンパク質。
請求項１に記載のキメラタンパク質であって、該キメラタンパク質内で、前記第１のポリペプチドが、前記第２のポリペプチドのＮ末端側にある、キメラタンパク質。
請求項１に記載のキメラタンパク質であって、該キメラタンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列または配列番号４のアミノ酸配列を含む、キメラタンパク質。
請求項１に記載のキメラタンパク質であって、該キメラタンパク質は、単離された形態である、キメラタンパク質。
組成物であって、
薬学的に受容可能なキャリアと、
請求項１に記載のキメラタンパク質と、
を含む、組成物。
請求項１４に記載の組成物であって、前記キメラタンパク質が、該キメラタンパク質を取り込む肝細胞におけるアポリポタンパク質ＢｍＲＮＡ編集を改変するに有効な量で存在する、組成物。
請求項１４に記載の組成物であって、該組成物は、錠剤形態、カプセル形態、散剤形態、溶液形態、懸濁剤形態、または乳剤形態である、組成物。
キメラタンパク質であって、第１のポリペプチドと第２のポリペプチドとを含み、
該第１のポリペプチドは、タンパク質形質導入ドメインを含み、
該第２のポリペプチドは、ＡＰＯＢＥＣ−１によるアポリポタンパク質ＢｍＲＮＡの編集を容易にするように該アポリポタンパク質ＢｍＲＮＡに結合し得る、ＡＣＦまたはそのフラグメントを含む、
キメラタンパク質。
請求項１７に記載のキメラタンパク質であって、前記タンパク質形質導入ドメインが、ＨＩＶｔａｔタンパク質形質導入ドメインである、キメラタンパク質。
請求項１８に記載のキメラタンパク質であって、前記ＨＩＶｔａｔタンパク質形質導入ドメインが、配列番号９のアミノ酸配列を含む、キメラタンパク質。
請求項１７に記載のキメラタンパク質であって、前記ＡＣＦまたはそのフラグメントが、配列番号２１のアミノ酸配列、もしくは配列番号２３のアミノ酸配列、またはそれらのフラグメントを含む、キメラタンパク質。
請求項１７に記載のキメラタンパク質であって、第３のポリペプチドをさらに含み、
該第３のポリペプチドは、複数の隣接ヒスチジン残基を含む、キメラタンパク質。
請求項１７に記載のキメラタンパク質であって、第３のポリペプチドをさらに含み、
該第３のポリペプチドは、赤血球凝集素ドメインを含む、キメラタンパク質。
請求項１７に記載のキメラタンパク質であって、該キメラタンパク質内で、前記第１のポリペプチドが、前記第２のポリペプチドのＮ末端側にある、キメラタンパク質。
請求項１７に記載のキメラタンパク質であって、該キメラタンパク質は、配列番号６のアミノ酸配列または配列番号８のアミノ酸配列を含む、キメラタンパク質。
請求項１７に記載のキメラタンパク質であって、該キメラタンパク質は、単離された形態である、キメラタンパク質。
組成物であって、第１のキメラタンパク質と、第２のキメラタンパク質とを含み、
該第１のキメラタンパク質は、（ｉ）第１のポリペプチドと（ｉｉ）第２のポリペプチドとを含み、
該第１のキメラタンパク質の該第１のポリペプチドは、タンパク質形質導入ドメインを含み、該第１のキメラタンパク質の該第２のポリペプチドは、アポリポタンパク質ＢをコードするｍＲＮＡを編集し得る、ＡＰＯＢＥＣ−１またはそのフラグメントを含み；そして
該第２のキメラタンパク質は、（ｉ）第１のポリペプチドと（ｉｉ）第２のポリペプチドとを含み、
該第２のキメラタンパク質の該第１のポリペプチドは、タンパク質形質導入ドメインを含み、該第２のキメラタンパク質の該第２のポリペプチドは、ＡＰＯＢＥＣ−１またはそのフラグメントによるアポリポタンパク質ＢｍＲＮＡの編集を容易にするように該アポリポタンパク質ＢｍＲＮＡに結合し得る、ＡＣＦまたはそのフラグメントを含む；
組成物。
請求項２６に記載の組成物であって、
前記第１のキメラタンパク質が、該第１のキメラタンパク質を取り込む細胞におけるアポリポタンパク質ＢｍＲＮＡ編集を改変するに有効な量で存在し、そして
前記第２のキメラタンパク質が、アポリポタンパク質ＢｍＲＮＡに結合するに有効であり、かつ該第１のキメラタンパク質および該第２のキメラタンパク質を取り込む細胞において該第１のキメラタンパク質がアポリポタンパク質ＢｍＲＮＡ編集を改変するのを補助するに有効な量で、存在する、
組成物。
請求項２６に記載の組成物であって、前記第１のキメラタンパク質が、配列番号２のアミノ酸配列または配列番号４のアミノ酸配列を含む、組成物。
請求項２６に記載の組成物であって、前記第２のキメラタンパク質が、配列番号６のアミノ酸配列または配列番号８のアミノ酸配列を含む、組成物。
請求項２６に記載の組成物であって、薬学的に受容可能なキャリアをさらに含み、
該薬学的に受容可能なキャリア中に、前記第１のキメラタンパク質および第２のキメラタンパク質が、分散されている、組成物。
請求項２６に記載の組成物であって、該組成物は、錠剤形態、カプセル形態、散剤形態、溶液形態、懸濁剤形態、または乳剤形態である、組成物。
請求項１に記載のキメラタンパク質をコードする、ＤＮＡ分子。
請求項３２に記載のＤＮＡ分子であって、配列番号１のヌクレオチド配列または配列番号３のヌクレオチド配列を含む、ＤＮＡ分子。
ＤＮＡ構築物であって、
請求項３２に記載のＤＮＡ分子と；
該ＤＮＡ分子の５’側に作動可能に連結されている、プロモーター配列と；
該ＤＮＡ分子の３’側に作動可能に連結されている、３’調節配列と；
を含む、ＤＡＮ構築物。
請求項３２に記載のＤＮＡ分子を含む、発現ベクター。
請求項３２に記載のＤＮＡ分子で形質転換された、組み換え宿主細胞。
請求項１７に記載のキメラタンパク質をコードする、ＤＮＡ分子。
請求項３７に記載のＤＮＡ分子であって、配列番号５のヌクレオチド配列または配列番号７のヌクレオチド配列を含む、ＤＮＡ分子。
ＤＮＡ構築物であって、
請求項３７に記載のＤＮＡ分子と；
該ＤＮＡ分子の５’側に作動可能に連結されている、プロモーター配列と；
該ＤＮＡ分子の３’側に作動可能に連結されている、３’調節配列と；
を含む、ＤＡＮ構築物。
請求項３７に記載のＤＮＡ分子を含む、発現ベクター。
請求項３７に記載のＤＮＡ分子で形質転換された、組み換え宿主細胞。
請求項１に記載のキメラタンパク質を含む、送達デバイス。
請求項４２に記載の送達デバイスであって、該送達デバイスが、リポソーム形態、ニオソーム形態、経皮パッチ形態、移植物形態、またはシリンジ形態である、送達デバイス。
請求項１４に記載の組成物を含む、送達デバイス。
請求項４４に記載の送達デバイスであって、該送達デバイスが、リポソーム形態、ニオソーム形態、経皮パッチ形態、移植物形態、またはシリンジ形態である、送達デバイス。
請求項２６に記載の組成物を含む、送達デバイス。
請求項４６に記載の送達デバイスであって、該送達デバイスが、リポソーム形態、ニオソーム形態、経皮パッチ形態、移植物形態、またはシリンジ形態である、送達デバイス。
インビボでのアポリポタンパク質ＢｍＲＮＡ編集を改変する方法であって、
細胞中のアポリポタンパク質ＢｍＲＮＡを、該細胞により分泌されるアポリポタンパク質Ｂ１００の濃度と比較した、該細胞により分泌されるアポリポタンパク質Ｂ４８の濃度を、未処理細胞に対して増加するに有効な条件下で、請求項１に記載のキメラタンパク質と接触させる工程を包含する、
方法。
請求項４８に記載の方法であって、前記細胞が肝細胞である、方法。
請求項４８に記載の方法であって、前記細胞が、哺乳動物中に存在する、方法。
請求項４８に記載の方法であって、前記接触させる工程の前に、
前記細胞を、前記キメラタンパク質に、該キメラタンパク質の細胞取り込みを誘導するに有効な条件下で曝露する工程、
をさらに包含する、方法。
請求項４８に記載の方法であって、前記キメラタンパク質が、配列番号２のアミノ酸配列または配列番号４のアミノ酸配列を含む、方法。
請求項４８に記載の方法であって、前記接触させる工程は、
前記細胞中のアポリポタンパク質ＢｍＲＮＡを、第２のキメラタンパク質と接触させる工程、
をさらに包含し、
該第２のキメラタンパク質は、（ｉ）第１のポリペプチドと（ｉｉ）第２のポリペプチドとを含み、該第１のポリペプチドは、タンパク質形質導入ドメインを含み、該第２のポリペプチドは、アポリポタンパク質ＢｍＲＮＡに結合し得る、ＡＣＦまたはそのフラグメントを含む、方法。
請求項５３に記載の方法であって、前記第２のキメラタンパク質が、配列番号６のアミノ酸配列または配列番号８のアミノ酸配列を含む、方法。
血清ＬＤＬレベルを減少させる方法であって、
患者の１つ以上の細胞に、該細胞を遺伝子改変することなく、アポリポタンパク質ＢをコードするｍＲＮＡを編集し得るＡＰＯＢＥＣ−１またはそのフラグメントを含む一定量のタンパク質を送達する工程、
を包含し、
該量は、該１つ以上の細胞により血清中に分泌されるＶＬＤＬ−アポリポタンパク質Ｂ４８の濃度を増加させるに有効であり、結果として、ＬＤＬの血清の濃度を減少させるに有効である、方法。
請求項５５に記載の方法であって、前記１つ以上の細胞が、肝細胞、腸細胞、またはそれらの組み合わせである、方法。
請求項５５に記載の方法であって、前記患者が哺乳動物である、方法。
請求項５７に記載の方法であって、前記哺乳動物がヒトである、方法。
請求項５５に記載の方法であって、前記送達する工程が、
前記１つ以上の細胞を、前記タンパク質に、該タンパク質の細胞取り込みを引き起こすに有効な条件下で曝露する工程、
を包含する、方法。
請求項５９に記載の方法であって、前記タンパク質がキメラタンパク質であり、該キメラタンパク質が、タンパク質形質導入ドメインを含むポリペプチドをさらに含む、方法。
請求項６０に記載の方法であって、前記キメラタンパク質が、配列番号２のアミノ酸配列または配列番号４のアミノ酸配列を含む、方法。
請求項５９に記載の方法であって、前記タンパク質が、肝細胞により取り込まれるリポソーム中またはニオソーム中に存在する、方法。
請求項５５に記載の方法であって、前記送達する工程が、
前記患者の１つ以上の細胞中に、該細胞を遺伝子改変することもなく、一定量の第２のタンパク質を同時に送達する工程、
をさらに包含し、該第２のタンパク質が、アポリポタンパク質ＢｍＲＮＡに結合し得る、ＡＣＦまたはそのフラグメントを含む、
方法。
請求項６３に記載の方法であって、前記同時に送達する工程が、
前記１つ以上の細胞を、前記第２のタンパク質に、該第２のタンパク質の細胞取り込みを引き起こすに有効な条件下で曝露する工程、
を包含する、方法。
請求項６４に記載の方法であって、前記第２のタンパク質がキメラタンパク質であり、該キメラタンパク質が、タンパク質形質導入ドメインを含むポリペプチドをさらに含む、方法。
請求項６５に記載の方法であって、前記キメラタンパク質が、配列番号６のアミノ酸配列または配列番号８のアミノ酸配列を含む、方法。
請求項５５に記載の方法であって、
前記送達する工程を、遅延の後に反復する工程、
をさらに包含する、方法。
請求項６７に記載の方法であって、前記遅延が、約１日〜約７日である、方法。
アテローム発生疾患またはアテローム発生障害を処置または予防する方法であって、
アポリポタンパク質ＢをコードするｍＲＮＡを編集し得るＡＰＯＢＥＣ−１またはそのフラグメントを含む、有効量のタンパク質を、患者に投与する工程、
を包含し、
該タンパク質を投与する工程の際に、血清中にＶＬＤＬ−アポリポタンパク質Ｂを合成および分泌し得る１つ以上の細胞により分泌されるＶＬＤＬ−アポリポタンパク質Ｂ４８の濃度を増加するに有効な条件下で、該タンパク質が、該患者の該１つ以上の細胞により取り込まれ、それにより、血清からのＶＬＤＬ−アポリポタンパク質Ｂ４８の迅速な除去により、ＬＤＬの血清濃度が減少されて、該アテローム発生疾患またはアテローム発生障害を処置または予防する、方法。
請求項６９に記載の方法であって、前記患者が哺乳動物である、方法。
請求項７０に記載の方法であって、前記哺乳動物がヒトである、方法。
請求項６９に記載の方法であって、前記投与する工程が、経口的にか、局所的にか、経皮的にか、非経口的にか、皮下的にか、静脈内にか、筋肉内にか、腹腔内にか、腔内性点滴注入によるかもしくは嚢内点滴注入によるか、眼内にか、動脈内にか、病変内にか、粘膜への適用によるか、または移植により、実行される、方法。
請求項６９に記載の方法であって、前記タンパク質がキメラタンパク質であり、該キメラタンパク質が、タンパク質形質導入ドメインをさらに含む、方法。
請求項７３に記載の方法であって、前記キメラタンパク質が、配列番号２のアミノ酸配列または配列番号４のアミノ酸配列を含む、方法。
請求項６９に記載の方法であって、前記タンパク質が、肝細胞により取り込まれるリポソーム中またはニオソーム中に存在する、方法。
請求項６９に記載の方法であって、前記送達する工程が、
前記患者に、有効量の第２のタンパク質を第２回投与する工程、
をさらに包含し、該第２のタンパク質が、アポリポタンパク質ＢｍＲＮＡに結合し得る、ＡＣＦまたはそのフラグメントを含む、
方法。
請求項７６に記載の方法であって、前記第２回送達する工程が、同時に実行される、方法。
請求項７６に記載の方法であって、前記第２のポリペプチドがキメラタンパク質であり、該キメラタンパク質が、タンパク質形質導入ドメインをさらに含む、方法。
請求項７８に記載の方法であって、前記キメラタンパク質が、配列番号６のアミノ酸配列または配列番号８のアミノ酸配列を含む、方法。
請求項６９に記載の方法であって、
前記投与する工程を、遅延の後に反復する工程、
をさらに包含する、方法。
請求項８０に記載の方法であって、前記遅延が、約１日〜約７日である、方法。
肝細胞による取り込みのために標的化されたリポソームまたはニオソームであって、
（ｉ）アポリポタンパク質ＢｍＲＮＡを編集するに有効な、ＡＰＯＢＥＣ−１またはそのフラグメント、（ｉｉ）アポリポタンパク質ＢｍＲＮＡに結合するに有効な、ＡＣＦまたはそのフラグメント、あるいは（ｉｉｉ）それらの組み合わせ、
を含む、リポソームまたはニオソーム。
リポソームの形態の請求項８２に記載のリポソームまたはニオソームであって、脂質二重層中に組み込まれたアシアロフェチュインを含む、リポソームまたはニオソーム。
ポリオキシエチレン表面を有するニオソームの形態の請求項８２に記載のリポソームまたはニオソームであって、ドキソルビシンを含む、リポソームまたはニオソーム。
請求項８２に記載のリポソームまたはニオソームであって、該リポソームまたはニオソームは、アポリポタンパク質ＢｍＲＮＡを編集するに有効な、ＡＰＯＢＥＣ−１またはそのフラグメントを含む、リポソームまたはニオソーム。
請求項８２に記載のリポソームまたはニオソームであって、該リポソームまたはニオソームは、アポリポタンパク質ＢｍＲＮＡに結合するに有効な、ＡＣＦまたはそのフラグメントを含む、リポソームまたはニオソーム。
請求項８２に記載のリポソームまたはニオソームであって、該リポソームまたはニオソームは、アポリポタンパク質ＢｍＲＮＡを編集するに有効な、ＡＰＯＢＥＣ−１またはそのフラグメントと、アポリポタンパク質ＢｍＲＮＡに結合するに有効な、ＡＣＦまたはそのフラグメントとの組み合わせ、を含む、リポソームまたはニオソーム。
組成物であって、
薬学的に受容可能なキャリアと、
請求項８２に記載のリポソームまたはニオソームと、
を含む、組成物。
d