CN113234745B - 利用PTD-Tat实现海洋微生物低温脂肪酶基因的跨膜转导方法 - Google Patents

Abstract

本发明适用于跨膜转导基因片段与脂肪酶的融合表达技术领域，提供了一种利用PTD‑Tat实现海洋微生物低温脂肪酶基因的跨膜转导方法，包括如下步骤：1、设计获得Lipase‑tat融合基因；2、构建pET28a‑Lipase‑tat载体：首先，应用Nco I和Xho I酶切Lipase‑tat，胶回收酶切片段；然后应用Nco I和Xho I酶切pET28a载体，胶回收获得线性化的pET28a载体片段；再连接酶切片段和pET28a载体片段，得到重组表达载体质粒；3、Lipase‑tat蛋白原核表达与纯化提取。借此，本发明能够实现海洋微生物低温脂肪酶基因的跨膜转导，使重组蛋白制备成的减肥药物能够进入细胞；同时为PTD‑Tat基因和海洋微生物低温脂肪酶基因的跨膜转导机理及其蛋白类药物递送方面的有效应用提供理论与实践依据。

Description

利用PTD-Tat实现海洋微生物低温脂肪酶基因的跨膜转导 方法

技术领域

本发明涉及跨膜转导基因片段与脂肪酶的融合表达技术领域，尤其涉及一种利用PTD-Tat实现海洋微生物低温脂肪酶基因的跨膜转导方法。

背景技术

随着社会经济的发展，肥胖症作为一种多因素的慢性代谢性疾病逐日增多，且在近20年来达到历史高峰，目前减肥浪潮正以席卷之势遍及全球。现今药物减肥几乎全部采用脂肪酶抑制剂，其工作原理是通过抑制肠道中脂肪酶对已经进入人体但尚未形成人体脂肪的物质的分解催化作用，达到减少人体对物质中脂肪的吸收的目的，从而控制和治疗肥胖。但是脂肪酶抑制剂只能在肠道中起作用，并不能进入人体细胞，另外，药物减肥存在着使身体器管异常工作，长期服用会引起脂溶性维生素吸收减少，而且停药之后马上反弹等弊端。

海洋微生物低温脂肪酶是海洋微生物来源的新型脂肪酶，具有较低的活化能和极高的催化常数，在生物制药领域有着广阔的应用前景。但是现阶段对于海洋微生物低温脂肪酶在减肥方向上的应用也是集中在脂肪酶抑制剂的筛选及其在体内的代谢调控中。

目前，大量研究表明PTD-Tat具有强大的运载潜能。PTD-Tat不仅可以携DNA、反义核酸、脂质体、颗粒（诸如人造血CD34+细胞、人NK细胞、人的CD4+淋巴细胞、老鼠神经细胞和老鼠脾细胞）以及富含Arg药物等无机物实现体内外的跨膜递送，其中富含精氨酸的肽身兼递送载体和药物的双重身份。同时，研究发现，喷洒在动物皮肤表面的PTD-Tat融合蛋白，能高效穿透表皮及真皮到达深层组织并保持酶活。

如果使用PTD-Tat运载海洋微生物低温脂肪酶基因，实现跨膜转导，其不仅能够在肠道中对已经进入人体但尚未形成人体脂肪的物质进行分解，还能进入到人体深层组织中进行药物作用，这种减肥方式将是一种全新的减肥思路，但是，关于利用PTD-Tat进行脂肪酶跨膜转导的方法尚未见研究报道。

综上可知，现有技术在实际使用上显然存在不便与缺陷，所以有必要加以改进。

发明内容

针对上述的缺陷，本发明的目的在于提供一种利用PTD-Tat实现海洋微生物低温脂肪酶基因的跨膜转导方法，其将PTD-Tat基因与海洋微生物低温脂肪酶基因进行融合，并分离纯化出高表达的重组蛋白，实现海洋微生物低温脂肪酶的跨膜转导；重组蛋白制备成减肥药物后，能够伸入人体深层组织进行作用，且蛋白药物不会影响人体器官的正常工作，也不会影响人体吸收其他营养物质，停药后不会发生反弹。

为了实现上述目的，本发明提供一种利用PTD-Tat实现海洋微生物低温脂肪酶基因的跨膜转导方法，包括如下步骤：

步骤一 Lipase-tat融合基因的设计及获得

登录GeneBank得到海洋微生物低温脂肪酶基因序列，根据文献查阅得到PTD-Tat基因片段序列，将PTD-Tat基因片段与海洋微生物低温脂肪酶基因连接，得到融合基因Lipase-tat。

步骤二 pET28a-Lipase-tat载体的构建

A1 应用Nco I和Xho I酶切Lipase-tat，胶回收酶切片段；

A2应用Nco I和Xho I酶切pET28a载体，胶回收获得线性化的pET28a载体片段；

A3连接所述酶切片段和pET28a载体片段，将连接产物导入感受态细胞DH5α进行转化，菌落PCR检测；将PCR检测获得的阳性菌落扩大培养，提取质粒并进行序列测定，得到pET28a-Lipase-tat重组表达载体质粒。

步骤三 Lipase-tat蛋白原核表达与纯化提取

B1蛋白原核表达：用所述pET28a-Lipase-tat重组表达载体质粒转化表达菌株感受态细胞，得到诱导表达后的菌液；

B2分离纯化：将诱导表达后的菌液进行分离纯化，得到纯化重组蛋白；

B3活力检测：检测所述纯化重组蛋白的活力。

根据本发明的利用PTD-Tat实现海洋微生物低温脂肪酶基因的跨膜转导方法，所述步骤二中的A1步骤中，酶切Lipase-tat过程中的酶切体系为：Lipase-tat基因，10×FastDiges Buffer，NcoI ，XhoI，去离子水，33-40℃孵育8-15min，然后60-70℃孵育10-20min；将酶切产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，并将目的片段切胶回收，备用。

根据本发明的利用PTD-Tat实现海洋微生物低温脂肪酶基因的跨膜转导方法，所述步骤二中的A2步骤中，酶切体系为：pET28a质粒，10×FastDigest Buffer，Nco I，Xho I，去离子水，30-45℃孵育8-15min；将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回收，备用。

根据本发明的利用PTD-Tat实现海洋微生物低温脂肪酶基因的跨膜转导方法，所述步骤二中的A3步骤中，连接所述酶切片段和pET28a载体片段过程中的连接体系为：T4DNA ligase，10×T4 ligase Buffer，线性化的pET28a载体片段，Lipase-tat片段，20-25℃连接8-15min。

根据本发明的利用PTD-Tat实现海洋微生物低温脂肪酶基因的跨膜转导方法，所述步骤三中的B1步骤中，蛋白原核表达的具体步骤为：

a1将所述pET28a-Lipase-tat重组表达载体质粒加入到感受态细胞中，冰上静置后热激，迅速再放入冰上，加入LB培养液；然后均匀地涂布于含Amp的LB培养皿中，倒置培养，菌落PCR检测；

a2挑取PCR检测得到的阳性单克隆菌落到含Amp的LB培养液中，菌液与培养液的体积比为1：100，然后接种于LB培养液中震荡培养，继续扩大培养，摇至菌液OD ₆₀₀为0.6-0.8时，菌液中加入IPTG，继续震荡培养6h，诱导Lipase-tat蛋白表达。

根据本发明的利用PTD-Tat实现海洋微生物低温脂肪酶基因的跨膜转导方法，所述步骤三中的B2步骤中，分离纯化步骤为：

b1将诱导表达后的菌液进行离心，收集菌体沉淀，用BugBuster菌体裂解液重悬菌体沉淀，振荡孵育后收集包涵体沉淀，加包涵体增溶试剂，然后振荡孵育，离心，得到上清液；

b2将所述上清液注入透析卡中，将透析卡放于尿溶液透析，逐步降低尿素浓度，再将透析卡放于Tris•HCl和NaCl混合溶液，再次透析；然后离心取上清，得Lipase-tat粗蛋白溶液；

b3平衡镍柱后将所述粗蛋白溶液上样，用Binding-Buffer冲洗，再次平衡镍柱；以梯度的Elution Buffer混合液洗脱镍柱，并监测OD₂₈₀值，收集蛋白吸收峰对应的洗脱液，并透析过夜，得到较纯的重组蛋白。

本发明的目的在于提供一种利用PTD-Tat实现海洋微生物低温脂肪酶基因的跨膜转导方法，将PTD-Tat基因与海洋微生物低温脂肪酶基因进行融合，并对融合基因进行优化，分离纯化出高表达的重组蛋白，实现海洋微生物低温脂肪酶的跨膜转导；同时利用细胞实验验证重组蛋白的跨膜转导机制以及跨膜后重组蛋白的活性。本发明通过上述方法，实现了海洋微生物低温脂肪酶的活体跨膜递送，并提供出一种新型的减肥用蛋白药物，该蛋白药物能够伸入人体深层组织进行作用，减肥效果更高效，且蛋白药物不会影响人体器官的正常工作，也不会影响人体吸收其他营养物质，停药后不会发生反弹。综上所述，本发明的有益效果是：为治疗性蛋白药物的应用提供了一个新的且可最大限度地降低治疗药物的副作用的有效途径，为新型减肥药物的开发奠定了理论实验基础，也为减肥方式的改变提供新的思路，同时为PTD-Tat基因和海洋微生物低温脂肪酶基因的跨膜转导机理及其蛋白类药物递送方面的有效应用提供理论与实践依据，为临床应用大分子药物有效治疗脑血管、肿瘤等疾病开辟了广阔的前景。

附图说明

图1是本发明重组表达载体DNA电泳图；

图2是本发明 Lipase-tat原核表达及分离纯化SDS-PAGE电泳图；

图3是本发明 BSA蛋白标准曲线；

图4是细胞毒性检测结果；

图5是荧光倒置显微镜观察重组蛋白跨膜图；

图6是重组蛋白免疫印迹图；

图1中M为DL2000 DNA Marker；1和2为阳性克隆菌落；

图2中，M为Marker；1为镍柱纯化后的 Lipase-tat；2和3均为经IPTG诱导表达的重组蛋白；4和5均为未经IPTG诱导的重组蛋白；

图6中，M为marker泳道、1泳道里为1mg/mL蛋白上样，2泳道里为0.75mg/mL蛋白上样。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明提供了一种利用PTD-Tat实现海洋微生物低温脂肪酶基因的跨膜转导方法，包括如下步骤：

步骤一 Lipase-tat融合基因的设计及获得

通过人工合成得到目的基因Lipase-tat片段，PCR扩增以保存，并用于后续实验。

登录GeneBank得到海洋微生物低温脂肪酶基因序列，根据文献查阅得到PTD-Tat基因片段序列，将PTD-Tat基因片段连接在海洋微生物低温脂肪酶基因的下游，添加酶切位点NcoI到XhoI，此为融合基因Lipase-tat，并对该基因进行优化。

Lipase-tat融合基因序列（未添加NcoI 、XhoI酶切位点和启动子）如下：CTGCCATCTGGTTCTGATCCGGCATTTAGTCAGCCAAAAAGCGTGCTGGACGCAGGTCTGACCTGTCAAGGCGCAAGTCCAAGTAGCGTCTCTAAACCGATTCTGCTGGTTCCAGGTACGGGTACCACCGGTCCACAAAGTTTTGATAGCAACTGGATTCCGCTGAGTACCCAACTGGGTTATACCCCGTGTTGGATTAGTCCACCGCCATTCATGCTGAACGATACCCAGGTCAACACCGAATACATGGTCAACGCGATTACCGCACTGTATGCAGGTAGCGGCAATAACAAACTGCCGGTTCTGACCTGGAGTCAAGGCGGTCTGGTTGCACAGTGGGGTCTGACCTTTTTCCCGAGTATTCGCAGCAAAGTCGATCGTCTGATGGCATTTGCGCCGGATTACAAAGGTACCGTTCTGGCAGGTCCACTGGACGCACTGGCAGTTTCTGCACCGAGCGTGTGGCAACAAACCACCGGTTCTGCACTGACCACCGCACTGCGTAACGCAGGCGGTCTGACCCAAATTGTTCCAACCACCAACCTGTATAGCGCGACCGACGAAATTGTCCAACCGCAAGTTAGCAATAGTCCGCTGGATTCCAGCTACCTGTTCAACGGCAAAAACGTCCAGGCACAAGCTGTTTGCGGTCCGCTGTTTGTTATTGATCACGCAGGTTCTCTGACCAGCCAGTTTAGCTACGTTGTTGGTCGTAGCGCACTGCGTAGTACCACCGGTCAAGCACGTTCTGCAGATTACGGCATTACCGATTGCAACCCACTGCCAGCAAACGATCTGACCCCAGAACAGAAAGTTGCAGCAGCAGCACTGCTGGCACCAGCAGCAGCAGCAATTGTAGCAGGTCCAAAACAGAACTGCGAACCGGATCTGATGCCATACGCACGTCCATTTGCAGTTGGTAAACGCACCTGTTCTGGTATTGTTACCCCATACGGTCGCAAAAAACGTCGTCAACGTCGTCGT

上述基因序列中，前951 个碱基组成的基因片段为海洋微生物低温脂肪酶基因片段，后33 个碱基组成的基因片段为PTD-Tat基因片段。

步骤二 pET28a-Lipase-tat载体的构建

A1应用Nco I（Thermo）和Xho I（Thermo）酶切Lipase-tat，胶回收酶切片段。

酶切体系为：Lipase-tat基因1-2 μg，10×FastDiges Buffer 2-4 μL，NcoI 1-2μL，XhoI 0.5-2.5μL，加去离子水至25-35 μL，33-40℃孵育(酶切）8-15min，然后60-70℃孵育（灭活）10-20min；将酶切产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，并将目的片段切胶回收，测定浓度，存于-20℃，备用。

A2应用Nco I（Thermo）和Xho I（Thermo）酶切pET28a载体（Thermo），胶回收获得线性化的pET28a载体片段。

酶切体系为：pET28a质粒1.5-3μg，10×FastDigest Buffer 2-4μL，Nco I 0.5-2μL，Xho I 0.5-2μL，加去离子水至25-35μL，30-45℃孵育8-15min；将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回收，测定浓度，存于-20℃，备用。

A3连接上述两步获得的酶切片段和pET28a载体片段，将连接产物导入感受态细胞DH5α进行转化，菌落PCR检测；其中，阳性菌落扩大培养，提取质粒并进行序列测定，得到pET28a-Lipase-tat重组表达载体质粒。

连接体系为：0.5-1.5μL T4 DNA ligase（Thermo），1.5-2.5μL 10×T4 ligaseBuffer（Thermo），线性化的pET28a载体片段25-35ng，Lipase-tat片段25-35ng，加水至15-25μL，20-25℃连接8-15min。重组表达载体 DNA 电泳结果见图1。

步骤三 Lipase-tat蛋白原核表达与纯化提取

B1蛋白原核表达：用pET28a-Lipase-tat重组表达载体质粒转化表达菌株感受态细胞（Rosseta DE3）。

具体步骤为：将pET28a-Lipase-tat重组表达载体质粒5-15μL加入到80-120μL 感受态细胞中，冰上静置25-40min；40-45℃热激85-95s，迅速放入冰上2.5-4min，加入0.8-1mL LB培养液（不含抗生素）；35-40℃，120-160 rpm震荡培养0.8-1.3h后，均匀地涂布于含45-60μg/mL Amp的LB培养皿中，35-40℃倒置培养10-15h，菌落PCR检测，挑取阳性单克隆菌落到1.8-3.5mL的含45-60 μg/mL Amp的LB培养液中，35-40℃，120-160 rpm震荡培养10-15h后，菌液与培养液体积比为1：100的比例，接种于8-12mL的LB培养液中，35-40℃，120-160rpm震荡培养10-15h，继续扩大培养到80-120 mL的LB培养液中，摇至菌液OD ₆₀₀为0.6-0.8时，菌液中加入IPTG至终浓度为0.8-1.2 mM，35-40℃，120-160 rpm继续震荡培养4-7h，诱导Lipase-tat蛋白表达。

取0.8-1.2mL菌液离心收集菌体，加入90-110 μL 1x上样缓冲液重悬菌体沉淀，进行12％SDS-PAGE分析，分析结果见图2，结果显示：在IPTG在终浓度0.5mM，37℃，6h下，菌株Rosseta DE3 能够成功高表达Lipase-tat蛋白，活性检测显示以包涵体的形式为主。

B2分离纯化

将诱导表达后的菌液在3-5℃，7600-8400g，离心8-12min，收集菌体沉淀，用5mL/gBugBuster菌体裂解液（Novangen）重悬菌体沉淀，35-40℃，120-160 rpm，振荡孵育25-35min。7600-8400rpm，8-12 min，收集包涵体沉淀，加包涵体增溶试剂（8mL/g）。35-40℃、120-170 rpm，25-35 min，振荡孵育。7600-8400rpm，12-18min离心。将上清注入透析卡（Thermo，截留分子量分为20k）中。将透析卡放于1L 6M尿溶液透析10-14h，逐步降低尿素浓度至1.8-2.2M，再将透析卡放于2L的25mM Tris•HCl（pH 7.5）和150mM NaCl混合溶液，再次透析5-7h。透析均在3-5℃进行（保持蛋白活力）。10000-13000rpm，离心8-12 min，留取上清，得Lipase-tat粗蛋白溶液。利用低压层析系统，上样前，使用10倍柱体积的Binding Buffer（20 mM Na₂HPO₄-NaH₂PO₄, pH 7.4, 500 mM NaCl, 5 mM 咪唑）以4-6mL/min的流速平衡镍柱（HisTrap TM HP，GE）。粗蛋白溶液以0.8-1.2ml/min流速上样；用10倍柱体积的Binding-Buffer以4-6ml/min流速冲洗，再次平衡镍柱以去除未结合上的蛋白；以梯度的ElutionBuffer（20 mM Na₂HPO₄-NaH₂PO₄, pH 7.4, 500 mM NaCl, 500 mM 咪唑）/Binding Buffer混合液洗脱镍柱，流速为4-6mL/min，并监测OD₂₈₀值，收集蛋白吸收峰对应的洗脱液，并透析过夜，SDS-PAGE分析。如图2所示，Lipase-tat蛋白纯化后杂质含量明显减少，可以得到较纯的重组蛋白。

B3活力检测

考马斯亮蓝法用BSA标准品绘制标准曲线及检测样品蛋白浓度；对硝基苯酚辛酸酯检测酶活力。

蛋白标准曲线见图3，曲线方程：y=124.61x+0.4866，R²=0.9991，其中x为595nm吸光度，y为蛋白浓度（μg/ml）。

分别测蛋白样品的吸光度（A），与标准曲线对照。结果显示，发酵液重组蛋白的浓度可达240 ug/ml，通过IPTG诱导，能够实现重组蛋白的高表达。

本发明通过上述方法，将PTD-Tat基因连接到海洋微生物低温脂肪酶基因上，实现基因融合，并制备出重组蛋白，借助PTD-Tat基因的跨膜运载功能，将海洋微生物低温脂肪酶运载到动物体深层组织中，实现海洋微生物低温脂肪酶基因的跨膜转导，使海洋微生物低温脂肪酶在深层组织中发挥作用，而不仅仅如传统药物一样，只在肠道中抑制脂肪分解。

本发明PTD-Tat基因与海洋微生物低温脂肪酶基因融合后制得的重组蛋白，制成药物之后，可以通过口服、涂抹、注射等方式使用，根据不同的使用方式，可以将重组蛋白药物制成液体、胶囊、片剂等不同形式的药物，当然，根据不同形式的药物，也可以在重组蛋白中加入调节口感、调节浓度、调节形态等的不同类型的辅药，本发明中的辅药类型包括但不限于上述几种。

为了验证本发明重组蛋白的跨膜转导机制，本发明还进行细胞学实验，具体实验步骤如下：

C1 SH-SY5Y细胞的培养

取本实验室里冻存的SH-SY5Y细胞，快速37℃解冻；用吸管快速将细胞吸入离心管中，1000rpm离心5min；弃去冻存液，继续加入1ml 培养液（含血清的DMEM），1000rpm离心5min，将残留的冻存液去除干净；加5ml培养基并将细胞转移到细胞培养瓶中，37℃培养过夜；细胞贴壁后更换培养基，继续37℃培养至细胞长满整个细胞瓶的底面；弃掉培养液，用1ml Hanks液将残留的培养液冲洗下来，洗涤3次；倒掉Hanks液，滴加胰蛋白酶液，在37℃的环境中消化3min，使大部分细胞从细胞培养瓶底部脱离下来，用1ml培养基终止消化；吹洗瓶壁尽量使所有的细胞都能够从细胞培养瓶壁；吸取混合液至15ml的离心管，1000rpm离心5min；弃上清，加入1ml Hanks液吹打混匀，1000rpm离心5min，重复3 次以将残余的酶液与培养基洗涤干净；向离心管中加入1ml的含血清的 DMEM 培养基，吹打混匀并进行细胞计数，将细胞分瓶后37℃继续进行培养。

C2 细胞毒性检测

镜下观察细胞量，胰酶-EDTA消化，离心，培养基悬浮细胞沉淀团，96孔细胞培养板每孔加入约100µL细胞悬液（已调整悬液浓度），边缘36个孔加细胞实验用PBS（防蒸发），空白5个孔用培养基（扣除吸光度干扰）填充；5% CO₂，37℃培养，挑选观察孔，查看细胞数量，加梯度浓度（培养基稀释）蛋白，每孔100µL；阴性组、空白组，以PBS替换蛋白溶液。均设5个复孔；5% CO₂，37℃孵育约8个小时；每孔（除边缘36个防蒸发孔）加20µLMTT，连续培养4个小时；终止培养，微量移液器吸取溶液，边缘孔不用吸；每孔（除边缘36个防蒸发孔）速加150µLDMSO，缓摇20min，酶联仪精确；分析结果并计算细胞存活率。

细胞毒性检测结果见图4，由图 4可见，融合蛋白对细胞活力具有低毒性作用。而且，浓度越低，对细胞活力的影响越低。

C3 细胞荧光标记

培养SH-SY5Y细胞，细胞铺满培养瓶后，正常消化，1000rpm离心5min，细胞计数后接种于6孔板中，培养24h后，吸出培养液，用PBS洗涤2~3次，加入无血清的培养液各1ml，在黑暗条件下，加入不同浓度FITC荧光标记的本发明制备的重组蛋白质（每mg蛋白溶液加入0.01mgFITC，并透析过夜）溶液（0，25，50，100，200 μg/ml）。用锡箔纸包好，放入细胞培养箱中培养30min，吸出培养液，PBS 洗涤2～3次，分别加入1ml PBS后，荧光显微镜下观察重组蛋白是否具有跨SH-SY5Y细胞膜的能力。荧光倒置显微镜观察重组蛋白跨膜效果见图5。

结果显示，培养30min，白光下观察到细胞多聚集性单层生长，呈上皮样，单个细胞有胞体（小、圆）、轴突（较短）、胞质（较少）与树突样突起（较少），即为SH-SY5Y细胞的正常细胞形态。同一视角荧光下呈现明亮的黄绿色，说明重组蛋白具有生物膜穿透作用。

C4 Western Blot检测

在培养的细胞中加入不同浓度重组蛋白质（0，25，50，100，200 μg/ml）。放入细胞培养箱中培养30min，吸出培养液，PBS洗涤2～3次，分别加入1ml PBS 后，12000rpm，5min。弃去上清液，加40µLPBS(0.01mol/L)，混悬细胞。再添加10µL电泳蛋白上样缓冲液，混匀。100℃沸水煮5min；12000rpm离心5min后上样电泳。浓缩胶，80-100V，约40min；分离胶，150V，约1h。电泳后转PVDF膜100mA，1h，免疫印迹。重组蛋白免疫印迹图见图6。

采用蛋白免疫印迹检测到细胞内有重组蛋白的存在，与预期蛋白质以及前期SDS-PAGE实验检测的分子量一致，重组蛋白本身并未因穿膜而降低分子量。1、2 泳道显示轻微的剂量依赖性。

通过上述实验表明，本发明中由PTD-Tat基因与海洋微生物低温脂肪酶基因融合制得的重组蛋白，能够很好的进行跨膜转导，且跨膜转导之后仍然具有非常高的活性。

本发明将PTD-Tat基因与海洋微生物低温脂肪酶基因进行融合，以基因融合的形式构建了PTD-Tat与低温脂肪酶重组蛋白，并通过细胞实验检测了PTD-Tat携带海洋微生物低温脂肪酶穿过细胞膜的情况，探索了重组蛋白的转导机制。

本发明PTD-Tat基因与海洋微生物低温脂肪酶融合后的重组蛋白，不同于传统化学药物，只能在肠道中发挥作用的方法，该重组蛋白实现跨膜转导且属于蛋白类药物，能够进入到人体细胞中作用，且不会对人体产生副作用。

综上所述，本发明将PTD-Tat基因与海洋微生物低温脂肪酶基因进行融合，并对融合基因进行优化，分离纯化出高表达的重组蛋白，实现海洋微生物低温脂肪酶的跨膜转导；同时利用细胞实验验证重组蛋白的跨膜转导机制以及跨膜后重组蛋白的活性。本发明通过上述方法，实现了海洋微生物低温脂肪酶的活体跨膜递送，并提供出一种新型的减肥用蛋白药物，该蛋白药物能够伸入人体细胞进行作用，但不会影响人体吸收其他营养物质。综上所述，本发明的有益效果是：为治疗性蛋白药物的应用提供了一个新的且可最大限度地降低治疗药物的副作用的有效途径，为新型减肥药物的开发奠定了理论实验基础，也为减肥方式的改变提供新的思路，同时为PTD-Tat基因和海洋微生物低温脂肪酶基因的跨膜转导机理及其蛋白类药物递送方面的有效应用提供理论与实践依据，为临床应用大分子药物有效治疗脑血管、肿瘤等疾病开辟了广阔的前景。

当然，本发明还可有其它多种实施例，在不背离本发明精神及其实质的情况下，熟悉本领域的技术人员当可根据本发明作出各种相应的改变和变形，但这些相应的改变和变形都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。

序列表

<110> 山东祥维斯生物科技股份有限公司、潍坊医学院

<120> 利用PTD-Tat实现海洋微生物低温脂肪酶基因的跨膜转导方法

<130> WF

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 951

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 1

ctgccatctg gttctgatcc ggcatttagt cagccaaaaa gcgtgctgga cgcaggtctg 60

acctgtcaag gcgcaagtcc aagtagcgtc tctaaaccga ttctgctggt tccaggtacg 120

ggtaccaccg gtccacaaag ttttgatagc aactggattc cgctgagtac ccaactgggt 180

tataccccgt gttggattag tccaccgcca ttcatgctga acgataccca ggtcaacacc 240

gaatacatgg tcaacgcgat taccgcactg tatgcaggta gcggcaataa caaactgccg 300

gttctgacct ggagtcaagg cggtctggtt gcacagtggg gtctgacctt tttcccgagt 360

attcgcagca aagtcgatcg tctgatggca tttgcgccgg attacaaagg taccgttctg 420

gcaggtccac tggacgcact ggcagtttct gcaccgagcg tgtggcaaca aaccaccggt 480

tctgcactga ccaccgcact gcgtaacgca ggcggtctga cccaaattgt tccaaccacc 540

aacctgtata gcgcgaccga cgaaattgtc caaccgcaag ttagcaatag tccgctggat 600

tccagctacc tgttcaacgg caaaaacgtc caggcacaag ctgtttgcgg tccgctgttt 660

gttattgatc acgcaggttc tctgaccagc cagtttagct acgttgttgg tcgtagcgca 720

ctgcgtagta ccaccggtca agcacgttct gcagattacg gcattaccga ttgcaaccca 780

ctgccagcaa acgatctgac cccagaacag aaagttgcag cagcagcact gctggcacca 840

gcagcagcag caattgtagc aggtccaaaa cagaactgcg aaccggatct gatgccatac 900

gcacgtccat ttgcagttggtaaacgcacctgttctggtattgttacccc a 951

<210> 2

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 2

ta cggtcgcaaa aaacgtcgtc aacgtcgtcg t 33

Claims (6)

1.一种利用PTD-Tat实现海洋微生物低温脂肪酶基因的跨膜转导方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一 Lipase-tat融合基因的设计及获得

登录GeneBank得到海洋微生物低温脂肪酶基因序列，根据文献查阅得到PTD-Tat基因片段序列，通过人工合成的方法将PTD-Tat基因片段与海洋微生物低温脂肪酶基因连接，并添加酶切位点Nco I和Xho I，得到融合基因Lipase-tat，并对所述融合基因Lipase-tat进行优化；

优化后的、未添加酶切位点Nco I和Xho I的Lipase-tat融合基因序列如下：CTGCCATCTGGTTCTGATCCGGCATTTAGTCAGCCAAAAAGCGTGCTGGACGCAGGTCTGACCTGTCAAGGCGCAAGTCCAAGTAGCGTCTCTAAACCGATTCTGCTGGTTCCAGGTACGGGTACCACCGGTCCACAAAGTTTTGATAGCAACTGGATTCCGCTGAGTACCCAACTGGGTTATACCCCGTGTTGGATTAGTCCACCGCCATTCATGCTGAACGATACCCAGGTCAACACCGAATACATGGTCAACGCGATTACCGCACTGTATGCAGGTAGCGGCAATAACAAACTGCCGGTTCTGACCTGGAGTCAAGGCGGTCTGGTTGCACAGTGGGGTCTGACCTTTTTCCCGAGTATTCGCAGCAAAGTCGATCGTCTGATGGCATTTGCGCCGGATTACAAAGGTACCGTTCTGGCAGGTCCACTGGACGCACTGGCAGTTTCTGCACCGAGCGTGTGGCAACAAACCACCGGTTCTGCACTGACCACCGCACTGCGTAACGCAGGCGGTCTGACCCAAATTGTTCCAACCACCAACCTGTATAGCGCGACCGACGAAATTGTCCAACCGCAAGTTAGCAATAGTCCGCTGGATTCCAGCTACCTGTTCAACGGCAAAAACGTCCAGGCACAAGCTGTTTGCGGTCCGCTGTTTGTTATTGATCACGCAGGTTCTCTGACCAGCCAGTTTAGCTACGTTGTTGGTCGTAGCGCACTGCGTAGTACCACCGGTCAAGCACGTTCTGCAGATTACGGCATTACCGATTGCAACCCACTGCCAGCAAACGATCTGACCCCAGAACAGAAAGTTGCAGCAGCAGCACTGCTGGCACCAGCAGCAGCAGCAATTGTAGCAGGTCCAAAACAGAACTGCGAACCGGATCTGATGCCATACGCACGTCCATTTGCAGTTGGTAAACGCACCTGTTCTGGTATTGTTACCCCATACGGTCGCAAAAAACGTCGTCAACGTCGTCGT

步骤二 pET28a-Lipase-tat载体的构建

A1 应用Nco I和Xho I酶切Lipase-tat，胶回收酶切片段；

A2应用Nco I和Xho I酶切pET28a载体，胶回收获得线性化的pET28a载体片段；

A3连接所述酶切片段和pET28a载体片段，将连接产物导入感受态细胞DH5α进行转化，菌落PCR检测；将PCR检测获得的阳性菌落扩大培养，提取质粒并进行序列测定，得到pET28a-Lipase-tat重组表达载体质粒；

步骤三 Lipase-tat蛋白原核表达与纯化提取

B1蛋白原核表达：用所述pET28a-Lipase-tat重组表达载体质粒转化表达菌株感受态细胞Rosseta DE3，得到诱导表达后的菌液；

B2分离纯化：将诱导表达后的菌液进行分离纯化，得到纯化重组蛋白；

B3活力检测：检测所述纯化重组蛋白的活力。

2.根据权利要求1所述的利用PTD-Tat实现海洋微生物低温脂肪酶基因的跨膜转导方法，其特征在于，所述步骤二中的A1步骤中，酶切Lipase-tat过程中的酶切体系为：Lipase-tat基因，10×FastDigest Buffer，NcoI ，XhoI，去离子水，33-40℃孵育8-15min，然后60-70℃孵育10-20min；将酶切产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，并将目的片段切胶回收，备用。

3.根据权利要求1所述的利用PTD-Tat实现海洋微生物低温脂肪酶基因的跨膜转导方法，其特征在于，所述步骤二中的A2步骤中，酶切体系为：pET28a质粒，10×FastDigestBuffer，Nco I，Xho I，去离子水，30-45℃孵育8-15min；将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回收，备用。

4.根据权利要求1所述的利用PTD-Tat实现海洋微生物低温脂肪酶基因的跨膜转导方法，其特征在于，所述步骤二中的A3步骤中，连接所述酶切片段和pET28a载体片段过程中的连接体系为：T4 DNA ligase，10×T4 ligase Buffer，线性化的pET28a载体片段，Lipase-tat片段，20-25℃连接8-15min。

5.根据权利要求1所述的利用PTD-Tat实现海洋微生物低温脂肪酶基因的跨膜转导方法，其特征在于，所述步骤三中的B1步骤中，蛋白原核表达的具体步骤为：

a1将所述pET28a-Lipase-tat重组表达载体质粒加入到感受态细胞中，冰上静置后热激，迅速再放入冰上，加入LB培养液；然后均匀地涂布于含Amp的LB培养皿中，倒置培养，菌落PCR检测；

a2挑取PCR检测得到的阳性单克隆菌落到含Amp的LB培养液中，菌液与培养液的体积比为1：100，然后接种于LB培养液中震荡培养，继续扩大培养，摇至菌液OD ₆₀₀ 为0.6-0.8时，菌液中加入IPTG，继续震荡培养6h，诱导Lipase-tat蛋白表达。

6.根据权利要求1所述的利用PTD-Tat实现海洋微生物低温脂肪酶基因的跨膜转导方法，其特征在于，所述步骤三中的B2步骤中，分离纯化步骤为：

b1将诱导表达后的菌液进行离心，收集菌体沉淀，用BugBuster菌体裂解液重悬菌体沉淀，振荡孵育后收集包涵体沉淀，加包涵体增溶试剂，然后振荡孵育，离心，得到上清液；

b2将所述上清液注入透析卡中，将透析卡放于尿溶液透析，逐步降低尿素浓度，再将透析卡放于Tris•HCl和NaCl混合溶液，再次透析；然后离心取上清，得Lipase-tat粗蛋白溶液；

b3平衡镍柱后将所述粗蛋白溶液上样，用Binding-Buffer冲洗，再次平衡镍柱；以梯度的Elution Buffer混合液洗脱镍柱，并监测OD₂₈₀值，收集蛋白吸收峰对应的洗脱液，并透析过夜，得到较纯的重组蛋白。

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