CN114891125B - 一种长效重组白细胞介素-18结合蛋白及其生产方法与应用 - Google Patents

一种长效重组白细胞介素-18结合蛋白及其生产方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种长效重组白细胞介素‑18结合蛋白及其生产方法与应用，属于生物技术领域。所述重组白细胞介素‑18结合蛋白包含人IL‑18BP亚型a的序列、人IgG Fc的序列，所述重组白细胞介素‑18结合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。还公开了生产所述的重组白细胞介素‑18结合蛋白的方法，将表达所述的融合蛋白的编码基因插入细胞表达载体，并将所述载体导入原核细胞中以表达重组白细胞介素‑18结合蛋白。本发明通过采用原核表达系统表达重组白细胞介素‑18结合蛋白，促进蛋白正确折叠，增强蛋白稳定性和降低体内降解速率，增强其生物学活性。

Description

一种长效重组白细胞介素-18结合蛋白及其生产方法与应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种长效重组白细胞介素-18结合蛋白及其生产方法与应用。
背景技术
白细胞介素-18(interleukin-18,IL-18)是一种由活化的单核细胞和树突状细胞产生的细胞因子，具有多种生物学功能。IL-18与IL-12协同作用可诱导自然杀伤细胞(natural killer cell,NK)和Th1细胞产生干扰素γ(interferon gamma,IFN-γ)。IL-18可以增强Fas介导的Th1细胞和NK细胞的细胞毒性作用，从而发挥抗感染和抗肿瘤活性。除了介导Th1反应外，IL-18还是一种巨噬细胞激活剂，可触发各种促炎细胞因子的产生，包括肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、IL-1、趋化因子IL-8和巨噬细胞炎症蛋白(macrophage-inflammatory protein,MIP)-1。有很多研究已经报道，IL-18在一些炎症性疾病和自身免疫性疾病中表达显著增高，是疾病潜在的诊断标志物。
白细胞介素-18结合蛋白(interleukin-18binding protein,IL-18BP)是一种组成型分泌蛋白，是天然的IL-18拮抗剂，可以结合IL-18并中和其活性，从而下调Th1细胞因子反应，减少IFN-γ的产生，阻断IL-18的生物学活性。然而，IL-18BP没有完整的跨膜结构，仅有一个免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig)结构域。在人IL-18BP的四种亚型中，IL-18BPa和c具有完整的Ig结构域，因此能够结合IL-18。其中IL-18BPa是结合能力最高的亚型。
截止目前，重组IL-18BP或IL-18BP融合蛋白的制备都是采用真核细胞，如猴COS7细胞、中华仓鼠CHO细胞(Raffaella Faggioni,2001)、SF9昆虫细胞，罕有采用原核细胞表达。因为IL-18BP作为一个真核分泌型蛋白，在原核系统中表达容易形成无活性包涵体结构，包涵体后期需要变性、复性，这些操作对重组蛋白的活性都产生一定程度的损害，由于复性效率的问题，还会影响后期的蛋白纯度，进而影响用药的安全性。因此，既要保证重组蛋白的生物学活性，又要满足今后规模化生产成本的考虑。
发明内容
本发明的目的是提供一种长效重组白细胞介素-18结合蛋白及其生产方法与应用，以解决上述现有技术存在的问题，通过采用原核表达系统表达重组白细胞介素-18结合蛋白，增加了重组蛋白产量，生成成本也大大降低。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种重组白细胞介素-18结合蛋白，所述重组白细胞介素-18结合蛋白包含编码人IL-18BP亚型a的序列和编码人IgG Fc的序列，所述重组白细胞介素-18结合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示：
TPVSQTTTAATASVRSTKDPCPSQPPVFPAAKQCPALEVTWPEVEVPLNGTLSLSCVACSRFPNFSIL YWLGNGSFIEHLPGRLWEGSTSRERGSTGTQLCKALVLEQLTPALHSTNFSCVLVDPEQVVQRHVVLAQLWAGLRA TLPPTQEALPSSHSSPQQQGGGGGSGGGGSGGGGSEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK。
优选的是，还包括修饰蛋白Sumo，所述修饰蛋白Sumo的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示：
MHHHHHHGMSDSEVNQEAKPEVKPEVKPETHINLKVSDGSSEIFFKIKKTTPLRRLMEAFAKRQGKEMDSLRFLYDGIRIQADQTPEDLDMEDNDIIEAHREQIGG。
进一步地，所述修饰蛋白Sumo的编码基因如SEQ ID NO：4所示：
ATGCATCATCATCATCATCACGGCATGTCGGACTCAGAAGTCAATCAAGAAGCTAAGCCAGAGGTCAAGCCAGAAGTCAAGCCTGAGACTCACATCAATTTAAAGGTGTCCGATGGATCTTCAGAGATCTTCTTCAAGATCAAAAAGACCACTCCTTTAAGAAGGCTGATGGAAGCGTTCGCTAAAAGACAGGGTAAGGAAATGGACTCCTTAAGATTCTTGTACGACGGTATTAGAATTCAAGCTGATCAGACCCCTGAAGATTTGGACATGGAGGATAACGATATCATTGAGGCTCACAGAGAACAGATTGGTGGT。
本发明还包括一种重组质粒，包括表达所述的重组白细胞介素-18结合蛋白的编码基因，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示：
ACACCTGTCTCGCAGACCACCACAGCTGCCACTGCCTCAGTTAGAAGCACAAAGGACCCCTGCCCCTC CCAGCCCCCAGTGTTCCCAGCAGCTAAGCAGTGTCCAGCATTGGAAGTGACCTGGCCAGAGGTGGAAGTGCCACTG AATGGAACGCTGAGCTTATCCTGTGTGGCCTGCAGCCGCTTCCCCAACTTCAGCATCCTCTACTGGCTGGGCAATG GTTCCTTCATTGAGCACCTCCCAGGCCGACTGTGGGAGGGGAGCACCAGCCGGGAACGTGGGAGCACAGGTACGCA GCTGTGCAAGGCCTTGGTGCTGGAGCAGCTGACCCCTGCCCTGCACAGCACCAACTTCTCCTGTGTGCTCGTGGAC CCTGAACAGGTTGTCCAGCGTCACGTCGTCCTGGCCCAGCTCTGGGCTGGGCTGAGGGCAACCTTGCCCCCCACCC AAGAAGCCCTGCCCTCCAGCCACAGCAGTCCACAGCAGCAGGGTGGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGATCTGGTGGTGGAGGTTCTGAACCAAAGTCTTGTGATAAGACTCACACTTGTCCACCATGTCCAGCTCCTGAACTTCTGGGTGGACCATCTGTCTTTCTTTTCCCACCAAAACCTAAGGACACTCTTATGATTTCCCGTACTCCTGAAGTCACTTGTGTTGTTGTGGACGTGAGTCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTTGACGGTGTTGAAGTTCATAATGCCAAGACTAAGCCTCGTGAAGAGCAATACAACAGTACTTACCGTGTTGTCAGTGTCCTTACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGTAAGGAGTACAAGTGTAAGGTCTCCAACAAGGCCCTTCCAGCCCCAATCGAGAAGACCATCTCCAAAGCCAAGGGTCAACCACGTGAACCACAAGTTTACACCCTGCCTCCATCCCGTGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGTCTGACTTGTCTGGTCAAGGGTTTCTATCCTTCCGACATCGCTGTTGAGTGGGAGTCCAACGGTCAACCAGAAAACAACTACAAGACCACCCCTCCAGTTCTTGACTCCGACGGTTCCTTCTTCCTTTACTCCAAGCTTACCGTTGACAAGTCCAGATGGCAACAAGGTAACGTTTTCTCATGTTCCGTTATGCACGAAGCTCTGCACAACCACTACACTCAAAAGAGCCTTTCCCTGTCCCCAGGTAAGTAA。
本发明还提供一种宿主菌，包括所述的重组质粒。
本发明还提供制备所述的重组白细胞介素-18结合蛋白的方法，将表达所述的重组白细胞介素-18结合蛋白的编码基因插入细胞表达载体，并将所述载体导入原核细胞中以表达重组白细胞介素-18结合蛋白。
优选的是，所述表达载体包括pET-20b(+)。
本发明还提供一种发酵生产所述的重组白细胞介素-18结合蛋白的方法，包括通过诱导发酵培养所述的宿主菌获取所述的重组白细胞介素-18结合蛋白的步骤。
优选的是，IPTG诱导表达条件为：在0.5mmol/L IPTG，20℃条件下诱导4-31h。
本发明还提供一种药物组合物，包括所述的重组白细胞介素-18结合蛋白。
本发明还提供一种所述的重组白细胞介素-18结合蛋白的应用，应用于制备治疗炎症性肠病药物中。
本发明公开了以下技术效果：
本发明利用分子伴侣Sumo的促折叠作用和Fc标签的促稳定性作用，建立了一种在原核系统中诱导表达和纯化可溶性长效重组蛋白的方法，并优化了一种可用于大规模生产的发酵工艺体系。经优化实验发现，在摇瓶中，目的蛋白Sumo-IL-18BP-Fc在0.5mmol/LIPTG，30℃条件下诱导5h表达量最高；在发酵罐中，0.5mmol/L IPTG，20℃条件下目的蛋白诱导后26h表达量最高，发酵后目的蛋白可溶性表达量占总蛋白的85％以上，动物实验结果还显示所纯化出的重组蛋白在体内和体外均具有很高的生物活性。因此，本发明公开的融合蛋白通过原核表达系统，促进蛋白正确折叠，增强蛋白稳定性和降低体内降解速率，增强其生物学活性，另外还能通过发酵增加重组蛋白产量，生成成本将会大大低于真核细胞表达系统，利于工业化生产。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为Sumo促进IL-18BP-Fc蛋白的可溶性表达；A：M，Protein Marker；1，空载体pET-20b(+)；2，37℃诱导后的重组Sumo-IL-18BP-Fc菌全菌体；3，重组Sumo-IL-18BP-Fc菌破碎后的蛋白上清；4，重组Sumo-IL-18BP-Fc菌破碎后的蛋白沉淀；B：M，Protein Marker；1，空载体pET-20b(+)；2，37℃诱导后的全菌体；3，重组IL-18BP-Fc菌破碎后的蛋白上清；4，重组IL-18BP-Fc菌破碎后的蛋白沉淀；5，空载体pET-20b(+)；6，20℃诱导后的重组IL-18BP-Fc菌全菌体；7，重组IL-18BP-Fc菌破碎后的蛋白上清；8，重组IL-18BP-Fc菌破碎后的蛋白沉淀；
图2为目的蛋白Sumo-IL-18BP-Fc诱导条件的优化；A：M，Protein Marker；1，空载体pET-20b(+)；2-9分别为0、0.1、0.3、0.5、0.7、1、1.5、2mmol/L IPTG诱导后的全菌体；B：M，Protein Marker；1，空载体pET-20b(+)；2-5分别为20、25、30、37℃诱导后的全菌体；C：M，Protein Marker；1，空载体pET-20b(+)；2-6分别为诱导3、4、5、6、7h后的全菌体；
图3为目的蛋白Sumo-IL-18BP-Fc发酵工艺优化；M：Protein Marker，1：空载体pET-20b(+)，2-12分别为IPTG诱导后4、8、12、24、25、26、27、28、29、30、31h的全菌体，13：目的蛋白上清，14：目的蛋白沉淀；
图4为目的蛋白Sumo-IL-18BP-Fc纯化结果图；A：M，Protein Marker；1，目的蛋白纯化前；2，40mM咪唑洗杂；3，250mM咪唑洗脱；B：M，Protein Marker；1，目的蛋白纯化前；2，40mM咪唑洗杂；3，250mM咪唑洗脱；
图5为Sumo酶切除Sumo并纯化结果；M：Protein Marker，1：融合蛋白Sumo-IL-18BP-Fc酶切后，2：目的蛋白IL-18BP-Fc酶切后经过Ni-NTA柱纯化；
图6为Western Blot检测结果；1-3：目的蛋白IL-18BP-Fc；图7为目的蛋白IL-18BP-Fc体外活性检测结果；
图8为目的蛋白IL-18BP-Fc体内活性检测结果；A、B：在DSS给药后每天监测体重变化和疾病活动指数；C：在第15天处死小鼠，测量各组小鼠结肠长度；D：在第15天处死小鼠，收集结肠组织并进行组织学评分；E、F、G、H：在第15天处死小鼠，在结肠组织中提取蛋白，通过蛋白质印迹测定指定基因的蛋白质表达；
图9为在第15天处死小鼠，检测结肠组织的MPO活性(A)；在第15天取小鼠血清，通过ELISA法检测血清中AST、ALT含量(B)，(n＝8，*p<0.05，**p<0.01)。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
实施例1
1.构建表达载体
根据资料NCBI中查到的IL-18BP亚型a的序列，3＇端通过(G4S)3接头连接人IgG Fc编码基因，然后通过合成将其优化为大肠杆菌偏爱密码子，然后融合基因的5＇端与分子伴侣基因Sumo的序列相连，构建融合基因Sumo-IL-18BP-Fc，并对融合基因进行优化和改造，在重组蛋白的N末端设计6His标签，以便于后续重组蛋白的纯化。由南京钟鼎生物公司合成重组质粒pET-20b-Sumo-IL-18BP-Fc和pET-20b-IL-18BP-Fc。
2.重组质粒转化扩增
1)将E.coli DH5α感受态细胞从-80℃冰箱中取出，冰上溶解，取5μL重组质粒加入到100μL DH5α感受态细胞中，冰浴30min，然后放入42℃水浴中90s，再放到冰上冰浴1-2min。
2)在超净台中向感受态细胞中加入1mL LB液体培养基，37℃，200rpm摇床中震荡1h。
3)4000rpm离心4min，弃去上清，留下200μL菌液。
4)混匀菌液，均匀的涂布在LB固体培养基(含有100μg/mL Amp)中，37℃培养12-16h。
3.质粒小提
按照质粒小提试剂盒说明书进行重组菌的质粒提取。
1)柱平衡：向已经放入收集管的吸附柱中加入500μL Buffer BL，12000rpm离心1min，将收集管中废液倒出。
2)取2-3mL菌液，12000rpm离心1min，弃掉上清。
3)向沉淀中加入250μL Buffer P1，使移液器将细菌重悬。
4)向离心管中加入250μL Buffer P2，温和上下颠倒混匀，使菌体充分裂解。
5)向离心管中加入350μL Buffer P3，温和的上下颠倒4-6次，此时将出现白色絮状沉淀，12000rpm离心10min。
6)将上清液转移至放入收集管的吸附柱内，12000rpm离心1min，弃掉收集管内废液。
7)向吸附柱内加入600μL Buffer PW，12000rpm离心1min，弃掉废液，重复此步。
8)将吸附柱放入收集管内，12000rpm离心2min，室温放置2min。
9)将吸附柱放入干净的离心管中，在吸附柱中间加入50μL ddH2O，室温放置2min，12000rpm离心2min，将质粒收集在离心管中。
4.重组质粒转化至大肠杆菌
具体步骤同上述重组质粒转化扩增使用的方法。
5.重组蛋白表达条件的摸索
1)挑取单个转化菌落于5mL含100μg/mL Amp的LB液体培养基中，37℃，160rpm摇床过夜震荡培养。
2)取1mL接种于100mL含Amp的LB液体培养基中，37℃，160rpm摇床震荡培养。
3)当菌液OD600值为0.6～0.8时，加入终浓度为0.5mmol/L IPTG诱导表达，37℃，160rpm摇床震荡培养4h。
4)将诱导后菌液8000rpm离心10min，弃掉上清，将沉淀用30mL的20mM Tris-HCl(pH8.0)重悬，使用高压均质机进行破碎。
5)取诱导前和诱导后的菌液以及破碎后上清和沉淀的蛋白，进行12％SDS-PAGE电泳鉴定重组蛋白分子量大小和可溶性表达情况。
6.重组蛋白发酵工艺条件的摸索
1)取SDS-PAGE电泳检测重组蛋白可溶性表达量高的菌种，使用接种环涂布于含100μg/mL Amp的LB固体培养基上，37℃过夜培养。
2)挑取单菌落于5mL含100μg/mL Amp的LB液体培养基中，37℃，160rpm摇床过夜震荡培养。
3)取1mL接种于100mL含Amp的LB液体培养基中，37℃，160rpm摇床震荡培养。
4)发酵罐基础培养基配制：按照10g/L胰蛋白胨、5g/L酵母粉、5g/L NaCl、10g/L无水葡萄糖配方配制4L基础培养基，1L补料(补料与基本培养基一致，添加速度为50mL/h)。121℃灭菌20min。
5)待发酵罐高压后冷却至37℃，种子培养基OD600值为1.5时，取40mL种子培养基接种于10L含Amp的基础培养基的发酵罐中，通入消泡剂(发酵罐培养基的消泡剂浓度为10％)和氨水(质量分数为25％)，调节pH为7.5，37℃，200rpm培养2h。
6)降低发酵罐温度为30℃继续培养。当OD600值为4.2～4.5时，加入终浓度为0.5mmol/L IPTG诱导表达，同时降温至20℃，开始添加补料，升速至400rpm继续培养。
7)诱导后4、8、12、24h至31h取菌液测OD600值并记录罐内溶氧值。
8)取诱导前和诱导后各时间的菌液进行12％SDS-PAGE电泳检测重组蛋白表达情况。
9)取发酵后菌液进行破碎，方法同上述破碎方法一致。
10)取破碎后上清和沉淀蛋白进行12％SDS-PAGE电泳检测重组蛋白可溶性表达情况。
7.重组蛋白的纯化
1)将破碎后的液体12000rmp，4℃离心30min，收集上清用0.45μm滤膜过滤除菌，样品分装后保存于-80℃。
2)打开紫外检测仪、记录仪、蠕动泵。
3)柱平衡：用pH为8.0的50mM Tris-HCl缓冲液平衡预先装好的Ni-NTA亲和层析柱，直至检测仪吸光度示数为零。
4)上样：将分装的蛋白样品Sumo-IL-18BP-Fc上样于Ni-NTA亲和层析柱，流速为2mL/min，上样完全后使样品在层析柱中结合30min。
5)洗杂：用含40mM咪唑的50mM Tris-HCl缓冲液进行洗杂，流速为3mL/min，收集洗杂峰液体。
6)洗脱：用含250mM咪唑的50mM Tris-HCl缓冲液进行洗脱，流速为3mL/min，收集洗脱峰液体。
7)柱子保存：用pH为8.0的50mM Tris-HCl缓冲液洗脱柱子，流速为4mL/min，之后用20％乙醇洗柱子，将柱子保存在4℃层析柜中。
8)将上样、洗杂和洗脱液体进行12％SDS-PAGE电泳检测重组蛋白的分子量大小及纯度。
8.重组蛋白酶切及纯化
1)将经过Ni-NTA亲和层析柱纯化后的重组蛋白进行透析除盐，用pH与待透析样品相同的50mM Tris-HCl作为透析液，将目的蛋白的溶液放置在透析液中，用于除去纯化后蛋白中的NaCl和咪唑。
2)将Sumo酶和Sumo-IL-18BP-Fc蛋白按2：1比例加入目的蛋白中，4℃过夜酶切。
3)用12％SDS-PAGE电泳检测重组蛋白的酶切情况。
4)纯化步骤同上述Sumo-IL-18BP-Fc蛋白纯化步骤一致，不同的是，收集的液体为穿出液。
5)用12％SDS-PAGE电泳检测目的蛋白IL-18BP-Fc的纯度。
9.目的蛋白浓度测定
按照Thermo BCA蛋白浓度测定试剂盒说明书检测目的蛋白IL-18BP-Fc的浓度。
10.目的蛋白Western Blot检测
1)将纯化好的蛋白进行SDS-PAGE电泳。取下凝胶，根据蛋白分子量大小将凝胶进行切割，浸泡于预冷的转膜缓冲液中。
2)使用甲醇激活PVDF膜，10min，按照从下到上如下顺序摆放：黑色面-海绵-3层滤纸-凝胶-PVDF膜-3层滤纸-海绵-透明面，设置转膜电流为300mA，转膜时间为90min。
3)转膜结束后，室温封闭1h或4℃封闭过夜。
4)封闭结束，配制一抗孵育液，室温孵育1h或4℃过夜。
5)使用1×TBST洗膜3次，每次10min，配制二抗孵育液，室温孵育1h。
6)TBST洗膜2次，每次10min，1×TBS洗膜10min，按ECL显影试剂盒说明书配制显影液。
7)将PVDF膜浸入显影液，孵育1min，拍摄保存照片。11.目的蛋白的质谱分析
将目的蛋白经过12％SDS-PAGE电泳，染色和脱色后切下目的蛋白位置的胶，将样品寄于北京华大蛋白进行质谱测序分析。
11.目的蛋白体外活性检测
1)复苏KG-1α细胞：向10mL离心管中加入8mL DMEM培养液；取出冻存的KG-1α细胞，37℃水浴融化；立即将融化的KG-1α细胞加入提前准备好的离心管中，1500rpm离心5min；吸弃上清，沉淀用1mL完全培养液重悬并加入含有6mL培养液的培养皿中，轻轻摇晃均匀，放37℃，5％CO2培养箱中培养。
2)将KG-1α细胞拿到显微镜下观察，待细胞生长状态良好即可将KG-1α细胞铺到96孔板。
3)铺板：使用移液枪将细胞收集至无菌离心管中，1000rpm，离心5min；弃掉上清，用1mL完全培养基重悬混匀，取1μL并用完全培养基稀释10倍后在显微镜下进行细胞计数；每孔100μL KG-1α细胞(3×105cell/mL)。
4)将重组蛋白IL-18BP-Fc(0～100ng/ml)和人IL-18(4ng/ml)混合在培养基中，每孔加100μL混合液，37℃，5％CO2培养箱中培养24h。
5)取每孔上清液使用人IFN-γ的ELISA检测试剂盒进行检测IFN-γ的含量，以检测重组蛋白IL-18BP-Fc对IL-18的中和作用。
12.目的蛋白体内活性检测
使用小鼠炎症性肠病模型检测重组蛋白IL-18BP-Fc体内活性：
1)雌性C57 BL/6小鼠，通过连续7天在喂养的水中给予3％的葡聚糖硫酸钠(dextran sulfate sodium salt,DSS)诱导炎症性肠病(每100mL水中3g DSS)。在第0天到第7天开始通过腹腔注射IL-18BP-Fc重组蛋白。每天监测小鼠体重变化，观察粪便变化。
2)进行分组实验：(每组8只小鼠)
①：No DSS+Tris-HCl：腹腔注射20mM Tris-HCl(PH 8.0)(200μL)；
②：No DSS+5mg/kg IL-18BP-Fc：腹腔注射重组IL-18BP-Fc(总体积200μL含5mg/kg重组IL-18BP-Fc)；
③：DSS+200uLTris-HCl：腹腔注射20mM Tris-HCl；
④：DSS+5mg/kg IL-18BP-Fc：腹腔注射重组IL-18BP-Fc(总体积200μL含5mg/kg重组IL-18BP-Fc)；
⑤：DSS+0.5mg/kg IL-18BP-Fc：腹腔注射重组IL-18BP-Fc(总体积200uL含0.5mg/kg重组IL-18BP-Fc)。
3)连续腹腔注射重组蛋白IL-18BP-Fc 7天后，第8天处死小鼠取病变结肠组织，检测结肠组织的髓过氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)活性，MPO活性是判断小鼠炎症程度的潜在标志物，结肠炎小鼠具有更高的MPO活性；提取组织总蛋白，通过蛋白质印迹检测促炎细胞因子IL-18、IFN-γ、IL-1β、TNF-α蛋白质表达水平，结肠炎小鼠促炎细胞因子水平升高。
4)连续腹腔注射重组蛋白IL-18BP-Fc 7天后，第8天对各组小鼠取血，检测血清中谷草转氨酶(Aspartate aminotransferase,AST)和谷丙转氨酶(Alanineaminotransferase,ALT)含量，检测重组蛋白IL-18BP-Fc的安全性。
5)组织病理学分析：
①：处死小鼠前对小鼠称重并进行外貌观察(包括毛发、活动和精神状态)。
②：收集小鼠的所有脏器(心、肝、脾、肺和肾脏)，解剖小鼠后，首先肉眼观察脏器，与对照组比较有差别进行拍照比较。
③：收集5组小鼠结肠直接进行组织固定，进行H&E染色分析，并对其进行组织学评分分析。
13.统计学分析
所有的实验数据均采用GraphPad Prism软件的Student t检验，所有数据均用Means±SEM，P<0.05被视为有统计学意义。
14.结果与分析
(1)Sumo促进IL-18BP-Fc蛋白可溶性表达
如图1所示，重组蛋白Sumo-IL-18BP-Fc在37℃，IPTG诱导下的表达情况，结果证明，重组蛋白主要为可溶性表达(图1A)。重组IL-18BP-Fc菌分别在37℃和20℃进行诱导，目的蛋白IL-18BP-Fc在IPTG诱导下均为包涵体表达(图1B)。
(2)重组蛋白Sumo-IL-18BP-Fc诱导条件的优化
如图2所示，经IPTG诱导浓度的优化，结果证明，目的蛋白Sumo-IL-18BP-Fc在0.5mmol/L IPTG诱导下表达量最高(图2A)。经诱导温度的优化，结果证明，目的蛋白Sumo-IL-18BP-Fc在0.5mmol/L IPTG，30℃诱导下表达量最高(图2B)。经诱导时间的优化，结果证明，目的蛋白Sumo-IL-18BP-Fc在0.5mmol/L IPTG，30℃条件下诱导5h表达量最高(图2C)。
(3)目的蛋白Sumo-IL-18BP-Fc发酵工艺优化
通过优化发酵条件，得到一种可溶性目的蛋白高表达的发酵体系，通过灰度值比较发现，目的蛋白诱导后26h表达量最高，发酵后目的蛋白可溶性表达量占总蛋白的85％以上(如图3所示)。
(4)目的蛋白Sumo-IL-18BP-Fc纯化结果
目的蛋白Sumo-IL-18BP-Fc经过Ni-NTA亲和层析纯化后，经过计算纯度为80％(图4A)。在结果图4A的基础上再一次经过Ni-NTA亲和层析纯化后，经过计算纯度为90％(图4B)。纯化后的目的蛋白Sumo-IL-18BP-Fc可进行酶切。
(5)Sumo酶去掉Sumo标签并纯化结果
如图5所示，在图4的结果基础上，用Sumo酶切掉纯化后的融合蛋白Sumo-IL-18BP-Fc的Sumo标签，并经过Ni-NTA亲和层析纯化得到目的蛋白IL-18BP-Fc，经过计算纯度为95％，蛋白浓度为5.48mg/mL。
(6)目的蛋白IL-18BP-Fc Western Blot检测结果
如图6所示，用Western Blot方法检测目的蛋白IL-18BP-Fc，经过抗Fc标签抗体检测曝光后结果显示，目的蛋白IL-18BP-Fc表达情况良好。
(7)目的蛋白IL-18BP-Fc体外活性检测
目的蛋白IL-18BP-Fc通过与IL-18结合并抑制KG-1α分泌IFN-γ，结果如图7所示，目的蛋白IL-18BP-Fc具有良好的生物活性，能够抑制IFN-γ分泌。
(8)目的蛋白IL-18BP-Fc体内活性检测
通过连续7天给予小鼠喂养3％的葡聚糖硫酸钠(dextran sulfate sodium salt,DSS)诱导小鼠炎症性肠病发生，通过构建小鼠炎症性肠病模型来检测目的蛋白体内的活性和安全性。
在DSS给药后每天监测体重变化和疾病活动指数，结果如图8A、B所示：在DSS给药后每天监测小鼠体重变化和疾病活动指数，如图8A、B所示，与注射20mM Tris-HCl溶液对照组相比，注射不同浓度的IL-18BP-Fc组小鼠体重减轻和疾病活动指数均显著降低。
在喂养3％DSS并连续腹腔注射不同浓度的IL-18BP-Fc 7天后，在第8天处死小鼠，测量各组小鼠的结肠长度，如图8C所示，与对照组相比，注射IL-18BP-Fc的小鼠结肠长度基本恢复正常水平。
在喂养3％DSS并连续腹腔注射不同浓度的IL-18BP-Fc 7天后，如图8D组织学评分结果显示，与对照组相比，注射不同浓度的IL-18BP-Fc组的小鼠结肠的隐窝丢失、上皮损伤和炎症均减少，表明IL-18BP-Fc能够修复小鼠的结肠炎损伤。
在第8天处死小鼠后，收集结肠组织并进行蛋白质印迹分析。如图8E、F、G、H所示：在处死小鼠后，在结肠组织匀浆中提取蛋白，通过蛋白质印迹测定IL-18、IFN-γ、IL-1β、TNF-α的蛋白质表达，结果发现，在注射IL-18BP-Fc后，实验组小鼠IL-18、IFN-γ、IL-1β、TNF-α蛋白质表达均下降。
在第8天处死小鼠后，收集结肠组织样本以评估组织MPO活性。如图9A所示，与对照组相比，注射IL-18BP-Fc后，小鼠结肠组织的MPO活性显著降低，表明小鼠的结肠炎得到改善。
在第8天取各组小鼠血清通过ELISA法检测血清中AST和ALT含量，如图9B所示，与对照组相比，注射IL-18BP-Fc后，小鼠血清中AST和ALT含量显著降低，表明IL-18BP-Fc具有良好的安全性。
以上结果证明，在给予DSS诱导炎症性肠炎后，通过腹腔注射IL-18BP-Fc后，能够有效中和IL-18并抑制疾病发展。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
序列表
<110> 广东医科大学
<120> 一种长效重组白细胞介素-18结合蛋白及其生产方法与应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 411
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Thr Pro Val Ser Gln Thr Thr Thr Ala Ala Thr Ala Ser Val Arg Ser
1               5                   10                  15
Thr Lys Asp Pro Cys Pro Ser Gln Pro Pro Val Phe Pro Ala Ala Lys
            20                  25                  30
Gln Cys Pro Ala Leu Glu Val Thr Trp Pro Glu Val Glu Val Pro Leu
        35                  40                  45
Asn Gly Thr Leu Ser Leu Ser Cys Val Ala Cys Ser Arg Phe Pro Asn
    50                  55                  60
Phe Ser Ile Leu Tyr Trp Leu Gly Asn Gly Ser Phe Ile Glu His Leu
65                  70                  75                  80
Pro Gly Arg Leu Trp Glu Gly Ser Thr Ser Arg Glu Arg Gly Ser Thr
                85                  90                  95
Gly Thr Gln Leu Cys Lys Ala Leu Val Leu Glu Gln Leu Thr Pro Ala
            100                 105                 110
Leu His Ser Thr Asn Phe Ser Cys Val Leu Val Asp Pro Glu Gln Val
        115                 120                 125
Val Gln Arg His Val Val Leu Ala Gln Leu Trp Ala Gly Leu Arg Ala
    130                 135                 140
Thr Leu Pro Pro Thr Gln Glu Ala Leu Pro Ser Ser His Ser Ser Pro
145                 150                 155                 160
Gln Gln Gln Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
                165                 170                 175
Gly Gly Ser Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro
            180                 185                 190
Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro
        195                 200                 205
Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr
    210                 215                 220
Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn
225                 230                 235                 240
Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg
                245                 250                 255
Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val
            260                 265                 270
Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser
        275                 280                 285
Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
    290                 295                 300
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu
305                 310                 315                 320
Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
                325                 330                 335
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
            340                 345                 350
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
        355                 360                 365
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
    370                 375                 380
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
385                 390                 395                 400
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
                405                 410
<210> 2
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Met His His His His His His Gly Met Ser Asp Ser Glu Val Asn Gln
1               5                   10                  15
Glu Ala Lys Pro Glu Val Lys Pro Glu Val Lys Pro Glu Thr His Ile
            20                  25                  30
Asn Leu Lys Val Ser Asp Gly Ser Ser Glu Ile Phe Phe Lys Ile Lys
        35                  40                  45
Lys Thr Thr Pro Leu Arg Arg Leu Met Glu Ala Phe Ala Lys Arg Gln
    50                  55                  60
Gly Lys Glu Met Asp Ser Leu Arg Phe Leu Tyr Asp Gly Ile Arg Ile
65                  70                  75                  80
Gln Ala Asp Gln Thr Pro Glu Asp Leu Asp Met Glu Asp Asn Asp Ile
                85                  90                  95
Ile Glu Ala His Arg Glu Gln Ile Gly Gly
            100                 105
<210> 3
<211> 1236
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
acacctgtct cgcagaccac cacagctgcc actgcctcag ttagaagcac aaaggacccc 60
tgcccctccc agcccccagt gttcccagca gctaagcagt gtccagcatt ggaagtgacc 120
tggccagagg tggaagtgcc actgaatgga acgctgagct tatcctgtgt ggcctgcagc 180
cgcttcccca acttcagcat cctctactgg ctgggcaatg gttccttcat tgagcacctc 240
ccaggccgac tgtgggaggg gagcaccagc cgggaacgtg ggagcacagg tacgcagctg 300
tgcaaggcct tggtgctgga gcagctgacc cctgccctgc acagcaccaa cttctcctgt 360
gtgctcgtgg accctgaaca ggttgtccag cgtcacgtcg tcctggccca gctctgggct 420
gggctgaggg caaccttgcc ccccacccaa gaagccctgc cctccagcca cagcagtcca 480
cagcagcagg gtggtggtgg tggttctggt ggtggtggat ctggtggtgg aggttctgaa 540
ccaaagtctt gtgataagac tcacacttgt ccaccatgtc cagctcctga acttctgggt 600
ggaccatctg tctttctttt cccaccaaaa cctaaggaca ctcttatgat ttcccgtact 660
cctgaagtca cttgtgttgt tgtggacgtg agtcacgaag accctgaggt caagttcaac 720
tggtacgttg acggtgttga agttcataat gccaagacta agcctcgtga agagcaatac 780
aacagtactt accgtgttgt cagtgtcctt accgtcctgc accaggactg gctgaatggt 840
aaggagtaca agtgtaaggt ctccaacaag gcccttccag ccccaatcga gaagaccatc 900
tccaaagcca agggtcaacc acgtgaacca caagtttaca ccctgcctcc atcccgtgag 960
gagatgacca agaaccaggt cagtctgact tgtctggtca agggtttcta tccttccgac 1020
atcgctgttg agtgggagtc caacggtcaa ccagaaaaca actacaagac cacccctcca 1080
gttcttgact ccgacggttc cttcttcctt tactccaagc ttaccgttga caagtccaga 1140
tggcaacaag gtaacgtttt ctcatgttcc gttatgcacg aagctctgca caaccactac 1200
actcaaaaga gcctttccct gtccccaggt aagtaa 1236
<210> 4
<211> 318
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
atgcatcatc atcatcatca cggcatgtcg gactcagaag tcaatcaaga agctaagcca 60
gaggtcaagc cagaagtcaa gcctgagact cacatcaatt taaaggtgtc cgatggatct 120
tcagagatct tcttcaagat caaaaagacc actcctttaa gaaggctgat ggaagcgttc 180
gctaaaagac agggtaagga aatggactcc ttaagattct tgtacgacgg tattagaatt 240
caagctgatc agacccctga agatttggac atggaggata acgatatcat tgaggctcac 300
agagaacaga ttggtggt 318

Claims (2)

1.一种发酵生产重组白细胞介素-18结合蛋白的方法，其特征在于，包括通过诱导发酵培养宿主菌获得重组白细胞介素-18结合蛋白的步骤；
IPTG诱导表达条件为：在0.5mmol/L IPTG，20℃条件下诱导4-31h；
制备重组白细胞介素-18结合蛋白的方法为：将重组白细胞介素-18结合蛋白的编码基因的5＇端与分子伴侣基因Sumo的序列相连，构建融合基因，将该融合基因插入细胞表达载体，并将所述载体导入原核细胞中以表达重组白细胞介素-18结合蛋白；
所述重组白细胞介素-18结合蛋白包含编码人IL-18BP亚型a的序列和编码人IgG Fc的序列，所述重组白细胞介素-18结合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；所述分子伴侣基因Sumo的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述表达载体包括pET-20b(+)。
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