CN114317385B - 一种促进her2亲和体蛋白分泌表达的发酵培养基及发酵工艺 - Google Patents

一种促进her2亲和体蛋白分泌表达的发酵培养基及发酵工艺 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种促进HER2亲和体蛋白分泌表达的发酵培养基及发酵工艺。所述的HER2亲和体蛋白为带有pel信号肽的HER2亲和体重组蛋白,其氨基酸序列如SEQ ID No.6所示,其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。所述的促进HER2亲和体蛋白分泌表达的发酵培养基,包括基础料和补料,所述的基础料配方如下:蛋白胨8‑15g/L,酵母浸出粉5‑8g/L,甘油5‑10g/L,无水硫酸钠0.7‑2g/L,无水硫酸镁0.7‑2g/L,无水磷酸二氢钾4‑6g/L,无水磷酸氢二钾8‑10g/L,消泡剂0.3‑0.5g/L;所述的补料配方如下:蛋白胨40‑60g/L,酵母浸出粉20‑30g/L,甘油300‑400g/L,另配置10‑15%浓度氨水。本发明通过不断对比与优化后的发酵配方与工艺,实现了80‑90%以上目标蛋白的分泌表达;下游仅需纯化发酵上清液中分泌表达的目标蛋白,菌泥可以废弃。

Description

一种促进HER2亲和体蛋白分泌表达的发酵培养基及发酵工艺
技术领域
本发明属于重组蛋白表达领域,具体地说,涉及一种促进HER2亲和体蛋白分泌表达的发酵培养基及发酵工艺。
背景技术
大肠杆菌(Escherichia coli)表达系统是目前应用最广泛、研究最透彻的表达系统之一,具有发酵周期短、生产效率高,操作简便等显著优势。当前大肠杆菌目标蛋白表达一般为胞内表达,目前报道目标蛋白分泌表达到发酵培养基的情况非常之少。因为大肠杆菌分泌系统的组成元件复杂,调控精细以及固有的双层膜结构,所以大肠杆菌表达系统的分泌性能很差。
目标蛋白分泌表达到发酵上清液中,或称胞外表达,不仅有助于蛋白折叠,产生天然活性蛋白,还有利于降低包涵体的形成量。同时,使用发酵上清液进行下游纯化生产,无需进行菌体破碎及二次离心,省去价格高昂的均质机设备,以及一次性进口深层过滤设备等,即可简化工艺步骤、降低生产成本。此外,发酵上清液中目标蛋白可占70%及以上,杂蛋白非常少,极有利于下游纯化,减少杂蛋白对产品的污染。还有,在生物医药行业蛋白药物领域,涉及内毒素、宿主蛋白残留、宿主DNA残留等问题,内毒素可引起发热、微循环障碍、内毒素休克及播散性血管内凝血等,涉及细胞和动物实验时,一般对内毒素控制都有严格要求;大肠杆菌破碎或者裂解后产生大量内毒素,100万-1000万EU/mL级别,根据相关法规,需要降至约10EU/mL以内,导致后续纯化去除内毒素压力非常大;而使用发酵上清液进行生产,其不涉及菌体裂解与破碎,内毒素含量很低,极有利于后续工艺内毒素的去除,以及有效避免菌体宿主胞内背景蛋白对蛋白纯化的影响,利于提高产品内毒素、宿主蛋白残留、宿主DNA残留等相关指标。因此,大肠杆菌重组蛋白的分泌表达,特别在医药行业具有十分重要的意义。
大肠杆菌的分泌型蛋白,它们在N端或C端带有一定的结构(包含着分泌信号),其中N端带有信号肽分子的蛋白。目前采用的信号肽一般来自大肠杆菌的外膜蛋白(如外膜蛋白A OmpA、OmpF、λ噬菌体受体LamB、热稳定肠毒素ST等)或周质蛋白(如碱性磷酸酶PhoA、麦芽糖结合蛋白MBP、DsbA等),此外金黄色葡萄球菌蛋白A和胡萝卜软腐欧文氏果胶酶裂解酶(PelB)的信号肽也常被采用。
人表皮生长因子受体2(HER2)亲和体分子,因其具有对靶组织亲和力高、特异性强、分子量小、制备简单、生物动力学特征良好等特点,近年来在肿瘤分子影像方面的研究中显示出了较好的临床应用前景。放射性核素标记HER2亲和体分子探针不仅可以进行肿瘤受体显像及疗效评价,特别是乳腺癌阳性患者的显像,还可以用于靶向治疗。
现有技术中,有研究尝试在构建大肠杆菌载体时,添加信号肽,以期实现分泌表达;然而即使载体添加信号肽,很多目标蛋白也不一定能够实现分泌表达;特定蛋白选择适宜的信号肽才能一定程度上实现分泌表达;但是大部分情况下,仅有40-50%目标蛋白分泌表达于发酵培养基中,仍有50-60%目标蛋白表达于发酵菌体里;反而造成下游处理工艺的复杂性。
如果能够实现目标蛋白分泌表达,且加之十分有效的发酵培养基配方与诱导表达工艺,实现绝大部分目标蛋白分泌表达,以上缺陷或都可以弥补。
过去的几十年里已经见证了跨膜转运机制和蛋白分泌机制研究的显著进展,信号肽的提出不仅为蛋白质的研究开辟了新的领域一蛋白质的空间属性,更为基因工程与蛋白质工程技术的应用提供了有效手段;目前,大肠杆菌的分泌表达系统已在基因工程技术领域得到了广泛的应用,然而相当多的重组蛋白的大规模表达还存在众多的技术瓶颈,最主要就是分泌表达量低。见何冰芳等人发表的“大肠杆菌蛋白质分泌机理及其重组蛋白分泌表达新进展”。
近几年来不同物种的重组蛋白已在大肠杆菌中成功分泌表达,但表达水平基本维持在10mg/L,限制了其大规模生产商业化的应用。见王靖瑶等人发表的“大肠杆菌I型分泌表达系统研究进展及提高蛋白表达量的策略”。
目前未有HER2亲和体蛋白利用大肠杆菌分泌,或渗透,或胞外表达的相关专利与文献。
发明内容
为了克服现有技术的不足,本发明的第一个目的是提供一种促进HER2亲和体蛋白分泌表达的发酵培养基,本发明的第二个目的是提供一种促进HER2亲和体蛋白分泌表达的发酵工艺。
本发明中,因改造优化后HER2亲和体蛋白分子量仅7.7kd,分子量较小,一定程度上更有利于蛋白分泌表达;通过基因工程手段,将pel信号肽基因与HER2目标蛋白基因整合到大肠杆菌中进行发酵表达,通过多种发酵配方与工艺对比,筛选出可实现80-90%目标蛋白表达于发酵上清液的发酵配方与工艺。
大肠杆菌体系蛋白表达,具有发酵周期短、生产效率高,操作简便的优点,如果做到分泌表达到发酵上清液中,不仅有利于降低包涵体的形成,有助于产生天然活性蛋白;同时,使用发酵上清液进行下游纯化生产,无需进行菌体破碎及二次离心,省去价格高昂的均质机设备,以及一次性进口深层过滤设备等,即可简化工艺步骤、降低生产成本。此外,发酵上清液中目标蛋白占比很高,杂蛋白非常少,极有利于下游纯化。还有,在生物医药行业蛋白药物领域,极有利于后续工艺内毒素的去除,利于提高产品指标。
为了实现上述目的,本发明采取的技术方案如下:
本发明提供的第一个目的是提供促进HER2亲和体蛋白分泌表达的发酵培养基,
所述的HER2亲和体蛋白为带有pel信号肽的HER2亲和体重组蛋白,其氨基酸序列如SEQ ID No.6所示,其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示;所述的带有pel信号肽的HER2亲和体重组蛋白由基因工程菌分泌表达,所述的基因工程菌转化有重组质粒表达载体,所述重组质粒表达载体中含有如下基因:1)核苷酸序列如SEQ ID No.3所示的编码pel信号肽的基因;2)核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的编码未带有pel信号肽的HER2亲和体蛋白的基因;
本发明中,带有pel信号肽的HER2亲和体重组蛋白表达的基因工程菌为基因工程大肠杆菌菌株,宿主菌为BL21(DE)3,质粒为pET22b(+)。
所述的发酵培养基包括基础料和补料;
所述的基础料配方如下:蛋白胨8-15g/L,酵母浸出粉5-8g/L,甘油5-10g/L,无水硫酸钠0.7-2g/L,无水硫酸镁0.7-2g/L,无水磷酸二氢钾4-6g/L,无水磷酸氢二钾8-10g/L,消泡剂0.3-0.5g/L。基础料配制方法:将上述组分用水充分溶解,pH为6.5-7.5,121℃20min灭菌使用。5L玻璃发酵罐发酵基础料起始体积2.5-3.0L。
发酵基础料作用在于发酵前期提供适宜培养基成分,供大肠杆菌前期生长扩增繁殖,达到一定菌浓度,以待诱导表达目标蛋白。配方中蛋白胨、酵母浸出粉及甘油是提供大肠杆菌生长增殖的起始必不可少的氮源与碳源;硫酸钠主要提供钠离子,硫酸镁主要提供蛋白活性成分镁离子,磷酸氢二钾与磷酸二氢钾是维持发酵过程培养基的起始pH7.0左右,以及提供磷源与钾离子。消泡剂为防止酵母粉蛋白胨灭菌过程蛋白起泡导致可能染菌,以及防止发酵过程中起泡,影响发酵。其中四种无机盐成分含量过低则不利于蛋白渗透表达,过高会因发酵过程大肠杆菌外部渗透压过高,而导致细胞失水,导致细胞生长受影响。适宜的无机盐浓度,才能保证菌体正常扩增,目标蛋白正常表达于发酵上清液中。
所述的补料配方如下:蛋白胨40-60g/L,酵母浸出粉20-30g/L,甘油300-400g/L。补料配制方法:将上述组分用水充分溶解灭菌,pH为6.5-7.5,121℃20min灭菌使用。对应5L玻璃发酵罐发酵基础料起始体积2.5-3.0L,发酵补料培养基配置体积为400-600mL。另外配置10-15%氨水,在超净台下将试剂级25-28%AR级氨水与超纯水进行1:1稀释,用于发酵过程调节pH7.0±0.2,以及补充无机氮源,体积150-300mL,氨水不需灭菌。
发酵补料培养基作用在于当基础培养基养分基本耗尽之后,补充营养成分继续培养,补料工艺有效优化大肠杆菌培养过程中的化学环境,使其处于最佳的生长环境。其一方面可以避免某些营养成分浓度过高抑制生长,另一方面能够防止限制性营养成分被耗尽而影响菌体的生长与产物的生成。补料过程中的碳氮比非常重要:若氮源过高,菌体生长过于旺盛,pH偏高,不利于目标蛋白的表达积累;氮源不足,菌体生长缓慢菌密度低,从而影响蛋白产量;若碳源过高,则发酵容易产乙酸,抑制蛋白产物的表达;碳源如果不足,会引起菌体衰老与自溶。
本发明促进HER2亲和体蛋白分泌表达的发酵方法,包括如下步骤:
1)平板培养:将配置有固体培养基的摇瓶灭菌后,冷却凝固前约50℃左右加入终浓度50-100ppm卡那霉素混合均匀,按照10-15mL/皿倒平板;待平板凝固后,取HER2甘油管菌株,四分区划线涂布于卡那抗性平板上,过夜培养12-16h,以备挑选单克隆菌株;
2)活化摇瓶:将配置有摇瓶培养基的活化摇瓶灭菌冷却后,接入终浓度50-100ppm卡那霉素,挑取步骤1)中的平板单克隆1个接入25mL培养基/100mL摇瓶中;活化摇瓶培养4-6h,OD600达0.6-1.2左右;
此步骤的作用是对单克隆进行扩增培养,以备接种入进罐摇瓶;
3)进罐摇瓶:将配置有摇瓶培养基的进罐摇瓶灭菌冷却后,接种同时加入终浓度50-100ppm卡那霉素;按照接种量2%,取步骤2)的活化种子转接进入进罐摇瓶中,进罐摇瓶培养基体积60-300mL;培养3-4h,OD600达1.0-1.6左右,
此步骤的产物作为发酵罐发酵种液;此处的“接种量2%”,含义是表示每100mL培养基中接种2mL活化种子。
4)发酵:发酵罐起始条件:pH7.0±0.5,发酵过程10-15%浓度氨水自动控制,温度37±1.0℃,通气比1:1即3LPM,搅拌转速200rpm,溶氧度校准100%;取步骤3)的发酵种液接种,接种比例2-10%,开始5L发酵罐发酵,发酵罐中接种有基础培养基;通过提高搅拌转速200-900rpm与通气量3-9LPM,以及逐步降低温度37-30℃,以维持溶氧25±5%。
此步骤的作用是提高菌浓待诱导表达。此处“接种比例2-10%”,含义是每100mL培养基中接种2-10mL发酵种液。
5)发酵诱导与补料:在发酵罐中发酵5h左右,检测OD600在15-20左右,设定诱导温度30-37℃,开始加入IPTG或者乳糖开始诱导,诱导剂IPTG终浓度使用0.2-1.0mM,如果诱导剂为乳糖则终浓度2-6g/L;且当DO一旦开始回升,则开始加入补料培养基进行补料,补料速度35-50mL/H,基本以补料来控制溶氧度在25±5%,诱导4-8h,检测OD600在30-40左右基本不再增长,则诱导结束放罐。此过程在诱导前、诱导2h、4h、6h、8h均取样检测OD600增长情况,以及考察蛋白表达效果。
优选地,诱导为温度35-37℃。实验证明,HER2亲和体蛋白渗透表达,诱导温度比较重要,35-37℃效果更佳。
6)收集发酵上清液:离心机7500rpm,30min离心,离心后收集发酵上清液;发酵清液中目标蛋白占比70%及以上,用于后续纯化。
进一步的,所述的步骤1)中,培养基配方如下:10-20g/L蛋白胨、5-10g/L酵母浸出粉,5-10g/L氯化钠,10-20g/L琼脂粉。配制方法如下:将上述组分用水充分溶解,pH为6.5-7.5,121℃20min灭菌使用。更优选地,所述的平板固体培养基配方为10g/L蛋白胨、5g/L酵母浸出粉、10g/L氯化钠、10g/L琼脂粉。此步骤培养基主要用于培养单克隆,供挑选活化扩培。
进一步的,所述的步骤2)中,培养基配方如下:10-20g/L蛋白胨、5-10g/L酵母浸出粉,5-10g/L氯化钠。配制方法如下:将上述组分用水充分溶解,pH为6.5-7.5,121℃20min灭菌使用。更优选地,所述的活化摇瓶培养基配方为10g/L蛋白胨,5g/L酵母浸出粉,10g/L氯化钠。此步骤培养基主要用于单克隆菌种扩培,以备转接进罐摇瓶。
进一步的,所述的步骤3)中,培养基配方如下:10-20g/L蛋白胨、5-10g/L酵母浸出粉,5-10g/L氯化钠。配制方法如下:将上述组分用水充分溶解,pH为6.5-7.5,121℃20min灭菌使用。更优选地,所述的进罐摇瓶培养基配方为10g/L蛋白胨,5g/L酵母浸出粉,10g/L氯化钠。此步骤培养基主要用于作为发酵罐发酵种液。
进一步的,所述的步骤4)中,发酵罐中采用基础料培养基,所述的基础料培养基配方如下:蛋白胨8-15g/L,酵母浸出粉5-8g/L,甘油5-10g/L,无水硫酸钠0.7-2g/L,无水硫酸镁0.7-2g/L,无水磷酸二氢钾4-6g/L,无水磷酸氢二钾8-10g/L,消泡剂0.3-0.5g/L。基础料配制方法:将上述组分用水充分溶解,pH为6.5-7.5,121℃20min灭菌使用。更优选地,所述的基础料培养基配方如下:蛋白胨10g/L,酵母浸出粉5g/L,甘油5.6g/L,无水硫酸钠0.76g/L,无水硫酸镁0.72g/L,无水磷酸二氢钾4g/L,无水磷酸氢二钾10g/L,消泡剂0.3g/L;发酵基础料作用在于发酵前期提供适宜培养基成分,供大肠杆菌前期生长扩增繁殖,达到一定菌浓度,以待诱导表达目标蛋白。
进一步的,所述的步骤5)中,所述的补料培养基配方如下:蛋白胨40-60g/L,酵母浸出粉20-30g/L,甘油300-400g/L。补料配制方法:将上述组分用水充分溶解灭菌,pH为6.5-7.5,121℃*20min灭菌使用。更优选地,所述的补料培养基配方如下:蛋白胨40g/L,酵母浸出粉20g/L,甘油300g/L。补料培养基的作用是在HER2亲和体蛋白诱导表达过程中,提供充足营养成分。另外配置10-15%氨水,用于发酵过程调节pH7.0±0.2,以及补充无机氮源。
本发明具有如下技术效果:
1)本发明首先将pel信号肽基因与HER2目标蛋白基因整合到载体上,得到重组质粒后,通过基因工程菌大肠杆菌进行发酵表达,实现了50%左右目标蛋白的分泌表达,为绝大部分目标蛋白的分泌表达奠定了基础。
2)本发明通过不断对比与优化后的发酵配方与工艺,实现了80-90%左右目标蛋白的分泌表达;下游仅需纯化发酵上清液中分泌表达的目标蛋白,菌泥可以废弃。
3)本发明通过以上技术创新手段,生产活性蛋白HER2亲和体,降低包涵体的形成量;同时,使用发酵上清液进行下游纯化生产,不必进行菌体破碎及二次离心,省去价格高昂的均质机设备,以及一次性进口深层过滤设备等,简化工艺步骤、降低生产成本。此外,由于发酵上清液中目标蛋白可占70%及以上,杂蛋白非常少,利于下游纯化,且使用发酵上清液进行生产,其不涉及菌体裂解与破碎,内毒素含量很低,极有利于后续工艺内毒素的去除,利于提高产品指标。
4)本发明的培养基及方法得到的发酵上清液中HER2亲和体重组蛋白,含量可达1500mg/L以上。
附图说明
图1为实施例2-4的表达过程各样品的电泳结果。
具体实施方式
为了加深对本发明的理解,下面结合实施例对本发明进一步说明,该实施例仅用于解释本发明,并不对本发明的保护范围构成限定。
HER2亲和体蛋白表达的基因工程菌大肠杆菌菌株,宿主为BL21(DE)3,质粒为pET22b(+),委托上海生工股份有限公司所构建。所用胰蛋白胨(Tryptone)、酵母浸出粉(Yeast Extract),为Oxide市售产品。各种无机盐以及消泡剂等,AR级别,均采购至上海国药股份有限公司。pET22b(+)大肠杆菌表达载体及大肠杆菌BL21(DE)3宿主菌均可以从Novagen公司购买。
实施例1
采用基因设计软件,将带有pel信号肽基因的HER2亲和体编码基因的密码子进行优化,使之适合大肠杆菌重组表达。在HER2亲和体的氨基端增加HEHEHE氨基酸序列,羧基端增加GGGC序列。采用HindⅢ酶切鉴定合成基因长度,基因测序证实合成的基因序列。将HER2亲和体基因克隆入pET22b(+)质粒,转化感受态BL21(DE)3大肠杆菌。IPTG诱导重组表达菌后用SDS-PAGE分析鉴定表达产物的相对分子质量约7.7kd。
编码未带有pel信号肽的HER2亲和体蛋白的基因的核苷酸序列为(SEQ ID No.1):
CCATGGCCCATGAACACGAGCACGAGGCGGAAAACAAATTCAACAAAGAAATGCGCAACGCGTACTGGGAAATTGCCCTGCTGCCGAACCTGACCAACCAACAGAAACGCGCCTTCATCCGCTCCCTGTACGACGACCCATCCCAATCTGCAAACCTGCTGGCGGAAGCGAAGAAACTGAACGATGCACAGGGTGGTGGTTGCTAAGAATTC
未带有pel信号肽的HER2亲和体蛋白的氨基酸序列(SEQ ID No.2):MAHEHEHEAENKFNKEMRNAYWEIALLPNLTNQQKRAFIRSLYDDPSQSANLLAEAKKLNDAQGGGC
编码pel信号肽的基因的核苷酸序列(SEQ ID No.3):
ATGAAATACCTGCTGCCGACCGCTGCTGCTGGTCTGCTGCTCCTCGCTGCCCAGCCGGCG
pel信号肽的氨基酸序列(SEQ ID No.4):
MKYLLPTAAAGLLLLAAQPA
编码带有pel信号肽的HER2亲和体重组蛋白的基因的核苷酸序列(SEQ ID No.5):
ATGAAATACCTGCTGCCGACCGCTGCTGCTGGTCTGCTGCTCCTCGCTGCCCAGCCGGCGCCATGGCCCATGAACACGAGCACGAGGCGGAAAACAAATTCAACAAAGAAATGCGCAACGCGTACTGGGAAATTGCCCTGCTGCCGAACCTGACCAACCAACAGAAACGCGCCTTCATCCGCTCCCTGTACGACGACCCATCCCAATCTGCAAACCTGCTGGCGGAAGCGAAGAAACTGAACGATGCACAGGGTGGTGGTTGCTAAGAATTC
带有pel信号肽的HER2亲和体重组蛋白的氨基酸序列(SEQ ID No.6):
MKYLLPTAAAGLLLLAAQPAMAHEHEHEAENKFNKEMRNAYWEIALLPNLTNQQKRAFIRSLYDDPSQSANLLAEAKKLNDAQGGGC
具体构建方法参考蔡炯等人发表的“HER2含末端半胱氨酸人类表皮生长因子受体2亲和体的重组表达与亲和纯化”(蔡炯,等人.“HER2含末端半胱氨酸人类表皮生长因子受体2亲和体的重组表达与亲和纯化”,《中国医学科学院学报》2013年35卷3期,281-285页)。
关于构建本发明所涉基因工程菌的具体操作方法,本领域技术人员也可以根据需要作出常规选择,本发明对此不作特别限定。
实施例2
HER2蛋白的分泌表达,包括如下步骤:
1)平板培养:将接种有平板培养基的平板灭菌后,冷却凝固前约50℃左右加入终浓度50ppm卡那霉素,倒平板。取HER2甘油管菌株,四分区划线涂布于卡那抗性平板上,过夜培养16h;
2)活化摇瓶:将接种有活化摇瓶培养基的活化摇瓶灭菌冷却后,接种单克隆同时加入终浓度50ppm卡那霉素;挑取平板单克隆1个,接入卡那抗性25mL培养基/100mL摇瓶中,培养4h,OD600达1.0;
3)进罐摇瓶:将接种有进罐摇瓶培养基的进罐摇瓶灭菌冷却后,接种同时加入终浓度50ppm卡那霉素。按照接种量2%,从活化瓶中取2mL活化种子进入100mL培养基/500mL摇瓶中,培养3h,OD600达1.0,待接入发酵罐中培养;
4)发酵罐起始条件:pH控制在7.0±0.5(发酵过程12%左右浓度的氨水自动控制),温度控制在37±1.0℃,通气比1:1,搅拌转速200rpm,溶氧度校准100%;接种比例2%,接种后开始发酵。通过逐步提高搅拌转速200rpm至900rpm与通气量3LPM至9LPM,以及逐步降低温度至35℃,以维持溶氧25±5%。
5)发酵诱导与补料:发酵5h后,检测OD600在15.2,设定诱导温度35℃,开始加入IPTG开始诱导,诱导剂终浓度0.5mM;且当DO一旦开始回升,则开始补料,根据溶氧度来调整补料速度35-50mL/H,基本以补料来控制溶氧度范围在25±5%;例如溶氧度高于40%,则提高补料速度至50mL/H左右;如果溶氧度低于20%,则降低补料速度至35mL/H左右。此批次诱导8h,检测OD600在31.0后基本不再增长,则诱导结束放罐。诱导4h-6h-8h分别取样,制样点胶并电泳考察发酵表达水平,以及蛋白表达是否基本全部在发酵上清液中,而非常见的发酵菌泥中。
6)收集发酵上清液:离心机7500rpm,30min离心,离心后收集发酵上清液;点胶电泳对比,待后续纯化。
步骤1)中,培养基配方如下:10g/L蛋白胨、5g/L酵母浸出粉,10g/L氯化钠,10g/L琼脂粉;配制方法如下:将上述组分用水充分溶解,pH为7.0,121℃*20min灭菌使用。
步骤2)中,培养基配方如下:10g/L蛋白胨、5g/L酵母浸出粉,10g/L氯化钠;配制方法如下:将上述组分用水充分溶解,pH为7.0,121℃*20min灭菌使用。
步骤3)中,培养基配方如下:10g/L蛋白胨、5g/L酵母浸出粉,10g/L氯化钠;配制方法如下:将上述组分用水充分溶解,pH为7.0,121℃*20min灭菌使用。
步骤4)中,发酵罐中采用基础料培养基,所述的基础料培养基配方如下:蛋白胨10g/L,酵母浸出粉5g/L,甘油5.6g/L,无水硫酸钠0.76g/L,无水硫酸镁0.72g/L,无水磷酸二氢钾4g/L,无水磷酸氢二钾10g/L,消泡剂0.3g/L;配制方法如下:将上述组分用水充分溶解,pH为7.0,121℃*20min灭菌使用。
步骤5)中,所述的补料培养基配方如下:蛋白胨40g/L,酵母浸出粉20g/L,甘油300g/L,配制方法如下:将上述组分用水充分溶解,pH为7.0,121℃*20min灭菌使用。超净工作台内将AR级氨水与超纯水1:1混合,配置12%左右浓度的氨水,无需灭菌,待用。
实施例3
HER2蛋白的分泌表达,包括如下步骤:
1)2)3)4)同实施例2,仅调整诱导温度至30℃。
5)发酵诱导与补料:发酵5h后,检测OD600在14.1,设定诱导温度30℃,开始加入IPTG开始诱导,诱导剂终浓度0.5mM;且当DO一旦开始回升,则开始补料,根据溶氧度来调控补料速度35-50mL/H,基本以补料速度来控制溶氧度范围在25±5%;例如溶氧度高于40%,则提高补料速度至50mL/H左右;如果溶氧度低于20%,则降低补料速度至35mL/H左右。诱导8h,检测OD600在37.3后基本不再增长,则诱导结束放罐。诱导4h-6h-8h分别取样,制样点胶并电泳考察发酵表达水平;以及蛋白表达是否基本全部在发酵上清液中,而非常见的发酵菌泥中。
6)收集发酵上清液:离心机7500rpm,30min离心,离心后收集发酵上清液;点胶电泳对比,待后续纯化。
步骤1)中,培养基同实施例2。
步骤2)中,培养基同实施例2。
步骤3)中,培养基同实施例2。
步骤4)中,基础料培养基同实施例2。
步骤5)中,补料培养基同实施例2。
实施例4(作为对照例)
HER2蛋白的分泌表达,包括如下步骤:
1)2)3)4)同实施例2,调整5L罐发酵配方以及相关工艺,进行对比。
5)发酵诱导与补料:发酵5h后,检测OD600在21.8,设定诱导温度30℃,开始加入IPTG开始诱导,诱导剂终浓度0.5mM;且当DO一旦开始回升,则开始补料,根据溶氧度来调控补料速度50-70mL/H,基本以补料速度来控制溶氧度在25±5%;例如溶氧度高于40%,则提高补料速度至70mL/H左右;如果溶氧度低于20%,则降低补料速度至50mL/H左右。诱导8h,检测OD600在47.0后基本不再增长,则诱导结束放罐。诱导4h-6h-8h分别取样,制样点胶并电泳考察发酵表达水平;以及目标蛋白表达在发酵上清液中与发酵菌泥中占比效果。
6)收集发酵上清液:离心机7500rpm,30min离心,离心后分别收集发酵上清液以及菌泥;点胶电泳对比,待后续纯化。
步骤1)中,培养基同实施例2。
步骤2)中,培养基同实施例2。
步骤3)中,培养基同实施例2。
步骤4)中,发酵罐中采用常规的基础料培养基,所述的基础料培养基配方如下:蛋白胨10g/L,酵母浸出粉20g/L,葡萄糖10g/L,硫酸铵2.6g/L,无水硫酸镁0.72g/L,无水磷酸二氢钾2.34g/L,无水磷酸氢二钾4.34g/L,消泡剂0.3g/L;用水充分溶解,pH为7.0,121℃*20min灭菌使用;其中葡萄糖单独灭菌115℃*15min。
步骤5)中,所述的补料培养基配方如下:葡萄糖500g/L,硫酸镁2g/L,补料体积0.6L;用水充分溶解,115℃*15min灭菌使用。超净工作台内将AR级氨水与超纯水1:1混合,配置14%浓度氨水,无需灭菌,待用。
实施例5蛋白表达检测
对实施例2-4得到的发酵产物的蛋白表达进行检测。检测结果如下表所示。
其中:
1、蛋白浓度采用中国药典20202版Bradford方法进行检测所得。
2、目标蛋白占比,是采用上海天能科技有限公司型号1160凝胶成像仪,分析软件计算所得。
上表中,
1)“最高OD600”表示:通过分光光度计在600nm波长条件下,诱导后每隔2h检测发酵过程大肠杆菌光密度,检测数值不再增加,则为最高OD600,即准备放罐。
2)“菌泥量”表示:通过离心机7500rpm*30min离心,倒出离心上清液进行单独收集,剩下部分为菌泥,称量其重量A(g)。
3)“菌泥破碎清液总蛋白浓度”表示:发酵菌泥稀释5倍,体积为5*A(mL),通过高压均质机800bar破碎2遍,25000g离心力离心30min,收集破碎清液,通过Bradford方法检测其总蛋白含量B(mg/mL)。
4)“发酵菌泥中HER2占比”表示:菌泥样品SDS-PAGE电泳,通过凝胶成像仪计算目标蛋白HER2亲和体条带,占所有蛋白条带的比例C。
5)“菌泥中HER2蛋白总量”表示:收集菌泥量A,其为稀释5倍后破碎,其进行点胶SDS-PAGE电泳,检测菌泥破碎清液中总蛋白浓度B,通过凝胶成像仪计算其HER2蛋白占总蛋白比值C,则计算菌泥中HER2目标蛋白量D:D=5*A*B*C
6)“离心收集上清液体积”表示:发酵诱导结束,发酵放罐料液通过离心机7500rpm*30min离心,倒出所有上清液进行收集,量筒量取其体积E(mL)。
7)“上清液总蛋白浓度”表示:收集的发酵上清液,通过Bradford检测其总蛋白浓度F(mg/mL)。
8)“发酵清液中HER2占比”表示:发酵上清液样品点胶SDS-PAGE电泳,通过凝胶成像仪计算目标蛋白HER2亲和体条带,占所有蛋白条带的比例G
9)“发酵清液中HER2蛋白总量”表示:收集发酵清液体积E,样品SDS-PAGE电泳,通过凝胶成像仪计算目标蛋白HER2亲和体条带,占所有蛋白条带的比例G,则计算发酵上清液中HER2目标蛋白量H:H=E*F*G。
10)“发酵上清液HER2蛋白占比”表示:发酵清液中HER2蛋白总量H/(菌泥中HER2蛋白总量D+发酵清液中HER2蛋白总量H)*100%
从上面的检测结果可以看出:本发明实施例2及实施例3由于采用了本发明的发酵培养基配方与工艺,实现了80-90%目标蛋白的分泌表达。实施例4没有采用本发明的发酵培养基配方与工艺,目标蛋白的分泌表达量明显低于实施例2及实施例3。
以上仅为本发明的实施例,并非因此限制本发明的专利范围,凡是利用本发明说明书内容所作的等效变换,或直接或间接运用在其它相关的技术领域,均同理包括在本发明的专利保护范围内。
序列表
<110> 元本(珠海横琴)生物科技有限公司
<120> 一种促进HER2亲和体蛋白分泌表达的发酵培养基及发酵工艺
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 212
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ccatggccca tgaacacgag cacgaggcgg aaaacaaatt caacaaagaa atgcgcaacg 60
cgtactggga aattgccctg ctgccgaacc tgaccaacca acagaaacgc gccttcatcc 120
gctccctgta cgacgaccca tcccaatctg caaacctgct ggcggaagcg aagaaactga 180
acgatgcaca gggtggtggt tgctaagaat tc 212
<210> 2
<211> 67
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Met Ala His Glu His Glu His Glu Ala Glu Asn Lys Phe Asn Lys Glu
1 5 10 15
Met Arg Asn Ala Tyr Trp Glu Ile Ala Leu Leu Pro Asn Leu Thr Asn
20 25 30
Gln Gln Lys Arg Ala Phe Ile Arg Ser Leu Tyr Asp Asp Pro Ser Gln
35 40 45
Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Gly
50 55 60
Gly Gly Cys
65
<210> 3
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atgaaatacc tgctgccgac cgctgctgct ggtctgctgc tcctcgctgc ccagccggcg 60
<210> 4
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala
1 5 10 15
Ala Gln Pro Ala
20
<210> 5
<211> 272
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
atgaaatacc tgctgccgac cgctgctgct ggtctgctgc tcctcgctgc ccagccggcg 60
ccatggccca tgaacacgag cacgaggcgg aaaacaaatt caacaaagaa atgcgcaacg 120
cgtactggga aattgccctg ctgccgaacc tgaccaacca acagaaacgc gccttcatcc 180
gctccctgta cgacgaccca tcccaatctg caaacctgct ggcggaagcg aagaaactga 240
acgatgcaca gggtggtggt tgctaagaat tc 272
<210> 6
<211> 87
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala
1 5 10 15
Ala Gln Pro Ala Met Ala His Glu His Glu His Glu Ala Glu Asn Lys
20 25 30
Phe Asn Lys Glu Met Arg Asn Ala Tyr Trp Glu Ile Ala Leu Leu Pro
35 40 45
Asn Leu Thr Asn Gln Gln Lys Arg Ala Phe Ile Arg Ser Leu Tyr Asp
50 55 60
Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn
65 70 75 80
Asp Ala Gln Gly Gly Gly Cys
85

Claims (5)

1.采用发酵培养基促进HER2亲和体蛋白分泌表达的发酵方法,其特征在于,
所述的发酵培养基为促进HER2亲和体蛋白分泌表达的发酵培养基,所述的HER2亲和体蛋白为带有pel信号肽的HER2亲和体重组蛋白,其氨基酸序列如SEQ ID No.6所示,其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示; 所述的带有pel信号肽的HER2亲和体重组蛋白由基因工程菌分泌表达,所述的基因工程菌转化有重组质粒表达载体,所述重组质粒表达载体中含有如下基因:1)核苷酸序列如SEQ ID No.3所示的编码pel信号肽的基因;2)核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的编码未带有pel信号肽的HER2亲和体蛋白的基因;
所述的发酵培养基包括独立的基础料培养基和补料培养基:
所述的基础料培养基配方如下:蛋白胨8-15g/L,酵母浸出粉5-8g/L,甘油5-10g/L,无水硫酸钠0.7-2g/L,无水硫酸镁0.7-2g/L,无水磷酸二氢钾4-6g/L,无水磷酸氢二钾8-10g/L,消泡剂0.3-0.5g/L;
所述的补料培养基配方如下:蛋白胨40-60g/L,酵母浸出粉20-30g/L,甘油300-400g/L,另配置10-15%浓度氨水;
所述的发酵方法包括如下步骤:
1)平板培养:将配置有固体培养基的摇瓶灭菌后,冷却凝固前50℃加入终浓度50-100ppm卡那霉素混合均匀,按照10-15mL/皿倒平板;待平板凝固后,取HER2甘油管菌株,四分区划线涂布于卡那抗性平板上,过夜培养12-16h,以备挑选单克隆菌株;
2)活化摇瓶:将配置有摇瓶培养基的活化摇瓶灭菌冷却后,接入终浓度50-100ppm卡那霉素,挑取步骤1)中的平板单克隆1个接入25mL培养基/100mL摇瓶中;活化摇瓶培养4-6h,OD600达0.6-1.2;
3)进罐摇瓶:将配置有摇瓶培养基的进罐摇瓶灭菌冷却后,接种同时加入终浓度50-100ppm卡那霉素;按照接种量2%,取步骤2)的活化种子转接进入进罐摇瓶中,进罐摇瓶培养基体积60-300mL;培养3-4h,OD600达1.0-1.6;
4)发酵:发酵罐起始条件:pH7.0±0.5,发酵过程10-15%浓度氨水自动控制,温度37±1.0℃,通气比1:1,搅拌转速200rpm,溶氧度校准100%;取步骤3)的发酵种液接种,接种比例2-10%,开始5L发酵罐发酵,发酵罐中加入前述的基础料培养基;通过提高搅拌转速200-900rpm与通气量3-9LPM,以及逐步降低温度至37-30℃,以维持溶氧25±5%;
5)发酵诱导与补料:在发酵罐中发酵5h,检测OD600在15-20,设定诱导温度30-37℃,开始加入IPTG或者乳糖开始诱导,诱导剂IPTG终浓度使用0.2-1.0mM,如果诱导剂为乳糖则终浓度2-6g/L;且当DO一旦开始回升,则开始加入前述的补料培养基进行补料,补料速度35-50mL/H,基本以补料来控制溶氧度在25±5%,诱导4-8h,检测OD600在30-40基本不再增长,则诱导结束放罐;
6)收集发酵上清液,用于后续纯化。
2.根据权利要求1所述的促进HER2亲和体蛋白分泌表达的发酵方法,其特征在于,所述的步骤5)中,诱导温度为35-37℃。
3.根据权利要求1所述的促进HER2亲和体蛋白分泌表达的发酵方法,其特征在于,所述的步骤1)中,培养基配方如下:10-20g/L蛋白胨、5-10g/L酵母浸出粉,5-10g/L氯化钠,10-20g/L琼脂粉。
4.根据权利要求1所述的促进HER2亲和体蛋白分泌表达的发酵方法,其特征在于,所述的步骤2)中,培养基配方如下:10-20g/L蛋白胨、5-10g/L酵母浸出粉,5-10g/L氯化钠。
5.根据权利要求1所述的促进HER2亲和体蛋白分泌表达的发酵方法,其特征在于,所述的步骤3)中,培养基配方如下:10-20g/L蛋白胨、5-10g/L酵母浸出粉,5-10g/L氯化钠。
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