CN112646826A - 编码Trx-hPTH（1-34）融合蛋白的基因序列、重组表达质粒、工程菌及应用 - Google Patents

编码Trx-hPTH（1-34）融合蛋白的基因序列、重组表达质粒、工程菌及应用 Download PDF

Info

Publication number
CN112646826A
CN112646826A CN202011544089.XA CN202011544089A CN112646826A CN 112646826 A CN112646826 A CN 112646826A CN 202011544089 A CN202011544089 A CN 202011544089A CN 112646826 A CN112646826 A CN 112646826A
Authority
CN
China
Prior art keywords
hpth
trx
fusion protein
gene sequence
fermentation
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202011544089.XA
Other languages
English (en)
Inventor
余传信
杨建良
沈孝森
丁铁林
何军山
刘晓龙
宋丽君
杨莹莹
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
WUXI HEBANG BIOLOGICAL TECHNOLOGY CO LTD
Jiangsu Institute of Parasitic Diseases
Original Assignee
WUXI HEBANG BIOLOGICAL TECHNOLOGY CO LTD
Jiangsu Institute of Parasitic Diseases
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by WUXI HEBANG BIOLOGICAL TECHNOLOGY CO LTD, Jiangsu Institute of Parasitic Diseases filed Critical WUXI HEBANG BIOLOGICAL TECHNOLOGY CO LTD
Priority to CN202011544089.XA priority Critical patent/CN112646826A/zh
Publication of CN112646826A publication Critical patent/CN112646826A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/635—Parathyroid hormone, i.e. parathormone; Parathyroid hormone-related peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A61P19/10—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease for osteoporosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/35—Fusion polypeptide containing a fusion for enhanced stability/folding during expression, e.g. fusions with chaperones or thioredoxin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/22—Vectors comprising a coding region that has been codon optimised for expression in a respective host

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明一种编码Trx‑hPTH(1‑34)融合蛋白的基因序列、重组表达质粒、工程菌及应用，5’端为编码Trx肽段的基因序列，其3’端为编码hPTH(1‑34)的基因序列，编码Trx肽段的基因序列与编码hPTH(1‑34)的基因序列之间为编码连接肽的基因序列，提高Trx‑hPTH(1‑34)融合蛋白可溶性表达水平。本发明提供的编码Trx‑hPTH(1‑34)融合蛋白的基因序列、重组表达质粒、工程菌及应用，不含氨苄青霉素基因，工程菌发酵过程中不需要使用β‑内酰胺类抗生素，可降低环境污染，可溶性Trx‑hPTH(1‑34)融合蛋白在其总表达量中占比大于80％，可采用非变性条件纯化，提高生产效率。

Description

编码Trx-hPTH（1-34）融合蛋白的基因序列、重组表达质粒、工 程菌及应用
技术领域
本发明属于生物工程制药技术领域，具体涉及编码Trx-hPTH(1-34)融合蛋白的基因序列、重组表达质粒、工程菌及应用。
背景技术
骨质疏松症是一种因骨量低下、骨微结构损坏导致骨脆性增加、易骨折的全身性骨病，多发于绝经后的女性、老年人，可因吸烟、酗酒、性腺功能减退、滥用皮质激素等原因所致，全球1/2的老年女性和1/3的老年男性将发生骨质疏松性骨折。骨质疏松症与糖尿病、阿尔茨海默病一起被WHO列为危害中老年人健康的三大杀手，对中老年人的健康构成了严重的威胁。
骨质疏松症的治疗药物包括：促进骨矿化药物、抗骨吸收药物、促骨生长药三大类。人甲状旁腺素(Parathyroid hormone，hPTH)是由人甲状旁腺分泌的由84个氨基酸组成的多肽分子。hPTH的N端肽链与hPTH-I受体结合发挥促进骨细胞生长的作用，而C 端肽链与hPTH-Ⅱ受体结合，可发挥促进骨细胞凋亡的作用，增强骨吸收。hPTH的N端 1-34肽(又称特立帕肽)是首先被FDA批准的可以促进骨合成代谢的药物，它与骨组织细胞上hPTH-I受体结合，直接刺激成骨细胞生长，间接增加肠道钙的吸收，增加肾小管钙的重吸收和增强磷酸盐在肾脏的排泄，同时也消除了hPTH的C端的促进骨凋亡作用。特立帕肽对骨骼的作用依赖于全身暴露模式，每天一次注射特立帕肽可通过优先刺激成骨细胞活性(相对于破骨细胞活性)，增加新骨在松质骨和皮质骨表面的积聚。人甲状旁腺素1-34肽(hPTH(1-34))已广泛应用于骨质疏松症及骨折患者的治疗。
人甲状旁腺素1-34肽的制备方法可以用化学合成法和基因工程重组表达法。化学合成法生产成本高，产能受到限制。采用基因工程重组技术在原核细胞大肠杆菌中进行大规模的发酵表达，具有成本低、生产周期短等明显优势，是制备肽类蛋白质原料药最常用一种方法。由于甲状旁腺素是一个真核细胞分子，其基因的天然编码DNA序列在大肠杆菌不是最优化序列，蛋白表达水平低，易形成包涵体，影响重组表达hPTH1-34的产量、纯化工艺、生物活性与纯度，难以满足商业化规模制药的需要。因此，迫切需要开发以可溶性表达为主的hPTH1-34工程菌及发酵、纯化工艺，提高重组hPTH1-34的生产效率。
中国发明专利，申请号：CN200610070995.4，专利名称：含有人甲状旁腺素1-34的融合蛋白及其表达载体，公开了一种编码融合蛋白的重组DNA序列，融合蛋白具有：
(1)硫氧还蛋白的序列；
(2)位于所述硫氧还蛋白下游的甲状旁腺激素1-34肽；和
(3)位于所述硫氧还蛋白和所述甲状旁腺激素1-34肽之间的含有肠激酶识别位点的连接肽，其中所述的肠激酶识别位点的C端直接连接所述甲状旁腺激素1-34肽的N端；并且，所述重组DNA序列包含编码所述融合蛋白中的所述肠激酶识别位点-甲状旁腺激素 1-34肽的下列核苷酸序列：
GACGACGACGACAAGTCCGTTTCCGAAATCCAGCTGATGCACAACCTGGGTAAA CACCTGAACTCCATGGAACGTGTTGAATGGCTGCGTAAAAAACTGCAGGACGTTCAC AACTTC。
但是上述专利工程菌表达的甲状旁腺素1-34肽以包涵体形式存在为主，需要采用变性条件与变性方法进行纯化，生产效率与产品纯度均很低，难以满足商业化大规模生产的需要。另外，上述专利的表达质粒是带有氨苄青霉素抗性基因的质粒pET32a(+)，生产过程中需要使用氨苄青霉素，不符合国家相关法规的要求，不能用于药品原料药的生产。
发明内容
为解决现有技术中存在的技术问题，本发明的目的在于提供一种编码Trx-hPTH(1-34)融合蛋白的基因序列、重组表达质粒、工程菌及应用。
为实现上述目的，达到上述技术效果，本发明采用的技术方案为：
一种编码Trx-hPTH(1-34)融合蛋白的基因序列，所述编码Trx-hPTH(1-34)融合蛋白的基因序列的5’端为编码Trx肽段的基因序列，其3’端为编码hPTH(1-34)的基因序列，编码Trx肽段的基因序列与编码hPTH(1-34)的基因序列之间为编码连接肽的基因序列，编码Trx-hPTH(1-34)融合蛋白的基因序列全长为599个碱基，为可在大肠杆菌中表达Trx-hPTH(1-34)融合蛋白的优化基因序列，其核苷酸序列为SEQ IN NO：3。
进一步的，所述编码Trx-hPTH(1-34)融合蛋白的基因序列的的5’端引入限制内切酶Nco I位点，在其3’端引入限制内切酶Xho I位点。
本发明公开了一种表达Trx-hPTH(1-34)融合蛋白的重组表达质粒，所述表达Trx-hPTH(1-34)融合蛋白的重组表达质粒为pET28b-Trx-hPTH(1-34)，由纯化的编码 Trx-hPTH(1-34)融合蛋白的基因序列(DNA片段)和表达质粒pET28b(+)DNA分别经限制酶Nco I和XhoI酶切再经DNA连接酶连接形成。
本发明公开了一种表达Trx-hPTH(1-34)融合蛋白的工程菌，所述表达Trx-hPTH(1-34) 融合蛋白的工程菌为大肠埃希氏菌Escherichia coli，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为中国，北京市，中国科学院微生物研究所，北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC21219，保藏时间为2020年11月23日。
进一步的，所述表达Trx-hPTH(1-34)融合蛋白的工程菌为通过将含有权利要求3所述的表达Trx-hPTH(1-34)融合蛋白的重组表达质粒pET28b-Trx-hPTH(1-34)纯化后转入大肠杆菌BL21(DE3)的感受态细胞中，经过卡那霉素筛选和IPTG诱导表达得到
本发明公开了一种提高Trx-hPTH(1-34)融合蛋白可溶性表达的发酵方法，包括以下步骤：
1)、种子活化
将低温保存的权利要求4或5所述的表达Trx-hPTH(1-34)融合蛋白的工程菌解冻，分区划线接种到含卡那霉素的LB固体平板上，置于37℃培养箱中培养过夜；
2)、一级种子制备
从LB固体平板上挑取100个单个菌落接种到100ml含35μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、200rpm振荡培养3-5h，测定OD600在0.5-2时，得到一级种子；
3)二级种子制备
将一级种子液按1:10-100的体积比接种到新鲜液体LB培养基中，于30-37℃、200rpm 转速下培养4-8h至OD600值达到2.5-3.0，获得二级种子；
4)发酵培养
按1:100的体积比接种二级种子液至发酵培养基中，于发酵罐内进行发酵培养，发酵温度控制在37℃，通过调节搅拌速度、通气流量和罐压控制发酵罐内DO>30％，发酵体系的pH为6.9-7.1；
5)补料
当发酵罐内溶解氧快速上升至50-70％时开始流加补料，补料液总体积为发酵培养基的 1/10，补料液分为补料I和补料II，补料II的体积是补料I的2倍，补料I流加结束后接着进行补料II的流加；
6)诱导
当OD600值达到10-15时，加入无菌IPTG至终浓度为0.3-0.6mM进行诱导，3h后再次加入无菌IPTG至终浓度为0.4-0.7mM进行第二次诱导，2h-5h后结束发酵；
7)菌体收集
发酵结束后，采用连续离心机对步骤6)所得发酵液进行离心，收集菌体，冷冻保存。
进一步的，步骤4)中，所述发酵培养基的组分包括：胰蛋白胨2％、酵母提取粉1％、甘油1％、氯化钠0.4％、磷酸二氢钾0.1％、磷酸氢二钾0.4％、硫酸钾0.24％、氯化钙0.113％、氯化铵0.1％，用氨水调pH至7.0。
进一步的，步骤5)中，所述补料液I的组分包括：7％酵母粉、蛋白胨7％、甘油7％；补料液II的组分包括：7％酵母粉、甘油7％。
本发明公开了一种提高Trx-hPTH(1-34)融合蛋白可溶性表达的发酵方法在制备用于治疗骨质疏松症和骨折患者药物的原料药人甲状旁腺素1-34中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
1)对编码Trx-hPTH(1-34)融合蛋白的密码子、基因序列进行了优化，提高密码子在大肠杆菌中的利用频率，使之更适合在大肠杆菌中表达，获得了在大肠杆菌中稳定、高效表达Trx-hPTH(1-34)融合蛋白的优化基因序列，优化后的基因序列优于现有产品，全长599个碱基，在其5’端引入一个Nco I的酶切位点，在其3’端引入一个Xho I的酶切位点，便于后期克隆操作，中间含有编码连接肽的DNA序列，方便重组甲状旁腺素1-34 的纯化；采用与大肠杆菌中的分子伴侣蛋白硫氧还蛋白(Thirodoxin，Trx)融合表达策略，提高蛋白的稳定性和表达量；
2)使用表达质粒pET28b(+)构建表达Trx-hPTH(1-34)融合蛋白的重组表达质粒pET28b-Trx-hPTH(1-34)，该重组质粒不含有氨苄青霉素，在发酵过程中不需要使用β- 内酰胺类抗生素，符合国家生物制品生产的法规的要求；
3)构建了一种新的表达Trx-hPTH(1-34)融合蛋白的工程菌pET28b-Trx-hPTH(1-34) /E.coli BL21(DE3)；
4)对发酵培养基及补料成分进行了优化，对发酵工艺进行了优化，形成了本发明独有的发酵培养基、补料液与发酵工艺，使发酵产物中可溶性表达的Trx-hPTH(1-34)融合蛋白的重量占比大于80％以上，有效地提高了硫氧还蛋白与人甲状旁腺素1-34肽融合蛋白[Trx-hPTH(1-34)]的可溶性表达水平，使重组表达的人甲状旁腺素1-34肽可以通过非变性条件进行纯化，提高了生产效率与重组人甲状旁腺素1-34肽的产量与纯度，满足商业化规模生产的要求，提高成药性。
附图说明
图1为本发明的重组表达质粒pET28b-Trx-hPTH(1-34)的Nco1/Xho1酶切分析图谱；其中，图1a为DNA分子量标志物，图1b为未经酶切的质粒pET28b-Trx-rhPTH(1-34) DNA，图1c为pET28b-Trx-PTH(1-34)DNA片段经Nco1/Xho1酶切的产物；
图2为本发明的重组表达质粒pET28b-Trx-hPTH(1-34)DNA序列测序结果图；
图3为本发明的工程菌pET28b-Trx-hPTH(1-34)/E.coli BL21(DE3)不同克隆菌中目的蛋白的表达图谱；其中，图3a为蛋白质标准分子量标志物；图3b为未经IPTG诱导的工程菌；图3c-3g为1-5号克隆菌中目的蛋白的表达；
图4为本发明的工程菌表达目的蛋白免疫印渍分析图；其中，图4A为SDS-PAGE分析图，图4B为蛋白条带被抗甲状旁腺素抗体免疫识别图，A1为pET28b-Trx-hPTH(1-34) /E.coli BL21(DE3)诱导后样品，A2为pET28b-Trx-hPTH(1-34)/E.coli BL21(DE3)诱导前样品，A3为BL21(DE3)诱导后样品，A4为BL21(DE3)诱导前样品；
图5为本发明的3个批次发酵产物的SDS-PAGE分析图；其中，5a为未诱导表达产物；5b为发酵细菌总蛋白；5c为发酵细菌裂解物上清；5d为发酵细菌裂解物沉淀；5e为蛋白质标准分子量标志物。
具体实施方式
下面对本发明的实施例进行详细阐述，以使本发明的优点和特征能更易于被本领域技术人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定。
如图1-5所示，本发明设计了一个编码大肠杆菌硫氧还蛋白(Trx)与人甲状旁腺素1-34肽(hPTH(1-34))的融合蛋白(Trx-hPTH(1-34)的基因序列，全长599个碱基，该基因序列的5’端为编码Trx的基因序列，3’端为编码hPTH(1-34)的基因序列，编码Trx肽段的基因序列与编码hPTH(1-34)的基因序列之间为编码连接肽的基因序列，编码Trx-hPTH(1-34)融合蛋白基因片段完全由人工合成，全长为599个碱基，其核苷酸序列为SEQ IN NO：3。
为方便重组人甲状旁腺素1-34肽的纯化，在Trx与hPTH(1-34)之间引入一个编码连接肽的DNA序列，该序列中有编码6个组氨酸(6×His)的序列和编码肠激酶酶切位点(DDDDK)的序列，其中，肠激酶序列C端与hPTH(1-34)的N端直接相连，对编码Trx-hPTH(1-34)融合蛋白的基因序列的DNA进行大肠杆菌密码子优化。
为了方便下一步的克隆操作，在Trx-hPTH(1-34)融合蛋白基因序列的5’端引入一个Nco I的酶切位点，在其3’端引入一个Xho I的酶切位点。Trx-hPTH(1-34)融合蛋白由194个氨基酸组成，理论分子量为21332.18Da，Trx-hPTH(1-34)融合蛋白的核甘酸序列为SEQIN NO:1，Trx-hPTH(1-34)融合蛋白的氨基酸序列为SEQ IN NO:2，Trx-hPTH (1-34)融合蛋白，其编码核苷酸序列插入在一种表达载体和细胞宿主系统。
本发明的表达载体可以是真核细胞表达载体、酵母表达载体，亦可以是大肠杆菌表达载体，本发明优选的表达载体是大肠杆菌表达载体，其中，大肠杆菌表达载体可为pGEX系列、pET系列、pMAL系列、pQE系列、pTrc99a系列、pTrcHis系列、pBV220系列、 pTXB系列、pLLP-ompA系列、pIN-III-ompA系列等，优选pET表达质粒系列，更优选 pET28b(+)。
本发明提供了表达Trx-hPTH(1-34)融合蛋白的重组表达质粒的构建方法，包括以下步骤：
1)、首先通过化学合成方法制备一条多聚核苷酸序列片段(Trx-hPTH(1-34))，即编码Trx-hPTH(1-34)融合蛋白的基因序列。该序列含有编码人甲状旁腺素1-34肽[hPTH(1-34)]的核苷酸序列、编码硫氧还蛋白(Trx)以及编码中间连接肽的核苷酸序列，该多聚核苷酸序列的5’端带有限制内切酶Nco I位点，其3’端带有限制内切酶Xho I位点；
2)、用Nco I、Xho I对步骤1)合成的Trx-hPTH(1-34)基因片段及表达载体pET28b(+)DNA进行限制酶切，酶切产物进行琼脂糖DNA电泳，采用胶回收试剂盒纯化经过酶切的Trx-hPTH(1-34)DNA片段和表达载体pET28b(+)DNA片段，用T4 DNA连接酶将此两个纯化DNA片段连接，连结产物经电转化到受体菌E.coli DH5α中，涂布在含卡那霉素(35μg/ml)LB平板上，37℃生长过液，获得含重组表达质粒pET28b-Trx-hPTH(1-34) 菌株；从LB平板上挑取若干单个菌落接种到含卡那霉素(35μg/ml)LB液体培养基中，37℃生长过夜，离心收集菌体，采用质粒DNA纯化试剂盒制备重组表达质粒pET28b-Trx-hPTH (1-34)DNA。
本发明提供了表达Trx-hPTH(1-34)融合蛋白的工程菌的构建方法，包括以下步骤：
将纯化的表达Trx-hPTH(1-34)融合蛋白的重组表达质粒pET28b-Trx-hPTH(1-34)转化到大肠杆菌宿主菌中进行诱导表达，优选的大肠杆菌宿主菌是E.coli BL21(DE3)。具体地，将重组表达质粒pET28b-Trx-hPTH(1-34)转化到商业化途径获得的大肠杆菌BL21(DE3)的感受态细胞中，通过卡那霉素筛选及蛋白质诱导表达获得能表达Trx-hPTH(1-34)融合蛋白的工程菌pET28b-Trx-hPTH(1-34)/E.coli BL21(DE3)，表达Trx-hPTH(1-34) 融合蛋白的工程菌为大肠埃希氏菌Escherichia coli，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为中国，北京市，中国科学院微生物研究所，北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC21219，保藏时间为2020年11月23日。
本发明提供了一种提高Trx-hPTH(1-34)融合蛋白可溶性表达的发酵方法，为一种高水平表达可溶性Trx-hPTH(1-34)融合蛋白的发酵方法，包括以下工艺步骤：
(1)种子活化：将保存在-70℃的工程菌工作种子取出后，置于4℃解冻，随后经分区划线接种到含35μg/ml卡那霉素的LB固体平板上，倒置于37℃培养箱中培养过夜。
(2)一级种子制备：从LB固体平板上挑取100个单个菌落接种到100ml含卡那霉素35μg/ml的LB液体培养基中，37℃、200rpm培养3-5h，测定OD600在0.5-2范围内，获得一级种子。
(3)二级种子制备：将一级种子液按1：10-100的比例接种至含卡那霉素35μg/ml的新鲜液体LB培养基中，30-37℃、200rpm培养4-8h，至OD600值在2.5-3.0时获得二级种子。
(4)发酵培养：配制发酵培养基，按1:100的比例接种二级种子液进行发酵培养；
按质量体积百分比计，发酵培养基的组分包括：胰蛋白胨2％、酵母提取粉1％、甘油 1％、氯化钠0.4％、磷酸二氢钾0.1％、磷酸氢二钾0.4％、硫酸钾0.24％、氯化钙0.113％、氯化铵0.1％，用氨水调pH至7.0；发酵过程中温度控制在37℃，通过搅拌速度、通气流量、罐压控制DO>30％，通过补加氨水控制pH在6.9-7.1。
(5)补料：当罐内DO大幅上升至50-70％时开始流加补料，补料液总体积为发酵培养基的十分之一，补料液分为补料I和补料II，补料I的体积是补料II的2倍，补料I流加结束后接着进行补料II的流加；
补料培养基的组分包括：
补料液I：7％酵母粉，蛋白胨7％，甘油7％
补料液II：7％酵母粉，甘油7％。
(6)诱导：当OD600达到10-15时通过补料管加入无菌IPTG至终浓度为0.3-0.6mM 进行诱导，3h后再次加入无菌IPTG至终浓度为0.4-0.7mM进行第二次诱导，2h-5h后结束发酵；
(7)菌体收集：发酵结束，采用连续离心机对发酵液进行离心，收集菌体，-20℃保存。
本发明公开了一种编码Trx-hPTH(1-34)融合蛋白的基因序列、表达Trx-hPTH(1-34) 融合蛋白的重组表达质粒pET28b-Trx-hPTH(1-34)、表达Trx-hPTH(1-34)融合蛋白的工程菌pET28b-Trx-hPTH(1-34)/E.coli BL21(DE3)，还公开了一种提高Trx-hPTH(1-34)融合蛋白可溶性表达的发酵方法，可用于生产用于治疗骨质疏松症和骨折患者药物的原料药人甲状旁腺素1-34(又称为特立帕肽)。表达Trx-hPTH(1-34)融合蛋白的重组表达质粒及工程菌中不含氨苄青霉素基因，工程菌发酵过程中不需要使用β-内酰胺类抗生素，可降低环境污染，本发明提供的发酵工艺可使发酵产物中可溶性Trx-hPTH(1-34)融合蛋白在其总表达量中占比大于80％，可采用非变性条件纯化Trx-hPTH(1-34)融合蛋白，有助于提高生产效率。
实施例1
Trx-hPTH(1-34)融合蛋白基因序列的设计、密码子优化与合成：
为了提高hPTH(1-34)在大肠杆菌中的表达水平和稳定性，同时便于下游的纯化，本发明采用了融合表达策略，将hPTH(1-34)肽与大肠杆菌硫氧还蛋白Trx进行融合表达，在Trx与hPTH(1-34)之间引入一个连接肽，该连接肽中包涵了一个6个组氨酸的序列 (6×HIS)，可使表达的Trx-hPTH(1-34)融合蛋白通过镍亲和层析柱进行纯化，同时，在连接肽的C端与hPTH(1-34)肽N端连接处引入一个肠激酶的酶切位点序列(DDDDK)，可以使重组表达的hPTH(1-34)肽通过酶切从Trx-hPTH(1-34)融合蛋白中完整地分离出来而不带有任何额外的氨基酸残基。为方便重组表达质粒的构建，在编码Trx-hPTH(1-34) 融合蛋白的基因序列的5’端引入一个Nco I的限制性内切酶位点序列，在其3’端引入一个Xho I的酶切位点。
对编码Trx-hPTH(1-34)融合蛋白基因序列进行了密码子优化，使之更适合大肠杆菌中进行蛋白质表达。
Trx-hPTH(1-34)融合蛋白的核苷酸序列如SEQ IN NO：1：
ATGGGCATGT CAGATAAAAT TATTCATCTG ACCGATGATA GCTTTGATAC CGATGTGCTGAAAGCAGATG GCGCCATTCT GGTTGATTTT TGGGCCGAAT GGTGTGGTCC GTGTAAAATG ATTGCCCCGATTTTAGATGA AATTGCAGAT GAATATCAGG GCAAACTGAC CGTTGCCAAA CTGAATATTG ATCAGAATCCGGGTACCGCC CCGAAATATG GCATTCGCGG TATTCCGACC CTGTTACTGT TTAAAAATGG CGAAGTTGCCGCAACCAAAG TGGGTGCCTT ATCTAAAGGT CAGCTGAAAG AATTTCTGGA TGCCAATCTG GCCGGCTCAGGTAGTGGCCA CATGCATCAT CATCATCATC ATAGTAGCGG CTTAGTTCCG CGCGGCTCTG GTATGAAAGAAACCGCAGCA GCCAAATTTG AACGTCAGCA CATGGATTCT CCGGATCTGG GCACCGCAAG CGATGATGATGATAAAAGTG TGAGCGAAAT TCAGTTAATG CATAATTTAG GCAAACATTT AAATAGCATG GAGCGGGTGGAATGGTTAAG AAAAAAACTA CAGGATGTTC ATAATTTTTA A。
Trx-hPTH(1-34)融合蛋白的氨基酸序列如SEQ IN NO：2：
MGMSDKIIHL TDDSFDTDVL KADGAILVDF WAEWCGPCKM IAPILDEIAD 50 EYQGKLTVAKLNIDQNPGTA PKYGIRGIPT LLLFKNGEVA ATKVGALSKG 100 QLKEFLDANL AGSGSGHMHHHHHHSSGLVP RGSGMKETAA AKFERQHMDS 150 PDLGTASDDD DKSVSEIQLM HNLGKHLNSMERVEWLRKKL QDVHNF。
编码Trx-hPTH(1-34)融合蛋白的基因序列如SEQ IN NO：3：
CCATGGGCAT GTCAGATAAA ATTATTCATC TGACCGATGA TAGCTTTGAT ACCGATGTGCTGAAAGCAGA TGGCGCCATT CTGGTTGATT TTTGGGCCGA ATGGTGTGGT CCGTGTAAAA TGATTGCCCCGATTTTAGAT GAAATTGCAG ATGAATATCA GGGCAAACTG ACCGTTGCCA AACTGAATAT TGATCAGAATCCGGGTACCG CCCCGAAATA TGGCATTCGC GGTATTCCGA CCCTGTTACT GTTTAAAAAT GGCGAAGTTGCCGCAACCAA AGTGGGTGCC TTATCTAAAG GTCAGCTGAA AGAATTTCTG GATGCCAATC TGGCCGGCTCAGGTAGTGGC CACATGCATC ATCATCATCA TCATAGTAGC GGCTTAGTTC CGCGCGGCTC TGGTATGAAAGAAACCGCAG CAGCCAAATT TGAACGTCAG CACATGGATT CTCCGGATCT GGGCACCGCA AGCGATGATGATGATAAAAG TGTGAGCGAA ATTCAGTTAA TGCATAATTT AGGCAAACAT TTAAATAGCA TGGAGCGGGTGGAATGGTTA AGAAAAAAAC TACAGGATGT TCATAATTTT TAACTCGAG。
Trx-hPTH(1-34)融合蛋白基因DNA片段由上海捷瑞生物工程有限公司合成。
Trx-hPTH(1-34)融合蛋白的重组核苷酸序列插入在一种表达载体和细胞宿主系统。本发明的表达载体可以是真核细胞表达载体、酵母表达载体，亦可以是大肠杆菌表达载体，优选的表达载体是大肠杆菌表达载体，大肠杆菌表达载体可以是pGEX系列、pET系列、pMAL系列、pQE系列、pTrc99a系列、pTrcHis系列、pBV220系列、pTXB系列、pLLP-ompA 系列、pIN-III-ompA系列等，优选pET表达质粒系列，更优选pET28b(+)。
实施例2
表达Trx-hPTH(1-34)融合蛋白的重组表达质粒pET28b-Trx-hPTH(1-34)的构建方法，包括以下步骤：
采用限制性内切酶Nco I、Xho I分别对纯化的Trx-hPTH(1-34)融合蛋白基因片段及表达质粒pET28b(+)进行酶切，将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，采用PROMEGA公司的DNA胶回收试剂盒回收纯化酶切后的Trx-hPTH(1-34)的DNA片段及线性化pET28b 的DNA片段；
将回收的经双酶切的Trx-hPTH(1-34)DNA片段与表达质粒pET28b的DNA片段在连接液中进行连接，连接反应体积为10μL，双酶切的pET28b质粒载体与双酶切 Trx-hPTH(1-34)DNA的摩尔比为1：3，连接反应温度16℃，恒温水浴锅内反应16h，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，并转种到含卡那霉素(35μg/ml)的LB平板上， 37℃培养过夜；挑取LB平板单个克隆，接种到含卡那霉素(35μg/ml)LB液体培养基中，37℃生长过夜，离心收集菌体，用质粒DNA纯化试剂盒抽提质粒DNA，用限制性内切酶Nco I、Xho I对纯化的质粒DNA进行酶切分析，酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图1 所示。重组表达质粒pET28b-Trx-hPTH(1-34)DNA可以被限制性内切酶Nco I、Xho I切割成分子量约5300bp的pET28b DNA条带及分子量约600bp的Trx-hPTH(1-34)DNA 条带，与预期的大小一致。同时，将表达质粒pET28b DNA送天霖生物科技无锡有限公司采用通用引物进行DNA测序，以确定融合基因序列的准确性。测序结果如图2所示，测定序列与理论的Trx-rhPTH(1-34)基因序列一致。
连接液体系：取酶切纯化Trx-hPTH(1-34)DNA 3μL，酶切纯化pET28b DNA 5μL,10×T4 DNA连接酶缓冲液1μL、T4 DNA连接酶1μL，至总体积为10μL。
实施例3
表达Trx-hPTH(1-34)融合蛋白的工程菌的构建方法与鉴定：
将实施例2提取的纯化重组表达质粒pET28b-Trx-hPTH(1-34)DNA采用电转化的方法转化入大肠杆菌BL21(DE3)的感受态细胞中，转化产物接种到含卡那霉素(35μg/ml) 的LB平板上，37℃培养过夜；挑取LB平板单个克隆接种到3ml含卡那霉素(35μg/ml) 的LB液体培养基中，37℃培养过液；第二天按体积比1:100转种到新鲜3ml含卡那霉素 (35μg/ml)的LB液体培养基中37℃培养5h，加IPTG(1mM)进行诱导3h，离心收集菌体，进行10％的SDS-PAGE分析，观察融合蛋白的表达情况，结果如图3。从图3可以看出，工程菌pET28b-Trx-hPTH(1-34)/E.coliBL21(DE3)经过IPTG诱导后，3c-3g菌落均能产生高水平的Trx-hPTH(1-34)融合蛋白表达，分子量与预期大小相似，初步表明表达Trx-hPTH(1-34)融合蛋白的工程菌pET28b-Trx-hPTH(1-34)/E.coliBL21(DE3) 构建成功。
表达Trx-hPTH(1-34)融合蛋白的工程菌为大肠埃希氏菌Escherichia coli，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为中国，北京市，中国科学院微生物研究所，北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC21219，保藏时间为2020 年11月23日。
将IPTG诱导前、诱导后的工程菌pET28b-hPTH(1-34)/BL21(DE3)样本，及宿主菌大肠杆菌BL21(DE3)的IPTG诱导前、后的样本进行13％的SDS-PAGE分析，并经电转移将蛋白条带转移至NC膜上，用5％脱脂奶粉PBS封闭NC膜，再与1：1000体积比稀释的兔抗人甲状旁腺素rhPTH(1-34)抗体溶液反应，4℃孵育过夜；用PBST(含0.05％ Tween-20)洗膜后，再与按1:2000体积比稀释的HRP标记的羊抗兔IgG二抗反应，用DAB 显色，并观察结果，结果图4所示。从图4A可以看出经过IPTG诱导的工程菌能表达分子量约22kDa的目的蛋白条带，而未经IPTG诱导工程菌及经IPTG诱导前、后的宿主菌BL21 (DE3)均不能表达此目的条带；图4B的免疫印渍图显示工程菌经IPTG诱导表达的22kDa 目的蛋白条带可以被抗人甲状旁腺素蛋白抗体所识别，其它样本没有产生抗体识别条带。免疫印渍结果证明工程菌pET28b-Trx-hPTH(1-34)/BL21(DE3)表达的目的蛋白为 Trx-hPTH(1-34)融合蛋白。
实施例4
Trx-hPTH(1-34)可溶性表达发酵方法：
将低温保存的工程菌种子菌解冻，分区划线接种到含卡那霉素(35μg/ml)的LB固体平板上，倒置于37℃培养箱中培养过夜；从LB固体平板上挑取100个单个菌落接种到100ml含35μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、200rpm培养3-5h，测定OD600在 0.5-2左右，再按1:10-100的体积比接种到新鲜液体LB培养基中(含卡那霉素35μg/ml)， 37℃、200rpm培养5h，至OD600值在2.5-3.0左右，得到二级种子；然后，二级种子液按1:100的体积比接种至发酵培养液中进行发酵，发酵培养基的组成为：胰蛋白胨2％、酵母提取粉1％、甘油1％、氯化钠0.4％、磷酸二氢钾0.1％、磷酸氢二钾0.4％、硫酸钾0.24％、氯化钙0.113％、氯化铵0.1％，用氨水调pH至7.0。发酵过程中温度控制在37℃，通过搅拌速度、通气流量、罐压控制DO>30％，通过补加氨水控制pH在6.9-7.1。当罐内DO大幅上升至60％时开始流加补料。补料液总体积为发酵培养基的十分之一。补料液分为补料 I和补料II，补料II的体积是补料I的2倍，补料I流加结束后接着进行补料II的流加。补料液I的组成包括：7％酵母粉、蛋白胨7％、甘油7％；补料液II的组成包括：7％酵母粉、甘油7％。当OD600达到13-14时通过补料管加入无菌IPTG至终浓度为0.6mM进行诱导，3h后再次加入无菌IPTG至终浓度为0.4mM进行第二次诱导，2h后结束发酵，采用连续离心机对发酵液进行离心，收集菌体，-20℃保存。
本发明对不同时间、相同方法和条件制备所得的20181102、20181103、20181104三批发酵产物中Trx-hPTH(1-34)融合蛋白在总菌体蛋白中的占比及可溶性Trx-hPTH(1-34)融合蛋白在总的Trx-hPTH(1-34)融合蛋白中的占比进行下述分析：
将低温保存的菌体反复冻融，然后进行超声裂解，裂解产物在4℃进行低温高速离心 (12000g、30min)，分别收集上清液与沉淀物，进行12％的SDS-PAGE电泳、考马斯亮兰染色。采用凝胶成相灰度扫描法分析Trx-hPTH(1-34)融合蛋白在总菌体蛋白中的点比，以及可溶性Trx-hPTH(1-34)融合蛋白在总的Trx-hPTH(1-34)融合蛋白中的占比。三批发酵产物的分析结果如图5和表1所示。
表1
Figure BDA0002855237170000121
图5和表1的数据显示，20181102、20181103和20181104三个批号的工程菌pET28b-Trx-hPTH(1-34)/BL21(DE3)表达地Trx-hPTH(1-34)蛋白在菌体总蛋白中的占比分别为25.3％、30.14％和28.25％，而可溶性Trx-hPTH(1-34)融合蛋白在总的Trx-hPTH (1-34)融合蛋白中占比分别为83.87％、83.68％和85.22％，表明本发明的工程菌及发酵工艺稳定，目的蛋白Trx-hPTH(1-34)融合蛋白以可溶性表达为主，可溶性Trx-hPTH(1-34) 融合蛋白占比大于80％。
本发明未具体描述的部分采用现有技术即可，在此不做赘述。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 无锡和邦生物科技有限公司
江苏省血吸虫病防治研究所
<120> 编码Trx-hPTH（1-34）融合蛋白的基因序列、重组表达质粒、工程菌及应用
<130> 2020
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 591
<212> DNA
<213> Trx-hPTH（1-34）融合蛋白的核苷酸序列
<400> 1
atgggcatgt cagataaaat tattcatctg accgatgata gctttgatac cgatgtgctg 60
aaagcagatg gcgccattct ggttgatttt tgggccgaat ggtgtggtcc gtgtaaaatg 120
attgccccga ttttagatga aattgcagat gaatatcagg gcaaactgac cgttgccaaa 180
ctgaatattg atcagaatcc gggtaccgcc ccgaaatatg gcattcgcgg tattccgacc 240
ctgttactgt ttaaaaatgg cgaagttgcc gcaaccaaag tgggtgcctt atctaaaggt 300
cagctgaaag aatttctgga tgccaatctg gccggctcag gtagtggcca catgcatcat 360
catcatcatc atagtagcgg cttagttccg cgcggctctg gtatgaaaga aaccgcagca 420
gccaaatttg aacgtcagca catggattct ccggatctgg gcaccgcaag cgatgatgat 480
gataaaagtg tgagcgaaat tcagttaatg cataatttag gcaaacattt aaatagcatg 540
gagcgggtgg aatggttaag aaaaaaacta caggatgttc ataattttta a 591
<210> 2
<211> 196
<212> PRT
<213> Trx-hPTH（1-34）融合蛋白的氨基酸序列
<400> 2
Met Gly Met Ser Asp Lys Ile Ile His Leu Thr Asp Asp Ser Phe Asp
1 5 10 15
Thr Asp Val Leu Lys Ala Asp Gly Ala Ile Leu Val Asp Phe Trp Ala
20 25 30
Glu Trp Cys Gly Pro Cys Lys Met Ile Ala Pro Ile Leu Asp Glu Ile
35 40 45
Ala Asp Glu Tyr Gln Gly Lys Leu Thr Val Ala Lys Leu Asn Ile Asp
50 55 60
Gln Asn Pro Gly Thr Ala Pro Lys Tyr Gly Ile Arg Gly Ile Pro Thr
65 70 75 80
Leu Leu Leu Phe Lys Asn Gly Glu Val Ala Ala Thr Lys Val Gly Ala
85 90 95
Leu Ser Lys Gly Gln Leu Lys Glu Phe Leu Asp Ala Asn Leu Ala Gly
100 105 110
Ser Gly Ser Gly His Met His His His His His His Ser Ser Gly Leu
115 120 125
Val Pro Arg Gly Ser Gly Met Lys Glu Thr Ala Ala Ala Lys Phe Glu
130 135 140
Arg Gln His Met Asp Ser Pro Asp Leu Gly Thr Ala Ser Asp Asp Asp
145 150 155 160
Asp Lys Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His
165 170 175
Leu Asn Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp
180 185 190
Val His Asn Phe
195
<210> 3
<211> 599
<212> DNA
<213> 编码Trx-hPTH（1-34）融合蛋白的基因序列
<400> 3
ccatgggcat gtcagataaa attattcatc tgaccgatga tagctttgat accgatgtgc 60
tgaaagcaga tggcgccatt ctggttgatt tttgggccga atggtgtggt ccgtgtaaaa 120
tgattgcccc gattttagat gaaattgcag atgaatatca gggcaaactg accgttgcca 180
aactgaatat tgatcagaat ccgggtaccg ccccgaaata tggcattcgc ggtattccga 240
ccctgttact gtttaaaaat ggcgaagttg ccgcaaccaa agtgggtgcc ttatctaaag 300
gtcagctgaa agaatttctg gatgccaatc tggccggctc aggtagtggc cacatgcatc 360
atcatcatca tcatagtagc ggcttagttc cgcgcggctc tggtatgaaa gaaaccgcag 420
cagccaaatt tgaacgtcag cacatggatt ctccggatct gggcaccgca agcgatgatg 480
atgataaaag tgtgagcgaa attcagttaa tgcataattt aggcaaacat ttaaatagca 540
tggagcgggt ggaatggtta agaaaaaaac tacaggatgt tcataatttt taactcgag 599

Claims (9)

1.一种编码Trx-hPTH(1-34)融合蛋白的基因序列，其特征在于，所述编码Trx-hPTH(1-34)融合蛋白的基因序列的5’端为编码Trx肽段的基因序列，其3’端为编码hPTH(1-34)的基因序列，编码Trx肽段的基因序列与编码hPTH(1-34)的基因序列之间为编码连接肽的基因序列，编码Trx-hPTH(1-34)融合蛋白的基因序列全长为599个碱基，其核苷酸序列为SEQ INNO：3。
2.根据权利要求1所述的一种编码Trx-hPTH(1-34)融合蛋白的基因序列，其特征在于，所述编码Trx-hPTH(1-34)融合蛋白的基因序列的的5’端引入限制内切酶Nco I位点，在其3’端引入限制内切酶Xho I位点。
3.一种表达Trx-hPTH(1-34)融合蛋白的重组表达质粒，其特征在于，所述表达Trx-hPTH(1-34)融合蛋白的重组表达质粒为pET28b-Trx-hPTH(1-34)，由编码Trx-hPTH(1-34)融合蛋白的基因序列和表达质粒pET28b(+)DNA分别经限制酶Nco I和Xho I酶切再经DNA连接酶连接形成。
4.一种表达Trx-hPTH(1-34)融合蛋白的工程菌，其特征在于，所述表达Trx-hPTH(1-34)融合蛋白的工程菌为大肠埃希氏菌Escherichia coli，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为中国，北京市，中国科学院微生物研究所，北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC21219，保藏时间为2020年11月23日。
5.根据权利要求4所述的一种表达Trx-hPTH(1-34)融合蛋白的工程菌，其特征在于，所述表达Trx-hPTH(1-34)融合蛋白的工程菌为通过将含有权利要求3所述的表达Trx-hPTH(1-34)融合蛋白的重组表达质粒pET28b-Trx-hPTH(1-34)纯化后转入大肠杆菌BL21(DE3)的感受态细胞中，经过卡那霉素筛选和IPTG诱导表达得到。
6.一种提高Trx-hPTH(1-34)融合蛋白可溶性表达的发酵方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)、种子活化
将低温保存的权利要求4或5所述的表达Trx-hPTH(1-34)融合蛋白的工程菌解冻，分区划线接种到含卡那霉素的LB固体平板上，置于培养箱中培养过夜；
2)、一级种子制备
从LB固体平板上挑取若干个单个菌落接种到LB液体培养基中振荡培养3-5h，测定OD600在0.5-2时，得到一级种子；
3)二级种子制备
将一级种子液按1:10-100的体积比接种到新鲜液体LB培养基中，于30-37℃、200rpm转速下培养4-8h至OD600值达到2.5-3.0，获得二级种子；
4)发酵培养
接种二级种子液至发酵培养基中进行发酵培养，通过调节发酵温度、搅拌速度、通气流量和罐压控制发酵罐内DO>30％，发酵体系的pH为6.9-7.1；
5)补料
当发酵罐内溶解氧快速上升至50-70％时开始流加补料，补料液总体积为发酵培养基的1/10；
6)诱导
当OD600值达到10-15时，加入无菌IPTG至终浓度为0.3-0.6mM进行诱导，再次加入无菌IPTG至终浓度为0.4-0.7mM进行第二次诱导，2h-5h后结束发酵；
7)菌体收集
发酵结束后，采用连续离心机对步骤6)所得发酵液进行离心，收集菌体，冷冻保存。
7.根据权利要求6所述的一种提高Trx-hPTH(1-34)融合蛋白可溶性表达的发酵方法，其特征在于，步骤4)中，所述发酵培养基的组分包括：胰蛋白胨2％、酵母提取粉1％、甘油1％、氯化钠0.4％、磷酸二氢钾0.1％、磷酸氢二钾0.4％、硫酸钾0.24％、氯化钙0.113％、氯化铵0.1％，用氨水调pH至7.0。
8.根据权利要求6所述的一种提高Trx-hPTH(1-34)融合蛋白可溶性表达的发酵方法，其特征在于，步骤5)中，所述补料液分为补料I和补料II，补料II的体积是补料I的2倍，补料I流加结束后接着进行补料II的流加，补料液I的组分包括：7％酵母粉、蛋白胨7％、甘油7％；补料液II的组分包括：7％酵母粉、甘油7％。
9.一种提高Trx-hPTH(1-34)融合蛋白可溶性表达的发酵方法在制备用于治疗骨质疏松症和骨折患者药物的原料药人甲状旁腺素1-34中的应用。
CN202011544089.XA 2020-12-23 2020-12-23 编码Trx-hPTH（1-34）融合蛋白的基因序列、重组表达质粒、工程菌及应用 Pending CN112646826A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011544089.XA CN112646826A (zh) 2020-12-23 2020-12-23 编码Trx-hPTH（1-34）融合蛋白的基因序列、重组表达质粒、工程菌及应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011544089.XA CN112646826A (zh) 2020-12-23 2020-12-23 编码Trx-hPTH（1-34）融合蛋白的基因序列、重组表达质粒、工程菌及应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN112646826A true CN112646826A (zh) 2021-04-13

Family

ID=75360197

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202011544089.XA Pending CN112646826A (zh) 2020-12-23 2020-12-23 编码Trx-hPTH（1-34）融合蛋白的基因序列、重组表达质粒、工程菌及应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN112646826A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2024149995A1 (en) 2023-01-10 2024-07-18 Nuclera Ltd Protein aggregation assays

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1807456A (zh) * 2005-01-19 2006-07-26 上海赛金生物医药有限公司 重组人甲状旁腺激素pth1－34的制备方法
CN1900120A (zh) * 2006-03-31 2007-01-24 深圳市华生元基因工程发展有限公司 含有人甲状旁腺素1－34的融合蛋白及其表达载体
CN1916172A (zh) * 2006-03-31 2007-02-21 深圳市华生元基因工程发展有限公司 制备人甲状旁腺素1－34的方法
CN103451219A (zh) * 2012-06-04 2013-12-18 成都博发生物技术有限公司 一种治疗骨质疏松的重组人甲状旁腺激素(1-34)
CN110295214A (zh) * 2019-06-03 2019-10-01 大连理工大学 一种人甲状旁腺素1-84肽的发酵工艺

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1807456A (zh) * 2005-01-19 2006-07-26 上海赛金生物医药有限公司 重组人甲状旁腺激素pth1－34的制备方法
CN1900120A (zh) * 2006-03-31 2007-01-24 深圳市华生元基因工程发展有限公司 含有人甲状旁腺素1－34的融合蛋白及其表达载体
CN1916172A (zh) * 2006-03-31 2007-02-21 深圳市华生元基因工程发展有限公司 制备人甲状旁腺素1－34的方法
CN103451219A (zh) * 2012-06-04 2013-12-18 成都博发生物技术有限公司 一种治疗骨质疏松的重组人甲状旁腺激素(1-34)
CN110295214A (zh) * 2019-06-03 2019-10-01 大连理工大学 一种人甲状旁腺素1-84肽的发酵工艺

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
杨玉红等: "《生物技术概论》", 武汉理工大学出版社, pages: 39 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2024149995A1 (en) 2023-01-10 2024-07-18 Nuclera Ltd Protein aggregation assays
WO2024149996A1 (en) 2023-01-10 2024-07-18 Nuclera Ltd Protein expression systems

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111635898A (zh) 谷氨酸脱羧酶突变体及其在制备γ-氨基丁酸中的应用
CN110950937B (zh) 一种改造的艾克曼菌Amuc_1100蛋白及其制备方法和应用
CN110791494A (zh) 一种天冬氨酸酶突变体、包含天冬氨酸酶突变体的重组表达载体和重组菌及应用
WO2010062279A1 (ru) Способ получения рекомбинантного инсулина человека
CN110938151B (zh) 用于表达甲状旁腺素pth的融合蛋白及重组质粒、重组工程菌
CN112646826A (zh) 编码Trx-hPTH（1-34）融合蛋白的基因序列、重组表达质粒、工程菌及应用
CN111303275A (zh) 一种重组人生长激素及其制备方法与药物应用
CN112239760B (zh) 高效表达重组hGH的重组工程菌及构建方法和应用
CN112625117A (zh) 一种可溶性重组特立帕肽的非变性纯化方法及应用
Liu et al. Large scale preparation of recombinant human parathyroid hormone 1–84 from Escherichia coli
CN114933658B (zh) 一种短肽元件及其应用方法
CN115058408B (zh) 一种宏基因组来源的高比活耐酸性d-阿洛酮糖3-差向异构酶及其编码基因和应用
CN111019927B (zh) 用于表达tev蛋白的重组质粒、重组工程菌，以及制备和纯化tev蛋白的方法
CN105218659B (zh) 人骨形成蛋白2成熟肽及其表达
CN108998431B (zh) 一种提高4-α-糖基转移酶可溶性表达水平的方法
CN113637690A (zh) 一种人乳头瘤病毒hpv16型e7活性蛋白的制备方法及应用
CN111349575B (zh) 组成型表达猪胃蛋白酶原c的毕赤酵母工程菌及其应用
US20160009779A1 (en) Novel fusion tags and expression vector system for the expression of human parathyroid hormone (rhpth)
CN115028740B (zh) 一种融合表达制备人甲状旁腺激素1-34的方法
CN111349576B (zh) 组成型表达猪胃蛋白酶原a的毕赤酵母工程菌及其应用
CN113004419B (zh) 普卡那肽的制备方法
CN114621959B (zh) 一种编码牙鲆igf2可溶性蛋白的基因及蛋白重组表达方法与应用
CN112680454B (zh) 一种人干扰素-κ的生产方法
CN113151227B (zh) 一种蛋白酶基因及其异源表达
CN114350587B (zh) 一种基因重组串联表达利那洛肽的工程菌

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20210413

RJ01 Rejection of invention patent application after publication