CN113637690A

CN113637690A - 一种人乳头瘤病毒hpv16型e7活性蛋白的制备方法及应用

Info

Publication number: CN113637690A
Application number: CN202110957482.XA
Authority: CN
Inventors: 于倩; 易汪雪; 蔡赢; 徐娅; 王营; 柯红; 殷婷子; 张振
Original assignee: Cusabio Biotech Co ltd
Current assignee: Cusabio Biotech Co ltd
Priority date: 2021-08-18
Filing date: 2021-08-18
Publication date: 2021-11-12

Abstract

本发明公开了一种人乳头瘤病毒HPV16型E7活性蛋白的制备方法及应用，通过对HPV16型E7蛋白的已知编码基因进行密码子优化，得到了如SEQ ID NO.1所示的HPV16型E7蛋白编码基因，并利用大肠杆菌发酵系统进行体外表达，从而显著提高了目的蛋白的溶解性，使其表现为可溶性蛋白，避免目的蛋白以包涵体形式进行表达且需要重新变性溶解复性才可得到活性蛋白，从而显著提高了E7蛋白的制备效率，可高效获得具有高纯度、天然活性的HPV16型E7蛋白。该方法操作简单，成本低廉，采用该方法制备得到的HPV16型E7活性蛋白可作为抗原，用于制备抗HPV的治疗性疫苗，具有极高的生产应用价值。

Description

一种人乳头瘤病毒HPV16型E7活性蛋白的制备方法及应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种人乳头瘤病毒HPV16型E7活性蛋白的制备方法及应用。

背景技术

人乳头瘤病毒(HPV)是一种球形DNA病毒，能引起人体皮肤黏膜的鳞状上皮增殖。目前已分离出100多种，其中黏膜高危型HPV-16、18、30、31、33、35、53、39与宫颈癌、直肠癌、口腔癌、扁桃体癌等多种癌症相关。

目前已经有HPV预防性二价疫苗(HPV16，18)、四价疫苗(HPV6，11，16，18)和九价疫苗(HPV6，11，16，18，31，33，45，52，58)，可以预防多种病毒类型感染，但其价格昂贵，并且作为预防性疫苗，对于已经感染HPV的人则无法发挥作用。因此寻求高性价比的疫苗，解决疫苗的亚型限制，并制备相应的治疗性疫苗仍然是宫颈癌防控研究的热点。

HPV感染尤其是高危型的HPV感染是大多数宫颈癌发生的主要原因，而HPV 16型，18型在高危HPV中最常见。HPV 16型感染多发于宫颈鳞状细胞癌，占宫颈癌的70％以上。HPV16型的E7基因是致癌的关键基因之一，E7基因编码的E7蛋白可以抑制宿主凋亡，使细胞生长失控，促进肿瘤血管的新生。E7蛋白作为肿瘤特异性排斥抗原，与MHC分子亲和力高、抗原性强，是开发HPV治疗性疫苗的首选靶抗原。因此高效制备E7活性蛋白具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种人乳头瘤病毒HPV16型E7活性蛋白的制备方法及应用，通过对HPV16型E7蛋白的编码基因进行密码子优化，并利用大肠杆菌发酵系统获得目的蛋白，提高了目的蛋白的溶解性，使其表现为可溶性蛋白，从而显著提高了HPV16型E7蛋白的制备效率，获得了具有高纯度、天然活性的HPV16型E7蛋白，该方法操作简单，成本低廉，采用该方法制备得到的HPV16型E7活性蛋白可作为抗原，用于制备抗HPV的治疗性疫苗，因此具有极高的生产应用价值。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

本发明提供了一种密码子优化的HPV16型E7蛋白编码基因，所述基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示。

进一步地，所述编码基因编码的HPV16型E7蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ IDNO.2所示。

本发明还提供一种扩增上述密码子优化的HPV16型E7蛋白编码基因的引物，所述引物的序列如序列表SEQ ID NO.4-5所示。

本发明还提供一种表达载体，所述表达载体包含上述密码子优化的HPV16型E7蛋白编码基因。

进一步地，所述表达载体选自PET载体或毕赤酵母表达载体。

进一步地，所述表达载体为pET-28a载体。

本发明还提供了一种细胞，所述细胞中包含上述表达载体。

进一步地，所述细胞选自大肠杆菌、酵母或真核细胞。

进一步地，所述细胞为大肠杆菌细胞。

本发明还提供了一种人乳头瘤病毒HPV16型E7活性蛋白的制备方法，所述方法包括：将如SEQ ID NO.1所示的编码基因与表达载体连接并转入受体细胞，诱导表达后裂解细胞，收集纯化得到所述人乳头瘤病毒HPV16型E7活性蛋白。

进一步地，所述方法还包括：将如SEQ ID NO.1所示的编码基因与表达载体连接并转入受体细胞后，将受体细胞接种至发酵培养基中进行发酵，当OD₆₀₀值增至12-15时结束发酵，再诱导目的蛋白表达。

进一步地，所述方法还包括：采用ELISA检测方法，检测所述人乳头瘤病毒HPV16型E7活性蛋白与MYC蛋白的结合活性。

本发明还提供了上述制备得到的人乳头瘤病毒HPV16型E7活性蛋白在制备抗人乳头瘤病毒的治疗性疫苗中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明针对现有的HPV疫苗性价比低，且相应的治疗性疫苗缺失的问题，提供了一种人乳头瘤病毒HPV16型E7活性蛋白的制备方法，通过对HPV16型E7蛋白的已知编码基因进行密码子优化，并利用大肠杆菌发酵系统进行体外表达，从而显著提高了目的蛋白的溶解性，使其表现为可溶性蛋白，避免目的蛋白以包涵体形式进行表达且需要重新变性溶解复性才可得到活性蛋白，从而显著提高了E7蛋白的制备效率，可高效获得具有高纯度、天然活性的HPV16型E7蛋白。该方法操作简单，成本低廉，采用该方法制备得到的HPV16型E7活性蛋白可作为抗原，用于制备抗HPV的治疗性疫苗，具有极高的生产应用价值。

附图说明

图1为本发明实施例1中原始编码基因和优化后E7蛋白编码基因的琼脂糖凝胶电泳检测结果，其中图1-A为原始编码基因的检测结果，图1-B为优化后E7蛋白编码基因的检测结果；

图2为本发明实施例1中pET-28a质粒经双酶切后的酶切产物的琼脂糖凝胶电泳检测结果；

图3为本发明实施例1中构建的重组质粒的图谱；

图4为本发明实施例1中阳性克隆筛选的检测结果，其中图4-A为pET28a-HPV16 E7(未)的检测结果，图4-B为pET28a-HPV16 E7(优)的检测结果；

图5为本发明实施例1中优化前后表达目的蛋白的裂解液上清和沉淀的SDS-PAGE检测结果；

图6为本发明实施例1中经镍离子亲和层析纯化得到的目的蛋白的SDS-PAGE检测结果；

图7为本发明实施例1中目的蛋白的LC-MS/MS检测结果；

图8为本发明实施例1中E7蛋白与MYC-生物素结合活性的检测结果。

具体实施方式

下面将结合本发明中的实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动条件下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

本实施例提供了一种通过大肠杆菌发酵系统获得HPV16型E7活性蛋白的方法。

1、实验材料

紫外仪(WD-9403F，北京六一)；

台式高速离心机(H1650-W，湘仪)；

恒温水浴锅(DK-S22，上海精宏)；

恒温培养箱(GNP-P270，上海精宏)；

洁净工作台(SW-CJ-1FD，苏州安泰)；

PCR扩增仪(DL9700，北京东林昌盛)；

恒温摇床(TS-100C，上海天呈)；

均质机(型号AH-1500，ATS)；

-80℃冰箱(DW-86L628，青岛海尔特种电器有限公司)；

限制性内切酶BamHI、SalI购于Fermentas公司；

甲醇、琼脂粉、氯化钠、咪唑购于国药集团化学试剂有限公司；

生物素标记的MYC蛋白(MYC-生物素)(Cusabio，CSB-EP015270HU-B)；

辣根过氧化物酶标记链霉亲和素(SA-HRP)(Cusabio，CSB-PA813185)。

2、载体构建

(1)密码子优化

HPV16型E7蛋白的原始核苷酸序列的NCBI登录号为NC_001526.4，其中编码E7蛋白的序列长度294bp，原始核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。针对表达系统的密码子偏好性，对原始核苷酸序列进行密码子优化，经密码子优化后的E7蛋白编码基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示，对应的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

(2)基因扩增

原始编码基因(SEQ ID NO.3)以及经优化后E7蛋白编码基因(SEQ ID NO.1)，由武汉金开瑞生物工程有限公司进行基因合成。并设计对应的PCR扩增引物，其中F-1和R-1扩增优化后E7蛋白编码基因，F-2和R-2扩增原始编码基因，引物序列如下表：

以合成的编码基因作为模板，进行常规PCR扩增反应，反应结束后，以1％琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，其中原始编码基因的检测结果如图1-A所示，优化后E7蛋白编码基因的检测结果如图1-B所示，其中Marker从大到小依次为5000、3000、2000、1500、1000、750、500、250、100(bp)，目的片段大小均为294bp，与预期的一致。

根据目的片段的大小切胶，并按照说明书的步骤利用回收试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司)回收目的基因片段。

(3)载体的制备

取pET-28a载体，使用BamHI、SalI双酶切体系，采用本领域常规方法于37℃水浴酶切20h以上，并按照说明书的步骤采用回收试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司)对双酶切产物进行回收，以1％琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物，检测结果如图2所示，其中Marker从大到小依次为：5000、3000、2000、1500、1000、750、500、250、100(bp)，目的载体片段大小为5334bp，与预期一致。

(4)连接、转化和阳性克隆筛选

将上述回收得到的优化前后的E7蛋白编码基因片段与pET-28a载体的酶切产物进行常规的连接反应，最终分别获得优化前和优化后的连接产物pET28a-HPV16 E7(未)和pET28a-HPV16 E7(优)，其质粒图谱如图3所示。

分别将上述连接产物pET28a-HPV16 E7(未)和pET28a-HPV16 E7(优)加入到Top10感受态细胞中；冰上30min，42℃热击90s，冰上1min。然后加入700μl预热的LB培养基，置37℃摇床中1.5h进行转化反应。

将培养好的菌液涂至含有卡那霉素的平板上；倒置平板，于37℃恒温培养箱中培养，12～16h后可出现菌落。挑斑检测，分别使用各自特异的上游引物和下游引物，进行PCR扩增检测，检测结果如图4所示，其中图4-A为pET28a-HPV16 E7(未)的检测结果，图4-B为pET28a-HPV16 E7(优)的检测结果，Marker从大到小依次为：5000、3000、2000、1500、1000、750、500、250、100(bp)。结果显示条带大小均约为294bp，与预期一致。将挑取的单克隆菌种的接种至3mL加卡那霉素的LB培养基中培养过夜，然后保种，送测序。测序结果与目的基因一致的单克隆菌种用以提取质粒，流程详见质粒回收试剂盒。

3、蛋白发酵表达与纯化

(1)表达菌制备以及放大

将上述pET28a-HPV16 E7(未)和pET28a-HPV16 E7(优)质粒与大肠杆菌表达宿主菌Rosetta(DE3)混合。通过冰上30min；42℃热击90s、冰上1min、加入800μL预热的LB培养基，置37℃摇床中2h，分别将质粒导入表达宿主中。分别涂平板挑选单克隆菌种，将单克隆接种于3ml LB培养基中放入摇床培养3h后，分别取500μL悬液加入到100μL(C＝50％)的保种甘油中，震匀，放入冰箱(-20℃)冻存。剩余菌液以千分之一的接种量转入两瓶350ml LB摇瓶中，加入终浓度50ug/ml的Kan抗生素，放入37℃摇床培养16小时。

(2)发酵制备目的蛋白

将350mL LB摇瓶中菌液和对应终浓度50ug/ml的Kan抗生素分别接入发酵罐。发酵培养基配方如表1所示，设置发酵参数：搅拌速度500rpm，温度30℃，通气量7V/V min，开始发酵并监测pH、溶氧、OD₆₀₀数据。溶氧下降至30％时，调整搅拌速度至700rpm；pH下降超过0.2时，接入氨水调控pH＝7.0(±0.1)。OD₆₀₀增至12-15时开始温度降低程序。温度降低至25℃，加入终浓度0.2mM IPTG开始诱导蛋白表达。诱导3小时后，停止碱液的流加，关闭温度自控和搅拌，开始放罐。8000rpm 3min离心收集菌体，菌体称重记录。

表1发酵培养基配方

药品	配方(g/L)	7L
			蛋白胨	8g/L	56g
酵母粉	12g/L	84g
			二水合磷酸二氢钠	2g/L	14g
十二水合磷酸氢二钠	5g/L	35g
			三水合磷酸氢二钾	5g/L	35g
硫酸铵	2g/L	14g
			甘油	50g/L	350g
消泡剂	0.2-0.5ml/L	4ml

(3)菌体裂解与蛋白纯化

收集上述菌体，加入NTA缓冲重悬菌体。均质机裂解，菌液循环裂解5-10次。裂解完成后，收集裂解样品，离心12000rpm 40min，样品放4℃等待纯化，取小样检测，观察表达情况。

分别取裂解液上清和沉淀进行SDS-PAGE检测，观察E7蛋白编码序列优化前后的表达情况，检测结果如图5所示，其中泳道1和4为Marker，泳道2和3分别为pET28a-HPV16 E7(未)的裂解上清液和沉淀，泳道5和泳道6分别为pET28a-HPV16 E7(优)的沉淀和裂解上清液。

结果显示，未经优化的原始编码基因进行体外表达时，目的蛋白主要以不溶的包涵体形式进行表达，表达的蛋白因为错误折叠、二硫键错配等原因，需要重新变性溶解后复性才能得到活性蛋白，导致操作更加繁琐。而本发明通过对E7蛋白编码基因进行优化，使其在进行体外表达时目的蛋白主要在上清中表达，即表现为可溶性蛋白，更利于使用并且制备过程更加简化快速，提高了目的蛋白的制备效率。

接着对pET28a-HPV16 E7(优)发酵制备得到的目的蛋白进行纯化，取裂解液上清用镍离子亲和层析纯化，分别用50mM咪唑，100mM咪唑，200mM咪唑，300mM咪唑,500mM咪唑洗脱，并进行常规SDS-PAGE检测，检测结果如图6所示，其中泳道1为Marker，Marker从上自下一依次为：116kD、66.2kD、45kD、35kD、25kD、18kD、14.4kD，泳道2为500mM咪唑洗脱液。

结果显示，目的蛋白大部分被500mM咪唑洗脱下来，目的蛋白的纯度大于85％，产量大于10mg/L。目的蛋白的理论分子量为16kD，而SDS-PAGE检测图显示分子量为20kD左右，原因可能为：目的基因的等电点4.2为酸性蛋白质，结合带有负电荷的SDS相对较少，在电场中的作用下相对较弱，因此SDS-PAGE检测图会偏大一点，同时将目的蛋白做LC-MS/MS检测。

(4)目的蛋白LC-MS/MS检测分析

将纯化后的上清蛋白100ul样本，送武汉金开瑞生物工程有限公司进行进行检测分析，检测结果如图7所示，结果显示该目的蛋白序列与预期的蛋白质序列相同，表明该目的蛋白来源于大肠杆菌表达的优化后的HPV16型E7蛋白。

4、HPV16型E7蛋白活性检测

采用ELISA检测方法，将经密码子优化后表达得到的的HPV16型E7重组蛋白(CSB-EP365855HML)包被10μg/ml，重组表达的MYC-生物素蛋白梯度稀释后孵育(从25μg/ml开始2倍梯度稀释18个梯度)，辣根过氧化物酶标记链霉亲和素检测。吸光度检测结果如表2所示。

表2 HPV16型E7蛋白与MYC-生物素结合活性检测结果

将对应分组标记好，然后将实验组浓度1-浓度18数据复制到Graphpad软件里面，作图，读取EC₅₀数据，最后导出曲线图，如图8所示。

结果显示，本发明制备得到HPV16型E7重组蛋白包被5μg/mL，MYC-生物素(CSB-EP015270HU-B)蛋白从25μg/ml开始2倍梯度稀释18个梯度，对照组正常的情况下，HPV16型E7重组蛋白与MYC-生物素蛋白结合的EC₅₀为268.1-354.3ng/ml。结果表明，本发明制备得到的HPV16型E7蛋白具有一定的天然蛋白结构，可以与MYC-生物素蛋白结合，即本发明采用大肠杆菌发酵系统，体外表达HPV16型E7蛋白，不仅实现了HPV16 E7蛋白的高产量、高纯度表达，同时还保留了其天然活性。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 武汉华美生物工程有限公司

<120> 一种人乳头瘤病毒HPV16型E7活性蛋白的制备方法及应用

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 294

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgcacggtg atactccaac cttgcacgag tacatgttgg acttgcaacc agagactacc 60

gacttgtact gttacgagca attgaacgac tcctccgaag aagaggacga aattgacggt 120

ccagctggtc aagctgaacc agatagagca cactacaaca tcgtcacttt ctgctgtaag 180

tgcgactcca ccttgagatt gtgtgttcag tctacccacg tcgacatcag aactttggag 240

gacttgttga tgggtactct gggtatcgtt tgtccaatct gttcccagaa gcca 294

<210> 2

<211> 98

<212> PRT

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 2

Met His Gly Asp Thr Pro Thr Leu His Glu Tyr Met Leu Asp Leu Gln

1 5 10 15

Pro Glu Thr Thr Asp Leu Tyr Cys Tyr Glu Gln Leu Asn Asp Ser Ser

20 25 30

Glu Glu Glu Asp Glu Ile Asp Gly Pro Ala Gly Gln Ala Glu Pro Asp

35 40 45

Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe Cys Cys Lys Cys Asp Ser Thr

50 55 60

Leu Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr His Val Asp Ile Arg Thr Leu Glu

65 70 75 80

Asp Leu Leu Met Gly Thr Leu Gly Ile Val Cys Pro Ile Cys Ser Gln

85 90 95

Lys Pro

<210> 3

<211> 294

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 3

atgcatggag atacacctac attgcatgaa tatatgttag atttgcaacc agagacaact 60

gatctctact gttatgagca attaaatgac agctcagagg aggaggatga aatagatggt 120

ccagctggac aagcagaacc ggacagagcc cattacaata ttgtaacctt ttgttgcaag 180

tgtgactcta cgcttcggtt gtgcgtacaa agcacacacg tagacattcg tactttggaa 240

gacctgttaa tgggcacact aggaattgtg tgccccatct gttctcagaa acca 294

<210> 4

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atccgaattc cggaccatgc acggtgatac tccaacc 37

<210> 5

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tgctcgagtg cggccttatg gcttctggga acagattgg 39

<210> 6

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

atccgaattc cggaccatgc atggagatac acctacattg 40

<210> 7

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tgctcgagtg cggccttatg gtttctgaga acagatgg 38

Claims

1.一种密码子优化的HPV16型E7蛋白编码基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的编码基因，其特征在于，所述编码基因编码的HPV16型E7蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示。

3.一种用于扩增如权利要求1所述的密码子优化的HPV16型E7蛋白编码基因的引物，其特征在于，所述引物的序列如序列表SEQ ID NO.4-5所示。

4.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包含如权利要求1所述的密码子优化的HPV16型E7蛋白编码基因。

5.根据权利要求4所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体选自PET载体或毕赤酵母表达载体。

6.一种细胞，其特征在于，所述细胞中包含如权利要求4或5所述的表达载体。

7.根据权利要求6所述的细胞，其特征在于，所述细胞选自大肠杆菌、酵母或真核细胞。

8.一种人乳头瘤病毒HPV16型E7活性蛋白的制备方法，其特征在于，所述方法包括：将如SEQ ID NO.1所示的编码基因与表达载体连接并转入受体细胞，诱导目的蛋白表达后裂解细胞，收集纯化得到所述人乳头瘤病毒HPV16型E7活性蛋白。

9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述方法还包括：将如SEQ ID NO.1所示的编码基因与表达载体连接并转入受体细胞后，将受体细胞接种至发酵培养基中进行发酵，当OD₆₀₀值增至12-15时结束发酵，再诱导目的蛋白表达。

10.如权利要求8中所述的人乳头瘤病毒HPV16型E7活性蛋白在制备抗人乳头瘤病毒的治疗性疫苗中的应用。